BR112020010504A2 - anticorpos anti-alfa-sinucleína - Google Patents

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Terence Seward Baker
Kerry Louise Tyson
Lorenzo De Lichtervelde
Daniel John Lightwood
David James MCMILLAN
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Abstract

A presente invenção se refere a anticorpos que se ligam à alfa-sinucleína e fragmentos dos mesmos capazes de se ligar à alfa-sinucleína como monômero e em fibrilas e impedem a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína. Os anticorpos da presente invenção são para uso no tratamento de alfa-sinucleinopatias, incluindo a doença de Parkinson.

Description

“ANTICORPOS ANTI-ALFA-SINUCLEÍNA” CAMPO DE INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-alfa-sinucleína e a um método de uso dos mesmos para tratar sinucleinopatias. Em particular, a presente invenção se refere a anticorpos anti-alfa-sinucleína humanos e a seu uso no tratamento da doença de Parkinson.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A alfa-sinuclena é uma pequena proteína solúvel longa de 140 aminoácidos existente em formas radicalmente diferentes. A alfa-sinucleina é encontrada principalmente nos terminais nervosos pré-sinápticos e, embora sua função precisa seja desconhecida, os pesquisadores acreditam que ela desempenha um papel central em vários processos neurodegenerativos.
[0003] Nos últimos 15 anos, demonstrou-se que a alfa-sinucleína desempenha um papel fundamental na patogênese de todas as formas da doença de Parkinson. As mutações genéticas ou multiplicações genéticas do gene da alfa-sinucleína causam a doença de Parkinson (DP) de início precoce familiar. Curiosamente, nas famílias de multiplicação de locus genético, o efeito patogênico é claramente dependente da dosagem do gene. As duplicações genéticas causam uma forma de início relativamente precoce de DP (-47 anos), que tem um curso normal da doença, enquanto as triplicações gênicas estão associadas a uma idade muito precoce de início (-33 anos) e a um curso muito rápido da doença. Em todas as formas da doença de Parkinson, a alfa-sinucleína é o principal constituinte dos corpos de Lewy, a principal característica patológica da doença.
[0004] A patologia dos corpos de Lewy se expande durante o curso da doença e se propõe que a alfa-sinucleína atue como um príon, como uma proteína, que se desdobra incorretamente para formar oligômeros tóxicos e agregados que podem se propagar a partir de neurônios afetados a não afetados (Olanow CW et al. Movement Disorders, volume 28, nº 1, 2013). As terapias existentes atualmente não são capazes de impedir a propagação da doença e apenas auxiliam no tratamento dos sintomas associados à perda progressiva de atividades dependentes de neurônios motores. Em
2014, Tran HT et al. (Tran HT et al, Cell Reports 7, 2.054 a 2.065, 2014) mostraram que a administração intraperitoneal de um anticorpo monoclonal para alfa-sinucleina incorretamente dobrada a camundongos previamente injetados de modo intrastrial com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína reduziu a patologia de corpos de Lewy, melhorou a perda de neurônios dopaminérgicos de substância nigra e aprimorou os comprometimentos motores. Portanto, ainda permanece a necessidade de uma imunoterapia passiva que possa exercer efeitos terapêuticos na DP e em outras alfa- sinucleinopatias.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A presente invenção aborda a necessidade acima identificada, fornecendo anticorpos anti-alfa-sinucleína de acordo com as seguintes modalidades.
[0006] Modalidade 1: Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 que compreende SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 que compreende SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: i. uma CDR-H1 que compreende SEQ ID NO: 4; ii. uma CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 45 e iii. uma CDR-H3 que compreende SEQ ID NO: 46.
[0007] Modalidade 2: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 1, que se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131; em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0008] Modalidade 3: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.
[0009] Modalidade 4: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de se ligar à alfa-sinucleína como um monômero e nas fibrilas.
[0010] Modalidade 5: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma maior afinidade de ligação à alfa-sinucleína em fibrilas em comparação com a alfa-sinucleína como monômero caracterizado por uma constante de dissociação (Kp) pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para alfa-sinucleina em fibrilas.
[0011] Modalidade 6: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma (Kp) para a alfa-sinucleína em fibrilas de 300 pM ou menos.
[0012] Modalidade 7: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que não se liga à beta- sinucleína e/ou gama-sinucleína.
[0013] Modalidade 8: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
[0014] Modalidade 9: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
[0015] Modalidade 10: O anticorpo, de acordo com a modalidade 9, em que o anticorpo de comprimento total é selecionado a partir de um IgG1, IgG4 ou IgG4P.
[0016] Modalidade 11: O fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir de um Fab, um Fab', um F(ab')2a, um scFv, um dAb ou um Vrr.
[0017] Modalidade 12: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID
NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 33.
[0018] Modalidade 13: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 23; ou c. uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID SEQ ID NO: 25.
[0019] Modalidade 14: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 27 ou 35; ou c. uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID SEQ ID NO: 29 ou 37.
[0020] Modalidade 15: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 23 ou 31; ou c. uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID SEQ ID NO: 25 ou 33.
[0021] Modalidade 16: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 27 ou 35; ou c. uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID SEQ ID NO: 29 ou 37.
[0022] Modalidade 17: Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que: a. compete pela ligação da alfa-sinucleína com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; e/ou b. bloqueia cruzadamente ou é bloqueado cruzadamente pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, para a ligação à sinucleína alfa; e/ou c. liga alfa-sinucleína ao mesmo epítopo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; e/ou d. compreende uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35; e/ou e. compreende uma região variável de cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19.
[0023] Modalidade 18: Um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16.
[0024] Modalidade 19: O polinucleotídeo isolado, de acordo com a modalidade 18, em que o polinucleotídeo codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; ou ii. compreende SEQ ID NO: 16 ou 20; ou ili. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou ii. compreende SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; Cc. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; ou ii. compreende SEQ ID NO: 18 ou 22; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou ii. compreende SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38.
[0025] Modalidade 20: Um vetor de clonagem ou expressão que compreende um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das modalidades 18 ou 19.
[0026] Modalidade 21: Uma célula hospedeira que compreende: a. um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das modalidades 18 ou 19 ou b. um ou mais vetores de expressão, de acordo com a modalidade 20.
[0027] Modalidade 22: Um processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 17, que compreende cultivar a célula hospedeira, de acordo com a modalidade 21, em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0028] Modalidade 23: Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, e um ou mais carreadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
[0029] Modalidade 24: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou a composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 23, para uso em terapia.
[0030] Modalidade 25: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou a composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 23, para uso no tratamento de uma ou mais sinucleinopatias.
[0031] Modalidade 26: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 25, em que as sinucleinopatias são selecionadas a partir de doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).
[0032] Modalidade 27: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 26, em que a sinucleinopatia é a doença de Parkinson.
[0033] Modalidade 28: Um método de tratamento de uma sinucleinopatia em um paciente que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, ou a composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 23.
[0034] Modalidade 29: O método, de acordo com a modalidade 28, em que a sinucleinopatia é selecionada a partir de doença de Parkinson (DP) (incluindo as formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de
Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), preferencialmente doença de Parkinson.
[0035] Modalidade 30: O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16, para uso no diagnóstico de alfa-sinucleinopatias, de preferência no diagnóstico da doença de Parkinson.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0036] Figura 1. (A) SDS-PAGE de amostras de expressão de alfa-sinucleína. Alfa-sinucleína com etiqueta de His (1) e após a remoção da etiqueta de His por protease de TEV (2), cromatografia por exclusão de tamanho Superdex 75 na alfa- sinucleína humana tratada com protease de TEV (3). Marcador de peso molecular de proteínas SeeBluePlus2 (Invitrogen) (M). (B) SDS-PAGE de alfa-sinucleína humana purificada a partir do sobrenadante Expi293 como proteína não etiquetada de tipo selvagem (4). Marcador de peso molecular de proteínas SeeBluePlus2 (Invitrogen) (M).
[0037] Figura 2. (A) Análise de fibrila pelo ensaio JC-1 de um monômero sem fluorescência e de fibrilas com uma fluorescência máxima a 540 nm. (B) Exemplo típico para o espectro de enrolamento aleatório de alfa-sinucleina humana monomérica (comprimento de onda de 1.646 cm”) e formação de inter-B-folhas em fibrilas de sinucleína-alfa humana recombinante (comprimento de onda de 1.625 a
1.630 cm”).
[0038] Figura 3. Ensaio de ligação ELISA. Ligação ELISA de IgG1 de coelho 6470 ao monômero alfa-sinuclena humana recombinante e fibrlas e peptídeo PVDPDNEAYE da alfa-sinucleina humana.
[0039] Figura 4. (A) Western blot que mostra a ligação de IgG1 de coelho 6470 à alfa-sinucleína humana e beta-sinucleína humana. 1, alfa-sinucleína humana; 2, alfa- sinucleína humana (rPeptídeo); 3, beta-sinucleína humana (rPeptídeo); Marcador, MagicMark XP. (B) Deslocamentos químicos em RMN que mostram o epítopo previsto de 6470 na alfa-sinucleína humana.
[0040] Figura 5. Inibição da ligação de IgG 6470 à alfa-sinucleína imobilizada (barras à esquerda, monômero e fibrilas à direita, respectivamente, para cada um dos peptídeos testados).
[0041] Figura 6. Representação esquemática do Fab 6470 em complexo com o peptídeo 123-132.
[0042] Figura 7. Representação esquemática dos contatos de cadeia pesada de Fab 6470 com o peptídeo 123-132. Os resíduos do peptídeo são marcados diretamente, os resíduos de cadeia pesada variável de 6470 são marcados com o número de resíduo vH.
[0043] Figura 8. Representação esquemática de contatos da cadeia leve de Fab 6470 com o peptídeo 123-132. Os resíduos do peptídeo são marcados diretamente, os resíduos de cadeia leve variável de 6470 são marcados com o número de resíduo vL.
[0044] Figura 9. Humanização da cadeia leve. 6470 é para a sequência de cadeia leve variável de coelho. 6470gL3 é para o enxerto humanizado da cadeia leve variável de 6470 usando a linhagem germinativa humana IGKV1-16 como estrutura aceitadora. CDRs são mostradas em negrito/sublinhado. Os resíduos doadores são mostrados em negrito/itálico e sombreados: Q48 e Q72. A mutação na CDRL1 N33R é mostrada em negrito/sublinhado e é sombreada.
[0045] Figura 10. Humanização de cadeia pesada. 6470 é para a sequência de cadeia pesada variável de coelho. 6470gH23 e gH36 são para enxertos humanizados de cadeia pesada variável do Anticorpo 6470 usando a linhagem germinativa humana IGHV3-23 como estrutura aceitadora. CDRs são mostradas em negrito/sublinhado. Os resíduos doadores são mostrados em negrito/itálico e sombreados: V24, Y47, 148, G49, S73, V78 e R97. As mutações S56N e N102H em CDRH2 e CDRH3, respectivamente, são apresentadas em negrito/sublinhado e estão sombreadas.
[0046] Figura 11. Tensão em uma interface ar-líquido. Anticorpos 6470 e mutantes em três tampões de pré-formulação às 3 e 24 horas após o vórtice.
[0047] Figura 12. Imuno-histoquímica. Imunorreatividade em seções do cérebro de pacientes com DP (A-E) e pacientes sem DP (F-H). (A-C) no córtex temporal de pacientes DP, anticorpo 6470 marcou o neurópilo e as estruturas semelhantes a corpo de Lewy (setas brancas) na massa cinzenta. (D, E) O anticorpo 6470 marcou as características semelhantes a corpo de Lewy (setas brancas) na substância nigra dos pacientes com DP. (F, G) Nos tecidos do córtex temporal de não DP, 6470 também marcou o neurópilo, mas nenhuma estrutura semelhante ao corpo de Lewy foi observada. (H) Não foram observadas estruturas semelhantes a corpos de Lewy na substância nigra de um indivíduo sem DP; setas pretas apontam para etiquetas não específicas. Barra de escala = 50 um.
[0048] Figura 13. Ensaio de agregação baseada em células (células HEK). Anticorpos da presente invenção foram capazes de inibir a agregação de alfa- sinucleína induzida por fibrilas de sinucleína-alfa, com IC5o inferior a 5 nM. Barras de erro representam erro padrão de medição (SEM, N = 3, n= 9). Na legenda, FL no final de cada nome de anticorpo significa “comprimento total”.
[0049] Figura 14. Ensaio de agregação baseado em células (neurônios primários). Um anticorpo representativo de acordo com a presente invenção foi capaz de inibir a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína em neurónios primários de camundongo que expressam os níveis endógenos de alfa-sinucleína, com uma ICso inferior a 4 nM. As barras de erro representam erro padrão de medição (SEM, N=4,n=18).
[0050] Figura 15. Imagens imuno-histoquímicas da patologia da alfa-sinucleína (setas) em diferentes regiões do cérebro de camundongos machos C57BlI/6J do tipo selvagem (A) e camundongos SNCA-OVX (B) injetados com PFFs de camundongos ou humanos, respectivamente.
[0051] Figura 16. Quantificação da patologia da alfa-sinucleína em diferentes regiões do cérebro de camundongos do tipo selvagem C57BI/6J (A: córtex cerebral; B: estriado; C: amígdala e D: substância nigra) injetados com PFF de camundongo.
[0052] Figura 17. Perfis farmacocinéticos de anticorpos de alfa-sinucleína: A. Anticorpo 6470 em camundongo do tipo selvagem; B. 6470 e anticorpos comparadores em macacos cynomolgus.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0053] A presente divulgação será agora descrita em relação a aspectos não limitativos particulares e modalidades dos mesmos e com referência a certas figuras e exemplos.
[0054] Os termos técnicos são usados pelo senso comum, salvo indicação em contrário. Se um significado específico levar a termos específicos, definições de termos serão fornecidas no contexto em que os termos são usados.
[0055] Quando o termo “compreendendo” é usado na presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos. Para os fins da presente divulgação, o termo “consistindo em” é considerado uma modalidade preferencial do termo “composto de”,
[0056] Quando um artigo indefinido ou definido é usado quando se refere a um substantivo singular, por exemplo, “um”, “uma” ou “a/0”, isso inclui um plural desse substantivo, a menos que algo mais seja especificamente indicado.
[0057] Conforme usado aqui, os termos “tratamento”, “tratando” e similares, referem-se à obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. O tratamento abrange, portanto, qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em humanos, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença.
[0058] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade de um anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que, quando administrado a um mamífero ou a outro indivíduo para o tratamento de uma doença, é suficiente para produzir um tal tratamento para a doença. A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, da doença e sua gravidade e da idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado.
[0059] O termo “isolado” significa, ao longo deste relatório descritivo, que o anticorpo, fragmento de ligação a antígeno ou polinucleotídeo, conforme o caso, existe em um meio físico distinto daquele em que pode ocorrer na natureza. A presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e lili. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 46.
[0060] Na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) ou arginina (Arg; R). Independentemente, na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) ou asparagina (Asn, N) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn, N) ou histidina (His; H).
[0061] Em uma modalidade, Xaa na SEQ ID NO: 44 e 46 é asparagina e Xaa na SEQ ID NO: 45 é serina.
[0062] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleina, em que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i.uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 6.
[0063] A alfa-sinucleína (ou alfa-sin; a-sinucleína; a-sin ou qualquer outro sinônimo conhecido) refere-se ao nome geral desta proteína e inclui, sem se limitar a, variantes de splicing alternativos, mutantes e alfa-sinucleína de outras espécies (camundongo, macaco, etc.). A menos que especificado de outra forma, quando a alfa-sinucleína humana é pretendida ou mencionada explicitamente, essa alfa-sinucleína compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 10 ou na Uniprot P37840.
[0064] O termo “anticorpo”, como aqui utilizado, geralmente se refere a anticorpos intactos (inteiros), isto é, que compreendem os elementos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. O anticorpo pode compreender outros domínios de ligação adicionais, por exemplo, de acordo com a molécula DVD-lg, como divulgada no documento WO 2007/024715, ou o chamado (FabFv)2Fc descrito no documento WO2011/030107. Assim, o anticorpo como empregado aqui, inclui os anticorpos bi, tri ou tetravalentes de comprimento total.
[0065] Os fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos incluem anticorpos de cadeia única (isto é, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de comprimento total); Fab, Fab modificado, Fab', Fab modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticorpos de domínio único (por exemplo, Vx ou Vi ou VHH ), scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, tricorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos anteriores (ver, por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1.126 a 1.136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). O formato Fab-Fv foi divulgado pela primeira vez no documento WOZ2009/040562 e suas versões estabilizadas com dissulfeto, o Fab-dsFv, foi divulgado pela primeira vez no documento WO2010/035012. Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos Pedidos de Patente Internacionais WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171. Os anticorpos multivalentes podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecíficos ou podem ser monoespeciíficos (ver, por exemplo, WO 92/22583 e WOO05/113605). Um exemplo deste último é um Tri-Fab (ou TFM) como descrito no documento WO92/22583.
[0066] Um fragmento de ligação a antígeno alternativo compreende um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv se liga ao mesmo alvo ou a um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv se liga a um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida ao se ligar, por exemplo, à albumina). Tais fragmentos de anticorpo são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2015/197772, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade e particularmente no que diz respeito à discussão de fragmentos de anticorpo.
[0067] Uma molécula de Fab' típica compreende um par de cadeia pesada e cadeia leve em que a cadeia pesada compreende uma região variável VH, um domínio constante CH1 e uma região de dobradiça natural ou modificada e a cadeia leve compreende uma região variável VL e um domínio constante CL. Os dímeros de um Fab', de acordo com a presente divulgação, criam um F(ab')2, onde, por exemplo, a dimerização pode ser através da dobradiça.
[0068] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, se liga a um epítopo da alfa-sinucleína.
[0069] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0070] e se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0071] Na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) ou arginina (Arg; R).
Independentemente, na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) ou asparagina (Asn; N) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N) ou histidina (His; H).
[0072] Em uma modalidade, Xaa na SEQ ID NO: 44 e 46 é asparagina e Xaa na SEQ ID NO: 45 é serina.
[0073] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6
[0074] e se liga à alfa-sinucleina a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0075] Na presente invenção, o termo “epíitopo” é usado de forma intercambiável para epítopos conformacionais e lineares, onde um epítopo conformacional é composto de seções descontinuadas da sequência primária de aminoácidos do antígeno e um epítopo linear é formado por uma sequência formada por aminoácidos contínuos.
[0076] O epítopo pode ser identificado por qualquer método de mapeamento de epítopos adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Exemplos de tais métodos incluem a seleção de peptídeos de comprimentos variados derivados da alfa-sinucleina de comprimento total para ligação ao anticorpo ou fragmento da presente invenção e identificam o menor fragmento que pode se ligar especificamente ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo. Os peptídeos de alfa- sinucleína podem ser produzidos sinteticamente ou por digestão proteolítica da proteína alfa-sinucleína. Os peptídeos que se ligam ao anticorpo podem ser identificados por, por exemplo, análise espectrométrica de massa. Em outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou a cristalografia de raios X pode ser usada para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Tipicamente, quando a determinação do epítopo é realizada por cristalografia de raios X, os resíduos de aminoácidos do antígeno dentro de 4 À das CDRs são considerados resíduos de aminoácidos que fazem parte do epítopo. Uma vez identificado, o epítopo pode servir para a preparação de fragmentos que se ligam a um anticorpo da presente invenção e, se necessário, usado como imunogênio para obter anticorpos adicionais que se ligam ao mesmo epítopo.
[0077] Em uma modalidade, o epítopo do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é determinado por cristalografia de raios X utilizando um peptídeo de alfa-sinucleína compreendendo os resíduos 123 a 132 com referência à SEQ ID NO: 10.
[0078] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.
[0079] Nesse contexto específico, o termo “prevenir” (e variantes gramaticais dos mesmos) é aqui utilizado intercambiavelmente com o termo “inibir” e indica o efeito que os anticorpos, de acordo com a presente invenção, têm em relação à agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir total ou parcialmente a agregação; ou reduzir completa ou parcialmente, isto é, bloquear a agregação que já teve início a partir da progressão adicional, ou redução completa ou parcial da ocorrência de agregação adicional; ou da reversão total ou parcial da agregação que já ocorreu.
[0080] Sem desejar se ater à teoria, acredita-se que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção se ligue à alfa- sinucleína: i) na forma monomérica e impede a alfa-sinucleína de formar oligôêômeros e agregados; e/ou ii) na forma oligomérica e fibrilar e impede alfa-sinucleína de propagar neurônios para neurônios e/ou iii) na forma oligomérica e/ou fibrilar e impede a agregação de alfa- sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleina, de preferência a agregação endógena de alfa-sinucleína.
[0081] O termo ”fibrilas”, forma fibrilar” ou “em fibrilas”, conforme usado aqui em relação à alfa-sinucleína, deve se referir a formas não monoméricas de alfa- sinucleína, incluindo oligômeros de alfa-sinucleína, que podem constituir as espécies que se espalham dentro e entre estruturas cerebrais.
[0082] Portanto, em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0083] impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y 125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0084] Na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) ou arginina (Arg; R). Independentemente, na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) ou asparagina (Asn; N) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N) ou histidina (His; H).
[0085] Em uma modalidade, Xaa na SEQ ID NO: 44 e 46 é asparagina e Xaa na SEQ ID NO: 45 é serina.
[0086] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6
[0087] e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína. De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0088] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é capaz de se ligar à alfa-sinucleína como um monômero e em fibrilas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem uma afinidade de ligação mais forte à alfa-sinucleina nas fibrilas em comparação com a alfa-sinucleina como monômero. Esse é caracterizado por uma constante de dissociação (Kp) de pelo menos 10 vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para a alfa-sinucleína em fibrilas.
[0089] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a presente invenção, tem uma constante de dissociação (Kb) menor do que 15 nM para alfa-sinucleína monomérica. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a presente invenção, tem uma constante de dissociação (Ko) menor do que 10 nM para a alfa-sinucleína em fibrilas. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma constante de dissociação (Ko) menor do de 300 pM para alfa-sinucleína em fibrilas.
[0090] O termo “Kv”, como aqui utilizado, refere-se à constante de dissociação que é obtida a partir da razão entre Ka e Ka (isto é, K/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Ka e Ka referem-se à taxa de velocidade de dissociação e associação, respectivamente, de uma interação particular entre anticorpo-antígeno (fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Os valores de Kp para os anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para a determinação da Kp de um anticorpo é usando ressonância de plasma de superfície, tal como o sistema Biacore6, por exemplo, como descrito nos Exemplos aqui apresentados, utilizando alfa-sinucleína natural ou recombinante isolada, uma proteína/polipeptídeo de fusão adequado da mesma ou fibrilas da mesma. Em um exemplo, a afinidade é medida usando alfa-sinucleína humana recombinante, conforme descrito nos Exemplos no presente documento. Para a ressonância e plasma de superfície, as moléculas-alvo são imobilizadas em uma fase sólida e expostas a ligantes em uma fase móvel que corre ao longo de uma célula de fluxo. Se ocorrer a ligação do ligante ao alvo imobilizado, o índice de refração local muda, levando a uma mudança no ângulo da SPR, que pode ser monitorada em tempo real, detectando alterações na intensidade da luz refletida. As taxas de alteração do sinal da SPR podem ser analisadas para produzir constantes de taxa aparentes para as fases de associação e dissociação da reação de ligação. A razão desses valores fornece a constante de equilíbrio aparente (afinidade) (ver, por exemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2.560 a 2.565 (1993)).
[0091] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma maior afinidade de ligação (isto é, menor Kp) para a alfa-sinucleína em fibrilas em comparação com a alfa-sinucleina como monômero. O termo “afinidade” refere-se à força de interação entre o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e alfa-sinucleína.
[0092] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma ICso inferior a 10 nM para bloquear a agregação de alfa-sinucleína induzida por alfa-sinucleína em fibrilas, preferencialmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma ICrso inferior a 5 nM para bloquear a agregação de alfa-sinucleína induzida por alfa-sinucleína em fibrilas. Exemplos de ensaios de agregação baseados em células são divulgados nos exemplos.
[0093] O termo IC5o, como aqui utilizado, refere-se à meia concentração inibitória máxima, que é uma medida da eficácia de uma substância, tal como um anticorpo, na inibição de uma função biológica ou bioquímica específica, na presente invenção, agregação induzida por alfa-sinucleína, de preferência alfa-sinucleína em fibrilas. À IC5o é uma medida quantitativa que indica a quantidade de uma substância em particular necessária para inibir um dado processo biológico pela metade.
[0094] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma ICrso inferior a 10 nM para bloquear a agregação da alfa-sinucleína induzida pela alfa-sinucleína em fibrilas, preferencialmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, tem uma ICso inferior a 5 nM para o bloqueio de agregação de alfa-sinucleína induzida por alfa-sinucleiína em fibrilas em ensaios in vitro.
[0095] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, não se liga à beta-sinucleína e/ou gama-sinucleina e são específicos para a alfa-sinucleína.
[0096] “Específico”, tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que só reconhece o antígeno ao qual é específico ou um anticorpo que tem afinidade significativamente mais elevada de ligação para o antígeno ao qual é específico (por exemplo, alfa-sinucleína) em comparação com a ligação a antígenos aos quais é não específico (gama e beta-sinucleínas), por exemplo, pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes maior afinidade de ligação.
[0097] Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos usando qualquer método adequado conhecido na técnica. O polipeptídeo/proteína alfa-sinucleína incluindo proteínas de fusão, células (recombinante ou naturalmente) que expressam o polipeptídeo podem ser usadas para produzir anticorpos que reconhecem especificamente a alfa-sinucleína. O polipeptídeo pode ser o polipeptídeo “maduro” ou um fragmento biologicamente ativo ou derivado do mesmo.
[0098] Em uma modalidade, o polipeptídeo (isto é, antígeno) é o monômero de alfa-sinucleína humana ou um fragmento do mesmo, produzido de preferência como descrito nos Exemplos abaixo.
[0099] Os polipeptídeos, para uso na imunização de um hospedeiro, podem ser preparados por processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras modificadas geneticamente compreendendo sistemas de expressão ou podem ser recuperados de fontes biológicas naturais. No presente pedido, o termo “polipeptídeos” inclui peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Eles são usados de forma intercambiável, a menos que especificado de outra forma. O polipeptídeo alfa- sinucleína ou um fragmento do mesmo pode, em alguns casos, fazer parte de uma proteína maior, tal como uma proteína de fusão, por exemplo, fundida a um marcador de afinidade ou similar.
[0100] Os anticorpos gerados contra o polipeptídeo alfa-sinucleína podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, administrando os polipeptídeos a um animal, preferencialmente um animal não humano, usando protocolos conhecidos e de rotina, consulte, por exemplo, Handbook of Experimental Immunology, DM Weir (ed.), Vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, vacas, camelos ou porcos podem ser imunizados. No entanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são geralmente mais adequados.
[0101] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica, como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495 a 497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today, 4:72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, páginas 77 a 96, Alan R Liss, Inc., 1985).
[0102] Os anticorpos para uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único por clonagem e expressão de cDNAs da região variável de imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por, por exemplo, os métodos descritos por
Babcook, J. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7.843 a 7848I; WOS92/02551; WO2004/051268 e WO2004/106377.
[0103] O rastreio de anticorpos pode ser realizado usando ensaios para medir a ligação à alfa-sinucleína e/ou ensaios para medir a inibição da alfa-sinucleína para formar fibrilas na presença do anticorpo ou fragmento do mesmo.
[0104] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três de uma cadeia pesada e três de uma cadeia leve. Geralmente, as CDRs estão em uma estrutura e juntas formam uma região variável. Por convenção, as CDRs na região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno são referidas como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 e nas regiões variáveis da cadeia leve como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Elas são numeradas sequencialmente na direção do N-terminal para o C-terminal de cada cadeia.
[0105] As CDRs são numeradas convencionalmente de acordo com um sistema desenvolvido por Kabat et al. Este sistema é estabelecido em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, NIH, EUA (daqui em diante “Kabat et al. (Supra)”). Esse sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo, exceto onde indicado em contrário.
[0106] As designações de resíduos Kabat nem sempre correspondem diretamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos adicionais do que na numeração estrita de Kabat, correspondente a um encurtamento ou inserção em um componente estrutural, seja estrutura ou região determinante de complementaridade (CDR), da estrutura básica de domínio variável. A numeração correta de resíduos de Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.
[0107] As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração Kabat. Contudo, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, AMJ Mol. Biol., 196, 901 a 917 (1987)), o laço equivalente a CDR- H1 se estende do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim, a menos que indicado de outra forma “CDR-H1”, conforme aqui utilizado, pretende referir-se aos resíduos 26 a 35, conforme descrito por uma combinação do sistema de numeração Kabat e definição de loop topológico de Chothia.
[0108] As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0109] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1, uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma CDR - L3 compreendendo SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR- H1 que compreende SEQ ID NO: 4, uma CDR- H2 que compreende a SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 que compreende SEQ ID NO: 6.
[0110] Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende a SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 que compreende SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 9.
[0111] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 compreendendo a SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 que compreende SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6.
[0112] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 compreendendo a SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 que compreende SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 9.
[0113] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode compreender as regiões estruturais do animal no qual o anticorpo foi criado. Por exemplo, se o anticorpo foi criado em coelho, ele compreenderá as CDRs como definidas acima e as regiões estruturais do anticorpo de coelho, como um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 11 (cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 12) e uma região variável de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 13 (cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 14).
[0114] Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou um fragmento do mesmo.
[0115] Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinante. O DNA pode ser modificado substituindo a sequência de codificação por cadeias L e H humanas pelas regiões H e L correspondentes não humanas (por exemplo, murinas) correspondentes (Morrison; PNAS 81, 6.851 (1984)).
[0116] Os anticorpos humanos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são “o produto de” ou “derivadas” de uma sequência germinativa específica se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento total do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico carregando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou rastrear uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana exibida no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano ou fragmento do mesmo que é “o produto de” ou “derivado de” uma sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal comparando a sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas da linhagem germinativa humana e selecionando a sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana mais próxima em sequência (ou seja, maior % de identidade) da sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é “o produto de” ou “derivado de” uma sequência de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana específica pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a sequência da linhagem germinativa, devido, por exemplo, a mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou à introdução intencional de mutação sítio-dirigida. No entanto, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina humana de linhagem germinativa e contém os resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com a imunoglobulina da linhagem germinativa de sequências de aminoácidos de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência germinativa humana específica não exibirá mais do que diferenças de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais que 5, ou mesmo não mais que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa.
[0117] Os anticorpos humanos podem ser produzidos por um número de métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os anticorpos humanos podem ser produzidos pelo método do hibridoma usando linhagens celulares de mieloma humano ou heteromieloma de camundongo-humano (Kozbor, J. Immunol; (1984) 133: 3001; Brodeur, Monocional Isolated Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63, Marcel Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fagos ou camundongos transgênicos, ambos os quais utilizam repertórios de regiões variáveis humanas (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:
433 a 455, Green LL, (1999) J Immuno!l Methods 231:1 1 a 23).
[0118] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a divulgação são humanizados.
[0119] Portanto, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo liga a alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e lili. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0120] em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é humanizado. De um modo preferencial, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo impede agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína, e mais de preferência, liga-se à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência a SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0121] Na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) ou arginina (Arg; R). Independentemente, na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) ou asparagina (Asn; N) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N) ou histidina (His; H).
[0122] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0123] e evitaa agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N).
[0124] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo liga a alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e lili. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6
[0125] e evita a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y 125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131.
[0126] Como aqui utilizado, o termo anticorpo “humanizado” ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que a cadeia pesada e/ou cadeia leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, caso se pretenda, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo não humano, como um anticorpo monoclonal de murino ou coelho) enxertado em uma estrutura de região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, consulte Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535 a 539, 1998. Em uma modalidade, em vez de toda a CDR ser transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinantes da especificidade de qualquer uma das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpos humanos (ver, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25 a 34). Em uma modalidade, apenas os resíduos determinantes da especificidade de uma ou mais das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano. Em outra modalidade, apenas os resíduos determinantes da especificidade de cada uma das CDRs descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano.
[0127] Quando as CDRs são enxertadas, qualquer sequência de estrutura de região variável aceitadora apropriada pode ser usada tendo em conta a classe/tipo de anticorpo doador do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões de estrutura de camundongo, primata e humana.
[0128] Adequadamente, o anticorpo humanizado, de acordo com a presente invenção, tem um domínio variável que compreende regiões estruturais aceitadoras humanas, bem como uma ou mais das CDRs fornecidas aqui especificamente. Assim, é fornecido em uma modalidade um anticorpo humanizado de bloqueio que se liga à alfa-sinucleína, de preferência alfa-sinucleína humana, em que o domínio variável compreende regiões estruturais aceitadoras humanas e CDRs dadoras não humanas.
[0129] Exemplos de estruturas humanas que podem ser utilizadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, UE, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., Supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e UE, LAY e POM podem ser usados para a cadeia pesada e a cadeia leve. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências de linhagem germinativa humana; essas estão disponíveis em: http://www.imgt.org/.
[0130] Em um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, as cadeias pesada e leve do aceitador não precisam necessariamente ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compostas com regiões estruturais derivadas de cadeias diferentes.
[0131] Uma região estrutural adequada para a cadeia leve do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é derivada da linhagem germinativa humana IGKV1-16 JK4 com a SEQ ID NO: 39 e cuja sequência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID NO: 40.
[0132] Uma região estrutural adequada para a cadeia pesada do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é derivada da linhagem germinativa humana IGHV3-23 JH4 com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 41 e cuja sequência nucleotídica é mostrada na SEQ ID NO: 42.
[0133] Por conseguinte, em uma modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende: - a sequência dada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para CDRL3, em que a luz a região da estrutura da cadeia é derivada da linhagem germinativa humana IGKV1-16 JKA4; e - a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 para CDR-H3, em que a região da estrutura da cadeia pesada é derivada da linhagem germinativa humana IGHV3-23 JHA4.
[0134] No anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, as regiões estruturais podem não ter as mesmas sequências exatas como aquelas do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos incomuns podem ser alterados para resíduos que ocorrem com mais frequência para essa classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões estruturais aceitadoras podem ser alterados de forma a corresponderem aos resíduos encontrados na mesma posição no anticorpo doador (ver Riechmann et al., 1998, Nature, 332, 323 a 324). Tais alterações devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões da estrutura aceitadora que podem precisar ser alteradas é apresentado no documento WOS91/09967.
[0135] Assim, em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos na estrutura são substituídos por um resíduo de aminoácido alternativo.
[0136] Por conseguinte, em uma modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que pelo menos os resíduos em cada uma das posições 48 e 72 do domínio variável da cadeia leve (com referência à SEQ ID NO: 15 ou 19) são resíduos dadores, ver, por exemplo, as sequências apresentadas na SEQ ID NO: 15, 17, 19 e 21. De preferência, o resíduo 48 do domínio variável da cadeia leve é glutamina e/ou o resíduo 72 do domínio variável da cadeia leve é glutamina.
[0137] Mais preferencialmente, os resíduos 48 e 72 são ambos glutamina na região variável de cadeia leve humanizada do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção.
[0138] Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que pelo menos os resíduos em cada uma das posições 24, 47, 48, 49, 73 e 97 (com referência à SEQ ID NO: 31 ou 35) ou 24, 47, 48, 49, 78 e 97 do domínio variável da cadeia pesada (com referência à SEQ ID NO: 23 e 27) são resíduos doadores, ver, por exemplo, as sequências dadas nas SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 e 37.
[0139] De preferência, o resíduo 24 do domínio variável da cadeia pesada é valina e/ou o resíduo 47 do domínio variável da cadeia pesada é tirosina e/ou o resíduo 48 do domínio variável da cadeia pesada é isoleucina e/ou o resíduo 49 do domínio variável da cadeia pesada é glicina e/ou o resíduo 97 do domínio variável da cadeia pesada é arginina e/ou o resíduo 73 do domínio variável da cadeia pesada é serina e/ou o resíduo 78 do domínio variável da cadeia pesada é valina.
[0140] De preferência, o resíduo 24 é valina, o resíduo 47 é tirosina, o resíduo 48 é isoleucina, o resíduo 49 é glicina, o resíduo 73 é serina e o resíduo 97 é arginina na região variável de cadeia pesada humanizada de acordo com a presente invenção. Além disso, de preferência, o resíduo 24 é valina, resíduo 47 é tirosina, resíduo 48 é isoleucina, resíduo 49 é glicina, resíduo 78 é valina e o resíduo 97 é arginina na região variável de cadeia pesada humanizada do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção.
[0141] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 31.
[0142] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: - uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23; ou - uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27 ou 35; ou - uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou 31; ou - uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27 ou
35.
[0143] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma sequência 80% semelhante ou idêntica a uma sequência aqui divulgada, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% sobre parte ou a totalidade da sequência relevante, por exemplo, uma sequência de domínio variável, uma sequência de CDR ou uma sequência de domínio variável, excluindo as CDRs. Em uma modalidade, a sequência relevante é a SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a sequência relevante é SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31.
[0144] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana compreendendo uma cadeia leve, em que o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 e/ou o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou semelhança com a sequência dada nas SEQ ID NOs: 31, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35.
[0145] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana, em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um domínio variável da cadeia leve que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% semelhante ou idêntico à sequência dada na SEQ ID NO: 15, mas em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo possui a sequência dada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para CDR-L3.
[0146] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína humana, em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um domínio variável da cadeia pesada que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou 99% semelhante ou idêntico à sequência dada na SEQ ID NO: 31, mas em que o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem a sequência dada em SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 para CDR-H3.
[0147] “Identidade”, como usado aqui, indica que em qualquer posição específica nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. “Similaridade”, como usado aqui, indica que, em qualquer posição específica nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Por exemplo, a leucina pode ser substituída por isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que geralmente podem ser substituídos um pelo outro incluem, mas não estão limitados a: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com cadeias laterais aromáticas); - lisina, arginina e histidina (aminoácidos com cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos com cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos com cadeias laterais de amida); e - cisteina e metionina (aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre).
[0148] Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, AM, e Griffin, HG, eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M Stockton Press, Nova York, 1991, o software BLAST TV disponível na NCBI (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403 a 410; Gish, W. & States, DJ 1993, Nature Genet. 3: 266 a 272. Madden, TL et al., 1996, Meth. Enzymol. 266: 131 a 141; Altschul, SF et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402; Zhang, J. & Madden, TL 1997, Genome Res. 7: 649 a 656).
[0149] Em uma modalidade, o fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a presente invenção, pode ser, mas não está limitado a, um Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, dsscFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos itens acima (ver, por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech.23 (9): 1.126 a 1.136; Adaire Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2 (3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos documentos WO2005/003169, WOZ2005/003170 e WOZ2005/003171. Anticorpos multivalentis podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecíficos ou podem ser monoespecíficos (ver, por exemplo, WOS92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 e WO2010/035012).
[0150] Um fragmento de ligação a antígeno alternativo compreende um Fab ligado a dois scFvs ou dsscFvs, cada scFv ou dsscFv se liga ao mesmo alvo ou a um alvo diferente (por exemplo, um scFv ou dsscFv se liga a um alvo terapêutico e um scFv ou dsscFv que aumenta a meia-vida ao se ligar, por exemplo, à albumina). Tais fragmentos de anticorpo são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2015/197772, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade e particularmente no que diz respeito à discussão de fragmentos de anticorpo.
[0151] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, é parte de uma proteína de fusão que se liga à alfa-sinucleína, que compreende, por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno fundidos da presente invenção, por exemplo, como um fragmento Fab ou Fab', e um ou dois anticorpos de domínio único (dAb) ligados direta ou indiretamente a eles, por exemplo, como descrito nos documentos WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, WO2011/061492 e WO2011/086091, todos aqui incorporados por referência. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende dois anticorpos de domínio, por exemplo, como um emparelhamento pesado variável (VH) e leve variável (VL), opcionalmente ligado por uma ligação dissulfeto.
[0152] Em uma modalidade, o elemento Fab ou Fab' da proteína de fusão tem a especificidade igual ou similar ao anticorpo ou anticorpos de domínio único. Em uma modalidade, o Fab ou Fab' tem uma especificidade diferente para o anticorpo ou anticorpos de domínio único, ou seja, a proteína de fusão é multivalente. Em uma modalidade, uma proteína de fusão multivalente de acordo com a presente invenção possui um local de ligação à albumina, por exemplo, um par VH/VL no mesmo fornece um local de ligação à albumina.
[0153] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados levando em conta a função proposta da molécula de anticorpo e, em particular, as funções efetoras que podem ser necessárias. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios IgA,
1gD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, podem ser utilizados domínios da região constante de IgG humana, especialmente dos isotipos IGG1 e IgG3, quando a molécula de anticorpo se destina a usos terapêuticos e são necessárias funções efetoras de anticorpos. Alternativamente, os isotipos IgG2 e IgG4 podem ser utilizados quando a molécula de anticorpo se destina a fins terapêuticos e as funções efetoras de anticorpos não são necessárias. Será apreciado que variantes de sequência desses domínios de região constante também podem ser usadas. Por exemplo, moléculas de IgG4 nas quais a serina na posição 241 foi alterada para prolina como descrito em Angal et al. (Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105 a 108) e aqui denominada IgG4P, podem ser usadas.
[0154] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, de preferência selecionado a partir de uma IgG1 e IgG4 ou IgG4P.
[0155] Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado de comprimento total que se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0156] em que o anticorpo humanizado impede a agregação de alfa-sinucleíina induzida por fibrilas de alfa-sinucleína e, de preferência, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132 e em que o anticorpo é uma isoforma de IGG4P.
[0157] Na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N) ou arginina (Arg; R). Independentemente, na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) ou asparagina (Asn; N) e na SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N) ou histidina (His; H).
[0158] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo humanizado de comprimento total que se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e lili. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi, uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46
[0159] e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e, de preferência, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132 e em que o anticorpo é uma isoforma de IgG4P, em que na SEQ ID NO: 44, Xaa é asparagina (Asn; N), na SEQ ID NO: 45, Xaa é serina (Ser; S) e em SEQ ID NO: 46, Xaa é asparagina (Asn; N).
[0160] Em uma modalidade mais preferencial, o anticorpo humanizado de comprimento total que liga a alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6
[0161] e impede a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e, de preferência, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129,
E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0162] Será também entendido por um especialista na técnica que os anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-tradução. O tipo e extensão dessas modificações geralmente dependem da linhagem de células hospedeiras usadas para expressar o anticorpo, bem como das condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação da metioninay formação de dicetopiperazina, isomerização do aspartato e desamidação da asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico do terminal carbóxi (como lisina ou arginina) devido à ação das carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129 a 134, 1995). Por conseguinte, a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo pode estar ausente.
[0163] Em uma modalidade, um aminoácido C-terminal do anticorpo é clivado durante modificações pós-tradução.
[0164] Em uma modalidade, um aminoácido N-terminal do anticorpo é clivado durante modificações pós-tradução.
[0165] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo IgG 4 de comprimento total compreendendo uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo Ig9gG4 de comprimento total que compreende uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 33. Em ainda outra modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab' que compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31.
[0166] Em outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO:
27 ou SEQ ID NO: 35. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgG 4 de comprimento total compreendendo uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35. Em outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo I9gG4 de comprimento total compreendendo uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 37. Em ainda outra modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab' compreendendo uma região variável leve de acordo com a SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada selecionada de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35.
[0167] Em outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgG de comprimento total compreendendo uma leve cadeia de região variável de acordo com a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4 de comprimento total compreendendo uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 37. Em ainda outra modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab' que compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35.
[0168] Em outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgG4 de comprimento total compreendendo uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo IgG4 de comprimento total compreendendo uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 33. Em ainda outra modalidade, o fragmento de ligação a antígeno é um Fab' que compreende uma região variável de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 33.
[0169] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo se liga à alfa-sinucleína e é um anticorpo IgG4 de comprimento total que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 31. Mais preferencialmente, o anticorpo evita a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleina e, ainda mais preferencialmente, o anticorpo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0170] Em uma outra modalidade preferencial, o anticorpo se liga à alfa-sinucleína e é um anticorpo IgG4 de comprimento total que compreende uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:
33. Mais preferencialmente, o anticorpo impede a agregação de alfa-sinucleína induzida pelas fibrilas de alfa-sinucleína e, ainda mais preferencialmente, o anticorpo se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0171] Além disso, a presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que omite a ligação à alfa-sinucleína com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção.
[0172] Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compete pela ligação da alfa-sinucleína com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção através do bloqueio cruzado ou sendo bloqueado pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção; e, em particular, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 ou
SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19.
[0173] Em outra modalidade, o anticorpo ou de ligação ao antígeno de um seu fragmento compete para ligação ing alfa-sinucleína no mesmo epopo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a presente invenção e, em particular, compete com um anticorpo ou de ligação do antígeno fragmento do mesmo com uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19 e para ligar a alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, pelo menos os resíduos M127, P128, S129, E130 e E131, de preferência os resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131.
[0174] Em uma modalidade, esse anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compete com os anticorpos ou seus fragmentos de acordo com a presente invenção e tem uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35; e/ou tem uma região variável de cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19.
[0175] Os anticorpos competidores podem ser identificados utilizando qualquer método adequado na técnica, por exemplo, utilizando ensaios ELISA ou BlAcore de competição em que a ligação do anticorpo de bloqueio cruzado para alfa-sinucleina humana impede a ligação de um anticorpo da presente invenção ou vice-versa. Tais ensaios competidores podem utilizar alfa-sinucleína natural ou recombinante isolada ou uma proteína/polipeptídeo de fusão adequada. Em um exemplo, a competição é medida utilizando alfa-sinucleína humana recombinante (SEQ ID NO: 10). Em um exemplo, a alfa-sinucleína humana recombinante marcada no N- terminal ou no C- terminal (por exemplo, uma fusão de etiqueta de 6xHis com um sítio de reconhecimento de TEV) é usada como nos exemplos aqui apresentados. Em outro exemplo, a competição é medida usando fibrilas de alfa-sinucleina humana recombinantes.
[0176] Em uma modalidade, os anticorpos competidores são totalmente humanos ou humanizados. Em uma modalidade, os anticorpos competidores têm uma afinidade por alfa-sinucleína humana de 100 pM ou menos, preferencialmente 50 pM ou menos.
[0177] As moléculas biológicas, como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, dando assim à molécula uma carga líquida positiva ou negativa. A quantidade total de carga “observada” dependerá da sequência absoluta de aminoácidos da entidade, do ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D e das condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pi) é o pH no qual uma determinada molécula ou superfície acessível ao solvente não carrega carga elétrica líquida. Em um exemplo, o anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ser manipulado para ter um ponto isoelétrico apropriado. Isso pode levar a anticorpos e/ou fragmentos com propriedades mais robustas, em particular perfis de solubilidade e/ou estabilidade adequados e/ou características de purificação melhoradas.
[0178] Assim, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleina e é manipulado para ter um ponto isoelétrico diferente daquele do anticorpo originalmente identificado. O anticorpo pode, por exemplo, ser manipulado substituindo um resíduo de aminoácido, como a substituição de um resíduo de aminoácido ácido por um ou mais resíduos de aminoácidos básicos. Alternativamente, os resíduos de aminoácidos básicos podem ser introduzidos ou os resíduos de aminoácidos ácidos podem ser removidos. Alternativamente, se a molécula tiver um valor de pl inaceitavelmente alto, resíduos ácidos podem ser introduzidos para diminuir o pl, conforme necessário. É importante que, ao manipular o pl, seja tomado cuidado para reter a atividade desejável do anticorpo ou fragmento. Assim, em uma modalidade, o anticorpo manipulado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade que o anticorpo ou fragmento “não modificado”.
[0179] Programas como **EXxPASY http://www.expasy.ch/tools/pi tool.html e http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d abim/compo-p.html, podem ser usados para prever o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.
[0180] Será apreciado que a afinidade dos anticorpos fornecidos pela presente invenção pode ser alterada usando qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção, portanto, também se refere a variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que possuem uma afinidade melhorada pela alfa- sinucleína, em particular pela alfa-sinucleína humana. Tais variantes podem ser obtidas por vários protocolos de maturação por afinidade, incluindo a mutação das CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392 a 403, 1995), embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779 a 783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359 a 368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724 a 733, 1997), exibição de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77 a 88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288 a 291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute esses métodos de maturação por afinidade.
[0181] Dentro da presente invenção, a maturação por afinidade foi realizada por IOTA (WO2014198951).
[0182] Se desejado, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ser conjugado com uma ou mais moléculas efetoras. Será apreciado que a molécula efetora pode compreender uma única molécula efetora ou duas ou mais dessas moléculas ligadas de modo a formar uma porção única que pode ser ligada aos anticorpos ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção. Onde se deseja obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isso pode ser preparado por procedimentos químicos ou de DNA recombinante padrão nos quais o fragmento de anticorpo está ligado diretamente ou através de um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para conjugar essas moléculas efetoras a anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2º Ed., Robinson et al., Eds., 1987, páginas 623 a 653; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119 a 158 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67 a 123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, os descritos nos documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03/031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo, a ligação pode ser alcançada usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito nos documentos WO 86/01533 e EP0392745.
[0183] O termo molécula efetora, conforme aqui utilizado, inclui, por exemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos, polímeros sintéticos ou naturais, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórteres, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR.
[0184] Exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos, incluindo qualquer agente que seja prejudicial (por exemplo, extermínio) para células. Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrina, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etomidina, etoposídeo, vinoposídeo, tenopositazina, ristidinas, hemiasterinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposidina, etoposídeo, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.
[0185] As moléculas efetoras também incluem, mas sem limitação, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomaniitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (11) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente, daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (dactinomicina (anteriormente, actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicina ou duocarmicina) e agentes antitimóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
[0186] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos quelados, como 111Ih e 90Y, Lu1i77, Bismuto213, Califórnio252, Irídio 192 e Tungstênio188/Rênio188; ou fármacos tais como, sem limitação, alquilfosfolininas, inibidores da topoisomerase |, taxoides e suramina.
[0187] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas sem limitação, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não estão limitados a, imunoglobulinas, toxinas, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína, tal como insulina, fator de necrose tumoral, a-interferão, B-interferão, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento derivado de plaquetas ou ativador de plasminogênio tecidual, um agente trombótico ou antiangiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina ou um modificador de resposta biológica, como uma linfoquina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônias de granulócitos de macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento de nervos (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.
[0188] —Outrasmoléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais emissores de pósitrons (para uso na tomografia por emissão de pósitrons) e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver geralmente a Patente nº US 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnóstico. Enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina;y materiais fluorescentes adequados incluem umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo e fitoeritina;y materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 1251, 1311, 111In e 99Tc.
[0189] Em outro exemplo, a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou melhorar a entrega de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imunológico. Exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação à albumina ou compostos de ligação à albumina, tais como os descritos no documento WO05/117984.
[0190] Quando a molécula efetora é um polímero, esse pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialgquenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramiíficada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramíificado ou não ramificado, por exemplo, um homo ou heteropolissacarídeo.
[0191] Substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.
[0192] Exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol), poli(propilenoglicol), álcool poli(vinílico) de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituídos ou seus derivados, especialmente poli(etilenoglicol) opcionalmente substituído, como metoxipoli(etilenoglicol) ou derivados do mesmo.
[0193] Polímeros específicos de ocorrência natural incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou seus derivados.
[0194] Em uma modalidade, o polímero é albumina ou um fragmento do mesmo, tal como albumina sérica humana ou um fragmento do mesmo.
[0195] “Derivados”, conforme aqui utilizado, pretende incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos a tiol, como maleimidas e similares. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento de ligação ao polímero. Será apreciado que o resíduo de um grupo desse tipo em alguns casos fará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.
[0196] O tamanho do polímero pode variar conforme desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50.000 Da, por exemplo, de 5.000 a 40.000 Da, como de 20.000 a 40.000 Da. O tamanho do polímero pode, em particular, ser selecionado com base no uso pretendido do produto, por exemplo, capacidade de localizar certos tecidos, como tumores ou prolongar a meia-vida circulante (para revisão, ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531 a 545). Assim, por exemplo, onde o produto se destina a deixar a circulação e penetrar nos tecidos, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de pequeno peso molecular, por exemplo, com um peso molecular de cerca de 5.000 Da. Para aplicações em que o produto permanece em circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de maior peso molecular, por exemplo, com um peso molecular na faixa de 20.000 Da a 40.000 Da.
[0197] Os políneros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um derivado do mesmo, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15.000 Da a cerca de 40.000 Da.
[0198] Em um exemplo, o antibiótico ou o fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, estão ligados a porções químicas de poli(etilenoglicol) (PEG). Em uma modalidade específica, o fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a presente invenção, e as moléculas de PEG podem ser ligados através de qualquer grupo funcional de cadeia lateral de aminoácidos ou de aminoácidos terminais disponíveis localizados no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser manipulados no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado, em que a modificação é a adição à extremidade C-terminal da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser ligada. Vários locais podem ser usados para conectar duas ou mais moléculas de PEG.
[0199] As moléculas de PEG adequadamente estão ligadas covalentemente através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser ligada covalentemente ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação dissulfeto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Quando um grupo tiol é utilizado como ponto de ligação de moléculas efetoras adequadamente ativadas, por exemplo, podem ser utilizados derivados seletivos de tiol, como maleimidas e derivados de cisteína. Um polímero ativado pode ser usado como material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímero, como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo tiol reativo tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinilsulfona, ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EUA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente usando procedimentos químicos convencionais. Moléculas particulares de PEG incluem metoxi-PEG-amina 20K (obtidas junto à Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M- PEG-SPA (obtidas junto à Nektar, anteriormente Shearwater).
[0200] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab modificado, fragmento Fab' ou diFab que é PEGuilado, ou seja, possui PEG (poli(etilenoglicol)) covalentemente ligado a ele, por exemplo, de acordo com o método divulgado em EP 0948544 ou EP1090037 [ver também “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova lorque, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531 a 545]. Em um exemplo, o PEG está ligado a uma cisteína na região da dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG possui um grupo maleimida covalentemente ligado a um único grupo tiol em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser ligado um polímero metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab pode, portanto, ser de aproximadamente 40.000 Da.
[0201] Moléculas particulares de PEG incluem 2-[3-(N- maleimido)propionamido]etilamida de N N'-bis(metoxipoli(etilenoglicol) 20.000 MW) lisina modificada, também conhecida como PEG2MAL 40K (obtida junto à Nektar, anteriormente Shearwater).
[0202] Fontes alternativas de ligantes PEG incluem NOF que fornece GL2- 400MA3 (em que m na estrutura abaixo é 5) e GL2-400MA (em que mé 2) e né aproximadamente 450: H,CO-(CH,CH,O), ore H o AN (CH), SÓ, o AA mézou5
[0203] Ou seja, cada PEG é de cerca de 20.000 Da.
[0204] Assim, em uma modalidade, o PEG é 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-f[3- (6-maleimido-1-ox0-hexil)amino]propiloxiXhexano (o PEG ramiíificado com 2 braços, - CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40.000, conhecido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.
[0205] Moléculas efetoras de PEG alternativas adicionais do seguinte tipo:
CH,O-(CH,CH,O)N o ) | CH,O-(CH,CH,O)N o
[0206] estão disponíveis junto a Dr. Reddy, NOF e Jenkem.
[0207] Em uma modalidade, o Fab ou Fab' de acordo com a presente invenção é conjugado com uma molécula de PEG.
[0208] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo que é PEGuilado (por exemplo, com um PEG aqui descrito), ligado através de um resíduo de aminoácido cisteína no ou próximo ao aminoácido 226 na cadeia, por exemplo, aminoácido 226 da cadeia pesada (por numeração sequencial), por exemplo, aminoácido 223 da SEQ ID NO: 33.
[0209] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece uma molécula Fab'PEG compreendendo um ou mais polímeros de PEG, por exemplo, 1 ou 2 polímeros, como um polímero ou polímeros de 40 kDa.
[0210] As moléculas Fab'-PEG de acordo com a presente divulgação podem ser particularmente vantajosas pelo fato de terem uma meia-vida independente do fragmento Fc. Em uma modalidade, é fornecido um Fab' conjugado com um polímero, tal como uma molécula de PEG, uma molécula de amido ou uma molécula de albumina. Em uma modalidade, é fornecido um scFv conjugado com um polímero, como uma molécula de PEG, uma molécula de amido ou uma molécula de albumina. Em uma modalidade, o Fab ou Fab' de acordo com a presente divulgação é conjugado à albumina sérica humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento é conjugado com uma molécula de amido, por exemplo, para aumentar a meia-vida. Métodos de conjugação de amido a uma proteína como descrito no documento US
8.017.739 são aqui incorporados por referência.
[0211] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção. O polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzido por processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos.
[0212] Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar codificação de sequências de DNA para o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte, utilizando técnicas de síntese de oligonucleotídeos. As técnicas de mutagênese sítio-dirigida e de reação em cadeia polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriado.
[0213] Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; ou ii. compreende SEQ ID NO: 16 ou 20; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou ii. compreende SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; c. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; ou ii. compreende SEQ ID NO: 18 ou 22; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou ii. compreende SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; e. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 12; ou li. compreende a SEQ ID NO: 12; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 12; f. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 14; ou ii. compreende SEQ ID NO: 14; ou iii. consiste essencialmente na SEQ ID NO: 14.
[0214] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia pesada de um fragmento de anticorpo Fab' ou de um anticorpo IgG1 ou IgG4 da presente invenção que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 24, 28, 32 ou 36. Também é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia leve de um fragmento de anticorpo Fab' ou de um anticorpo IgG1 ou IgG4 da presente invenção que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 16 ou
20.
[0215] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo IgG4(P) da presente invenção, no qual o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 26, 30, 34 ou 38 e o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 18 ou 22.
[0216] A presente invenção também fornece um vetor de clonagem ou expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos aqui descritos. Em um exemplo, o vetor de clonagem ou expressão de acordo com a presente invenção compreende um ou mais polinucleotídeos isolados compreendendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 ou 38.
[0217] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção e os métodos de cultura são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A esse respeito, é feita referência a “Current Protocols in Molecular Biology", 1999, FM Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova York e ao Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.
[0218] Também é fornecida uma célula hospedeira compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas isoladas de acordo com a invenção ou um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas isoladas que codificam um anticorpo da presente invenção. Qualquer célula hospedeira/sistema vetorial adequado pode ser utilizado para expressão das sequências polinucleotídicas que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção. Podem ser utilizados sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos ou sistemas eucarióticos, por exemplo, mamíferos, de expressão de células hospedeiras. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, mieloma ou hibridoma.
[0219] Tipos adequados de ovário de hamster chinês (células CHO) para uso na presente invenção podem incluir células CHO e CHO-K1 incluindo células dhfr-CHO, como células CHO-DG44 e células CHO-DXB11 e que podem ser usadas com um marcador selecionável DHFR ou células CHOK1-SV que podem ser usadas com um marcador selecionável de glutamina sintetase. Outros tipos de células utilizados na expressão de anticorpos incluem linhagens celulares linfocíticas, por exemplo, células de mieloma NSO e células SP2, células COS. A célula hospedeira pode ser transformada ou transfectada estavelmente com as sequências polinucleotídicas isoladas ou os vetores de expressão de acordo com a presente invenção.
[0220] Em uma modalidade, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção é uma célula CHO-DG44 transfectada de maneira estável com vetores de expressão compreendendo as sequências polinucleotídicas isoladas da presente invenção, de preferência compreendendo as sequências polinucleotídicas isoladas de acordo com a SEQ ID NO: 18 e 26 ou SEQ ID NO: 18 e 34 ou SEQ ID NO: 18 e 30 ou SEQ ID NO: 18 e 38.
[0221] A presente invenção também fornece um processo para a produção de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com invenção e isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0222] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso em que apenas uma sequência de codificação de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreende cadeias pesadas e leves, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor, incluindo o vetor que codifica sequências que codificam polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.
[0223] Assim, é fornecido um processo para cultivar uma célula hospedeira e expressar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, isolando o último e opcionalmente purificando-o para fornecer um anticorpo ou fragmento isolado. Em uma modalidade, o processo compreende ainda a etapa de conjugar uma molécula efetora ao anticorpo ou fragmento isolado, por exemplo, conjugando-se com um polímero de PEG, em particular, como aqui descrito.
[0224] — Assim, em uma modalidade, é fornecido um anticorpo anti-alfa-sinucleína purificado ou fragmento do mesmo, por exemplo, um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, em particular um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a invenção, em uma forma substancialmente purificada, em particular livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteína ou DNA da célula hospedeira.
[0225] Substancialmente livre de endotoxina pretende-se geralmente referir-se a um teor de endotoxina de 1 UE por mg de produto de anticorpo ou menos, como 0,5 ou 0,1 UE por mg de produto.
[0226] Substancialmente livre de proteína ou DNA da célula hospedeira,
geralmente se refere ao teor da proteína e/ou de DNA da célula hospedeira de 400 ug por mg de produto de anticorpo ou menos, como 100 ug por mg ou menos, em particular 20 ug por mg, conforme apropriado.
[0227] Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento, diagnóstico e/ou profilaxia de uma condição patológica, como uma Aalfa- sinucleinopatia, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, em combinação com um ou mais de um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0228] De preferência, a composição farmacêutica ou de diagnóstico compreende um anticorpo humanizado que se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 46.
[0229] Mais preferencialmente, a composição farmacêutica ou de diagnóstico compreende um anticorpo humanizado que se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 6.
[0230] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção é o único ingrediente ativo. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção está em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais. Alternativamente, as composições farmacêuticas compreendem o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção, que é o único ingrediente ativo, e que podem ser administradas individualmente a um paciente em combinação (por exemplo, simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, fármacos ou hormônios.
[0231] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 15 ou 19 e compreendendo uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23, 27, 31 ou 35, por exemplo, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 31.
[0232] De preferência, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína e compreende uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 31.
[0233] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas adequadamente a um paciente para identificar a quantidade terapeuticamente eficaz necessária. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição direcionada, ou exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Essa informação pode então ser usada para determinar doses e vias úteis para administração em humanos.
[0234] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade,
peso e gênero do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação (ou combinações) de medicamentos, sensibilidades da reação e tolerância/resposta à terapia. Esse valor pode ser determinado por experimentação de rotina e está sob julgamento do médico responsável. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, como 100 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.
[0235] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos como água, solução salina, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias tampão de pH, podem estar presentes nessas composições. Tais carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente.
[0236] Formas adequadas para administração incluem formas adequadas para administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua, na forma intravenosa, inalável ou subcutânea. Quando o produto é para injeção ou infusão, pode adotar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservação, estabilização e/ou dispersantes. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado. Formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.
[0237] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Por conseguinte, é aqui fornecido o uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento.
[0238] Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. Preferencialmente, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são adaptadas para administração a seres humanos.
[0239] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção fornece o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso em terapia, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à sinucleína alfa e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi, uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 46,
[0240] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e evita a agregação de alfa-sinucleina induzida por fibrilas de alfa- sinucleina, e mais preferencialmente se liga à alfa-sinucleina a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E 123, Y 125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0241] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso em terapia, é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à sinucleíina alfa e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 6.
[0242] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e evita a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleina e, mais preferencialmente, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0243] Em particular, o uso em terapia compreende o uso no tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias.
[0244] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece para um método de tratamento de uma ou mais sinucleinopatias em um paciente que compreende a administração ao dito paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, ou de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a.uma região variável de cadeia leve que compreende: i. uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: iv. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; v. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e vi. uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 46.
[0245] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e evita a agregação de alfa-sinucleina induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e, mais preferencialmente, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0246] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso no tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0247] Preferencialmente, esse anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e evita a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa-sinucleína e, mais preferencialmente, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0248] Em outra modalidade preferencial, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias em um paciente que compreende administração ao dito paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, ou de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0249] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humanizado e evita a agregação de alfa-sinucleína induzida por fibrilas de alfa- sinucleína e, mais preferencialmente, se liga à alfa-sinucleína a um epítopo que compreende, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que o epítopo opcionalmente compreende A124 e G132.
[0250] Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso em terapia ou para uso no tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias e é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou
19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 35; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 ou SEQID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 37.
[0251] Em outra modalidade da presente invenção, o método de tratamento de uma ou mais alfa-sinucleinopatias em um paciente compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ |D NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 35; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 ou SEQID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 37.
[0252] As alfa-sinucleinopatias de acordo com a presente invenção compreendem, mas sem limitação, doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1). De preferência, a ALFA-sinucleinopatia é a doença de Parkinson (DP).
[0253] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso no tratamento da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com Lewy corpos (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência a doença de Parkinson (DP), e é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0254] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é para uso no tratamento da doença de Parkinson (PD) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência doença de Parkinson (PD), e é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende:
a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 35; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 37.
[0255] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA), e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência doença de Parkinson (DP), a um paciente que compreende a administração ao dito paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0256] Em outra modalidade, o método de tratamento da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência doença de Parkinson (PD), em um paciente compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 ou 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 35; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 ou SEQID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 37.
[0257] Alternativamente, a invenção também fornece o uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma alfa-sinucleinopatia, em que a alfa-sinucleinopatia é preferencialmente a doença de Parkinson (PD) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DCL), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), mais preferencialmente doença de Parkinson (PD), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0258] Também faz parte da presente invenção o uso dos anticorpos anti-alfa- sinucleína ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo para uso como agentes diagnosticamente ativos ou em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar alfa-sinucleinopatias, tais como a doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DCL), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).
[0259] O diagnóstico pode ser realizado preferencialmente em amostras biológicas. Uma “amostra biológica” abrange uma variedade de tipos de amostra obtidos de um indivíduo e pode ser usada em um teste de diagnóstico ou monitoramento. A definição abrange líquido cefalorraquidiano, sangue como plasma e soro e outras amostras líquidas de origem biológica, como urina e saliva, amostras de tecido sólido, como uma amostra de biópsia ou culturas de tecidos ou células derivadas dele e sua progênie. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer forma após sua aquisição, como por tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento para certos componentes, como polinucleotídeos.
[0260] O teste de diagnóstico pode, de preferência, ser realizado em amostras biológicas que não estão em contato com o corpo humano ou animal. Esses testes de diagnóstico também são chamados de testes in vitro. O teste de diagnóstico in vitro pode depender de um método in vitro de detecção de alfa-sinucleína em uma amostra biológica que foi obtida de um indivíduo que compreende as etapas de i) contato da amostra biológica com anticorpo anti-alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como descrito aqui; e ii) detecção da ligação do anticorpo anti- alfa-sinucleína ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo à alfa-sinucleína. Ao comparar o nível de alfa-sinucleína detectado ou a presença de uma forma específica de alfa-sinucleína pós-traducional com um controle adequado, uma ou mais alfa- sinucleinopatias podem ser identificadas. Esse método de detecção pode, portanto, ser usado para determinar se um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma alfa-sinucleinopatia, incluindo a determinação do estágio (gravidade) de uma alfa- sinucleinopatia.
[0261] Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso no diagnóstico de alfa-sinucleinopatias, preferencialmente no diagnóstico ou na doença de Parkinson, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 44; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID
NO: 45 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 46.
[0262] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para uso no diagnóstico de alfa-sinucleinopatias, preferencialmente no diagnóstico ou doença de Parkinson, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à alfa-sinucleína e compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável! de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma região variável pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou c. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33.
[0263] As sequências incluídas na presente invenção são mostradas na Tabela 1: TABELA 1 Nome SEQ ID NO: | SEQUÊNCIA CDR-H2 5 AIYASGSTYYASWAKG corr fe Treo CDR-L1 7 QASQSVYKNRYLA
EM CDR-H2 AIYASGNTYYASWAKG 2 [RA o mesa
| N102H | | Alfa- MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEG sinucleína VLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVT humana GVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQ P37840 EGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA VvL de | 11 AIVMTQTPSSKSVAVGDTVTINCQASQSVYKNNYLAW coelho FQOQKPGQPPKQLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFT
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DLKMTSLTTEDTATYFCARIHYGNSGGLWGQGTLVTV ss Nucleotíde | 14 Cagtcggtagaggagtcegggggtegectagtcacgcetaggacaceccet o de VH de gacactcacctgcacagtctetagaategaccteagtagecacgacatgtat coelho taggtecgecaggactecagggaaggggctagaatacattggagccatttat gctagtagtagcacatactacgcegagctaggcgaaagaccgattcaccat ctccaagacctegaccacgagtagatctgaaaatgaccagtctgacaaceg aggacacggccacctatttetataccagaattcattatagtaatagtggtagot tagtggggccaaggacaccctagtcacegtetegagt VL de 6470 | 15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCAOASQSVYKNNYLAW as O ravoanancimasorrscscsrar
LTISSLAOPEDFATYYCAGYKGGRNDGFAFGGGTKVEI o Nucleotíde | 16 Gacattcagatgacccagteccectteateactatecgegagegtaggegac o de VL de agagtgaccattacgtgccaagecagcecagtcegtgtacaagaacaacta 6470 gL3 cetggectagttecagcaaaagecegggaaggegecaaaacagoettatct acggtacatccactetegectegggagtgcegagecgcettetegggatetag gtceggaacteagtteacectgactatetegtecetacaaceegaggattteg ccacctactactacgccggctataagggaggacagaacgacagcettegoctt ttagtggaggcaccaaggategaaatcaag Cadeia 17 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCOASQSVYKNNYLAW leve de FQQKPGKAPKQLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTQFT 6470 gL3 LTISSLQOPEDFATYYCAGYKGGRNDGFAFGGGTKVEI
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DR Nucleotíde | 20 Gacattcagatgacccagteccectteateactatecgegagegtaggegac o N33R de agagtgaccattacgtgccaagecagecagtccegtgtacaagaacegttac VL de 6470 ctggcctagttecagcaaaagecegggaaggegecaaaacagcttateta gL3 cggtacatccactetegectegggagtgcegagecgcttetegggatetaga tccggaactcagttcacectgactatctegtecetacaaceegaggatttege cacctactactgcgceggcetataagggaggacggaacgacagettcgctttt ggtggaggcaccaaggategaaatcaag N33R dej21 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCOASQSVYKNRYLAW cadeia leve FQQKPGKAPKQLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTQFT de 6470 LTISSLQOPEDFATYYCAGYKGGRNDGFAFGGGTKVEI gL3 KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
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[0264] Ainvenção será agora descrita adicionalmente por meio de exemplos com referências a modalidades ilustradas nos desenhos anexos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: EXPRESSÃO DE MONÔMERO E FIBRILAS DE ALFA-SINUCLEÍNA
HUMANA
[0265] Um gene que codifica a alfa-sinucleína humana foi gerado sinteticamente e subclonado no vetor pMH 10His TEV (contendo um promotor de CMV) usando técnicas padrão de biologia molecular, para criar um vetor projetado para produzir alfa- sinucleína com uma etiqueta 10His-TEV N-terminal. O vetor resultante foi transfectado para células Expi293F usando o sistema de expressão Expi293TM (Invitrogen), seguindo os protocolos do fabricante. A proteína alfa-sinucleína acumulada no meio de cultura de onde foi recuperada usando uma coluna excel HisTrap de cromatografia por afinidade de íons metálicos imobilizados (GE Healthcare). A coluna foi lavada com TrisHCI 25 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 e a proteína eluída com um gradiente escalonado de imidazol 500 MM no mesmo tampão. A etiqueta 10His foi removida utilizando protease de TEV. A amostra foi então concentrada e dessalinizada antes de reaplicar a proteína clivada à coluna excel HisTrap e coletar a alfa-sinucleina clivada no fluxo. A alfa-sinucleína foi ainda purificada por filtração em gel em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare) e a endotoxina foi removida por passagem sobre um cartucho Proteus NoEndo (Generon). A alfa-sinucleína purificada foi confirmada como monomérica por SEC MALS (Figura 1A).
[0266] A alfa-sinucleína humana do tipo selvagem (não etiquetada) também foi expressa em células Expi293F. A proteína foi recuperada do meio de cultura por troca aniônica usando uma coluna HiTrap Q (GE Healthcare). A coluna foi lavada com TrisHCI 20 mM, pH 8,0, e a proteína eluída usando um gradiente de cloreto de sódio a 400 mM. As frações foram concentradas e dessalinizadas passando por uma coluna HiPrep 26/10 (GE Healthcare) e eluídas com TrisHCI 20 mM, pH 8,0. A proteína foi ainda purificada usando uma coluna MonoQ 10/100GL, eluída com um gradiente de cloreto de sódio a 400 mM em TrisHCI 20 mM pH 8,0, seguida de filtração em gel em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare), com eluição em pH PBS 7,4 (Figura 1B).
[0267] Esse monômero de alfa-sinucleína do tipo selvagem (não etiquetado) foi usado para preparar as fibrilas de alfa-sinucleína obtidas por agitação do monômero de alfa-sinucleína recombinante purificado (9-10 mg/ml em PBS pH7,4) a 1.200 rom,
37 “C em uma incubadora com agitação Vortemp56 (Labnet) continuamente por 10 dias. A formação de fibrila foi avaliada pelo ensaio JC-1 (Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311 a 323) e espectroscopia de infravermelho por transformada C de Fourier da solução. O monômero não incorporado nas soluções de fibrila foi avaliado por ultracentrifugação e por passagem através de uma membrana de corte de 100 KDa seguida por eletroforese em gel. Somente fibrilas com resposta JC-1 >15, baixa quantidade de monômero solúvel (<5%) e espectro de FTIR com absorção principal entre 1.625 e 1.630 cm-1 foram utilizadas em estudos posteriores (Figura 2). As fibrilas preparadas foram armazenadas a -80 ºC. EXEMPLO 2: IMUNIZAÇÃO E ISOLAMENTO DE ANTICORPOS
[0268] Inúmeras estratégias de imunização usando várias espécies e imunógenos foram realizadas. O anticorpo 6470 foi derivado de um coelho branco fêmea da Nova Zelândia (>2 kg) que recebeu imunização subcutânea com uma proteína de fusão Fc de coelho, compreendendo resíduos de alfa-sinucleína humana 68-140 fundidos ao Fc de coelho Fc (SEQ ID NO: 43).
[0269] A proteína de fusão Fc de coelho alfa-sinucleína (68-140) para imunização foi expressa em células Expi293F, usando o Sistema de Expressão Expi293TM (Invitrogen), seguindo os protocolos do fabricante. A proteína foi purificada do sobrenadante por cromatografia de afinidade usando uma coluna MabSelectSure (GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com tampão 50 mM de glicina/glicinato de sódio pH 8,8 e eluída com um gradiente de ácido cítrico 0,1 M, pH 2,0, no mesmo tampão. As frações proteicas foram neutralizadas com Tris HCl 2M pH 8,5, concentradas e posteriormente purificadas por filtração em gel em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada e eluída em PBS pH 7,4. Os coelhos receberam uma imunização primária compreendendo 500 ug da proteína de fusão emulsionada em um volume igual de adjuvante de Freund completo (CFA). Os coelhos receberam 2 injeções de reforço a intervalos de 21 dias usando adjuvante incompleto de Freund (IFA), com sangramentos retirados da orelha 14 dias após a imunização. À terminação ocorreu 14 dias após o reforço final com suspensões monocelulares de baço, medula óssea e células mononucleares do sangue periférico preparadas e congeladas em dimetilsulfóxido a 10% (DMSO) no soro fetal de bezerro (FCS) a -80 ºC.
CULTURA DE CÉLULAS B
[0270] As culturas de células B foram preparadas usando um método semelhante ao descrito por Tickle et al., 2015. J Biomol Screen: 20 (4), 492 a 497. Resumidamente, as células B derivadas de linfonodos ou esplenócitos de animais imunizados foram cultivadas a uma densidade de aproximadamente 2.000 a 5.000 células por poço em placas de cultura de tecidos com 96 poços com código de barras e 200 ul/poço de meio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado com 10% de FCS (Sigma Aldrich), 2% de HEPES (Sigma Aldrich), 1% de L-glutamina (Gibco BRL), 1% de solução de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL), 0,1% de B-mercaptoetanol (Gibco BRL), 1% de sobrenadante PBMC humano ativado (BSS) e de células de timoma EL4 murino mutantes irradiadas com raios X (5x10%/poço) durante sete dias a 37 ºC em uma atmosfera de 5% de CO». As culturas foram estabelecidas utilizando células B a partir de todos os animais imunizados e, no total, cerca de 1,7x10º células B foram amostradas.
[0271] 6470, um anticorpo de acordo com a presente invenção, foi gerado a partir de células B derivadas de linfonodos ativados que foram cultivadas a uma densidade de aproximadamente 5.000 células por poço. O nódulo linfático foi utilizado em adição a esplenitos para a revelação de anticorpo para nos dar uma fonte alternativa de células B a partir da qual se fez a amostragem e identificação de novos anticorpos. Os anticorpos com sequências relacionadas foram identificados a partir de células B derivadas do linfonodo, mas não do baço. Foram amostradas aproximadamente 9,6x107 células do coelho imunizado com proteína alfa-sinucleína C- terminal humana.
TRIAGEM PRIMÁRIA
[0272] A presença de anticorpos humanos específicos da alfa-sinucleína nos sobrenadantes da cultura de células B foi determinada usando um ensaio de ligação à base de fluorescência homogêneo usando esferas Superavidin'y (Bangs Laboratories) revestidas com monômero de comprimento total da alfa-sinucleína humana recombinante biotinilada como fonte de antígeno-alvo. A alfa-sinucleína humana recombinante, tal como aqui descrita, foi biotinilada utilizando 3 vezes um excesso molar de biotina. Um baixo excesso molar de biotina foi utilizado para evitar a modificação completa de todos os sete resíduos de lisina que residem na molécula de alfa-sinucleína. O monômero de alfa-sinucleína foi incubado durante a noite a 40 ºC com a biotina e a biotina livre foi removida no dia seguinte utilizando uma coluna de dessalinização por rotação Zeba'Y. A triagem envolveu a transferência de 10 ul de sobrenadante a partir de placas de cultura de tecidos de 96 poços com código de barras em placas de ensaio com paredes pretas de 384 poços com código de barras contendo monômero de alfa-sinucleína humana recombinante biotinilada imobilizado em esferas de Superavidin (10 ul/poço) utilizando um manipulador de líquidos Agilent Bravo. A ligação foi revelada com um conjugado Alexafluor647 específico de Fcy de IgG anticoelho de cabra (Jackson). As placas foram lidas em um TTP Labtech Mirrorball, a fim de identificar poços contendo IgG específica de alfa-sinucleína.
TRIAGEM SECUNDÁRIA
[0273] Após a triagem primária, os sobrenadantes positivos foram consolidados em placas mestras com código de barras de 96 poços usando um robô coletor de Beckman Coulter BiomekNXP e células B em placas de cultura de células congeladas a -80 ºC. As placas mestras foram triadas em um ensaio ELISA de captura de estreptavidina utilizando monômero de alfa-sinucleina humana recombinante biotinilada ou fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante biotiniladas. Isso foi realizado para identificar poços que deram ligação à alfa-sinucleina humana recombinante monomérica e fibrilar e para excluir quaisquer poços falsos positivos mostrando ligação fora do alvo às esferas Superavidin'"". Dada a natureza insolúvel das fibrilas, os protocolos convencionais de revestimento ELISA, que são usados com proteínas em solução, não eram favorecidos. Foi decidido que um protocolo mínimo de biotinilação fosse empregado para preservar a estrutura fibrilar e facilitar o revestimento eficiente das fibrilas em uma placa ELISA pré-revestida com estreptavidina.
[0274] As fibrilas totais biotiniladas de alfa-sinucleína foram geradas, como aqui descrito, combinando o monômero de alfa-sinucleína recombinante biotinilado (como descrito acima) com um excesso de 50 vezes de alfa-sinucleína recombinante não marcada em PBS. A formação de fibrila foi confirmada pelo ensaio JC1 (Lee et al., Biochem. J. 2009, 418, 311 a 323).
[0275] O monômero biotinilado ou as fibrilas biotiniladas em PBS foram capturados em placas Maxisorp de 384 poços revestidas com estreptavidina em um tampão de revestimento de carbonato (dH2O + 0,16% de Na2COs + 0,3% de NaHCO;). As placas foram bloqueadas com 1% p/v de PEG/PBS e depois incubadas com 10 ul/poço de sobrenadante da cultura de células B (diluído 1:1 com tampão de bloqueio). O anticorpo de Fc de IgG anticoelho de cabra conjugado a HRP secundário (Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch) foi adicionado a placas, seguido de visualização da ligação com o substrato TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina, da EMD Millipore; 10 ul/poço). A densidade óptica foi medida em 630 nM usando o leitor de microplacas BioTek Synergy 2. O ensaio de ligação primário identificou 640 ocorrências e, após a triagem de ELISA, 491 dessas se mostraram ligadas à alfa- sinucleína humana recombinante monomérica e fibrilar.
[0276] Os sobrenadantes de células B que demonstram sinais mais fortes de ligação ELISA a fibrilas recombinantes foram selecionados para análise posterior por ressonância plasmônica de superfície para identificar aqueles com a melhor taxa de dissociação no monômero de alfa-sinucleína humana recombinante, fibrilas de alfa- sinucleína humana recombinantes e fibrilas de alfa-sinucleína recombinantes de camundongo. Os sobrenadantes a partir de 80 células B diferentes foram testados, nove poços deram taxas de dissociação (kd) <1x105 em fibrilas humanas recombinantes. Dessas, sete deram taxas de dissociação (kd) inferiores a 1x10º em fibrilas de camundongo recombinantes e duas deram taxas de dissociação (kd) inferiores a 1xX10º no monômero humano recombinante. Todos os nove sobrenadantes foram selecionados para recuperação de região variável.
RECUPERAÇÃO DE REGIÃO VARIÁVEL
[0277] Para permitir a recuperação dos genes da região variável de anticorpos a partir de uma seleção de sobrenadantes de interesse, uma etapa de deconvolução teve que ser realizada para permitir a identificação das células B específicas do antígeno em um determinado poço que continha uma população heterogênea de células B. Isso foi alcançado utilizando o método de focos fluorescentes (Clargo et al,
2014. MAbs: 6 (1), 143 a 159) Resumidamente, células B secretoras de imunoglobulina de um poço positivo foram misturadas com esferas de estreptavidina (New England Biolabs) revestidas com fibrlas de alfa-sinucleina humana recombinante biotiniladas (geradas usando a mistura 1:50 como descrito acima) e uma diluição final de 1:1.200 de um conjugado FITC específico de fragmento Fcy anticoelho de cabra (Jackson). Após a incubação estática a 37 ºC durante 1 hora, as células B específicas do antígeno podem ser identificadas devido à presença de um halo fluorescente que circunda essas células B. Vários desses clones individuais de células B, identificados usando um microscópio Olympus, foram então colhidos com um micromanipulador Eppendorf e depositados em um tubo de PCR.
[0278] Os genes da região variável do anticorpo foram recuperados a partir de células únicas por PCR de transcrição reversa (RT) usando iniciadores específicos da região variável de cadeia pesada e leve. Dois ciclos de PCR foram realizados com os sítios de restrição aninhados que incorporaram a segunda PCR nas extremidades 3' e 5', permitindo a clonagem da região variável em um vetor de expressão de mamífero de kapa de coelho (VL) e de IgG de coelho (VH). Os genes de anticorpos anti-alfa- sinucleína de 5 diferentes sobrenadantes foram clonados com sucesso em vetores de expressão. Os construtos de cadeia pesada e leve foram cotransfectados em células Expi-293 usando ExpiFectamine 293 (Invitrogen) e anticorpo recombinante expresso em balão Erlenmeyer de 125 ml em um volume de 30 ml. Após 5 a 7 dias de expressão, os sobrenadantes foram colhidos e purificados usando cromatografia de afinidade.
TRIAGEM ELISA DE SOBRENADANTES TRANSITÓRIOS
[0279] Os antibióticos purificados foram então submetidos à triagem adicional por ELISA. O monômero e fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante biotinilados foram capturados em placas Maxisorp de 384 poços (ThermoScientific/Nunc) revestidas com estreptavidina em tampão de revestimento de carbonato (dH2O0 + 0,16% de Na2CO;s + 0,3% de NaHCO;). Placas separadas também foram revestidas com um peptídeo biotinilado correspondente aos resíduos 117 a 126 da alfa- sinucleína humana de acordo com a SEQ ID NO: 10 (peptídeo PVDPDN EAYE) para verificar se os transientes se ligam a essa ou a uma região diferente da molécula. As placas foram bloqueadas com 1% p/v de PEG/PBS e depois incubadas com várias diluições de sobrenadante transitório purificado. O anticorpo de Fc de IgG anticoelho de cabra conjugado a HRP secundário (Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch) foi adicionado às placas, seguido de visualização de ligação com substrato de TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina, junto à Merck; 10 ul/poço). À densidade óptica foi medida em 630 nM usando o leitor de microplacas BioTek Synergy 2. Os dados para 6470 são mostrados na Figura 3. Como pode ser visto, 6470 mostra a ligação à alfa-sinucleína humana recombinante monomérica e fibrilar, mas não mostra ligação ao peptídeo 117-126.
[0280] Os anticorpos (IgG) foram então testados em um ensaio de agregação baseado em células, conforme descrito posteriormente no exemplo 7. A cinética de ligação de todos os anticorpos que demonstram atividade no ensaio celular foi subsequentemente determinada por ressonância plasmônica de superfície. Os anticorpos foram testados como IlgGs e Fabs para determinar avidez (ligação bivalente) e afinidade (ligação monovalente), respectivamente. EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS
CINÉTICA BIACORE
[0281] A cinética de interação foi determinada usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície em um instrumento Biacore T200. Três diferentes ligantes incluindo monômero de alfa-sinucleína humana de comprimento total recombinante, fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante purificadas e fibrilas de alfa- sinucleína de camundongo recombinante purificadas, preparadas como descrito aqui, foram imobilizados, cada um, em três células de fluxo diferentes de uma superfície de chip CM5 usando química de acoplamento de amina. Os três ligantes foram preparados em NaÃc 10 mM, pH 3,5 e imobilizados em superfícies de células de fluxo separadas para atingir um nível de imobilização de cerca de 30 unidades de resposta (UR) para monômero de alfa-sinucleína, cerca de 40 UR para fibrilas de alfa-sinucleina humana e cerca de 300 UR para fibrilas de alfa-sinucleina de camundongo, respectivamente, a uma taxa de fluxo de 10 ulímin. O tampão HBS-EP+ (GE Healthcare Bio-Sciences AB) foi usado como tampão de corrida para imobilização de ligantes e ensaio de cinética. A ligação de IgG1 de coelho de 6770 monoclonal (que compreende as SEQ ID NOs: 47 e 48) e Fab de coelho de 6470 monoclonal (que compreende as SEQ ID NOs: 47 e 49) para os três ligantes foi então medida. Os anticorpos IgG ou Fab monoclionais foram injetados a 7 concentrações diferentes de 800 nM a 0,195 nM ao longo dos 3 células de fluxo com um tempo de contato de 3 minutos e um tempo de dissociação de 30 minutos, a uma taxa de fluxo de 100 ul/min. A superfície foi regenerada por uma injeção de HCI 50 mM durante 90 s a 10 ul/min, e outra injeção de HCI 50 mM durante 60 s a 10 ul/min. Os dados foram analisados usando o software de avaliação Biacore T200 (versão 3.0), usando o modelo de analito bivalente com nenhuma contribuição em massa assumida (RI = 0) e RMmax global para o formato IgG, e o modelo 1:1 com contribuição em massa flexível (RI local) e Rmax global.
[0282] Os valores cinéticos para a ligação de IgG e Fab aos alvos imobilizados são mostrados na Tabela 2. O formato IgG mostrou afinidade seletiva aparente em relação às fibrilas de alfa-sinucleína humana em comparação com a afinidade ao monômero de alfa-sinucleína humana, já que a constante de dissociação KD é 10 vezes menor para fibrilas humanas. TABELA 2 ão o a E (Ms) |(1/s) (nM) j1/Ms) (1/s) (nM) i(1/Ms) (1/s) (NM) 6470 6470 6 02 6 04 5 104
LIGAÇÃO À BETA SINUCLEÍNA
[0283] A ligação de antibióticos criados contra a alfa-sinucleína humana para beta-
sinucleina humana foi testada por Western blot usando o rPeptídeo beta-sinucleína. Um micrograma de sinucleína foi executado em um gel Bis/Tris 4 a 12% e transferido para membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada em PBS com 3% de BSA e 0,1% de Tween20. O anticorpo IgG1 de coelho 6470 foi adicionado à mancha bloqueada e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente, lavado com PBS, 0,1% Tween 20 e incubado durante 1 hora com um conjugado secundário de anticorpo-HRP (conjugado de anticoelho H + L HRP, Bethyl A120-101P). A mancha foi lavada extensivamente em PBS com 0,1% de Tween20, PBS e água. A quimi-luminescência foi medida após a adição do substrato de Western blot ECL (Pierce). Como mostrado na Figura 4 (A) faixa 3, o I9G1 de coelho 6470 não se liga à beta-sinucleína humana.
MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS RMN
[0284] A alfa-sinucleína humana foi clonada no vetor de expressão pET28a, de modo que a proteína foi expressa sem nenhuma etiqueta. O construto foi transformado em células E. coli BL21 (DE3) (Stratagene), e as células foram cultivadas em meio definido com DL-glicose marcado com C'*? e sulfato de amônio marcado com N'* na presença e na ausência de óxido de deutério (D2O). A expressão foi induzida a OD600nm = 1 com IPTG 300 mM e a cultura foi incubada a 30 “ºC por 4 horas. As células foram sedimentadas e lisadas por três ciclos de congelação-descongelação em 100 ml de tampão de lise (20 mM Tris/HCI pH 8,0, 25 unidades de benzonase (Merck Millipore), coquetel inibidor de protease completo EDTA (2 comprimidos, Roche) e 10 mg de lisozima (Sigma)). O lisado foi clarificado por centrifugação a
18.000 rpm, e o lisado clarificado passou por um filtro de 0,22 (Stericup, Millipore). O lisado estéril foi carregado em um MonoQ 10/100GL (GE Healthcare) equilibrado com Tris/HCI 20 mM pH 8,0, 5CV e a proteína foi eluída com um gradiente para NaCl 500 MM no mesmo tampão. A purificação adicional das frações mais puras foi repetida na coluna MonoQ 10/100GL, após uma diluição de 5 vezes em 20 mM de Tris/HCI pH 8,0. As frações mais puras foram reunidas, concentradas com um concentrador de centrífuga de 10 kKDa MWCO (Centriprep, Millipore), purificadas por exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare), e eluidas em tampão de fosfato de sódio 25 mM, NaCl 100 mM (pH 6,4). As frações da coluna Superdex 75 foram reunidas e azida de sódio (0,02% de concentração final) e AEBSF (10 uM de concentração final) foram adicionados. A concentração final de proteína foi de aproximadamente 5 mg/ml.
[0285] O Fab 6470 de coelho (compreendendo uma VL da SEQ ID NO: 11 e uma VH da SEQ ID NO: 13, e também compreendendo SEQ ID NOs: 47 e 49) foi expresso em CHO SXE como entidades etiquetadas com His e purificado a partir do sobrenadante por cromatografia de afinidade com etiqueta His, ligando a proteína ao HisTrap Excel (GE Healthcare) a partir do sobrenadante e eluindo-a com imidazol 250 mM em PBS. A piscina de eluição foi carregada em HiTrap GammaBind Plus Sepharose (GE Healthcare), a coluna foi lavada com PBS e a proteína eluída com glicina 0,1 M-HCIl a pH 2,6, e o pH foi ajustado para pH 6 com fosfato de sódio 0,75 M de pH 9. A proteína Fab-His eluída foi trocada de tampão para tampão RMN (fosfato de sódio 25 mM, pH 6,4, NaCl 100 mM) em uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10. As frações de proteína Fab-His foram concentradas e os inibidores de protease AEBSF (concentração final de 10 uM) e azida de sódio (concentração final de 0,02%) foram adicionados antes da esterilização do filtro sobre um filtro Millex GV 0,22 um. Para cristalografia, o Fab-His 6470 concentrado foi purificado por cromatografia preparativa por exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare) e eluído com fosfato de sódio 25 mM, pH 6,4, NaCl 100 mM. A pureza das piscinas finais foi testada em UPLC-SEC, em pureza >99%. As piscinas finais passaram através de um filtro Millex GV 0,22 mm para esterilização. ATRIBUIÇÃO DA ESTRUTURA DE A-SINUCLEÍNA
[0286] As amostras de RMN tinham tipicamente 350 ul em volume com uma concentração de proteína de 360 uM marcada com *3ºC/"SN ou 430 uM 2H/3C/SN de a-Sinucleína humana marcada em tubos Shigemi de 5 mm. As condições de tampão foram 100 mM de NaCl, 25 mM de fosfato de sódio pH 6,4, 10 uM de AEBSF, 0,02% de NaN;z. Todas as experiências foram registradas a 20 ºC em um espectrômetro Bruker AVIII! de 600 MHz ou Bruker AVII de 800 MHz, equipado com sondas de refrigeração criogênica. As ligações sequenciais entre sinais de RMN de estrutura de resíduos na proteína, Hn(i)-N(i)-N(it+1), foram feitas usando um experimento 3D (H)N(CA)NNL (Weisemann et al., 1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins.
J.
Biomol.
NMR 3) registradas com larguras espectrais de 28, 28 e 10 ppm e tempos de aquisição de 117 (F1), 117 (F2) e 140 (F3) ms nas dimensões SN, **N e 'H, respectivamente, com 8 varreduras por incremento e um atraso de relaxamento de 1,58. A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade de amostragem de 10% (4.000 de 40.000 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,75 dias.
As conexões sequenciais foram confirmadas e os tipos de resíduos identificados usando experimentos de TROSY-HNCA (Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein.
J.
Magn.
Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA. 95, 13.585 a 13.590) e TROSY-HNCACB (Wittekind e Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins.
J.
Magn.
Reson.
Ser.
B 101, 201 a 205; Salzmann et.al., 1999. TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NUR Assignment of Large Proteins.
J.
Am.
Chem.
Soc. 121, 844 a 848). O experimento TROSY-HNCA foi registrado com larguras espectrais de 23, 28, 10 ppm e tempos de aquisição de 12,1 (F1), 21,7 (F2) e 100 (F3) ms nas dimensões !ºC, **N e '!H, respectivamente (8 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s, tempo total de aquisição de 1 dia) enquanto o TROS Y- HNCACB foi registrado com larguras espectrais de 56, 28 e 10 ppm e tempos de aquisição de 8,2 (F1), 21,7 (F2) e 100 (F3) ms nas dimensões "ºC, **N e 'H, respectivamente (8 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s, tempo total de aquisição de 1,7 dias). As atribuições de carbonila da estrutura foram obtidas a partir de um espectro TROSY-HNCO (Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple- resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein.
J.
Magn.
Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA. 95,
13.585 a 13.590) registradas com larguras espectrais de 10, 29, 10 ppm e tempos de aquisição de 80 (F1), 21,7 (F2) e 150 (F3) ms nas dimensões "ºC, **N e 'H, respectivamente (8 varreduras por incremento e um atraso de relaxamento de 1,5s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 15% (1.208 de 8.050 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 19 horas. Os espectros de RMN foram processados usando NMRPipe ((Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277 a 293), com previsão linear usada para estender o tempo efetivo de aquisição em nitrogênio por até 1 vez. Os dados amostrados não uniformes foram reconstruídos usando o método de limiar suave iterativo de Harvard (Hyberts et al., 2012), com os dados reconstruídos para o próximo número de Fourier, aumentando os tempos de aquisição indireta em até 60%. A análise dos dados foi realizada usando Sparky (Goddard e Kneller, DG SPARKY 3. In., University of California, San Francisco), resultando na atribuição das ressonâncias de prótons e nitrogênio de 133 resíduos, correspondendo a 99% dos resíduos (excluindo resíduos de prolina e metionina N-terminal).
[02867] O mapeamento do local de ligação do Fab 6470 foi executado usando uma amostra de 150 UM de alfa-sinucleína humana etiquetada com 2H/"3C/'SN contendo um excesso molar de 10% do Fab 6470 não etiquetado. As amostras foram preparadas no mesmo tampão, como descrito acima, para a atribuição da estrutura da alfa-sinucleína. As alterações de deslocamento químico 1H, **N e "ºC foram determinadas por comparação do espectro de Trosy-HNCO ((Grzesiek e Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432 a 440; Salzmann et.al., 1998. TROSY in triple-resonance experiments: new perspectives for sequential NMR assignment of large proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13.585 a 13.590) registrado no complexo de alfa-sinucleína/Fab com um espectro de controle equivalente registrado na alfa-sinucleína livre. O experimento de controle de Trosy-HNCO da alfa-sinucleína livre foi registrado com larguras espectrais de 10, 28 e 10 ppm e de tempos de aquisição de 80 (F1), 22 (F2) e 150 ms (F3) nas dimensões de *ºC, *SN e *H, respectivamente (16 varreduras por incremento,
atraso de relaxamento de 1,5 s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 25% (2.013 de 8.050 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,7 dias. O experimento TROSY- HNCO do complexo de alfa-sinucleína/Fab foi registrado com larguras espectrais de 10, 28 e 10 pom e tempos de aquisição de 80 (F1), 21,7 (F2) e 80 (F3) ms nas dimensões de ºC, **N e 1H, respectivamente (32 varreduras por incremento, atraso de relaxamento de 1,5 s). A amostragem não uniforme foi empregada com uma densidade amostral de 25% (1.119 de 4.477 pontos hipercomplexos), resultando em um tempo total de aquisição de 2,8 dias. Os espectros de RMN foram processados usando NMRPipe (Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277 a 293) com reconstrução dos dados NUS realizados usando mddnmr. (Analysis of non-uniformly sampled spectra with Multi-Dimensional Decomposition. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 59, páginas 271 a 292). O tempo de aquisição eficaz da dimensão nitrogênio foi aumentado em até 1 vez durante a reconstrução dos dados.
[0288] As alterações de deslocamento químico foram analisadas usando a abordagem de deslocamento mínimo (Williamson et al., 1997 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13.882 a
13.889), essencialmente como descrito anteriormente ((Veverka et al., 2008 Structural characterization of the interaction of MTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor: compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule- mediated regulation of MTOR. Oncogene 27, 585 a 595), com exceção de uma modificação na equação usada para calcular a alteração do deslocamento químico combinado (A) para incluir o deslocamento químico de carbonila, resultando na seguinte equação: né = VENTA T GSNaN FT (A5CAOT 3
[0289] onde Aônn, Aôn e Adc são as diferenças nos deslocamentos químicos de 1H, SN e 1%C, respectivamente. aN e aC correspondem a fatores de escala de 0,2 e
0,35, respectivamente, usados para compensar as diferenças nas faixas de deslocamento químico dos deslocamentos químicos de prótons de amida, nitrogênio e carbonila.
[0290] Para identificar os locais de ligação de Fab (epítopos) em alfa-sinucleína, um histograma de deslocamento mínimo combinado versus sequência proteica foi usado para revelar regiões de alfa-sinucleína contendo sinais significativamente perturbados. Se o tamanho da mudança de deslocamento químico combinado para aminoácidos individuais exceder um valor limite da média da mudança de deslocamento químico combinado para todos os aminoácidos mais um desvio padrão dessa média, esses resíduos foram selecionados para avaliação adicional como possíveis resíduos de contato no local de ligação de Fab.
[0291] Os resíduos significativamente perturbados foram identificados como aqueles cujo deslocamento mínimo foi pelo menos maior que a média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados. Quatro limiares diferentes foram aplicados para identificar resíduos ligados pelo Fab. Os resíduos envolvidos no local de ligação são classificados com crescente rigor como: aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,018925); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais dois desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,032049); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais três desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,045174); aqueles cujo deslocamento mínimo excede a média mais quatro desvios padrão de todos os deslocamentos calculados (sendo >0,058299). Nessa análise, os resíduos de prolina não podem ser identificados uma vez que não contêm prótons de amida.
[0292] O epítopo para o Fab 6470 é, portanto, definido com crescente rigor como média mais um desvio padrão de todos os deslocamentos calculados: D121, N122, E123, A124, Y125, E126, M127, S129, E130, Y133, 0134, D135 e Y136; média mais dois desvios padrão de todos os deslocamentos calculados: E 123, A124, Y125, E126, M127, S129, E130, D135 e Y136; média mais três desvios padrão de todos os deslocamentos calculados: Y125, M127, S129 e D135; média mais quatro desvios padrão de todos os deslocamentos calculados: M127, S129 e D135.
[0293] Como mostrado na Figura 4B, foi revelado que o anticorpo 6470 se liga por estudos de RMN pelo menos aos seguintes resíduos (média + 3 DP) Y125, M127, 8129 e D135 e além de também se ligar a todos os seguintes resíduos (média + 1 DP) D121, N122, E123, A124, E126, E130, Y 133, Q134 e Y136 da alfa-sinucleína humana (SEQ ID NO: 10).
MAPEAMENTO DE PEPTÍDEOS
[0294] Uma caracterização adicional do epítopo ligado por 6470 foi realizada usando peptídeos curtos (tipicamente 9-mer ou 10-mer) representativos e cobrindo a região C-terminal da alfa-sinucleína humana. Esses foram utilizados em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície competitiva para testar se algum era capaz de inibir a ligação do anticorpo a qualquer fibrila de alfa-sinucleína monomérica ou de alfa-sinucleína pré-formada imobilizadas em um chip de Biacore. Um peptídeo que mostra o nível máximo de inibição foi então selecionado para estudos de cocristalização com o anticorpo, a fim de confirmar o epítopo exato.
[0295] Os peptídeos foram fornecidos pela Peptide Protein Research Ltd., Bishop's Waltham, Reino Unido, e foram sintetizados pela química dos peptídeos em fase sólida Fmoc, de acordo com o método de Atherton e Sheppard. (Ref: Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press). Os terminais peptídicos N e C foram tapados com grupos acetila e amida, respectivamente, exceto no caso dos peptídeos representando o N- terminal e o C-terminal da a-sinucleína, onde os grupos amino e carboxila, respectivamente, permaneceram livres. As soluções de estoque de peptídeo foram preparadas em DMSO a 10 mM. A lista completa de peptídeos é mostrada na Tabela
3. TABELA 3
[0296] O monômero de alfa-sinucleína humano recombinante e as fibrilas de alfa- sinucleína pré-formadas foram imobilizadas em um chip CM5 usando um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Após a ativação da superfície do carboximetil dextrano por injeção de 100 ul de uma mistura fresca 1:1 (v/v) de N-hidroxissuccimida 50 mM e 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida 200 mM a uma taxa de fluxo de 10 pl/min de HBS-EP (GE Healthcare) como tampão de corrida, o acoplamento foi obtido através da injeção de 100 ul de monômero e fibrilas, a 5 UM em acetato de 10 mM pH 5,0, em células de fluxo separadas. Uma célula de fluxo de referência foi ativada da mesma maneira e, em seguida, todas as superfícies das células de fluxo foram desativadas com um pulso de 50 ul de 1 M de etanolamina HCl pH 8,5.
[0297] As soluções peptídicas foram preparadas em tampão de corrida a 100 uM e um controle de peptídeo em branco foi preparado como uma diluição de 1 em 100 de DMSO em tampão de corrida. Uma solução de Fab de coelho 6470 (compreendendo SEQ ID NOs: 47 e 49) foi preparada a 50,5 nM em tampão de corrida antes de pré-incubar 198 ul com 2 ul de controle em branco ou peptídeo diluído para produzir uma mistura final de 50 nM de Fab e peptídeo ou controle 1 uM. Os sensogramas foram registrados para cada amostra, injetando 30 ul da mistura a 10 ul/min e registrando um ponto de relatório 5 segundos antes do final da injeção. O chip foi regenerado no final de cada ciclo por duas injeções de 10 ml de HCl 40 mM e uma injeção de NaOH 5 mM. Os ciclos de controle foram alternados com ciclos de peptídeos.
[0298] O grau de inibição de cada peptídeo foi calculado como a variação percentual nas unidades de resposta medidas no ponto do relatório em comparação com aquelas da média de ciclos de controle adjacentes.
[0299] O nível de inibição de cada peptídeo de alfa-sinucleína é mostrado na Figura 5. A inibição significativa do Fab 6470 ao monômero ou fibrilas de alfa- sinucleína foi observada apenas para os três peptídeos: AS121-130, AS123-132 e AS125-134, onde os níveis mais altos de inibição foram observados para AS123-132 a 37% e 54% para ligação do anticorpo ao monômero e fibrilas, respectivamente. Níveis de inibição ligeiramente mais baixos foram obtidos para o peptídeo AS125-134 a 34% e 52%, respectivamente, indicando que o componente principal do epítopo compreendia os resíduos 125 a 132. O peptídeo AS121-130 inibiu em níveis mais baixos de 20% e 27%, respectivamente, sugerindo que os resíduos em comum com os três peptídeos: 125 a 130 contribuíram mais para o epítopo.
[0300] Como o epítopo do anticorpo 6470 parecia compreender pelo menos a sequência YEMPSEE G, o peptídeo AS123-132 foi investigado em estudos de cocristalização com o Fab 6470.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS X
[0301] Para preparar os complexos, 1 ml de Fab de coelho 6470 purificado, a aproximadamente 10 mg/ml, foi misturado com o peptídeo de alfa-sinucleína 123-132 (EAYEMPSE E G) em uma razão molar Fab:peptídeo de 1:2 e incubada por 1 hou à temperatura ambiente. As condições adequadas para o crescimento de cristais foram identificadas pelo método de difusão do vapor de gota em repouso usando telas de cristalização disponíveis no mercado (Qiagen). Para gerar cristais de qualidade de difração, foi utilizado o método de difusão de vapor suspenso.
[0302] Para o complexo Fab 6470-peptídeo 123-132, 1 ul de solução de proteína foi misturada com 1 ul de solução reservatória contendo sulfato de amônio 1,6 Me tampão Hepes 0,1 M, pH 7,5. Os cristais foram colhidos e congelados rapidamente em nitrogênio líquido depois de passarem brevemente por uma solução crioprotetora contendo sulfato de amônio 1,6 M, tampão Hepes 0,1 M, pH 7,5 e glicerol a 20%. Os cristais C foram colhidos e congelados rapidamente em nitrogênio líquido após passar brevemente por uma solução crioprotetora contendo sulfato de amônio 0,2 M e polietilenoglicol 8000 a 35% (v/v).
[0303] Os dados de difração para 2,9 À foram coletados a partir de cristais únicos do Fab 6470- peptídeo 123-132 na linha de feixe i04-1 no Diamond Synchrotron, Didcot, Oxfordshire, Reino Unido, e processados usando Mosflm, Aimless e Truncate. A estrutura do complexo foi resolvida por substituição molecular com Phaser usando as coordenadas de um Fab interno como modelo de pesquisa.
[0304] Os ciclos de refinamento e construção de modelos foram realizados usando CNS (Brunger et al., (2007) Nature Protocols 2, 2.728 a 2.733) e COOT (Emsley et al., (2004) Acta crystallographica. Seção D, Biological crystallography 60, 2.126 a 2.132) até que todas as estatísticas de refinamento convergissem para os dois modelos. À geometria do modelo foi validada usando Molprobity43. As visualizações moleculares foram geradas com Pymol44. As informações do epítopo descritas abaixo foram obtidas considerando átomos a uma distância de 4À na superfície de contato Fab/peptídeo. As estatísticas de coleta e refinamento de dados são mostradas na Tabela 4A e na Tabela 4B. TABELA 4A Dimensões dacéra
Tabela 4B 132
FR CA e RB seo — | [Isso
[0305] Os valores entre parênteses se referem à aparência de alta resolução. Rsym = ZÍ(1 - <>) |/X(1), onde | é a intensidade observada integrada, <l> é a intensidade média integrada obtido a partir de medições múltiplas, e o somatório é sobre todas as reflexões observadas. Rwork = Z| |Fobs|- klFcalc | |/z| Fobs|, onde Fobs e Fcalc são os fatores de estrutura observados e calculados, respectivamente. O Rree É calculado como Rworx usando 5% dos dados de reflexão escolhidos aleatoriamente e omitidos nos cálculos de refinamento.
[0306] O contato principal entre os resíduos das cadeias pesada e leve e o peptídeo é mostrado na Tabela 5. Tabela 5 resíduo . Aminoácido JÁtomo-alvo Cadeia (SEQ ID NO:Átomo Cadeia Distância (À) Ide peptídeo — jde peptídeo 13) Eos en emo fe is Fm ee em fra Co E ER Ee e Fe Em em Fes tv e em Foo Em fo ema fem e Fes Fo E eme fe poros Em o ema fem e Fa im Ro em ea Foo Ra o ma fe poe im Ro me fem e Fes Fo eme E Forest eme fem to poses mo ema ea Eos e e an ER Fes ee e eme ee is poa to e me ea Fe qe Rr fem E Ee im o a ER Forms Re o ma pre ms Form tv E em bm Fm fe E fem bm Ee Rm emo Ra Form er em pro bm
H o7(TYR) CAIC] A 125(TYR) — JoHÇo] 3,19
E poem o ese Ao esqmvyR error 638 | E paro cota a GsqYR) | Jorío] E paras onto da faser) PArero Ba | po dE fem) es E pa esa Ao faser sr 20 | HH —— EB2ASP) [OD1 [O] Pp f26GLW) CG [C] Lo] | pp Saes for FER NR emo pen ss ps Ee Rr eo pe po RSS pb eo pen Es Fís Ee Rr eo pe pes o R seo pe Forms o es bem o fes par em Fo pos pe eo Fm zo Es pro eo Fo pos be ro eo po pos Rm Rr fes boo rs pr peer eo po Forms tor pes ba Ef pes eo po Cl ff pm ts Lp |] | bp [jXWm PO E pero erra ao fenven Dio] E pem PROA feven PO E por pro A fPaSER sra E pm zo po fase estro Ba = |
H 57(TYR) [OH [0] A 129(SER) OG [O] 2,78 popa ee o ee bem Er pm ee E jeep resíduo
, Aminoácido lÁtomo-alvo Distância
Cadeia (SEQ ID NO:Átomo Cadeia , ,
11) Ide peptídeo — jde peptídeo (angstroms) E pena bro A eae) Polo po o pa em Pemar bae po pm Peg A exe peZIor pes => po pm pra Ao fam pEezo E pan ro A exe pEeZIor pot pr p [POR Pe po pemm Pee A jesmyrm cem pass > po dA PA EE ps Epa fee po femme bra ss Epa ee o eee ba pop ES Ro mem be fe Epa bra fo ferem Esta os Eos em mv fo poem E E eme poa Eos emo mem em ss pp E fo mem po Eee Ro o mm os pop eo mem o popa Ee E eee ea Ep be E em Ee e
L P3(TYR) cCE2[C] |A 127(MET) — [CEC] 3,22 popa Rm Rr em Em rs Es pe Ro mm ES pos ee mm Em ss pr err mm o pps ER Rr mm Em rs Ep pe RF mero po Lo A [= fa poe Em Rs meo fem 6 Es po Ro ES pa L P6(GLY N [IN A 128(PRO B,41 E pasmo NIDA sro) or Bt | poe e Ro em Ao em bo « sm A Fo No Rr es Em ss en po | jam sc Lol RE fes Fm ss Ee Re RF se Eos EE em e dh qse NON L P6(GLY A 130(GLU IN [N 2,73 E pese orar A seem NI Ba | ERES NR ao em po k fe ar LC A [ES For pe pf eo fm o LL RF eo fa LC Ff ES pe tr | — PT(ARG) (cG [Cc] A —fsoGL) OE1 [0] E pars) cG [0] hp fso(GLU) OE1 [0] Eras pe fo eo pao em
L 97(ARG) NE [N] A 130(GLU) 1OE1 [O] B,75 Er Fes pes em ss —) ERR bo E sem bem ts Er bo pes em rm —) poa pe o sem pera bas E pao em Ro em Em o E pao ba sem bo im E ro en E sem po e Eoeo ee o sem bo is E hao pen o fem por pr
[0307] Em resumo, o epítopo compreende os resíduos E123, Y125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131. A Figura 6 mostra o Fab 6470 em complexo com o peptídeo 123-132 e as Figuras 7 e 8 mostram os contatos entre o peptídeo 123-132 e a cadeia pesada e cadeia leve do Fab 6470, respectivamente. EXEMPLO 4: ANTICORPOS HUMANIZAÇÃO E MATURAÇÃO DE AFINIDADE
[0308] O anticorpo 6470 de coelho foi humanizado por enxerto de CDRs de regiões V de coelho em estruturas de região V de anticorpo da linhagem germinativa humana. A fim de recuperar a atividade do anticorpo, vários resíduos de estrutura das regiões V de coelho também foram retidos na sequência humanizada. Esses resíduos foram selecionados usando o protocolo delineado por Adair et al. (1991) (WO 91/09967). Os alinhamentos das sequências de região V (doadora) do anticorpo de coelho com as sequências da região V da linhagem germinativa humana (aceitadora) são mostrados nas Figuras 9 e 10, em conjunto com as sequências humanizadas projetadas. As CDRs enxertadas da sequência doadora para a aceitadora são as definidas por Kabat (Kabat et al., 1987), com exceção da CDR-H1 onde a definição combinada de Chothia/Kabat é usada (consulte Adair et al., WO91/09967).
[0309] Os genes que codificam uma série de sequências variantes das regiões V das cadeias pesada e leve foram projetados e construídos por uma abordagem de síntese automatizada pela DNA2.0 Inc. Outras variantes das regiões V das cadeias pesada e leve foram criadas pela modificação dos genes VH e VK por mutagênese oligonucleotídeo-direcionada, incluindo, em alguns casos, mutações nas CDRs. Para a expressão transiente em células de mamífero, os genes da região V da cadeia leve humanizados foram clonados no vetor de expressão de cadeia leve UCB pMhCK, que contém DNA que codifica a região constante da cadeia humana Kapa (alotipo Km3). Os genes da região V da cadeia pesada humanizados foram clonados no vetor de expressão de cadeia pesada UCB gama-4 humana PMHy4PFL, que contém DNA que codifica a região constante de cadeia pesada gama-4 humana com a mutação de estabilização de dobradiça S241P (Angal et al., Mol. Immunol. 1993, 30 (1): 105 a 108). O 6470 quimérico, compreendendo as regiões V de coelho (SEQ ID NOs: 11 e 13) e as regiões constantes humanas também foi preparado de forma semelhante e utilizado como um anticorpo comparador. A cotransfecção dos vetores de cadeias pesada e leve resultantes em células em suspensão Expi293'YM proporcionou a expressão dos anticorpos recombinantes humanizados no IgG4P humano.
[0310] A região V humana IGKV1-16 mais a região JK4 J (IMGT, http://www.imgt.org/) foi escolhida como aceitadora para CDRs da cadeia leve do anticorpo 6470. Os resíduos da estrutura da cadeia leve no enxerto gL3 são todos do gene da linhagem germinativa humana, com exceção dos resíduos 48 e 7 2 (com referência à SEQ ID NO: 15), onde os resíduos doadores de Glutamina (Q48) e Glutamina (Q72) foram retidos, respectivamente. A retenção de resíduos Q48 e Q72 era essencial para a plena potência do anticorpo humanizado (Figura 9 e Tabela 6) para a ligação de fibrilas de alfa-sinucleína humana.
TABELA 6 Afinidade de Variantes de fibrilas Cadeia leve | Cadeia pesada anticorpos humanas Resíduos o fases [ienes x
[ame e
[0311] A região V humana IGHV3-23 mais a região J JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) foram escolhidas como aceitadoras das CDRs da cadeia pesada do anticorpo 6470. Em comum com muitos anticorpos de coelho, o gene VH do anticorpo 6470 é mais curto que o aceitador humano selecionado. Quando alinhada com a sequência aceitadora humana, uma estrutura da região VH de anticorpo 6470 não possui o resíduo N-terminal, que é retido no anticorpo humanizado (Figura 10). A estrutura 3 da região VH de coelho 6470 também carece de dois resíduos (75 e 76) no laço entre fios de folhas beta D e E: nos enxertos humanizados, a lacuna é preenchida com os resíduos correspondentes (Lisina 75, K75; Asparagina 76, N76) a partir da sequência aceitadora humana selecionada (Figura 10). Os resíduos da estrutura da cadeia pesada nos enxertos gH23 e gH36 são todos do gene da linhagem germinativa humana, com exceção de um ou mais resíduos do grupo que compreendem os resíduos 24,47, 48,49,73,78 e 97 (com referência às SEQ ID NOs: 23 e 31), onde foram retidos os resíduos de Valina (V24), Tirosina (Y47), Isoleucina (148), Glicina (G49), Serina (S73), Valina (V78) e Arginina (R97), respectivamente. À retenção de resíduos V24, Y47, 148, G49 e R9 7 era essencial para a plena potência do anticorpo humanizado para a ligação de fibrilas de alfa-sinucleína humana.
[0312] Além disso, os genes de VH humanizados foram clonados no vetor de expressão Fab-His humano UCB pMhFab10HIS que contém o DNA que codifica o domínio de dobradiça CH1 gama-1 humano com uma etiqueta C-terminal de dez resíduos de histidina: A etiqueta de histidina facilita a purificação dos Fabs expressos por cromatografia de afinidade. A cotransfecção dos vetores de cadeias pesada e leve resultantes em células em suspensão Expi293'Y proporcionou a expressão dos anticorpos recombinantes humanizados em formatos de Fab-His.
[0313] A maturação de afinidade foi executada de acordo com métodos IOTA descritos no documento WO2014198951. A interface entre Fab de coelho 6470 e o peptídeo de alfa-sinucleína EAYEMPSEEG (123-132) no complexo determinado por cristalografia de raios X foi submetida à análise para identificar mutações que potencialmente poderiam melhorar a afinidade do Fab de coelho 6470 para a proteína alfa-sinucleína. O IOTA é uma ferramenta estatística potencial para determinar a probabilidade de um determinado tipo de átomo de contato em uma interface de proteína ou local de ligação.
[0314] Para avaliar o efeito dessas mutações na potência dos anticorpos para a ligação ao monômero ou fibrilas de alfa-sinucleína humana, as mutações foram primeiramente estudadas no Fab de coelho 6470 (Tabela 7A). A cinética de interação foi determinada usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície no instrumento Biacore T200, como descrito no Exemplo 3. O resíduo 33 no CDRL1 (com referência à SEQ ID NO: 11) foi mutado de uma asparagina (N) para uma arginina (R) ou lisina (K): a mutação do resíduo 33 para arginina resultou em uma maior afinidade pela alfa-sinucleína (Tabela 7A). O resíduo 55 em CDRH2 foi mutado de uma serina (S) para uma asparagina (N), e o resíduo 99 em CDRH3 foi mutado de uma asparagina (N) para uma lisina (K), ou uma glutamina (Q) ou uma histidina (H) ou um triptofano (W) (com referência à SEQ ID NO: 13), a mutação do resíduo 55 para asparagina e do resíduo 99 para histidina resultou em uma afinidade aumentada para a alfa-sinucleína (Tabela 7A). A mutação da asparagina em CDRH3 (N99H) também remove um local potencial de desamidação. TABELA 7A Ika1 ka1 LC] pn foco fere fa foco ferem] IFab de coelho) Boo Dmenben he Ieecbren tos | E ea E nes eia er E Tr Tae o ee ho
[0315] Finalmente, as mutações identificadas recentemente também foram testadas nos anticorpos humanizados de comprimento total gerados anteriormente (Tabela 6) e a sua seletividade para fibrilas humanas foi testada (Tabela 7B). À cinética de interação foi determinada usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície no instrumento Biacore T200, como descrito no Exemplo 3. Como mostrado na Tabela 7B, as mutações na posição 33 na cadeia leve (com referência à SEQ ID NO: 19) e 56 e 102 na cadeia pesada (com referência à SEQ ID NO: 27 e 35) resultam em aumento da afinidade por fibrilas humanas, que é uma característica vantajosa para anticorpos que precisam atravessar a barreira hematoencefálica para vincular seu alvo. Quando os anticorpos são administrados sistemicamente, uma grande quantidade do anticorpo administrado pode ser perdida porque os anticorpos têm sistemas limitados para atravessar barreiras fisiológicas complexas. TABELA 7B Anticorpos ka1 kd1 KD1 ka1 kd1 KD1 humanizados (1/Ms) (1/s) (nM) (Ms) |(1/s) (nM) VR6470 gL3; | 1,20E+0 | 0,0241 8,55E+ |1,42E- 20,15 0,166 gH23 6 6 os 04 VR6470 gL3; | 1,15E+0 | 0,0174 1,07E+ |3,17E- 15,10 0,298 gH36 6 2 o6 04 VR6470 gL3; 9,66E+O0 | 0,0044 1,04E+ |7,08E- gH23-S56N- 4,62 0,068 5 o6 os N102H VR6470 gL3; 1,19E+0 | 0,0048 1,25E+ |7,44E- gH36-S56N- 4,10 0,059 6 8 o6 os N102H VR6470 gL3- 3,48E+0 | 0,0059 2,07E+ |1,16E- N33R; gH23- 171 0,056 6 4 o6 04 S56N-N102H VR6470 — gL3- 4,97E+0 | 0,0064 2,39E+ |1,26E- N33R; gH36- 1,31 0,053 6 8 o6 04 S56N-N102H
[0316] As cadeias de anticorpo humanizado variantes e suas combinações foram expressas e avaliadas quanto à sua potência em relação ao anticorpo progenitor, as suas propriedades biofísicas e aptidão para o processamento a jusante.
EXEMPLO 5: CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANIZADOS
[0317] A caracterização biofísica foi realizada em seis anticorpos IIG4P 6470 humanizados (Tabela 8, sequências na Tabela 1). TABELA 8 gL3-N33RgH23-S56N- gL3-N33RgH36-S56N-
[0318] Todos os anticorpos foram triados com base na estabilidade térmica (Tm), pl experimental, hidrofobicidade, solubilidade (ensaio de precipitação com PEG) e estabilidade de agregação em uma interface ar/líquido para determinar se as mutações tiveram alguma influência em particular no que diz respeito à afinidade, estabilidade e capacidade de desenvolvimento.
[0319] O processo de triagem também incluiu a avaliação da estabilidade química (desamidação, propensão à isomerização do ácido articular de Asp), uma vez que os anticorpos possuem:
1. Motivo Asn(102)S (desamidação) na CDR3 de cadeia pesada para gL3gH23 e gL3gH36 apenas;
2. Motivo Asn(98)Asp(99) (desamidação) na CDR3 de cadeia leve para todos os anticorpos;
3. Motivo Asn(32)Asn(33) (desamidação) na CDR1 de cadeia leve de todos, menos mutantes N33;
4. Motivo Asp(99)G (isomerização de Asp) na CDR3 da cadeia leve para todos os anticorpos.
[0320] A instabilidade química nesses locais pode resultar em heterogeneidade e imunogenicidade do produto. MEDIÇÕES DE ESTABILIDADE TÉRMICA (Tv)
[0321] A temperatura de fusão (Tm) ou a temperatura no ponto médio do desdobramento, foi determinada usando o ensaio Thermofluor. Nesse método, o corante fluorescente SYPROO laranja foi usado para monitorar o processo de desdobramento da proteína, ligando-se a regiões hidrofóbicas que ficam expostas à medida que a temperatura aumenta.
[0322] A mistura de reação continha 5 ul de corante laranda SYPROO 30x (InvitrogenTY), diluído com PBS a partir da solução estoque 5000X e 45 ul de amostra a 0,12 mg/ml (em PBS pH 7,4). Cerca de 10 ul da mistura foram distribuídos em quadruplicado em uma placa de poço óptico de 384 PCR e foram executados em um sistema de PCR em tempo real rápido 7900HT (Applied Biosystems"Y). O dispositivo de aquecimento do sistema de PCR foi ajustado de 20 ºC a 99 ºC, com uma taxa de aumento de 1,1 ºC/min. Um dispositivo acoplado à carga monitorou as alterações de fluorescência nos poços. Os aumentos de intensidade foram plotados, e o ponto de inflexão da inclinação (ou inclinações) foi usado para calcular a Tm, conforme descrito abaixo.
[0323] Duas transições de desdobramento foram observadas para todos os anticorpos. O primeiro pode ser atribuído à Tm do domínio CH2. O segundo pode ser atribuído a uma média da Tm do domínio de desdobramento Fab e do domínio CH3 de acordo com a literatura (Garber E, Demarest SJ. Biochem Biophys Res Commun. 13 de abril de 2007; 355(3): 751 a 757). A Tabela 9 resume os resultados. TABELA 9 pe geér Eméo | Descritor domínio de) domínio de) Fab CH? gL3gH23 73,1 o,6 64,8 0,2 gL3gH36-S56N- N10 2 H 73,4 o,2 65,1 0,3 guanaaRanenssaN Nana — bs se a
[0324] As estabilidades térmicas estão dentro da faixa esperada normal (Heads et al. “Relative stabilities of IIG1 and IgG4 Fab domains: influence of the light-heavy interchain disulfide bond architecture”. Protein Sci. Setembro de 2012; 21(9):1.315a
1.322) para moléculas de IgG4. pl EXPERIMENTAL
[0325] O pl experimental dos anticorpos 6470 foi obtido usando o sistema cIEF iCE3TY com capilaridade total (ProteinSimple).
[0326] As amostras foram preparadas misturando o seguinte: 30 ul de amostra (de um estoque de 1 mg/ml em água de qualidade para HPLC), 35 ul de solução de metilcelulose a 1% (Protein Simple), 4 ul de anfólitos pH 3 a 10 (Pharmalyte), 0,5 ul de 4,65 e 0,5 ul 9,77 marcadores de pl sintéticos (ProteinSimple), 12,5 ul de solução de ureia 8M (Sigma-Aldrich&). Foi utilizada água de qualidade HPLC para perfazer o volume final até 100 ul. A mistura foi agitada no vórtex brevemente para garantir a mistura completa e centrifugada a 10.000 rpm por 3 minutos para remover as bolhas de ar antes da análise. As amostras foram focalizadas durante 1 minuto a 1,5 kV, seguido de 5 minutos a 3 kV, e imagens A280 do capilar foram feitas usando o software ProteinSimple. Os eletroferogramas resultantes foram analisados primeiro usando o software iCE3 e os valores de pl foram atribuídos (relação linear entre os marcadores de pl). Os eletroferogramas calibrados foram então integrados usando o software EmpowerO (Waters).
[0327] O pl experimental para todos os anticorpos 6470 estava na faixa de 84 a 9,2. Houve uma ligeira diferença na proporção de espécies carregadas entre as moléculas, no entanto, isso não é inesperado para uma molécula de IgG4P. Todos os pls eram altos e, portanto, ajudariam no processo de fabricação dos anticorpos. CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA (HIC)
[0328] A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) separa as moléculas em ordem crescente de hidrofobicidade. As moléculas se ligam à fase estacionária hidrofóbica na presença de altas concentrações de sais polares e absorvem a fase móvel à medida que a concentração de sal diminui. Um tempo de retenção mais longo equivale a uma maior hidrofobicidade.
[0329] As amostras a 2 mg/ml foram diluídas 1:2 com sulfato de amônio 1,6 Me PBS (pH 7,4). 5 ug (5 ul) da amostra foram injetados em uma coluna Dionex ProPacTM HIC-10 (100 mm x 4,6 mm) conectada em série a uma HPLC binária Agilent 1200 com um detector de fluorescência. A separação foi monitorada por fluorescência intrínseca (comprimentos de onda de excitação e emissão, 280 nm e 340 nm, respectivamente).
[0330] Usando tampão A (0,8 M de sulfato de amónio 100 mM Fosfato pH 7,4) e tampão B (100 mM de fosfato pH 7,4), a amostra foi analisada utilizando uma eluição de gradiente como se segue: (i) dois minutos de espera, a 0% de B, (ii) gradiente linear de O a 100% de B em 30 minutos (0,8 ml/minuto) (iii) a coluna foi lavada com 100% de B por 2 minutos e reequilibrada em 0% de B por 10 minutos antes da próxima injeção da amostra. A temperatura da coluna foi mantida a 20 ºC,
[0331] Os padrões exibindo baixa e alta hidrofobicidade mais um controle também foram analisados na mesma sequência de execução para permitir a normalização dos tempos de retenção (Tabela 11). O tempo de retenção (RT) da amostra foi normalizado contra os padrões baixo e alto de hidrofobicidade usando a seguinte equação: [(Amostra (RT) - baixo padrão (RT)/alto padrão (RT) - baixo padrão (RT) ] x 100 TABELA 10 mi Lagras a BB | Lages Be BA IgL3gH23-S56N-N102H fa 6 gL3gH36-S56N-N102H 8,8 8,1 IgL3-N33RgH23-S56N-N102H |8,8 3,1
[0332] Todos os anticorpos e mutantes 6470 apresentaram tempos de retenção normalizados semelhantes e baixa hidrofobicidade semelhante. Os anticorpos terapêuticos comercialmente disponíveis tendem a exibir baixa hidrofobicidade (Jain et al. “Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape” Proc Natl Acad Sci US A. 31 de janeiro de 2017; 114(5):944 a 949). A baixa hidrofobicidade ajuda na estabilidade (isto é, reduz a agregação) durante a fabricação.
MEDIÇÃO DA SOLUBILIDADE USANDO UM ENSAIO DE PRECIPITAÇÃO COM POLIETILENO GLICOL (PEG).
[0333] A estabilidade coloidal foi analisada utilizando um ensaio de precipitação de polietileno glicol (PEG). O PEG foi utilizado para reduzir a solubilidade da proteína de uma maneira quantitativa definível, aumentando as concentrações de PEG (p/v) e medindo a quantidade de proteína restante na solução. Esse ensaio serviu para imitar o efeito da solubilidade de alta concentração sem o uso de métodos de concentração convencionais. A precipitação induzida por PEG dos anticorpos 6470 foi investigada na presença de 7 a 18% de PEG-3350 em PBS pH 7,4, acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0 (acetato pH 5) e L-histidina 20 MM, NaCl 140 mM, pH 6.0. As amostras foram trocadas de tampão quando necessário usando diálise e a concentração ajustada para 2 mg/ml. A fim de minimizar a precipitação sem equilíbrio, a preparação da amostra consistiu na mistura de soluções 2 x proteína e 2 x PEG na razão de 1:1 em volume. Após a mistura, as amostras foram incubadas a 37 ºC por minutos para redissolver os agregados sem equilíbrio. Após uma incubação durante a noite a 20 ºC, as amostras foram centrifugadas por 60 min (4.000 9). Alíquotas do sobrenadante foram transferidas para placas ópticas de 96 poços com meio volume e a absorbância a 280 nm foi medida usando um leitor de placas BMG Labtech FLUOstarº Omega LVIS A280. Os dados de concentração foram plotados versus % de PEG e o ponto médio calculado (LogEC50), gerado por um ajuste de curva não linear, a inclinação variável foi obtida como uma medida da solubilidade coloidal relativa das amostras. Nesse ensaio, o LogEC50 mais alto equivale a uma maior estabilidade coloidal.
[0334] Os resultados (não mostrados) indicaram que, à medida que o pH do tampão aumentou, a estabilidade coloidal foi reduzida para todos os anticorpos 6470.
Além disso, a seguinte tendência foi obtida, do mais solúvel para o menos solúvel gL3gH23 e gL3gH36 > glagH23-S56N-N102H e gL3gH36-S56N-N102H > gL3- N33RgH23-S56N-N102H e gL3-N33RgH36-S56N-N102H.
[0335] Portanto, mutações introduzidas para a maturação por afinidade reduziram a estabilidade coloidal das moléculas de anticorpo. Não foi observada diferença entre os enxertos de gL3 gH23 e gL3 gH36. EFEITO DA TENSÃO NA INTERFACE AR-LÍQUIDO (ENSAIO DE AGREGAÇÃO)
[0336] As proteínas tendem a se desdobrar quando expostas a uma interface ar- líquido, onde superfícies hidrofóbicas são apresentadas ao ambiente hidrofóbico (ar) e superfícies hidrofílicas ao ambiente hidrofílico (água). A agitação das soluções de proteínas alcança uma grande interface ar-líquido que pode impulsionar a agregação. Esse ensaio serve para imitar tensões às quais a molécula seria submetida durante a fabricação (por exemplo, ultrafiltração) e para fornecer condições rigorosas, a fim de tentar discriminar entre diferentes moléculas de anticorpo.
[0337] As amostras em PBS pH 7 4, acetato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 125 mM pH 5,0 (acetato pH 5) e L-histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 foram estressadas por vórtex usando um Eppendorf Thermomixer Comfort'!Y, Os tampões foram escolhidos como tampões comuns de pré-formulação. Antes do vórtex, a concentração foi ajustada para 1 mg/ml usando os coeficientes de extinção apropriados (1,35 Abs 280 nm, 1 mg/ml, 1 cm de comprimento do caminho) e a absorbância a 280 nm, 340 nm e 595 nm obtida usando um espectrofotômetro Varian Caryº 50-Bio para estabelecer a leitura do tempo zero. Cada amostra foi subdividida em tubos cônicos de 1,5 ml com tampa Eppendorf & (4x 250 ul) e sujeita a condições rigorosas para testar a robustez por vórtex a 1.400 rpm a 25 ºC por até 24 horas. A agregação dependente do tempo (turbidez) foi monitorada por medição das amostras em 3 horas e 24 horas após o vórtice a 595 nm usando um espectrofotômetro Varian Cary'" 50-Bio. Os valores médios de absorbância foram plotados versus o tempo para cada amostra.
[0338] Os resultados são ilustrados na Figura 11. Não houve diferenças entre os anticorpos 6470 às 24 horas em qualquer um dos três tampões, no entanto, pequenas diferenças foram discernidas na propensão à agregação após 3 horas após o vórtice, que parecia ser dependente do tampão. ESTUDO DE TENSÃO DE DESAMIDAÇÃO/ISOMERIZAÇÃO DE ASP
[0339] Foi realizado um estudo de tensão utilizando anticorpos 6470 gL3gH23 e gL3gH36 para determinar a propensão à desamidação/isomerização de Asp de quatro desvantagens potenciais de sequência identificados: Asn(102)S (motivo de desamidação) na CDR3 de cadeia pesada; Asn(98)Asp(99) (motivo de desamidação) na CDR3 da cadeia leve; Asn(32)Asn(33) (motivo de desamidação) na CDR1 da cadeia leve e ASp(99)G (motivo de isomerização de Asp) em CDR3 da cadeia leve. A propensão/taxa de desamidação e isomerização de Asp não pode ser prevista, uma vez que está dependente de sequência primária e da estrutura 3D, bem como de propriedades da solução (RC Stephenson e S Clarke (1989); K. Diepold et al (2012); Jasmin F. Sydow et al (2014); NE Robinson et al (2004)
[0340] Os níveis basais de desamidação (amostras não estressadas) também foram obtidos - baixos níveis indicam baixa suscetibilidade, mas os níveis podem mudar devido a diferentes lotes/condições de fabricação.
[0341] Os dois anticorpos 6470 foram trocados de tampão em tampões (i) conhecidos por favorecer a desamidação de resíduos de Asn(N) (Tris pH 8/87 ºC) e (ii) conhecidos por favorecer a isomerização de Asp (acetato, pH 5/87 ºC). A concentração final da amostra em cada um dos tampões foi ajustada para -6,5 mg/ml e depois dividida em duas alíquotas, onde uma foi armazenada a 4 ºC e outra a 37 ºC por até 4 semanas. Uma alíquota foi removida imediatamente (TO) e às 2 e 4 semanas e armazenada a -20 ºC.
[0342] As amostras de 2 semanas foram descongeladas e analisadas por digestão tríiptica/espectroscopia de massa (MS) para análise de modificação química como se segue. As amostras de proteínas estressadas foram reduzidas com TCEP e alquiladas com ácido cloroacético em Tris-HCI pH 8,0 contendo 0,1% p/v de detergente RapiGest. Foi adicionada tripsina (1:25 p/p) e as amostras foram digeridas durante a noite à temperatura ambiente. A proteólise foi interrompida pela adição de ácido fórmico a 1% v/v e as amostras foram diluídas a 0,5 mg/ml antes da centrifugação para remover o Rapigest”Y precipitado. Os peptídeos resultantes foram separados e analisados em uma coluna Waters BEH C18 em interface com um espectrômetro de massa Thermo Fusion'Y, executando um método orbitrap-orbitrap dependente de dados de +ve-íon, com fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID). Os dados de LC-MS foram analisados usando o software Thermo Xcalibur"" e PepfinderTY,
[0343] A HPLC com exclusão por tamanho e a SDS PAGE também foram realizadas para monitorar a agregação/degradação.
[0344] Os resultados do mapeamento peptídico/espectrometria de massa mostraram que o nível basal de desamidação de Asn em todos os três locais de CDR era <1,5% e que a desamidação aumentou no máximo até -6% após 2 semanas a pH 8,0 e 37 ºC para local de Asn(102)S na CDR3 de cadeia pesada.
[0345] A modificação de Asp(99) (formação de succinimida) na CDR3 da cadeia leve foi de -25% após 2 semanas a pH 5,0 e 37 ºC.
[0346] O efeito de modificação química (desamidação em Asn (102) em CDR3 de cadeia pesada e formação do intermediário succinimida na Asp(99) em CDR3 de cadeia leve) na afinidade/avidez para monômero de alfa-sinucleína humana recombinante comprimento total e fibrilas de alfa-sinucleína humana recombinante purificadas foram avaliadas. Um produto totalmente desamidado (Asn(102)Asp) e um material sob tensão (pH 5/semana 2/37 ºC) foram utilizados no estudo. EXEMPLO 6: IMUNO-HISTOQUÍMICA
[0347] A imuno-histoquímica foi realizada por Asterand Bioscience (Royston, Reino Unido). As criosseções (10 um) foram submetidas primeiro ao procedimento de recuperação de antígeno usando as soluções de recuperação de alvos Dako PT Link e EnVision FLEX (pH 6) a 97 ºC por 20 minutos com aquecimento e resfriamento automático. Todas as etapas de incubação seguintes foram realizadas à temperatura ambiente. As criosseções foram secas a ar por 30 minutos, fixadas em paraformaldeído a 4% preparado em 1X PBS por 10 minutos, lavadas com o tampão de lavagem Dako EnvVision'y FLEX (Dako) e depois carregadas em um Dako Autostainer Plus. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das seções com o bloco Dako peroxidase (Dako) por 5 minutos. As seções foram então lavadas duas vezes com 1X PBS antes de serem incubadas com o bloco de proteínas Dako CSA Il (Dako) durante 10 minutos. A solução de bloco de proteínas foi removida por jato de ar e as seções incubadas por 30 minutos com IgG1 de coelho 6470 (compreendendo SEQ ID NOs: 47 e 48) diluídas (0,05 ug/ml) em diluente de anticorpo Dako (Dako). Após a incubação, as seções foram lavadas duas vezes com 1X PBS, depois incubadas com substrato de polímero HRP anticoelho Dako Flex (Dako) por 20 minutos, lavadas duas vezes e depois incubadas com substrato de diaminobenzidina (Dako) por 10 minutos. A reação cromogênica foi interrompida lavando as lâminas com água destilada. Após a cromogênese, as seções foram removidas do Dako Autostainer Plus e contracoradas manualmente com hematoxilina, desidratadas em uma série ascendente de etanol, eliminadas em três trocas de xileno e a tampa deslizada sob meio de montagem DPX (Sigma-Aldrich). As imagens digitais das seções coradas foram obtidas usando o sistema Aperio ScanScope AT Turbo (Leica Biosystems). Um anticorpo 6470 foi testado em seções cerebrais derivadas de cinco diferentes doadores pS129-a-sinucleína positivos e três doadores diferentes pS129-a-sinucleína-negativos (1 seção/doador). Um anticorpo 6470 rotulou as características neuropílicas e corpos de Lewy no córtex temporal e substância nigra de pacientes com DP (Figura 12 A-E). Nos tecidos cerebrais de não DP, o anticorpo 6470 marcou o neurópilo no córtex temporal, mas nenhuma estrutura semelhante a corpos de Lewy foram observadas no córtex ou substância nigra (Figura 12 M-H). Essas observações sugerem que o anticorpo 6470 se liga à a-sinucleína normal no neurópilo dos tecidos cerebrais de pacientes com DP e sem DP, enquanto se liga à a- sinucleína patológica presente nos corpos de Lewy apenas nos pacientes com DP. EXEMPLO 7: ENSAIO DE AGREGAÇÃO BASEADA EM CÉLULAS
[0348] As células HEK Freestyle 293F (células de suspensão) foram preparadas a 0,7x10º células/ml em meio de expressão Freestyle 293 (Invitrogen'Y) e cultivadas a 300x10º células/ml. A transfecção foi realizada de acordo com as instruções do fabricante e, brevemente, 600 ug de pcDNA3.1 (+) incorporando o gene da alfa- sinucleína foram misturados em 20 ml de meio OptiMEM, enquanto a 293Fectina foi ilustrada em meio OptiMEM (Invitrogen'!Y) e incubada por 5 minutos à temperatura ambiente. O DNA diluído foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante minutos antes de ser adicionado gota a gota nas células (20 ml por frasco). As células foram incubadas durante 24 horas a 37 “*C, 125 rom, 8% de CO». As células foram usadas imediatamente ou congeladas na concentração de 5 milhões de células/ml em FBS + 10% de DMSO.
[0349] Caso as células tenham sido previamente congeladas, os criotubos foram descongelados e as células ressuspensas em meio Freestyle 293, centrifugadas a 500 g durante 5 minutos, o sobrenadante foi descarregado e o sedimento foi ressuspenso em meio Freestyle 293 (Life Technologies!Y) compreendendo Pen/Strep (InvitrogenTY) a 2x106 células/ml. Em uma placa de 384 poços (Grainer"Y), foram adicionados 20 ul de suspensão de células (a um total de cerca de 40.000 células/poço). A cada poço, foram adicionados 150 nM de fibrilas alfa-sinucleina humana (preparadas como descritas aqui no Exemplo 1) seguidos pelos anticorpos (6470 gL3gH23; 6470 gL3gH36; 6470 gL3N33gH23 S56N N102; 6470 gL3N33gH23 S56N N102; 6470 gL3gH23 S56N N102; 6470 gL3gH23 S56N N102; S56N N102; todas como sequências de IgG4P de comprimento total na Tabela 1) em PBS a serem testadas (em várias concentrações). As placas foram incubadas a 37 ºC, 5% de CO;>, 95% de umidade em um incubador de cultura de células durante 2 dias.
[0350] No fim do segundo dia, o meio foi aspirado a partir de todas as cavidades e lavou-se a placa deixando 20 ul por poço. Cerca de 50 ul de PBS foi adicionado a cada poço e as placas foram centrifugadas a 500 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado a partir de todas as cavidades com um lavador de placas, deixando 20 ul de meio em cada poço. Adicionou-se Versene (Lonza'Y) (50 ul/poço) e as placas foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado deixando apenas 20 ul de meio por poço. Cada poço foi suplementado com 20 ul de 8% de formaldeído (solução 16% em água, Life Technologies'!Y) + 2% de Triton X-100 (VWRTY) em PBS. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois 50 ul de tampão de FACS constituído por HBSS (livre de cálcio- magnésio VWRTY) + 2% de FBS + 2 mM de EDTA, (Life Technologies'Y) foram adicionados. As placas foram centrifugadas a 2.000 g durante 1 minuto e o sobrenadante foi aspirado deixando apenas 20 ul de meio em cada poço. Cada poço foi ainda suplementado com 20 ul de tampão de FACS com anticorpo alfa-sinucleína anti-pSer129 (AbcamTY) diluído 1:300. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, cada poço foi suplementado com 50 ul de tampão de FACS antes da centrifugação de novo a 2.000 g durante 1 minuto. O sobrenadante foi removido antes de cada poço ser suplementado com anticorpo secundário — anticoelho conjugado com Alexafluor647 diluído 1:500 (Life Technologies!Y) e DAP! (Life Technologies'Y). As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente no escuro, e, em seguida, 50 ul de tampão de FACS foram adicionados e as placas foram centrifugadas a 2.000 g durante 1 minuto. Após a lavagem, mais tampão FACS foi adicionado e as placas estavam prontas para serem colocadas no citômetro de fluxo (BD FACS Canto Il) para a leitura.
[0351] Os dados do FACS foram analisados usando o software FlowdJo. Primeiramente, as células únicas vivas foram fechadas utilizando dispersão frontal e lateral. Em segundo, eventos de DAPI+ foram fechados e seu número foi usado como uma medida do número de células individuais nucleadas vivas. Finalmente, as células positivas para fosfo-serina 129-alfa-sinucleíina (pSer129+) foram fechadas. A porcentagem de células pSer129+ em relação a todas as células DAPI+ foi usada como uma medida de agregação. Os dados foram normalizados em relação aos poços tratados apenas com fibrilas e sem anticorpo, e expressos como uma porcentagem.
[0352] Os resultados estão resumidos na Figura 13, que mostra a capacidade dos anticorpos testados para inibir a agregação induzida por fibrilas de alfa-sinucleína nas células que expressam alfa-sinucleína. Esses dados confirmam que os anticorpos da presente invenção foram capazes de bloquear a agregação induzida por fibrilas de sinucleína-alfa, com ICso inferior a 5 nM.
[0353] Barras de erro representam erro padrão de medição (SEM, N=3,n=9). EXEMPLO 8: ENSAIO DE AGREGAÇÃO DE NEURÔNIOS PRIMÁRIOS
[0354] Os hipocampos de embriões de camundongo E17 foram dissecados em tampão de dissecação (HBSS sem cálcio e sem magnésio, 0,6% de D-(+)-Glicose, 20 mM de Hepes). O tampão de dissecção foi então removido e substituído por uma solução de dissociação (HBSS sem cálcio e sem magnésio, 0,6% de D-(+)-Glicose, mM de HEPES, 40 U/m de papaína, 1 mg/ml de DNase, 1 mM de L-cisteína, 0,5 mM de EDTA ). Após 30 minutos de incubação a 37 ºC, o tampão de dissociação foi removido e os hipocampos foram lavados 3x com meio de revestimento (Meio NeurobasalTY, suplemento B27 a 2%, GlutaMAX 1mM, FBS a 2,5%, FBS a 2,5%, 50 unidades/ml de penicilina-estreptomicina). Os aglomerados de tecido foram triturados com uma pipeta de 1 ml para obter uma suspensão de célula única. As células foram diluídas para a concentração apropriada no meio de revestimento. Cerca de 15.000 células foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 384 poços revestida com PDL. As células foram em seguida mantidas em uma incubadora de cultura de células, a 37 ºC, 5% de CO», 95% de umidade.
[0355] No dia seguinte, 80% do meio foi substituído por meio de revestimento sem FBS [Meio NeurobasalTY, suplemento B27 a 2%, GlutaMAX 1 mM, 50 unidades/ml de Penicilina-Estreptomicina). Sete dias após o plaqueamento, o meio foi removido deixando 20 ul em cada poço. A cada poço, 100 nM de fibrilas de alfa-sinucleina humana (preparadas como aqui descritas no Exemplo 1) foram adicionados seguidos pelo anticorpo 6470 (6470gL3gH36 hlgG4P; VR6470 na Figura 14 compreendendo SEQ1D NO: 17 e SEQID NO: 33) em PBS para ser testado (em várias concentrações). A placa foi incubada a 37 ºC, 5% de CO», 95% de umidade em um incubador de cultura de células durante um período adicional de 7 dias. Quatorze dias após o revestimento, o meio foi aspirado de todos os poços, deixando 20 ul por poço. Cada poço foi lavado com 80 ul de salina tamponada com fosfato de DulBecco (DPBS). A DPBS foi removida e as células foram incubadas em 40 ul de tampão de fixação (DPBS com paraformaldeído a 4%) por poço por 15 minutos. O tampão de fixação foi então removido e as células foram lavadas novamente com 80 ul de DPBS. A DPBS foi removida e substituída por 40 ul de tampão de permeabilização (DPBS com 0,1% de Triton X-100) por poço. Após 10 minutos, o tampão de permeabilização foi removido e as células foram incubadas por 1 hora em 40 ul de tampão de bloqueio (PBS com 1% de BSA e 0,1% de Triton X-100) por poço. O tampão de bloqueio foi então removido e substituído por 40 ul/poço da solução de anticorpo primário (tampão de bloqueio com 0,3% de anticorpo alfa-sinucleína antifosfoserina 129 de coelho (AbCamTY ab51253). A solução de anticorpo foi incubada nas células por 1 h, seguido por três lavagens (90 ul/cada, PBS). Após a última lavagem, o PBS foi removido e substituído por 40 ul de solução de anticorpo secundário (anticorpo anticoelho conjugado com AlexaFluor647 a 0,1% em PBS com anticorpo anti-beta-lll-tubulina conjugado com AlexaFluor488 a 0,2%). A solução de anticorpo secundário foi incubada nas células por 1 h, em seguida, removida e substituída por 40 ul de PBS contendo 0,3% de CellMask Blue'Y. Após 5 min de incubação, os poços foram lavados 3 vezes com 80 ul de PBS, em seguida, encheu-se com 50 ul de PBS cada poço antes de a placa ser velada com uma película de plástico transparente.
[0356] As placas foram imageadas em um gerador de imagens Arrayscan (ThermoFisher Scientific'M). As imagens foram analisadas usando o software HCS Scan"'Y do mesmo fabricante. A densidade neuronal foi monitorada usando o sinal beta-lll-tubulina. Campos esparsos ou campos mostrando uma camada celular neuronal danificada, refletida por uma diminuição significativa na superfície do sinal beta-lll-tubulina, foram excluídos. Finalmente, a superfície do sinal pSer129 alfa- sinucleina por campo foi usada para quantificar a agregação patológica de alfa- sinucleína.
[0357] Acredita-se que a fosforilação em S129 da alfa-sinucleína desempenhe um papel importante no controle das funções normais da alfa-sinucleína, bem como na regulação de sua agregação, formação de LBs e neurotoxicidade. Sob condições normais, apenas uma pequena fracção de alfa-sinucleina é constitutivamente fosforilada em S129 no cérebro (Fujiwara H, et al. (2002) Cell Biol Nat, 4, 160 a 164), enquanto que foi observada uma acumulação drástica de pS129 no cérebro de pacientes que sofrem de sinucleinopatias (Kahle PJ, et al. (2000) Ann NY Acad Sci, 920, 33 a 41); Okochi M, et al. (2000) J. Biol Chem, 275, 390 a 397); Anderson JP et al. (2006) J. Biol Chem, 281, 29.739 a 29.752).
[0358] Os dados foram normalizados em relação aos poços tratados apenas com fibrilas e sem anticorpo, e expressos como uma porcentagem. Como mostrado na
Figura 14, 6470 gL3gH36 (indicado como VR6470) inibe a agregação de alfa- sinucleina induzida por fibrilas de alfa-sinucleina em neurônios primários de camundongo que expressam níveis endógenos de alfa-sinucleína. Barras de erro representam erro padrão da média (SEM, N = 4, n = 18). Esses dados confirmam que 6470 gL3gH36 foi capaz de bloquear a agregação induzida por fibrilas de alfa- sinucleina em neurónios primários de camundongo, com ICso inferior a 4 nM. EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DO VR6470 IN VIVO
[0359] O anticorpo 6470gL3gH36 IGgG4P (nomeado neste exemplo VR6470 e compreendendo SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 33) foi testado em camundongos machos do tipo selvagem C57BI/6J (Janvier, França) e em um modelo transgênico de camundongo Knockout de a-sinucleína que expressa alfa-sinucleína humana (a seguir denominada SNCA-OVX; Charles River, França).
[0360] Os camundongos C57BI/(6J e SNCA-OVX foram injetados com 6470gL3gH36 IgG4P e fibrilas pré-formadas murinas (PFF) (preparadas como descrito aqui no Exemplo 1). Um anticorpo de controle negativo (101.4) e o veículo também foram injetados juntamente com um anticorpo comparador anti-alfa- sinucleiína (comparador Ab C-term) que liga a alfa-sinucleina nos últimos nove resíduos C-terminais. Esse anticorpo comparador (que possui CDRs diferentes dos anticorpos de acordo com a presente invenção) mostrou características de ligação comparáveis aos anticorpos da presente invenção. O anticorpo comparador possui uma maior afinidade para a alfa-sinucleína do que os anticorpos da presente invenção e propriedades biofísicas semelhantes. Foi também igualmente eficaz ao impedir a agregação de alfa-sinucleina em ensaios baseados em células HEK de acordo com o exemplo 8 (Tabela 11). TABELA 11
KD1 ka1 ka1 (1/Ms) Ikd1 5) nm) (Ms) kd1 (1/s) KD1 (nM)|((nM) 1,07E+0 Menor que Ab C-term| 1,03E- 1,08E+O0 Menor que
[0361] Os anticorpos foram pré-incubados com os PFFs durante 30 minutos, em um agitador, à temperatura ambiente, antes da administração direta no cérebro dos animais. As misturas de anticorpos/PFFs foram preparadas em PBS em uma razão de 1 ug de PFFS/10 ug de anticorpos. Foi utilizado PBS a pH 7,4 como solução do veículo. Uma injeção foi feita 24 h antes da administração intracerebral combinada.
[0362] Os anticorpos foram então administrados intraperitonealmente a camundongos na dose de 30 mg/kg. A segunda injeção intraperitoneal foi administrada 7 dias após a primeira e, em seguida, foi realizada com o mesmo regime (uma injeção intraperitoneal/semana na dose de 30 mg/kg para um volume de administração de 10 ml/kg) por 4 semanas durante um total de 4 injeções para camundongos machos selvagens C57BI/6J e por 11 semanas para um total de 12 injeções para camundongos SNCA-OVX. Para ambas as experiências, os camundongos foram aleatoriamente designados para os grupos de tratamento medicamentoso e os pesquisadores foram cegos para o tratamento.
[0363] As experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes da Diretiva Europeia 2010/63/UE e da legislação belga. O comitê de ética para experimentação animal da UCB Biopharma SPRL (LA1220040 e LA2220363) aprovou o protocolo experimental (ASYN-IC-PARKINSON-MO). Os camundongos pesavam entre 25 e 30 g e tinham 17 semanas de idade no momento da cirurgia. Os camundongos foram alojados em gaiolas (4 camundongos por gaiola, Macrolon tipo 2). Eles foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12:12, com luz acesa às 06: 00h. A temperatura foi mantida a 20 a 21 ºC e a umidade era de cerca de 40%. Todos os animais tiveram acesso livre a comida e gotas de água padrão antes da atribuição aos grupos experimentais. Enriquecimento e bem-estar adicionais foram fornecidos (Enviro-dri, Pharma Serv) antes e após a cirurgia. A saúde animal foi monitorada diariamente pela equipe de assistência animal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O sacrifício foi realizado sob anestesia.
[0364] A cirurgia foi realizada sob anestesia geral utilizando uma mistura de 50 mg/kg de cetamina (Nimatek, Eurovet Animal Health BV) e 0,5 mg/kg de medetomidina (Domitor, Orion Corporation) injetada por via intraperitoneal. Além disso, 2,5 mg/kg de atipamezol (Antisedan, Orion Corporation) foram administrados para apoiar o despertar. Os PFFs purificados recombinantes foram descongelados e sonicados à temperatura ambiente (Qsonica 500 - 20 kHz; 65% de potência, por 30 pulsos de 1s LIGADO, 1 s DESLIGADO por um minuto). Os PFFs foram, em seguida, pré- misturados com os anticorpos durante 30 minutos e agitados à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da injeção no cérebro. A solução (2 ul) foi infundida a uma taxa de 0,2 ul/min e a agulha foi deixada no local por mais 2,5 minutos antes de sua retração lenta. As injeções foram realizadas unilateralmente no estriado direito nas seguintes coordenadas: PA = +0,20 mm, ML = -2,00 mm, DV = -3,20 mm.
[0365] Após anestesia, os camundongos foram perfundidos por perfusão transcardíaca com PBS a 0,9% gelado contendo 10 U/ml de heparina por 9 minutos a uma taxa de fluxo de 6 ml/min através do ventrículo esquerdo. O átrio direito foi cortado como uma via de saída. Posteriormente, os animais foram perfundidos com paraformaldeído a 4% gelado em PBS por 15 minutos a uma taxa de fluxo de 6 ml/min. Os cérebros foram pós-fixados durante a noite em PBS contendo paraformaldeído a 4% a 4 ºC (dia 0). Na manhã seguinte (dia +1), o paraformaldeído a 4% foi descartado e os cérebros foram lavados em PBS frio e incubados durante a noite. No dia seguinte (dia +2), os cérebros foram lavados em PBS por um período mínimo de 1 hora e transferidos para PBS contendo 15% de sacarose e armazenados a 4 ºC até a remessa.
[0366] O corte cerebral foi realizado na Neuroscience Associates (TN, EUA). Primeiro, os cérebros foram tratados durante a noite com 20% de glicerol e 2% de dimetilsulfóxido para evitar artefatos de congelamento e incorporados em uma matriz de gelatina usando a Tecnologia MultiBrain&. Após a cura, os blocos foram congelados rapidamente por imersão em isopentano resfriado a -70 ºC com gelo seco picado e montados no estágio de congelamento de um micrótomo deslizante AO860. Os blocos MultiBrain&O foram seccionados no plano coronal a 40 um. Todas as seções foram coletadas sequencialmente em 24 recipientes por bloco que foram preenchidos com solução Antigen Preserve (49% de PBS pH 7,0, 50% de etileno glicol, 1% de polivinilpirrolidona). As seções não coradas imediatamente foram armazenadas a -20 ºC.
[0367] As seções flutuantes foram coradas por imunoquímica com anticorpo alfa- sinucleína pSer129 (anti-alfa-sinucleína de camundongo (pSer129) Biotina - (Wako - 010-26481)), diluída a 1:30.000. Todas as soluções de incubação a partir do soro bloqueador utilizaram solução salina tamponada Tris (TBS) com Triton X-100 como veículo; todas as lavagens foram realizadas com TBS. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com peróxido de hidrogênio a 0,9% e a ligação não específica foi bloqueada com soro normal total de 1,26%. Após as lavagens, as seções foram coradas com um anticorpo primário durante a noite à temperatura ambiente. A solução do veículo continha 0,3% de Triton X-100 para permeabilização. Após as lavagens, as seções foram incubadas com um complexo avidina-biotina-HRP (Kit Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante uma hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as seções foram tratadas com tetra- hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio a 0,0015% para criar um produto de reação visível, montado em lâminas de vidro gelatinizado (seco), secas ao ar, levemente coradas com tionina, desidratadas em álcoois, limpas em xileno e tampa - escorregou com Permount.
[0368] A imuno-histoquímica fluorescente para p82/SQSTM1 (p62 é conhecida por coagregar em corpos de Lewy em humanos) e manchamentos Amytracker (para agregados de proteínas em geral) foram realizados em seções do cérebro de flutuação. Demonstrou-se que o VR6470 reduz o número de proteínas agregadas coradas com Amytracker e colocaliza com pS129. Isso indica que o anticorpo VR6470 não apenas reduz a fosfosinucleina, mas também reduz os agregados de sinucleína
(dados não mostrados).
[0369] A quantificação de sinal de alfa-sinucleína pSer129 por sinal de alfa- sinucleína pSer129 por campo foi utilizada para quantificar a agregação de alfa- sinucleína patológica no lado ipsilateral do estriado, córtex, amígdala basolateral, e substância nigra. As regiões de interesse (ROI) foram delineadas manualmente e a quantificação automática do sinal de alfa-sinucleína pSer129 nas diferentes regiões do cérebro foi realizada com o software VisioPharm 6 (VisioPharm). Para quantificar o sinal de alfa-sinucleína pSer129, o algoritmo bayesiano linear, que fornece um valor de área de sinal (área de marcador em um2), foi utilizado. A área do marcador reflete a quantidade de patologia da pSer129 alfa-sinucleína que cobre as diferentes regiões do cérebro. Todas as quantificações foram feitas às cegas até o final da análise estatística.
[0370] As análises dos dados foram feitas na % da área do marcador (isto é, a razão entre a área do sinal pSer129 em um? e a região da região de interesse em um?). A % da área do marcador foi avaliada repetidamente para várias seções do cérebro posicionadas rostro-caudalmente (estriado: 13 a 14 seções de Bregma +1,1 a -0,94; córtex: 13 a 14 seções de +1,1 a -0,94; amígdala basolateral: 6 a 10 seções entre -0,58 a -2,06; substância nigra: 6 a 8 seções de -2,54 a -3,88), e uma AUC foi calculada separadamente para cada indivíduo testado.
[0371] ANOVA unidirecional foi considerada para análise estatística. A ANOVA foi seguida por múltiplas comparações pareadas entre médias sem nenhum ajuste de multiplicidade. (com **, para p <0,01 e *, para p <0,05). Os dados foram transformados em log para atender aos critérios de normalidade e homoscedasticidade. Os gráficos representam as médias geométricas dos dados não transformados.
[0372] Como mostrado nas Figuras 15A e 15B, o anticorpo 6470 (correspondente a 6470gL3gH36 IgG4P) diminuiu acentuadamente a patologia da alfa-sinucleína (ou seja, sinal de alfa-sinucleína pSer129) em comparação com os três grupos de controle, em quatro regiões cerebrais ipsilaterais diferentes, incluindo o estriado, o córtex cerebral, a amígdala e a substância nigra, uma mês após a administração de TFPs murinos a camundongos macho C57BlI/6J do tipo selvagem (Figura 15A) e três meses após a administração de PFFs humanos para camundongos macho SNCA- OVX (Figura 15B).
[0373] A Figura 16 mostra a quantificação de alfa-sinucleína em Ser129 fosforilada (AUC da % da área do marcador) no córtex ipsilateral, estriado, amígdala e substância nigra de camundongos C57BL/6J do tipo selvagem, respectivamente. O anticorpo de controle negativo e o anticorpo C-terminal comparador não diminuíram a patologia da alfa-sinucleína em comparação com o grupo tratado com veículo. Por outro lado, o anticorpo 6470 diminuiu significativamente o nível de patologia (ou seja, sinal alfa- sinucleína pSer129) no córtex, estriado, amígdala e substância nigra (p <0,01), em comparação com os três grupos de controle de camundongos C57BI/6J injetados com PFFs murinos. Quando testado em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem, o grupo tratado com 6470 mostrou níveis reduzidos significativos de alfa-sinucleína pSer129 em quatro estruturas diferentes e entre esses, três regiões distais do local de injeção (córtex, nigra e amígdala).
[0374] Nos camundongos SNCA OVX injetados com PFFs humanos, o anticorpo 6470 diminuiu significativamente o nível de patologia no córtex e no estriado em comparação com os camundongos que receberam o veículo, o anticorpo de controle negativo (101.4) e o anticorpo C-terminal comparador. Em camundongos SNCA-OVX, 6470 mostrou níveis significativamente reduzidos de pSer129 em, pelo menos, duas estruturas diferentes do cérebro (córtex e no estriado) com pelo menos um (córtex cerebral) distal do local da injeção.
[0375] Esses resultados confirmam que os anticorpos compreendendo as características estruturais da presente invenção, tais como 6470gL3gH36 IgG4P, são capazes de impedir in vivo o aparecimento de alfa-sinucleína fosforilada em Ser129.
[0376] Além disso, os resultados demonstram que nem todos os anticorpos que se ligam à a-sin na região C-terminal são eficazes in vivo. O anticorpo comparador, que se liga ao último C-terminal de uma alfa-sinucleína com alta afinidade e que é eficaz na prevenção da agregação de alfa-sinucleína em ensaios à base de células, falhou ao impedir a fosforilação de Ser129 in vivo.
[0377] Portanto, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado para o tratamento de alfa-sinucleinopatias, por exemplo, quando caracterizadas por um aumento de fosforilação de Ser129, incluindo a doença de Parkinson (DP) (incluindo as formas idiopáticas e hereditárias da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB ), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), doenças de Alzheimer e Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1). EXEMPLO 10: S FARMACOCINÉTICOS DO ANTICORPO 6470 EM
CAMUNDONGOS
[0378] Camundongos machos C57/BI6 (n = 3 por medicamento) foram injetados por via intravenosa como uma dose única de 2mg/kg com anticorpo 6470gL3gH36 I9gG4P (compreendendo SEQ ID NOs: 17 e 33; na Figura 17 e a seguir simplesmente referido como 6470).
[0379] As amostras de sangue foram tomadas (0,083, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168 e 336 horas de injeções) a partir da veia da cauda e deixou-se coagular à temperatura ambiente. O soro foi isolado após centrifugação, que foi congelado até a análise. A quantificação de 6470 foi realizada por LC-MS/MS. As amostras de soro do estudo foram descongeladas e quantificadas contra uma linha de calibração preparada usando 6470 ou o anticorpo comparador adicionado em diferentes concentrações no soro de camundongo de controle. Antes de injetar as amostras no sistema LC-MS/MS, o soro foi desnaturado, reduzido e alquilado usando acetonitrila (VWR, Reino Unido), cloridrato de TCEP-Tris (2-carboxietil)fosfina (Sigma, Reino Unido) e iodoacetamida (Sigma, Reino Unido), respectivamente. As amostras alquiladas foram então reconstituídas em tampão de bicarbonato de amônio 100 mM (Sigma, Reino Unido) e digeridas durante a noite usando a enzima tripsina (Promega, Reino Unido) a 37 ºC. A digestão foi parada adicionando ácido fórmico às amostras para diminuir o pH e depois dessalinizada usando a placa Waters HLB SPE. O eluente resultante foi evaporado usando evaporador a vácuo. Depois que as amostras foram completamente secas, foram reconstituídas com 95/5: Água/Acetonitrila contendo ácido fórmico a 0,1% e injetadas no sistema LC-MS/MS. A análise LC-MS/MS foi realizada pelo sistema HPLC de destaque Schimadzu acoplado ao espectrômetro de massa triplo quádruplo AB Sciex QTrap 6500. A amostra digerida foi injetada pelo amostrador automático em uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência e fase reversa (coluna de peptídeo Phenomenex Aeris C18 100X2,1 mm, 2,6 um) que foi mantida a 50 ºC. Um gradiente linear de 5 a 70% de acetonitrila em ácido fórmico a 0,1% foi aplicado por 6 minutos e depois aumentado para 95% de acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico durante 0,8 minuto a uma taxa de fluxo de 0,6 mi/min. O espectrômetro de massa foi configurado para executar análise de monitoramento de reação múltipla para detectar transições múltiplas de peptídeos de 6470 ou 5811 a um tempo de permanência de 50 milissegundos por transição. A análise dos dados foi realizada no software Analyst 1.6.
[0380] Esses dados demonstram que o anticorpo 6470 possui propriedades farmacocinéticas muito boas (Tabela 12 e Figura 17 A) no camundongo, com base nos baixos valores de depuração medidos. Esses parecem ser superiores às faixas típicas cotadas para fármacos de IgG humanos doseados a camundongos (3 a 16 ml/dia/kg; Deng et al 2011 mAbs 3:1 61 a 66).
[0381] A propriedade farmacocinética do anticorpo 6470 também foi investigada em macacos cynomolgus e comparada com um anticorpo da técnica anterior. Macacos cynomolgus machos (n = 3 ou n = 6 por medicamento) foram injetados por via intravenosa como uma dose única de 2 ou 3 mg/kg de anticorpo 6470gL3gH36 IgG4P (6470) e outro anticorpo anti-alfa-sinucleína comparador (anticorpo I9G1 anti- alfa-sinucleína que se liga à alfa-sinucleina no aminoácido 118-126; WOZ2013/063516).
[0382] As amostras de sangue foram coletadas em vários momentos (0,083, 1,3, 6, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 504, 576, 672 horas após as injeções) e deixadas coagular à temperatura ambiente. O soro foi isolado após centrifugação, que foi congelado até a análise. As amostras foram descongeladas e analisadas utilizando LC/ES| MS/MS. Para 6470, foi utilizado o método aqui descrito anteriormente nesse exemplo, com a quantificação feita através da criação de uma curva padrão no soro de cynomolgus. Para o anticorpo comparador, a mioglobina de cavalo foi usada como um padrão interno e a quantificação feita comparando os sinais para o sinal de padrão interno. Para a preparação, as amostras foram misturadas com o padrão interno. As amostras foram então desnaturadas, alquiladas e consequentemente submetidas à digestão enzimática durante a noite (tripsina). Após a digestão, as amostras são diluídas e os peptídeos de assinatura para todos os analitos são submetidos à análise por LC-MS/MS. As amostras foram preparadas apenas uma vez e injetadas duas vezes (uma vez para cada método).
[0383] Os perfis de tempo de concentração foram analisados usando Pharsight Phoenix 6 utilizando análise não comportamental para obter parâmetros farmacocinéticos de meia-vida e depuração para cada animal individual. Parâmetros de média e desvio padrão foram relatados para cada molécula.
[0384] Como mostrado na Figura 17 B e na Tabela 1 2, um anticorpo 6470 exibe também excelentes propriedades farmacocinéticas em macacos cynomolgus exibindo baixa depuração. Como no camundongo, seu comportamento farmacocinético parece ser superior à faixa típica cotada para fármacos de IgG humanos administrados a macacos cynomolgus (5 a 12 ml/dia/kg; Deng et al 2011 mabs 3:1 61 a 66).
[0385] A depuração rápida em cynomolgus observada para o anticorpo comparador é consistente com os dados humanos publicados (JAMA Neurology 2018, 75, 10: 1.206 a 1.214). O anticorpo 6470 é superior ao anticorpo comparador tanto na exposição quanto na depuração em comparação com o anticorpo comparador que exibe recursos e parâmetros farmacocinéticos pobres, atípicos. TABELA 12 [comparador [| [234668 “|

Claims (30)

U7 REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfa-sinucleína, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que compreende: a. região variável de cadeia leve que compreende: i.uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 44; ii. uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2 e iii. uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3; e b. uma região variável de cadeia pesada que compreende: i. uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; ii. uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 45 e iii, uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 46.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga à alfa-sinucleína a um epítopo compreendendo, com referência à SEQ ID NO: 10, resíduos E123, Y 125, E126, M127, P128, S129, E130 e E131, em que epítopo opcionalmente compreende A124 e G132,
3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo impede a agregação de alfa-sinucleíina induzida por fibrilas de alfa-sinucleína.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de se ligar à alfa-sinucleína como um monômero e em fibrilas.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que tem uma maior afinidade de ligação para a alfa-sinucleína em fibrilas em comparação com alfa- sinucleína monomérica definida por uma constante de dissociação (Kp) de pelo menos vezes maior para alfa-sinucleína monomérica do que para alfa-sinucleína em fibrilas.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que tem uma (Ko) para a alfa-sinucleína em fibrilas de 300 pm ou menos.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que não se liga à beta-sinucleína e/ou gama-sinucleína.
8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de comprimento total é selecionado a partir de uma IgG1, IgG4 ou IgG4P.
11. Fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado a partir de um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv, um dAb ou um VHH.
12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 31; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 33.
13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 23; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 25.
14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 que compreende SEQ ID NO: 1; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27 ou 35; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 29 ou 37.
15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 que compreende SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23 ou 31; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 25 ou 33.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: a. uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR- L1 que compreende SEQ ID NO: 7; uma CDR-L2 compreendendo a SEQ ID NO: 2 e uma CDR-L3 compreendendo a SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma CDR-H2 compreendendo a SEQ ID NO: 8 e uma CDR-H3 compreendendo a SEQ ID NO: 9; ou b. uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 27 ou 35; ou Cc. uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID SEQ ID NO: 29 ou 37.
17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que: a. compete pela ligação da alfa-sinucleína com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores; e/ou b. bloqueia cruzadamente ou é bloqueado cruzadamente pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para a ligação à sinucleína alfa; e/ou Cc. se liga à alfa-sinucleína ao mesmo epítopo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores; e/ou d. compreende uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 35; e/ou e. compreende uma região variável de cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou semelhança com a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19.
18. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
19. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica: a. uma região variável de cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; ou ii. compreende SEQ ID NO: 16 ou 20; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20; b. uma região variável de cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou ii. compreende SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 36; Cc. uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; ou ii. compreende SEQ ID NO: 18 ou 22; ou iii. consiste essencialmente em SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 22; d. uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo: i. é pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou ii. compreende SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38; ou iii. consiste essencialmente na SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 38.
20. Vetor de clonagem ou expressão caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 18 ou 19.
21. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende: a. um ou mais polinucleotídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, ou b. um ou mais vetores de expressão como definidos na reivindicação 20.
22. Processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 21, sob condições adequadas para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e um ou mais carreadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
25. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma ou mais sinucleinopatias.
26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada a partir da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD ), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doenças de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1).
27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é a doença de Parkinson.
28. Método para tratar uma sinucleinopatia em um paciente caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada a partir da doença de Parkinson (DP) (incluindo formas idiopáticas e herdadas da doença de Parkinson), Demência com corpos de Lewy (DLB), Doença com corpos de Lewy difusos (DLBD ), Variante com corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), Doenças de Alzheimer e de Parkinson combinadas, Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e Neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo 1 (NBIA-1), de preferência a doença de Parkinson.
30. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso no diagnóstico de alfa-sinucleinopatia, de preferência no diagnóstico da doença de Parkinson.
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