BR112020006581A2 - meio de diagnóstico para detectar e/ou quantificar uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra - Google Patents
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Abstract
Um meio de diagnóstico imunocromatográfico (1) para a detectar e/ou
quantificar uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente
líquida (E), compreendendo: - pelo menos uma mistura de reação (2) contendo
moléculas biológicas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos rotulados com
pelo menos uma molécula de visualização detectável por fluorescência, a referida
mistura de reação estando presente em um recipiente separado do referido sistema
de recuperação (3); e - pelo menos um sistema de recuperação (3) na forma de um
suporte sólido ao qual ligantes competitivos e/ou moléculas biológicas de
reconhecimento são fixos em posições de recuperação (4 e 5) que são distintas e
conhecidas e que são arranjadas de acordo com um arranjo semelhante à matriz
bidimensional definido de acordo com um sistema de coordenadas, de modo a
identificar pela localização das referidas posições de recuperação (4 e 5) no referido
suporte, os referidos analitos presentes na referida amostra (E).
Description
“MEIO DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR E/OU QUANTIFICAR UMA PLURALIDADE DE ANALITOS PRESENTES EM UMA AMOSTRA” Campo da Técnica
[001]A presente invenção refere-se a um meio de diagnóstico imunocromatográfico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida, compreendendo: - pelo menos uma mistura de reação contendo moléculas biológicas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos rotulados com pelo menos uma molécula de visualização; e - pelo menos um sistema de recuperação na forma de um suporte sólido ao qual são ligados, ligantes competitivos e/ou moléculas biológicas de reconhecimento em locais de recuperação distintos e conhecidos, de modo a identificar pela localização dos referidos locais de recuperação no referido suporte, os referidos analitos presentes na referida amostra.
Fundamentos Tecnológicos
[002]Atualmente, o interesse no meio de diagnóstico que torna possível detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra é crescente, e isto particularmente no campo de produtos alimentícios, do mesmo modo no campo médico.
[003]De fato, novos problemas com a saúde pública emergentes devem ser continuamente enfrentados, contra os quais soluções de diagnóstico rápidas e eficazes devem ser desenvolvidas em virtude de fornecer um tratamento adequado.
Por exemplo, a cada ano em todo o mundo, em torno de 60000 intoxicações humanas estão ligadas às toxinas produzida por algas (incluindo cianotoxinas de água mole), com uma mortalidade total de aproximadamente 1,5 %. Biotoxinas marinhas (também chamadas ficotoxinas) são produzidas por certas espécies de fitoplâncton e provavelmente se acumulam em várias espécies marinhas, por exemplo em peixes, caranguejos ou bivalves de alimentação por filtro (mariscos) tais como mexilhões, ostras, vieiras e amêijoas. Se alguém consume quantidades significativas de mariscos contaminados, pode ser uma vítima de uma intoxicação grave. Portanto, é crucial ter meio de diagnóstico rápido e eficaz para detectar estas biotoxinas marinhas, por exemplo, por intermédio de uma análise do sangue ou urina.
[004]O meio de diagnóstico tal como definido acima também pode ser usado para detectar e quantificar vírus responsáveis por várias patologias. Tal meio de diagnóstico tornaria possível: (1) fornecer prova da origem viral dos sinais clínicos observados e diagnosticar o vírus responsável (por exemplo, hepatite ou herpes) e monitorar a evolução biológica da infecção (por exemplo, por intermédio da quantificação do vírus no sangue: HIV, HBV, HCV); (2) monitorar uma evolução biológica da infecção (por exemplo, HIV ou hepatite B); (3) tornar possível uma decisão terapêutica e julgar a efetividade de tratamentos antivirais (por exemplo, para o tratamento de uma infecção por citomegalovírus por ganciclovir); (4) impedir a transmissão de infecções virais quando do fornecimento de sangue, órgãos e tecidos; (5) avaliar o estado imunológico (por exemplo, no caso de rubéola); (6) estudar os marcadores séricos na população (por exemplo, durante investigações de prevalência ou estudos epidemiológicos). Geralmente, o diagnóstico médico visa uma extensão máxima dos parâmetros a serem detectados para melhor alvejar o tratamento e o tipo de cuidado a fornecer ao paciente, o que limita, em particular, os efeitos secundários que são frequentemente não muito bem conhecidos.
[005]Além disso, no setor de alimentos e mais especificamente, na indústria de laticínios, monitorar e controlar produtos, envolve realizar testes no estágio mais cedo possível da fabricação destes. Idealmente, estes testes devem ser realizados no lugar de produzir matérias-primas ou no lugar de sua transformação. Estes testes de triagem são particularmente designados para detectar a presença e a quantidade de certos analitos, dos quais são contaminantes químicos (por exemplo, resíduos de antibióticos e toxinas), proteínas (por exemplo, alérgenos) ou patógenos (por exemplo, vírus, parasitas ou bactérias). O aumento dos padrões de saúde e o desejo de uma melhor rastreabilidade de produtos alimentícios, envolve um aumento de analitos a serem testados, bem como o conhecimento tão preciso quanto possível, das classes destes (identificações de famílias, classes e do composto específico) e das quantidades destes com respeito aos limites máximos autorizados em cada uma das matrizes. Além disso, com leite vindo de numerosos e muitos lugares em todo o mundo, é difícil determinar especificamente os contaminantes que podem ser encontrados no leite de acordo com o local de produção, visto que práticas são diferentes de um lugar para outro no mundo. De fato, a origem de gêneros alimentícios, bem como as práticas de produção local associadas nem sempre são conhecidas, o que obriga a detectar como um amplo espectro de compostos, tão amplo quanto possível que cubra tudo que pode ser encontrado na amostra a ser analisada.
[006]Em particular, o agronegócio está interessado em um meio de diagnóstico que torna possível considerar em uma única operação, a análise de compostos pertencentes a classes diferentes que podem ter propriedades físico- químicas fundamentalmente diferentes, dentro de uma mesma família de analitos ou não, e presentes simultaneamente em uma amostra dada. Por exemplo, o tipo e o número de antibióticos que podem ser administrados a animais podem variar de acordo com uma aplicação terapêutica ou profilática, de acordo com a espécie animal, o germe a ser combatido, práticas veterinárias, legislação em vigor, meios disponíveis ou também regiões geográficas. No caso de certos tratamentos particulares, uma mistura de fármacos pode ser usada. Como uma regra geral, o médico usa, por si só ou em combinação de produtos antibióticos selecionados dentre todos os compostos comercialmente disponíveis de acordo com a avaliação destes da melhor efetividade.
[007]As principais classes de agentes antibacterianos e antibióticos são: penicilinas e cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, aminoglicosídeos e aminociclitóis, macrolídeos, cloranfenicóis ou outros peptídeos, ionóforos, antibióticos de nitrofurano, quinolonas, carbadox, etc., cada uma destas classes agrupando um conjunto muito vasto de compostos quimicamente diferentes.
[008]A presença de tais moléculas em produtos lácteos pode ter um maior impacto negativo sobre a rentabilidade do método industrial envolvendo uma fermentação (queijo, iogurte, etc.) a partir do leite fresco.
[009]Além disso, o uso, algumas vezes intenso, de antibióticos na medicina veterinária e na produção agrícola pode estar na origem de cepas bacterianas emergentes que se tornaram resistentes a antibióticos. Para preservar a saúde humana e legislar a esse respeito, numerosos países estabeleceram limites máximos de resíduos (MRL) para resíduos de antibióticos em gêneros alimentícios. Estes MRLs ligam o limite entre uma amostra positiva e uma amostra negativa, isto é, entre uma amostra recusada e uma amostra aceita.
[010]É importante que os métodos de triagem recorram a um meio de diagnóstico (1) que possa cobrir a detecção simultânea de um máximo dos compostos, portanto, os testes de triagem precisando ser preferivelmente e logicamente testes de analitos múltiplos, (2) que possa tornar possível conhecer as classes às quais os compostos encontrados em uma amostra positiva pertencem, de modo a ser capaz de orientar diretamente para o método de confirmação adequado, e (3) que não possa fornecer resultados do tipo “falso negativo”, visto que estes subsequentemente evitarão a análise e subsequentemente não serão confirmados.
Estado da Técnica
[011]Um meio de diagnóstico tal como indicado no início é conhecido. De fato, o documento EP1712914 divulga um meio de diagnóstico imunocromatográfico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida, compreendendo: - pelo menos uma mistura de reação contendo moléculas biológicas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos rotulados com pelo menos uma molécula de visualização; e - pelo menos um sistema de recuperação na forma de um suporte sólido ao qual são ligados, ligantes competitivos e/ou moléculas biológicas de reconhecimento em locais de recuperação distintos e conhecidos, de modo a identificar localizando-se os referidos locais de recuperação no referido suporte, os referidos analitos presentes na referida amostra.
[012]Mais especificamente, este documento fornece um meio de diagnóstico que torna possível detectar simultaneamente detectar um conjunto de compostos que possam pertencer a pelo menos duas classes separadas de analitos e caracterizar a classe à qual um composto detectado realmente pertence, e isto demonstrando-se a compatibilidade técnica e prática da combinação em um único e mesmo método, pelo menos dois mecanismos de detecção sem o funcionamento de qualquer um sendo capaz de interferir com o funcionamento do outro. Além disso, um meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914 demonstra a praticabilidade técnica de uma dosagem de analitos múltiplos que pode ser realizada rapidamente, por exemplo em menos do que 10 minutos, e em uma única e mesma etapa de análise no início de uma única e mesma amostra.
[013]Praticamente, o método para implementar o meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914 é caracterizado pelas etapas seguintes: - colocação de uma mistura de reação predeterminada em contato com uma amostra a ser caracterizada para obter uma solução que é incubada a 50 °C por 3 minutos; - imersão do sistema de recuperação definido acima na solução obtida e incubação por 3 minutos;
- interpretação quantitativa e qualitativa do resultado no sistema de recuperação por meio de um dispositivo de leitura óptica.
[014]De acordo com este documento, é a alocação dos elementos de recuperação (ligantes competitivos) que tornará possível identificar o tipo de contaminação. Por exemplo, de acordo com o documento EP1712914 que corresponde à dosagem simultânea de tetraciclinas, β-lactamas e sulfonamidas, cada elemento de recuperação é arranjado na forma de uma linha de captura, cada um deles sendo arranjado sucessivamente um atrás do outro se referindo à direção da migração do líquido (correspondendo à mistura de reação colocada em contado com uma amostra). De acordo com uma modalidade preferida deste meio de diagnóstico, as zonas de captura compreendendo os elementos de recuperação das β-lactamas, tetraciclinas e sulfadimetoxina são arranjadas respectivamente a um primeiro, a um segundo e a um terceiro nível se referindo à direção da migração do líquido.
[015]A interpretação dos resultados de acordo com um tal meio de diagnóstico deve ser feita reciprocamente e é fundamentada no princípio de competição que explora o reconhecimento dos compostos procurados com respeito a um ligante competitivo e/ou uma molécula biológica de reconhecimento. Vários casos podem ser apresentados quando os elementos de recuperação ligados no sistema de recuperação são ligantes competitivos: - o composto procurado está presente na amostra, e assim será ligado às moléculas biológicas de reconhecimento presentes em uma mistura de reação que consequentemente não estará mais livre para ser ligada às moléculas competitivas ligadas ao sistema de recuperação. O resultado assim será positivo e terá uma marcação que está ausente; - ou o composto procurado está ausente da amostra, as moléculas biológicas de reconhecimento presentes em uma mistura de reação, portanto sendo livres para serem ligadas às moléculas competitivas ligadas ao sistema de recuperação. O resultado assim será negativo e terá uma marcação que está presente.
[016]Infelizmente, um meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914 apenas torna possível detectar e/ou quantificar um número limitado de analitos presentes em uma amostra e não pode, portanto, ser considerado como realmente sendo um meio de diagnóstico de analitos múltiplos. Mais especificamente, o meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914 torna possível detectar os compostos pertencentes a três classes separadas de antibióticos apenas, isto é, β- lactamas, tetraciclinas e sulfonamidas.
[017]Consequentemente, mesmo que as β-lactamas, as tetraciclinas e as sulfonamidas realmente constituam classes de analitos que podem ser considerados como sendo diferentes, este documento torna possível apenas detectar antibióticos.
Assim, um meio de diagnóstico de acordo com este documento certamente não torna possível detectar e/ou quantificar analitos, como agentes antibacterianos, toxinas, hormônios, patógenos, agentes adulterantes ou também alérgenos.
[018]De fato, os setores envolvidos tais como o agronegócio e o setor médico demandam uma análise que é tão completa quanto possível, e que pode preferivelmente identificar um número máximo de compostos. É mais prático e mais econômico realizar um único teste múltiplo a partir uma única amostra ao invés de precisar realizar um teste particular para cada composto ou para apenas um pequeno grupo de compostos, isto é, 2 ou 3 compostos como um máximo, tal como é o caso com um meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914.
[019]Como descrito acima, este documento compreende um sistema de recuperação tendo zonas de captura (elementos de recuperação ligados) na forma de linhas arranjadas uma atrás da outra e perpendicularmente à direção da migração do líquido, uma incompatibilidade técnica é encontrada quando um técnico no assunto tenta arranjar um maior número de zonas de captura simultaneamente no sistema de recuperação, e isto por causa (1) do tamanho restrito da zona de teste, (2) da maior quantidade de reagentes a serem depositados nas linhas sucessivas (favorecendo um ruído de fundo e inter-reatividades mais significativas) e (3) de uma falta de precisão durante a interpretação dos resultados com uma análise visual ou instrumental que é longa e complexa. Portanto, torna-se difícil, até impossível delimitar as diferentes zonas de captura uma da outra e, portanto, distinguir os diferentes analitos um do outro.
[020]A publicação de Taranova (Taranova et al., 2013) tenta resolver as falhas do documento EP1712914 combinando-se tecnologia de imunocromatografia e “microarranjo”. De fato, em virtude de aumentar o número de analitos que podem ser detectados/quantificados em um único teste, o documento de Taranova propõe arranjar os locais de recuperação no suporte sólido de acordo com uma matriz bidimensional. Deste modo, o suporte sólido do diagnóstico imunocromatográfico de acordo com Taranova tem compostos de um microarranjo de 32 antígenos (ligantes competitivos) ligados na forma de pontos (locais de recuperação). Infelizmente, um meio de diagnóstico de acordo com este documento torna possível apenas detectar e quantificar quatro analitos, isto é, anfetamina, benzoilecgonina, metanfetamina e morfina, que são reconhecidos como sendo fármacos de abuso. De fato, de acordo com Taranova et al., oito locais de recuperação na forma de pontos são fornecidos no suporte sólido para detectar e quantificar um único analito. Especificamente, para detectar e/ou quantificar um analito dado, oito pontos compreendendo antígenos específicos (ligantes competitivos) deste analito são ligados no suporte sólido, os oito pontos tornando possível identificar o analito dado sendo arranjado sobre o eixo perpendicular à direção da migração do líquido. Consequentemente, de acordo com este documento, são os 32 antígenos diferentes, que tornam possível detectar 32 analitos diferentes que são ligados no suporte sólido, mas apenas quatro antígenos diferentes reproduziram oito vezes que são específicos de quatro analitos diferentes.
Assim, a identificação dos analitos é apenas feita de acordo com uma única dimensão,
os oito locais de recuperação arranjados sobre o eixo perpendicular à direção da migração sendo idênticos, isto é, de modo que eles compreendam antígenos específicos de um único analito. De acordo com este documento, o arranjo dos movimentos de recuperação na forma de pontos é feito ao longo de fileiras de pontos, cada fileira correspondendo a um analito dado, e não de acordo com um arranjo de matriz bidimensional real.
[021]Assim, o meio de diagnóstico imunocromatográfico do estado da técnica encontra, neste estágio, um limite significativo para a efetividade que é caracterizado pela ausência de um teste que seja realmente de analitos múltiplos, que seja rápido e prático e que torne possível uma detecção e/ou uma quantificação dos analitos que é: - específica, isto é, que distingue os analitos de classes diferentes, e - universal, isto é, que é aplicável para a maioria das substâncias que são úteis para analisar nos campos de agronegócio e diagnóstico médico tais como resíduos de fármacos (por exemplo, antibióticos e agentes antibacterianos), toxinas, hormônios, patógenos, agentes adulterantes ou também alérgenos.
Objetivo da Invenção
[022]A invenção visa superar as desvantagens do estado da técnica fornecendo-se um meio de diagnóstico, que é mais rápido, mais prático, mais econômico, mais eficaz e que torna possível uma detecção e/ou uma quantificação de analitos que é: - específica, isto é, que distingue os analitos de classes diferentes, e - universal, isto é, que é aplicável para a maioria das substâncias que são úteis para analisar nos campos de agronegócio e diagnóstico médico tais como resíduos de fármacos (por exemplo, antibióticos e agentes antibacterianos), toxinas, hormônios, patógenos, agentes adulterantes ou também alérgenos, a detecção e/ou a quantificação sendo realizada em uma única etapa e em menos do que 15 minutos.
[023]Mais especificamente, um meio de diagnóstico de acordo com a invenção torna possível detectar e/ou quantificar pelo menos 5 classes diferentes de analitos, preferivelmente pelo menos 10 classes diferentes de analitos,
preferivelmente pelo menos 15 classes diferentes de analitos presentes em uma amostra, as classes de analitos sendo resíduos de fármacos (por exemplo, antibióticos ou agentes antibacterianos), toxinas, hormônios, patógenos, agentes adulterantes ou também alérgenos, e isto em menos do que 15 minutos e em uma única etapa.
Para resolver este problema, um meio de diagnóstico imunocromatográfico é fornecido, de acordo com a invenção, para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida, compreendendo:
- pelo menos uma mistura de reação contendo moléculas biológicas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos rotulados com pelo menos uma molécula de visualização; e
- pelo menos um sistema de recuperação na forma de um suporte sólido ao qual são ligados, ligantes competitivos e/ou moléculas biológicas de reconhecimento em locais de recuperação distintos e conhecidos que são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional, de modo a identificar pela localização dos referidos locais de recuperação no referido suporte, os referidos analitos presentes na referida amostra,
o referido meio de diagnóstico sendo caracterizado em que,
a) o referido arranjo de matriz bidimensional é definido de acordo com um sistema de coordenadas tendo uma primeira coordenada X e uma segunda coordenada Y, tal que cada local de recuperação ligado no referido suporte sólido torna possível identificar um analito distinto;
b) para detectar e/ou quantificar um analito dado, um par de diagnóstico consistindo em um ligante competitivo e em uma molécula biológica de reconhecimento está presente, tal que a referida molécula biológica de reconhecimento é encontrada na referida mistura de reação e o referido ligante competitivo é ligado em pelo menos um local de recuperação, ou reciprocamente; c) a referida pelo menos uma molécula de visualização é uma molécula que é detectável em fluorescência; e d) a referida mistura de reação está presente em um recipiente, o referido recipiente sendo separado do referido sistema de recuperação.
[024]Pelo termo “analito”, isto significa, no sentido da presente invenção, um composto que constitui um interesse em ser detectado e/ou quantificado para fornecer um diagnóstico, particularmente no agronegócio e campo médico.
[025]Pelos termos “classe de analitos”, isto significa, no sentido da presente invenção, um agrupamento de vários analitos que têm propriedades biológicas e químicas similares. Como um exemplo, os resíduos de fármacos podem ser separados em classes diferentes, tais como penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, aminoglicosídeos, aminociclitóis, macrolídeos, quinolonas, ionóforos, carbadox, antibióticos de nitrofurano e fenicóis. Especificamente, penicilinas são antibióticos que têm um modo de ação comum (propriedade biológica) e que têm uma estrutura química similar (propriedade química).
[026]Pelos termos “detecção e/ou quantificação respectiva”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma detecção e/ou uma quantificação de todos os analitos de interesse usando-se um único meio de diagnóstico de acordo com a invenção.
[027]Pelos termos “detecção e/ou quantificação simultânea”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma detecção e/ou uma quantificação de todos os analitos de interesse depois de um lapso de tempo idêntico.
[028]Pelos termos “detecção e/ou quantificação específica”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma detecção e/ou uma quantificação de todos os analitos de interesse separadamente, de modo a ser capaz de identificar precisamente o analito que é detectado e/ou quantificado.
[029]Pelos termos “par de diagnóstico”, isto significa, no sentido da presente invenção, duas moléculas complementares intencionadas a detectar e/ou quantificar um analito dado, as referidas duas moléculas sendo uma molécula biológica de reconhecimento e um ligante competitivo. A detecção e/ou a quantificação do analito dado é fundamentada no princípio de competição de acordo com duas situações possíveis: - a molécula biológica de reconhecimento é encontrada na mistura de reação e o ligante competitivo complementar é ligado no suporte sólido; - ou o ligante competitivo é encontrado na mistura de reação e a molécula biológica de reconhecimento complementar é ligada no suporte sólido.
[030]Pelos termos “moléculas biológicas de reconhecimento”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma molécula natural ou sintética que é capaz de ser ligada especificamente a um analito de interesse.
[031]Pelos termos “ligantes competitivos”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma molécula que é capaz de ser ligada especificamente às moléculas biológicas de reconhecimento e que, portanto, entrarão em competição com um analito de interesse pela ligação às moléculas biológicas de reconhecimento.
[032]Pelos termos “local de recuperação”, isto significa, no sentido da presente invenção, uma alocação na qual as moléculas biológicas de reconhecimento ou ligantes competitivos serão ligadas. No caso onde moléculas biológicas de reconhecimento são ligadas em um local de recuperação, o analito de interesse (se ele estiver presente) ou o ligante competitivo (se o analito de interesse estiver ausente) será ligado especificamente, será capturado e, portanto, parará a migração. No caso onde ligantes competitivos são ligados em um local de recuperação, as moléculas biológicas de reconhecimento específicas de um analito de interesse, serão ligadas especificamente, serão recuperadas e, portanto, pararão de migrar, e isto se o analito de interesse estiver ausente.
[033]O método implementado para a detecção e/ou a quantificação é como segue: - contatar a mistura de reação com a amostra para obter um líquido; - incubar em uma temperatura de 30 °C por 3 minutos; - imergir a extremidade do sistema de recuperação que é encontrada a montante da direção da migração no líquido (compreendendo a amostra e a mistura de reação); - incubar por 10 minutos a 30 °C; e - interpretar qualitativa e/ou quantitativamente o resultado no sistema de recuperação por meio de um dispositivo de leitura óptica.
[034]A direção da migração do líquido de acordo com a invenção é definida de acordo com o referido sistema de coordenadas que define o arranjo de matriz dos locais de recuperação ligados no sistema de recuperação de acordo com a invenção e é feita consequentemente de acordo com uma coordenada X e uma coordenada Y.
[035]A detecção e/ou a quantificação de acordo com a invenção é fundamentada no princípio de competição que explora o reconhecimento dos analitos procurados com respeito a um ligante competitivo e/ou uma molécula biológica de reconhecimento.
[036]Vários casos podem ser apresentados de acordo com os ligantes competitivos ou moléculas biológicas de reconhecimento que são ligados aos locais de recuperação: 1) No caso onde os elementos de recuperação são ligantes competitivos, - o composto procurado está presente na amostra, e assim será ligado às moléculas biológicas de reconhecimento presentes em uma mistura de reação que consequentemente não estará livre para ser ligada às moléculas competitivas ligadas ao sistema de recuperação. O resultado assim será positivo e terá uma marcação que está ausente; - ou o composto procurado está ausente da amostra, as moléculas biológicas de reconhecimento presentes em uma mistura de reação, portanto, estando livres para serem ligadas às moléculas competitivas ligadas ao sistema de recuperação. O resultado assim será negativo e terá uma marcação que está presente.
2) No caso onde os elementos de recuperação são moléculas biológicas de reconhecimento, - o composto procurado está presente na amostra, e assim entrará em competição com os ligantes competitivos presentes em uma mistura de reação a ser ligada às moléculas biológicas de reconhecimento ligadas ao sistema de recuperação.
O resultado assim será positivo e terá uma marcação que está ausente ou é fraca; - ou o composto procurado está ausente da amostra, os ligantes competitivos assim sendo os únicos a serem ligados às moléculas biológicas de reconhecimento ligadas ao sistema de recuperação. O resultado assim será negativo e terá uma marcação que está presente.
[037]No escopo da presente invenção, foi surpreendentemente demonstrado que um meio de diagnóstico imunocromatográfico que compreende as características (a), (b) (c) e (d) tal como indicado acima, significa que o meio de diagnóstico de acordo com a invenção é mais eficaz e é tanto específico quanto universal. Especificamente, torna-se possível detectar e/ou quantificar pelo menos 5 classes diferentes de analitos, preferivelmente pelo menos 10 classes diferentes de analitos, preferivelmente pelo menos 15 analitos diferentes presentes em uma amostra, as classes de analitos sendo resíduos de fármacos (por exemplo, antibióticos ou agentes antibacterianos), toxinas, hormônios, patógenos, agentes adulterantes ou também alérgenos, e isto, em menos do que 15 minutos e em uma única etapa. Um meio de diagnóstico de acordo com a invenção é consequentemente mais prático, mais econômico e mais eficaz do que o meio de diagnóstico correntemente conhecido que é limitado à detecção e/ou à quantificação de menos do que cinco classes diferentes de analitos.
[038]Especificamente, foi surpreendentemente observado que a alocação da mistura de reação em um recipiente separado do suporte sólido trouxe várias vantagens.
[039]Primeiro, com a interação da mistura de reação com a amostra analisada sendo focalizada em um recipiente separado, o controle da interação da mistura de reação com a amostra é otimizado. Ao fazer isso, é certo que a amostra que interage completamente com a mistura de reação antes do líquido assim obtido (formado a partir da mistura de reação e a partir da amostra) não está em contato com o suporte sólido e, portanto, com os locais de recuperação. Consequentemente, a separação da mistura de reação em um recipiente separado do suporte sólido torna possível evitar obter falso-negativos. De fato, no caso onde a mistura de reação é ligada no suporte sólido a montante dos elementos de recuperação com respeito à direção da migração como é o caso em o documento de Taranova et al., a amostra principalmente líquida é diretamente colocada em contado com a mistura de reação ligada no suporte sólido, que levará à migração imediata do líquido por capilaridade. O risco é assim aumentado de modo que a amostra encontre os locais de recuperação antes que a interação com a mistura de reação seja completa, levando a um resultado errôneo, isto é, de modo que o analito esteja realmente presente na amostra, mas que não seja detectado.
[040]Segundo, a separação da mistura de reação em um recipiente torna possível ter um melhor controle da quantidade de amostra que é analisada. De fato, com um meio de diagnóstico de acordo com a invenção, é possível depositar um volume de amostra definido e específico no recipiente e garantir que todo este volume de amostra seja analisado, e isto contrário ao meio de diagnóstico divulgado por Taranova et al.. De fato, com um tal meio de diagnóstico, isto é, onde a mistura de reação está presente no suporte sólido a montante dos elementos de recuperação com respeito à direção da migração do líquido, a amostra é diretamente colocada em contado com o suporte sólido que é imerso na amostra, o líquido obtido (formado a partir da amostra e a partir da mistura de reação) instantaneamente migrando por capilaridade. Deste modo, é impossível definir especificamente o volume de líquido que migrará no suporte sólido, o que torna muito difícil, até impossível determinar o volume de amostra que é realmente analisado. Esta característica distintiva do meio de diagnóstico de acordo com a invenção torna possível reduzir os desvios padrão e assim obter uma reprodutibilidade melhorada com respeito ao meio de diagnóstico do estado da técnica. A determinação específica do volume de amostra, que é analisado também torna possível definir, mais adequadamente, a composição da mistura de reação e particularmente, da quantidade dos diferentes elementos que a compõem.
Consequentemente, a detecção ou a quantificação de um analito dado é significativa e fraca, mesmo em uma única amostra, e isto contrário ao documento de Taranova.
De fato, de acordo com o documento e como citado acima, oito locais de recuperação devem ser fornecidos no suporte sólido para detectar e quantificar um único analito.
Portanto, para a detecção e/ou quantificação fraca de um mesmo número de analitos, por exemplo quatro analitos, um suporte sólido de acordo com a invenção deve compreender 4 locais de recuperação, enquanto um suporte sólido de acordo com Taranova et al. deve compreender 32 locais de recuperação. Consequentemente, para uma mesma superfície de suporte sólido, o meio de diagnóstico de acordo com a invenção torna possível detectar e/ou quantificar 32 analitos diferentes.
[041]Terceiro, a separação da mistura de reação em um recipiente torna possível aumentar o número de componentes da mistura de reação. De fato, como descrito acima, para detectar e/ou quantificar um analito dado, um par de diagnósticos constituídos de um ligante competitivo e de uma molécula biológica de reconhecimento está presente, tal que a molécula biológica de reconhecimento seja encontrada na mistura de reação e o ligante competitivo seja ligado em pelo menos uma alocação de recuperação, ou reciprocamente. Portanto, a mistura de reação contém uma molécula de reconhecimento ou um ligante competitivo por analito.
Consequentemente, para detectar e/ou quantificar um grande número de analitos diferentes, um maior número de moléculas de reconhecimento ou ligantes competitivos diferentes deve ser adicionado na mistura de reação. Com o meio de diagnóstico do estado da técnica, como divulgado por Taranova et al., o número de componentes da mistura de reação é limitado pela superfície disponível no suporte sólido.
[042]Além disso, de acordo com a invenção, o arranjo de matriz bidimensional é definido de acordo com um sistema de coordenadas tendo uma primeira coordenada X e uma segunda coordenada Y, tal que cada local de recuperação ligado no referido suporte sólido torna possível identificar um analito separado. Esta característica também melhora significativamente a efetividade do meio de diagnóstico de acordo com a invenção fornecendo-se um meio de diagnóstico que torna possível detectar e/ou quantificar um maior número de analitos separados para uma superfície de suporte idêntica, por exemplo para melhorar a efetividade em oito vezes com respeito ao meio de diagnóstico de acordo com Taranova et al..
[043]Assim, de acordo com a invenção, para uma mesma coordenada X, vários locais de recuperação, cada um compreendendo moléculas biológicas de reconhecimento ou ligantes competitivos diferentes, são arranjados ao longo de diferentes coordenadas Y assim tornando possível detectar e/ou quantificar, para uma mesma coordenada X, vários analitos diferentes. Reciprocamente, para uma mesma coordenada Y, vários locais de recuperação, cada um compreendendo moléculas biológicas de reconhecimento ou ligantes competitivos diferentes, são arranjados ao longo de diferentes coordenadas X, assim tornando possível detectar e/ou quantificar vários analitos diferentes.
[044]Além disso, foi surpreendentemente observado que o uso de uma molécula de visualização que é detectável em fluorescência torna possível melhorar o limite de detecção do sinal, e, portanto, reduzir o risco de falso-negativos aumentando-se a sensibilidade da detecção e/ou da quantificação.
Consequentemente, com o limiar de detecção sendo mais baixo, os locais de recuperação podem ser menores, o que torna possível obter um suporte sólido que compreende mais locais de recuperação para uma superfície idêntica. Além disso, com a detecção do sinal por fluorescência sendo mais sensível, uma quantidade mais baixa de ligantes competitivos e/ou de moléculas biológicas de reconhecimento deve ser ligada aos locais de recuperação, o que fornece uma vantagem econômica significativa, mas também um ruído de fundo que é reduzido e um risco de inter- reações entre os mecanismos de detecção e/ou quantificação que é diminuído.
[045]Em conclusão, um meio de diagnóstico de acordo com a invenção fornece um maior efeito técnico com respeito ao meio de diagnóstico corrente e mais especificamente, com respeito ao meio de diagnóstico de acordo com o documento de Taranova et al..
[046]Assim, a presente invenção demonstra a compatibilidade técnica e prática de combinação em um único e mesmo meio de detecção, um número aumentado (pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15) de mecanismos de detecção e/ou quantificação. Além disso, uma praticabilidade técnica foi enfatizada, no escopo da presente invenção, de uma dosagem de analitos múltiplos que pode ser realizada prontamente, em menos do que 15 minutos, preferivelmente em 13 minutos, e em uma única e mesma etapa de análise usando uma única e mesma amostra. De fato, o meio de diagnóstico de acordo com a invenção não requer nenhuma depuração nem produção de uma etapa separada de marcação de moléculas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos com pelo menos uma molécula de visualização sendo fornecida que, de acordo com a invenção, a mistura de reação compreende moléculas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos ligados com pelo menos uma molécula de visualização.
[047]Preferivelmente, os referidos locais de recuperação ligados no referido sistema de recuperação do referido meio de diagnóstico de acordo com a invenção, são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional na forma de pontos, cada um tendo um diâmetro entre 20 µm e 2 mm, preferivelmente entre 100 µm e 500 µm, preferivelmente entre 250 µm e 400 µm.
[048]Foi demonstrado que locais de recuperação na forma de pontos, cada um tendo um diâmetro entre 20 µm e 2 mm, preferivelmente entre 100 µm e 500 µm, preferivelmente entre 250 µm e 400 µm, tornaram possível ligar pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 locais de recuperação em uma única amostra, em duas amostras ou em três amostras para detectar e/ou quantificar pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos diferentes, bem como pelo menos uma alocação de recuperação depositada em uma única amostra, em duas amostras ou em três amostras, intencionada para controlar o limiar de detecção tornando possível validar o teste e/ou a calibração para a detecção e/ou a quantificação, e isto em um sistema de recuperação tendo um tamanho razoável, para realizar a detecção e/ou a quantificação dos referidos pelo menos 15 analitos por um dispositivo de leitura óptica.
[049]Vantajosamente, os locais de recuperação ligados no referido sistema de recuperação do referido meio de diagnóstico de acordo com a invenção são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional na forma de pontos, os referidos pontos estando presentes em uma densidade entre 62500 e 6,25 pontos por cm2, preferivelmente entre 2500 e 100 pontos por cm2, preferivelmente entre 400 e 150 pontos por cm2.
[050]Preferivelmente, o arranjo de matriz de todos os locais de recuperação é menos do que ou igual a 3 cm², preferivelmente menos do que ou igual a 2 cm²,
preferivelmente menos do que ou igual a 1 cm².
[051]Vantajosamente, a primeira coordenada X é definida em um eixo longitudinal de um comprimento do referido sistema de recuperação e a segunda coordenada Y é definida em um eixo longitudinal de uma largura do referido sistema de recuperação.
[052]É razoável fornecer uma distância espacial mínima entre dois pontos que está entre 20 µm e 2 mm, preferivelmente entre 100 µm e 500 µm, preferivelmente entre 250 µm e 400 µm, de acordo com as coordenadas X e Y.
[053]Em uma modalidade particular, o referido sistema de recuperação de acordo com a invenção compreende pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 locais de recuperação separados intencionados a respectiva, simultânea e especificamente detectar e/ou quantificar pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos separados presentes em uma amostra, e pelo menos uma alocação de recuperação intencionada para um controle e/ou um calibrador.
[054]Preferivelmente, o referido controle e/ou o referido calibrador é obtido a partir de um par de ligante competitivo/molécula de reconhecimento independente, do qual a natureza intrínseca (ou sintética) significa que a molécula de controle nunca está presente na amostra (por exemplo, um anticorpo específico de uma proteína ou uma outra espécie animal diferente daquela da qual a amostra vem) ou uma proteína portadora (por exemplo, albumina sérica bovina) quimicamente modificada com um marcador sintético (por exemplo, uma biotina ou uma poli-histidina ou marcador de c- Myc).
[055]Em uma modalidade particularmente vantajosa do meio de diagnóstico de acordo com a invenção, cada um dos referidos locais de recuperação é arranjado no referido sistema de recuperação em duplicata, preferivelmente em triplicata.
Realizar duplicatas ou triplicatas torna possível também melhorar a estatística e a precisão dos resultados obtidos.
[056]Preferivelmente, o arranjo de matriz dos locais de recuperação aos quais os ligantes competitivos ou moléculas de reconhecimento são ligados, é determinado pela direção da migração do líquido, tal que uma alocação de recuperação à qual os ligantes competitivos ou moléculas biológicas de reconhecimento são ligados, intencionada a detectar e/ou quantificar um primeiro analito dado é localizada a montante de uma alocação de recuperação à qual os ligantes competitivos ou moléculas biológicas de reconhecimento são ligados, intencionada a detectar e/ou quantificar um segundo analito dado, e isto com respeito à direção da migração do líquido. Um tal arranjo de matriz também torna possível diminuir o risco de inter- reações entre os diferentes mecanismos para detectar e/ou para quantificar os analitos de interesse.
[057]Vantajosamente, o referido sistema de recuperação na forma de um suporte sólido compreende uma membrana ou um conjunto de membranas.
Preferivelmente, a membrana é uma membrana de nitrocelulose.
[058]Vantajosamente, o referido recipiente é um recipiente de vidro ou plástico.
[059]Vantajosamente, as referidas moléculas biológicas de reconhecimento são anticorpos, preferivelmente anticorpos primários, monoclonais ou policlonais, purificados ou não purificados, e/ou aptâmeros e/ou GEPIs e/ou receptores biológicos.
[060]Vantajosamente, os referidos ligantes competitivos são similares aos analitos e/ou moléculas procurados capazes de se ligarem especificamente às referidas moléculas biológicas de reconhecimento.
[061]Em uma modalidade particularmente vantajosa do meio de diagnóstico de acordo com a invenção, os referidos ligantes competitivos são selecionados do grupo constituído de substâncias medicamentosas de antibiótico, hormônio, tipo de toxina tal como Aflatoxina, vírus do tipo da Dengue, bactérias do tipo L,
monocitogenes, metais pesados, agentes adulterantes, alérgenos, e as misturas destes.
[062]Preferivelmente, a referida pelo menos uma molécula de visualização é fundida com as referidas moléculas biológicas de reconhecimento e/ou com os referidos ligantes competitivos por intermédio de uma ligação química e/ou genética.
[063]Pelos termos “ligação química e/ou genética”, é entendido no sentido da presente invenção, uma ligação da molécula de reconhecimento e/ou do ligante competitivo à molécula de visualização por intermédio de uma modificação química e/ou genética da molécula biológica de reconhecimento e/ou do ligante competitivo, estes consequentemente não estando mais no estado natural destes, mas em uma forma modificada ou em uma forma complexa.
[064]Foi demonstrado que uma tal ligação química e/ou genética da molécula de visualização às moléculas biológicas de reconhecimento e/ou aos ligantes competitivos presentes na mistura de reação torna possível também melhorar a compatibilidade técnica e prática de combinar em um único e mesmo meio para detectar e/ou quantificar um número aumentado (pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15) de mecanismos de detecção e/ou quantificação sem o funcionamento de um deles sendo capaz de interferir com o funcionamento de um dos outros mecanismos. De fato, uma mistura de reação de acordo com a invenção que tem uma tal ligação oferece a vantagem de diminuir, até remover o risco de não especificidade e de inter-reações entre as diferentes moléculas biológicas de reconhecimento e/ou os diferentes ligantes competitivos presentes na mistura de reação, e assim o risco de observar falso-positivos e/ou falso-negativos, mas também de diminuir consideravelmente a marcação residual (ruído de fundo) observada no sistema de recuperação quando uma tal ligação não está presente e de obter assim um melhor contraste entre a marcação dos elementos de recuperação e do suporte sólido não ligado (e de obter assim um melhor limiar de detecção).
[065]O documento EP1712914 recomenda, ao contrário, que nenhuma marcação por modificação química ocorra de modo a preservar, ao máximo, as funcionalidades dos receptores e anticorpos usados, e que consequentemente, as moléculas biológicas de reconhecimento sejam exploradas no estado mais natural quanto possível. Por exemplo, uma molécula biológica de reconhecimento como um receptor é rotulada usando um anticorpo, por si só reconhecido por uma proteína A (que reconhece todos os tipos de anticorpos, no geral) que é conjugada com ouro coloidal. De acordo com este documento, portanto, a proteína A, e não a molécula biológica de reconhecimento, que é ligada com ouro coloidal (a molécula de visualização).
[066]Vantajosamente, a referida ligação química e/ou genética é obtida por intermédio de pelo menos uma força eletrostática, pelo menos uma ligação peptídica, pelo menos um gene repórter, ou uma combinação destes.
[067]Em uma modalidade particular, a referida pelo menos uma molécula de visualização é selecionada do grupo constituído de isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), rodamina B e as misturas destes.
[068]Preferivelmente, os referidos analitos são selecionados do grupo consistindo em resíduos de fármacos, toxinas, vírus, bactérias, hormônios, metais pesados, agentes adulterantes, alérgenos e as misturas destes. Dentre os resíduos de fármacos, em particular antibióticos e agentes antibacterianos são encontrados.
Moléculas químicas, agentes adulterantes, indesejáveis também podem ser detectados a seguir de uma contaminação passiva por transferência do recipiente (por exemplo, a partir de um empacotamento plástico).
[069]Em uma modalidade vantajosa particular, os referidos analitos são resíduos de fármacos e são selecionados do grupo constituído de penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, aminoglicosídeos, aminociclitóis, macrolídeos, quinolonas, ionóforos, carbadox, antibióticos de nitrofurano, fenicóis, e as misturas destes.
[070]Vantajosamente, a referida amostra é obtida de leite, mel, carne, ovos, sangue total, soro, urina, ou outros líquidos biológicos.
[071]Pelos termos “líquidos biológicos”, isto significa, no sentido da presente invenção, qualquer líquido orgânico ou fluido corpóreo produzido por um organismo vivo.
[072]Preferivelmente, a referida amostra é obtida a partir do leite. Foi observado que a detecção de analitos é mais sensível, quando a amostra analisada é obtida a partir do leite, e esta, como os componentes do leite, satura a membrana de nitrocelulose e assim diminuir o ruído de fundo.
[073]Especificamente, de acordo com a invenção, a detecção e/ou quantificação respectiva, simultânea e especificamente de uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra é realizada por meio de um dispositivo de leitura óptica.
[074]Em uma modalidade particular de acordo com a invenção, os locais de recuperação são arranjados de acordo com um arranjo de matriz tridimensional. Um tal arranjo de matriz tridimensional torna possível ser arranjado entre um maior número de locais de recuperação em um suporte sólido tendo uma superfície similar e, portanto, detectar e/ou quantificar um maior número de analitos de interesse, respectiva e simultaneamente.
[075]Vantajosamente, o arranjo de matriz tridimensional é definido de acordo com um sistema de coordenadas tendo uma primeira coordenada (X) definida em um eixo longitudinal de um comprimento do referido sistema de recuperação, uma segunda coordenada (Y) definida em um eixo longitudinal de uma largura do referido sistema de recuperação e uma terceira coordenada (Z) definida em um eixo longitudinal de uma profundidade do referido sistema de recuperação. Neste caso, a direção da migração do líquido (compreendendo a amostra e a mistura de reação) é definida de acordo com o referido sistema de coordenadas que define o arranjo de matriz dos locais de recuperação ligado no sistema de recuperação de acordo com a invenção e é feita consequentemente de acordo com uma coordenada X, uma coordenada Y e uma coordenada Z.
[076]Outras modalidades do meio de diagnóstico de acordo com a invenção são indicadas nas reivindicações anexas.
[077]A invenção também é fundamentada em um método para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida compreendendo as etapas seguintes: - contatar uma mistura de reação de um meio de diagnóstico de acordo com a invenção com a amostra para obter um líquido; - incubar em uma temperatura entre 0 e 70 °C, preferivelmente entre 10 e 60 °C, preferivelmente entre 20 e 50 °C, preferivelmente entre 20 e 40 °C, preferivelmente entre 25 e 35 °C, preferivelmente 30 °C, por uma duração menor do que ou igual a 15 minutos, preferivelmente menor do que ou igual a 10 minutos, preferivelmente menor do que ou igual a 5 minutos, preferivelmente menor do que ou igual a 3 minutos, preferivelmente igual a 3 minutos; - imergir uma extremidade de um sistema de recuperação de um meio de diagnóstico de acordo com a invenção no líquido; - incubar em uma temperatura entre 0 e 70 °C, preferivelmente entre 10 e 60 °C, preferivelmente entre 20 e 50 °C, preferivelmente entre 20 e 40 °C, preferivelmente entre 25 e 35 °C, preferivelmente 30 °C, por uma duração menor do que ou igual a 15 minutos, preferivelmente menor do que ou igual a 10 minutos, preferivelmente igual a 10 minutos; e - interpretar qualitativa e/ou quantitativamente o resultado no sistema de recuperação por meio de um dispositivo óptico.
[078]O método de acordo com a invenção é fundamentado em tecnologias microfluídicas e imunocromatográficas.
[079]A invenção também visa um conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra compreendendo um meio de diagnóstico de acordo com a invenção, e compreende ainda um dispositivo para ler opticamente um suporte sólido removível, compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido; - uma unidade óptica para analisar o referido suporte sólido e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir de acordo com uma intensidade de emissão e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico para fornecer uma imagem de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de comunicação para obter um item de informação em relação a um suporte sólido; - meio de seleção para: ◦ selecionar a partir de uma lista de analitos predefinidos correspondendo aos referidos locais de recuperação ligados no suporte sólido, uma seleção de analitos a serem detectados e/ou a serem quantificados para a referida amostra a partir de um mesmo suporte sólido; - meio de processamento de imagem da referida imagem para: ◦ determinar, a partir da informação se referindo ao referido suporte sólido a ser lido, um número finito de submontagens da referida imagem, cada submontagem correspondendo a um analito; ◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos, uma intensidade de submontagem; ◦ determinar, com base na referida intensidade de submontagem, a informação do analito a partir da referida amostra para cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos; - meio de transmissão configurado para transmitir a referida informação do analito a partir da referida amostra analisada quanto a cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos.
[080]Um tal dispositivo de acordo com a invenção torna possível ler as zonas a serem testadas, em particular com uma medição de fluorescência instantânea ou preferivelmente, com uma medição da luz refletida a partir das zonas a serem testadas. De modo a tornar possível uma seleção de analitos a serem testados correspondendo às zonas de interesse em um bastão, um tal dispositivo propõe, graças ao acesso a um método contendo informação se referindo a um bastão, uma seleção de uma lista de analitos a serem testados. De fato, é útil selecionar os analitos a serem testados antes da obtenção dos mesmos, os resultados de modo a alvejar corretamente os analitos, dos quais é necessário conhecer os resultados de um teste de modo a não expor um usuário a uma quantidade de resultados que seja muito grande. Fornecer acesso a uma quantidade de resultados que é muito grande a um usuário não necessariamente precisa estar exposto ao risco de uma perda de objetividade com respeito à intenção da análise inicial destes. Assim, um tal dispositivo da invenção, graças ao meio de seleção, torna possível selecionar os analitos a serem testados pelo usuário antes de ler o bastão. O meio de seleção, em comunicação com o meio de processamento de imagem torna possível que o meio de processamento de imagem, determine a informação dos analitos selecionados apenas.
[081]Uma vantagem de usar o leitor óptico da invenção para realizar um diagnóstico contendo uma seleção de analitos de interesse é que ele não requer uma primeira seleção de diferentes tipos de tiras a serem testadas, nem a colocação em contato de cada uma destas tiras com o produto a ser testado, depois a alocação deste no leitor óptico. Todo isto torna possível evitar um manejo significativo das tiras a serem testadas, caro ao longo do tempo e manejo do estoque. Isto também torna possível que uma análise mais simples, mais rápida e mais alvejada dos analitos a serem testados, apenas tenha resultados selecionados da leitura da tira pelo leitor óptico da invenção.
[082]Vantajosamente, a seleção de analitos é uma seleção de vários analitos.
[083]Preferivelmente, o dispositivo óptico compreende ainda: - meio que torna possível ler um perfil de seleção; e o referido meio de seleção é configurado para realizar a referida seleção de analitos com base no referido perfil de seleção.
[084]Vantajosamente, cada submontagem do referido número finito de submontagens da referida imagem determinada pelo meio de processamento de imagem corresponde à referida seleção de analitos, preferivelmente a cada analito selecionado.
[085]Preferivelmente, o referido meio de processamento de imagem é configurado para determinar, além disso, o referido número finito de submontagens da referida imagem do referido perfil de seleção.
[086]Vantajosamente, a referida primeira fonte de luz é configurada para emitir diretamente o referido primeiro feixe de luz diretamente à referida alocação, preferivelmente diretamente aos referidos locais de recuperação ligados no suporte sólido.
[087]Preferivelmente, o referido suporte sólido compreende locais de recuperação na forma de pontos, cada um tendo um diâmetro entre 20 µm e 2 mm, preferivelmente entre 100 µm e 500 µm, preferivelmente entre 250 µm e 400 µm.
[088]A invenção também é fundamentada em um conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra compreendendo um meio de diagnóstico de acordo com a invenção e compreende ainda um dispositivo de leitura óptica de um suporte sólido removível, compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido; - uma unidade óptica para analisar o referido suporte sólido e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir de acordo com uma intensidade de emissão e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sensor de intensidade luminosa para medir a intensidade de emissão emitida pela referida primeira fonte de luz; ◦ um meio de retroalimentação para modular a referida intensidade de emissão da referida primeira fonte de luz de acordo com a intensidade de emissão medida pelo referido sensor de intensidade luminosa tal que a referida primeira fonte de luz emite uma intensidade alvo; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico para fornecer uma imagem de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de processamento de imagem da referida imagem para: ◦ determinar um número finito de submontagens da referida imagem,
◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem, uma intensidade de submontagem, e - meio de transmissão para transmitir um item de informação se referindo à referida intensidade de submontagem para cada submontagem.
[089]Um tal dispositivo óptico de acordo com a invenção torna possível ler as zonas a serem testadas, em particular com uma medição de fluorescência instantânea ou preferivelmente, com uma medição da luz refletida a partir das zonas a serem testadas. Quando uma técnica de fluorescência ou uma técnica de luz refletida é usada para ler as zonas a serem testadas (ou pontos), um meio de retroalimentação torna possível garantir uma intensidade luminosa de excitação sempre igual, que torna possível uma medição de fluorescência instantânea ou reflexão confiável, qualquer que seja a temperatura, a fonte de energia usada ou também a duração do uso e o envelhecimento da fonte de luz. O uso do meio de retroalimentação torna possível garantir uma fonte de luz tendo uma intensidade constante ao longo do tempo e predefinida. Uma fonte de energia luminosa tendo uma intensidade predefinida torna possível, em particular, garantir resultados quantitativos confiáveis. O meio de retroalimentação é preferivelmente um meio de retroalimentação eletrônico. Por exemplo, o sensor de intensidade luminosa é um fotodiodo.
[090]A invenção também visa um conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra compreendendo uma unidade de diagnóstico de acordo com a invenção e compreende ainda um dispositivo para ler opticamente um suporte sólido removível, compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido; - uma unidade óptica para analisar o referido suporte sólido e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir, de acordo com uma intensidade de emissão e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico bidimensional para fornecer uma imagem bidimensional de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de processamento de imagem da referida imagem bidimensional para: ◦ detectar as zonas de referência da referida imagem bidimensional, ◦ determinar um número finito de submontagens da referida imagem bidimensional, ◦ posicionar na referida imagem bidimensional, cada submontagem em uma posição predeterminada com respeito às referidas zonas de referência, ◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem, uma intensidade de submontagem, e - meio de transmissão configurado para transmitir a referida intensidade de submontagem para cada submontagem.
[091]Um tal dispositivo óptico de acordo com a invenção torna possível ler simultaneamente um grande número de pontos graças a um detector óptico bidimensional e ao meio de processamento de imagem e determinação, tornando possível ler a informação do analito para cada um dos pontos. A imagem bidimensional compreende submontagens, porções, regiões de interesse, zonas de interesse ou também porções de imagem. Preferivelmente, as submontagens de uma imagem bidimensional compreendem uma pluralidade de pixels. Preferivelmente, cada submontagem compreende pelo menos 20 pixels, preferivelmente mais do que 50 pixels e também mais preferivelmente, mais do que 200 pixels.
[092]A vantagem de um tal dispositivo de acordo com a invenção é ser capaz de realizar um diagnóstico por uma leitura de fluorescência contínua evitando-se um ruído de fundo máximo causado pela fonte de luz.
[093]Uma outra vantagem de um tal dispositivo de leitura óptica da invenção é tornar possível ler opticamente um grande número de regiões de interesse presentes em um único e mesmo bastão. No caso de um tal dispositivo óptico de acordo com a invenção, a leitura de um grande número de regiões de interesse não requer fornecer alocações para vários bastões. Usando vários bastões em um mesmo leitor óptico para uma leitura simultânea de vários bastões de modo a abranger um grande número de regiões de interesse com um mesmo sensor óptico sendo uma fonte de alocação incorreta e de compensação de regiões de interesse de uma medição para outra e isto, para cada um dos bastões inseridos no leitor óptico.
[094]A invenção também é fundamentada em um conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra compreendendo um meio de diagnóstico de acordo com a invenção e compreendendo ainda um dispositivo para ler opticamente um suporte sólido removível, compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido; - um dispositivo de identificação para identificar um suporte sólido a ser lido; - meio de comunicação para acessar uma base de dados dos métodos se referindo ao referido suporte sólido a ser lido para obter um item de informação se referindo a um suporte sólido; - uma unidade óptica, para analisar o referido suporte sólido com base em parâmetros de análise compreendidos na referida informação se referindo a um suporte sólido e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir, de acordo com uma intensidade de emissão, e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico para fornecer uma imagem de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de processamento de imagem da referida imagem para: ◦ ler na informação se referindo ao referido suporte sólido a ser lido, um item de informação se referindo a um número finito de submontagens da referida imagem; ◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem, uma intensidade de submontagem, e ◦ determinar com base na referida intensidade de submontagem e com base na informação se referindo ao referido suporte sólido a ser lido, informação do analito para cada submontagem; - meio de transmissão configurado para transmitir a referida informação do analito para cada submontagem.
[095]O dispositivo de leitura óptica de acordo com a invenção torna possível ler opticamente um bastão para a análise de uma amostra com uma seleção de método de leitura automático. O método de leitura preferivelmente compreendendo dados se referindo a: uma versão do método, um número de lote, um prazo de validade, um tipo de fonte de luz usada, o tipo da zona de interesse (linha ou ponto), método para análise qualitativa (binária) ou quantitativa, parâmetros de aquisição de imagem (tempo de exposição, ganho, etc.), as posições com respeito a pontos de referência (por exemplo, de acordo com coordenadas cartesianas), várias zonas de interesse, várias réplicas por analito, a organização de matriz das zonas de interesse no suporte sólido móvel, as dimensões das zonas de interesse (por exemplo, um raio), uma dimensão se referindo a uma zona em torno de uma zona de interesse a ser considerada para considerar os fundamentos, parâmetros de calibração do tipo de interpolação de dados ou tornar possível uma análise quantitativa de uma amostra e finalmente, a designação das zonas de interesse de acordo com o analito de modo que se torne possível detectar e/ou quantificar.
[096]Outras modalidades do conjunto de diagnóstico de acordo com a invenção são indicadas nas reivindicações anexas.
[097]A invenção também visa um uso de um meio de diagnóstico de acordo com a invenção para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos diferentes.
[098]A invenção também visa um uso de um conjunto de diagnóstico de acordo com a invenção, para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos diferentes.
[099]Outras modalidades de uso do meio de diagnóstico e do conjunto de diagnóstico de acordo com a invenção são indicadas nas reivindicações anexas.
[0100]Outras características, detalhes e vantagens da invenção emergirão da descrição fornecida abaixo, em uma maneira não limitante e fazendo-se referência aos desenhos anexos.
Descrição das figuras
[0101]A Figura 1a é uma vista esquemática de um meio de diagnóstico de acordo com o documento EP1712914.
[0102]A Figura 1b é uma vista esquemática de um meio de diagnóstico de acordo com o documento de Taranova et al..
[0103]A Figura 2 é uma vista esquemática de um meio de diagnóstico de acordo com a invenção.
[0104]A Figura 3 é uma vista esquemática que ilustra em detalhe, um sistema de recuperação de acordo com a invenção.
[0105]Nas figuras, os elementos idênticos ou similares têm as mesmas referências.
[0106]A Figura 1a representa um meio de diagnóstico 1 de acordo com o documento EP1712914 e ilustra a alocação dos elementos de recuperação 4 1, 42, 43 e 5 em um sistema de recuperação 3 na forma de um suporte sólido de nitrocelulose no caso da dosagem simultânea de β-lactamas 41, tetraciclinas 42 e sulfadimetoxina 43, uma zona de controle ligada 5 também sendo fornecida, com respeito a uma direção da migração M. De acordo com este documento, a mistura de reação 2 é fornecida em um recipiente separado com o qual uma amostra E a ser testada é colocada em contado.
[0107]A Figura 1b representa um meio de diagnóstico 1 de acordo com o documento de Taranova et al. e ilustra a alocação dos elementos de recuperação 41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, em um sistema de recuperação 3 na forma de um suporte sólido de nitrocelulose no caso da dosagem simultânea de anfetaminas (41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h), de benzoilecgonina (42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h), de metanfetaminas (43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h) e de morfina (44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h). Os elementos de recuperação 4 são ligados na forma de pontos de acordo com um arranjo de matriz bidimensional. De acordo com Taranova et al., a mistura de reação 2 está presente no referido sistema de recuperação 3, em uma forma liofilizada, a montante dos referidos elementos de recuperação 4 ligados no referido sistema de recuperação 3 com respeito a uma direção da migração M de um líquido compreendendo a amostra E a ser testada na mistura de reação 2. De acordo com este documento, os elementos de recuperação arranjados em uma mesma fileira, isto é, tendo a mesma coordenada Y, são específicos do mesmo analito.
[0108]A Figura 2 representa um meio de diagnóstico 1 de acordo com a invenção e ilustra a alocação dos elementos de recuperação 4 e 5 em um sistema de recuperação 3 na forma de um suporte sólido com respeito a uma direção da migração M, os elementos de recuperação 4 e 5 sendo ligados na forma de pontos de acordo com um arranjo de matriz bidimensional. De acordo com a invenção, a mistura de reação 2 é fornecida em um recipiente separado com o qual uma amostra E a ser testada é colocada em contado para obter um líquido, antes de imergir o sistema de recuperação 3 no líquido obtido.
[0109]A Figura 3 ilustra em detalhe, o sistema de recuperação 3 de acordo com a invenção no qual os locais de recuperação 4 e 5 são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional na forma de pontos tendo um diâmetro definido, cada um dos pontos sendo separados por uma distância mínima. O arranjo de matriz bidimensional é definido de acordo com um sistema de coordenadas (X; Y) que tem uma primeira coordenada X definida em um eixo longitudinal (AL) de um comprimento (L) do referido sistema de recuperação 3 e uma segunda coordenada Y definida em um eixo longitudinal (Al) de uma largura (l) do referido sistema de recuperação 3. De acordo com uma modalidade preferida, o sistema de recuperação 3 compreende pelo menos 12 locais de recuperação separados (41 a 412) intencionados a detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente pelo menos 12 analitos de classes separadas presentes em uma amostra E e pelo menos três locais de recuperação 5 intencionados para um controle do limiar de detecção ou sendo usados como um calibrador. Além disso, cada um dos locais de recuperação (41 a 412 e 51-53) é arranjado em duas amostras (41A; 41B a 412A; 412B).
[0110]É entendido que a presente invenção não é de modo algum limitada às modalidades descritas acima e que modificações podem ser aplicadas às mesmas sem se afastar do escopo das reivindicações anexas.
Modalidades de acordo com a invenção - Exemplos Exemplo 1: Exemplo da composição de um tampão para a mistura de reação e exemplo de um método para preparar a mistura de reação Tabela 1: Sais e aditivos Concentração final (nM) TRIS 20 a 25 HEPES 3 a 10 NaCl 4a8 MgCl2 0a2 Açúcar 50 a 100 BSA 0a1 Glicerol 10 a 30 Tween 0a1
[0111]A este tampão são adicionados moléculas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos. Depois de incubar a mistura por uma noite a 4 °C, esta é liofilizada. Durante a realização do teste, 250 µl de amostra a ser testada serão adicionados à mistura de reação assim obtida.
Exemplo 2: Exemplo de ligação de moléculas de reconhecimento ao fluoróforo rodamina B
[0112]Receptores “Beta” e “Tetra” e oligonucleotídeos de DNA são obtidos de acordo com o método descrito em EP1712914A1.
[0113]Anticorpos monoclonais são purificados na coluna de proteína A ou proteína G de acordo com a espécie e do isótipo. Os anticorpos depois são armazenados a -20 °C no tampão de fosfato a 10 mM NaCl a 140 mM pH 7,4.
[0114]A rodamina B usada tem um resíduo de ésteres N- hidroxissuccinimidílicos (NHS) que tem a particularidade de reagir com os grupos amina de proteínas com um pH básico.
[0115]As moléculas de reconhecimento (anticorpos e/ou receptores) são dialisadas por uma noite em um tampão de carbonato a 50 mM pH 8,5.
[0116]O fluoróforo é dissolvido em DMF em 5 mg/ml.
[0117]A molécula de reconhecimento e o fluoróforo (a molécula de visualização) são reunidos em uma razão molar em torno de 1/4 por uma hora longe da luz.
[0118]Finalmente, a reação química é interrompida durante a diálise complexa com um tampão de fosfato a 10 mM pH 7,4.
[0119]Outros tipos de ligações químicas podem ser obtidos, com fluorocromos tendo um grupo maleimida ou carboxila.
[0120]Outros tipos de fluoróforos podem ser usados, tais como FITC, Alexa, DyLight, etc.
[0121]A ligação das moléculas de reconhecimento também pode ser realizada com nanopartículas colorimétricas (nanopartículas de ouro, látex, carbono, etc.), tanto por ligação covalente, quanto por adsorção eletrostática.
Exemplo 3: Exemplo de composição da mistura de reação e exemplo de elementos de recuperação ligados no sistema de recuperação Tabela 2: Canai Moléculas da Ligantes Classe Família Analitos s mistura de ligados no detectado reação sistema de s recuperação CTL1 Anticorpo de Antígeno de controle controle / controle 1 controle 1 BETA Receptor beta βlactamas βlactamas antibióticos 27 CEFA Anticorpo cefalexina βlactamas antibióticos 2 monoclonal anti- cefalexina
TETR Receptor oligonucleotíde tetraciclinas antibióticos 10 A tetra os de DNA SULF Anticorpo sulfonamidas sulfonamidas antibióticos 20 A anti- sulfonamida SDX Anticorpo sulfadoxina sulfonamidas antibióticos 1 anti- sulfadoxina QUIN Anticorpos fluoroquinolona fluoroquinolona agentes 20 O anti- s s antibacterianos fluoroquinolon a CAP Anticorpo cloranfenicol fenicóis antibióticos 1 anti- cloranfenicol MELA Anticorpo melamina melamina agente adulterante 4 anti-melamina AFLA Anticorpo aflatoxinaM1 micotoxinas toxinas 2 anti- aflaxotinaM1 CTL2 Anticorpo de Antígeno de controle controle / controle 2 controle 2 COLI Anticorpo colistina polimixinas antibióticos 1 anti-colistina NEO Anticorpo neomicina aminoglicosíde antibióticos 2 anti- os neomicina GEN1 Anticorpo gentamicin aminoglicosíde antibióticos 2 anti- os gentamicina STR Anticorpo estreptomicina aminoglicosíde antibióticos 2 anti- os estreptomicin a TYLO Anticorpo tilosina macrolídeos antibióticos 2 anti-tilosina LINC Anticorpo lincosamidas sulfonamidas antibióticos 3 O anti- lincosamida SPIRA Anticorpo espiramicina macrolídeos antibióticos 2 anti- espiramicina ERY Anticorpo eritromicina macrolídeos antibióticos 3 anti- eritromicina CTL1 Anticorpo de Antígeno de controle controle / controle 3 controle 3 TOTA 104 analitos detectados e distinguidos por intermédio de 17 canais
L Exemplo 4: Exemplo de realização do teste e resultados obtidos
[0122]Uma amostra de leite é colocada em contado com a mistura de reação (compreendendo o tampão e as moléculas de reconhecimento e/ou os ligantes competitivos em forma liofilizada) por 3 minutos a 30 °C. Depois, a extremidade a montante da direção da migração do sistema de recuperação é imersa na solução (compreendendo a amostra e a mistura de reação). Depois de uma incubação de 10 minutos a 30 °C, a leitura dos resultados é realizada usando um dispositivo óptico.
[0123]Os resultados são esboçados na Tabela 3.
Tabela 3: Canais Concentrações Concentração Sinal (unidade arbitrária) Interpretação alvejadas pelo (ppb; µg/kg) instrumental teste (ppb; µg/kg) BETA ≥4 2 1,04 negativo 4 0,68 positivo CEFA ≥2 1 1,09 negativo 2 0,64 positivo TETRA ≥50 30 1,10 negativo 50 0,71 positivo SULFA ≥100 50 1,08 negativo 100 0,71 positivo SDX ≥100 50 1,08 negativo 100 0,69 positivo QUINO ≥20 10 1,29 negativo 20 0,69 positivo CAP ≥0,3 0,2 1,01 negativo 0,3 0,84 positivo MELA ≥15 10 1,11 negativo
15 0,86 positivo
AFLA ≥0,3 0,1 1,05 negativo
0,3 0,93 positivo
COLI ≥25 20 1,14 negativo
25 0,72 positivo
NEO ≥1200 900 1,04 negativo
1200 0,69 positivo
GEN ≥80 60 1,03 negativo
80 0,68 positivo
STR ≥200 150 1,05 negativo
200 0,68 positivo
TYLO ≥40 30 1,14 negativo
40 0,80 positivo
LINCO ≥80 60 1,08 negativo
80 0,66 positivo
SPIRA ≥50 30 1,05 negativo
50 0,79 positivo
ERY ≥20 10 1,23 negativo
20 0,73 positivo
Claims (15)
1. Meio de diagnóstico imunocromatográfico (1) para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida (E), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: - pelo menos uma mistura de reação (2) contendo moléculas biológicas de reconhecimento e/ou ligantes competitivos rotulados com pelo menos uma molécula de visualização; e - pelo menos um sistema de recuperação (3) na forma de um suporte sólido ao qual são ligados ligantes competitivos e/ou moléculas biológicas de reconhecimento em locais de recuperação distintos e conhecidos (4 e 5) que são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional, de modo a identificar, pela localização dos referidos locais de recuperação (4 e 5) no referido suporte, os referidos analitos presentes na referida amostra (E), o referido meio de diagnóstico (1) sendo caracterizado em que, a) o referido arranjo de matriz bidimensional é definido de acordo com um sistema de coordenadas tendo uma primeira coordenada (X) e uma segunda coordenada (Y) com, para uma mesma coordenada X, vários locais de recuperação, cada um compreendendo moléculas biológicas de reconhecimento ou ligantes competitivos diferentes, arranjados ao longo de diferentes coordenadas Y e, para uma mesma coordenada Y, vários locais de recuperação, cada um compreendendo moléculas biológicas de reconhecimento ou ligantes competitivos diferentes, arranjados ao longo de diferentes coordenadas X; b) para a detecção e/ou a quantificação de um analito dado, um par de diagnóstico consistindo em um ligante competitivo e uma molécula biológica de reconhecimento está presente, tal que a referida molécula biológica de reconhecimento é encontrada na referida mistura de reação (2) e o referido ligante competitivo é ligado em pelo menos um local de recuperação (4) ou reciprocamente; c) a referida pelo menos uma molécula de visualização é uma molécula que é detectável em fluorescência; e d) a referida mistura de reação (2) está presente em um recipiente, o referido recipiente sendo separado do referido sistema de recuperação (3).
2. Meio de diagnóstico (1), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos locais de recuperação (4 e 5) são arranjados de acordo com um arranjo de matriz bidimensional na forma de pontos, cada um tendo um diâmetro entre 20 µm e 2 mm, preferivelmente entre 100 e 500 µm, preferivelmente entre 250 e 400 µm.
3. Meio de diagnóstico (1), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de recuperação (3) compreende pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 locais de recuperação distintos (4), intencionados a detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos distintos presentes em uma amostra, e pelo menos um local de recuperação intencionado para um controle e/ou um calibrador.
4. Meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de recuperação (3) na forma de um suporte sólido compreende uma membrana ou um conjunto de membranas.
5. Meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida pelo menos uma molécula de visualização é fundida às referidas moléculas biológicas de reconhecimento e/ou aos referidos ligantes competitivos por intermédio de uma ligação química e/ou genética.
6. Meio de diagnóstico (1), de acordo com a reivindicação 5,
CARACTERIZADO pelo fato de que a referida ligação química e/ou genética é realizada por intermédio de pelo menos uma força eletrostática, pelo menos uma ligação peptídica, pelo menos um gene repórter, ou uma combinação destes.
7. Meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos analitos são selecionados do grupo consistindo em resíduos de fármacos, toxinas, vírus, bactérias, hormônios, metais pesados, agentes adulterantes, alérgenos e as misturas destes.
8. Meio de diagnóstico (1), de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos analitos são resíduos de fármacos e são selecionados do grupo consistindo em penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, aminoglicosídeos, aminociclitóis, macrolídeos, quinolonas, ionóforos, carbadox, antibióticos de nitrofurano, fenicóis, e as misturas destes.
9. Meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que os locais de recuperação (4 e 5) são arranjados de acordo com um arranjo de matriz tridimensional.
10. Método para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente uma pluralidade de analitos presentes em uma amostra essencialmente líquida (E), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas seguintes: - contatar uma mistura de reação de um meio de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 com a amostra (E) para obter um líquido; - incubar em uma temperatura entre 0 e 70 °C, por uma duração menor do que ou igual a 15 minutos; - imergir uma extremidade de um sistema de recuperação de um meio de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 no líquido; - incubar em uma temperatura entre 0 e 70 °C, por uma duração menor do que ou igual a 15 minutos; e
- interpretar qualitativa e/ou quantitativamente o resultado no sistema de recuperação por meio de um dispositivo óptico.
11. Conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra (E) compreendendo um meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que ele compreende ainda um dispositivo para ler opticamente um suporte sólido removível (3), compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido (3); - uma unidade óptica para analisar o referido suporte sólido (3) e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir de acordo com uma intensidade de emissão e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico para fornecer uma imagem de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de comunicação para obter um item de informação em relação a um suporte sólido (3); - meio de seleção para: ◦ selecionar a partir de uma lista de analitos predefinidos correspondendo aos referidos locais de recuperação ligados no suporte sólido (3), uma seleção de analitos a serem detectados e/ou a serem quantificados para a referida amostra a partir de um mesmo suporte sólido (3); - meio de processamento de imagem da referida imagem para: ◦ determinar, a partir da informação se referindo ao referido suporte sólido (3)
a ser lido, um número finito de submontagens da referida imagem, cada submontagem correspondendo a um analito; ◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos, uma intensidade de submontagem; ◦ determinar, com base na referida intensidade de submontagem, informação do analito a partir da referida amostra para cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos; - meio de transmissão configurado para transmitir a referida informação do analito a partir da referida amostra analisada quanto a cada submontagem correspondendo a um analito selecionado na referida seleção de analitos.
12. Conjunto de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo óptico compreende ainda: - meio que torna possível ler um perfil de seleção; e em que, o referido meio de seleção é configurado para realizar a referida seleção de analitos com base no referido perfil de seleção.
13. Conjunto de diagnóstico para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra (E) compreendendo um meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que ele compreende ainda um dispositivo para ler opticamente um suporte sólido removível, compreendendo: - uma alocação para receber o referido suporte sólido (3); - uma unidade óptica para analisar o referido suporte sólido (3) e compreendendo: ◦ uma primeira fonte de luz para emitir de acordo com uma intensidade de emissão e em uma primeira faixa de comprimento de onda, um primeiro feixe de luz à referida alocação; ◦ um sensor de intensidade luminosa para medir a intensidade de emissão emitida pela referida primeira fonte de luz; ◦ um meio de retroalimentação para modular a referida intensidade de emissão da referida primeira fonte de luz de acordo com a intensidade de emissão medida pelo referido sensor de intensidade luminosa tal que a referida primeira fonte de luz emite uma intensidade alvo; ◦ um sistema imagiológico compreendendo um detector óptico para fornecer uma imagem de uma zona de visualização, a referida zona de visualização compreendendo pelo menos uma porção da referida alocação; ◦ um filtro para filtrar uma faixa de comprimento de onda definida, e posicionado entre a alocação e o referido sistema imagiológico; - meio de processamento de imagem da referida imagem para: ◦ determinar um número finito de submontagens da referida imagem, ◦ fornecer dados se referindo às intensidades luminosas vindo das referidas submontagens; - meio de determinação para: ◦ calcular, para cada submontagem, uma intensidade de submontagem, e - meio de transmissão para transmitir um item de informação se referindo à referida intensidade de submontagem para cada submontagem.
14. Uso de um meio de diagnóstico (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de ser para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente os analitos presentes em uma amostra (E), preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 analitos pertencentes às classes separadas, que formam parte das famílias de analitos, que são diferentes ou não.
15. Uso de um conjunto de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de ser para detectar e/ou quantificar respectiva, simultânea e especificamente classes de analitos presentes em uma amostra (E), preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 10,
preferivelmente pelo menos 15 analitos pertencentes às classes separadas, que formam parte das famílias de analitos, que são diferentes ou não.
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