BR112020007790A2 - métodos e materiais para terapia genética com nt-3 - Google Patents

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Abstract

A presente revelação se relaciona com a administração por vírus adenoas-sociado recombinante (rAAV) de um polinucleótido de neurotrofina 3 (NT-3). A reve-lação proporciona rAAV e métodos de uso do rAAV para terapia genética com NT-3 com o propósito de melhorar a força muscular, estimular o crescimento muscular e para tratar distúrbios de emaciação muscular, como distrofia muscular e neuropatia de Charcot-Marie-Tooth.

Description

"MÉTODOS E MATERIAIS PARA TERAPIA GENÉTICA COM NT-3"
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/574,828, depositado em 20 de outubro de 2017, Pedido de Patente Pro- visório U.S. No. 62/676687, depositado em 25 de maio de 2018 e Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/741,335, depositado em 4 de outubro de 2018, cujas revela- ções são deste modo incorporadas a título de referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE INTERESSE GOVERNAMENTAL DOS E.U.A.
[002]Esta invenção foi realizada com financiamento do governo através das bolsas números NS105986 e UO01-NSO66914, atribuídas pelo National Institutes of Health. O governo detém certos direitos na invenção.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A TÍTULO DE REFERÊNCIA
[003]Este pedido contém, como uma parte separada da revelação, uma Lista- gem de Sequências em formato legível por computador (nome do arquivo: 53122A Sedqlisting.txt; arquivo de texto ASCII com 17.133 bytes; criado em 18 de ou- tubro de 2018) que é incorporada aqui a título de referência na sua totalidade.
DOMÍNIO
[004]A presente revelação se relaciona com a administração por vírus adeno- associado recombinante (rAAV) de um polinucleotídeo de neurotrofina 3 (NT-3). A re- velação proporciona rAAV e métodos de uso do rAAV para terapia genética com NT- 3 com o propósito de melhorar a força muscular estimular o crescimento muscular e para tratar neuropatias e distúrbios de emaciação muscular, como neuropatia de Char- cot-Marie-Tooth.
ANTECEDENTES
[005]Estudos recentes demonstraram que a neurotrofina 3 (NT-3) é uma mo- lécula versátil com características previamente desconhecidas ou não devidamente apreciadas. Para além dos seus efeitos bem reconhecidos na regeneração de nervos periféricos e células de Schwan (SCs), a NT-3 tem efeitos anti-inflamatórios e imuno- moduladores. Yang et al., Mel Titer, 22(2):440-450 (2014). Foi recentemente demons- trado que a NT-3 é capaz de atenuar polineuropatia periférica autoimune espontânea no modelo de roedor de distúrbio desmielinizante inflamatório crônico de nervos peri- féricos que ocorre em humanos. Yalvac et al., Gene therapy, 23(1):95-102 (2015).
[006]As neuropatias de Charcot-Marie-Tooth (CMT) são as neuropatias here- ditárias mais comuns. CMT1 inclui cinco tipos de CMT que são causados por quatro genes quando mutados. Este grupo inclui a maior parte das pessoas com CMT. Estes genes estão associados a SCs e à bainha de mielina que envolve o axônio, apesar de interagirem de diferentes modos e, assim, serem fenotipicamente heterogêneos. CMT do tipo 1A é o resultado de uma duplicação do DNA no cromossomo 17p11 abran- gendo o gene PMP22 que conduz ao desenvolvimento do fenótipo clássico de CMT1. Os pacientes desenvolvem sinais clínicos nas primeiras duas décadas de vida, cau- sando incapacidades significativas que requerem auxílio ambulatorial. Nestes pacien- tes, a regeneração de nervos periféricos é incompleta devido a axotomia prolongada e desnervação que ocorre como parte da neuropatia crônica. NT-3 é um fator trófico secretado por células de Schwann (SCs) que suporta a regeneração de nervos. À capacidade de sobrevivência das SCs desnervadas é crucial para a regeneração de nervos, pois SCs proporcionam fatores de crescimento e lâmina basal, suportes que promovem o crescimento axonal. Uma desnervação prolongada conduz a capacidade regenerativa decrescida relacionada com expressão reduzida de moléculas de SCs associadas à regeneração (fatores neurotróficos (NTFs) e seus receptores) resultando em atrofia das SCs desnervadas, degradação das bandas de Bungner e perda de suportes da lâmina basal de SCs.
[007]Estudos prévios mostraram que a terapia genética com NT-3 no modelo de camundongo TremblerJ (TrJ) de neuropatia de Charcot-Marie-Tooth (CMT) não só melhorou a regeneração dos nervos com aumentos concomitantes do número de SCs, densidades de fibras mielinizadas e espessura da mielina, mas também aumentou o diâmetro das fibras musculares, ilustrado nos músculos dos compartimentos anterior e posterior nos membros traseiros. Sahenk et al., Mol Ther, 22(3):511-521 (2014). Estudos prévios mostraram que é conhecido que fenótipos neuropáticos produzem diversas alterações no músculo esquelético, incluindo uma mudança de fibras rápidas do tipo Il, para lentas do tipo |. Nos camundongos TrJ, se verificou que o extensor digital longo, maioritariamente composto por fibras do tipo rápido, tem uma percenta- gem significativamente mais elevada de fibras lentas em comparação com o tipo sel- vagem (TS) e a percentagem de fibras do tipo | no músculo sóleo aumentou dramati- camente com a idade. Nicks et al., J Neuropathol Exp Neurol, 72(10):942-954 (2013). É interessante notar que o envelhecimento também tem paralelo com alterações simi- lares na proporção de fibras lentas, em humanos e outros mamíferos. Larsson L, Moss R, J Physiol., 472:595-614 (1993); Larsson et al., Am J Physiol., 272:C638-C649 (1997).
[008]CMT1A, herdado como uma afecção autossômica dominante, é o tipo mais comum de CMT. A maior parte das vezes é causado por uma duplicação de 1,5 Mb em 17p11.2 incluindo o gene da proteína mielina periférica 22 (PMP22), criada por cruzamento desigual de cromossomos homólogos (1). Esta é uma doença lentamente progressiva sem tratamento conhecido. Os sintomas começam muito frequentemente nas primeiras duas décadas. Estão presentes pés cavos e dedos em martelo. São requeridos auxílios ambulatoriais, tais como órteses para tornozelo e pé. Menos fre- quentemente, casos infantis graves podem depender de cadeira de rodas ou ventila- dor. Tipicamente, 90% dos pacientes têm velocidade de condução motora dos nervos (NCV) no nervo ulnar situada entre 16 e 35 m/s ou menos (2). Mesmo apesar de a deficiência genética envolver maioritariamente células de Schwann (SCs), o quadro eletrofisiológico clínico é uma neuropatia desmielinizante sensório-motora depen- dente do comprimento. O quadro clínico é significativamente influenciado por degene- ração axonal resultante de interações enfraquecidas célula de Schwann (SC)-axônio G).
[009]Presentemente não há nenhum tratamento para esta afecção. Tem sido insistentemente veiculado que suplementos de ácido ascórbico ajudam, mas múltiplos estudos não mostraram nenhum benefício. Terapias a dose baixa (1-2 g/dia) (4-6) e dose elevada (3-4 g/dia) não demonstraram ser benéficas (6,7). Inicialmente, um en- saio humano de NT-3 revelou eficácia clínica após 24 semanas de tratamento acom- panhada de números crescentes de fibras nervosas mielinizadas em biopsias do nervo sural pós-tratamento (8). No camundongo Tr, o tratamento subcutâneo com NT-3 melhorou a regeneração axonal e intensificou a mielinização. No entanto, a meia vida curta no soro de NT-3 demonstrou ser um grande obstáculo à administração sub- cutânea continuada e este produto foi descontinuado.
[010]Foi mostrado que um grande número de doenças musculoesqueléticas conduz a um decréscimo da força muscular. Estas incluem, mas sem limitação, mio- patias hereditárias ou recessivas (como distrofias musculares), doenças de emacia- ção muscular (como caquéxia que pode resultar de doenças subjacentes como doen- ças de imunodeficiência adquirida (SIDA), artrite reumatoide, câncer, doença pulmo- nar obstrutiva crônica (COPD) e cirrose), afecções de atrofia ou atenuação muscular ou (como sarcopênia que pode resultar do envelhecimento), desuso prolongado (como paralisia, coma, imobilidade prolongada no leito e internamento em UCI), fra- queza induzida por cirurgia (como cirurgia de substituição de articulações), miopatia induzida por fármacos e rabdomiólise. A patologia muscular destas doenças e afec- ções é mediada, em parte ou na totalidade, por uma combinação de respostas imunes, inflamatórias e fibróticas. Agentes capazes de bloquear estas respostas e/ou de esti- mular a regeneração do tecido danificado serão capazes de abrandar ou reverter a progressão da doença nestes distúrbios.
[011]O vírus adenoassociado (AAV) é um parvovírus deficiente para replica- ção, cujo genoma de DNA de fita simples tem cerca de 4,7 kb de comprimento, inclu- indo uma repetição terminal invertida (ITR) de 145 nucleotídeos. Há múltiplos seróti- pos do AAV. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos serótipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma completo do AAV-1 é proporcionado em Gen- Bank Nº de Acesso NC 002077; o genoma completo do AAV-2 é proporcionado em GenBank Nº de Acesso NC 001401 e Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983); o genoma completo do AAV-3 é proporcionado em GenBank Nº de Acesso NC 1829; o genoma completo do AAV-4 é proporcionado em GenBank Nº de Acesso NC 001829; o genoma do AAV-5 é proporcionado em GenBank Nº de Acesso AFO85716; o genoma completo do AAV-6 é proporcionado em GenBank Nº de Acesso NC 00 1862; pelo menos porções dos genomas de AAV-7 e AAV-8 são proporciona- das em GenBank Nºs de Acesso AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma do AAV-9 é proporcionado em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma do AAV-10 é proporcionado em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma do AAV- 11 é proporcionado em Virology, 330(2): 375-383 (2004). Sequências de atuação cis que dirigem a replicação (rep), encapsidação/empacotamento do DNA viral e integra- ção cromossômica de células hospedeiras estão contidas nas ITRs do AAV. Três pro- motores do AAV (denominados p5, p19 e p40 quanto às suas localizações mapeadas relativas) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos do AAV codificando genes rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e p19), acoplados ao encadeamento diferencial do único íntron do AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) a partir do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que por fim são responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas capsídicas VP1, VP2 e VP3. Sítios de encadeamento alternativo e de início da tradução não de consenso são responsáveis pela produção das três proteínas capsídicas relacionadas. Um único sítio de poliade- nilação de consenso está localizado na posição mapeada 95 do genoma do AAV. O ciclo de vida e genética do AAV são revistos em Muzyczka, Current Topics in Micro- biology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
[012]O AAV possui características únicas que o tornam atrativo como vetor para administração de DNA estranho a células, por exemplo, em terapia genética. À infecção pelo AAV de células em cultura não é citopática e a infecção natural de hu- manos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamífero, abrindo a possibilidade de visar muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV procede à transdução em células se dividindo lentamente e não se dividindo e pode persistir essencialmente durante o tempo de vida daquelas células como um epissomo nuclear (elemento extracromossômico) ativo para transcrição. O genoma proviral do AAV é infeccioso como DNA clonado em plasmídeos, o que torna exequível a construção de genomas recombinantes. Adicionalmente, uma vez que os sinais que dirigem a replicação, encapsidação do genoma e integração do AAV estão contidos dentro das ITRs do genoma do AAV, alguns ou a totalidade dos aproximada- mente 4,3 kb internos do genoma (codificando proteínas de replicação e capsídicas estruturais, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho. As proteínas rep e cap podem ser proporcionadas in trans. Outra característica significativa do AAV é o fato de ser um vírus extremamente estável e forte. Suporta facilmente as condições usa- das para inativar adenovírus (56 ºC até 65 ºC durante várias horas), tornando menos crítica a conservação a frio do AAV. O AAV pode mesmo ser liofilizado. Por fim, células infectadas com o AAV não são resistentes a superinfecção.
[013]É necessário desenvolver terapias para neuropatias CMT e outros dis- túrbios de emaciação muscular. A invenção proporciona métodos de terapia genética de administração de NT-3 para o tratamento de neuropatias CMT e outros distúrbios de emaciação muscular.
SUMÁRIO
[014]A revelação proporciona métodos de estimulação do crescimento mus- cular em um sujeito. O método compreende administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de neurotrofina-3 (NT-3), pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, ou um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, a um sujeito necessitado. A revelação descreve o novo efeito de NT-3, a sua capacidade para in- fluenciar diretamente a síntese de proteínas e remodelagem metabólica em músculo neurogênico.
[015]Em várias modalidades da revelação, a NT-3, pró-NT-3, ou um seu frag- mento eficaz, ou um ácido nucleico codificando NT-3 ou um seu fragmento eficaz da revelação, é administrado intramuscularmente.
[016]Em quaisquer dos métodos da revelação, o ácido nucleico codificando NT-3 ou um seu fragmento eficaz, é administrado usando um vetor viral. Em certas modalidades, o vetor viral é o vetor de vírus adenoassociado (AAV). Em modalidades relacionadas, o ácido nucleico codificando NT-3 ou um seu fragmento eficaz da reve- lação, é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos, como um promotor triplo de creatina cinase específico para músculos. Em várias modalidades, o ácido nucleico codificando NT-3 ou um seu fragmento eficaz da revelação, compre- ende a SEQ ID NO: 1.
[017]A revelação proporciona ácidos nucleicos compreendendo, na ordem 5' para 3': (1) uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2; (ii) uma sequência promotora/intensificadora de creatina cinase muscular apresentada nos nucleotídeos 147-860 da SEQ ID NO: 11; (iii) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de NT-3 humano; e (iv) uma segunda sequência de ITR de AAV2; em que o polipeptídeo de NT-3 humano tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2,
ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos 90% idêntica aos nucleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11 ou 100% idêntica aos nucleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11.
[018]Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos da revelação compreen- dem adicionalmente, a 3' do promotor/intensificador, um íntron quimérico apresentado nos nucleotídeos 892-1024 da SEQ ID NO: 11. Adicionalmente, os ácidos nucleicos da revelação podem compreender adicionalmente, a 3' da referida sequência de nu- cleotídeos codificando um polipeptídeo de NT-3 humano, um sinal de poliadenilação do SV40 apresentado nos nucleotídeos 1860-2059 da SEQ ID NO: 11.
[019] Quaisquer dos ácidos nucleicos da revelação podem compreender uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR). Por exemplo, o ácido nu- cleico pode compreender uma primeira ITR que é apresentada nos nucleotídeos 7- 112 da SEQ ID NO: 11 e/ou uma segunda ITR que é apresentada nos nucleotídeos 2121-2248 da SEQ ID NO: 11.
[020]Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos compreendem um ge- noma de scAAV1.tMCK.NTF3 que é pelo menos 90% idêntico à sequência de nucle- otídeos apresentada na SEQ ID NO: 11.
[021]A revelação também proporciona partículas de vírus adenoassociado re- combinante (rAAV) compreendendo quaisquer dos ácidos nucleicos da revelação, em que o rAAV é infeccioso. As partículas de rAAV podem ser de qualquer serótipo do rAAV, como AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, ou AAVrh.74. Adicionalmente, em quaisquer das partículas de rAAV da invenção, o DNA do AVV no genoma de rAAV provém de AAV-1.
[022]A revelação também proporciona composições compreendendo o rAAV da revelação e um transportador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, estas composições são formuladas para tratar um distúrbio de emaciação muscular ou neu-
ropatia em um sujeito necessitado, ou estas composições são formuladas para esti- mular o crescimento muscular em um sujeito necessitado.
[023]Em uma modalidade, a revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessi- tado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3; em que a) o ácido nucleico compreende uma se- quência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nucleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o po- lipeptideo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,5x10*? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/Kkg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10'? vg/kg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de
4x10*? vg/kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adeno- associado recombinante (rAAV) scAAV1.IMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/Kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.t(MCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10!3 vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
[024]Em outra modalidade, a revelação proporciona métodos para melhorar a força muscular ou estimular o crescimento muscular em um sujeito humano necessi- tado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3; em que a) o ácido nucleico compreende uma se- quência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nucleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o po- lipeptideo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,5x10*? vg/kg até cerca de 6,5x10*? va/Kg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/Kkg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10? vg/kg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 4x10*? va/Kkg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adeno- associado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º*? vg/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou |) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10!3 vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
[025]Em quaisquer dos métodos da revelação, o ácido nucleico é adminis- trado usando um vetor viral, como vetor de vírus adenoassociado. Quaisquer dos mé- todos da revelação podem ser implementados com um ácido nucleico que é operavel- mente ligado a um promotor específico para músculos, como o promotor de creatina cinase específico para músculos (MCK). Adicionalmente, quaisquer dos métodos da revelação podem ser implementados com o scAAV1.tMCK.NTF3 que compreende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
[026]Em algumas modalidades, a revelação proporciona métodos de terapia genética usando o gene da neurotrofina-3 (NTF3) humana sob o controle de um pro- motor específico para músculos, tMCK, usando um vetor scAAV1, um serótipo do AAV1 autocomplementar. Em particular, a revelação proporciona métodos de trata- mento de sujeitos diagnosticados com um distúrbio de emaciação muscular ou uma neuropatia, compreendendo administrar um vetor de AAV expressando NT-3. Em par- ticular, os métodos compreendem administrar o construto SscCAAV1.tMCK.NTF3 via in- jeção intramuscular (IM) no músculo gastrocnêmio e tibial anterior. Por exemplo, a administração intramuscular de um vetor de AAV expressando NT-3, por exemplo, SCAAV1.tMCK.NTF3, inicia a produção e secreção locais de NT-3 para a circulação, desse modo promovendo a mielinização de nervos e regeneração de fibras, condu- zindo à estabilização do fenótipo da doença CMT. Mais particularmente, a revelação proporciona métodos para administrar ScCAAV1.tMCK.NTF3 a uma dose de cerca de 2x10'? vg/kg ou a uma dose de cerca de 6x10*? vg/kg. O scAAV1.tIMCK.NTF3 com- preende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
[027]A revelação também proporciona métodos para administrar um vetor de AAV expressando NT-3 como terapia genética substituta para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou uma neuropatia. NT-3 tem uma meia vida curta e os métodos da revelação compreendem administrar um vetor de AAV para uma libe- ração sustentada de proteína NT-3, mesmo apesar de o sujeito expressar proteína NT-3 endógena. Como terapia genética substituta, a administração do vetor de AAV proporciona administração sustentada da proteína NT-3 através de secreção susten- tada por células musculares. Este baixo nível em circulação sustentado e contínuo de proteína NT-3 proporciona um efeito terapêutico com um risco mínimo de toxicidade. A produção sistêmica de NT-3 por terapia genética também é uma opção de terapia mais conveniente e econômica em comparação com injeções repetidas de um peptí- deo de NT-3 purificado.
[028]A revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de ema- ciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano uma dose de vírus adenoassociado recom- binante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[029]A revelação também proporciona métodos de estimulação do cresci- mento muscular em um sujeito humano necessitado, compreendendo o passo de ad- ministrar ao sujeito humano uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3 que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[030]Em uma modalidade, a revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessi- tado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoas- sociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10"? vg/kg até cerca de 7x10*? vg/Kkg, ou cerca de 1,5x 10º? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/kg, ou cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg.
Em outra modalidade
[031]revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de emaci- ação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10*? vg/Kg, ou cerca de 1,5x10? vg/Kkg, ou cerca de 2x10? vg/Kkg, ou cerca de 3x10*? vg/Kkg, ou cerca de 4x10? vg/Kg, ou cerca de 5x10? vg/Kg, ou cerca de 6x10? va/Kg, ou cerca de 7x10? va/Kg, ou cerca de 8x10? vg/Kkg, ou cerca de 9x 10º? vg/Kkg ou cerca de 1x10? vg/kg.
[032]Em outra modalidade, a revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em sujeito humano necessi- tado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoas- sociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 1x10*? va/mL. Por exem- plo, o rAAV é administrado usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente, por exemplo, cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL, em que um total de 5 mL até 14 mL de vetor é administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[033]Em uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona métodos de tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de ad- ministração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10'? vg/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada vo- lume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor é administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[034]Em uma modalidade, proporciona métodos para melhorar a força mus- cular ou estimular o crescimento muscular em um sujeito humano necessitado, com- preendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoassociado re- combinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, em que a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10? vg/kg até cerca de 7Xx10'? vg/Kkg, ou cerca de 1,5x 10? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/kg ou cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/Kkg.
[035]Em outra modalidade, a revelação proporciona métodos para melhorar a força muscular ou estimular o crescimento muscular em um sujeito humano necessi- tado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um vírus adenoas- sociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, em que a via de administração é uma via intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10*? vg/Kg, ou cerca de 1,5x10'? vg/Kkg, ou cerca de 2x10*? vg/Kg, ou cerca de 3x10'? vg/Kg, ou cerca de 4x10*? vg/kg, ou cerca de 5x10!? vg/kg, ou cerca de 6x10!? vg/Kkg, ou cerca de 7Xx10*? va/Kkg, ou cerca de 8x10*? va/Kg, ou cerca de 9x 101? vg/Kg, ou cerca de 1x10'3 vg/kg.
[036]EmM uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona métodos para melhorar a força muscular ou estimular o crescimento muscular em sujeito hu- mano necessitado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um ví- rus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de ad- ministração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 1x10'? vg/mL. Por exemplo, o rAAV é administrado usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente, por exemplo, cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL, em que um total de 5 mL até 14 mL de vetor é administrado nas cabeças medial e lateral do mús- culo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[037]Em uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona métodos para melhorar a força muscular ou estimular o crescimento muscular em sujeito hu- mano necessitado, compreendendo o passo de administrar ao sujeito humano um ví- rus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, em que a via de ad- ministração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 1x10'3 vg/mL administrada a dose baixa (2x107? vg/Kkg por paciente) e a dose elevada (6x10'? vg/kg por paciente) usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada vo- lume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor é administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[038]Em quaisquer dos métodos da revelação, a via de administração de SCAAV1.tMCK.NTF3 é uma injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior. Adicionalmente, em quaisquer dos métodos da invenção, a administração de scCAAV1.tMCK.NTF3 resulta em força muscular me- lhorada no sujeito que ocorre nas extremidades superiores ou inferiores, e, por exem- plo, a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação com- posta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds). Adicionalmente, em quaisquer dos métodos da invenção, a administração de scAAV1.tMCK.NTF3 resulta em um decrés- cimo ou paragem da progressão de doença ao longo de um período de tempo de dois anos. A progressão da doença é medida pela CMTPedS.
[039]A força muscular também é medida usando eletromiografia, miometria portátil, miometria por sistema fixo, testes musculares manuais, e/ou testes funcio- nais/de atividade como o teste de Jebsen, e testes | cronometrados que avaliam quanto tempo um sujeito demora a executar uma tarefa específica, como o teste de caminhada durante 6 minutos, tempo que demora para se levantar do chão, cami- nhada/corrida de 10 metros, tempo que demora a subir 4 degraus e tempo que demora para descer 4 degraus.
[040]Em um aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o sujeito está sofrendo de uma neuropatia hereditária como neuropatia de Charcot-Marie-Tooth (CMT), por exemplo, CMT1A , CMT2K, CMT4A, CMTRIA, e neuropatias axonais e desmielinizantes causadas por uma variante genética autossômica recessiva, ou uma variante genética autossômica dominante ou uma variante genética ligada a X. A neu- ropatia hereditária pode ser causada por qualquer uma das variantes genéticas pro- porcionadas na Tabela 1. Adicionalmente, a neuropatia hereditária pode consistir em neuropatias amiloides associadas à transtirretina causadas por uma mutação no gene da transtirretina (TTR), como as seguintes variantes genéticas: Val30Met, Ile107Val e Ser77Tyr.
[041]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o sujeito está sofrendo de uma neuropatia adquirida com perda axonal e/ou regeneração en- fraquecida de nervos. A neuropatia adquirida é uma neuropatia periférica causada por qualquer distúrbio ou doença que é conhecido causar uma neuropatia. Por exemplo, o sujeito está sofrendo de neuropatia periférica causada por diabetes mellitus, infec- ção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), distúrbio da tireoide como hipotire- oidismo, hipoglicêmia, urêmia, insuficiência renal, disfunção hepática, falha hepática, policitêmia, distúrbios do tecido conjuntivo, câncer, doença de Lyme, doença celíaca, lepra, porfíria, síndrome de Sjogren, poliomielite, acromegalia, distúrbios do metabo- lismo de lipídeos/glicolipídeos, síndrome do Nilo Ocidental, amiloidose, distúrbios mi- tocondriais, distúrbios disproteinêmicos como gamapatia monoclonal de importância indeterminada (MGUS) ou síndrome de POEMS. O sujeito está sofrendo de deficiên- cias nutricionais/vitamínicas como deficiência de vitamina B12, deficiência de vitamina E ou deficiência de cobre.
[042]Em um aspecto adicional da revelação, em quaisquer dos métodos des- critos aqui, o sujeito está sofrendo de polineuropatia periférica autoimune, polirradicu- loneuropatia desmielinizante inflamatória aguda (AIDP), polirradiculoneuropatia des- mielinizante inflamatória crônica (CIDP), mononeurite múltipla vasculítica, paraneuro- patia, ganglionite idiopática, esclerose lateral amiotrófica, neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, ou síndrome de neurônios motores inferiores.
[043]A neuropatia adquirida pode ser uma neuropatia tóxica. Por exemplo, a neuropatia tóxica é o resultado do efeito tóxico de uma medicação prescrita, como Cloranfenicol, Cloroquilina, Colchicina, Dissulfiram, Etanercept, Etambutal, ouro, Hi- droxicloroquina, Nitrofuantoína, Metronidazol, Estravudina, Zalcitabina, Inflixóimab, Le- flunomida, Talidomida ou um agente quimioterapêutico como Cisplatina, Citarabina, Bortezombid, Docetaxal, Lenalidomida, Misondiazol, Oxaliplatina, Paclitaxel, Procar- bazina, Suramina, Talidomida, Vimblastina ou Vincristina, ou um fármaco antiálcool como Dissulfiran, ou um anticonvulsivo como Fenitoína ou Dilantina, ou medicações para o coração ou pressão sanguínea como estatina, Amiodarona, Hidralazina, pro- cainamida, Per-hexilina, ou um antibiótico como Fluoroquinolonas, Isoniazida, Cipro,
Levaquina, Flagil, ou Metronidazol ou tratamentos para uma afecção cutânea como Dapsona. A neuropatia tóxica também pode ser causada por abuso de álcool de longa duração ou toxicidade de vitamina Be.
[044]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos descritos aqui, o sujeito é um paciente com câncer sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paciente com câncer desenvolveu uma neuropatia relacionada com defi- ciência nutricional, efeitos secundários de quimioterapia, e/ou síndrome paraneoplás- tica.
[045]Ainda em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o su- jeito é um paciente cirúrgico sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paciente cirúrgico desenvolveu uma neuropatia depois de ser submetido a cirurgia bariátrica, múltiplos procedimentos ortopédicos, ou múltiplas cirurgias para "nervos comprimidos".
[046]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o sujeito está sofrendo de miopatia hereditária, doença neuromuscular, atrofia muscular, mio- patia induzida por fármacos, sarcopênia, caquéxia, atrofia de fibras musculares de tipo Il, distrofias musculares geneticamente determinadas, atrofia muscular relacionada com a idade ou um distúrbio de músculos primários autoimune adquirido.
[047]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o sujeito está sofrendo de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, dis- trofia muscular miotônica, sarcoglicanopatias, distrofia miotônica, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular congênita, distrofia muscular congênita defici- ente em Merosina, miopatia de Bethlem, distrofia muscular congênita de Ullrich, dis- trofia muscular fascioscapulo-humeral, distrofia muscular espinhal, distrofia muscular com espinha rígida, distrofia muscular distal, distrofia muscular oculofaríngea, Distro- fia Muscular Congênita (MDC) 1A, 1B, 1C e 1D; Distrofia Muscular das Cinturas dos Membros (LGMD) 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 2H,21,
2J, 2K, 2L, 2M, 2N, 20 e 2Q; Doença Músculo Olho Cérebro; Síndrome de Fukuyama Walker Warburg; Síndromes miastênicas; Miastenias Congênitas; Miopatia de Corpos de Inclusão; Miosite de Corpos de Inclusão; Dermatomiosite; Miopatia Centronuclear; Miopatia de Myoshi; Miopatia Mitocondrial; Miopatia de Nemaline; Miopatia de No- naka; Miastenia Grave; ou Polimiosite.
[048]Em uma modalidade, a revelação proporciona o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de neurotrofina-3 (NT-3), pró-NT-3, ou um seu fragmento efi- caz, ou um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, para a fabricação de um medicamento destinado a estimulação do crescimento mus- cular em um sujeito. Por exemplo, o medicamento é formulado para administração intramuscular.
[049]Em uma modalidade exemplificativa, o medicamento compreende um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, em que o ácido nucleico está em um vetor viral. Em modalidades relacionadas, o vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado. Em várias modalidades, o ácido nucleico é opera- velmente ligado a um promotor específico para músculos, como promotor triplo de creatina cinase específico para músculos. Em várias modalidades, o ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 1.
[050]A invenção também proporciona o uso de um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano, em que: a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idên- tica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando a uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nucleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoas- sociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptí- deo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adeno- associado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10!? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/kg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medica- mento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? va/kg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptidco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração in- tramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10? vg/Kkg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptideco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração in- tramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10'? vg/Kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptideco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/Kkg, k) o ácido nu- cleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramus- cular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mlL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptidco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
[051]A revelação também proporciona o uso de uma dose de um ácido nu- cleico codificando o polipeptídeo de NT-3 para a fabricação de um medicamento des- tinado a melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano, em que: a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotí- deos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nu- cleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando a uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nucleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentra- ção baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a compo- sição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAÃAV é cerca de 1,5x10*? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptíideo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração in- tramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombi- nante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de ad- ministração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10? vg/kg, i) o ácido nu- cleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administra- ção intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10*? va/Kg, j) o ácido nucleico codi- ficando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV)
SCAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/Kkg, k) o ácido nu- cleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramus- cular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mlL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptidco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
[052]Por exemplo, quaisquer dos medicamentos da revelação podem com- preender um ácido nucleico que é formulado para administração usando um vetor vi- ral, como um vetor de vírus adenoassociado. Adicionalmente, quaisquer dos medica- mentos da revelação podem compreender um ácido nucleico que é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos, como o promotor específico para músculos que é o promotor de creatina cinase específico para músculos (MCK). Em outra modalidade, em quaisquer dos medicamentos ou na revelação, SCAAV1.tMCK.NTF3 compreende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus adenoasso- ciado recombinante (rAAV) scAAV1.IMCK.NTF3 para a preparação de um medica- mento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[053]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a preparação de um me- dicamento destinado a estimular o crescimento muscular em um sujeito humano ne- cessitado, em que a dose resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[054]Em uma modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus adeno- associado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3 para a preparação de um medi- camento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuro- patia em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma dose do rAAV que é cerca de 1,0x10'? vg/kg até cerca de 7x10? vg/Kg, ou cerca de 1,5x 10º? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, ou cerca de 2x10? vg/kg até cerca de 6x10? vg/kg.
[055]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a preparação de um me- dicamento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neu- ropatia em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma dose do rAAV que é cerca de é cerca de 1,0x10"? vg/Kkg, ou cerca de 1,5x10? vg/kg, ou cerca de 2x10*? vg/kg, ou cerca de 3x10º? vg/Kkg, ou cerca de 4x10*? vg/Kkg, ou cerca de 5x10? vg/kg, ou cerca de 6x10? vg/kg, ou cerca de 7x10*? vg/kg, ou cerca de 8x10*? vg/Kkg, ou cerca de 9x 10º? vg/kg ou cerca de 1x103 vg/Kkg.
[056]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a preparação de um me- dicamento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neu- ropatia em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma concentração do rAAV que é cerca de 2x10'? vg/mL. Por exemplo, o medicamento é administrado usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente, por exemplo, cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna, em que um total de 5 mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[057]EmM uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona o uso de um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a prepara- ção de um medicamento destinado ao tratamento de um distúrbio de emaciação mus- cular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma dose do rAAV que é cerca de 1x10*? vg/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor é administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[058]Em uma modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus adeno- associado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a preparação de um medi- camento destinado à melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento mus- cular em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma dose do rAAV que é cerca de 1,0x10*? vg/kg até cerca de 7x10'? vg/kg, ou cerca de 1,5x 10º? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/kg, ou cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10? vo/kg.
[059]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3 para a preparação de um me- dicamento destinado à melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma dose do rAAV que é cerca de 1,0x10*? vg/kg, ou cerca de 1,5x10? vg/Kkg, ou cerca de 2x10? vg/Kkg, ou cerca de 3x10*? vg/kg, ou cerca de 4x10*? vg/kg, ou cerca de 5x10*? vg/kg, ou cerca de 6x10*? vg/kg, ou cerca de 7x10*? vg/kg, ou cerca de
8x10*? vg/Kkg, ou cerca de 9x 10*? vg/kg ou cerca de 1x10*? vg/kg.
[060]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3 para a preparação de um me- dicamento destinado à melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma concentração do rAAV que é cerca de 2x10º*? vg/mL administrada a dose baixa (2x10*? vg/Kkg por paciente) e a dose elevada (6x10*?vg/kg por paciente). Em algumas modalidades, o medicamento é administrado usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente, por exemplo, cada volume de injeção é 0,5 até 1 mL nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna. Um total de mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[061]Em uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona o uso de um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a prepara- ção de um medicamento destinado à melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano necessitado, em que o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular, e em que o medicamento compreende uma concentração do rAAV que é cerca de 2x10*? vg/mL administrada a dose baixa (2x10!? vg/Kkg por paciente) e a dose elevada (6x10!?vg/kg por paciente) usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[062]Em quaisquer dos usos da revelação, o medicamento é formulado para injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior. Adicionalmente, em quaisquer dos usos da invenção, o medicamento resulta em força muscular melhorada no sujeito que ocorre nas extremidades superi- ores ou inferiores, e, por exemplo, a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação composta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds). Adici- onalmente, em quaisquer dos usos da invenção, o medicamento resulta em um de- créscimo ou paragem da progressão de doença ao longo de um período de tempo de dois anos. A progressão da doença é medida pela CMTPedS.
[063]Em um aspecto da revelação, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito está sofrendo de uma neuropatia hereditária como neuropatia de Charcot-Ma- rie-Tooth (CMT), por exemplo, CMT1A, CMT2K, CMT4A, CMTRIA, e neuropatias axo- nais e desmielinizantes causadas por uma variante genética autossômica recessiva, ou uma variante genética autossômica dominante ou uma variante genética ligada a X. A neuropatia hereditária pode ser causada por qualquer uma das variantes genéti- cas proporcionadas na Tabela 1. Adicionalmente, a neuropatia hereditária pode con- sistir em neuropatias amiloides associadas à transtirretina causadas por uma mutação no gene da transtirretina (TTR), como as seguintes variantes genéticas: Val30Met, lle107Val e Ser77Tyr.
[064]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos da invenção, o sujeito está sofrendo de uma neuropatia adquirida com perda axonal e/ou regene- ração enfraquecida de nervos. A neuropatia adquirida é uma neuropatia periférica causada por qualquer distúrbio ou doença que causa neuropatia. Por exemplo, o su- jeito está sofrendo de neuropatia periférica causada por diabetes mellitus, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), distúrbio da tireoide tal como hipotireoi- dismo, hipoglicêmia, urêmia, insuficiência renal, disfunção hepática, falha hepática, policitêmia, distúrbios do tecido conjuntivo, câncer, doença de Lyme, doença celíaca, lepra, porfíria, síndrome de Sjogren, poliomielite, acromegalia, distúrbios do metabo- lismo de lipídeos/glicolipídeos, síndrome do Nilo Ocidental, amiloidose, distúrbios mi- tocondriais, distúrbios disproteinêmicos como gamapatia monoclonal de importância indeterminada (MGUS) ou síndrome de POEMS. O sujeito pode estar sofrendo de deficiências nutricionais/vitamínicas como deficiência de vitamina B12, deficiência de vitamina E ou deficiência de cobre.
[065] Adicionalmente, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito está so- frendo de polineuropatia periférica autoimune, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória aguda (AIDP), polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crô- nica (CIDP), mononeurite múltipla vasculítica, paraneuropatia, ganglionite idiopática, esclerose lateral amiotrófica, neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, ou síndrome de neurônios motores inferiores.
[066]A neuropatia adquirida é uma neuropatia tóxica. Por exemplo, a neuro- patia tóxica é o resultado do efeito tóxico de uma medicação prescrita, como Cloran- fenicol, Cloroquilina, Colchicina, Dissulfiram, Etanercept, Etambutal, ouro, Hidroxiclo- roquina, Nitrofuantoína, Metronidazol, Estravudina, Zalcitabina, Infliximab, Lefluno- mida, Talidomida ou um agente quimioterapêutico como Cisplatina, Citarabina, Borte- zombid, Docetaxal, Lenalidomida, Misondiazol, Oxaliplatina, Paclitaxel, Procarbazina, Suramina, Talidomida, Vimblastina ou Vincristina, ou um fármaco antiálcool como Dis- sulfiran, ou um anticonvulsivo como Fenitoína ou Dilantina, ou medicações para o co- ração ou pressão sanguínea como estatina, Amiodarona, Hidralazina, procainamida, Per-hexilina, ou um antibiótico como Fluoroquinolonas, Isoniazida, Cipro, Levaquina, Flagil, ou Metronidazo| ou tratamentos para uma afecção cutânea como Dapsona. À neuropatia tóxica pode ser causada por abuso de álcool de longa duração ou toxici- dade de vitamina Be.
[067]Em outro aspecto, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito é um paciente com câncer sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paciente com câncer desenvolveu uma neuropatia relacionada com deficiência nutricional, efei- tos secundários de quimioterapia, e/ou síndrome paraneoplástica.
[068]Ainda em outro aspecto, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito é um paciente cirúrgico sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paci- ente cirúrgico desenvolveu uma neuropatia depois de ser submetido a cirurgia bariá- trica, múltiplos procedimentos ortopédicos ou múltiplas cirurgias para "nervos compri- midos",
[069]Em outro aspecto, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito está sofrendo de miopatia hereditária, doença neuromuscular, atrofia muscular, miopatia induzida por fármacos, sarcopênia, caquéxia, atrofia de fibras musculares de tipo |l, distrofias musculares geneticamente determinadas, atrofia muscular relacionada com a idade ou um distúrbio de músculos primários autoimune adquirido.
[070]Em outro aspecto, em quaisquer dos usos da revelação, o sujeito está sofrendo de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular miotônica, sarcoglicanopatias, distrofia miotônica, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular congênita, distrofia muscular congênita deficiente em Merosina, miopatia de Bethlem, distrofia muscular congênita de Ullrich, distrofia muscular fascioscapulo-humeral, distrofia muscular espinhal, distrofia muscular com espinha rígida, distrofia muscular distal, distrofia muscular oculofaríngea, Distrofia Muscular Congênita (MDC) 1A, 1B, 1C e 1D; Distrofia Muscular das Cinturas dos Membros (LGMD) 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 2H, 21, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N, 20 e 2Q; Doença Músculo Olho Cérebro; Síndrome de Fukuyama Walker Warburg; Síndromes miastênicas; Miastenias Congênitas; Miopatia de Corpos de Inclusão; Miosite de Corpos de Inclusão; Dermatomiosite; Miopatia Centronuclear; Miopatia de Myoshi; Miopatia Mitocondrial; Miopatia de Nemaline; Miopatia de No- naka; Miastenia Grave; ou Polimiosite.
[071]Em uma modalidade, a revelação proporciona uma composição compre- endendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de neurotrofina-3 (NT-3), pró-NT- 3, ou um seu fragmento eficaz, ou um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, para uso na estimulação do crescimento muscular em um sujeito. Por exemplo, as composições da revelação são formuladas para administra- ção intramuscular.
[072]EM uma modalidade exemplificativa, a composição compreende um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz. Em modali- dades relacionadas, o ácido nucleico está presente em um vetor viral, como um vetor de vírus adenoassociado. Em várias modalidades, o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos, como promotor triplo de creatina ci- nase específico para músculos. Em várias modalidades, a composição compreende um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1.
[073]A revelação também proporciona composições compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de NT-3 para uso no tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano, em que: a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à se- quência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequên- cia de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nucleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado re- combinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT- 3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10'? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formu- lada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10!?
vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT- 3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10? vg/Kg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10!? vg/kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10!? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? va/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou |) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
[074]Em outra modalidade, a revelação proporciona uma composição com- preendendo um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 para uso na me- lhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito hu- mano, em que a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico com- preende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1; c) o ácido nucleico compre- ende uma sequência de ácido nucleico codificando a uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é qualquer um dos ácidos nu- cleicos da revelação, e) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de po- lipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formu- lada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipep- tídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10? vg/kg, h) o ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intra- muscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10? vg/Kkg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptideco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intra- muscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10? vg/Kkg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptideo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intra- muscular e a dose do rAAV é cerca de 6x10*? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptideo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando 3 até 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou |) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a com- posição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10*? vg/mL administrada usando múltiplas injeções em um volume total de cerca de até 14 mL.
[075]Por exemplo, quaisquer das composições da revelação podem compre- ender um ácido nucleico que é formulado para administração usando um vetor viral, como um vetor de vírus adenoassociado. Adicionalmente, quaisquer das composições da revelação podem compreender um ácido nucleico que é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos, como o promotor específico para músculos que é promotor de creatina cinase específico para músculos (MCK). Em outra moda- lidade, em quaisquer das composições ou na revelação, scCAAV1.tIMCK.NTF3 com- preende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
[076]EmM uma modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um su- jeito humano necessitado, que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[077]Em outra modalidade, a revelação proporciona o uso de um vírus ade- noassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para a estimulação do cresci- mento muscular em um sujeito humano necessitado, que resulta em expressão sus- tentada de uma concentração baixa de proteína NT-3.
[078]EmM uma modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um su- jeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10*? vg/Kkg até cerca de 7Xx10'? vg/Kkg, ou cerca de 1,5x 10? vg/kg até cerca de 6,5x10*? vg/kg ou cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10? vg/kg.
[079]Em outra modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um su- jeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10*? vg/Kg, ou cerca de 1,5x10? vg/Kg, ou cerca de 2x10*? vg/Kg, ou cerca de 3Xx10? vg/Kkg, ou cerca de 4x10'? vg/kg, ou cerca de 5x10*? vg/Kg, ou cerca de 6x10*? vg/Kg, ou cerca de 7x10*? vg/Kkg, ou cerca de 8x10*? vg/Kg, ou cerca de 9x 10? vg/kg, ou cerca de 1x10*? vg/kg.
[080]Em outra modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um su- jeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10*? vg/mL administrada a dose baixa (2x10'? vg/kg por paciente) e a dose elevada (6x10'?vg/kg por paciente). Em algumas modalidades, a composição é administrada usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL) nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna. Um total de mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[081]Em uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona composi- ções compreendendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) SCAAV1.tMCK.NTF3 para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10'? vg/mL administrado a dose baixa (2x10'? vg/kg por paciente) e a dose elevada (6x10'?vg/Kkg por paciente) usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[082]Em uma modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3 para melhoria da força muscular em um sujeito humano, em que a composição é for- mulada para administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10? vg/kg até cerca de 7x10*? vg/Kkg, ou cerca de 1,5x 10? vg/kg até cerca de 6,5x10"? vg/kg, ou cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg.
[083]Em outra modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para melhoria da força muscular em um sujeito humano, em que a composição é for- mulada para administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,0x10? va/kg, ou cerca de 1,5x10º? vg/kg, ou cerca de 2x10º? vg/kg, ou cerca de 3x10? vg/kg, ou cerca de 4x10'? vg/Kkg, ou cerca de 5x10*? vg/Kg, ou cerca de 6x10!2 vg/kg, ou cerca de 7x10*? vg/kg, ou cerca de 8x10*? vg/Kkg, ou cerca de 9x 10º? vg/kg, ou cerca de 1x10*? vg/kg.
[084]Em outra modalidade, a revelação proporciona composições compreen- dendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 para melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento dos músculos em um sujeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10*? vg/mL administrado a dose baixa (2x10*? vg/Kkg por paciente) e a dose elevada (6x10'? vg/kg por paciente). Em algumas modalidades, a composição é administrada usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL) nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna. Um total de mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[085]Em uma modalidade exemplificativa, a revelação proporciona composi- ções compreendendo uma dose de vírus adenoassociado recombinante (rAAV)
SCAAV1.tMCK.NTF3 para melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano necessitado, em que a composição é formulada para administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10"? vg/mL administrado a dose baixa (2x10*? vg/Kkg por paciente) e a dose elevada (6x10? vg/Kkg por paciente) usando 3 até 6 injeções por músculo, respectivamente (cada volume de injeção será 0,5 até 1 mL). Um total de 5 mL até 14 mL de vetor será administrado nas cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior em cada perna.
[086]Em quaisquer das composições da revelação, a via de administração de SCAAV1.tMCK.NTF3 é uma injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior. Adicionalmente, em quaisquer das compo- sições da invenção, a administração de SscCAAV1.tIMCK.NTF3 resulta em força muscu- lar melhorada no sujeito que ocorre nas extremidades superiores ou inferiores, e, por exemplo, a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação composta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds). Adicionalmente, para quaisquer das composições da revelação, a administração da composição resulta em um de- créscimo ou paragem da progressão de doença ao longo de um período de tempo de dois anos. A progressão da doença é medida pela CMTPedS. A CMTPedS é uma escala de 11 itens compreendida pelo Teste de Destreza Funcional, Teste de Pinos em Nove Buracos (9HPT), preensão manual, flexão plantar do pé, e força de dorsi- flexão do pé usando miometria portátil, sensação de picada de alfinete e vibração, o Teste de Bruininks Oseretsky - avaliação do Equilíbrio, avaliação do porte, salto em comprimento, e teste de caminhada de seis minutos (S8MWT). A eficácia é definida como paragem do declínio de capacidades, medida por esta escala aos 2 anos após a transferência genética.
[087]Num aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o sujeito está sofrendo de neuropatia hereditárias como neuropatia de Charcot-Marie-Tooth
(CMT), por exemplo, CMT1A, CMT2K, CMT4A, CMTRIA e neuropatias axonais e des- mielinizantes causadas por uma variante genética autossômica recessiva, ou uma va- riante genética autossômica dominante ou uma variante genética ligada a X. A neuro- patia hereditária pode ser causada por qualquer uma das variantes genéticas propor- cionadas na Tabela 1. Adicionalmente, a neuropatia hereditária pode consistir em neu- ropatias amiloides associadas à transtirretina causadas por uma mutação no gene da transtirretina (TTR), como as seguintes variantes genéticas: Val30Met, Ile107Val e Ser77Tyr.
[088]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o su- jeito está sofrendo de uma neuropatia adquirida com perda axonal e/ou regeneração enfraquecida de nervos. A neuropatia adquirida é uma neuropatia periférica causada por qualquer distúrbio ou doença que causa neuropatia. Por exemplo, o sujeito está sofrendo de neuropatia periférica causada por diabetes mellitus, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), distúrbio da tireoide como hipotireoidismo, hipo- glicêmia, urêmia, insuficiência renal, disfunção hepática, falha hepática, policitêmia, distúrbios do tecido conjuntivo, câncer, doença de Lyme, doença celíaca, lepra, porfí- ria, síndrome de Sjogren, poliomielite, acromegalia, distúrbios do metabolismo de lipí- deos/glicolipídeos, síndrome do Nilo Ocidental, amiloidose, distúrbios mitocondriais, distúrbios disproteinêmicos como gamapatia monoclonal de importância indetermi- nada (MGUS) ou síndrome de POEMS. O sujeito está sofrendo de deficiências nutri- cionais/vitamínicas como deficiência de vitamina B12, deficiência de vitamina E ou de- ficiência de cobre.
[089]Adicionalmente, em quaisquer das composições da revelação, o sujeito está sofrendo de polineuropatia periférica autoimune, polirradiculoneuropatia desmie- linizante inflamatória aguda (AIDP), polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamató- ria crônica (CIDP), mononeurite múltipla vasculítica, paraneuropatia, ganglionite idio- pática, esclerose lateral amiotrófica, neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução ou síndrome de neurônios motores inferiores.
[090]Em quaisquer das composições da revelação, a neuropatia adquirida é uma neuropatia tóxica. Por exemplo, a neuropatia tóxica é o resultado do efeito tóxico de uma medicação prescrita, como Cloranfenicol, Cloroquilina, Colchicina, Dissulfi- ram, Etanercept, Etambutal, Ouro, Hidroxicloroquina, Nitrofuantoína, Metronidazol, Estravudina, Zalcitabina, Infliximab, Leflunomida, Talidomida ou um agente quimiote- rapêutico como Cisplatina, Citarabina, Bortezombid, Docetaxal, Lenalidomida, Mison- diazol, Oxaliplatina, Paclitaxel, Procarbazina, Suramina, Talidomida, Vimblastina ou Vincristina, ou fármacos antiálcool como Dissulfiran, ou anticonvulsivos como Fenito- Ína ou Dilantina, ou medicações para o coração ou pressão sanguínea como estati- nas, Amiodarona, Hidralazina, procainamida, Per-hexilina, ou um antibiótico como Flu- oroquinolonas, Isoniazida, Cipro, Levaquina, Flagil, ou Metronidazol e tratamentos para uma afecção cutânea como Dapsona. A neuropatia tóxica também é causada por abuso de álcool de longa duração ou toxicidade de vitamina Be.
[091]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o su- jeito é um paciente com câncer sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paciente com câncer desenvolveu uma neuropatia relacionada com deficiência nu- tricional, efeitos secundários de quimioterapia, e/ou síndrome paraneoplástica.
[092]Ainda em outro aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o sujeito é um paciente cirúrgico sofrendo de uma neuropatia adquirida. Por exemplo, o paciente cirúrgico desenvolveu uma neuropatia depois de ser submetido a cirurgia bariátrica, múltiplos procedimentos ortopédicos ou múltiplas cirurgias para "nervos comprimidos".
[093]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer dos métodos, o sujeito está sofrendo de miopatia hereditária, doença neuromuscular, atrofia muscular, mio- patia induzida por fármacos, sarcopênia, caquéxia, atrofia de fibras musculares de tipo Il, distrofias musculares geneticamente determinadas, atrofia muscular relacionada com a idade ou um distúrbio de músculos primários autoimune adquirido.
[094] Em outro aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o su- jeito está sofrendo de distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular miotônica, sarcoglicanopatias, distrofia miotônica, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular congênita, distrofia muscular congênita defici- ente em Merosina, miopatia de Bethlem, distrofia muscular congênita de Ullrich, dis- trofia muscular fascioscapulo-humeral, distrofia muscular espinhal, distrofia muscular com espinha rígida, distrofia muscular distal, distrofia muscular oculofaríngea, Distro- fia Muscular Congênita (MDC) 1A, 1B, 1C e 1D; Distrofia Muscular das Cinturas dos Membros (LGMD) 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 2H, 21, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N, 20 e 2Q;; Doença Músculo Olho Cérebro; Síndrome de Fukuyama Walker Warburg; Síndromes miastênicas; Miastenias Congênitas; Miopatia de Corpos de Inclusão; Miosite de Corpos de Inclusão; Dermatomiosite; Miopatia Centronuclear; Miopatia de Myoshi; Miopatia Mitocondrial; Miopatia de Nemaline; Miopatia de No- naka; Miastenia Grave; ou Polimiosite.
[095]Em outro aspecto da revelação, em quaisquer das composições, o su- jeito está sofrendo de lesões traumáticas em nervos como lesões em nervos causadas por compressão, duplo esmagamento ou transeção.
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS
[096]A presente invenção pode ser mais prontamente entendida com referên- cia às seguintes figuras, nas quais:
[097]As Figuras 1A-C proporcionam gráficos e imagens mostrando remodela- gem do tipo de fibras induzida por AAV1.NT-3 em músculo TrJ. Imagens representa- tivas de seções de tecido coradas com SDH de músculo gastrocnêmio Trembler J (TrJ) tratado com AAV1.tMCK.NT-3 (Fig. 1A) e não tratado (TrJ-PBS) (Fig. 1B) às 16 semanas pós-injeção. Oxidativas de contração lenta (STO, setas), oxidativas de con- tração rápida (FTO, ponta de seta) e glicolíticas de contração rápida (FTG, asteriscos)
são mostradas (Fig. 1B). Fibras oxidativas estão decrescidas em a. No músculo TrJ- PBS (Fig. 1B), números aumentados de pequenas fibras STO e fibras angulares de todos os tipos de fibras estão presentes juntamente com agrupamentos de tipos pe- quenos compatíveis com alterações neurogênicas. Barra de escala= 30 g para a, b. Troca do tipo de fibras de fibras STO para FTO/FTG no músculo TrJ com terapia ge- nética com NT-3 (Fig. 1C). A percentagem média de STO (derivado de n=3-5 camun- dongos em cada grupo) em ambos os grupos de tratamento não foi significativamente diferente da do músculo de tipo selvagem (TS), indicando uma alteração no sentido da normalização da distribuição de tipos de fibras com NT-3 no músculo neurogênico TrJ.
[098]As Figuras 2A-C proporcionam gráficos e imagens mostrando o efeito do tratamento com AAV1.NT3 na sinalização de MTOR marcadores metabólicos. Ima- gens de transferência Western representativas e análise de alvos de mMTOR, Fosfo (P)-4EBP1 (Thr37/46), e P-S6 (Ser235/236) em músculos gastrocnêmios TrJ (Fig. 2A) e de tipo selvagem (TS) (Fig. 2B) às 16 semanas pós-injeção. Os gráficos mostram níveis de expressão da forma fosforilada de proteínas normalizados para GAPDH. Membranas coradas com Coomassie Blue representam carga igual em gel. As barras de erro são + EPM; n=5-6 em cada grupo, *P <0,05, teste t não emparelhado. (Fig. 2C) Expressão relativa de reguladores glicolíticos (1-1K1 e PK1) e oxidativos (PGC1a) por qPCR; GAPDH foi usado como gene doméstico. As barras de erro são + EPM; n=5-6 em cada grupo, *P <0,05, Anova de uma via seguido de teste de múltiplas com- parações de Tukey.
[099]As Figuras 3A-D proporcionam gráficos e imagens mostrando o efeito direto de NT-3 em miotubos. (Fig. 3A) Imagens de transferência Western representa- tivas e análise da via de AkKVMTOR, Fosfo (P)-Akt (Ser473), P-AEBP1 (Thr37/46), e P- S6 (Ser235/236) em miotubos incubados com NT-3 humana recombinante (100 ng/mL) ou PBS (controle) durante 30 minutos. Os valores da densidade de bandas de proteína fosforilada foram normalizados para GAPDH e mostrados como percentagem do grupo de controle. Membrana corada com Coomassie Blue representa carga igual em gel. Miotubos foram incubados com NT-3 (100 ng/mL) durante 48 horas, então a expressão relativa de MRNA de marcadores metabólicos (PGC1a, HK1, PK1) foi de- tectada por qPCR (Fig. 3B), e o consumo de glicose versus produção de lactato em meio de cultura de células foi detectada por ELISA (Fig. 3C). (Fig. 3D) Níveis de ex- pressão relativos de miogenina e receptores de NT-3, P75NTR e TrkC em mioblastos versus miotubos após tratamento com NT-3 (100 ng /mL) durante 48 horas. GAPDH foi usado como gene doméstico nas análises. Os resultados mostrados são a média + EPM de pelo menos três experiências independentes, *P <0,05, teste t emparelhado de Student.
[0100]A Figura 4 proporciona um gráfico mostrando níveis de NT-3 no soro em camundongos tratados e não tratados. No Ponto final, soro foi recolhido de cada camundongo e níveis em circulação de NT-3 foram detectados por ELISA.
[0101]A Figura 5 mostra a expressão relativa de MRNA de P75NTR e TrkC em músculo gastrocnêmio TrJ e TS. GAPDH foi usado como gene doméstico nas análi- ses. Os resultados mostrados são a média + EPM de pelo menos três experiências independentes, *P <0,05, teste t de Student.
[0102]A Figura 6 proporciona uma representação esquemática do construto AAV.tIMCK.NTF3 (SEQ ID NO: 11). O vetor contém o promotor específico para mús- culos tMCK (SEQ ID NO: 3), íntron quimérico (SEQ ID NO: 5), sequência de Kozak de consenso (SEQ ID NO: 6), o cDNA de NTF3 (SEQ ID No: 1), e um sinal de poliadeni- lação (SEQ ID NO: 7).
[0103]A Figura 7 proporciona um mapa de restrição e Análise de ORF de PAAV.tMCK.NTF3.
[0104]As Figuras 8A-8B indicam a localização da injeção IM de AAV.IMCK.NTF3 em sujeitos humanos.
[0105JA Figura 9 proporciona a sequência de nucleotídeos de AAV.tIMCK.NTF3 (SEQ ID NO: 11).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0106]O aumento do tamanho de fibras induzido por tratamento com AAV.NT- 3 no músculo TrJ foi pesquisado para determinar se este aumento é unicamente a consequência de reinervação, ou se NT-3 tem efeito direto na síntese de proteínas musculares que é independente da regeneração de nervos e, desse modo, capaz de aumentar o tamanho de fibras musculares.
[0107]É revelado aqui um novo efeito de NT-3, a sua capacidade para influ- enciar diretamente a síntese de proteínas e remodelagem metabólica em músculo neurogênico.
[0108]O trabalho descrito aqui avaliou primeiramente os efeitos de terapia ge- nética com AAV.NT-3 no estado oxidativo do músculo TrJ às 16 semanas pós-injeção do gene e se verificou que o aumento do tamanho das fibras musculares estava as- sociado a uma alteração do estado oxidativo de fibras musculares no sentido da nor- malização da razão de tipos de fibras observada no TS. O tratamento resultou em um decréscimo da percentagem de fibras oxidativas de contração lenta (STO), ao passo que populações de fibras oxidativas e glicolíticas de contração rápida (FTO e FTG) aumentaram, refletindo uma reversão do padrão observado no músculo TrJ não tra- tado. O aumento do tamanho de fibras induzido por NT-3 foi muito notável para a população de fibras FTG. Foi então pesquisado se a ativação do complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos (MTORC1) desempenhou um papel na síntese de pro- teínas musculares induzida por NT-3 com uma ênfase particular no crescimento radial preferencial de fibras glicolíticas. O MTORC1 regula a tradução e biogênese ribossô- mica através da fosforilação dos reguladores da tradução proteína de ligação 1 ao fator de iniciação da tradução 4E eucariótico (4E-BP1) e S6 cinase 1 (S6K1). Laplante M, Sabatini D., Cell, 149(2):274-293 (2012). Além disso, o MTORC1 está associado a ativação da glicólise celular, que envolve a tradução aumentada de enzimas glicolíti- cas ou seus reguladores da transcrição. Duvel et al., Molecular cell, 39(2):171-183 (2010). Se verificou que as alterações histoquímicas no músculo TrJ foram acompa- nhadas de níveis aumentados de fosforilação de 4E-BP1 e proteína S6 (S6P) como evidência da ativação do MTORC1. Em paralelo, os níveis de expressão do regulador da biogênese mitocondrial (coativador 1 a do receptor y ativado por proliferadores de peroxissomos, PGC1a) e dos marcadores da glicólise (hexocinase-1, HK1 e piruvato cinase 1, PK1) aumentaram no músculo TrJ. Estas alterações não foram significativas em músculo TS tratado com AAV.NT-3. Adicionalmente, estudos in vitro mostraram que NT-3 recombinante pode induzir diretamente ativação da via AkKVUMTOR nos mio- tubos expressando TrkC, mas não em mioblastos. Além disso, os níveis de expressão de miogenina foram significativamente elevados nos miotubos, ao passo que a ex- pressão de p75NTR foi subrregulada em comparação com mioblastos, indicando que a diferenciação de mioblastos induzida por NT-3 está associada a ativação de mMTORC1.
[0109]As descobertas descritas aqui têm muitas implicações para o uso po- tencial de NT-3, não só para tratamento de neuropatias com benefícios para nervos e músculo, mas também para afecções de emaciação muscular incluindo envelheci- mento, câncer, caquéxia ou atrofia de fibras musculares de tipo |l bem como distúrbios de músculos primários autoimunes genéticos ou adquiridos associados a fase de re- generação de crescimento radial enfraquecido onde podem estar envolvidas pertur- bações na sinalização de MTORC1 e biogênese mitocondrial deficiente.
[0110]A presente revelação se relaciona com métodos de estimulação do crescimento muscular em um sujeito. O método inclui administrar uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de neurotrofina-3 (NT-3), pró-NT-3, ou um seu fragmento efi- caz, ou um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, a um sujeito necessitado. Sujeitos necessitados de estimulação do crescimento muscu- lar incluem aqueles que têm distrofia muscular ou atrofia muscular.
[0111]A invenção proporciona um método de inibição da emaciação muscular, compreendendo administrar um vetor de AAV para administrar o gene NTF3 codifi- cando neurotrofina-3 (NT-3). Em uma modalidade, a invenção proporciona métodos de terapia genética de tratamento de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A (CMT1A) em que o gene NTF3 codificando NT-3 é administrado ao sujeito usando vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) de tipo 1 sob o controle de um promotor tMCK específico para músculos. Em outra modalidade, a invenção proporciona métodos de terapia ge- nética de aumento da força muscular em sujeitos necessitados, por exemplo, sujeitos diagnosticados ou sofrendo de distúrbios de emaciação muscular como CMT.
[0112]Estudos pré-clínicos demonstraram que a administração do construto AAV1.-t(MCK.NTF3 no músculo gastrocnêmio dos camundongos Trembler J 9(Tr”), um modelo de camundongo de ocorrência natural para CMT1, melhorou a regeneração, mielinização de nervos, densidade de fibras mielinizadas, amplitude do potencial de ação muscular composto do nervo ciático e desempenho funcional no teste de haste rotativa ("rotarod") e força de preensão de membros posteriores (ver Exemplo 3).
[0113]Como usados aqui, os termos "tratamento", "tratar", e similares, se re- lacionam com a obtenção de um efeito farmacológico ou fisiológico desejado. O efeito pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença ou um efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", como usado aqui, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um hu- mano, e pode incluir inibir a doença ou afecção, isto é, travar o seu desenvolvimento; e atenuar a doença, isto é, causar regressão da doença.
[01 14]Prevenção, como usado aqui, se relaciona com qualquer ação que pro- porcione um benefício a um sujeito em risco de ficar afetado com uma afecção ou doença tal como neuropatia, polineuropatia desmielinizante, distúrbios de emaciação muscular ou atrofia.
[0115]"Farmaceuticamente aceitável", como usado aqui, significa que o com- posto ou composição é adequado para administração a um sujeito para os métodos descritos aqui, sem efeitos secundários prejudiciais desnecessários à luz da gravidade da doença e necessidade do tratamento.
[01 16]É pretendido que os termos "terapeuticamente eficaz" e "farmacologi- camente eficaz" qualifiquem a quantidade de um agente que irá alcançar o objetivo de melhorar a gravidade da doença e a frequência da incidência. A eficácia do tratamento pode ser medida avaliando uma redução de sintomas em um sujeito em resposta à administração de NT-3.
[0117]O termo "fragmento eficaz" se relaciona com uma porção da sequência polinucleotídica codificando um fragmento funcional do polipeptídeo de NT-3. O termo "fragmento eficaz" também se relaciona com uma porção da sequência de aminoáci- dos do polipeptídeo de NT-3 que retém atividade do fator de crescimento NT-3. Ativi- dades exemplificativas do fator de crescimento NT-3 incluem o suporte da sobrevivên- cia e diferenciação de neurônios existentes, e indução e suporte do crescimento e diferenciação de novos neurônios e sinapses. Adicionalmente, a atividade de NT-3 inclui estimulação do crescimento muscular e função muscular.
[0118]Como usado aqui, o termo "diagnóstico" pode abranger determinar a probabilidade de um sujeito vir a desenvolver uma doença, ou a existência ou natureza de doença em um sujeito. O termo diagnóstico, como usado aqui, também abrange determinar a gravidade e desfecho provável de doença ou episódio de doença ou perspectiva de recuperação, que geralmente é referido como prognóstico. "Diagnós- tico" também pode abranger diagnóstico no contexto de terapia racional, em que o diagnóstico orienta a terapia, incluindo seleção inicial de terapia, modificação de tera- pia (por exemplo, ajuste da dose ou regime de dosagem), e similares.
[0119]Um "sujeito", como usado aqui, pode ser qualquer animal, e também pode ser referido como paciente. Preferencialmente, o sujeito é um animal vertebrado, e mais preferencialmente o sujeito é um mamífero, como um animal de fazenda do- mesticado (por exemplo, vaca, cavalo, porco) ou animal de estimação (por exemplo, cão, gato). Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[0120]O termo "polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucleico" se relaciona com uma forma polimérica de nucleotídeos com pelo menos 10 bases de compri- mento. O termo inclui moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico ou sintético) e moléculas de RNA (por exemplo, MRNA ou RNA sintético), bem como análogos de DNA ou RNA contendo análogos de nucleotídeos não naturais, ligações internucleosídeos não nativas, ou ambos. O ácido nucleico pode estar em qualquer conformação topológica. Por exemplo, o ácido nucleico pode ter fita simples, fita du- pla, fita tripla, em quadruplex, parcialmente de fita dupla, ramificado, em grampo, cir- cular ou em uma conformação em cadeado.
[0121]O termo "gene", como usado aqui, se relaciona com uma sequência de nucleotídeos que pode dirigir a síntese de uma enzima ou outra molécula polipeptídica (por exemplo, pode compreender sequências codificadoras, por exemplo, um quadro de leitura aberto (ORF) contíguo que codifica um polipeptídeo) ou pode ser, ele pró- prio, funcional no organismo. Um gene em um organismo pode estar agrupado dentro de um óperon, como definido aqui, em que o óperon está separado de outros genes e/ou óperons por DNA intergênico. Genes individuais contidos dentro de um óperon podem se sobrepor sem DNA intergênico entre os genes individuais.
[0122]Como usado aqui, o termo "AAV" é uma abreviatura padrão para vírus adenoassociado. Um vírus adenoassociado é um parvovírus de DNA de fita simples que cresce somente em células nas quais certas funções são proporcionadas por um vírus auxiliador coinfeccioso. Presentemente há treze serótipos de AAV que foram caracterizados. Informação geral e revisões de AAV podem ser encontradas, por exemplo, em Carter, 1989, "Handbook of Parvoviruses", Vol. 1, pp. 169-228, e Berns,
1990, "Virology", pp. 1743-1764, Raven Press (Nova lorque). No entanto, é totalmente esperado que estes mesmos princípios sejam aplicáveis a serótipos de AAV adicio- nais uma vez que é bem conhecido que os vários serótipos estão muito intimamente relacionados, estrutural e funcionalmente, mesmo ao nível genético. (Ver, por exem- plo, BlacKklowe, 1988, pp. 165-174 de "Parvoviruses and Human Disease", J. R. Patti- son, editor; e Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974).) Por exemplo, todos os serótipos de AAV exibem aparentemente propriedades de replicação muito similares mediadas por genes rep homólogos; e todos têm três proteínas capsídicas relaciona- das como as expressas em AAV2. O grau de relação é adicionalmente sugerido por análise de heteroduplexes que revela extensa hibridação cruzada entre serótipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de autoemparelha- mento análogos nos terminais que correspondem a "sequências de repetição terminal invertida" (ITRs). Os padrões de infectividade similares também sugerem que as fun- ções de replicação em cada serótipo estão sob controle regulador similar.
[0123]O termo "vetor" ou "vetor de expressão" se relaciona com qualquer tipo de construto genético compreendendo um ácido nucleico codificando um RNA capaz de ser transcrito. Vetores de expressão podem conter uma variedade de sequências de controle, genes estruturais (por exemplo, genes de interesse), e sequências de ácidos nucleicos que também têm outras funções.
[0124]Por "vetor" se pretende referir uma molécula de DNA, habitualmente derivada de um plasmídeo ou bacteriófago, na qual fragmentos de DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vetor recombinante conterá um ou mais sítios de restrição únicos, e pode ser capaz de replicação autônoma em um organismo hospedeiro ou de veículo definido de modo que a sequência clonada seja reproduzível. Um vetor contém um promotor operavelmente ligado a um gene ou região codificadora de modo que, por transfecção em uma célula receptora, um RNA é expresso.
[0125]Um "vetor de AAV", como usado aqui, se relaciona com um vetor com- preendendo um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flan- queados por sequências de repetição terminal (ITRs) de AAV. Tais vetores de AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presen- tes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor codificando e ex- pressando produtos dos genes rep e cap.
[0126]Um "vírion de AAV" ou "partícula viral de AAV" ou "partícula de vetor de AAV" se relaciona com uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína capsídica de AAV e um vetor de AAV polinucleotídico encapsidado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV de tipo selvagem, tal como um transgene a ser distribuído em uma célula de mamífero), esta é tipicamente referida como "partícula de vetor de AAV" ou simplesmente um "vetor de AAV". Assim, a produção de partícula de vetor de AAV inclui necessariamente a produção de vetor de AAV, pois tal vetor está contido dentro de uma partícula de vetor de AAV.
[0127]Como usado aqui, o termo "cerca de" se relaciona com um desvio de +/- 10% do valor básico.
[0128]A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e cien- tíficos usados aqui têm o mesmo significado que é habitualmente entendido pelo perito na técnica à qual pertence esta invenção.
Terapia Genética de Neuropatia Periférica
[0129]Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de trata- mento de um sujeito tendo atrofia muscular usando terapia genética.
[0130]Vetores que podem ser utilizados para administrar um ácido nucleico terapêutico incluem vetores virais e não virais. Vetores adequados que podem ser usados incluem adenovírus, vírus adenoassociado, retrovírus, lentivírus, HSV (vírus herpes simplex) e plasmídeos. Uma vantagem de vetores de vírus Herpes simplex é o seu tropismo natural para neurônios sensoriais. No entanto, vetores virais associa- dos a adenovírus são muito populares, devido ao seu baixo risco de mutagênese por inserção e imunogenicidade, a sua falta de genes virais endógenos, e a sua capaci- dade de serem produzidos em um título elevado. Kantor et al. reveem uma variedade de métodos de transferência genética para o sistema nervoso central, ao passo que Goins et al. descrevem métodos de terapia genética para o tratamento de dor crônica do sistema nervoso periférico. Ver Kantor et a/., Adv Genet. 87, 125-197 (2014), e Goins et al., Neurobiol. Dis. 48(2), 255-270 (2012), cujas revelações são incorporadas aqui a título de referência. Em particular, a administração com êxito de genes a células de Schwann, as células da glia residentes de nervos periféricos, foi relatada usando vários vetores virais. Mason et al., Curr. Gene Ther. 11, 75-89 (2011). Se o vetor esti- ver em um vetor viral e o vetor tiver sido empacotado, então os vírions podem ser usados para infectar células. Se for usado DNA nu, então podem ser usados procedi- mentos de transfecção ou transformação apropriados para as células hospedeiras particulares. Formulações de DNA nu utilizando polímeros, lipossomos, ou nanoesfe- ras podem ser usadas para administração de genes. Ácidos nucleicos podem ser ad- ministrados em qualquer formato desejado que proporcione níveis de administração suficientemente eficientes, incluindo em partículas de vírus, em lipossomos, em nano- partículas e complexados com polímeros.
[0131]O ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou transgene) codificando um gene cuja expressão decresce neuropatia periférica pode ser clonado em um cassete de expressão que tem um elemento regulador como um promotor (constitutivo ou re- gulável) para conduzir a expressão do transgene e uma sequência de poliadenilação a jusante do ácido nucleico. Por exemplo, podem ser usados elementos reguladores que são 1) específicos para um tecido ou região do corpo; 2) constitutivos; e/ou 3) induzíveis/reguláveis.
[0132]Em algumas modalidades, são usados elementos reguladores especí- ficos para músculos. Elementos reguladores específicos para músculos incluem pro- motores específicos para músculos incluindo promotor de creatina cinase para mús- culo (MCK) de mamífero, promotor de desmina de mamífero, promotor de troponina | (TNNI2) de mamífero, ou promotor da alfa-actina esquelética (ASKA) de mamífero. Intensificadores específicos para músculos úteis na presente invenção são seleciona- dos do grupo consistindo em intensificador de MCK de mamífero, intensificador de DES de mamífero, e intensificador da troponina | IRE (TNI IRE, daqui em diante refe- rido como FIRE) de vertebrado. Um ou mais destes elementos intensificadores espe- cíficos para músculos podem ser usados em combinação com um promotor específico para músculos da invenção para proporcionar um elemento regulador específico para tecidos.
[0133]Um vetor preferencial para uso no tratamento de atrofia muscular por terapia genética é AAV. A administração de genes mediada por AAV tem emergido como uma ferramenta eficaz e segura para estudos pré-clínicos e clínicos de distúr- bios neurológicos. Ojala et a/., Neuroscientist., 21(1):84-98 (2015). Presentemente, AAV é o vetor mais amplamente utilizado para ensaios clínicos para distúrbios neuro- lógicos, e nenhuns efeitos adversos ligados ao uso deste vetor foram relatados de ensaios clínicos: O vírus adenoassociado é um dependovírus não patogênico da fa- mília Parvoviridae requerendo funções auxiliadoras de outros vírus, como adenovírus ou vírus herpes simplex, para cumprir o seu ciclo de vida. O AAV de tipo selvagem (TS) é CARACTERIZADO por um genoma de DNA de fita simples (sSDNA), com re- petições terminais invertidas (ITR) em ambas as extremidades, de aproximadamente kb rodeado por um capsídeo.
[0134]Vetores adenovirais para uso na administração de transgenes em célu- las para aplicações como terapia genética in vivo e estudo in vitro e/ou produção dos produtos de transgenes, são habitualmente derivados de adenovírus por deleção dos genes da região inicial 1 (El) (Berkner, K. L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158 L39-66 1992). A deleção de genes El torna tais vetores adenovirais deficientes para replica- ção e reduz significativamente a expressão dos restantes genes virais presentes no vetor. Vetores adenovirais recombinantes têm várias vantagens para uso como veícu- los de administração de genes, incluindo tropismo para células se dividindo e não se dividindo, potencial patogênico mínimo, capacidade de replicação em título elevado para preparação de estoques de vetores, e o potencial de conter grandes insertos. No entanto, se crê que a presença dos restantes genes virais em vetores adenovirais pode ser prejudicial.
[0135]Em conformidade, em algumas modalidades, vetores adenovirais com deleções de várias sequências de genes adenovirais. Em particular, vetores pseudo- adenovirais (PAVs), também conhecidos como 'adenovírus incompletos' ('gutless ade- novirus') ou vetores miniadenovirais, são vetores adenovirais derivados do genoma de um adenovírus que contêm sequências de nucleotídeos de atuação cis mínimas requeridas para a replicação e empacotamento do genoma do vetor e que podem conter um ou mais transgenes (Ver Pat. U.S. No. 5,882,877 que abrange vetores pseu- doadenovirais (PAV) e métodos para a produção de PAV, incorporada aqui a título de referência). Tais PAVs, que podem acomodar até cerca de 36 kb de ácido nucleico estranho, são vantajosos porque a capacidade de carga do vetor é otimizada, en- quanto o potencial de respostas imunes do hospedeiro ao vetor ou a geração de vírus competentes para replicação é reduzido. Vetores PAV contêm a repetição terminal invertida (ITR) 5' e as sequências de nucleotídeos 3' ITR que contêm a origem da replicação, e a sequência de nucleotídeos de atuação cis requerida para empacota- mento do genoma do PAV, e podem acomodar um ou mais transgenes com elementos reguladores apropriados, por exemplo, promotor, intensificadores, etc.
AAV
[0136]Genomas de AAV recombinantes da invenção compreendem molécula de ácido nucleico da invenção e uma ou mais ITRs de AAV flanqueando uma molécula de ácido nucleico. DNA do AVV nos genomas de rAAV pode provir de qualquer seró- tipo de AAV para o qual pode ser derivado um vírus recombinante, incluindo, mas sem limitação, os serótipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 e AAV-13 (ver, por exemplo, Gao et al., PNAS, 99:11854-11859 ((2002); e "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Pro- tocols", editor Machida, Humana Press, 2003). Adicionalmente, vetores de AAV pseu- dotipados também podem ser utilizados nos métodos descritos aqui. Vetores de AAV pseudotipados são aqueles que contêm o genoma de um serótipo de AAV no capsí- deo de um segundo serótipo de AAV; por exemplo, um vetor de AAV que contém o capsídeo de AAV2 e o genoma de AAV1 ou um vetor de AAV que contém o capsídeo de AAVS5 e o genoma de AAV 2. (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10 (26):3075-81.) A produção de rAAV pseudotipado é revelada, por exemplo, em WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações cap- sídicas, também são contemplados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular The- rapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Como notado na seção Antecedentes acima, as se- quências de nucleotídeos dos genomas de vários serótipos de AAV são conhecidas na técnica. Para promover a expressão específica no músculo esquelético podem ser usados AAV1, AAV6, AAV8 ou AAVrh.74.
[0137]Plasmídeos de DNA da invenção compreendem genomas de rAAV da invenção. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permissíveis para in- fecção com um vírus auxiliador do AAV (por exemplo, adenovírus, adenovírus dele- tado em E1 ou vírus herpes) para montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas. Técnicas para produzir partículas de rAAV, nas quais um genoma do AAV a ser empacotado, genes rep e cap, e funções de vírus auxiliador são proporcionados a uma célula, são comuns na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes em uma única célula (designada aqui como célula de empacotamento): um genoma de rAAV, genes rep e cap de AAV separados de (isto é, não presentes em) o genoma de rAAV, e funções de vírus auxiliador. Os genes rep e cap do AAV podem provir de qualquer serótipo de AAV para o qual pode ser derivado vírus recombinante e podem provir de um serótipo de AAV diferente das ITRs do genoma de rAAV, incluindo, mas sem limitação, os serótipos de AAV AAV-1, AAV- 2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 e AAV-13. A produção de rAAV pseudotipado é revelada, por exemplo, em WO 01/83692 que é incorporado a título de referência aqui na sua totalidade.
[0138]Um método para gerar uma célula de empacotamento consiste em criar uma linha de células que expresse de modo estável todos os componentes necessá- rios para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo um genoma de rAAV sem genes rep e cap de AAV, ge- nes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV, e um marcador selecionável, como um gene de resistência a neomicina, são integrados no genoma de uma célula. Genomas do AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos por procedimentos como formação de caudas GC (Samulski et a/., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081), adição de ligadores sintéticos contendo sítios de clivagem por endo- nucleases de restrição (Laughlin et a/., 1983, Gene, 23:65-73) ou por ligação direta de extremidades planas (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). À linha de células de empacotamento é então infectada com um vírus auxiliador, como adenovírus. As vantagens deste método são o fato de as células serem selecionáveis e serem adequadas para produção em larga escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas e/ou genes rep e cap de rAAV em células de empacotamento.
[0139]Os princípios gerais da produção de rAAV são revistos, por exemplo, em Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin etal., J. Virol., 62:1963 (1988); e Lebkowski et a/., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et a/. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Patente U.S. No. 5,173,414; WO 95/13365 e correspondente Patente U.S. No. 5,658,776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600: WO 97/09441 (PCT/US96/14423)) WO 97/08298 (PCT/US96/13872)) WO 97/21825 (PCT/US96/20777) WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124- 1132; Patente U.S. No. 5,786,211; Patente U.S. No. 5,871,982; e Patente U.S. No. 6,258,595. Os documentos anteriores são deste modo incorporados a título de refe- rência na sua totalidade aqui, com ênfase particular naquelas seções dos documentos relacionadas com a produção de rAAV.
[0140]A invenção proporciona assim células de empacotamento que produ- zem rAAV infeccioso. Em uma modalidade, células de empacotamento podem ser células cancerígenas transformadas de modo estável, como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linha que é um cognato de 293). Em outra modalidade, células de empacotamento são células que não são células cancerígenas transformadas, como células 293 de baixa passagem (células de rim fetal humano transformadas com E1 de adenovírus), células MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fi- broblastos fetais humanos), células Vero (células de rim de macaco) e células FRhL- 2 (células de pulmão fetal de rhesus).
[0141]AAVs recombinantes (isto é, partículas de rAAV encapsidadas infecci- osas) da invenção compreendem um genoma de rAAV. Em modalidades exemplifica- tivas, os genomas de ambos os rAAV não têm DNA de rep e cap de AAV, isto é, não há nenhum DNA de rep ou cap de AAV entre as ITRs dos genomas. Exemplos de rAAV que podem ser construídos para compreender as moléculas de ácido nucleico da invenção são apresentados no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352) incorporado a título de referência aqui na sua totalidade.
[0142]O rAAV pode ser purificado por métodos comuns na técnica, como por cromatografia em coluna ou gradientes de cloreto de césio. Métodos para purificar vetores de rAAV de vírus auxiliador são conhecidos na técnica e incluem métodos revelados, por exemplo, em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); Patente U.S. No. 6,566,118 e WO 98/09657.
[0143]Em outra modalidade, a invenção contempla composições compreen- dendo rAAV da presente invenção. Composições da invenção compreendem rAAV e um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições também podem com- preender outros ingredientes como diluentes e adjuvantes. Transportadores, diluentes e adjuvantes aceitáveis não são tóxicos para recebedores e são preferencialmente inertes às dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões como fosfato, citrato, ou outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobu- linas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, gluta- mina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros hidra- tos de carbono incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; álcoois de açúcar como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol (PEG).
[0144]Títulos de rAAV a serem administrados em métodos da invenção irão variar dependendo, por exemplo, do rAAV particular, do modo de administração, do objetivo do tratamento, do indivíduo, e o(s) tipo(s) de células a ser(em) visado(s), e podem ser determinados por métodos comuns na técnica. Títulos de rAAV podem variar desde cerca de 1x10º, cerca de 1x107, cerca de 1x10º, cerca de 1x10º, cerca de 1x10%º, cerca de 1x10*), cerca de 1x10%?, cerca de 1x10%? até cerca de 1x10** ou mais partículas resistentes a DNase (DRP) por mL. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg).
[0145]Métodos de transdução de uma célula-alvo com rAAV, in vivo ou in vitro, são contemplados pela invenção. Os métodos in vivo compreendem o passo de ad- ministrar uma dose eficaz, ou múltiplas doses eficazes, de uma composição compre- endendo um rAAV da invenção a um animal (incluindo um ser humano) necessitado. Se a dose for administrada antes do desenvolvimento de um distúrbio/doença, a ad- ministração é profilática. Se uma dose for administrada depois do desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é terapêutica. Em modalidades da invenção, uma dose eficaz é uma dose que alivia (elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado ao estado de distúrbio/doença a ser tratado, que abranda ou previne a pro- gressão para um estado de distúrbio/doença, que abranda ou previne a progressão de um estado de distúrbio/doença, que diminui a extensão da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) da doença, e/ou que prolonga a sobrevivência.
[0146]Em particular, a administração real de rAAV da presente invenção pode ser efetuada usando qualquer método físico que transporte o vetor recombinante de rAAV para o tecido-alvo de um animal. Administração de acordo com a invenção inclui, mas sem limitação, injeção em músculo, na corrente sanguínea e/ou diretamente no fígado. Simplesmente ressuspender um rAAV em solução salina tamponada com fos- fato tem demonstrado ser suficiente para proporcionar um veículo útil para expressão em tecido muscular, e não há restrições conhecidas quanto aos transportadores ou outros componentes que podem ser coadministrados com o rAAV (apesar de compo- sições que degradem DNA deverem ser evitadas no modo normal com rAAV). Prote- Ínas capsídicas de um rAAV podem ser modificadas de modo que o rAAV seja dirigido para um tecido de interesse-alvo particular, como músculo. Ver, por exemplo, WO
02/053703, cuja revelação é incorporada a título de referência aqui. Composições far- macêuticas podem ser preparadas como formulações injetáveis ou como formulações tópicas a serem administradas nos músculos por transporte transdérmico. Numerosas formulações para injeção intramuscular e transporte transdérmico foram previamente desenvolvidas e podem ser usadas na prática da invenção. O rAAV pode ser usado com qualquer transportador farmaceuticamente aceitável para facilidade de adminis- tração e manejo.
[0147]A transdução pode ser efetuada com cassetes de genes compreen- dendo elementos de controle específicos para tecidos. Por exemplo, uma modalidade da invenção proporciona métodos de transdução de células musculares e tecidos musculares dirigidos por elementos de controle específicos para músculos, incluindo, mas sem limitação, os derivados das famílias dos genes de actina e miosina, como da família de genes myoD [Ver Weintraub et a/., Science, 251: 761-766 (1991)], o fator de ligação intensificador específico para miócitos MEF-2 [Cserjesi e Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], elementos de controle derivados do gene da actina es- quelética humana [Muscat et al/., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], o gene da actina cardíaca, elementos de sequência de creatina cinase muscular [Ver Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] e o elemento intensificador de creatina cinase mu- rina (mCK), elementos de controle derivados do gene da troponina C esquelética de contração rápida, o gene da troponina C cardíaca de contração lenta e o gene da troponina | de contração lenta: fatores nucleares induzíveis por hipóxia (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementos induzíveis por esteroi- des e promotores incluindo o elemento de resposta a glucocorticoides (GRE) (Ver Mader e White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)), e outros elementos de controle.
[0148] Tecido muscular é um alvo atrativo para administração de DNA in vivo porque não é um órgão vital e é fácil de aceder. A invenção contempla expressão sustentada de miRNAs a partir de miofibras transduzidas.
[0149]Por "célula muscular" ou "tecido muscular" se pretende significar uma célula ou grupo de células derivado de músculo de qualquer tipo (por exemplo, mús- culo esquelético e músculo liso, por exemplo, do trato digestivo, vesícula urinária, va- sos sanguíneos ou tecido cardíaco). Tais células musculares podem ser diferenciadas ou indiferenciadas, como mioblastos, miócitos, miotubos, cardiomiócitos e cardio- mioblastos.
[0150]O termo "transdução" é usado para referir a administração/distribuição da região codificadora de NT-3 a uma célula recebedora in vivo ou in vitro, via um rAAV deficiente para replicação da invenção, resultando em expressão de NT-3 pela célula recebedora.
[0151]Em uma modalidade, a terapia genética é terapia genética com NT-3 via administração de vírus adenoassociado recombinante (AAV). Os inventores de- senvolveram um cassete de expressão de AAV contendo a sequência codificadora de CDNA de NT-3 humano sob o controle do promotor do CMV ou do promotor triplo da creatina cinase específico para músculos (tMCK). Os inventores mostraram previa- mente que uma melhoria na função motora, histopatologia, e eletrofisiologia de nervos periféricos pode ser alcançada usando o vetor de AAV1 recombinante para aumentar a expressão de neurotrofina-3 no camundongo Tremble (Try), que é um modelo para a variante da doença Charcot-Marie-Tooth CMT1A. Ver Sahenk et al., Mol Ther. 22(3):511-21 (2014), cuja revelação é incorporada aqui a título de referência.
[0152]Assim, a invenção proporciona métodos para administrar uma dose efi- caz (ou doses, administradas essencialmente de modo simultâneo ou doses adminis- tradas em intervalos) de rAAV que codifica NT-3 a um paciente necessitado.
Doses e Vias de Administração
[0153]A invenção proporciona administração local e administração sistêmica de uma dose eficaz de rAAV e composições da invenção, incluindo terapia de combi- nação da invenção. Por exemplo, administração sistêmica é administração no sistema circulatório de modo que todo o corpo é afetado. Administração sistêmica inclui admi- nistração entérica, como absorção através do trato gastrointestinal, e administração parentérica através de injeção, infusão ou implantação.
[0154]Vias de administração para o rAAV contempladas nos métodos anteri- ores incluem, portanto, mas sem limitação, as vias intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) e intravascular [incluindo, por exemplo, perfusão de membros interarterial (ILP) e intravenosa (IV)].
[0155]A dose de rAAV a ser administrada em métodos revelados aqui irá va- riar dependendo, por exemplo, do rAAV particular, do modo de administração, do ob- jetivo do tratamento, do indivíduo, e o(s) tipo(s) de células a ser(em) visado(s), e pode ser determinada por métodos comuns na técnica. Pode ser administrada mais do que uma dose, por exemplo, uma, duas, três ou mais doses. Títulos de rAAV em uma dose podem variar desde cerca de 1x108, cerca de 1x107, cerca de 1x108, cerca de 1x10º, cerca de 1x10%º, cerca de 1x1), cerca de 1x10"?, cerca de 1,5x10"?, cerca de 1x10"?, cerca de 3x10?, cerca de 4x10'?, cerca de 5x10"?, cerca de 6x10?, cerca de 6,5 x10"?, cerca de 7x1072?, 1x10%3, cerca de 1x10%4, ou até cerca de 1x10'* ou mais partículas resistentes a DNase (DRP) por mL. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg) (isto é, 1xX107 vg, 1x10º vg, 1x10º vg, 1x10º vg, 1x10*! vg, 1xX10? vg, cerca de 1,5x10!? vg, cerca de 1x10? vg, cerca de 3x10"? vg, cerca de 4x10? vg, cerca de 5x10'? vg, cerca de 6x10"? vg, cerca de 6,5 x10? vg, cerca de 7xX10*? vg, 1x10º? vg, 1x10*º vg, 1xX105, respectivamente). Métodos para titular AAV são descritos em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).
[0156]Em algumas modalidades dos métodos anteriores nos quais a via de administração é uma via IM, a dose do rAAV administrado vai desde cerca de 1,5x102 até pelo menos cerca de 6,5x10? vg/Kkg. (É pretendido que todos os intervalos aqui apresentados representem cada valor individual dos intervalos, bem como os valores superior e inferior individuais de cada intervalo.) Em algumas modalidades dos méto- dos anteriores nos quais a via de administração é IM, a dose do rAAV administrado é 2x10? vg/kg. Em algumas modalidades dos métodos anteriores nos quais a via de administração é IM, a dose do rAAV administrado é 4x10? vg/kg. Em algumas moda- lidades dos métodos anteriores nos quais a via de administração é IM, a dose do rAAV administrado é 6x10*? vg/Kkg.
[0157]Pacientes humanos são sujeitos contemplados aqui para tratamento. Pacientes humanos são sujeitos contemplados aqui para tratamento por administra- ção IM. Tais pacientes incluem aqueles pacientes que, por exemplo: i) são sujeitos adultos (>18 anos) diagnosticados com CMTI1A, ii) exibem uma duplicação de 1,5 Mb em 17p11.2 inclusive do gene da proteína mielina periférica 22 (PMP22), iii) são indi- víduos do sexo masculino e feminino de qualquer grupo étnico ou racial, iv) exibem fraqueza do músculo de dorsiflexão do tornozelo (deve ter atividade ROM completa contra a gravidade mas não consegue manter dorsiflexão total contra a gravidade ou capaz de suportar saltos altos durante 3 segundos ou mais (critérios Northstar)), v) velocidades anormais de condução nervosa, vi) têm capacidade de cooperar para avaliação clínica e repetir estudos de condução nervosa, e vil) são sujeitos sexual- mente ativos que por vontade prórpia praticarão um método fiável de contracepção durante o estudo. Pacientes adequados podem não incluir, por exemplo, aqueles com i) infecção viral ativa com base em observações clínicas ou evidência sorológica de infecção por HIV, ou Hepatite A, B ou C, ii) terapia imunossupressora decorrente ou terapia imunossupressora em um período de 6 meses do início do ensaio (por exem- plo, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, ciclofosfamida, imunoglo- bulina intravenosa), iii) leucopênia ou leucocitose persistente (Leucócitos < 3,5 K/uL ou 2 20,0 K/yL) ou uma contagem absoluta de neutrófilos < 1,5 K/uL, iv) títulos de anticorpos de ligação a AAV1 2 1:50 determinados por imunoensaio ELISA, v) doença concomitante ou requisito de tratamento crônico com fármacos que, na opinião do PI, cria riscos desnecessários para transferência genética, vi) contraturas ou cirurgias do tornozelo que não permitem um teste apropriado da força muscular, vii) gravidez, alei- tamento, ou planos para engravidar, viii) outras causas de neuropatia, e/ou ix) cirurgia em membros nos últimos seis meses. Em um protocolo clínico exemplificativo, paci- entes com CMT1A recebem uma dose total de vetor sceAAV1.tMCK.NTF3 dividida nas cabeças medial e lateral dos músculos gastrocnêmio e tibial anterior (TA) das pernas que estão preferencialmente causando fraqueza do tornozelo e instabilidade em CMT. Os sujeitos recebem uma das seguintes: i) dose baixa de vetor de 2x10!? va/kg (dose total) ou ii) uma dose elevada de vetor de 6x10? vg/kg (dose total).
[0158]EmM uma modalidade, o vetor é administrado por injeção IM sem dilu- ente. Em modalidades alternativas, podem ser empregues composições para injeção intramuscular que incluem um adjuvante como óleo de sésamo ou amendoim ou pro- pilenoglicol aquoso, bem como soluções aquosas esterilizadas. Tais soluções aquo- sas podem ser tamponadas, se desejado, e o diluente líquido é primeiramente tornado isotônico com solução salina ou glicose. Soluções de rAAV como ácido livre (DNA contém grupos fosfato acídicos) ou um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, como hidroxipro- pilcelulose. Uma dispersão de rAAV também pode ser preparada em glicerol, polieti- lenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazena- mento e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos. A este respeito, todos os meios aquosos esterilizados empregues são prontamente obteníveis por técnicas comuns bem conhecidas dos peritos na téc- nica.
[0159]Os transportadores, diluentes ou excipientes farmacêuticos adequados para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas esterilizadas e pós esteri-
lizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esteri- lizadas. Em todos os casos, a forma deve ser esterilizada e deve ser fluida de modo a existir capacidade fácil de manuseamento com seringa. Deve ser estável nas con- dições de fabricação e armazenamento e ser conservada contra as ações contamina- doras de microrganismos, tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exem- plo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglico! líquido, e similares), suas misturas ade- quadas, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, usando um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho desejado das partí- culas no caso de uma dispersão, e usando tensoativos. A prevenção da ação de mi- crorganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provo- cada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0160]Soluções injetáveis esterilizadas são preparadas incorporando-se rAAV, na quantidade requerida, no solvente apropriado com vários ingredientes dife- rentes enumerados acima, conforme requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando-se o ingrediente ativo esterili- zado em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e a técnica de liofilização, originando um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da sua solução previa- mente esterilizada por filtração.
[0161]A transdução com rAAV também pode ser efetuada in vitro. Em uma modalidade, células musculares-alvo desejadas são removidas do sujeito, transduzi- das com rAAV e reintroduzidas no sujeito. Alternativamente, células musculares sin- geneicas ou xenogeneicas podem ser usadas quando tais células não gerarem uma resposta imune inapropriada no sujeito.
[0162]Em outro aspecto, genomas de rAAV são proporcionados aqui. Os ge- nomas do rAAV administrados compreendem um polinucleotídeo de NT-3 sob o con- trole de sequências de controle da transcrição. Os genomas de rAAV não têm DNA de rep e cap de AAV. DNA do AVV nos genomas de rAAV podem provir de qualquer serótipo de AAV para o qual pode ser derivado um vírus recombinante, incluindo, mas sem limitação, os serótipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAVA, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 e AAVrh.74. As sequências de nucleotídeos dos genomas destes serótipos de AAV são conhecidas na técnica, como notado na Seção Antecedentes acima.
[0163]Em algumas modalidades, as sequências de controle da transcrição dos genomas de rAAV são elementos de controle específicos para músculos, inclu- indo, mas sem limitação, os derivados das famílias dos genes de actina e miosina, como da família de genes myoD [Ver Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], o fator de ligação intensificador específico para miócitos MEF-2 [Cserjesi e Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], elementos de controle derivados do gene da actina esquelética humana [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], o gene da actina cardíaca, promotor de creatina cinase muscular (MCK) [Johnson et a/., Mol. Cell. Biol., 9:3393-3399 (1989)] e o intensificador de MCK, promotor de MHCK7 (uma versão modificada do promotor de MCK que incorpora um intensificador da cadeia pesada de miosina (Salva et al., Mol. Ther., 15: 320-329 (2007)), promotor de desmina, elementos de controle derivados do gene da troponina C esquelética de contração rápida, o gene da troponina C cardíaca de contração lenta e o gene da troponina | de contração lenta: fatores nucleares induzíveis por hipóxia (Semenza et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementos induzíveis por esteroides e promo- tores incluindo o elemento de resposta a glucocorticoides (GRE) (Ver Mader e White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)), e outros elementos de controle. Em algumas modalidades, os elementos de controle da transcrição incluem o promotor de MCK. Em algumas modalidades, os elementos de controle da transcrição incluem o promotor de MHCK7.
[0164]Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de NT-3 em um genoma de rAAV é o cDNA de NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 1 (correspondente aos nu- cleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o polinucleotí- deo de NT-3 em um genoma de rAAV é o cDNA de NT-3 apresentado no Genbank Acesso tt NM 001102654 ou a sequência de cDNA de NT-3 apresentada como SEQ ID NO: 1, ou é um polinucleotídeo variante tendo 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o cDNA de NT-3. Em algumas modalidades, o polinu- cleotídeo de NT-3 variante codifica o mesmo polipeptídeo de NT-3 do polipeptídeo codificado por cDNA de NT-3 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos do poli- peptídeo de NT-3 codificado pelo cDNA de NT-3 apresentado como SEQ ID NO: 1 ou proporcionado como Genbank Acesso tt! NM 001102654 é apresentada na SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de NT-3 variante codifica um poli- peptídeo de NT-3 variante com pelo menos uma alteração da sequência de aminoá- cidos em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo (SEQ ID NO: 2) codificado por cDNA de NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 1 ou proporcionado como Genbank Acesso % NM 001102654. Uma alteração da sequência de aminoácidos pode ser, por exemplo, uma substituição, uma deleção, ou uma inserção de um ou mais aminoácidos, preferencialmente substituições conservativas. Um polipeptídeo de NT-3 variante pode ter qualquer combinação de substituições, deleções ou inserções de aminoácidos em que a atividade do polipeptídeo é retida. Em um aspecto, um po- lipeptídeo de NT-3 variante pode ter algumas alterações de aminoácidos de modo que a sua sequência de aminoácidos partilha pelo menos 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 99,5% de identidade com a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) codifi- cada por cDNA de NT-3 apresentada como SEQ ID NO: 1 ou proporcionada como Genbank Acesso tt! NM 001102654.
[0165]JEM algumas modalidades, o genoma de rAAV é o genoma de AAV.IMCK.NTF3, cuja sequência do cassete do gene NT-3 é apresentada na SEQ ID NO: 11 e está anotada na Tabela 4 (ver Exemplo 3).
[0166]Ainda em outro aspecto, um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência de nucleotídeos ilustrada na SEQ ID NO: 11 é proporcionado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado consiste na sequência de nucleotídeos ilustrada na SEQ ID NO:11.
[0167] Também é proporcionado um ácido nucleico isolado compreendendo, na ordem 5' para 3': (1) uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2 (SEQ ID NO: 4); (ii) uma sequência do promotor de creatina cinase muscular (SEQ ID NO: 3); (iii) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de NT-3 humano (SEQ ID NO: 1); e (iv) uma segunda sequência de ITR de AAV2 (SEQ ID NO: 8), em que o polipeptídeo de NT-3 humano tem uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2, é 100% idêntica à SEQ ID NO:2, ou é codificada pelos nucleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11.
[0168]AAV recombinante compreendendo os ácidos nucleicos anteriores é contemplado bem como rAAV compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos ilustrada na SEQ ID NO: 1.
[0169]São proporcionados plasmídeos de DNA compreendendo genomas de rAAV da revelação. Os plasmídeos de DNA compreendem genomas de rAAV contem- plados aqui. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permissíveis para infecção com um vírus auxiliador do AAV (por exemplo, adenovírus, adenovírus dele- tado em E1 ou vírus herpes) para montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas. Técnicas para produzir partículas de rAAV, nas quais um genoma do AAV a ser empacotado, genes rep e cap, e funções de vírus auxiliador são proporcionados a uma célula, são comuns na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes em uma única célula (designada aqui como célula de empacotamento): um genoma de rAAV, genes rep e cap de AAV separados de (isto é, não presentes em) o genoma de rAAV, e funções de vírus auxiliador. Os genes rep e cap do AAV podem provir de qualquer serótipo de AAV para o qual pode ser derivado um vírus recombinante e podem provir de um serótipo de AAV diferente das ITRs do genoma de rAAV, incluindo, mas sem limitação, os serótipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 e AAV rh74. A produção de rAAV pseudotipado é revelada, por exemplo, em WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações capsídicas, tam- bém são contemplados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014).
[0170]Um método para gerar uma célula de empacotamento consiste em criar uma linha de células que expresse de modo estável todos os componentes necessá- rios para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo um genoma de rAAV sem genes rep e cap de AAV, ge- nes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV, e um marcador selecionável, como um gene de resistência a neomicina, são integrados no genoma de uma célula. Genomas do AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos por procedimentos como formação de caudas GC (Samulski et a/., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081), adição de ligadores sintéticos contendo sítios de clivagem por endo- nucleases de restrição (Laughlin et a/., 1983, Gene, 23:65-73) ou por ligação direta de extremidades planas (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). À linha de células de empacotamento é então infectada com um vírus auxiliador, tal como um adenovírus. As vantagens deste método são o fato de as células serem selecionáveis e serem adequadas para produção em larga escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas e/ou genes rep e cap de rAAV em células de empacotamento. Métodos para produzir rAAV com genomas autocomplementares também são conhecidos na técnica.
[0171]Os princípios gerais da produção de rAAV são revistos, por exemplo, em Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); e Lebkowski et al/., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et a/. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Patente U.S. No. 5,173,414; WO 95/13365 e correspondente Patente U.S. No. 5,658,776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872)) WO 97/21825 (PCT/US96/20777) WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et a/. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124- 1132; Patente U.S. No. 5,786,211; Patente U.S. No. 5,871,982; e Patente U.S. No. 6,258,595. Os documentos anteriores são deste modo incorporados a título de refe- rência na sua totalidade aqui, com ênfase particular naquelas seções dos documentos relacionadas com a produção de rAAV.
[0172]EmM um aspecto adicional, a revelação proporciona assim células de empacotamento que produzem rAAV infeccioso. Em uma modalidade, células de em- pacotamento podem ser células cancerígenas transformadas de modo estável, como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linha que é um cognato de 293). Em outra modalidade, células de empacotamento são células que não são células cance- rígenas transformadas, tais como células 293 de baixa passagem (células de rim fetal humano transformadas com E1 de adenovírus), células MRC-5 (fibroblastos fetais hu- manos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células de rim de macaco) e células FRhL-2 (células de pulmão fetal de rhesus).
[0173]O rAAV pode ser purificado por métodos comuns na técnica, como por cromatografia em coluna ou gradientes de cloreto de césio. Métodos para purificar vetores de rAAV de vírus auxiliador são conhecidos na técnica e incluem métodos revelados, por exemplo, em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); Patente U.S. No. 6,566,118 e WO 98/09657.
[0174]Assim, em outro aspecto, a revelação contempla um rAAV compreen- dendo um polinucleotídeo de NT-3. Em algumas modalidades, o rAAV compreende capsídeo de AAV rh74 e um polinucleotídeo de NT-3. Em algumas modalidades, o genoma do rAAV não tem DNA de rep e cap de AAV. Em algumas modalidades dos métodos, o rAAV é rAAVrh7.4.t»MCK.NTF3. Em algumas modalidades, o rAAV é um genoma autocomplementar.
[0175]EmM outro aspecto, a revelação contempla composições compreen- dendo um rAAV descrito aqui. Composições da revelação compreendem rAAV em um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições também podem compre- ender outros ingredientes, como diluentes. Transportadores e diluentes aceitáveis não são tóxicos para recebedores e são preferencialmente inertes às dosagens e concen- trações empregues, e incluem tampões como fosfato, citrato, ou outros ácidos orgâ- nicos; antioxidantes como ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros hidratos de carbono incluindo gli- cose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; álcoois de açúcar como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como Tween, Pluronics ou polietilenoglico! (PEG). Em algumas modalidades, o rAAV é formulado em Tris, MgCl2, NaCl e Pluronic F68. Em algumas modalidades, o rAAV é formulado em Tris 20 mM (pH 8,0), MgCl2 1 mM e NaCl 200 mM contendo Pluronic F68 0,001%.
[0176] Tratamentos de combinação também são contemplados aqui. Combi- nações, como as usadas aqui, incluem tratamento simultâneo ou tratamentos sequen- ciais. Combinações de métodos da revelação com tratamentos médicos padrão (por exemplo, corticosteroides e/ou fármacos imunossupressores) são especificamente contemplados, como o são combinações com tratamentos novos. Em várias modali- dades, sujeitos são tratados com corticosteroides antes, durante ou após (ou com qualquer permutação de combinações de duas ou mais das três possibilidades) o su- jeito ser tratado de acordo com um método contemplado aqui. Por exemplo, as com- binações incluem administrar um corticosteroide, por exemplo, prednisolona, antes, durante e/ou após administração do vetor de rAAV.
[0177]Soluções injetáveis esteriizadas são preparadas incorporando-se rAAV, na quantidade requerida, no solvente apropriado com vários ingredientes dife- rentes enumerados acima, conforme requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando-se o ingrediente ativo esterili- zado em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e a técnica de liofilização, originando um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da sua solução previa- mente esterilizada por filtração.
Estimulação do Crescimento Muscular
[0178]Um aspecto da invenção proporciona um método de estimulação do crescimento muscular em um sujeito, compreendendo administrar uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de neurotrofina-3 (NT-3), pró-NT-3, ou um seu fragmento efi- caz, ou um ácido nucleico codificando NT-3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz; a um sujeito necessitado.
[0179]Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para aumentar a força muscular, massa muscular, ou capacidade de resistência mus- cular e decrescer a fadiga muscular em um sujeito.
[0180]O músculo pode ser dividido em três tipos: músculo esquelético, mús- culo cardíaco, e músculo liso. O músculo esquelético é tecido muscular capaz de gerar força, e a transferência dessa força para o esqueleto permite a respiração, movimento, e manutenção da postura. O músculo cardíaco é músculo do coração. O músculo liso é tecido muscular das paredes arteriais e do intestino. Os métodos e composições da presente invenção se aplicam principalmente ao músculo esquelético e, mas também podem afetar positivamente músculos lisos. "Músculo esquelético" e "músculos es- queléticos" são definidos como músculos com interações com ossos, tendões e arti- culações.
[0181]Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de tratamento de enfermidades, doenças, distúrbios, e afecções que causam um de- créscimo da força muscular (também referidas aqui como doenças musculoesqueléti- cas, e como disfunção muscular e doenças de emaciação muscular). As principais categorias de doenças musculoesqueléticas são distrofias musculares e atrofia mus- cular.
[0182]Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para o tra- tamento de doenças musculoesqueléticas, incluindo disfunção muscular e doenças ou distúrbios de emaciação muscular, incluindo miopatia hereditária, doença neuro- muscular, atrofia muscular, miopatia induzida por fármacos, ou uma enfermidade, do- ença, distúrbio ou afecção que causa um decréscimo da força muscular. A invenção também proporciona métodos para o tratamento de neuropatias como CMT hereditá- ria e CMT1A, bem como polineuropatias axonais e desmielinizantes como polineuro- patia desmielinizante inflamatória crônica. O método de tratamento inclui administrar a um paciente necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de neurotrofina- 3 (NT-3), pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz, ou um ácido nucleico codificando NT- 3, pró-NT-3, ou um seu fragmento eficaz. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença muscular selecionada do grupo consistindo em sarcopênia, caquéxia, atrofia de fibras musculares de tipo || e distúrbios de músculos primários autoimunes adqui- ridos associados a fase de regeneração de crescimento radial enfraquecida.
[0183]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usada para tratar atrofia mus- cular. Atrofia muscular é um termo geral usado para descrever uma afecção marcada pela emaciação ou perda de tecido muscular resultante de uma variedade de doenças, distúrbios, outras afecções, ou eventos. Atrofias musculares podem resultar, mas sem limitação, de imobilização prolongada resultante da recuperação de queimaduras gra- ves, grande cirurgia de substituição de articulações, dor neuropática, neuropatia peri- férica, vasculite necrotizante, ambiente de gravidade nula (por exemplo, astronautas e cosmonautas), hospitalização prolongada, doença degenerativa (por exemplo, es- clerose lateral amiotrófica) e transplante de órgãos bem como lesão da medula espi- nhal, hemodiálise crônica e derrame cerebral.
[0184]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usado para tratar atrofia mus- cular por desuso. Atrofia muscular por desuso é uma afecção marcada pela emacia- ção ou perda de tecido muscular resultante de longos períodos de inatividade. Atrofia muscular por desuso pode resultar, mas sem limitação, de imobilização prolongada resultante da recuperação de queimaduras graves, grande cirurgia de substituição de
7T1/134 articulações, dor neuropática, ambiente de gravidade nula (por exemplo, astronautas e cosmonautas), hospitalização prolongada, anorexia e transplante de órgãos bem como lesão da medula espinhal, hemodiálise crônica e derrame cerebral.
[0185]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usada para tratar atrofia mus- cular relacionada com a idade. Atrofia muscular relacionada com a idade é uma afec- ção marcada pela emaciação ou perda de tecido muscular e a substituição de tecido muscular por tecido fibrótico à medida que o sujeito envelhece.
[0186]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usada para tratar sarcopênia. Sarcopênia é uma afecção marcada pela emaciação ou perda de tecido muscular e a substituição de tecido muscular por tecido fibrótico à medida que o sujeito envelhece.
[0187]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usada para tratar a emacia- ção muscular em caquéxia. Caquéxia é perda de peso, atrofia muscular, fadiga, fra- queza e perda de apetite significativa em alguém que não está ativamente determi- nado em perder peso, mas ao invés disso, como resultado de doença crônica. O com- ponente de emaciação muscular de caquéxia pode resultar, mas sem limitação, de câncer, esclerose múltipla, tuberculose, síndrome de deficiência imune adquirida, ví- rus da imunodeficiência humana, desnutrição, doença de Parkinson, enfisema, falha cardíaca, doença de neurônios motores, fibrose cística, demência, sarcopênia, do- ença pulmonar obstrutiva crônica, doença do rim e falha renal.
[0188]Em algumas modalidades, NT-3 pode ser usada para tratar emaciação muscular resultante de infecções virais (por exemplo, HIV, vírus Epstein-Barr), infec- ções bacterianas (por exemplo, micobactérias e Rickettsia), síndrome pós-polio, e in- fecção parasitária (por exemplo, tripanossomos e esquistossomo) em que o sujeito está em risco de desenvolver atrofia muscular.
Neurotofina-3
[0189]Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de NT-3, pró-NT-3, ou um seu análogo de NT-3 é administrada ao sujeito para estimular o crescimento muscular. Neurotrofina 3 (NT-3) é um fator neurotrófico da família das neurotrofinas NGF (Fator de Crescimento dos Nervos). NT-3 é um fator de cresci- mento proteico que tem atividade em certos neurônios do sistema nervoso periférico e central; é melhor conhecido por ajudar a suportar a sobrevivência e diferenciação de neurônios existentes, e encoraja o crescimento e diferenciação de novos neurônios e sinapses.
[0190]A revelação inclui peptídeos bloqueadores que são substancialmente similares a pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de Cx26. O termo "uma porção", como usado aqui, se relaciona com uma sequência de aminoácidos dentro dos domínios extracelulares de Cx26 que inclui pelo menos 4 aminoácidos. Em modalidades adicionais, uma porção se relaciona com uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 6 aminoácidos de comprimento, uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 8 aminoácidos de comprimento, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 10 aminoácidos de comprimento. Em consequência, os peptídeos bloqueadores consistem em pelo menos 4, 6, 8, ou aminoácidos. De igual modo, os peptídeos bloqueadores descritos aqui podem ter um tamanho máximo. O tamanho máximo do peptídeo bloqueador se relaciona com o tamanho global do peptídeo, e inclui quaisquer sequências adicionais ligadas ao peptídeo, como um domínio de transdução de proteína. Em algumas modalidades, o peptídeo bloqueador tem um tamanho máximo menor do que cerca de 200 aminoáci- dos, ao passo que, em outras modalidades, o peptídeo bloqueador tem um tamanho máximo menor do que cerca de 100 aminoácidos. Em outras modalidades, o peptídeo bloqueador tem um tamanho máximo de 75 aminoácidos ou menos, 50 aminoácidos ou menos, 40 aminoácidos ou menos, 30 aminoácidos ou menos, ou 20 aminoácidos ou menos.
[0191]Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" se relaciona com uma se- quência de oligopeptídeo, peptídeo ou proteína, ou com um fragmento, porção, ou subunidade de quaisquer destes, e com moléculas de ocorrência natural ou sintéticas. O termo "polipeptídeo" também inclui aminoácidos ligados entre si por ligações peptí- dicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteros peptídicos, e pode conter qualquer tipo de aminoácidos modificados. O termo "polipeptídeo" também inclui pep- tídeos e fragmentos, motivos de polipeptídeos e similares, polipeptídeos glicosilados, todas as formas de polipeptídeos "miméticas" e "peptidomiméticas", e peptídeos de retroinversão (também referidos como all-D-retro- ou retro-enantio-peptídeos).
[0192]"Substancialmente similar" significa que uma determinada sequência de aminoácidos (ou ácido nucleico) partilha pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade com uma sequência de referência. Identidade ou homologia relativamente a tais sequên- cias é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos peptídeos conhecidos, depois de alinhar as sequên- cias e introduzir intervalos, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de homologia, e não considerando nenhumas substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Extensões, deleções, ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas na sequência peptídica não devem ser consideradas como afetando a homologia.
[0193]Peptídeos substancialmente similares incluem aqueles que diferem por uma ou mais alterações de aminoácidos, em que as alterações, por exemplo, substi- tuições, adições ou deleções de resíduos de aminoácidos, não abolem as proprieda- des dos peptídeos relevantes, como a sua capacidade para se associarem a FAK ou NANOG. Além disso, apenas sequências descrevendo ou codificando proteínas nas quais somente substituições conservativas são efetuadas nas regiões conservadas são substancialmente similares globalmente. Sequências substancialmente similares preferenciais também retêm a atividade distintiva do polipeptídeo.
[0194]Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um
7T4/134 resíduo não polar (hidrofóbico) como isoleucina, leucina ou metionina, por outro. De igual modo, a presente invenção contempla a substituição de um resíduo polar (hidro- fílico), tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, e entre glicina e serina. Adicionalmente, também é contemplada a substituição de um resíduo básico como lisina, arginina ou histidina por outro ou a substituição de um resíduo acídico como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro. Exemplos de substituições não conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) como iso- leucina, valina, leucina, alanina, metionina por um resíduo polar (hidrofílico) como cis- teína, glutamina, ácido glutâmico, lisina e/ou um resíduo polar por um resíduo não polar.
[0195]A frase "substituição conservativa" também inclui o uso de resíduos qui- micamente derivatizados em vez de resíduos não derivatizados, desde que o peptídeo retenha a capacidade requirida de se associar a NT-3. Peptídeos substancialmente similares também incluem a presença de aminoácidos adicionais ou a deleção de um ou mais aminoácidos que não afetam a capacidade requirida de se associar a NT-3. Por exemplo, peptídeos substancialmente similares podem conter uma cisteína N- ou C- terminal, pela qual, se desejado, o peptídeo pode ser covalentemente ligado a uma proteína transportadora, por exemplo, albumina. Tal ligação pode decrescer a elimi- nação do peptídeo do sangue e também decrescer a taxa de proteólise dos peptídeos. Adicionalmente, para propósitos da presente invenção, peptídeos contendo D-amino- ácidos em vez de L-aminoácidos também estão incluídos no termo "substituição con- servativa". A presença de tais isômeros D pode ajudar a minimizar a atividade prote- olítica e eliminação do peptídeo.
[0196]Em algumas modalidades, uma proteína pró-neurotrofina-3 (pró-NT-3) é administrada ao sujeito. A forma pró de neurotrofina-3 é uma forma precursora de NT-3 com —30 kDa que é convertida na NT madura por clivagem enzimática e remo- ção de um pró-domínio N-terminal de -15 kDa. Ver Tauris et al., Eur. J Neurosci, 33(4),
622-631 (2011).
Tratamento de Atrofia Muscular
[0197]A presente invenção proporciona um método de tratamento de um su- jeito tendo atrofia muscular periférica. Compostos de piruvato podem ser usados para proporcionar tratamento profilático e/ou terapêutico. Compostos de piruvato podem, por exemplo, ser administrados profilaticamente a um sujeito antes da ocorrência de neuropatia periférica. A administração profilática (isto é, preventiva) é eficaz para de- crescer a probabilidade da ocorrência subsequente de neuropatia periférica no sujeito, ou decrescer a gravidade de neuropatia periférica que ocorre subsequentemente. Tra- tamento profilático pode ser proporcionado a um sujeito que está em risco elevado de desenvolver neuropatia periférica, como um sujeito com um histórico familiar de neu- ropatia periférica. A expressão de mutações da proteína mielina 22 (PMP22) repre- senta 70-80% de todas as ocorrências de neuropatia de Charcot-Marie-Tooth, e assim a sua presença pode ser útil como critério para selecionar pacientes para receberem tratamento usando os compostos de piruvato descritos aqui.
[0198]Alternativamente, os compostos da invenção podem ser administrados terapeuticamente a um sujeito que já está afetado por neuropatia periférica. Em uma modalidade de administração terapêutica, a administração dos compostos é eficaz para eliminar a neuropatia periférica; em outra modalidade, a administração dos com- postos de piruvato é eficaz para decrescer a gravidade da neuropatia periférica ou prolongar o tempo de vida do sujeito afetado desse modo. Em algumas modalidades, o método de tratamento consiste em administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de piruvato em uma formulação farmaceuticamente aceitável ao sujeito ao longo de um período de tempo substancial.
Variantes de CMT
[0199]Neuropatia hereditária de Charcot-Marie-Tooth (CMT) se relaciona com um grupo de distúrbios caracterizados por uma polineuropatia motora e sensorial crô- nica, também conhecidos como neuropatias motoras e sensoriais hereditárias. Os ti- pos autossômicos dominantes de neuropatia CMT são: desmielinizante (também re- ferida como CMT1), axonal não desmielinizante (também referida como CMT2) e CMT dominante intermédia (DI-CMT). Outras neuropatias que também são equivalentes a CMT são neuropatia motora hereditária distal (IHMN) e atrofia muscular espinhal dis- tal (DSMA) e síndrome de Dejerine-Sottas (DSS). Descrições e classificações de neu- ropatias CMT são proporcionadas em Bird, "GeneReviews", Seattle Washington: Uni- versity of Washington Seattle PIM 20301532, atualizado em 28 de junho de 2018.
[0200]Presentemente há mais de 70 variantes genéticas conhecidas que se sabe estarem associadas a genes de CMT. Estas variantes genéticas são proporcio- nadas na Tabela 1 abaixo usando o sistema de classificação de Magy et al. (Neurology 90:2870-6, 2018). Os modos de hereditariedade para cada uma das variantes genéti- cas associadas a CMT são autossômico dominante (AD), autossômico recessivo (AR) ou Ligado a X (XL). A neuropatia para cada variante genética associada a CMT é axonal (Ax), desmielinizante (De) e intermédia (In). As "outras designações" proporci- onadas na Tabela 1 são designações usadas em outros sistemas de classificação que incluem CMT dominante intermédia (DI-CMT), distrofia muscular espinhal distal (DSMA), neuropatia sensorial e autonômica hereditária (HSAN) e neuropatia motora hereditária distal (HMN). Tabela 1 Tipo de Neuro- gutras — Características ; Gene * MOI patia Fenotípicas / Comentá- e DSsignas Ax De |n Tos AR . Paresia das cordas vo- CMT2K cais * GDAP1 CMT4A AR º .º º Ce
CMTRIA
Tipo de Neuro- Outras — Características 5 1.5 Designa- Gene * MOI patia Fenotípicas / Comentá- ções? 9 Ax De In frios AD,AR e O histórico familiar pode aparentar ser AD uma vez que indivíduos do sexo fe- GJB1 xL º minino podem ser tão gra- CMTX1 vemente afetados como indivíduos do sexo mas- culino.
HINT1 AR º Neuromiotonia io as CMT2A2 MFN2 AD,AR e Atrofia óptica CMT21/2 CMT1IB MPZ AD .º o º CMT21I/J DI-CMTD
CMTIA PMP22 AD U CMTIE SH3TC2 AR º CMT4C AARS AD º CMT2N ABHD12 AR . Surdez, cataratas, retinite PHARC pigmentosa AIEM1 xL e Surdez, incapacidade in- CMTX4 telectual ARHGEF10 AD .º ATP1A1 AD º ATP7AS XL .º Extremidades inferiores distais BAG3 AD e Miopatia miofibrilar, cardi- omiopatia Extremidades inferiores distais; BSCL2 AD º O envolvimento de UMN dHMN5SA pode causar paraplegia espástica CNTNAP1 AR . . Artrogripose, leucodistro- COA7 AR o.
DCTN1 AD Extremidades inferiores dHMN7B
Tipo de Neuro- Outras — Características Outras Designa- Gene * MOI patia Fenotípicas / Comentá- ções ? 9 Ax De In frios distais DCTN2 AD e Paresia das cordas vo- cais DGAT2 AD º DHTKD1 AD U CMT2Q DNAJB2 AR .º Neuropatia motora distal! DSMAS DNMT1 AD e.
Perda de audição, de- DMNT1 mência CMT2M DNM2 AD º DI-CMTB DRP2 XL e Autismo DYNC1H1 AD .º SMA CMT2O0 AD oº CMT1ID EGR2 AR U CMT4E FGD4 AR U CMT4H FIG4 AR o CMT4J : = CMT2D GARS AD º Surgimento nas mãos dHMNSA GNB4 AD º DI-CMTF HARS AD º º CMT2W CMT2F HSPB1 AD U dHMN2B HSPB3 AD dHMN2C ; CMT2L HSPB8 AD º Surgimento no adulto dHMN2A CMT2S IGHMBP2 AR º DSMA1 INF2 AD e —Glomerulosclerose KIF1B AD º CMT2A1 KIFS5A AD º Espasticidade LITAF AD .º CMTIC LMNA AR º CMT2B1 LRSAM1 AD º CMT2G
Tipo de Neuro- Outras — Características 5 11. Designa- Gene * MOI patia Fenotípicas / Comentá- ções? Ax De |n Tfos AR CMT2P MARS AD º CMT2U MCM3AP AR e º Suauenénto na infância, MED25 AR º CMT2B2 MME AR º CMT2T
AD MORC2 AD º CMT2Z MPVI7 AR e Navago Patopatia de CMT1IB MPZ AD .º o .º CMT2IJ DI-CMTD MTMR2 AR .º Paresia das cordas vo- CMT4B1 NAGLU AD º CMT2V NDRG1 AR º CMT4D NEFH AD º NEFL AD,AR e» º CMT1F/2E PDK3 XL º CMTX6 PLEKHG5 AR e —Predominante distal DSMA4 PRPS1 XL Retinopatia, surdez CMTX5 PRX AR º CMT4F PTRH2 AR Perda de audição RAB7A AD . perda sensorial proemi- CMT2B SBF1 AR º CMT4B3 SBF2 AR º CMT4B2 SCO2 AR º Neuropatia motora SETX AD Extemidades inferiores FALS SIGMAR1T AR º Neuropatia motora
Tipo de Neuro- Outras — Características 5 1.5 Designa- Gene * MOI patia Fenotípicas / Comentá- ções? 9 Ax De In frios SGPL1 AR e Mononeuropatia — recor- rente Espasticidade, — declínio CMT2X SPG11 AR º cognitivo ALS5 SPTLC1 AD º HSAN1IA TRIM2 AR . Paresia das cordas vo- CMT2R cais TRPV4 AD e Paresia de cordas vocais CMT2C , displasia esquelética vcP AD .º Miopatia de corpos de in- CMT2Y clusão, demência WARS AD U Neuropatia motora dHMN9 YARS AD .º DI-CMTC Desconhe- xL o.
Progressão rápida, fra- CMTX3 cido queza grave das mãos MOI = modo de hereditariedade AD = autossômico dominante AR = autossômico recessivo XL = ligado a X Ax = axonal De = desmielinizante Ih = intermédia UMN = neurônio motor superior DI-CMT = CMT intermédia dominante DSMA = atrofia muscular espinhal distal ALS = esclerose lateral amiotrófica HSAN = neuropatia sensorial e autonômica hereditária dHMN = neuropatia motora hereditária distal
Administração e Formulação
[0201]O vetor ou peptídeo usado com algumas modalidades da presente in- venção pode ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para admi- nistração a um sujeito. Em algumas modalidades particulares, a composição farma- cêutica compreende o vetor da invenção e um transportador farmaceuticamente acei- tável. Como usado aqui, “transportador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos de transportadores farmaceuticamente acei- táveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos pode ser preferencial incluir na composição agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem adicionalmente compreender quantidades muito pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que intensificam a vida no armazenamento ou eficácia do vetor ou composição farmacêutica.
[0202]Os vetores ou peptídeos podem ser administrados de modo pontual (isto é, durante o surgimento ou pouco após eventos conducentes a atrofia muscular), ou podem ser administrados profilaticamente (por exemplo, antes de cirurgia calenda- rizada ou antes do aparecimento de sinais ou sintomas), ou administrados durante a ocorrência de atrofia muscular para reduzir ou melhorar a progressão de sintomas que de outro modo iriam ocorrer. A calendarização e intervalo de administração são vari- ados de acordo com os sintomas do sujeito, e podem ser administrados em um inter- valo de várias horas até vários dias, ao longo de um período de horas, dias, semanas ou mais, como será determinado pelo perito na técnica.
[0203]As composições contendo os vetores ou peptídeos são geralmente ad- ministradas intravenosamente. Quando administradas intravenosamente, as compo- sições podem ser combinadas com outros ingredientes, como transportadores e/ou adjuvantes. Peptídeos também podem ser covalentemente ligados a um transportador proteico, como albumina, de modo a minimizar a eliminação dos peptídeos. Não há nenhumas limitações quanto à natureza dos outros ingredientes, excetuando que tais ingredientes devem ser farmaceuticamente aceitáveis, eficazes para a sua adminis- tração pretendida e não podem degradar a atividade dos ingredientes ativos das com- posições.
[0204]As formas farmacêuticas adequadas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas esterilizadas e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Em todos os casos, a forma final da formulação deve ser esterilizada e fluida. Transportadores típicos incluem um sol- vente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, soluções aquosas tampo- nadas (isto é, tampões biocompatíveis), etanol, polióis como glicerol, propilenoglico!, polietilenoglicol, suas misturas adequadas, tensoativos ou óleos vegetais. A esterili- zação pode ser alcançada por qualquer técnica reconhecida na técnica, incluindo, mas sem limitação, filtração ou adição de agentes antibacterianos ou antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutano, fenol, ácido sórbico ou timerosal. Além disso, agen- tes isotônicos como açúcares ou cloreto de sódio podem ser incorporados nas com- posições em questão.
[0205]A produção de soluções injetáveis esterilizadas contendo os peptídeos em questão é alcançada incorporando-se estes compostos, na quantidade requerida, no solvente apropriado com vários ingredientes enumerados acima, consoante o re- querido, seguido de esterilização, preferencialmente esterilização por filtração. Para obter um pó esterilizado, as soluções acima são secas a vácuo ou criodessecadas se necessário.
[0206]Quando os peptídeos da invenção são administrados oralmente, as suas composições farmacêuticas contendo uma dose eficaz do peptídeo também po- dem conter um diluente inerte, um transportador comestível assimilável e similares, sejam em cápsulas de gelatina duras ou moles, sejam comprimidas em comprimidos, ou sejam em um elixir, suspensão, xarope ou similares. Os peptídeos em questão são assim submetidos ao processo de composição para administração conveniente e efi- caz em quantidades farmaceuticamente aceitáveis com um transportador farmaceuti- camente aceitável adequado em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[0207]As expressões "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz", como usadas aqui, se relacionam com uma quantidade suficiente de agente para estimular o crescimento muscular ou decrescer ou prevenir atrofia muscular. À quantidade exata requerida irá variar de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade, e estado geral do sujeito, o agente terapêutico particular, o seu modo e/ou via de administração, e similares. Será entendido, no entanto, que a utilização diária total dos compostos e composições da presente invenção pode ser decidida por um médico de atendimento dentro do escopo de avaliação médica fundamentada. O nível espe- cífico de dose terapeuticamente eficaz para qualquer sujeito ou organismo particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravi- dade do distúrbio; a atividade do composto específico empregue; a composição espe- cífica empregue; a idade, peso do corpo, estado geral de saúde, sexo e dieta do su- jeito; o momento da administração, via de administração, e taxa de excreção da com- posição específica empregue; a duração do tratamento; fármacos usados em combi- nação ou de modo coincidente com a composição específica empregue; e fatores si- milares bem conhecidos nas técnicas médicas.
[0208]Os vetores ou peptídeos podem ser administrados de um modo com- patível com a formulação da dosagem e em quantidade tal que serão terapeutica-
mente eficazes. Dosagens sistêmicas dependem da idade, peso e afecções do paci- ente e da via de administração. Por exemplo, uma dose adequada de peptídeo para a administração em humanos adultos varia desde cerca de 0,001 até cerca de 20,0 mg por quilograma de peso do corpo. Os peptídeos devem ser preferencialmente ad- ministrados em uma quantidade de pelo menos cerca de 50 mg por dose, mais prefe- rencialmente em uma quantidade até cerca de 500 mg até cerca de 1 grama por dose. Uma vez que as composições peptídicas desta invenção acabarão por ser eliminadas da corrente sanguínea, a readministração das composições é indicada e preferencial.
Exemplos
[0209]Assim, aspectos e modalidades da invenção são ilustrados pelos se- guintes exemplos. No entanto, há uma grande variedade de outras modalidades den- tro do escopo da presente invenção, que não devem ser limitadas aos exemplos par- ticulares proporcionados aqui.
Exemplo 1 Terapia genética com AAV1.NT-3 aumenta o diâmetro de fibras musculares através de ativação da via MTOR e remodelagem metabólica em um modelo de CMT de camundongo
[0210]NT-3 tem efeitos bem reconhecidos em nervos periféricos e células de Schwann, promovendo a regeneração axonal e mielinização associada. Os efeitos da terapia genética com AAV.NT-3 no estado oxidativo do músculo neurogênico dos ca- mundongos Trembled (TrJ) às 16 semanas pós-injeção do gene foram avaliados e se verificou que o aumento do tamanho das fibras musculares estava associado a uma alteração do estado oxidativo de fibras musculares no sentido da normalização da razão de tipos de fibras observada no tipo selvagem. O aumento do tamanho de fibras induzido por NT-3 foi muito notável para a população de fibras glicolíticas de contração rápida. Estas alterações no músculo TrJ foram acompanhadas de níveis aumentados de fosforilação de 4E-BP1 e proteína S6 como evidência da ativação do MTORC1.
Em paralelo, os níveis de expressão do regulador da biogênese mitocondrial PGC 1a, e dos marcadores da glicólise (HK1 e PK1) aumentaram no músculo TrJ. Estudos in vitro mostraram que NT-3 recombinante pode induzir diretamente ativação da via AKkt/mTOR nos miotubos expressando TrkC, mas não em mioblastos. Conjuntamente, os níveis de expressão de miogenina foram significativamente elevados nos miotubos ao passo que a expressão de p7SNTR foi subrregulada em comparação com mioblas- tos, indicando que a diferenciação de mioblastos induzida por NT-3 está associada a ativação de MTORC1. Estes estudos mostraram pela primeira vez que NT-3 aumenta o diâmetro de fibras musculares no músculo neurogênico através da ativação direta da via de MTOR e que o aumento do tamanho das fibras é mais notável para fibras de contração rápida.
Métodos [021 1]Animais, protocolos de tratamento e histopatologia: Camundongos TrJ (B6.D2-Pmp22Tr-J/J) e C57BL/6 de tipo selvagem foram obtidos do Jackson Labora- tory (Bar Harbor, ME). Camundongos TrJ com nove até 12 semanas de idade foram injetados no músculo gastrocnêmio esquerdo com PBS (n=6) ou 3 x10*º vg de vetor (SC)AAV1.tMCK.NT-3 autocomplementar (n=6). Outro coorte de camundongos TrJ foi injetado com 1 x 10º vg de AAV1.CMV.NT-3 de fita simples para induzir níveis eleva- dos de expressão de NT-3 para comparação (n=6). Camundongos TS receberam PBS (n=6) ou 3 x10'º vg de vetor sScCAAV1.tIMCK.NT-3 (n=4). Grupos de camundongos fo- ram eutanasiados e seus músculos recolhidos às 16 semanas pós-injeção do gene e processados para secionamento com criostato. A histoquímica da enzima succínico desidrogenase (SDH) foi usada para avaliar a diferenciação metabólica de tipos de fibras usando protocolo padrão estabelecido internamente. As medições do diâmetro específico de tipos de fibras musculares foram obtidas de seções transversais coradas com SDH de 12 itpolegadas de espessura. Três imagens, cada uma representando três zonas distintas do músculo gastrocnêmio (uma zona profunda composta predo- minantemente por STO, zona intermédia mostrando uma aparência de tabuleiro de damas de STO e FTO ou FTG e a zona superficial composta predominantemente por fibras FTG) ao longo do eixo da linha média (por seção por zona por animal) foram fotografadas a uma ampliação de X20 usando um microscópio Olympus BX41 e câ- mera SPOT. Esta abordagem foi escolhida para capturar as alterações no estado oxi- dativo de fibras em cada zona em resposta a alterações metabólicas com tratamento. Os diâmetros de fibras escuras (STO), intermédias (FTO) e claras (FTG) foram deter- minados medindo a distância mais curta através das fibras do músculo usando sof- tware Zeiss Axiovision LE4 e foram expressos como percentagem do total. O diâmetro médio das fibras (média + EPM) foi derivado da combinação de todos os 3 tipos de fibras em cada coorte. Uma média de 1250 fibras (entre 960 e 1486) foi medida por grupo.
[0212]Produção e potência do vetor AAV.NT-3: O planejamento de vetores virais de AAV autocomplementares com serótipo 1 contendo NT-3 sob o promotor tMCK ou CMV foi descrito previamente, tendo sido produzidos no Viral Vector Core no Nationwide Children's Hospital, Columbus. Sahenk et a/., Mol Ther, 22(3):511-521 (2014). Vírus separados em alíquotas foram mantidos a — 80 ºC até serem usados. Amostras de sangue foram recolhidas de camundongos tratados e não tratados por sangria ocular sob anestesia às 6 e 16 semanas pós-injeção e soro foi avaliado quanto a níveis de NT-3 usando um ELISA de captura.
[0213]Cultura de mioblastos C2C12 e formação de miotubos: Mioblastos C2C12 foram cultivados em meio de crescimento (GM) consistindo em Meio DMEM (Gibco-lnvitrogen, %10569010, Carlsbad, CA) suplementado com FBS 10% (Fisher Scientific, tt26-140-079 Carisbad, CA), e solução 1% de Penicilina/estreptomicina (Gibco-lInvitrogen, tt15640055 Carlsbad, CA) a 37 ºC e 5% de CO2 em uma câmara umidificada. A formação de miotubos foi induzida em células cultivadas confluentes por troca de GM para meio de diferenciação [DMEM (Gibco-lnvitrogen, 11965092, Carlsbad, CA) suplementado com Soro de cavalo 5% (Gibco-lnvitrogen, 826050088, Carlsbad, CA) e solução 1% de Penicilina/estreptomicina (Invitrogen, 415640055 Car- Isbad, CA)]. Todos os ensaios subsequentes com miotubos incluindo QPCR, Transfe- rência Western e ELISA foram iniciados 3 dias após a indução da formação de miotu- bos. Mioblastos e miotubos foram expostos a NT-3 humana recombinante (Peppro- tech, Rocky Hill, NJ) à concentração de 100 ng/mL em placas de 6 poços. O meio de cultura foi recolhido para a detecção do consumo de glicose e formação de lactato usando kits de ensaio de glicose e lactato (Eton Bioscience, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
[0214]Experiências de QPCR: RNA total foi isolado dos músculos gastrocnê- mios de camundongos tratados com NT-3 e de controle não tratados no ponto final. RNAs totais foram isolados de mioblastos e miotubos antes e 48 horas após os trata- mentos com NT-3. Um kit de isolamento de RNA mirVana (Life Technologies, HAM1560, TX, EUA) foi usado e subsequentemente o cDNA foi sintetizado usando o kit de síntese da primeira Fita de cDNA Trascriptor (Roche, f% 04379012001 Roche, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Outras experiências de qPCR foram rea- lizadas usando iTagTm Universal SYBRO Green Supermix (Biorad, 41725122, Hercu- les, CA, EUA). Sequências de iniciadores para PGC 1a (Cunningham et al., Nature, 450(7170):736-740 (2007)) e GAPDH (Toscano et al., Mol Ther, 18(5):1035-1045 (2010)) (gene doméstico) foram encontradas na literatura. Outras sequências de inici- adores foram encontradas através de Primer Band. Wang et al., Nucleic acids rese- arch, 40 (Fascículo da base de dados): D1144-1149 (2012). Todas as experiências de qPCR foram realizadas usando uma máquina de PCR em Tempo real ABI 7500 e os resultados foram analisados usando Software Data Assist (ABI).
[0215]Experiências de extração de proteínas e transferência Western: Blocos de músculo gastrocnêmio congelados foram cortados em espessura de 20 micropole- gadas, colocados em pequenos tubos de plástico de 2 mL (15-20 seções por bloco) e homogeneizados em tampão de lise [tampão de lise RIPA (Thermo Fisher, f89900, EUA) com lx inibidor de proteases Halt (Thermo Fisher, t78429, EUA) e lx inibidor de fosfatases (Sigma, %POO44, EUA)] usando um misturador de péletes automático e pi- lões descartáveis com períodos de 20 segundos durante três vezes.
Para ensaios de transdução do sinal in vitro, mioblastos e miotubos foram recolhidos em pequenos tubos de 2 mL após 30 minutos de incubação com NT-3 (100 ng/mL) e submetidos a lise do mesmo modo mencionado acima.
Os lisados foram centrifugados a 13.000 rom durante 10 minutos a 4 ºC e os sobrenadantes foram cuidadosamente recolhidos.
À concentração de proteínas foi medida usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA (Thermo Fisher, 423252, Waltham, MA, EUA). Amostras de proteínas (10-40 ita) foram processadas em géis de poliacrilamida Bolt& Bis-Tris Plus 4-12% de 10 ou 15 poços pré-vazados (Thermo Fisher, f%NWO4120BOX) e transferidas para membranas de PDVF (GE Healthcare, 410600021, Pittsburgh, EUA). As membranas foram bloquea- das durante 2 horas à temperatura ambiente com albumina de soro bovino 5% (BSA, Bedford, MA, EUA) em tampão TBS com Tween-20 0,05% (TBS-T, Amresco, OH, EUA) e incubadas com o anticorpo primário apropriado em tampão TBS-T com BSA 5% durante a noite em sala fria a 4 ºC.
Os anticorpos primários usados neste estudo foram os seguintes: anti-fosfoproteína S6 Ser235/236 (H4858), anti-proteína S6 (82217), anti-Fosfo Akt Ser473 (4060), anti-Akt (49272), anti-fosfo 4E-BP1 thr37/46 (42855), anti-4E-BP1 (49644), anti-GAPDH (Santa cruz, Xsc365062). Após lavagem durante 5 minutos por 5 vezes em um agitador orbital com TBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários [anti-coelho conjugado a HRP (HHAFOOB8), anticcamundongo conjugado a HRP (HAFO0O07)] da R&D Systems, Minne- apolis, MN, EUA] em leite magro 5% em tampão TBS-T durante 1 hora.
As membranas foram lavadas novamente com TBS-T do mesmo modo de acima e então incubadas com reagente de detecção Western ECL Prime (Amersham, XRPN2232 NJ, EUA) du- rante 1-3 minutos seguido de exposição a filmes de raios X (Denville, fE3018, MA, EUA) usando múltiplos tempos de exposição. Bandas de proteínas no filme foram fo- tografadas usando uma câmera (Sony A600, Japão) e as intensidades das bandas foram quantificadas usando software Quantity-One, BioRad, v.4.6.9. O teor relativo de proteínas analisadas em cada amostra foi determinado por normalização das intensi- dades de bandas relativamente ao teor de GAPDH na mesma amostra. As membra- nas foram coradas com corante Coomassie Brilliant Blue R 0,1% (Thermo Fisher, EUA), enxaguadas e fotografadas para confirmar uma carga igual de proteínas em cada via.
[0216]Estatística: Para comparações de tamanhos de fibras musculares entre grupos tratados e não tratados, análises estatísticas foram realizadas em software Graph pad Prism 6, usando análise da variância de uma via (Anova). O teste t de Student ou Anova de uma via foi realizado quando aplicável para outras análises es- tatísticas. O nível de significância foi fixado em P < 0,05. Os resultados foram apre- sentados como média + EPM em todas as experiências.
Resultados Remodelagem do tipo de fibras induzida por AAV1.NT-3 em músculo TrJ
[0217]Previamente nos músculos TrJ, uma troca de fibras de tipo rápido para lento foi observada como parte do fenótipo neuropático. Nicks et al., J Neuropathol Exp Neurol, 72(10):942-954 (2013). Neste estudo, coloração com SDH foi usada para avaliar a diferenciação metabólica do tipo de fibras no músculo gastrocnêmio de TrJ e TS de idades correspondentes por amostragem de zonas profundas, intermédias e superficiais do músculo como descrito. Às 16 semanas pós-injeção do gene, ocorreu um decréscimo notável nas fibras STO juntamente com aumento do tamanho das fi- bras, particularmente dos tipos FTO e FTG em comparação com o grupo não tratado
(PBS), que exibiu alterações neurogênicas, pequenas fibras angulares e agrupamen- tos de tipos (Figuras 1A e B). Estudos quantitativos mostraram que, nos músculos TrJ- PBS, o número por unidade de área bem como a percentagem de fibras STO foram significativamente mais elevados do que no músculo TS, em concordância com os estudos anteriores. Nos grupos de tratamento, AAV1.NT-3 à dose de 1 x10** vg, com ambos os promotores resultando em expressão baixa (tMCK) ou elevada (CMV) de NT-3 (Figura 4), exibiu troca do tipo de fibras de fibras STO para FTO/FTG. A densi- dade média ou percentagem de STO (derivado de n=3-5 camundongos em cada grupo) em ambos os grupos de tratamento não foi significativamente diferente da do músculo TS, indicando uma alteração no sentido da normalização da distribuição de tipos de fibras com NT-3 (Figura 1C). Além disso, músculo TS tratado com AAV1.NT- 3 não exibiu nenhuma alteração significativa no perfil da distribuição de tipos de fibras.
[0218]O tratamento com NT-3 em camundongos TrJ exibiu um efeito diferen- cial no aumento do tamanho de fibras musculares (Tabela 2). Quando NT-3 foi ex- pressa sob o controle do promotor tMCK, foi observado um aumento significativo do diâmetro somente nas fibras FTG. No segundo coorte de tratamento, onde foi obtida expressão elevada de NT-3 com o promotor do CMV, ocorreu um aumento significa- tivo do diâmetro em todos os tipos de fibras. É interessante notar que este efeito de NT-3 dependente da dose só foi observado no músculo TrJ neurogênico; não foi ob- servada nenhuma alteração significativa do diâmetro em nenhum dos tipos de fibras no músculo TS com terapia genética com NT-3 no mesmo instante, 16 semanas pós- injeção do gene.
[0219]A Tabela 2 mostra que o aumento do tamanho das fibras no músculo TrJ neurogênico após terapia genética com NT-3 é mais notável para fibras de con- tração rápida.
Diâmetro Médio das Fibras
TS (n=3) TS +NT3 | TrJ-PBS TrJ-tMCK TrJ-CMV n=4 n=3 n=4 n=5 Nú- Dià- Nú- | Diãâ- Nú- | Diã- Nú- | Diã- Nú- | Diã- mero | metro | mero | metro | mero | metro | mero | metro | mero | metro um um um um um STO | 315 314 [413 31,25 /605 [28,52 |524 29,41 [436 |/33,46 + +0,32 + +0,23 + 0,4* 0,35 0,29* FTO | 262 38,09 | 378 /37,35 |273 /34,32 [457 |/35,33 374 |39,15 +0,5 +0,39 + + 0,47 + 0,6* 0,65* FTG | 383 46,02 [525 |45,76 [194 /39,79 505 43,77 | 458 |44,35 + + 0,4 + + + 0,45 0,74"* 0,41* 0,52* To- 39,06 | 1316 | 38,79 | 1072 [32,04 | 1486 | 36,11 | 1268 | 39,07 das + + 0,28 + 0,3* + + as 0,32 0,27* 0,32* Fi- bras *, p < 0,001 AAV-NT-3 melhorou a sinalização de MTOR e marcadores metabólicos em Músculo TrJ
[0220]As descobertas histológicas mostradas acima no músculo TrJ em res- posta ao tratamento com AAV1.NT-3 desencadearam a pesquisa de se a ativação de MTORC1 desempenhou um papel no crescimento radial de fibras musculares indu- zido por NT-3. A atividade de MTORC1 foi avaliada pelos níveis de fosforilação de seus substratos a jusante, 4EBP-1 e S6P ribossômico em amostras de músculo de grupos. Em músculo TrJ tratado com AAV1.NT-3, os níveis de 4EBP-1 e S6P fosfori- ladas aumentaram significativamente em comparação com correspondentes não tra- tados obtidos de controles Trtl—PBS (Figura 2A). Em contraste, se verificou que o tratamento com NT-3 não afetou significativamente os níveis de fosforilação de 4EBP- 1 e S6P no músculo TS (Figura 2B).
[0221]Via 4E-BPs, MTORC1 regula a síntese de proteínas mitocondriais co-
dificadas pelo núcleo, controla a atividade e biogênese mitocondriais, consequente- mente coordena o consumo e produção de energia [17]. Em conformidade, o regula- dor principal da biogênese mitocondrial, PGC 1a foi sobrerregulado no músculo TrJ tratado com NT-3, indicando que NT-3 é capaz de reverter os níveis de expressão defeituosos de PGC 1a observados no músculo neurogênico (Figura 2C). Em concerto com a ausência de ativação de MTORC1, não foi observada nenhuma alteração nos níveis de expressão de PGC 1a no músculo TS com tratamento com NT-3 (Figura 2C). O aumento do tamanho das fibras no músculo TrJ com terapia genética com NT- 3 ocorreu maioritariamente em fibras FTO e FTG, que têm maior atividade glicolítica do que fibras lentas [18]. Em concordância, também se verificou que a expressão das enzimas de glicólise limitadoras da velocidade, HK1 e PK1, no músculo TrJ tratado foi sobrerregulada, sugerindo fluxo glicolítico aumentado. Estas alterações não foram sig- nificativas no músculo TS tratado com AAV.NT-3.
NT-3 ativa a via AkRVMTORC1 através de receptores TrkC em miotubos C2C12
[0222]Os estudos in vivo descritos aqui mostraram que o aumento do tamanho das fibras e remodelagem dos tipos de fibras induzidos por tratamento com AAV1.NT- 3 no músculo TrJ estão associados a ativação de MTORC1. No entanto, é necessário responder à questão de se esta alteração é apenas a consequência de reinervação, ou NT-3, independente da regeneração de nervos, pode alterar diretamente a síntese de proteínas musculares e metabolismo celular. Como passo seguinte, foram pesqui- sados os efeitos diretos de NT-3 na via de MTOR em um sistema in vitro, independen- temente da influência de nervos, por exposição de mioblastos C2C12 e miotubos a NT-3 recombinante. Os resultados indicaram que NT-3 pode induzir ativação da via de AKkVmMTOR em miotubos (Figura 3A) mas não em mioblastos. O tratamento de mio- tubos com 100 ng de NT-3 recombinante durante 30 minutos resultou em fosforilação significativamente mais elevada de Akt, 4EBP1 e S6P em comparação com o grupo de controle (Figura 3A). Em outro conjunto de experiências se verificou que NT-3 au- mentou significativamente a expressão do marcador da biogênese mitocondrial PGC 1a e do marcador de glicólise, PK1, em miotubos por incubação durante 48 horas (Figura 3B). Em conformidade, a análise de sobrenadantes neste instante revelou consumo de glicose e produção de lactato aumentados em miotubos tratados com NT-3 em comparação com o controle (Figura 3C). Sob as condições em que foram realizadas estas experiências, não foi observado nenhum efeito de NT-3 nos níveis de expressão de HK1.
[0223]A expressão de receptores de p75SNTR e TrkC, e miogenina, que é o marcador para a entrada de mioblastos na via de diferenciação em culturas de mioblastos e miotubos, foi analisada. NT-3 exerce o seu efeito biológico através do seu receptor TrkC preferencial ou ligação ao receptor de neurotrofina p7SNTR de baixa afinidade. Schecterson LC, Bothwell M, Neuron, 9(3):449-463 (1992). py SNTR é expresso em mioblastos C2C12 e subrregulado durante a diferenciação miogênica. Seidl et al., Journal of cellular physiology, 176(1):10-21 (1998). Foi mostrado que o fator neurotrófico NGF afeta a diferenciação miogênica e crescimento celular via P75NTR e se crê que a subrregulação de p75SNTR é essencial para a diferenciação miogênica. De modo similar a efeitos de NGF, se verificou que NT-3 também intensi- ficou a expressão de miogenina nos miotubos e, como esperado, tal foi associado a expressão notavelmente aumentada de p75NTR em mioblastos em comparação com os miotubos, ao passo que os níveis de expressão de TrkC não foram diferentes em ambos os grupos (Figura 3D). NT-3 não exerceu um efeito diferencial nos níveis de expressão destes receptores em mioblastos ou em miotubos.
Discussão
[0224]São apresentadas aqui evidências de que NT-3 pode ter um efeito di- reto no metabolismo de músculo neurogênico resultando em aumento do tamanho de fibras e remodelagem do tipo de fibras no sentido de normalização via ativação de mMTORC1. O aumento do tamanho de fibras foi muito notável para fibras de tipo |l, particularmente para o subtipo FTO. Além disso, é mostrado que NT-3 pode induzir ativação da via de AKUMTOR em miotubos mas não em mioblastos diretamente, dando um contributo importante para o seu efeito in vivo em músculo neurogênico. É interessante notar que terapia genética com NT-3 em músculo TS à mesma dose não afetou estas propriedades, apesar de o efeito de NT-3 no músculo TS desnervado usando o paradigma de terapia genética não ter sido estudado. Um efeito diferencial de NT-3 no subtipo de fibras musculares de tipo |l foi previamente demonstrado em músculo gastrocnêmio de rato 8 meses após o reparo de nervos com ou sem admi- nistração local de NT-3 no sítio do nervo esmagado e se verificou que a proporção e tamanho de fibras de tipo llb regressaram ao normal. Sterne et al., J Cell Biol, 139(3):709-715 (1997). No entanto, este efeito foi interpretado como regeneração axo- nal intensificada por NT-3 tendo um resultado benéfico no órgão motor-alvo bem como a possibilidade de NT-3 poder estar influenciando especificamente um subconjunto de motoneurônios que determinam o fenótipo de fibras musculares de tipo Ilb. Pode ser argumentado que as descobertas dos nossos estudos in vivo podem representar um efeito combinatorial de NT-3 em nervo e músculo. No entanto, os nossos dados in vitro salientam a evidência de que NT-3 tem efeito direto no metabolismo muscular via ativação de AKVMTORC1 e que é provável que este efeito direto seja importante no músculo neurogênico, conduzindo a aumento de tamanho preferencial em fibras FTG, isto é, de tipo Erb.
[0225JEM um camundongo transgênico condicional, expressar uma forma constitutivamente ativa de Akt conduziu a hipertrofia muscular devido ao crescimento de fibras musculares de tipo Ill. Izumiya et al., Cell metabolism, 7(2):159-172 (2008). Tal foi associado a sobrerregulação de transcritos envolvidos em glicólise, consumo de glicose e produção de lactato aumentados, que foram ligados a níveis mais baixos de insulina, níveis aumentados de glucagon no sangue e resistência a obesidade in- duzida por dieta rica em gorduras. Inversamente, a inativação de MTOR foi associada com a redução de enzimas glicolíticas, PK1 e HK1. Risson et al., J Cell Biol, 187(6):859-874 (2009). Nos nossos estudos, o tratamento com AAV.NT-3 no músculo TrJ aumentou o tamanho das fibras FTG e a expressão de enzimas glicolíticas PK-1 e HK-1. Adicionalmente, estudos in vitro revelaram que NT-3 aumentou a captação de glicose e formação de lactato em miotubos juntamente com sobrerregulação de PK-
1. Apesar de estes resultados sugerirem que NT-3 poderá participar no controle do metabolismo de todo o corpo por regulação de fibras rápidas/glicolíticas, são neces- sários estudos adicionais para caracterizar o seu papel em detalhe. Adicionalmente, o tratamento com AAV.NT-3 conseguiu reverter os níveis de expressão deficientes de PGC1a observados no músculo neurogênico TrJ juntamente com níveis intensificados de 4E-BP1 ativado. Foi previamente sugerido que, no músculo esquelético, MTOR regula a biogênese e metabolismo mitocondriais através de 4E-BP1/PGC10a. Tsai et al., J Clin Invest, 125(8):2952-2964 (2015). NT-3 também poderá desempenhar um papel na promoção da fosforilação oxidativa através de ativação de 4EBP1 e PGC la no músculo.
[0226]NT-3 está presente em níveis elevados primeiramente no sistema ner- voso central (SNC) durante o desenvolvimento fetal e está reduzido no cérebro adulto, sugerindo que desempenha um papel central durante o desenvolvimento neuronal ini- cial [28, 29]. NT-3 também é importante nos nervos periféricos, e tem efeitos positivos em múltiplos estágios do desenvolvimento neuromuscular. Em coculturas nervo-mús- culo de Xenopus, NT-3 derivado de músculo intensifica significativamente a matura- ção da transmissão sináptica na junção neuromuscular [30-33]. Além disso, NT-3 au- menta a sobrevivência de um elemento crucial do sistema neuromuscular, o SC [34]. NT-3 expresso em SCs promove a regeneração de nervos, e é um componente im-
portante do circuito de sobrevivência autócrina, assegurando sobrevivência e diferen- ciação de SCs em nervos adultos [35-39]. Nos estudos nos modelos de camundongo CMTI1A, vários efeitos biológicos importantes de NT-3 foram observados, (i) um au- mento do número de SCs, (ii) um aumento do número de fibras mielinizadas e (iii) uma normalização do citoesqueleto neurofilamentar axonal [5, 40]. Outro efeito de NT-3, de interesse particular aqui, é um aumento da espessura de mielina, que foi aperce- bido como a evidência morfológica de que NT-3 poderá influenciar a produção de pro- teína mielina.
[0227]Estudos anteriores mostraram evidências consideráveis de que MTORC1 desempenha um papel na regulação da mielinização no SNC. A sobre-ex- pressão transgênica de uma Akt cinase constitutivamente ativa é suficiente para in- tensificar o crescimento da membrana de mielina no SNC via sinalização de MTOR [41, 42] e a síntese de proteínas estimulada por IGF-1 em progenitores de oligoden- drócitos requer as vias de PISKJAKkt e MER/ERK [43]. A capacidade de NT-3 de dirigir a maquinaria da tradução para estimular síntese da proteína mielina foi primeiramente mostrada em culturas primárias de oligodendrócitos [44]. Se verificou que NT-3 so- brerregula a fosforilação de 4EBP1 nos oligodendrócitos através da via de PISK/MTOR. Usando a abordagem de inativação de genes, a ablação da função de MmMTOR especificamente em SCs influenciou a sua capacidade de mielinização normal
[45]. De fato, em mutantes, se verificou que a bainha de mielina era fina, o compri- mento internodal era pequeno e o crescimento radial de axônios estava enfraquecido. Conjuntamente, os alvos a jusante MTOR, S6 e 4E-BP1, estavam menos fosforilados
[45].
[0228]À luz destes estudos anteriores, é possível que o efeito de NT-3 no au- mento do diâmetro de fibras musculares tenha ocorrido pelo mesmo mecanismo, um efeito direto via ativação de MTORC1. É importante notar que terapia genética com
NT-3 em músculo TS à mesma dose usada no TrJ não induziu uma alteração signifi- cativa na distribuição dos tipos ou tamanhos de tipos de fibras. Estas observações em músculo TS sugerem que o efeito de NT-3 não é dirigido a células em funcionamento bem diferenciadas ou normais, ao invés disso, é funcional por metabolismo celular remodelado que pode resultar de um processo patológico. Uma evidência de suporte é o fato de NT-3 não alterar a recuperação funcional após lesão por esmagamento em animais TS, resultando em apenas ligeiramente mais axônios do que animais de con- trole ou tratados com NGF [46]. Os nossos estudos de toxicologia avaliando SCAAV1.tMCK.NT-3 estão de acordo com estas observações, mostrando nenhuma toxicidade ou anormalidades histopatológicas relacionadas com o tratamento de teci- dos de órgãos em camundongos C57BL/6 ou em TrJ, doseados a 1 X 10º? vg/Kkg, que é 10 vezes mais elevado do que a dose mais alta proposta para ensaios humanos para o tratamento de CMT1A.
[0229]Durante o desenvolvimento muscular, p7 SNTR é expresso transiente- mente em mioblastos que irão formar miotubos/fibras musculares ou se diferenciar em células satélites [23]. O padrão de expressão temporal do receptor indica que p7? SNTR medeia a sobrevivência de mioblastos antes da diferenciação e que a atividade deste receptor durante a miogênese é importante para desenvolver músculo [23]. De modo similar ao efeito do NGF [21], se verificou que NT-3 intensificou a expressão de mio- genina nos miotubos e, como esperado, tal esteve associado a uma expressão nota- velmente maior de p75SNTR em mioblastos, que foi significativamente subrregulada nos miotubos. A expressão de p75NTR e TrkC em amostras de músculo TrJ e TS foi examinada e foram encontrados níveis de expressão significativamente elevados de ambos no músculo TrJ neurogênico em comparação com TS e os níveis caíram em resposta a NT-3 (Figura 5). Apesar de ser interessante, esta observação não permite tirar qualquer conclusão quanto aos tipos de células que expressam estes receptores, ou se são expressos em todos ou apenas um subtipo de fibras musculares, em células satélites ou SCs. Os dados disponíveis sobre a expressão de NT-3 e outras neurotro- finas e seus receptores em doença muscular humana são limitados. No entanto, es- tudos recentes combinando até à data pesquisas histológicas de biopsias musculares com análises moleculares e celulares de células precursoras de músculo primário mostraram que p75NTR é expresso pela maior parte das células satélites in vivo e é um marcador para a regeneração de fibras em músculo inflamado e distrófico [47, 48]. As nossas descobertas em músculo neurogênico são de particular interesse, e são requeridos estudos mais abrangentes sobre mecanismos em diferentes processos de doença.
[0230]Sendo uma Ser/Thr cinase conservada, MTOR é um regulador central do crescimento celular por integração de sinais de nutrientes, fatores de crescimento, estado energético, e estresse ambiental. O papel essencial de MTOR em biologia e patobiologia celulares, particularmente em músculo com capacidades adaptativas me- tabólicas e morfológicas notáveis, tem agora grande interesse. MTOR se associa a raptor para formar MTORC1 e foi mostrado que a inativação específica em músculo de raptor conduz a atrofia muscular, capacidade oxidativa enfraquecida, e depósitos de glicogênio aumentados, resultando em características distróficas que foram muito notáveis em músculos oxidativos [49]. A perda de atividade de MTOR, por outro lado, exacerbou as características miopáticas em músculos oxidativos lentos e glicolíticos rápidos e exibe alterações metabólicas similares às observadas em músculos sem raptor, incluindo metabolismo oxidativo enfraquecido, regulação mitocondrial alterada e acúmulo de glicogênio [26]. Em estudos usando um paradigma de ciclos induzidos por cardiotoxina de necrose/regeneração muscular, os inventores mostraram recen- temente regeneração enfraquecida em um modelo de camundongo de distrofia mus- cular de cinturas dos membros tipo 2A, e mostraram que músculo nulo para calpaína- 3 está associado a perturbações na sinalização de MTORC1 e biogênese mitocondrial deficiente (em revisão). Consideradas em conjunto, as descobertas descritas aqui têm muitas implicações para o uso potencial de NT-3, não só para tratamento de neuro- patias com benefícios para nervos e músculo, mas também para afecções de emaci- ação muscular incluindo envelhecimento, câncer, caquéxia ou atrofia de fibras mus- culares de tipo Il, bem como distúrbios de músculos primários autoimunes genéticos ou adquiridos associados a fase de regeneração de crescimento radial enfraquecida [50-52]. Compreender o papel das perturbações na sinalização de mMTOR nestes dis- túrbios deve permitir o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas combina- toriais nas quais NT-3 pode desempenhar um papel importante.
Exemplo 2 Administração de NT-3 usando o vetor scEAAV1.tMCK.NFT3
[0231]A composição administrada é um vírus adenoassociado recombinante sem replicação scAAV1.tMCK.NTF3, que é mostrado na Figura 3. O vetor contém o gene NT-3 humano sob o controle de um promotor específico para músculos de tMCK. A biopotência in vivo será testada após a injeção intramuscular do vetor (1x10* vg) em músculos gastrocnêmios de camundongos C57B16 seguido de quantificação de NT-3 em circulação no soro por ELISA em 4 a 6 semanas após a injeção do gene.
[0232]Em primeiro lugar foi demonstrado que sSAAV1.CMV.NTF3 adminis- trado no músculo gastrocnêmio produziu níveis no sangue prolongados e terapêuticos de NT-3 suficientes para proporcionar melhoria funcional, eletrofisiológica e histopa- tológica em nervos TrJ. Foi então pesquisado se era possível produzir a dose reque- rida do vetor e alcançar o mesmo nível de expressão por empacotamento do cassete de expressão por scAAV1. Foi realizado um estudo de resposta à dose em camun- dongos C57BL/6 comparando dados de ELISA de NT-3 no soro após injeção intra- muscular de scAAV1.tMCK.NTF3 e scAAV1.CMV.NTF3 em 3 doses (3 x 10º vg, 1 x 10º vg e 3 x 10º vg). A administração do vetor sc.rAAV1.CMV.NTF3 em 1x10*' vg produziu níveis significativamente mais elevados de NT-3 do que o vetor de fita sim-
ples à mesma dose, consistente com maior potência usando vetores autocomplemen- tares. A uma dose meio-log menor (3 x 10ºº vg), ambos os vetores CMV e tMCK pro- duziram níveis no soro de NT-3 comparáveis aos obtidos de camundongos que rece- beram ss.AAV1.CMV.NTF3 à dose de 1x10* vg, que produziu uma resposta bioló- gica. Os níveis de NT-3 (média + EPM) de camundongos TrJ às 24 semanas pós- injeção. Há uma diferença significativa nos níveis de NT-3 entre todos os 7 grupos, valor p <0,0001. Foi observada uma diferença significativa em níveis de NT-3 para as doses mais elevada e intermédia de vetores para ambos os promotores e controle. No entanto, a análise não conseguiu encontrar uma diferença significativa para as doses menores para ambos os vetores. O teste de Kruskal-Wallis é usado para comparar NT-3 no soro entre todos os grupos (PBS, CMV 3E+09/1E+10/3E+10 e tMCK 3E+09/1E+10/3E+10). O teste U de Mann-Whitney é usado para comparar NT-3 entre cada grupo e grupo de PBS (controle) e a correção de Bonferroni é usada para ajus- tamento para múltiplas comparações. Ver Sahenk et al., Mol. Ther. 22(3): 511-521, 2014, que é incorporado a título de referência aqui na sua totalidade.
[0233]O diâmetro muscular aumenta às 40 semanas pós-tratamento: Os efei- tos da terapia genética com NT-3 foram avaliados em camundongos TrJ pelo tamanho das fibras musculares às 40 semanas pós-injeção em um subconjunto de animais in- jetados com ssAAV1.CMV.NTF3 (1 x 10º! vg) em comparação com PBS. Alterações neurogênicas caracterizadas por fibras angulares atróficas e atrofia de grupo foram evidentes nos músculos de camundongos não tratados, ao passo que evidências de reinervação como agrupamentos de tipos de fibras e um aumento global do tamanho das fibras foram reconhecíveis como efeito do tratamento. Histogramas do tamanho de fibras musculares gerados a partir de músculos do compartimento anterior e pos- terior contralateral do membro inferior esquerdo (tibial anterior e gastrocnêmio) exibi- ram um aumento do diâmetro das fibras.
[0234]Estudos adicionais no nosso laboratório mostraram que NT-3 estimula a via de AKVMTOR em células SCs originando mielinização e crescimento radial de axônios no nervo melhorados e NT-3 também tem um efeito estimulador direto em miotubos através de receptores Trk-C, indicando o seu papel no aumento do diâmetro das fibras em músculos de camundongos TrJ. A Figura 3A mostra que NT-3 aumentou a fosforilação de alvos de Akt (P-Akt) e MTOR, 4EBP-1 (P-4EBP1) e PS6K (P-S6K) em culturas de SCs e miotubos. Estes estudos proporcionam evidências que justificam a nossa escolha de músculos anterior e posterior do membro inferior para a adminis- tração do vetor neste ensaio clínico.
Estudos com (sc)AAV1 Autocomplementar e o Uso de um Promotor de Crea- tina Cinase Truncado (tMCK) Específico para Músculos
[0235]O scAAV permite uma dosagem menor que acumula com segurança aumentada e níveis de dosagem que irão cumprir padrões de produção. O uso do promotor tMCK é um objetivo valorizado, mais uma vez oferecendo maior segurança ao evitar efeitos fora do alvo. No conjunto seguinte de experiências, a eficácia de SCAAV1.NTF3 sob o controle do promotor do CMV foi comparada com a do promotor tMCK específico para músculos ambos administrados a três doses, dentro de um in- tervalo de meio-log (3 x 10º vg, 1 x 107º vg e 3 x 107º vg). A eficácia da transferência genética com AAV1.NTF3 em nervos periféricos de camundongos TrJ foi avaliada por estudos eletrofisiológicos (Tabela 3) e morfológicos às 24 semanas pós-transferência do gene. A evidência de expressão transgênica foi avaliada medindo-se os níveis no soro de NT-3 usando ELISA.
[0236] Tabela 3. CMAP e Velocidade de Condução no Nervo Ciático de TrJ
I Tratamento ] Latência | Duração | CMAP Área | Velocidade | [de Condução Grupo (número) (ms) (ms) (mV) (mVms) (m/s) PBS | 29 | 2,36+0,08 | 7,00 + 0,42 | 0,42+0,03* | 0,70+0,09 | 8,24 + 0,43 AAVI.NTF3.CMV- | | HD | 23 | 2.430,10 | 6,58+ 0450 | 0,57 + 0,04* | 0,84 + 0,09 | 10.30 + 0.65 AAVI.NTF3MCK- | 0,54 + HD | 27 | 2,52 +0,07 | 5,64 + 0,49 | 0,03** 0,64 + 0,04 | 8,90 + 0,56 AAVI.NTF3.CMV- | ID 21 /2,08+0,09 | 5,20+0,38 | 0,460.04 | 0,61 0,07 | 9.000,63 AAVI.NTF3UMCK- | | | | | | ID 26 /2,20+0,08 | 5,85+0,42 | 0,450,03 | 0,61 40,06 | 9,01 + 0,40 | AAVINTFSCMV- || | e e ;IAÃÁAÃM I A LD 22 | 2,2340,10 | 6,38+ 0,53 | 048+0,04 | 0,68+0,07 | 8,95 0,74 | AAVINTESAMCK- | 23 [2182006 | 7,2920,60 | 0432003 [0802008 | SAVE0,59 E I I —L *p=0,0017; **p=0,0051; Valores são Média & EPM; HD=Dose Elevada; ID=Dose Intermédia; | LLD=Dese Baixa UU — e ]
[0237]O examinador durante estudos de eletrodiagnóstico foi tornado cego para os grupos de tratamento. Não há nenhuma diferença estatística entre AAV1.NTF3.CMV (dose elevada, HD) e AAV1.NTF3.tMCK (dose elevada, HD) em CMAP e foi preferencial usar o promotor tMCK específico para músculos. Tal é adici- onalmente suportado pelos níveis de NT-3 no Ensaio ELISA onde foi observada uma diferença significativa em níveis de NT-3 para as doses mais elevadas e intermédias de vetores para ambos os promotores e controle.
[0238]A revelação completa de todas as patentes, pedidos de patentes, e pu- blicações, e material eletronicamente disponível citado aqui é incorporada a título de referência. A descrição detalhada anterior e exemplos foram proporcionados apenas por motivos de clareza do entendimento. Nenhumas limitações desnecessárias devem ser entendidas daqueles. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, pois variações óbvias para o perito na técnica serão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.
Exemplo 3
Construção de Construto de AAV Expressando NT-3
[0239]O planejamento de vetores virais de AAV autocomplementares com se- rótipo 1 contendo cDNA de NT-3 sob o controle do promotor tMCK ou CMV foi descrito previamente em Sahenk et a/., Mol Ther, 22(3):511-521 (2014), que é incorporado a título de referência aqui na sua totalidade. Vírus separados em alíquotas foram man- tidos a -80 ºC até serem usados. Amostras de sangue foram recolhidas de camun- dongos tratados e não tratados por sangria ocular sob anestesia às 6 e 16 semanas pós-injeção e soro foi avaliado quanto a níveis de NT-3 usando um ELISA de captura. O construto é referido aqui como SscAAV1.tMCK.NTF3.
[0240]Uma sequência promotora/intensificadora de tMCK foi usada para con- duzir a expressão genética específica para músculos e é composta pelo promotor de creatina cinase muscular com um elemento intensificador adicionado (enh358MCK, 584 pb) fundido àquele. Um tandem triplo do intensificador de MCK (206 pb) foi ligado ao promotor basal de 87 pb no promotor/intensificador de tMCK.
[0241]O produto farmacológico do ScAAV1.tIMCK.NTF3 foi produzido por transfecção de 3 DNAs plasmídicos de células humanas HEK293 do Master Cell Bank com: (i) o plasmídeo vetorial pPAAV.tMCK.NTF3 (ver Figura 7), (ii) um plasmídeo auxi- liador de AAV1 denominado R88/C1 contendo os genes rep2 e Cap1 de tipo selvagem de AAV e (iii) o plasmídeo de adenovírus auxiliador.
[0242]Uma representação esquemática do plasmídeo com características mo- leculares e quadros de leitura abertos é mostrada em 7. O genoma do vetor de AAV derivado do plasmídeo pAAV.tMCK.NTF3 é um genoma de DNA autocomplementar contendo o cassete de expressão de cDNA de NTF3 humana flanqueado por sequên- cias de repetição terminal invertida (ITR) do AAV2. É esta sequência que é encapsu- lada em vírions de AAV1. O plasmídeo pAAV.tMCK.NTF3 foi construído inserindo o cassete de expressão de tMCK que conduz uma sequência do gene NTF3 no vetor de clonagem psub201 de AAV. O gene NTF3 humano é expresso a partir do promotor de MCK em tandem triplo de camundongo que é uma modificação do promotor de CKG6 previamente descrito e contém uma sequência de caixa E tripla. Um sinal de poliadenilação do SV40 é usado para terminação eficiente da transcrição. O cassete também contém um íntron quimérico para expressão genética aumentada e é com- posto pelo sítio doador 5' do primeiro íntron do gene da B-globina humana, e o ponto de ramificação e sítio aceitador de encadeamento 3' do íntron que está entre o líder e o corpo de uma região variável de cadeia pesada de gene de imunoglobulina. O cas- sete de expressão de NTF3 tem uma Kozak de consenso imediatamente em frente do início de ATG e sinal poliA do SV40 de 200 bp para terminação de mRNA eficiente. O cDNA de NTF3 é incluído na sua totalidade (NCBI Sequência de Referência: NM 001102654). As únicas sequências virais incluídas neste vetor são as repetições terminais invertidas de AAV2, que são requeridas para replicação e empacotamento de DNA viral. As ITRs de AAV são sequências que são quase idênticas em ambas as extremidades, mas em orientação oposta. A ITR da "esquerda" (mutada) tem o sítio de resolução terminal deletado para permitir a formação em grampo do genoma. À identidade de todos os elementos plasmídicos do DNA é confirmada por sequencia- mento de plasmídeo de DNA no estoque de fonte do plasmídeo.
[0243]Na Tabela 4 são mostradas as localizações de pares de bases de ca- racterísticas moleculares relevantes dentro do plasmídeo de DNA do vetor de AAV da SEQ ID NO: 11.
Tabela 4. Características Moleculares do plasmídeo sc pAAV.tMCK.NTF3
TIPO INÍCIO NOME DESCRIÇÃO REGIÃO |7 112 5SUITR repetição terminal invertida de AAV2 com sítio de resolução terminal dele- tado REGIÃO | 147 860 promotor /in- | Promotor/intensificador de creatina tensificador cinase muscular de camundongo tMCK REGIÃO | 892 1024 |Intron Quimé- | Sítio doador 5' de B-globina humana rico e o ponto de ramificação e sítio acei- tador de encadeamento 3' da região variável de HC de IgG.
- humano AAV?2 de tipo selvagem Exemplo 4 Estudo Intramuscular de Fase |
[0244]Para o estudo de segurança intramuscular (IM) de fase | inicial, a ex- pressão sustentada do transgene NT-3 é a medida de desfecho proposta nesta pri- meira fase que é importante por vários motivos. A avaliação verdadeira da toxicidade depende da demonstração da expressão do gene. Se músculo não for transduzido, os testes de toxicidade (efeitos adversos) serão mais difíceis de interpretar (falha da transdução versus perda da expressão do gene). O estudo oferece a possibilidade de se estabelecer métodos para reconhecer inequivocamente a expressão do transgene e diferenciá-la de expressão do gene endógeno.
[0245]Este ensaio clínico é um estudo com doses crescentes de injeção em uma única vez, aberto, no qual sceAAV1.tMCK.NTF3 é administrado por injeção intra- muscular em músculos gastrocnêmio e tibial anterior em ambas as pernas em sujeitos CMT1A com duplicação do gene PMP22. Nove pacientes adultos com CMT1A, 18 anos de idade e mais velhos são inscritos em um de dois coortes neste ensaio. Os primeiros três sujeitos são inscritos a uma dose baixa minimamente eficaz (2,0 X 10!? vg/kg) distribuída de modo bilateral entre ambos os membros no Coorte 1. Seis sujei- tos adicionais são inscritos com um escalamento de dose de 3 vezes (6,0 X 10º? vg/Kkg) no Coorte 2. A monitoração pós-transferência do gene inclui visitas de seguimento nos dias 7, 14, 30, 60, 90, 120, e 3 intervalos de 3 meses durante o restante do ensaio se prolongando durante 2 anos. A segurança é um ponto final principal para este en- saio clínico de transferência genética. Os critérios de terminação são baseados no desenvolvimento de toxicidade inaceitável definida como a ocorrência de qualquer to- xicidade ocular ou sistêmica de Grau || não se resolvendo passadas duas semanas ou quaisquer toxicidades de Grau Ill ou maior. O ponto final secundário é eficácia definida como a interrupção do declínio de capacidades medidas pela Escala Pediá- trica CMT (CMTPedS) aos 2 anos pós-transferência genética. A CMTPedS é uma es- cala de 11 itens compreendida pelo Teste de Destreza Funcional, Teste de Pinos em Nove Buracos (9HPT), preensão manual, flexão plantar do pé, e força de dorsiflexão do pé usando miometria portátil, sensação de picada de alfinete e vibração, o Teste de Bruininks Oseretsky - avaliação do Equilíbrio, avaliação do porte, salto em compri- mento, e teste de caminhada de seis minutos (SMWT). Medidas exploratórias de des- fecho incluirão teste cronometrado de 100 metros (100M), amplitude de CMAP pero- neal e ulhar e velocidades de condução sensoriais e motoras, um teste sensorial re- visto para aumentar a sensibilidade à picada de alfinete, teste de toque e avaliações da vibração, escalas análogas visuais para dor e fadiga, Questionário de Saúde em Forma Curta (SF-36) como medida da Qualidade de Vida, e níveis em circulação de NT-3.
[0246]Os pacientes inscritos no ensaio incluem qualquer contexto racial, ét- nico ou de gênero. Os critérios para esta doença foram definidos e seguirão as dire- trizes previamente estabelecidas por Shy et al. (Neurology 64: 1209-1214, 2001 e Neurology 70:378-383, 2008).
[0247]Os Critérios de Inclusão para o estudo são os seguintes: «Sujeitos adultos (>18 anos) diagnosticados com CMTIA eDevem exibir uma duplicação de 1,5 Mb em 17p11.2 inclusive do gene da proteína mielina periférica 22 (PMP22) elndivíduos do sexo masculino e feminino de qualquer grupo étnico ou racial Devem exibir fraqueza do músculo de dorsiflexão do tornozelo (devem ter ROM completo contra a gravidade mas não conseguem manter dorsiflexão completa contra a gravidade ou capazes de suportar saltos altos durante 3 segundos ou mais (critérios Northstar)] «Velocidades anormais de condução nervosa «Capacidade de cooperar para avaliação clínica e repetir estudos de condu- ção nervosa «Vontade de sujeitos sexualmente ativos para praticar um método fiável de contraceção durante o estudo
[0248]Os Critérios de Exclusão para o estudo são os seguintes: elnfecção viral ativa com base em observações clínicas ou evidência soroló- gica de infecção com HIV, ou Hepatite A, B ou C eTerapia imunossupressora decorrente ou terapia imunossupressora em um período de 6 meses do início do ensaio (por exemplo, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, ciclofosfamida, imunoglobulina intravenosa) eLeucopênia ou leucocitose persistente (Leucócitos < 3,5 K/uL ou 2 20,0 K/uL) ou uma contagem absoluta de neutrófilos < 1,5 K/uL eSujeitos com títulos de anticorpos de ligação a AAV1 > 1:50 determinados por imunoensaio ELISA sEnfermidade concomitante ou requisito de tratamento crônico com fármacos que, na opinião do PI, cria riscos desnecessários para transferência genética «Contraturas ou cirurgias do tornozelo que previnem um teste apropriado da força muscular «Gravidez, aleitamento, ou planos para engravidar «Outras causas de neuropatia «Cirurgia em membros nos últimos seis meses
Tabela 5 Planejamento do Estudo *Peso dorkconc NVolume/paci- Vo- inieções Coorte Dose (vga/kg)Paciente v /mL) ente com 70lume/perna h duo (9) kg 9 kg (mL mL Pp
1. Bilateral em dose2x102 70 1,5xX101? 9,33 4,67 5 baixa (n=3)
12. Bilateral em — doseis, 1912 7o 1,5x10? [28,00 14 14 elevada n=6 *A Tabela 5 proporciona um esboço do plano de dosagem com base no peso do corpo de um paciente de 70 Kg como exemplo. Os volumes de dosagem são ba- seados na concentração do produto-alvo de aproximadamente 1,5x10? vg/mL.
Medidas de Referência Antes da Injeção (dia -30 até dia -1)
[0249]Depois de se obter o consentimento informado escrito e de completar os procedimentos de registro hospitalar, os seguintes procedimentos e medições mé- dicos de referência serão realizados.
eHistórico médico elngestão de medicações concomitantes «Exame físico eRaios X ao peito eEcocardiograma «ECG «Análises laboratoriais sanguíneas de hematologia (CBC) «Parâmetros de coagulação: Plaquetas, PT/INR, PTT «Análises laboratoriais sanguíneas de Química Clínica: Bilirrubina, Nitrogênio de Ureia no Sangue (BUN), GGT, eFosfatase alcalina, Alfa-fetoproteína (AFP), Creatinina, Amilase, Eletroforese de Proteínas no Soro, Eletrólitos, Glicose, Creatina Cinase eUrinálise eRastreio viral (hepatite e HIV) «Teste de gravidez (apenas indivíduos do sexo feminino com idade para en- gravidar) elmunologia do Sangue: Anticorpos Neutralizadores (AAV1) e ELISpots *(NT-3 e AAV1) «Soro para ELISA (NT-3 em circulação) Medidas de Eficácia Medidas Exploratórias «Fotografias do sítio de injeção Pré-lnjeção de Dose de Prednisolona
[0250]Antes da transferência genética, cada paciente receberá uma dose de prednisona oral de 1 mg/kg/dia com um máximo de 60 mg/dia, seguido de uma se- gunda dose no dia da transferência genética. O sujeito receberá prednisona 24 e 48 horas pós-transferência genética durante um total de 4 doses.
Protocolo para a Transferência Genética
[0251]AAV1 autocomplementar contendo um gene NTF3 humano sob o con- trole do promotor tMCK (scAAV1.tMCK.NTF3) é administrado em uma injeção intra- muscular bilateral de uma vez nas cabeças medial e lateral dos músculos gastrocnê- mio e tibial anterior (TA).
Procedimento de Transferência Genética
[0252]O procedimento de transferência genética é o seguinte: «O procedimento por infusão de transferência genética é realizado sob condi- ções esterilizadas.
«O vetor é administrado sem diluente para um total de aproximadamente 10 mL até 28 mL por paciente (5 até 14 mL por membro, que são divididos em 3 múscu- los).
«O vetor é administrado na sala do procedimento em seringas pré-etiquetadas seladas em sacos duplamente à prova de fugas, transportadas em um refrigerador etiquetado designado.
Um total de 5 mL até 14 mL de vetor são administrados a cada uma das cabeças medial e lateral do músculo gastrocnêmio e TA em um total de 3 até 6 inje- ções por músculo (cada volume de injeção será 0,5 até 1,0 mL). Ver diagrama esque- múático de sítios de injeção na Figura 8A e 8B.
+As injeções são administradas pelo menos 0,25 cm abaixo da fáscia com injeções seguindo um eixo longitudinal do músculo guiado por ultrassons.
«Cada injeção está afastada aproximadamente 1,5 cm.
Monitoração Interna dos Pacientes
[0253] Após injeção da transferência genética, os sujeitos regressam a um leito interno do paciente designado para monitorar de perto os sinais vitais e função respi- ratória. Os sinais vitais são monitorados aproximadamente a cada hora durante as primeiras 4 horas, então a cada 4 horas até terem alta. A segurança é avaliada por exame físico e avaliação laboratorial. Os sujeitos recebem a terceira dose de predni- sona oral (Dia 1), e a quarta dose e dose final de prednisona são administradas no dia seguinte (48 horas pós-injeção, Dia 2). Os pacientes terão alta aproximadamente 48 horas após a transferência genética (se não forem observados efeitos secundários).
Monitoração Externa dos Pacientes
[0254]Após terem alta, os pacientes regressam para visitas de seguimento nos dias 7, 14, 30, 60, 90, 120, e intervalos de 3 meses durante o resto do ensaio que se prolonga durante 2 anos após a transferência genética. Amostras de sangue obti- das de todas as visitas são avaliadas quanto à expressão da proteína NT-3 como demonstrado com anticorpos anti-NT-3 em um ELISA de soro. Adicionalmente, os pa- cientes serão testados nas visitas 7, 9, 11, 13 e 14 quanto a medidas de eficácia e exploratórias. O ELISA de soro é uma medida direta da expressão genética funcional com medidas de desfecho secundário demonstrando a eficácia do transgene em cir- culação.
Ponto Final Primário:
[0255]A segurança é um ponto final principal para este ensaio clínico de trans- ferência genética. Esta é avaliada com base no desenvolvimento de toxicidade inacei- tável definida como a ocorrência de toxicidades relacionadas com o tratamento não previstas de Grau |ll ou mais elevado.
Medidas de Segurança
[0256]A segurança será medida em cada estudo com uma coleção de altura e peso, sinais vitais, exame físico e revisão de sistemas, e uma bateria de trabalho laboratorial do sangue. O trabalho laboratorial incluirá CBC, plaquetas, nitrogênio de ureia no sangue (BUN), GGT, bilirrubina, fosfatase alcalina, alfa-fetoproteína, creati- nina, amilase, eletroforese de proteínas no soro, eletrólitos, glicose, PT/INR e PTT, CK, urinálise. A imunologia consiste em anticorpos neutralizadores para AAV1 e ELISA para a detecção de anticorpos para NT-3, ELISpots para detectar respostas de células T a AAV1 e NT-3. Todos os eventos adversos serão registrados e avaliados quanto à relação com a transferência genética.
Ponto Final Secundário
[0257]O ponto final secundário do ensaio clínico de transferência genética é eficácia definida como a interrupção do declínio das capacidades medidas pela Escala Pediátrica CMT (CMTPedS) aos 2 anos pós-transferência genética.
[0258]O teste da força muscular dos membros superiores e inferiores é con- duzido usando um dinamômetro portátil para movimentos distais na extremidade su- perior (preensão manual) e pernas (dorsiflexão do pé). A extremidade para o teste é imobilizada para o teste, o que melhora significativamente a fiabilidade de medidas de contração isométrica do pé (29). A função dos membros superiores é medida com o teste de pinos em 9 buracos (9HPT). A função dos membros inferiores é medida com o teste de corrida/caminhada de 10 metros cronometrada (T10MW).
Medidas de Desfecho Exploratório
[0259]Desfechos exploratórios incluirão teste cronometrado de 100 metros (100M), amplitude de CMAP peroneal e ulnar e velocidades de condução sensoriais e motoras, um teste sensorial revisto para aumentar a sensibilidade à picada de alfi- nete, teste de toque e avaliações da vibração, escalas análogas visuais para dor e fadiga, Questionário de Saúde em Forma Curta (SF-36) como medida da Qualidade de Vida e níveis em circulação de NT-3.
[0260]O teste eletrofisiológico inclui medição da amplitude de nervos sensori- ais ulnares e amplitude do potencial de ação muscular composto (CMAP) do nervo ulnar (registradas a partir do músculo abdutor do dedo mínimo) e do nervo peroneal (registradas a partir do músculo tibial anterior) e velocidades de condução sensoriais e motoras. Foi mostrado que a amplitude de CMAP peroneal do tibial anterior é uma medida de desfecho útil para ensaios clínicos em pacientes com CMT1A (30); e para sintomas motores de membros superiores, a amplitude de CMAP ulnar demonstrou ser o parâmetro mais informativo (31). As temperaturas de pés e mãos serão mantidas a 32-34 ºC durante estes procedimentos de teste. Escalas análogas visuais serão usadas para a medição da dor e fadiga (32). O Questionário de Saúde em Forma Curta (SF-36) é usado como documento da qualidade de vida para monitorar e com- parar o fardo da doença pré- e pós-tratamento.
[0261]Aos pacientes é oferecido um incentivo financeiro para serem submeti- dos a biopsias opcionais do nervo sural fascicular. Se elegidas, as biopsias são obti- das antes do início do tratamento (de sural esquerdo) e no final do estudo (de sural direito). As biopsias são realizadas em uma visita externa do paciente sob anestesia local. Os tecidos serão processados e examinados para avaliar os efeitos de NT-3 na regeneração de fibras mielinizadas. Para corresponder ao nível do material pré- e pós- tratamento relativamente ao comprimento de todo o nervo, a extremidade próxima de uma incisão (2,5 cm de comprimento) é situada precisamente 10 cm acima do tendão de Aquiles (8).
Análise Estatística
[0262]A segurança é um ponto final principal para este ensaio clínico de trans- ferência genética. Esta será avaliada com base no desenvolvimento de toxicidade ina- ceitável definida como a ocorrência de toxicidades relacionadas com o tratamento não previstas de Grau Ill ou mais elevado. A segurança será medida em cada estudo com uma coleção de altura e peso, sinais vitais, exame físico e revisão de sistemas, e uma bateria de trabalho laboratorial do sangue. O trabalho laboratorial incluirá CBC, pla- quetas, nitrogênio de ureia no sangue (BUN), GGT, bilirrubina, fosfatase alcalina, alfa- fetoproteína, creatinina, amilase, eletroforese de proteínas no soro, eletrólitos, B12, glicose, PT/INR e PTT, CK, urinálise. A imunologia consistirá em anticorpos neutrali- zadores para AAV1 e ELISA para a detecção de anticorpos para NT-3, ELISpots para detectar respostas de células T a AAV1 e NT-3. Todos os eventos adversos serão registrados e avaliados quanto à relação com a transferência genética.
[0263]A principal medida de desfecho secundário é definida como ausência de declínio na gravidade da doença na pontuação da Escala Pediátrica de Doença de CMT (CMTPedS). O sistema de pontuação computorizado de CMTPedS usa pontua- ções z de uma amostra normativa para determinar a pontuação individual com base no número de desvios padrão pelo qual o desempenho de pacientes difere da popu- lação saudável. A pontuação de CMTPedS ocorre a uma idade fixa de 20 anos para todos os pacientes ao longo do estudo, o que é necessário por dois motivos. O pri- meiro motivo é que a escala CMTPedS original se baseia em valores normativos para itens individuais da escala no cálculo da pontuação final, mas não existem valores normativos para indivíduos com idade superior a 2030. O segundo motivo é que, ape- sar de uma pontuação comparando a criança com pares saudáveis ser essencial para crianças que ainda estão se desenvolvendo, esta tem a limitação de impor um declínio funcional em outro aniversário da criança. Mesmo que a pontuação bruta da criança no teste não se altere, os critérios de pontuação são planejados para se tornarem mais restritos à medida que envelhecem, refletindo a melhoria esperada das capaci- dades motoras tipicamente observada em crianças saudáveis. No entanto, em um ensaio clínico de uma doença degenerativa, uma paragem da progressão real consti- tuirá um ensaio com êxito. Manter a idade dos dados de controle de referência con- sistente ao longo do estudo permite usar o sistema de pontuação validado construído na CMTPedS. Também permite observar uma alteração real da avaliação de modo a ser detectada uma paragem na progressão.
[0264]A proporção de pacientes cujas pontuações CMTPedS melhoraram ou permaneceram iguais ao longo de um período de dois anos usando testes binomiais é estimada com intervalos de confiança de 95%. Como objetivo exploratório, a pro- porção de pacientes com ausência de declínio em cada um dos 11 itens da CMTPedS é estimada separadamente, bem como no teste cronometrado de 100 metros (100M), amplitudes de CMAP, a escala análoga visual da intensidade da dor (VAS), pontua- ções no Questionário de Saúde em Forma Curta (SF-36), e níveis em circulação de NT-3. Adicionalmente, os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman são usados em cada momento da medição para avaliar a associação entre níveis de cir- culação de NT-3 e cada medida do desfecho. Uma vez que este estudo está nos es- tágios preliminares, os valores p para múltiplas comparações não serão ajustados. No entanto, é realizada uma análise da sensibilidade e esta indica quais as associações que são estatisticamente significativas após o ajustamento, com base no procedi- mento de etapa abaixo de Bonferroni-Holm.
[0265]Com base nos dados de histórico natural longitudinal (31, 32), uma me- dida secundária do desfecho com êxito é definida como uma travagem da velocidade de deterioração em uma pontuação composta padronizada de preensão manual e força de dorsiflexão do tornozelo, tempo até completar o teste de pinos em 9 buracos e tempo de caminhada/corrida ao longo de 10 metros.
Exemplo 5 Estudo de Toxicologia
[0266]O propósito deste estudo foi avaliar a segurança de um vetor viral ade- noassociado autocomplementar (scAAV) expressando o cDNA do fator de neurotro- fina 3 (NTF3) humano sob o controle de um promotor tMCK específico para músculos (SCAAV1.tMCK.NTF3) em camundongos de tipo selvagem (C57BL/6) e Trembler (Tr") após uma única injeção intramuscular no músculo gastrocnêmio. Os resultados deste relatório demonstram que uma única injeção intramuscular em camundongos de tipo selvagem e Trembler é segura e bem tolerada até 48 semanas pós-injeção.
Animais de Teste
[0267] Camundongos C57BL/6 de tipo selvagem (controle negativo) e Tr" (ar- tigo de teste) foram injetados intramuscularmente com veículo (solução salina esteri- lizada 0,9%) ou 1 x 10º? vg/kg de scAAV1.tMCK.NTF3 em um volume total de 50 uL. Esta estirpe de camundongos portadores é disponibilizada pela Jackson Laboratories (estoque *000664) ou Charles River (estoque 027). Camundongos Tr” são disponi- bilizados pela Jackson Laboratories (estoque f002504).
[0268] Camundongos Trembler tinham 8-10 semanas de idade no momento da injeção. Devido à disponibilidade de animais e questões de criação conhecidas da estirpe animal, um subconjunto de animais foi tratado às 12 semanas de idade.
[0269]Um total de 88 animais (44 Machos / 44 Fêmeas) foi incluído no estudo. 44 animais (22 C57BL/6, 22 TrJ) foram tratados com controle de solução salina e 44 animais (22 C57BL/6, 22 TrJ) foram tratados com o artigo de teste SCAAV1.tMCK.NTF3. Destes números, metade dos animais de cada coorte foram eu- tanasiados às 24 semanas pós-tratamento e os restantes animais foram eutanasiados às 48 semanas pós-tratamento. Os animais foram exclusivamente identificados por marcas nas orelhas.
Planejamento do Estudo
[0270]Para avaliar a segurança do artigo de teste scEAAV1.tIMCK.NTF3, ca- mundongos C57BL/6 com 4-6 semanas de idade de tipo selvagem e Tr! com 8-12 semanas de idade foram injetados com veículo (solução salina esterilizada 0,9%) ou 1 x 10º? vg/kg de scAAV1.IMCK.NTF3 em um volume total de 50 ul via uma única injeção IM no músculo gastrocnêmio esquerdo. Os animais foram observados diaria- mente ao longo do estudo quanto ao estado geral de saúde e morbidez. As verifica- ções de mortalidade foram efetuadas duas vezes ao dia. A massa corporal foi medida a cada 2 semanas. Realização de testes funcionais da hipersensibilidade (teste de Placa Quente e Sobressalto Acústico) a cada 8 semanas. Os testes comportamentais (haste rotativa e suspensão em fio) foram realizados a cada 2 semanas.
[0271]A sensibilidade térmica foi testada começando duas semanas antes da injeção seguido do Dia O, e a cada 8 semanas usando o Teste da Placa Quente de Roedores. Para efetuar o teste, o animal foi colocado sobre a superfície da placa que havia sido mantida a uma temperatura de 55 ºC, e a locomoção foi restrita a uma área de 100 cm? usando-se uma parede de Plexiglas de 15 cm de altura rodeando a su- perfície da placa. Um cronômetro foi iniciado no momento em que o animal foi colo- cado sobre a superfície aquecida, e a latência até ao tempo de resposta foi registrada até 0,1 s via paragem do cronômetro. As seguintes atividades são consideradas uma resposta ao estímulo térmico: lamber a pata traseira ou movimento súbito/estremeci- mento, uma tentativa para escapar saltando também é uma resposta aceitável. O ca- mundongo foi imediatamente removido quando esta resposta foi observada.
[0272]A sensibilidade acústica foi testada duas semanas antes da injeção se- guido do Dia O (referência), no pico dos níveis de NT-3 no soro (8 até 12 semanas) e a cada 8 semanas a seguir, todos os animais foram testados quanto à hipersensibili- dade auditiva usando o Teste de Sobressalto Acústico (AST). A reatividade de sobres- salto foi medida usando-se uma única câmara de sobressalto (SR-Lab, San Diego
Instruments, San Diego, CA) como previamente descrito em Beigneux et a/l., Behavi- oral Brain Res. 171:295-302, 2006.
[0273]A câmara consistiu em um cilindro de Plexiglas não restritivo transpa- rente repousando sobre uma plataforma dentro de uma câmara ventilada. Um autofa- lante de alta frequência dentro da câmara produziu um ruído de fundo contínuo de 65 dB e os vários estímulos acústicos. Vibrações do cilindro de Plexiglas causadas pela resposta de sobressalto de todo o corpo do animal foram transduzidas em sinais aná- logos por uma unidade piezoelétrica presa à plataforma. Os sinais foram então digita- lizados e armazenados pelo computador. Foram recolhidas sessenta e cinco leituras em intervalos de 1 ms, começando no início dos estímulos, e a amplitude média (Vméa) foi usada para determinar a resposta de sobressalto acústico. Um nível de ruído de fundo de 65 dB foi apresentado durante um período de aclimatização de 5 min e con- tinuou ao longo da sessão do teste. Todas as sessões de teste de inibição pré-pulso (PPI) consistiram em ensaios de sobressalto (só pulso), ensaios de pré-pulso (pré- pulso + pulso), e ensaios sem estímulos (sem estímulo). O ensaio só de pulso consis- tiu em um pulso durante 40 ms a 120 dB de ruído de banda larga. PPI foi medida por ensaios de pré-pulso + pulso que consistiram em um pré-pulso de ruído durante 20 ms, retardamento de 100 ms, e então um pulso de sobressalto durante 40 ms a 120 dB. As intensidades do pré-pulso acústico foram 69, 73, e 81 dB. O ensaio sem estí- mulos consistiu apenas em ruído de fundo. A sessão de teste começou e terminou com cinco apresentações do ensaio só de pulso; entre estas, cada tipo de ensaio foi apresentado 10 vezes em ordem pseudoaleatória. Houve uma média de 15 s (inter- valo 12—30 s) entre ensaios.
[0274]Para a análise da haste rotativa, foi necessária pelo menos uma se- mana de treino para assegurar que todos os sujeitos tinham aprendido a tarefa na mesma extensão. No protocolo de rotação com aceleração, os animais foram coloca- dos sobre uma haste que acelera até 5 rpm e então aumenta a 5 rom/s7. Os animais foram submetidos a três ensaios por sessão, dos quais foi feita a média.
[0275]Para a análise de suspensão em fio, os animais foram colocados com as suas quatro patas sobre um fio metálico de 2 mm de diâmetro mantido horizontal- mente 35 cm acima de uma camada grossa de leito macio. A extensão de tempo até os camundongos caírem do fio foi registrada e, após cada queda, os camundongos receberam um período de recuperação de 1 minuto. Cada sessão de teste consistiu em três ensaios dos quais foi feita a média das pontuações.
[0276]Às 22 e 46 semanas pós-injeção (2 semanas antes da eutanásia), san- gue foi recolhido do seio retro-orbital para estudos de hematologia (Contagem de eri- trócitos, Hematócrito, Hemoglobina, Contagem de leucócitos, total e diferencial, He- moglobina Corpuscular Média, Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, Volume Corpuscular Médio, Volume Médio de Plaquetas, Contagem de Plaquetas, Contagem de Reticulócitos). As químicas clínicas foram analisadas para os seguintes parâmetros: Alanina aminotransferase, Fosfatase Alcalina, Aspartato aminotransfe- rase, Bilirrubina (Total e Direta), nitrogênio de Ureia no Sangue, Creatinina, Creatina Cinase, Glicose, Proteína Total.
[0277]Às 24 e 48 semanas pós-injeção, sangue foi recolhido por punção intra- cardíaca com o soro usado para estudos imunes. Amostras de soro foram recolhidas para titulação de anticorpos anti-AAV1 e anti-NT-3 para todos os animais em cada coorte (independentemente do tratamento ou gênero). Amostras de soro foram adici- onalmente usadas para ensaio ELISA de níveis em circulação de NT-3.
[0278]ÀAs 24 e 48 semanas pós-injeção, os seguintes tecidos de animais Tr! foram recolhidos para análise de histopatologia: gônada, cérebro, baço, rim, jejuno, cólon, pâncreas, coração, pulmão, estômago, fígado, gânglios linfáticos inguinais, me- dula espinhal, músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo), e grandes lesões (se exis- tentes). Os tecidos foram fixados em formalina tamponada neutra 10%, secionados e corados com Hematoxilina e eosina. A análise histológica foi realizada por SNBL USA.
[0279]ÀAs 24 e 48 semanas pós-injeção, tecido para histopatologia interna foi recolhido para 6 animais por coorte (3M, 3F), com a exceção do coorte de controle Tr" (n=5, 3M, 2F). Camundongos foram sacrificados e submetidos a perfusão transcardí- aca com paraformaldeído 4% em tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,4). A medula espinhal lombar, gânglios da raiz dorsal (DRGs) e a totalidade do segmento do nervo ciático (chanfradura ciática até fossa poplítea) foram dissecados. A metade próxima do seg- mento ciático no seu comprimento in situ e um DRG lombar foram transferidos para agente de fixação glutaraldeído, processados para embutimento em plástico e secio- namento com a espessura de 1 um. O remanescente do tecido do nervo ciático e DRGs lombares foram crioprotegidos em sacarose 30%, congelados em isopentano esfriado em nitrogênio líquido e cortados em seções de 12 um para imuno-histoquíi- mica para detecção de positividade de CGRP em neurônios e axônios de DRG (me- dula espinhal e cérebro de camundongos TrJ foram colocados em formalina tampo- nada neutra 10%). Tabela 6: Planejamento do Estudo Dos |Trata- | Pontos Finais do Coorte Es- e mento | Sacrifício Número tirpe Agente do Estudo (vg! Se- | Se- ka) man | man | Ex- 9) |piao Ja24 /a48 |ta n=jn = Dose Ccs57 1 10 10 68 Elevada | BL/6 | SCAAVIIMOKNTFS 091 ne | (sM/ | (SM ção IM | 5F) |5F) única n=j|n = Dose J 1x1 | no 10 10 7 Elevada | Tr SCAAVI.IMCK.NTF3 | 01 | mos. (SM/ | (sw culo 5F) |5F) , gastro- |IN =|n = 8 Controle A Estação Salina Este- | O enê- 1º 1º BL6 | iizada O 9%) mio de | (5M/ | (SM/ O» uma 5F) |5P) Veículo única nen o Controle | TP (Solução Salina Este- | O perna | 10 10 rilizada 0,9%) SM | SM/ ' 5F) |5E
TOTAL DE CAMUNDONGOS N=88
LLC LL aaa] Dosagem, Observação e Análise de Animais
[0280]Os animais indicados foram doseados uma vez no dia O com um volume de 50 uL via uma única injeção IM no músculo gastrocnêmio esquerdo. Para efetuar uma dosagem rigorosa, os animais foram anestesiados com inalação de isoflurano, durante um período mínimo de 15 minutos. As doses foram administradas por injeções diretas no gastrocnêmio esquerdo. É tido o cuidado de depositar rigorosamente a to- talidade da dose de vetor no músculo. Depois de efetuada a dosagem, os animais foram observados até ao estado ambulatório e regressaram à gaiola. As observações de cada animal são realizadas diariamente durante todo o estudo. A massa corporal é medida a cada 2 semanas. As verificações da mortalidade foram realizadas duas vezes ao dia.
[0281]À idade apropriada, os camundongos foram sobredoseados com mis- tura de Cetamina/Xilazina (200 mg/Kkg/20 mg/kg). Sangue foi recolhido via punção car- díaca. Os tecidos foram então recolhidos e enviados para análise.
[0282]Os pesos corporais, hematologia e químicas clínicas dos camundongos são representados graficamente para cada coorte por instante. Ensaios ELISA para anticorpos em circulação anti-AAV1, anticorpos em circulação anti-NT-3 e níveis em circulação de NT-3 foram realizados para todos os pontos finais. Testes funcionais de hipersensibilidade usando o aparelho de placa quente e sobressalto acústico de roe- dores foram realizados a cada 8 semanas para todos os animais. Testes comporta- mentais foram realizados a cada duas semanas para os testes de haste rotativa e suspensão em fio para todos os animais. Histopatologia formal em órgãos foi realizada para todos os animais. Histopatologia interna na medula espinhal lombar e DRGs foi realizada em 6 camundongos por coorte (3M, 3F), com a exceção do coorte Tr! que incluiu 5 animais (3M, 2F). A avaliação de histopatologia incluiu distribuição imunoci- toquímica de positividade de CGRP (em neurônios DRG e medula espinhal lombares)
e embutimento em plástico de nervos ciáticos e neurônios DRG para análise de alte- rações patológicas.
Resultados Morbidez e Mortalidade
[0283] Todos os camundongos sobreviveram ao procedimento de injeção e um período de observação inicial passou sem quaisquer sinais de aflição. Quatro animais Tr morreram devido a disfunção no sistema de distribuição de água. Não houve mor- tes relacionadas com o artigo de teste.
Pesos Corporais
[0284]Os pesos corporais de todos os camundongos em cada grupo foram medidos a cada duas semanas ao longo de todo o estudo. Todos os grupos de trata- mento continuaram a ganhar peso de um modo regular ao longo de todo o estudo.
[0285]Em animais C57BL/6 machos não houve diferenças significativas entre animais injetados com o artigo de teste e controles. Em animais fêmeas, os pesos foram ligeiramente maiores em animais de controle em comparação com animais in- jetados com o artigo de teste. Nos animais Tr! machos, o coorte tratado com solução salina ficou significativamente mais pesado do que o coorte tratado com NT-3. Para camundongos Tr! fêmeas não houve nenhuma diferença significativa nos pesos cor- porais.
Hematologia e Químicas Clínicas
[0286]Não ocorreram alterações relacionadas com o artigo de teste nos parâ- metros de hematologia nos momentos 22 e 46 ou na química do soro nos momentos 24 e 48 semanas.
Ensaios ELISA
[0287]Ensaios ELISA para anticorpos anti-AAV1, anticorpos anti-NT-3 e NT-3 em circulação foram realizados com amostras de soro recolhidas durante as necróp- sias às 24 e 48 semanas.
[0288]Para medir anticorpos anti-AAV1 em circulação, amostras de soro fo- ram recolhidas às 24 e 48 semanas pós-administração do vetor e títulos de anticorpos foram determinados por ligação em Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA), ver Tabela 7 abaixo. Os animais tratados com scAAV1.tMCK.NTF3 tinham anticorpos em circulação elevados para o capsídeo de AAV1. Os títulos de anticorpos foram similares em machos e fêmeas em ambos os momentos. Um título positivo >1:50) não foi detectado em animais de controle tratados com solução salina. Tabela 7. Títulos Médios de Anticorpos em Circulação no Soro para o capsídeo de AAV1 de camundongos tratados com ScAAV1.tMCK.NT-3 Tempo-Pós-Administração | Grupo de Tratamento do Vetor Grupo 1: Controle de Solução Salina (0 Lo Medanaa = [Intervalo = "úÚ| Po Macho [Fêmea | Macho Fêmea <1:50 [<1:50 | <1:50 Grupo 2: Vetor scCAAV1.tMCK.NT-3 (2,0X10! Intervalo Fêmea | Macho Fêmea : : 1:25600 - | 1:25600 - 1725600 | 1725600 | 1:25600 1:25600 . ' 1:3200 - | 1:12800 - 173200 | 1:12800 | 1:25600 1:25600
[0289]Para medir anticorpos anti-NT-3 em circulação, amostras de soro foram recolhidas às 24 e 48 semanas pós-administração do vetor e títulos de anticorpos para NT-3 foram determinados por ligação em Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA). Todos os camundongos tinham títulos de anticorpos <1:50 (considerado ne- gativo) às 24 e 48 semanas pós-administração do vetor. Ver a Tabela 8. Tabela 8. Títulos Médios de Anticorpos em Circulação no Soro para o peptídeo de NT-3 de camundongos tratados com scAAV1.tMCK.NT-3 Tempo-Pós-Administração do Vetor ivo e DOS) - - Grupo 1: Controle de Solução Salina (O Lo | Medaca ————Jinmtevãao =| L Macho Fêmea |Macho Fêmea | 24 semanas <1:50 |<1:50 <1:50
Grupo 2: Vetor sSscAAVI.IMCK.NT-3 2,0x10!
[0290]Os níveis de NT-3 em circulação foram determinados em amostras de soro de camundongos Tr recolhidas às 24 e 48 semanas pós-administração do vetor via ligação em ensaio ELISA padrão. A injeção intramuscular do vetor SCAAV1.tMCK.NTF3 resultou em expressão e secreção robustas de NT-3 em camun- dongos Tr! às 24 e 48 semanas pós-administração do vetor. A Tabela 9 mostra a média e desvios padrão de níveis de NT-3 no soro às 24 e 48 pós-injeção em Tr de grupos injetados com solução salina e vetor. O gênero não teve nenhum efeito nos níveis em circulação de NT-3.
Tabela 9. Níveis no Soro de NT-3 em Circulação (ng/mL) Grupo Dose (vg/Kkg) | Sexo Média | DP Média | DP Solução Salina o 0,000 | 0,000 | 0,019 [0,038 F 0,003 0,004 | 0,000 | 0,000 10,808 | 6,705 | 7,616 | 4,572 É 13 ' , , » SCAAV1.tMCK.NT-3 | 1,0x10 10,470 [3,729 [9,312 [4,809 Teste de Hipersensibilidade
[0291]O teste da sensibilidade térmica foi efetuado na referência (antes do tratamento com o artigo de teste ou solução salina de controle) e a cada 8 semanas até às 48 semanas pós-injeção em camundongos C57BL/6 e TrJ. Não houve nenhu- mas diferenças entre camundongos injetados com controle e vetor nos coortes C57BL/6 e TrJ. Também não houve nenhuma diferença significativa nas latências do afastamento entre camundongos machos e fêmeas em cada coorte.
[0292]Os resultados das medições de sensibilidade auditiva realizadas no teste de sobressalto acústico demonstraram que o AST foi claramente inibido pelo pré-pulso a todas as intensidades (69, 73 e 81 dB) e o nível de inibição dependeu da intensidade do pré-pulso a ambos os camundongos de tipo selvagem e TrJ. O trata- mento com o artigo de teste não alterou as respostas PP| nos camundongos C57BL/6 de tipo selvagem. A % de PP! foi detectavelmente menor em animais TrJ tratados com o artigo de controle, que foi melhorada no sentido da normalização em animais TrJ tratados com o artigo de teste (NT-3). Esta melhoria em animais Tr! tratados com NT- 3 foi observada predominantemente nos animais machos.
Teste Comportamental
[0293]Para a avaliação de haste rotativa, animais no coorte C57BL/6 não de- monstraram nenhumas diferenças no teste funcional de haste rotativa, qualquer que tenha sido o tratamento. Animais no coorte TrJ tratados com NT-3 demonstraram me- lhorias significativas no desempenho de haste rotativa em comparação com animais TrJ de controle começando às 16 semanas pós-tratamento, que persistiram até ao ponto final.
[0294]Para a avaliação da suspensão em fio, animais no coorte C57BL/6 não demonstraram nenhumas diferenças no teste funcional de suspensão em fio, qualquer que tenha sido o tratamento. Animais nos coortes TrJ tratados com NT-3 demonstra- ram melhoria significativa na capacidade de suspensão em fio em comparação com animais TrJ de controle começando às 28 semanas pós-tratamento, que persistiu até ao ponto final.
Histopatologia
[0295]Foi realizada histopatologia formal. Uma listagem dos órgãos e tecidos analisados é apresentada abaixo na Tabela 10.
Tabela 10. Lista de Órgãos examinados quanto à histologia
Tabela 10. Lista de Órgãos examinados quanto à histologia Órgão / Tecido Histopatologia Cólon x Estômago x Gânglios linfáticos inguinais Medula espinhal Músculo gastrocnêmio* x Lesões extensas (se existentes *Gastrocnêmio Direito e Esquerdo
[0296]Após a eutanásia, medula espinhal lombar, gânglios da raiz dorsal (DRGs) e a totalidade do nervo ciático (desde a chanfradura ciática até à fossa poplí- tea) foram removidos e processados para avaliação histopatológica. Uma lista dos animais individuais incluídos para a histopatologia interna é mostrada na Tabela 11. Tabela 11. Esboço da histopatologia interna após SCAAV1.tIMCK.NTF3 administrado via injeção intramuscular no músculo gastrocnêmio de camundongos Tre C57BL/6
ID ID Estirpe Nú 1ÕSs Artigo Injetado — | Estirpe NE SSs Artigo Injetado mer | nero mer | nero o o Ponto final: 24 semanas Ponto final: 48 semanas E ho F Solução Salina 1 Solução Salina TP e Esterilizada TP 3 Mm Esterilizada 6 F 0,9% 2 0,9% [390 lM |
Tabela 11. Esboço da histopatologia interna após scCAAV1.t(MCK.NTF3 administrado via injeção intramuscular no músculo gastrocnêmio de camundongos Tre C57BL/6 391 392 M 8 F 391 394 3 3 F 391 4 394 390 o |F 4 394 390 1 F 5 e] Sh 2 F SCAAV1.tMCK.N 6 Tt 57 TF3 Tt Gs 4 M o F 392 393 2 M 1 F 392 393 3 M 2 ão Sal 927 ; ; cs7e Dean aas nº [este eatsaas 7º 6 º 6 lorim 099% 0,9% 0,9% 939 | M | lo46 | M | [940 M | C57BL SCAAV1.tMCK.N | C57BL SCAAV1.IMCK.N 6 [om |TF3 6 —foselmM TF less | M | 960 | M loss im | less im | Análise Imunocitoquímica da Distribuição de CGRP
[0297]Para análise imunocitoquímica da distribuição de CGRP, foram exami- nadas as seções transversais de segmentos da medula espinhal lombar às 24 e 48 semanas pós-injeção. Esta análise não revelou nenhum aumento da reatividade de CGRP com NT-3 em animais Tr! e C57BL/6 independentemente do artigo de trata- mento.
[0298]Alterações Patológicas em Seções Embutidas em Plástico foram anali- sadas. Nervos ciáticos esquerdos e neurônios DRG lombares esquerdos embutidos em plástico examinados às 24 e 48 semanas pós-injeção não mostraram nenhumas alterações patológicas em animais C57BL/6. Alterações relacionadas com a idade, como corrugação/dobramentos para dentro e dobramentos para fora de mielina suge- rindo atrofia axonal, foram observadas em ambos os coortes de tratamento de animais C57BL/6 às 48 semanas pós-tratamento. Em animais Tr tratados com solução salina ocorreu uma queda notável nas fibras mielinizadas e numerosos axônios hipomielini- zados ou nus. Animais Tr! tratados com o artigo de teste exibem um aumento visível em pequenas fibras mielinizadas, espessura da mielina e decréscimo de axônios nus. Não houve nenhuns efeitos adversos do tratamento com NT-3 em camundongos TrJ, evidenciado por ausência de brotamento axonal dentro de DRGs.
[0299]Globalmente, a ausência de descobertas adversas relacionadas com o tratamento ao longo de todo o estudo em animais C57BL/6 e Trº indica que o trata- mento foi bem tolerado ao longo de 48 semanas pós-injeção.
Discussão
[0300]Para avaliar a segurança de scAAV1.tMCK.NTF3 administrado via uma única injeção intramuscular foi planejado um estudo de toxicologia incluindo um total de 88 animais (44 Machos / 44 Fêmeas). 44 animais (22 C57BL/6, 22 TrJ) foram tra- tados com controle de solução salina esterilizada 0,9% e 44 animais (22 C57BL/6, 22 TrJ) foram tratados com o artigo de teste SscCAAV1.tMCK.NTF3 a uma concentração de 1x103 vg/kg. Destes animais, metade dos animais de cada coorte foram eutanasiados às 24 semanas pós-tratamento e os restantes animais foram eutanasiados às 48 se- manas pós-tratamento.
[0301]Os dados deste relatório demonstram que o tratamento de animais com uma dose 10 vezes mais elevada do que a dose clínica proposta não resultou em manifestação de efeitos adversos de segurança relacionados com o artigo de teste.
Ao longo de todo o estudo, os animais foram observados diariamente quanto ao es- tado geral de saúde e morbidez, com verificações da mortalidade efetuadas duas ve- zes ao dia. A massa corporal dos animais foi medida a cada 2 semanas. Testes fun- cionais da hipersensibilidade (térmica e acústica) foram efetuados a cada 8 semanas. O teste comportamental foi efetuado a cada 2 semanas. Todos os animais sobrevive- ram ao procedimento de injeção e período de observação inicial sem quaisquer sinais de aflição. Devido a uma disfunção no sistema de distribuição de água, foram regis- tradas 4 mortes em animais TrJ que não estiveram relacionadas com a administração do artigo de teste. Não foram registradas outras mortes neste estudo.
[0302]Após a necrópsia, a hematologia do sangue e químicas clínicas foram medidas e não demonstraram nenhumas diferenças relacionadas com o artigo de teste. ELISAs para anti-AAV1 no soro foram realizados e demonstraram um aumento esperado nos anticorpos em circulação em animais tratados com o artigo de teste, que não foi específico do gênero. ELISAs para anti-NT-3 no soro foram realizados com todos os animais demonstrando títulos negativos de anticorpos para todos os instantes. Os níveis de NT-3 em circulação também foram medidos para todos os grupos de tratamento e estavam aumentados apenas em animais tratados com o ar- tigo de teste. Não houve nenhum efeito específico do gênero nos níveis em circulação de NT-3. O teste de hipersensibilidade térmica não revelou nenhumas alterações es- pecíficas do tratamento ou gênero em animais C57BL/6 ou Tr”. Medições da sensibi- lidade auditiva não revelaram nenhumas alterações relacionadas com o artigo de teste em animais C57BL/6, mas demonstraram um défice em animais Tr tratados com o artigo de controle com uma melhoria no sentido da normalização em animais Tr tra- tados com o artigo de teste. Esta melhoria foi observada principalmente em animais Tr machos. A avaliação pela haste rotativa do controle motor em animais C57BL/6 não revelou nenhumas diferenças relacionadas com o tratamento com o artigo de teste. Animais TrJ tratados com o artigo de teste demonstraram uma melhoria signifi- cativa em comparação com animais Tr! de controle, começando às 16 semanas pós- tratamento. De modo similar, a avaliação da suspensão em fio não revelou nenhumas diferenças no coorte C57BL/6 relacionadas com o artigo de teste. Animais Tr" tratados com o artigo de teste demonstraram uma melhoria significativa no tempo de suspen- são em fio, começando às 28 semanas pós-tratamento, que persistiu até ao ponto final.
[0303] Tecidos e órgãos recolhidos de todos os coortes às 24 e 48 semanas pós-tratamento foram avaliados. Para resumir, da necrópsia às 24 semanas foi obser- vada uma infiltração mínima de células mononucleares no músculo gastrocnêmio es- querdo injetado com o artigo de teste em 3/4 machos do Grupo 1 e 4/5 fêmeas do grupo 1. No entanto, uma infiltração similar também foi observada no músculo gastro- cnêmio que não foi injetado na fêmea remanescente do Grupo 1 (animal 3942). Esta alteração não foi observada nos músculos gastrocnêmios esquerdos injetados com solução salina ou direitos não injetados em nenhuns animais do Grupo 2 (controle) da necrópsia às 24 semanas. Nos animais com necrópsia às 48 semanas, foi novamente observada uma infiltração mínima de células mononucleares no músculo gastrocnê- mio esquerdo injetado com o artigo de teste em 2/5 machos do grupo 1 e 1/6 fêmeas do grupo 1. Todas as outras descobertas microscópicas estavam aleatoriamente dis- tribuídas através dos animais de controle e tratados, foram descobertas do fundo para a espécie ou foram consideradas acidentais relativamente à administração do artigo de teste.
[0304]Histologia interna foi realizada na seção da medula espinhal lombar, gânglios da raiz dorsal e no nervo ciático de um subconjunto de animais (3M, 3F por grupo). O exame de seções transversais de segmentos da medula espinhal lombar não revelou nenhum aumento da atividade de CGRP com NT-3 em animais indepen- dentemente do tratamento. A avaliação da patologia de nervos ciáticos e neurônios
DRG lombares embutidos em plástico não revelou nenhumas alterações em animais C57BL/6 para além de diferenças relacionadas com a idade. Em animais Tr”, o trata- mento com o artigo de teste resultou em patologia melhorada, evidenciado por um aumento em pequenas fibras mielinizadas, espessura da mielina aumentada e um decréscimo de axônios nus. A ausência de brotamento axonal em DRGs suporta adi- cionalmente a segurança do artigo de teste.
[0305]Globalmente, os dados recolhidos apresentados neste estudo indicam que o artigo de teste ScCAAV1.tIMCK.NTF3 injetado diretamente no músculo gastroc- nêmio por uma única injeção intramuscular a uma dose de 1 x 10º? va/kg foi bem tolerado até às 48 semanas pós-injeção em camundongos C57BL/6 de tipo selvagem e Tr! machos e fêmeas, evidenciado pelas múltiplas medições apresentadas acima.
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[0306]Não obstante a presente invenção ter sido descrita em termos de mo- dalidades específicas, é entendido que variações e modificações ocorrerão aos peri- tos na técnica.
Em conformidade, apenas limitações tais como as que aparecem nas reivindicações devem ser impostas na invenção.

Claims (56)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, na or- dem de 5' para 3': (i) uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2; (ii) uma sequência promotora/intensificadora de creatina cinase muscular apresentada nos nucleotídeos 147-860 da SEQ ID NO: 11; (iii) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de NT-3 hu- mano; e (iv) uma segunda sequência AAV2 ITR; em que o polipeptídeo de NT-3 humano tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos 90% idêntica aos nucleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11 ou 100% idêntica aos nucleotídeos 1077-1850 da SEQ ID NO: 11.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente, a 3' do referido promotor/intensificador, um íntron quimérico apresentado nos nucleotídeos 892-1024 da SEQ ID NO: 11.
3. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente, a 3' da referida se- quência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de NT-3 humano, um sinal de poliadenilação do SV40 apresentado nos nucleotídeos 1860-2059 da SEQ ID NO: 11.
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: em que a referida primeira ITR é apresentada nos nucleotídeos 7-112 da SEQ ID NO: 11, e/ou em que a referida segunda ITR é apresentada nos nucleotídeos 2121-2248 da SEQ ID NO: 11.
5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: em que a referida primeira ITR é apresentada nos nucleotídeos 7-112 da SEQ IDNO: 11 e em que a referida segunda ITR é apresentada nos nucleotídeos 2121-2248 da SEQ ID NO: 11.
6. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ge- noma de scAAV1.tMCK.NTF3 que é pelo menos 90% idêntico à sequência de nucle- otídeos apresentada na SEQ ID NO: 11.
7. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o genoma de scAAV1.tMCK.NTF3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
8. Partícula de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que o rAAV é infeccioso.
9. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é do serótipo AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 ou AAVrh.74.
10. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA do AVV no genoma do rAAV é de AAV-1.
11.Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a partícula de rAAV, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para tratar um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito necessitado da mesma.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para estimular o crescimento muscular em um sujeito necessitado da mesma.
14. Método de tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuro- patia em um sujeito humano necessitado do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o passo de administrar ao sujeito humano um ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo de NT-3; em que a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7, €) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,5x10*? vg/Kkg até cerca de 6,5x10"? va/kg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10'? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg,
h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10*? vg/Kkg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 4x10*? vg/kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
15. Método de melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano necessitado do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o passo de administrar ao sujeito humano um ácido nucleico co- dificando o polipeptídeo de NT-3; em que a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é
100% idêntica à SEQ ID NO: 2,
d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7,
€) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3,
f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 1,5x10*? vg/kg até cerca de 6,5x10"? vg/kg,
g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10'? vg/kg até cerca de 6x10? vg/Kkg,
h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 2x10"? vg/kg,
i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 4x10*? vg/Kkg,
j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a via de administração é uma via in- tramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10*? vg/kg,
k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a via de administração é uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico é administrado usando um vetor viral.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico para músculos é promotor de creatina cinase específico para músculos.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o scAAV1.t(MCK.NTF3 compreende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a via de administração é por injeção intramuscular.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a via de administração é por injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21 ou 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a força muscular melhorada no sujeito ocorre nas extremidades superiores ou inferiores.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação composta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds) ou como um decréscimo da progressão da doença ao longo de um perí- odo de tempo de dois anos.
25. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de NT-3 para uso no tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito humano, em que: a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7, €) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV é administrado a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10"? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg,
g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? va/kg até cerca de 6x10*? vg/kg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/Kkg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10*? vg/Kkg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10'? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando de 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
26. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 para uso na melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano, em que a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1,
b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:
G c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6 ou 7, €) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV está a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10"? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/kg até cerca de 6x10*? vg/kg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/kg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10*? vg/Kkg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 6x10*? vg/Kkg,
k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando de 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 26, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico é formulado para administração usando um vetor viral.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado.
29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27 ou 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos.
30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28 ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor específico para músculos é promotor de creatina cinase específico para músculos.
31. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28 ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o SCAAV1.tMCK.NTF3 compreende o cassete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
32. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para injeção intramuscular.
33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnê- mio e tibial anterior.
34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33, CARACTERIZADA pelo fato de que a força muscular melhorada ocorre nas extremidades superiores ou inferiores do sujeito.
35. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 28, 29,30, 31,32 ou 33, CARACTERIZADA pelo fato de que a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação composta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds) ou como um decréscimo da progressão da doença ao longo de um perí- odo de tempo de dois anos.
36. Uso de um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de emaciação muscular ou neuropatia em um sujeito hu- mano, em que: a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7, €) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV está a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3, f) o ácido nucleico codificando o polipeptíideco de NT-3 é o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formu- lado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10? vg/Kkg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg, g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? va/kg até cerca de 6x10*? vg/Kkg, h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? vg/Kkg, i) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10*? vg/kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10'? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando de 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tI(MCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
37. Uso de uma dose de um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT- 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para melhoria da força muscular ou estimulação do crescimento muscular em um sujeito humano, em que:
a) o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1,
b) o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 c) o ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2,
d) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7,
€) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3 e o rAAV está a uma dose que resulta em expressão sustentada de uma concentração baixa de polipeptídeo de NT-3,
f) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, a composição é formulada para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 1,5x10*? vg/kg até cerca de 6,5x10? vg/Kkg,
g) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x10*? va/kg até cerca de 6x10*? vg/Kkg,
h) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 2x1 via de administração intramuscular e a dose do rAAV é cerca de 4x10*? vg/kg, j) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma via de administração intramuscular e a dose do rAAV administrado é cerca de 6x10'? vg/kg, k) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tIMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vg/mL administrada usando de 3 a 6 injeções por músculo de cerca de 0,5 até 1 mL, ou 1) o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de NT-3 é o vírus adenoassoci- ado recombinante (rAAV) scAAV1.tMCK.NTF3, o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular a uma concentração de cerca de 2x10º? vag/mL administrada usando múltiplas injeções a um volume total de cerca de 5 até 14 mL.
38. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 ou 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico é formulado para administração usando um vetor viral.
39. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37 ou 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado.
40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38 ou 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor específico para músculos.
41. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico para músculos é pro- motor de creatina cinase específico para músculos.
42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40 ou 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o ScCAAV1.tMCK.NTF3 compreende o cas- sete do gene NT-3 apresentado na SEQ ID NO: 11.
43. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40, 41 ou 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para uma injeção intramuscular.
44, Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para injeção intramuscular bilateral na cabeça medial e lateral do músculo gastrocnêmio e tibial anterior.
45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44, CARACTERIZADO pelo fato de que a força muscular melhorada no sujeito ocorre nas extremidades superiores ou inferiores.
46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44 ou 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a melhoria na força muscular é medida como um decréscimo da pontuação composta na Escala Pediátrica de CMT (CMTPeds) ou como um decréscimo da progressão de doença ao longo de um perí- odo de tempo de dois anos.
47. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está em risco de desenvolver atrofia muscular.
48. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de atrofia muscular.
49. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem distrofia muscular.
50. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de uma neuropatia.
51. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de neuropatia de Charcot-Marie-Tooth (CMT).
52. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma das variantes genéticas pro- porcionadas na Tabela 1.
53. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de uma neuropatia amiloide associada à transtirretina.
54. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma das variantes genéticas de Val30Met, Ile107Val e Ser77Tyr.
55. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de uma neuropatia adquirida causada por câncer, diabetes mellitus, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), distúrbio da tireoide, hipotireoidismo, hipoglicêmia, urêmia, insuficiência renal, disfunção hepática, falha he- pática, policitêmia, distúrbios do tecido conjuntivo, doença de Lyme, doença celíaca, lepra, porfíria, síndrome de Sjogren, poliomielite, acromegalia, distúrbios do metabo- lismo de lipídeos/glicolipídeos, síndrome do Nilo Ocidental, amiloidose, distúrbios mitocondriais, distúrbios disproteinêmicos, gamapatia monoclonal de importância in- determinada (MGUS), síndrome de POEMS, deficiência nutricional/vitamínica, defici- ência de vitamina B12, deficiência de vitamina E ou deficiência de cobre.
56. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está sofrendo de miopatia hereditária, neuropatia periférica, neuropatia tó- xica, polineuropatia periférica autoimune, polirradiculoneuropatia desmielinizante in- flamatória aguda (AIDP), polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), mononeurite múltipla vasculítica, paraneuropatia, ganglionite idiopática, es- clerose lateral amiotrófica, neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, ou síndrome de neurônios motores inferiores, doença neuromuscular, atrofia muscu- lar, miopatia induzida por fármacos, sarcopênia, caquéxia, atrofia de fibras musculares de tipo Il, atrofia muscular relacionada com a idade ou um distúrbio de músculos pri- mários autoimune adquirido.
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Figura 9 Sequência completa do vetor sc pAAV.tMCK.NT3 (584 pb) SEQ ID NO: 11
CAGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCECCCGEGCAAAGCCCGEGCETCEGECGACCTTTGGTC GCCCGECCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGggttaaccaattggeggeogeaaactta catgccccactacgggtetaggoetgcccatgtaaggaggeaaggectagggacaccegagatgoctagtt ataattaaccccaacacetgetgecececececencaacacetgetgectgagectgageggttaceeca ceceggtgectaggtettaggetetatacaccataggaggagaagetegetetaaaaataacectatecet ggatagatecactacagotetatoctacccatataaggagacaagecctagagacaceegagatacetagt tataattaaccccaacacetgetgececececececcaacacetacetgcetgagectgageggttacece aceceggtgcetaggtettaggetotgtacaccatagaggagaagetegetetaaaaataaccctateceo tggtagaccactacgggtetaggctaccecatataaggaggeaaggectagggacaccegagatgccetagt tataattaaccccaacacetgctgcccccacaacecaacacetactacetgagectgageggttacecca ceceggtgcetaggtettaggetetatacaccatggaggagaagetegetetaaaaataaccctatecet ggtcetecetggggacagecectectggetagteacacectgtaggetectotatataacccaggggeao aggggetacccecoggagteaccetacagaagttagtoegtgaggcactaggcagataagtatcaaggattacaa gacaggtttaaggagaccaatagaaactoggcttatogagacagagaagactettgegtttetgatagge acctattggtcttactgacatecactttacetttetetecacaggtgtecacteccagttcaattacage gegtggtacetgcagggatatCcaccATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGCTTATCTCCGTGG
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GAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGA
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ATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAA
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CGGTGEGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTA
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Figura 9 Cont.
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GCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAAC
GACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTAC
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CTCEGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGETCTCGCGETATC
ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAA
CTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA
CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAMAAGGATCTAGGTGAAG
ATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCOG
TAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAA
ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGEC
TTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACT
CTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC
GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACEGEGEGT
TCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAG
AAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGA
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