BR112020005552A2

BR112020005552A2 - composições de células compreendendo células t específicas de antígeno para terapia adotiva

Info

Publication number: BR112020005552A2
Application number: BR112020005552-2A
Authority: BR
Inventors: Mathias Oelke; Kristi JONES; Sojung Kim; Lauren SUAREZ; Ken Carter; Scott CARMER; Dan BEDNARIK
Original assignee: Neximmune, Inc.
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2020-10-27
Also published as: JP7475684B2; IL273452A; EP3684402A1; CN111629748A; US20230399613A1; KR20200104283A; SG11202002523YA; RU2020113627A3; JP2020534313A; MX2020003129A; EP3684402A4; RU2020113627A; US20190119639A1; CA3076490A1; AU2018337960A1; WO2019060558A1

Abstract

  A presente invenção fornece uma composição de célula isolada adequada para imunoterapia adotiva, assim como métodos de fabricação das composições de células e métodos de tratamento com as composições de células. A composição compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável, pelo menos cerca de 106 células T CD8+ específicas para antígeno(s) de peptídeo de alvo. Em várias modalidades, a composição é predominantemente de células T CD8+ e pelo menos cerca de 20% de células T na composição exibem um fenótipo de memória central ou efetora, fornecendo uma terapia adotiva robusta e durável de um repertório de célula T natural que sofreu seleção natural.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES CELULARES COMPREENDENDO CÉLULAS T ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO PARA TERAPIA ADOTIVA".

PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/561.044, depositado em 20 de setembro de 2017, e o benefício do Pedido Provisório US 62/656.679, depositado em 12 de abril de 2018, cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[002] Imunoterapias adotivas, como infusões de linfócitos de doadores, são usadas para o tratamento da recidiva de leucemia após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) para melhorar o efeito do enxerto contra leucemia (GVL). Essas abordagens geralmente levam vários meses para funcionar; e requerem doses muito grandes de células, o que resulta em um risco substancial de doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD). Ver, McLaughlin L, et al., Adoptive T-cell therapies for refractory/relapsed leukemia and Iymphoma; current strategies and recent advances. Ther. Adv. Hematol. 2015 vol. 6 (6) 295-

307.

[003] Com as opções terapêuticas atuais, o resultado para pacientes com leucemia recidiva, por exemplo, após o HSCT, é difícil. Embora as terapias com células adotivas possam proporcionar algum benefício, o número de células específicas de alvo que podem ser fornecidas geralmente é insuficiente e altamente variável, e é difícil ativar e expandir as populações de células T naive de linfócitos doadores ex vivo, especialmente com relação aos precursores de CTL específicos para o câncer que são frequentemente extremamente baixos e até indetectáveis no sangue periférico de indivíduos saudáveis. Quintarelli C, et al., Cytotoxic T Iymphocytes directed to the preferentially expressed antigens of melanoma (PRAME) target chronic myeloid leukemia. Blood 2008; 112: 1876-1885. Além disso, as terapias celulares, tais como células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e terapias de células exterminadoras naturais tendem a induzir fenótipos celulares esgotados que não são suficientemente robustos e/ou têm persistência limitada in vivo, e podem exibir toxicidade alvo fora do tecido. Ver, Cruz e Bollard, T-cell and natural killer cell therapies for hematological — malignancies — after — hematopoietico stem cell transplantation; —enhancing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica 2015; 100 (6) 709-719. Além disso, essas terapias geralmente têm flexibilidade limitada devido ao alvo único projetado.

[004] As composições celulares são necessárias para fornecer opções de imunoterapia adotiva mais eficazes e seguras, inclusive para pacientes que sofrem de leucemia ou linfoma (incluindo leucemia aguda ou crônica), bem como outros pacientes que poderiam se beneficiar da imunoterapia adotiva. Em vários aspectos e modalidades, a presente invenção atende a essas necessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Em vários aspectos e modalidades, a invenção fornece uma composição celular isolada adequada para imunoterapia adotiva, bem como métodos de fabricação das composições celulares e métodos de tratamento com as composições celulares. A composição compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável, pelo menos cerca de 10º células T CD8+ específicas para o(s) antígeno(s) peptídico(s) alvo. Em várias modalidades, a composição é predominantemente células T CD8+, e pelo menos cerca de 20% das células T na composição exibem um fenótipo de memória central ou efetora, proporcionando uma terapia adotiva robusta e durável a partir de um repertório de células T naturais que foi submetido à seleção natural. À composição celular não compreende células T que expressam um receptor de antígeno quimérico ou um TCR recombinante e, portanto, em várias modalidades, fornece uma alternativa para essas tecnologias que geralmente produzem fenótipos de células T mais esgotados e respostas menos duráveis e maiores toxicidades.

[006] Em várias modalidades, a composição celular compreende pelo menos cerca de 107 células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo alvo, ou pelo menos cerca de 108, pelo menos cerca de 10º ou pelo menos cerca de 10*º células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo alvo, para fornecer destruição robusta das células alvo e uma longa persistência in vivo. Por exemplo, para o tratamento da leucemia mieloide aguda (AML) ou síndrome mielodisplásica, a composição celular pode compreender células T específicas para os antígenos de peptídeo WT1, PRAME, Survivin e Cyclin A1.

[007] Em várias modalidades, as células T na composição (e/ou células T específicas para os antígenos-alvo) são pelo menos cerca de 50% de células T de memória central ou efetoras, ou em algumas modalidades são pelo menos cerca de 70% de memória central ou efetoras ou pelo menos cerca de 80% de células T de memória central ou efetora. Em algumas modalidades, as células de memória são de cerca de 25:75 a cerca de 75:25 de células de memória centrais para efetoras. A composição celular compreende menos de cerca de 20% de células T de memória terminalmente diferenciada (por exemplo, células Temra) € não mais que cerca de 20% de células puras. Em algumas modalidades, a composição celular compreende de cerca de 5 a cerca de 25% de células tronco de memória T (Tscm). Este fenótipo de célula pode ser criado e/ou controlado usando um processo de enriquecimento e expansão com Células de Apresentação de Antígenos artificiais paramagnéticos (aAPCs) e um coquetel de fator de crescimento de células T recombinante.

[008] Em várias modalidades, a composição celular é pelo menos 90% de células T CD8+ (por exemplo, células CD3 + CD8+). Por exemplo, a composição celular isolada pode ser caracterizada por possuir menos de cerca de 10% ou menos de cerca de 5% de células T CD4 +. Ao expandir células T CD8+ ex vivo, as células CD4+ têm uma tendência a crescer acima das células CD8+ e competir pelos sinais de crescimento e não são necessárias para uma resposta in vivo robusta e durável.

[009] Em várias modalidades, as células T específicas do antígeno exibem um fenótipo polifuncional após a ativação. Por exemplo, após a ativação, as células T são positivas para dois ou mais dos seguintes: coloração intracelular para IL-2, produção de IFN-y, produção de TNF- a e CD107A. Em várias modalidades, pelo menos 50% ou pelo menos 70% das células T específicas do antígeno exibem pelo menos dois desses marcadores. Em várias modalidades, pelo menos 50% ou pelo menos 70% das células T específicas do antígeno exibem pelo menos três desses marcadores, ou em algumas modalidades os quatro desses marcadores.

[010] As composições celulares de acordo com várias modalidades podem ser preparadas por um processo de enriquecimento e expansão. Em algumas modalidades, as células CD8+ são enriquecidas que são específicas para o(s) antígeno(s)-alvo (por exemplo, antígenos associados a tumores ou antígenos associados a vírus) Esta população celular, mesmo quando células predominantemente puras nos linfócitos de fonte, pode ser rapidamente expandida em cultura para chegar às composições celulares aqui descritas. O enriquecimento pode acontecer usando esferas paramagnéticas para selecionar positivamente as populações celulares, e que podem ter a vantagem adicional de ativar células puras devido ao potente agrupamento magnético dos receptores da superfície das células T. Por exemplo, esferas ou nanopartículas paramagnéticas podem conter ligantes HLA monoméricos ou multiméricos (por exemplo, diméricos) que apresentam antígenos de peptídeo, juntamente com um sinal de coestimulação na mesma ou em partículas diferentes, como um agonista para CD28 (por exemplo, um agonista de anticorpos de CD28). Em algumas modalidades, as células CD28+ também são enriquecidas, o que pode ser simultâneo ao enriquecimento específico de antígeno.

[011] Em várias modalidades, os antígenos de peptídeo alvo são antígenos associados a tumores ou câncer, incluindo antígenos derivados de tumores, específicos de tumores e neoantígenos. As células T específicas para antígenos associados a tumores geralmente são muito raras e, em muitos casos, indetectáveis no sangue periférico de indivíduos saudáveis. Esta é frequentemente uma distinção observada entre células T específicas para vírus e para antígenos tumorais.

[012] Em algumas modalidades, os antígenos de peptídeo alvo incluem pelo menos um que está associado ou derivado de um patógeno, como um patógeno viral, bacteriano, fúngico ou parasitário. Por exemplo, pelo menos um antígeno de peptídeo pode estar associado ao HIV, hepatite (por exemplo, B, C ou D) CMV, vírus Epstein-Barr (EBV), gripe, vírus do herpes (por exemplo, HSV 1 ou 2 ou varicela zoster) e adenovírus. O CMV, por exemplo, é o patógeno viral mais comum encontrado em pacientes transplantados e é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes submetidos a transplante de medula óssea ou de células-tronco do sangue periférico. Sabe-se que a ativação viral está implicada na biologia do câncer.

[013] Ainda em outras modalidades, a composição celular compreende células T específicas para antígenos associados a tumores, com células T associadas a patógenos fornecidas como células espectadoras. Especificamente, ao enriquecer para células T CD8+ com base na seleção tanto de peptídeo HLA quanto anti-CD28, as células espectadoras serão enriquecidas, e expandidas, particularmente ao usar um coquetel de fator de crescimento de células T que pode impulsionar uma expansão não específica dessas células sem ativação específica do antígeno. Nestas modalidades, enquanto uma grande parte da composição é de células T específicas para os peptídeos alvo (por exemplo, de 5% a 75%), as células T restantes (de cerca de 0,25% a cerca de 25%) fornecem alguma reconstituição do sistema imunológico para patógenos comuns, o que é particularmente benéfico após o transplante ou benéfico em cânceres com etiologia viral.

[014] Algumas modalidades empregam fatores de crescimento de células T durante a expansão, que afetam a proliferação e/ou diferenciação de células T. As citocinas particularmente úteis incluem MIP-16, IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, 11-10, 11-12, 11-15, 11-21, IFN-y. Nestas ou outras modalidades, as células são expandidas em cultura na presença de uma, duas ou três citocinas selecionadas entre MIP-18, IL-18 e IL-6. Em algumas modalidades, as citocinas compreendem ainda IL-10. As células podem ser expandidas em cultura de 1 a 4 semanas, como de 10 a 21 dias.

[015] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para fabricar as composições de células, inclusive por enriquecimento e expansão com aAPCs, como descrito aqui. Especificamente, após a depleção de células CD4 + de linfócitos de origem (por exemplo, de um doador saudável), as células T CD8+ específicas do antígeno são enriquecidas para células T específicas para os antígenos-alvo do peptídeo, bem como células CD28 + em algumas modalidades. As células-alvo podem ser enriquecidas usando aAPCs de nanopartículas ou micropartículas, como partículas paramagnéticas que ativam células T ex vivo por agrupamento induzido por campo magnético de receptores de superfície celular. Outros materiais, incluindo látex ou outras partículas poliméricas, também podem ser usados para agrupar os receptores da superfície celular (sem agrupamento induzido magneticamente). As células T enriquecidas podem ser rapidamente expandidas ex vivo, inclusive com o uso de fatores de crescimento de células T reconstituídos (por exemplo, compreendendo fatores selecionados entre MIP-18, IL-18, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, 11-10, 11-12, IL- 15, I1L-21, IFN-y). Em algumas modalidades, as células são expandidas em cultura na presença de uma, duas ou três citocinas selecionadas entre MIP-16, IL-18 e IL-6 e, opcionalmente, I1L-10. Em algumas modalidades, os fatores de crescimento compreendem ou consistem essencialmente em IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL-1B.

[016] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para terapia celular adotiva, incluindo métodos para o tratamento de um paciente com câncer e/ou pacientes submetidos a transplante alogênico de células-tronco, com ou sem terapia de deleção linfoma, terapia citorredutora, terapia imunomodulatória (antes da administração da terapia celular). A terapia celular pode ainda ser fornecida com ou sem suporte de citocina após o tratamento. Em algumas modalidades, o paciente tem um câncer hematológico, que em algumas modalidades foi recidivo após o transplante alogênico de células-tronco. Em algumas modalidades, o paciente tem leucemia mieloide aguda (AML) ou síndrome mielodisplásica. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição celular compreende células T específicas para os antígenos de peptídeo WT1, PRAME, Survivin e Cyclin A. No entanto, em outras modalidades, os cânceres incluem vários tipos de tumores sólidos, incluindo carcinomas, sarcomas e linfomas. Exemplos de antígenos de peptídeo alvo são aqui descritos.

[017] Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença infecciosa ou está em risco de uma doença infecciosa. Por exemplo, os pacientes que foram submetidos ao HSCT correm um risco particular de doença infecciosa, dado o estado imunocomprometido. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem as causadas por bactérias, vírus, príons, fungos, parasitas, helmintos, etc. Tais doenças incluem AIDS, hepatite B/C, infecção por CMV, infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV), influenza, infecção pelo vírus do herpes (incluindo herpes zóster) e infecção por adenovírus.

[018] Outros aspectos e modalidades serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] A FIGURA 1 mostra que as células T específicas da MART- 1 enriquecidas e expandidas ex vivo de linfócitos do doador mostram um fenótipo polifuncional, incluindo coloração intracelular para IL-2 (proliferação e memória), IFN-y (ativação de outras células T, memória, regulação positiva do MHC), TNF-a (pró-inflamatório) e CD107A (liberação de granzimas, atividade citotóxica). A maioria das células T mostra pelo menos três fenótipos funcionais.

[020] A FIGURA 2 mostra que as células T específicas de MART- 1 e AML enriquecidas e expandidas ex vivo de linfócitos de doadores usando aAPCs paramagnéticos são predominantemente fenótipo de memória central (rm) e memória efetora (Tem).

[021] A FIGURA 3 mostra que as células T específicas do antígeno podem ser enriquecidas e expandidas em lotes. A figura também mostra o enriquecimento e a expansão em lote de células T específicas para os peptídeos antigênicos Pramesoo RHAMM, WT1 e Survivin.

[022] A FIGURA 4 mostra que a composição com estimulação e expansão individual teve níveis consistentes de células T específicas para o antígeno de AML. O processo de estimulação e expansão individual gera consistentemente — 15% de células T específicas do antígeno.

[023] A FIGURA 5 mostra que o processo simultâneo de estimulação/expansão gera frequências de células T específicas para AML comparáveis à estimulação/expansão individual. A composição mostrada preparada por estimulação/expansão em lote tem — 47% de células T específicas do antígeno.

[024] A FIGURA 6 mostra que as células T geradas demonstram a morte específica de antígeno de células tumorais de AML (linha celular THP-1). As células T específicas de AML são direcionadas para 5 epítopos de WT-1, PRAME e Survivin.

[025] A FIGURA 7 mostra que o coquetel de citocinas usado para expansão ex vivo afeta o número e o fenótipo das células resultantes. O fator de crescimento de células T reconstituído (TF) inclui IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, 11-21, IFN-y e MIP1B.

[026] A FIGURA 8 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 7 após enriquecimento e expansão específicos para MART-1.

[027] A FIGURA 9 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 14 após enriquecimento e expansão específicos para MART-1.

[028] A FIGURA 10 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 14 após enriquecimento e expansão específicos para AML. Essas células eram, em grande parte, de um fenótipo de memória.

[029] A FIGURA 11 mostra a detecção de células T espectadoras específicas para CMV durante o processo de enriquecimento e expansão específico de MART-1. A porcentagem de células espectadoras específicas do vírus permanece constante até o dia 14, enquanto o número e a porcentagem de células T específicas para MART-1 aumentam dramaticamente.

[030] A FIGURA 12 mostra a detecção de células espectadoras específicas do vírus no dia 14 após enriquecimento e expansão específicos de MART-1 usando um coquetel de fator de crescimento de células T recombinante (IL-18, IL-2, IL-4, IL-6, 11-21, IFN-y e MIP1-B), o que melhora a expansão dessas células espectadoras.

[031] A FIGURA 13 tem dois painéis (Figura 13A e Figura 13B) que mostram a especificidade e fenótipo de células T específicas de Mart-1 geradas pelo processo de enriquecimento e expansão usando um coquetel de fator de crescimento de células T recombinante (IL-2, IL-4, IL- 6, IFN-y e IL1-B). As células T específicas de Mart-1 (Figura 13A, painel direito) constituíam cerca de 35% da cultura e mostravam um fenótipo de memória central (- 89%) e memória efetora (- 9%). À cultura total mostrou um fenótipo de — 66% de memória central e — 32% de memória efetora.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] Em vários aspectos e modalidades, a invenção fornece uma composição celular isolada adequada para imunoterapia adotiva, bem como métodos de fabricação das composições celulares e métodos de tratamento com as composições celulares. A composição compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável, pelo menos cerca de 10º células T CD8+ específicas para o(s) antígeno(s) peptídico(s) alvo. Em várias modalidades, pelo menos cerca de 20% das células T na composição exibem um fenótipo de memória central ou efetora, proporcionando uma terapia adotiva robusta e durável. A composição celular não compreende células T que expressam um receptor de antígeno quimérico ou um TCR recombinante e, portanto, em várias modalidades, fornece uma alternativa para essas tecnologias que geralmente produzem fenótipos de células T mais esgotados e respostas menos duráveis.

[033] Como usado aqui, o termo "antígeno(s) peptídico (s) alvo" ou "antígenos-alvo" refere-se a antígenos de peptídeo empregados ex vivo para enriquecer e/ou expandir a população de células CD8+ desejada, por exemplo, em conjunto com a célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) ou plataformas profissionais de células apresentadoras de antígenos (pAPC) (por exemplo, células dendríticas). As aAPCs ou pAPCs são empregadas para ativar e expandir CTLs de linfócitos de doadores ou pacientes. Em algumas modalidades, os antígenos de peptídeo alvo são epítopos peptídicos carregados em aAPCs para enriquecimento e expansão ex vivo de células T CD8+ específicas. Assim, o termo "específico para o antígeno de peptídeo alvo" significa que a célula T é um antígeno reconhecido com o antígeno-alvo.

[034] Em várias modalidades, a composição celular compreende pelo menos cerca de 107 células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo alvo, ou pelo menos cerca de 108, pelo menos cerca de 10º ou pelo menos cerca de 10ºº células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo alvo, para fornecer destruição robusta das células alvo. Em algumas modalidades, a composição celular contém de 1 x 107 a 1 x 10º células T CD8+ específicas para os antígenos-alvo, ou em algumas modalidades de 5 x 107 a 5x 10º células CD8+ T específicas para os antígenos-alvo. Por exemplo, a composição pode compreender de cerca de 5 x 10º a cerca de 5 x 10º células por ml, em um volume de 50 a 200 ml. Em certas modalidades, o volume da composição é £100 ml (por exemplo, de 50 a 100 ml). As células da composição em várias modalidades são pelo menos 70% viáveis e fornecidas em um meio estéril, que pode ser um meio crioprotetor (por exemplo, 10% de DMSO).

[035] As células da composição, que são predominantemente linfócitos citotóxicos CD8+ (CTLs), também são substancialmente de um fenótipo de memória central ou efetora. Os CTLs geralmente incluem as seguintes populações fenotípicas: células-tronco puras da memória T (Tsem), memória central, memória efetora e células de memória diferenciadas terminalmente. De acordo com modalidades da invenção, as células T específicas para os antígenos-alvo são substancialmente compostas por fenótipos de memória central e de memória efetora. Em algumas modalidades, as células T específicas para os antígenos-alvo compreendem ainda células-tronco da memória T (Tsem). A composição celular fornece, assim, uma resposta durável, incluindo persistência in vivo de células T específicas de antígeno por pelo menos cerca de 1 mês, ou pelo menos cerca de 3 meses, ou pelo menos cerca de 6 meses, ou pelo menos cerca de 12 meses, ou pelo menos cerca de 18 meses, ou pelo menos cerca de dois anos em algumas modalidades.

[036] Uma célula T pura se diferenciou na medula óssea e passou por processos positivos e negativos de seleção central no timo. Uma célula T pura é considerada madura e, diferentemente das células T ativadas ou da memória, não encontrou seu antígeno cognato. As células T naive podem ser caracterizadas pela expressão superficial da L-selectina (CD62L) e pela ausência de marcadores de ativação. No estado puro, as células T são geralmente quiescentes e não se dividem. De acordo com esta descrição, as células T puras são definidas como CD62L+ e CD45RAr+.

[037] As células T de memória incluem células-tronco de memória T (Tsem), memória central e células T de memória efetora. As células T da memória responderam anteriormente ao seu antígeno cognato. Em um segundo encontro com o antígeno cognato, as células T da memória podem se reproduzir para montar uma resposta imune mais rápida e mais forte. As células T de memória incluem pelo menos subtipos de efetora e de memória central. Os subtipos de células T da memória têm vida longa e podem se expandir rapidamente para um grande número de células T efetoras após a exposição ao antígeno cognato.

[038] As células-tronco da memória T (tsom) são aqui definidas como CD45RA+ e como tendo pelo menos dois marcadores (ou em algumas modalidades pelo menos três ou todos os quatro marcadores) selecionados dentre CXCR3+, CD95+, CD11a+ e CDB58+. Essa subpopulação de memória possui a capacidade de autorrenovação semelhante a uma célula-tronco, bem como a capacidade multipotente de reconstituir a subpopulação de células T efetoras e de memória. As células Tsem podem representar uma pequena fração de linfócitos T circulantes (por exemplo, > 5%) e têm a capacidade de proliferar rapidamente e liberar citocinas inflamatórias em resposta à reexposição a antígenos. Consequentemente, as células Tsem são um subconjunto da subpopulação de células T da memória. Os fenótipos das células Tsem podem ser criados e/ou controlados usando, como aqui divulgado, um processo de enriquecimento e expansão com células apresentadoras de antígenos artificiais paramagnéticas (aAPCs) e um coquetel de fator de crescimento de células T recombinante.

[039] De acordo com esta descrição, as células T de memória central células (células Tem ) são definidas como CD62L+ e CD45RA-. Essa subpopulação de memória é comumente encontrada nos linfonodos e na circulação periférica. As células T da memória efetora (células Tem) são definidas como CD62L- e CD45RA-. Essas células T de memória carecem de receptores de retorno aos linfonodos e, portanto, são encontradas na circulação periférica e nos tecidos. TEMRA significa células de memória efetoras diferenciadas terminalmente que re-expressam CD45RA. Essas células não têm capacidade de divisão e são CD62L- e CD45RA+.

[040] As células Tem exibem uma capacidade de autorrenovação e, de acordo com as modalidades da invenção, são importantes para a obtenção de um efeito de longa duração. As células Tem também têm alguma capacidade de autorrenovação e expressam fortemente genes essenciais à função citotóxica. As células Temra também fornecem uma função citotóxica robustay mas não exibem capacidade de autorrenovação.

[041] As composições em várias modalidades compreendem CTLs que são substancialmente compostos por células Tsem, Tem € Tem para equilibrar a duração do efeito contra a destruição potente da malignidade ou outras células alvo.

[042] Em várias modalidades, as células T na composição são pelo menos cerca de 30% de células de memória central e efetoras, ou pelo menos cerca de 40% de células de memória central ou efetoras, ou pelo menos cerca de 50% de células T de memória central ou efetora, ou em algumas modalidades são pelo menos cerca de 70% de células de memória central ou efetoras, ou pelo menos cerca de 80% de células T de memória central ou efetoras. Em algumas modalidades, as células de memória são de cerca de 10:90 a cerca de 90:10 de células de memória central para efetoras. Em algumas modalidades, as células T na composição são de cerca de 25:75 a cerca de 75:25 de células de memória centrais para efetoras. Em algumas modalidades, as células T de memória são de cerca de 40:60 a cerca de 60:40 células T de memória central para efetoras. A composição celular compreende menos de cerca de 20% de células T de memória terminalmente diferenciadas (por exemplo, células Temra) ou menos de cerca de 10% ou menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 4% de células T de memória terminalmente diferenciadas em algumas modalidades. Em várias modalidades, as células T CD8+ contêm não mais que cerca de 20% de células puras, ou em algumas modalidades, não mais que cerca de 15% de células puras, ou não mais que cerca de 10% de células puras ou não mais que cerca de 5% de células puras, ou não mais que cerca de 4% de células puras, ou não mais que cerca de 3% de células puras, ou não mais que cerca de 2% de células puras, ou não mais que cerca de 1,5%, ou não mais que cerca de 1% de células puras. Em várias modalidades, as células T CD8+ contêm de cerca de 5% a cerca de 25% de células Tsem, ou em algumas modalidades, de cerca de 5% a cerca de 20% de células Tscm ou de cerca de 5% a cerca de 15% de células Tscm.

[043] Em várias modalidades, as células T específicas para os antígenos-alvo são pelo menos cerca de 30% de células de memória central e efetoras, ou pelo menos cerca de 40% de células de memória central ou efetoras, ou pelo menos cerca de 50% de células T de memória central ou efetora, ou em algumas modalidades são pelo menos cerca de 70% de células de memória central ou efetoras, ou pelo menos cerca de 80% de células T de memória central ou efetoras. Em algumas modalidades, estas células de memória são de cerca de 10:90 a cerca de 90:10 de células de memória central para efetoras. Em algumas modalidades, estas células T são de cerca de 25:75 a cerca de 75:25 de células de memória central para efetoras. Em algumas modalidades, as células T de memória são de cerca de 40:60 a cerca de 60:40 células T de memória central para efetoras. As células T específicas para o(s) antígeno(s) alvo são inferiores a cerca de 20% de células T de memória terminalmente diferenciadas (por exemplo, células TEMRA) ou inferiores a cerca de 10% ou menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 4% de células T de memória terminalmente diferenciada. Em várias modalidades, as células T específicas para antígenos-alvo contêm não mais que cerca de 20% de células puras, ou em algumas modalidades, não mais que cerca de 15% de células puras, ou não mais que cerca de 10% de células puras ou não mais que cerca de 5% de células puras, ou não mais do que cerca de 2% ou 1,5% ou 1% de células puras. Em várias modalidades, as células T específicas para antígenos-alvo contêm de cerca de 5% a cerca de 25% de células Tscm, OU em algumas modalidades, de cerca de 5% a cerca de 20% de células Tsem Ou de cerca de 5% a cerca de 15% de células Tscm. Esse fenótipo pode ser criado pelo processo de enriquecimento e expansão com células para apresentação de antígenos artificiais paramagnéticos (aAPCs).

[044] Em várias modalidades, a composição celular é pelo menos 90% de células T ou pelo menos 95% de células T ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% de células T. Para os fins desta descrição, as células T são caracterizadas por células CD3+. As células T são geralmente CD8+. Por exemplo, a composição celular isolada pode ser caracterizada por possuir menos de cerca de 10% ou menos de cerca de 5% de células T CD4+ ou, em algumas modalidades, menos de cerca de 2%, menos de cerca de 1,5% ou menos de cerca de 1% de células T CD4+. Ao expandir células T CD8+ ex vivo, as células CD4+ têm uma tendência a crescer sobre as células CD8+ e competir pelos sinais de crescimento e não são necessárias para uma resposta in vivo robusta e durável.

[045] Foi descrito que a presença de células T polifuncionais CD4+ e CD8+ se correlaciona com a resposta à terapia de vacina contra o câncer com neoantígenos de peptídeo. Ott PA, et al., An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma, Nature 547(7662):217-221 (2017). As células T CD4+ e CD8+ são ainda descritas como importantes para mediar a destruição de células tumorais. Ver, Tran E, Cancer immunotherapy based on mutation- specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 344, 641-645 (2014); Sahin U, et al., Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer, Nature 547(7662):222-226 (2017). Com relação a esta descrição, acredita-se que as composições de células adotivas precisam apenas fornecer números substanciais de células T CD8+ específicas do antígeno para uma resposta robusta e durável, e particularmente em que as células T CD8+ específicas do antígeno são fornecidas em número suficiente e são substancialmente do fenótipo de memória central e efetora. Em várias modalidades, as células T CD8+ específicas do antígeno compreendem ainda células-tronco de memória T.

[046] Em várias modalidades, a composição celular é substancialmente CD28+.

[047] Em várias modalidades, as células T específicas do antígeno exibem um fenótipo polifuncional após a ativação. Por exemplo, após a ativação, as células T são positivas para dois ou mais dos seguintes: coloração intracelular para IL-2, que é um marcador para proliferação e memória; Produção de IFN-y, que ativa outras células T e induz a memória e a regulação positiva do MHC); produção de TNF-a, um marcador pró-inflamatório; e CD107A, que é um marcador para liberação de granzimas e atividade citotóxica. Em várias modalidades, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% das células T específicas do antígeno exibem pelo menos três desses marcadores. Em várias modalidades, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% das células T específicas do antígeno exibem todos os quatro desses marcadores. Em algumas modalidades, a polifuncionalidade é avaliada ou quantificada usando ensaios de morte alvo, que avaliam a capacidade das células T citotóxicas CD8+ de lisar as células-alvo que apresentam o antígeno de peptídeo em complexo com MHC.

[048] As composições celulares de acordo com várias modalidades podem ser preparadas por enriquecimento de células CD8+ que são específicas para o(s) antígeno(s)-alvo (por exemplo, antígenos associados a tumores ou antígenos associados a vírus). Esta população celular, mesmo quando células predominantemente puras nos linfócitos de fonte, pode ser rapidamente expandida em cultura para chegar às composições celulares aqui descritas. As células CD4+ podem ser esgotadas (enriquecimento específico de pré ou pós- antígeno) dos linfócitos usando microesferas de depleção de células CD4+. O enriquecimento específico do antígeno da células CD8+ pode acontecer usando esferas paramagnéticas para selecionar positivamente as populações celulares, e que podem ter a vantagem adicional de ativar células puras devido ao potente agrupamento magnético dos receptores da superfície das células T. Por exemplo, esferas ou nanopartículas paramagnéticas podem conter ligantes HLA monoméricos ou multiméricos (por exemplo, diméricos) que apresentam antígenos de peptídeo, juntamente com um sinal de coestimulação em algumas modalidades, como um agonista para CD28 (por exemplo, um agonista de anticorpos de CD28). Métodos exemplares de acordo com essas modalidades são descritos em WO 2016/044530 e PCT/US2017/22663, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[049] Em algumas modalidades, as células CD28+ também são enriquecidas, o que pode ser simultâneo ao enriquecimento específico de antígeno. O CD28 é expresso nas células T e é um sinal coestimulatório necessário para a ativação e sobrevivência das células T. CD28 é o único receptor B7 expresso constitutivamente em células T puras. A associação do TCR de uma célula T pura com o complexo MHC-antígeno sem coestimulação com CD28 pode resultar em uma célula T que é anérgica. Em algumas modalidades, as células CD28+ não são enriquecidas, mas um agonista de CD28 é adicionado na forma solúvel durante o processo de enriquecimento ou adicionado como conjugado a esferas não paramagnéticas. Em algumas modalidades, CD28 (na forma conjugada ou não conjugada) é adicionado às células após enriquecimento específico de antígeno, a fim de ativar as células para a fase de expansão.

[050] Em várias modalidades, as células T específicas para antígenos-alvo (por exemplo, em virtude dos peptídeos exibidos pelas aAPCs ou pAPCs) são específicas para 1 a cerca de 100 antígenos- alvo, ou de 1 a cerca de 75 antígenos-alvo ou de 1 a cerca de 50 antígenos-alvo, ou de 1 a cerca de 25 antígenos-alvo, ou de 1 a cerca de 20 antígenos-alvo, ou de 1 a cerca de 15 antígenos-alvo, ou de 1 a antígenos-alvo ou de 1 a 5 antígenos-alvo. Em várias modalidades, existem pelo menos 3, ou pelo menos 4 ou pelo menos 5 antígenos- alvo. Os antígenos-alvo distintos podem incluir epítopos peptídicos sobrepostos em algumas modalidades. As células T específicas para esses antígenos de peptídeo podem ser enriquecidas e expandidas em lotes, permitindo a produção rápida e paralela de composições celulares. Em algumas modalidades, a composição contém células T específicas para 5 a 15 ou 5 a 10 antígenos de peptídeo. À especificidade da célula T em relação a um antígeno de peptídeo alvo na composição é definida por coloração com multímero de MHC (por exemplo, coloração com dímero ou tetrâmero), como é bem conhecido na técnica.

[051] Por exemplo, um coquetel de nano-aAPCs, cada aAPC apresentando um antígeno alvo diferente e distinto, pode ser usado para enriquecer as células T contra vários antígenos simultaneamente. Por exemplo, as células T específicas para 2 a 10 antígenos podem ser enriquecidas simultaneamente a partir da fonte de linfócitos. Nesta modalidade, inúmeros diferentes lotes de nano-aAPC, cada um contendo um peptídeo de MHC diferente, seria combinado e utilizado para enriquecer simultaneamente as células T contra cada um dos antígenos de interesse. O grupo de células T resultante seria ativado contra cada um desses antígenos e expandido juntos em cultura. Esses antígenos podem estar relacionados a uma única intervenção terapêutica; por exemplo, múltiplos antígenos presentes em um único tumor ou célula maligna.

[052] Os antígenos de peptídeo alvo são geralmente adequados para apresentação por um complexo molecular HLA-A, B ou C e, em algumas modalidades, um complexo molecular HLA-A2.

[053] Em várias modalidades, os antígenos de peptídeo alvo são antígenos associados a tumores ou câncer, incluindo antígenos derivados de tumor ou antígenos específicos de tumor. As células T específicas para antígenos associados a tumores geralmente são muito raras e, em muitos casos, indetectáveis no sangue periférico de indivíduos saudáveis. Além disso, as células são frequentemente de um fenótipo naive, particularmente ao usar linfócitos T do doador. Ver, Quintarelli et al., Cytotoxic T Iymphocytes directed to the preferentially expressed antigens of melanoma (PRAME) target chronic myeloid leukemia. Blood 2008; 112: 1876-1885. Esta é frequentemente uma distinção observada entre células T específicas para vírus e para antígenos tumorais.

[054] "Antígenos associados a tumores" ou "antígenos específicos para câncer" incluem antígenos de tumor ou de câncer exclusivos, expressos exclusivamente pelo tumor ou células malignas das quais eles derivam, antígenos de tumor compartilhados expressos em muitos tumores, mas não em tecidos adultos normais (antígenos oncofetais) e antígenos específicos de tecido expressos também pelo tecido normal do qual o tumor surgiu. Os antígenos associados ao tumor podem ser, por exemplo, antígenos embrionários, antígenos com modificações pós- traducionais anormais, antígenos de diferenciação, produtos de oncogenes ou supressores de tumor mutados, proteínas de fusão ou proteínas oncovirais.

[055] Em algumas modalidades, os antígenos de peptídeo alvo incluem um ou mais associados ou derivados de câncer hematológico, como leucemia, linfoma ou mieloma. Por exemplo, a malignidade hematológica pode ser leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia aguda na infância, linfomas não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, síndrome mielodisplásica, células T cutâneas malignas, micoses fungoides, linfoma de células T cutâneas não-MF, papulose linfomatoide e hiperplasia linfoide cutânea rica em células T. Em outras modalidades, os antígenos de peptídeo alvo incluem um ou mais associados ou derivados de um tumor sólido, incluindo melanoma, câncer de cólon, câncer duodenal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário, câncer ductal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer renal câncer endometrial, câncer testicular, câncer de estômago, mucosa oral displásica, polipose, câncer de cabeça e pescoço, câncer bucal invasivo, carcinoma pulmonar de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma, carcinoma urinário de células transicionais e escamosas, câncer cerebral, neuroblastoma e glioma.

[056] Uma variedade de antígenos associados a tumor é conhecida na técnica. Os antígenos oncofetais e embrionários incluem antígeno carcinoembrionário e alfa-fetoproteína (geralmente apenas altamente expressos em embriões em desenvolvimento, mas frequentemente expressos em tumores do fígado e cólon, respectivamente), MAGE-1 e MAGE-3 (expressos em melanoma, câncer de mama e glioma), fosfatase alcalina placentária sialil-Lewis X (expressa em adenocarcinoma), CA-125 e CA-19 (expressa em tumores gastrointestinais, hepáticos e ginecológicos)) TAG-72 (expressa em tumores colorretais), glicoproteína epitelial 2 (expressa em muitos carcinomas), antígeno pancreático oncofetal, 5T4 (expresso em carcinoma gástrico), receptor de alfafetoproteína (expresso em vários tipos de tumores, particularmente tumores mamários) e M2A (expresso em neoplasia de células germinativas).

[057] Os antígenos de diferenciação associados ao tumor incluem tirosinase (expressa em melanoma) e imunoglobulinas de superfície específicas (expressas em linfomas).

[058] Os produtos do gene oncogene ou supressor de tumor mutado incluem Ras e p53, ambos expressos em muitos tipos de tumor, Her-2/neu (expresso em câncer de mama e ginecológico), EGF-R, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, produto genético de retinoblastoma, myc (associado ao câncer de pulmão), ras, p53, não mutante associado a tumores da mama, MAGE-1 e MAGE-3 (associados a melanoma, pulmão e outros cânceres). As proteínas de fusão incluem BCR-ABL, que é expressa na leucemia mieloide crômica. As proteínas oncovirais incluem o HPV tipo 16, E6 e E7, encontradas no carcinoma cervical.

[059] Os antígenos específcos do tecido incluem melanotransferrina e MUC1 (expressos nos cânceres de pâncreas e de mama); CD10 (anteriormente conhecido como antígeno comum da leucemia linfoblástica aguda, ou CALLA) ou imunoglobulina de superfície (expressa em leucemias e linfomas de células B); a cadeia a do receptor de 1IL-2, receptor de células T, CD45R, CD4+/CD8+ (expressa em leucemias e linfomas de células T); antígeno específico da próstata e fosfatase ácida prostática (expresso no carcinoma da próstata); GP 100, MelanA/Mart-1, tirosinase, gp75/marrom, BAGE e S- 100 (expresso em melanoma); citoqueratinas (expressas em vários carcinomas); e CD19, CD20 e CD37 (expresso em linfoma).

[060] Os antígenos associados ao tumor também incluem antígenos — glicolipídicos e glicoproteicos alterados, — como glicosfingolipídeos contendo ácido neuramínico (por exemplo, GM2 e GD2, expressos em melanomas e em alguns tumores cerebrais); antígenos de grupos sanguíneos, particularmente antígenos T e Tn sialilados, que podem ser expressos aberrantemente em carcinomas; e mucinas, tais como CA-125 e CA-19-9 (expressas em carcinomas de ovário) ou o MUC-1 subglicosilafo (expresso em carcinomas de mama e pancreático).

[061] Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer de bexiga, como um ou mais antígenos NY-ESO-1, MAGE-A10 e MUC-1. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer no cérebro e podem incluir um ou mais dos antígenos NY-ESO-1, Survivin e CMV.

Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer de mama e podem incluir um ou mais antígenos MUC-1, Surivin, WT-1, HER-2 e CEA.

Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer do colo do útero e podem incluir o antígeno de HPV.

Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer colorretal e podem incluir um ou mais dos antígenos NY-ESO-1, Survivin, WT-1, MUC-1 e CEA.

Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer de esôfago e podem incluir o antígeno NY-ESO-1. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo podem estar associados ao câncer de cabeça e pescoço e podem incluir o antígeno de HPV.

Em algumas modalidades, o antígeno alvo está associado ao câncer de rim ou fígado e pode incluir o antígeno NY-ESO-1. Em algumas modalidades, o antígeno alvo está associado ao câncer de pulmão e pode incluir um ou mais antígenos NY-ESO-1, Survivin, WT- 1, MAGE-A1I10 e MUC-1. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao melanoma e podem incluir um ou mais de NY-ESO-1, Survivin, MAGE-A10, MART-1 e GP-100. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos de peptídeo estão associados ao câncer de ovário e podem incluir um ou mais antígenos NY-ESO-1, WT-1 e Mesotelina.

Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao câncer de próstata e podem incluir um ou mais dos antígenos Survivin, NTERT, PSA, PAP e PSMA.

Em algumas modalidades, o antígeno alvo está associado a um sarcoma e pode incluir o antígeno NY-ESO-1. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao linfoma e podem incluir o antígeno EBV. Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados ao mieloma múltiplo e podem incluir um ou mais antígenos NY-ESO-1, WT-1 e SOX2.

[062] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos-alvo estão associados à leucemia mieloide aguda ou síndrome mielodisplásica e podem incluir um ou mais antígenos (incluindo 1, 2, 3, 4 ou 5 de) Survivin, WT-1, PRAME, RHAMM, PR3 e ciclina A1. Em algumas modalidades, os antígenos-alvo incluem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou todos os antígenos-alvo da Tabela 1 a seguir. Tabela 1: Antígenos de peptídeo alvo de AML exemplares Nome/posição do Antígeno Sequência SEQ ID Nº: peptídeo [ALA Oo rem mo |] 187-195 SLGEQQYSV | SEQID Nº:4 ee van Temas Ls ear aan | P300 ALYVDSLFFL |SEQID Nº:8 | P425 SLLQHLIGL — | SEQID Nº:9 [ LDR 104-113 LDRERAKNKI | SEQ ID Nº:11 Cyeclin A1 FLDRFLSCM |SEQID Nº: 12 APPA SA par —

[063] Em algumas modalidades, um ou mais antígenos de peptídeo alvo são neoantígenos. Por exemplo, em algumas modalidades, neoantígenos específicos para o paciente são identificados e sintetizados para carregar aAPCs. Em algumas modalidades, entre três e dez neoantígenos são identificados por análise genética da malignidade do paciente (por exemplo, por sequenciamento de ácido nucleico de células malignas), seguido por bioinformática preditiva. Em algumas modalidades, os antígenos são antígenos naturais, não mutados, de câncer, dos quais muitos são conhecidos.

[064] Em várias modalidades, pelo menos um dos antígenos de peptídeo alvo é reconhecido por uma célula T precursora de baixa frequência. De acordo com essas modalidades, a invenção permite a rápida ativação e expansão dessas células para terapia adotiva.

[065] Em algumas modalidades, os antígenos de peptídeo alvo incluem pelo menos um que está associado ou derivado de um patógeno, como um patógeno viral, bacteriano, fúngico ou parasitário. Por exemplo, pelo menos um antígeno de peptídeo pode estar associado ao HIV, hepatite (por exemplo, A, B, C ou D) CMV, vírus Epstein-Barr (EBV), gripe, vírus do herpes (por exemplo, HSV 1 ou 2 ou varicela zóster) e adenovírus. O CMV, por exemplo, é o patógeno viral mais comum encontrado em pacientes transplantados e é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes submetidos a transplante de medula óssea ou de células-tronco do sangue periférico. Isso se deve ao estado imunocomprometido desses pacientes, que permite a reativação do vírus latente em pacientes soropositivos ou infecção oportunista em indivíduos soronegativos. Nestas modalidades, o paciente pode receber imunoterapia adotiva compreendendo células T específicas para antígenos patógenos. O método pode levar à geração de CTL específico do vírus derivado do paciente ou de um doador apropriado antes do início do procedimento de transplante.

[066] Em algumas modalidades, pelo menos um antígeno alvo é um antígeno associado a patógenos, incluindo antígenos associados a protozoários, bactérias, fungos (unicelulares e multicelulares), vírus, príons, parasitas intracelulares, helmintos e outros agentes infecciosos.

[067] Antígenos bacterianos incluem antígenos de cocos gram- positivos, bacilos gram-negativos, bactérias gram-negativas, bactérias anaeróbicas, como organismos das famílias Actinomycetaceae, Bacillaceae, Bartonellaceae, Bordetellae, Captophagaceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Spirochaetaceae, Vibrionaceae e organismos dos gêneros Acinetobacter, Brucella, Campylobacter, Erysipelothrix, Ewingella, Francisella, Gardnerella, Helicobacter, Levinea, Listeria, Streptobacillus e Tropheryma.

[068] Antígenos de agentes infecciosos protozoários incluem antígenos de plasmodia da malária, espécies de Leishmania, espécies de Trypanosoma e espécies de Schistosoma.

[069] Antígenos fúngicos incluem antígenos de Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Paracoccicioides, Sporothrix, organismos da ordem Mucorales, organismos indutores de coromicose e micetoma e organismos dos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton.

[070] Os antígenos de peptídeo virais incluem, entre outros, os de adenovírus, vírus do herpes simplex, vírus do papiloma, vírus sincicial respiratório, poxvírus, HIV, vírus da influenza, EBV, hepatite e CMV. Os antígenos de peptídeo virais particularmente úteis incluem proteínas do HIV como proteínas gag do HIV (incluindo, mas não se limitando a, proteína de ancoragem à membrana (MA), proteína do capsídeo central

(CA) e proteína do nucleocapsídeo (NC)), polimerase do HIV, matriz do vírus influenza (M1) proteína nucleocapsídica (NP) do vírus da proteína e influenza, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), proteína central da hepatite B (HBcAg), proteína da hepatite e (HBeAg), polimerase de DNA da hepatite B, antígenos da hepatite C e semelhantes.

[071] Em algumas modalidades, os antígenos de peptídeo alvo incluem um ou mais antígenos associados a tumores e um ou mais antígenos associados a vírus (como CMV, EBV, influenza ou Adenovírus), para fornecer uma resposta antitumoral enquanto protege contra patógenos comuns que complicam a recuperação após o HSCT.

[072] Os pacientes que foram submetidos ao HSCT correm um risco particular de doença infecciosa, dado o estado imunocomprometido. O estado imunocomprometido desses pacientes permite a reativação do vírus latente em pacientes soropositivos ou infecção oportunista em indivíduos soronegativos. Por exemplo, a doença linfoproliferativa pós-transplante (PTLD) ocorre em uma fração significativa dos pacientes transplantados e resulta da infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Acredita-se que a infecção por EBV esteja presente em aproximadamente 90% da população adulta nos Estados Unidos. A replicação e infecção virais ativas são controladas pelo sistema imunológico, mas, como nos casos de CMV, os indivíduos imunocomprometidos pelas terapias de transplante perdem as populações controladoras de células T, o que permite a reativação viral. Isso representa um sério impedimento aos protocolos de transplante. O EBV também pode estar envolvido na promoção do tumor em uma variedade de cânceres hematológicos e não hematológicos.

[073] Ainda em outras modalidades, a composição celular compreende células T específicas para antígenos associados a tumores, com células T associadas a patógenos fornecidas como células espectadoras. Especificamente, ao enriquecer para células T CD8+ com base na seleção tanto com complexos de peptídeo-HLA quanto anti-CD28, as células espectadoras serão enriquecidas, e expandidas, particularmente ao usar um coquetel de fator de crescimento de células T que pode impulsionar uma expansão não específica dessas células sem ativação específica do antígeno. Nestas modalidades, enquanto uma grande porção da composição são células T específicas para os peptídeos alvo (por exemplo, de 5% a 75%, ou de a 50%), as células T restantes fornecem alguma reconstituição do sistema imunológico contra bactérias patógenos comuns, o que é particularmente benéfico após o transplante. Por exemplo, a composição pode compreender células T específicas para CMV, EBV, influenza e Adenovírus. Em cada caso, as células T específicas do patógeno podem estar presentes de 0,1% a cerca de 4% da composição.

[074] Em várias modalidades, a invenção envolve composições preparadas por enriquecimento e expansão de células T CD8+ específicas do antígeno. As células T precursoras podem ser obtidas do paciente ou de um doador compatível com HLA. As células T de origem podem ser amostras frescas ou congeladas. As células T precursoras podem ser obtidas de várias fontes que compreendem WBCs, incluindo células mononucleares do sangue periférico (PBMC), medula óssea, tecido linfonodal, tecido do baço, fração de buffy coat e tumores. Em algumas modalidades, as células T precursoras são obtidas de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, as células T precursoras do sangue circulante de um indivíduo podem ser obtidas por aferese ou leucaferese. O produto de aferese normalmente contém linfócitos, incluindo células T e células T precursoras, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados,

glóbulos vermelhos e plaquetas. A leucaferese é um procedimento de laboratório no qual os glóbulos brancos são separados de uma amostra de sangue.

[075] As células coletadas por aferese podem ser lavadas para remover a fração plasmática e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. As etapas de lavagem podem ser realizadas por métodos conhecidos pelos versados na técnica, como o uso de uma centrífuga semiautomatizada de "fluxo contínuo". Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, como, por exemplo, PBS sem Ca e Mg. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aferese podem ser removidos e as células diretamente ressuspensas em um meio de cultura.

[076] Se desejado, as células T precursoras podem ser isoladas dos linfócitos do sangue periférico, lisando os glóbulos vermelhos e esgotando os monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLLTY,

[077] Em certas modalidades, os leucócitos são coletados por leucaferese e podem ser subsequentemente enriquecidos para células T CD8+, por exemplo, esgotando a amostra de células CD4+ e/ou enriquecendo positivamente para células CD8+. Em algumas modalidades, outros tipos de células são esgotados, como células NK. As células enriquecidas com CD8 podem então ser enriquecidas ainda mais para células T específicas de antígeno.

[078] Em várias modalidades, a amostra compreendendo as células imunes (por exemplo, células T CD8+) é colocada em contato com uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) com propriedades magnéticas. Os materiais paramagnéticos têm uma suscetibilidade pequena e positiva aos campos magnéticos. Esses materiais são atraídos por um campo magnético e o material não retém as propriedades magnéticas quando o campo externo é removido. Materiais paramagnéticos = exemplares incluem, sem limitação, magnésio, molibdênio, lítio, tântao e óxido de ferro. Esferas paramagnéticas adequadas para enriquecimento magnético estão disponíveis comercialmente (DYNABEADSTY, MACS MICROBEADSTY, Miltenyi Biotec). Em algumas modalidades, a partícula aAPC é uma esfera de ferro dextrana (por exemplo, esfera de óxido de ferro revestida com dextrana).

[079] Os complexos de apresentação de antígeno compreendem uma fenda de ligação ao antígeno e são geralmente MHC classe |, que podem ser ligados ou amarrados para fornecer MHC dimérico ou multimérico. Em algumas modalidades, o MHC é monomérico, mas sua estreita associação na nanopartícula é suficiente para avidez e ativação. Em algumas modalidades, o MHC é dimérico. Os liganres diméricos do MHC classe | podem ser construídos por fusão com sequências de cadeias pesadas de imunoglobulina, que são então associadas através de uma ou mais ligações dissulfeto (com ou sem cadeias leves associadas). Os multímeros de MHC podem ser criados por ligação direta através de peptídeos ou ligantes químicos, ou podem ser multiméricos por associação com estreptavidina através de porções de biotina. Em algumas modalidades, os complexos de apresentação de antígeno são complexos de MHC de classe | envolvendo fusões com sequências de imunoglobulina.

[080] Os complexos moleculares de MHC de classe | com sequências de imunoglobulinas são descritos na Patente dos EUA

6.268.411, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Estes complexos moleculares de MHC de classe | podem ser formados de maneira conformacionalmente intacta nas extremidades das cadeias pesadas de imunoglobulina. Os complexos moleculares do MHC classe | aos quais os peptídeos antigênicos estão ligados podem se ligar de maneira estável aos receptores de linfócitos específicos ao antígeno (por exemplo, receptores de células T). Em várias modalidades, a sequência da cadeia pesada de imunoglobulina não é completa, mas compreende uma região dobradiça de lg e um ou mais dos domínios CH1, CH2 e/ou CH3. A sequência de Ig pode ou não compreender uma região variável, mas onde as sequências de regiões variáveis estão presentes, a região variável pode ser completa ou parcial. O complexo pode ainda compreender cadeias leves de imunoglobulina. Os ligantes do MHC de classe | (por exemplo, HLA-lg) sem sequências de cadeia variável (e sem cadeia leve) podem ser empregados com conjugação direcionada ao local para partículas, conforme descrito no documento WO 2016/105542, que é incorporado por referência em sua totalidade.

[081] Exemplos de complexos moleculares de MHC de classe | compreendem pelo menos duas proteínas de fusão. Uma primeira proteína de fusão compreende uma primeira cadeia de MHC de classe | ae uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina (ou uma porção da mesma compreendendo a região de dobradiça), e uma segunda proteína de fusão compreende uma segunda cadeia de MHC de classe lae uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina (ou porção compreendendo a região da dobradiça). A primeira e a segunda cadeias pesadas de imunoglobulina se associam para formar o complexo molecular de MHC de classe |, que compreende duas fendas de ligação a peptídeos MHC de classe |. A cadeia pesada de imunoglobulina pode ser a cadeia pesada de uma IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2R, IgG2a, I19G4, IgE ou IgA. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada de IgG é usada para formar complexos moleculares de MHC de classe |. Se forem desejados complexos moleculares de MHC de classe | multivalentes, as cadeias pesadas de IQM ou IgA podem ser usadas para fornecer moléculas pentavalentes ou tetravalentes, respectivamente.

[082] Moléculas de classe | exemplares incluem HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, e estas podem ser empregadas individualmente ou em qualquer combinação. Em algumas modalidades, o complexo de apresentação de antígeno é um ligante HLA-A2. O termo MHC, como aqui utilizado, pode ser substituído por HLA em cada caso.

[083] Sequências de imunoglobulina em algumas modalidades são sequências de anticorpos monoclonais humanizados.

[084] As aAPCs podem conter um "Sinal 2", como um ligante anti- CD?28. O sinal 2 é geralmente uma molécula que afeta a célula T, isto é, uma molécula que tem um efeito biológico em uma célula T precursora ou em uma célula T específica de antígeno. Em certas modalidades, o sinal 2 é uma molécula coestimulatória de células T. As moléculas coestimulatórias das células T contribuem para a ativação de células T específicas do antígeno. Essas moléculas incluem, mas não estão limitadas a, moléculas que se ligam especificamente a CD28 (incluindo anticorpos), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BB, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, anticorpos que se ligam especificamente ao HVEM, anticorpos que se ligam especificamente ao CD40L e anticorpos que se ligam especificamente ao OXA40. Em algumas modalidades, a molécula coestimulatória (sinal 2) é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou uma porção do mesmo, como F (ab') 2, Fab, scFv ou anticorpo de cadeia única ou outro fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado ou uma porção do mesmo com atividade de ligação ao antígeno, ou é um anticorpo totalmente humano ou uma porção do mesmo com atividade de ligação ao antígeno.

[085] As combinações de ligantes coestimulatórios que podem ser empregadas (na mesma ou em nanopartículas separadas) incluem anti- CD28/anti-CD27 e anti-CD28/anti-41BB. As razões desses ligantes coestimulatórios podem variar para efetuar a expansão.

[086] Os ligantes do sinal 1 e sinal 2 exemplares são descritos no documento WO 2014/209868, que descreve ligantes com uma sulfidrila livre (por exemplo, cisteína não emparelhada), de modo que a região constante possa ser acoplada a suportes de nanopartículas com a funcionalidade química apropriada.

[087] As moléculas de adesão úteis para nano-aAPC podem ser usadas para mediar a adesão do nano-aAPC a uma célula T ou a um precursor de célula T. Moléculas de adesão úteis incluem, por exemplo, ICAM-1 e LFA-3.

[088] Em algumas modalidades, o sinal 1 é fornecido pelos complexos peptídeo-HLA-A?2 e o sinal 2 é fornecido por B7.1-lg ou anti- CD28. Um anticorpo monoclonal anti-CD28 exemplar é 9,3 mAb (Tan et al., J. Exp. Med. 1993 177:165), que pode ser humanizado em certas modalidades e/ou conjugado à esfera como um anticorpo totalmente intacto ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[089] A ativação magnética pode ocorrer por 2 minutos a 5 horas, ou de 5 minutos a duas horas, seguida de expansão em cultura por pelo menos 5 dias e até duas semanas ou até 3 semanas em algumas modalidades. Em algumas modalidades, a ativação magnética ocorre por pelo menos 2 minutos, mas menos de 30 minutos (por exemplo, cerca de 5 ou 10 minutos). As células T CD8+ resultantes podem ser caracterizadas fenotipicamente para confirmar a presença de células- tronco da memória T (Tsem), bem como um alto fenótipo de memória central e efetora.

[090] Algumas modalidades empregam fatores de crescimento de células T durante a expansão, que afetam a proliferação e/ou diferenciação de células T. Exemplos de fatores de crescimento de células T incluem citocinas (por exemplo, interleucinas, interferons) e superantígenos. Se desejado, as citocinas podem estar presentes em complexos moleculares compreendendo proteínas de fusão ou podem ser encapsuladas pela aAPC ou fornecidas na forma solúvel. Citocinas particularmente úteis incluem MIP-18, IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, I1L-15, 11-21, IFN-y e CXCL10. Em algumas modalidades, os fatores de crescimento incluem 3, 4, 5 ou 6 de MIP-18, IL-18, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, I1L-21 e INF-y. Nestas ou outras modalidades, as células são expandidas em cultura na presença de uma, duas, três citocinas selecionadas de MIP-1B, IL-18 e IL-6 e, opcionalmente, 11-10. Em algumas modalidades, as células não são cultivadas na presença de IL- 7 e/ou IL-21 e/ou IL-15. As células podem ser expandidas em cultura de 1 a 4 semanas, como cerca de duas semanas (cerca de 14 dias) ou cerca de 3 semanas.

[091] Em algumas modalidades, as células são expandidas em cultura na presença de 4 a 8 citocinas, para alcançar um equilíbrio entre a expansão de células T (incluindo a expansão de células T específicas do antígeno), a ativação e o fenótipo de memória. Em algumas modalidades, as células são expandidas na presença de IL-4. Em algumas modalidades, as células são expandidas na presença de IL-4 e I|L-6. Em algumas modalidades, as células são expandidas na presença de IL-4 e IL-18. Em algumas modalidades, as células são expandidas na presença de IL-4, IL-6 e IL-18. Em algumas modalidades, as células são expandidas na presença de IL-2, IL-4 e IL-

6. Em algumas modalidades, as células são expandidas em cultura na presença de IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL-18. Em algumas modalidades, as células são expandidas ainda na presença de IL-10.

[092] Em algumas modalidades, os fatores de crescimento consistem ou consistem essencialmente em IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL- 16, e opcionalmente IL-10.

[093] Em algumas modalidades, a IL-2 está presente no início da cultura de 10 a 200 Unidades Internacionais (IU) por ml, como de cerca de 20 a cerca de 100 IU/ml, ou cerca de 20 a cerca de 60 IU/ml. Em algumas modalidades, a IL-2 está presente no início da cultura em cerca de 30 a cerca de 50 IU/ml (por exemplo, cerca de 40 IU/ml). A IU da IL- 2 (86/500 NIBSC) pode ser determinada usando um ensaio de proliferação (por exemplo, usando a linha celular CTLL-2), como descrito, por exemplo, por Gearing e Bird (1987) Lymphokines and Interferons, A Practical Approach. Clemens, MJ et al. (eds): IRL Press.

295. Em algumas modalidades, a IL-2 está presente no início da cultura de cerca de 2 a cerca de 25 ng/ml, tal como de cerca de 5 a cerca de ng/ml.

[094] Nestas ou modalidades independentes, a IL-4 está presente no início da cultura em 0,2 a 25 Unidades Internacionais (IU) por ml, como de cerca de 0,5 a cerca de 10 IU/ml, ou de cerca de 0,5 a cerca de 5 IU/ml. Em algumas modalidades, a IL-4 está presente no início da cultura em cerca de 1 IU/ml. A IL-4 IU (88/656 NIBSC) pode ser definida usando um ensaio de proliferação (por exemplo, usando a linha celular TF-1), como descrito, por exemplo, por Kitamura T. et al., (1991) IL-1 regula positivamente a expressão de receptores de citocinas em uma linha celular hemopoiética humana dependente do fator, TF-1. Int. Immunol. 3:571-577. Em algumas modalidades, a IL-4 está presente no início da cultura em cerca de 0,2 a cerca de 2 ng/ml, como de cerca de 0,2 a cerca de 1 ng/ml (por exemplo, cerca de 0,5 ng/ml).

[095] Nestas ou modalidades independentes, a IL-6 pode estar presente no início da cultura de 10 a 200 Unidades Internacionais (IU) por ml, como de cerca de 25 a cerca de 100 IU/ml, como de 25 a 75 IU/ml. Em algumas modalidades, a IL-6 está presente no início da cultura em cerca de 40 a cerca de 60 IU/ml (por exemplo, cerca de 50 IU/ml). A IU de IL-6 (89/548 NIBSC) pode ser definida usando um ensaio de proliferação (por exemplo, usando a linha celular B9), como descrito por exemplo por Gaines-Das RE e Poole S. (1993) The international standard for interleukin-6. Evaluation in an international collaborative study. J. Immunol. Methods 160:147-153. Em algumas modalidades, a IL-6 está presente no início da cultura em cerca de 0,2 a cerca de 10 ng/ml, como de cerca de 0,2 a cerca de 5 ng/ml (por exemplo, cerca de 0,5 a 2 ng/ml).

[096] Nestas ou em modalidades independentes, a erferon gama (INF-y) pode estar presente no início da cultura de 10 a 200 Unidades Internacionais (IU) por ml, como de cerca de 20 a cerca de 100 IU/ml, como de 20 a 60 IU/ml. Em algumas modalidades, o INF-y está presente no início da cultura em cerca de 30 a cerca de 50 IU/ml (por exemplo, cerca de 40 IU/ml). A IU de INF-y (87/586 NIBSC) pode ser definida usando um ensaio antiviral (por exemplo, com células Hela infectadas com EMC), como descrito por exemplo em Meager A. (1987) em Lymphokines and interferons, a Practical Approach. Clemens, MJ, et al. (eds): IRL Press. 129. Em algumas modalidades, o INF-y está presente no início da cultura em cerca de 0,5 a cerca de 20 ng/ml, como de cerca de 1 a cerca de 10 ng/ml (por exemplo, de 1 a 5 ng/ml).

[097] O IL-18 pode estar presente no início da cultura de 5 a 100 Unidades Internacionais (IU) por ml, como de cerca de 10 a cerca de 50 IU/ml, como de cerca de 10 a cerca de 30 IU/ml. Em algumas modalidades, a IL-18 está presente no início da cultura em cerca de 10 a cerca de 20 IU/ml (por exemplo, cerca de 15 IU/ml). A IU de IL-1B (86/680 NIBSC) pode ser definida usando um ensaio de proliferação (por exemplo, usando células D.10.G4.1), como descrito por exemplo por Poole, S. e Gaines-Das, RE (1991) The international standards for interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta. Evaluation in an international collaborative study. J. Immunol. Methods 142:1-13. Em algumas modalidades, a IL-18 está presente no início da cultura em cerca de 0,2 a cerca de 5 ng/ml, como de cerca de 0,2 a cerca de 2 ng/ml, ou de cerca de 0,2 a cerca de 1 ng/ml.

[098] Em várias modalidades, as células são cultivadas na presença de um coquetel de fator de crescimento que compreende ou consiste em IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL-18. Em algumas modalidades, a atividade relativa (definida pela respectiva IU) de IL-2 e INF-y é de cerca de 0,5: 1 a cerca de 1: 0,5 (por exemplo, cerca de 1: 1). Nestas ou nas modalidades independentes, a atividade relativa (definida pelas respectivas IU) de IL-2 e IL-6 é de cerca de 0,5: 1 a 1: 0,5. Nestas ou nas modalidades independentes, a atividade relativa de IL-168 em relação a IL-2, IL-6 e/ou IFN-y (definido pelas respectivas IUs) é de 1:4 a 1: 2 (por exemplo, cerca de 1:3). Nestas ou nas modalidades independentes, a atividade relativa de IL-4 em relação a IL-2, IL-6 e/ou IFN-y (definido pelas respectivas IUs) é de 1:30 a 1:60. Nestas ou nas modalidades independentes, a atividade relativa de I1L-4 em relação à IL-168 (definida pelas respectivas IUs) é de cerca de 1:5 a cerca de 1:25, tal como de cerca de 1:10 a cerca de 1:20.

[099] Em algumas modalidades, a atividade específica de cada fator de crescimento (IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL-1B) no início da cultura (em IUs) pode ser mostrada como uma porcentagem quando as IUs totais de todos os fatores de crescimento da cultura são consideradas 100%. Por exemplo, em algumas modalidades, a porcentagem de cada fator de crescimento na cultura pode ser a seguinte: 20% a 40% de IL-2 (por exemplo, 20 a 30% de I|L-2); 0,5% a 5% de IL-4 (por exemplo, 1 a 3% de IL-4); 25% a 50% de IL-6 (por exemplo, 30 a 40% de IL-6); 20% a 40% de IFN-y (por exemplo, 20 a 30% de IFN-y); e 5% a 20% de IL-16B (por exemplo, 5 a 15% de IL-18).

[0100] As nanopartículas de aAPC podem ser feitas de qualquer material, e os materiais podem ser adequadamente selecionados para a propriedade magnética desejada e podem compreender, por exemplo, metais como ferro, níquel, cobalto ou liga de metais de terras raras. Os materiais paramagnéticos também incluem magnésio, molibdênio, lítio,

tântalo e óxido de ferro. As esferas paramagnéticas adequadas para enriquecimento de materiais (incluindo células) estão disponíveis comercialmente e incluem esferas de ferro dextrana, tais como esferas de óxido de ferro revestidas com dextrana. Nos aspectos da invenção em que as propriedades magnéticas não são necessárias, as nanopartículas também podem ser feitas de materiais não metálicos ou orgânicos (por exemplo, poliméricos), como celulose, cerâmica, vidro, náilon, poliestireno, borracha, plástico ou látex. Em um exemplo de material para a preparação de nanopartículas está o poli (ácido lático- co-glicólico) (PLGA) ou PLA e seus copolímeros, que podem ser empregados em conjunto com essas modalidades. Outros materiais, incluindo polímeros e copolímeros que podem ser empregados, incluem os descritos em PCT/US2014/25889, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0101] Em várias modalidades, a partícula tem um tamanho (por exemplo, diâmetro médio) dentro de cerca de 10 a cerca de 500 nm, ou dentro de cerca de 40 a cerca de 400 nm, ou dentro de cerca de 100 nm a 400 nm. Para agrupamento magnético, é preferível que as nanopartículas tenham um tamanho na faixa de 10 a 250 nm ou 20 a 100 nm em algumas modalidades. As interações receptor-ligante na interface célula-nanopartícula não são bem conhecidas. No entanto, a ligação de nanopartículas e a ativação celular são sensíveis à organização espacial da membrana, o que é particularmente importante durante a ativação das células T, e os campos magnéticos podem ser usados para manipular nanopartículas ligadas a aglomerados para melhorar a ativação. Por exemplo, a ativação de células T induz um estado de agrupamento de TCR em nanoescala persistentemente aprimorado e as nanopartículas são sensíveis a esse agrupamento de uma maneira que as partículas maiores não são.

[0102] Além disso, as interações de nanopartículas com aglomerados de TCR podem ser exploradas para aprimorar o desencadeamento de receptores. A ativação das células T é mediada pela agregação de proteínas de sinalização, com "aglomerados de sinalização" com centenas de nanômetros de diâmetro, formando-se inicialmente na periferia do local de contato da célula T-APC e migrando para dentro. Como descrito aqui, um campo magnético externo pode ser usado para enriquecer células T específicas de antígeno (incluindo células raras puras) e para conduzir a agregação de nano-aAPC magnética ligado ao TCR, resultando na agregação de agregados de TCR e na ativação aprimorada de células T naive. Os campos magnéticos podem exercer forças adequadamente fortes sobre as partículas paramagnéticas, mas são biologicamente inertes, tornando- os uma ferramenta poderosa para controlar o comportamento das partículas. As células T ligadas à nano-aAPC paramagnética são ativadas na presença de um campo magnético aplicado externamente. As nano-aAPC são magnetizadas e atraídas para a fonte do campo e para as nanopartículas próximas no campo, induzindo o grânulo e, portanto, a agregação de TCR para aumentar a ativação mediada pela aAPC.

[0103] As químicas de ativação podem ser usadas para permitir a fixação específica e estável de moléculas à superfície das nanopartículas. Existem vários métodos que podem ser usados para anexar proteínas a grupos funcionais. Por exemplo, o glutaraldeído reticulador comum pode ser usado para conectar grupos amina de proteínas a uma superfície de nanopartículas aminadas em um processo de duas etapas. A ligação resultante é hidroliticamente estável. Outros métodos incluem o uso de reticuladores contendo ésteres de n-hidrossuccinimida (NHS) que reagem com aminas nas proteínas, reticuladores que contêm halogênios ativos que reagem com proteínas contendo amina, sulfidrila ou histidina, reticuladores que contêm epóxidos que reagem com grupos aminas ou sulfidrila, conjugação entre grupos maleimida e grupos sulfidrila e a formação de grupos proteína aldeído por oxidação periódica das porções de açúcar pendente seguida de aminação redutora.

[0104] A razão de ligantes específicos quando utilizados simultaneamente na mesma ou em partículas diferentes pode variar para aumentar a eficácia da nanopartícula na apresentação de antígeno ou ligante coestimulatório. Por exemplo, as nanopartículas podem ser acopladas a HLA-A2-lg e anti-CD28 (ou outros ligantes de sinal 2) em uma variedade de razões, como cerca de 30: 1, cerca de 25: 1, cerca de 20: 1, cerca de 15: 1, cerca de 10: 1, cerca de 5: 1, cerca de 3: 1, cerca de 2: 1, cerca de 1: 1, cerca de 0,5: 1, cerca de 0,3: 1; cerca de 0,2: 1, cerca de 0,1: 1 ou cerca de 0,03: 1. Em algumas modalidades, a razão é de 2: 1 para 1: 2. A quantidade total de proteína acoplada aos suportes pode ser, por exemplo, cerca de 250 mg/ml, cerca de 200 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 100 mg/ml ou cerca de 50 mg/ml de partículas. Em virtude de as funções efetoras, como liberação e crescimento de citocinas, poderem ter requisitos diferentes para o sinal 1 contra sinal 2 do que a ativação e diferenciação de células T, essas funções podem ser determinadas separadamente.

[0105] Em certas modalidades, as aAPCs são partículas paramagnéticas na faixa de 50 a 150 nm, com uma PDI (distribuição de tamanho) menor que 0,2 ou em algumas modalidades menor que 0,1. As aAPCs podem ter uma carga superficial de O a -10 mV, tal como de cerca de -2 a -6 mV. As aAPCs podem ter de 10 a 120 ligantes por partícula, como de cerca de 25 a cerca de 100 ligantes por partícula, com ligantes conjugados à partícula através de uma cisteína livre introduzida na região Fc das sequências de imunoglobulina. As partículas podem conter uma razão de cerca de 1: 1 de dímero de HLA:anti-CD28, que pode estar presente na mesma ou em diferentes populações de partículas. As nanopartículas fornecem expansão potente das células T cognatas, embora não exibam estimulação de TCRs não cognatos, mesmo com carga passiva do antígeno de peptídeo. As partículas são estáveis na forma liofilizada por pelo menos dois ou três anos.

[0106] Após o enriquecimento e a expansão, o componente de célula T específico do antígeno da amostra será de pelo menos cerca de 5% ou pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 15% ou pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 25% das células T específicas de antígeno. Além disso, essas células T geralmente exibem um fenótipo de memória (incluindo a memória central e efetora, bem como as células-tronco da memória T). A partir da amostra original isolada do paciente, as células T específicas do antígeno em várias modalidades são expandidas (em cerca de 7 dias) de cerca de 100 Vezes a cerca de 10.000 vezes, como pelo menos cerca de 100 vezes ou pelo menos cerca de 200 vezes. Após 2 semanas, as células T específicas do antígeno são expandidas pelo menos 1.000 vezes, ou pelo menos cerca de 2.000 vezes, pelo menos cerca de 3.000 vezes, pelo menos cerca de 4.000 vezes ou pelo menos cerca de 5.000 vezes em várias modalidades. Em algumas modalidades, as células T específicas do antígeno são expandidas em mais de 5.000 vezes ou em mais de 10.000 vezes após duas semanas. Após uma ou duas semanas de expansão, são obtidos pelo menos cerca de 10º ou pelo menos cerca de 107 ou pelo menos cerca de 10º ou pelo menos cerca de 10º células T específicas do antígeno.

[0107] As condições de incubação adequadas (meio de cultura, temperatura, etc.) incluem as usadas para cultivar células T ou precursores de células T, bem como as conhecidas na técnica para induzir a formação de células T específicas de antígeno usando células apresentadoras de antígeno DC ou artificiais.

[0108] A composição celular pode ser administrada aos pacientes por quaisquer vias apropriadas, incluindo infusão intravenosa, administração intra-arterial, administração intralinfática e administração intratumoral.

[0109] Em algumas modalidades, o paciente recebe imunoterapia com um ou mais inibidores do ponto de verificação, antes de (ou opcionalmente após) receber a composição celular por transferência adotiva. Em várias modalidades, o(s) inibidor(es) do ponto de verificação têm como alvo um ou mais de CTLA-4 ou PD-1/PD-L1, que podem incluir anticorpos contra tais alvos, como anticorpos monoclonais ou porções dos mesmos, ou versões humanizadas ou totalmente humanas dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia inibidora do ponto de verificação compreende ipilimumabe ou Keytruda (pembrolizumabe).

[0110] Em algumas modalidades, o paciente recebe cerca de 1a 5 rodadas de imunoterapia adotiva (por exemplo, uma, duas, três, quatro ou cinco rodadas). Em algumas modalidades, cada administração de imunoterapia adotiva é realizada simultaneamente com, ou após (por exemplo, cerca de 1 dia a cerca de 1 semana após), uma rodada de terapia inibidora de ponto de verificação. Em algumas modalidades, a imunoterapia adotiva é fornecida cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias ou cerca de uma semana após uma dose de inibidor de ponto de verificação. Em algumas modalidades, o paciente recebe apenas uma única administração da composição celular.

[0111] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para imunoterapia personalizada contra o câncer. Os métodos são realizados usando as aAPCs para identificar os antígenos aos quais o paciente responderá, seguido pela administração da aAPC carregada com o peptídeo apropriado para o paciente, ou seguido pelo enriquecimento e expansão das células T específicas do antígeno ex vivo.

[0112] O sequenciamento em todo o genoma alterou drasticamente nossa compreensão da biologia do câncer. O sequenciamento de cânceres produziu dados importantes sobre os processos moleculares envolvidos no desenvolvimento de muitos cânceres humanos. Mutações driver foram identificadas em genes-chave envolvidos nas vias que regulam três processos celulares principais (1) destino celular, (2) sobrevivência celular e (3) manutenção do genoma. Vogelstein et al., Science 339, 1546-58 (2013).

[0113] O sequenciamento em todo o genoma também tem o potencial de revolucionar nossa abordagem à imunoterapia contra o câncer. Os dados de sequenciamento podem prover informações sobre alvos tanto compartilhados quanto personalizados para imunoterapia contra o câncer. Em princípio, as proteínas mutantes são estranhas ao sistema imunológico e são antígenos putativos específicos de tumores. De fato, os esforços de sequenciamento definiram centenas, senão milhares, de alvos imunes potencialmente relevantes. Estudos limitados mostraram que as respostas das células T contra esses neo-epítopos podem ser encontradas em pacientes com câncer ou induzidas por vacinas contra o câncer. No entanto, a frequência de tais respostas contra um câncer específico e a extensão em que essas respostas são compartilhadas entre os pacientes não são bem conhecidas. Uma das principais razões para a nossa compreensão limitada das respostas imunológicas específicas do tumor é que as abordagens atuais para validar possíveis alvos imunologicamente relevantes são incômodas e demoradas.

[0114] Embora a tolerância central anule as respostas das células T contra autoproteínas, mutações oncogênicas induzem neo-epítopos contra os quais as respostas das células T podem se formar. Os catálogos de mutações derivados do sequenciamento completo do exoma fornecem um ponto de partida para identificar esses neo-

epítopos. Utilizando algoritmos de previsão de ligação ao HLA (Srivastava, PLoS One 4, e6094 (2009)), foi previsto que cada câncer pode ter até 7 a 10 neo-epítopos. Uma abordagem semelhante estimou centenas de neo-epítopos tumorais. Tais algoritmos, no entanto, podem ter baixa precisão na previsão das respostas das células T, e espera-se que apenas 10% dos epítopos de ligação ao HLA previstos se liguem no contexto do HLA (Lundegaard C, Immunology 130, 309-18 (2010)). Assim, os epítopos previstos devem ser validados quanto à existência de respostas de células T contra esses potenciais neo-epítopos.

[0115] Em certas modalidades, o sistema nano-aAPC é usado para rastrear neo-epítopos que induzem uma resposta de células T em uma variedade de cânceres ou no câncer de um paciente em particular. Os cânceres podem ser analisados geneticamente, por exemplo, por sequenciamento total do exoma.

[0116] Uma lista de peptídeos candidatos pode ser gerada da sobreposição de nove janelas de aminoácidos em proteínas mutadas. Todas as nove janelas AA que contêm um aminoácido mutado e 2 "controles" não mutados de cada proteína serão selecionados. Esses peptídeos candidatos serão avaliados computacionalmente com relação à ligação ao MHC usando um consenso de algoritmos de previsão de ligação ao MHC, incluindo Net MHC e método de matriz estabilizada (SMM). Os algoritmos de ligação Nano-aAPC e MHC foram desenvolvidos principalmente para o alelo HLA-A2. O corte de sensibilidade da previsão de consenso pode ser ajustado até que seja identificado um número tratável de mutação contendo peptídeos (- 500) e peptídeos de controle não mutados (- 50).

[0117] Em modalidades exemplares, a composição celular compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável: pelo menos 90% de células T CD8+ e menos de 5% de células T CD4+; pelo menos 10º células T CD8+ específicas para 1 a 10 antígenos de peptídeo alvo associados ao tumor e células T CD8+ específicas para patógenos bacterianos, virais e/ou fúngicos, em que pelo menos 30% das células T CD8+ são células T de memória central e de memória efetora com uma razão de 25:75 a 75:25, com menos de 10% das células T CD8+ sendo células T diferenciadas terminalmente. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo alvo associados ao tumor são células T de memória central e de memória efetora com uma razão de 25:75 a 75:25 e com menos de 10% das células T CD8+ sendo células T terminalmente diferenciadas. Em algumas modalidades, a composição celular compreende ainda de cerca de 5% a cerca de 20% de células- tronco de memória T (Tscm), ou de cerca de 5% a cerca de 15% de células-tronco de memória T.

[0118] A composição celular compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável adequado para infusão intravenosa e que pode ser adequado como um crioprotetor. No exemplo de transportador é DMSO (por exemplo, cerca de 10%). As composições celulares podem ser fornecidas em frascos ou sacos unitários e armazenadas congeladas até o uso. As doses unitárias podem compreender de cerca de 5 x 10º a cerca de 5 x 108 células por ml, em um volume de 50 a 200 ml. Em certas modalidades, o volume da composição é <100 ml (por exemplo, de 50 a 100 ml).

[0119] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para o tratamento de um paciente com câncer, compreendendo a administração da composição celular aqui descrita a um paciente em necessidade.

[0120] Em algumas modalidades, o paciente tem um câncer hematológico, que em algumas modalidades foi recidivo após o transplante alogênico de células-tronco. Em algumas modalidades, o paciente tem leucemia mieloide aguda (AML) ou síndrome mielodisplásica.

[0121] Outros cânceres que podem ser tratados de acordo com esta descrição incluem cânceres que historicamente iliiam respostas imunes ruins ou têm uma alta taxa de recorrência. Exemplos de câncer incluem vários tipos de tumores sólidos, incluindo carcinomas, sarcomas e linfomas. Em várias modalidades, o câncer é melanoma (incluindo melanoma metastático), câncer de cólon, câncer duodenal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário, câncer ductal, câncer hepático, câncer de pâncreas, câncer renal, câncer de endométrio, câncer de testículo, câncer de estômago, displásico mucosa oral, polipose, câncer de cabeça e pescoço, câncer bucal invasivo, carcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma, carcinoma urinário de células transicionais e escamosas, câncer cerebral, neuroblastoma e glioma. Em várias modalidades, o câncer é de estágio |, estágio Il, estágio Ill ou estágio IV. Em algumas modalidades, o câncer é metastático e/ou recorrente e/ou não é ressecável.

[0122] Em algumas modalidades, o paciente é refratário à quimioterapia e/ou terapia inibidora de ponto de verificação.

[0123] Em algumas modalidades, o paciente recebe ainda terapia de citocina em baixa dose, o que pode melhorar a persistência e a resposta in vivo.

[0124] Em algumas modalidades, o câncer é uma neoplasia hematológica, incluindo leucemia, linfoma ou mieloma. Por exemplo, a malignidade hematológica pode ser leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia aguda na infância, linfomas não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, síndrome mielodisplásica, células T cutâneas malignas, micoses fungoides, linfoma de células T cutâneas não-MF, papulose linfomatoide e hiperplasia linfoide cutânea rica em células T. Em uma modalidade exemplar, o paciente tem um câncer hematológico, como leucemia mieloide aguda (AML) ou síndrome mielodisplásica, e em algumas modalidades o paciente foi recidivo após o transplante alogênico de células-tronco. Em algumas modalidades, a terapia não induz GVHD.

[0125] Em algumas modalidades, o paciente, além do transplante alogênico de células-tronco, também é submetido à terapia de deleção linfoma, terapia citorredutora ou terapia imunomoduladora (antes da administração da terapia celular). Em algumas modalidades, a terapia celular pode ainda ser fornecida com ou sem suporte de citocina após o tratamento.

[0126] Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença infecciosa ou está em risco de uma doença infecciosa. Por exemplo, os pacientes que foram submetidos ao HSCT correm um risco particular de doença infecciosa, dado o estado imunocomprometido. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem as causadas por bactérias, vírus, príons, fungos, parasitas, helmintos, etc. Tais doenças incluem AIDS, hepatite B/C, infecção por CMV, infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV), influenza, infecção pelo vírus do herpes (incluindo herpes zóster) e infecção por adenovírus. O CMV, por exemplo, é o patógeno viral mais comum encontrado em pacientes transplantados e é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes submetidos a transplante de medula óssea ou de células-tronco do sangue periférico. Isso se deve ao estado imunocomprometido desses pacientes, que permite a reativação do vírus latente em pacientes soropositivos ou infecção oportunista em indivíduos soronegativos. Nestas modalidades, o paciente pode receber imunoterapia adotiva compreendendo células T específicas para antígenos patógenos. O método pode levar à geração de CTL específico do vírus derivado do paciente ou de um doador apropriado antes do início do procedimento de transplante.

[0127] O PTLD ocorre em uma fração significativa dos pacientes transplantados e resulta da infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Acredita-se que a infecção por EBV esteja presente em aproximadamente 90% da população adulta nos Estados Unidos. A replicação e infecção virais ativas são controladas pelo sistema imunológico, mas, como nos casos de CMV, os indivíduos imunocomprometidos pelas terapias de transplante perdem as populações controladoras de células T, o que permite a reativação viral. Isso representa um sério impedimento aos protocolos de transplante. O EBV também pode estar envolvido na promoção do tumor em uma variedade de cânceres hematológicos e não hematológicos.

[0128] Outros aspectos e modalidades da invenção serão evidentes para os versados.

EXEMPLOS

[0129] As células T específicas do antígeno foram enriquecidas e expandidas de células doadoras isoladas por leucaferese. As células foram esgotadas de células CD4+ por seleção negativa com microesferas de CDA4. As células resultantes foram enriquecidas para células T específicas do antígeno através da incubação com nanopartículas paramagnéticas (nanopartículas de óxido de ferro revestidas com dextrana, com cerca de 80 a 200 nm de diâmetro). As nanopartículas têm ligantes HLA diméricos conjugados à superfície (apresentando o antígeno de peptídeo alvo), bem como um anticorpo monoclonal anti-CD28 agonístico. O ligante HLA dimérico contém dois domínios HLA-A2, compreendendo as fendas de ligação ao peptídeo, cada uma fundida com um braço da região de dobradiça de Ig. Os HLA- lg diméricos são coexpressos com microglobulina B2. Os ligantes e construtos de aAPC são divulgados nos documentos WO 2016/044530 e WO 2016/105542, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0130] As células foram incubadas na presença da aAPC paramagnética, depois na presença de um campo magnético por cerca de 5 minutos. As células associadas às partículas foram então recuperadas e expandidas ex vivo por vários períodos de tempo (geralmente de 1 a 2 semanas). A expansão foi realizada na presença de fatores de crescimento. Durante um período de cultura de duas semanas, os fatores de crescimento foram adicionados nos dias 1 e 7. As células foram re-estimuladas com aAPCs no dia 7.

[0131] As células T específicas do antígeno também foram enriquecidas e expandidas em lote. Por exemplo, a FIGURA 3 mostra o enriquecimento e a expansão em lote de peptídeos específicos para AML Prame100 RHAMM, WT1 e Survivin. No dia 7, as células contêm 1,4% específico para Prame, 1,8% específico para RHAMM, 7,0% específico para WT1 e 2,3% específico para Survivin. O componente total de células T específicas para o antígeno é de 12,5% nesta modalidade. As células T foram caracterizadas por coloração com tetrâmero.

[0132] A FIGURA 4 mostra que a composição com estimulação e expansão individual para duas semanas teve níveis consistentes de células T específicas para o antígeno de AML. O processo de estimulação e expansão individual gera consistentemente — 15% de células T específicas do antígeno.

[0133] A FIGURA 5 mostra que o processo simultâneo de estimulação/expansão gera frequências de células T específicas para AML comparáveis à estimulação/expansão individual. A composição mostrada preparada por estimulação/expansão em lote tem — 47% de células T específicas do antígeno.

[0134] A FIGURA 6 mostra que as células T geradas demonstram a morte específica de antígeno de células tumorais de AML (linha celular THP-1). As células T específicas de AML são direcionadas para 5 epítopos de WT-1, PRAME e Survivin. De 1 a 100 (razão de alvo para efetora), — 40% das células alvo foram mortas.

[0135] Como mostrado na FIGURA 7 o coquetel de citocinas usado para expansão ex vivo pode impactar o número e o fenótipo das células resultantes.

[0136] As células foram ainda caracterizadas por seu fenótipo, naive (CD62L+, CD45RA+), memória central (CD62L+, CD45RA-), memória efetora (CD62L-, CD45RA-) e memória diferenciada terminalmente (CD62L-, CD45RA+). As células T específicas de MART- 1 e AML enriquecidas e expandidas ex vivo de linfócitos do doador são predominantemente fenótipo de memória central e de memória efetora. Ver FIGURA 2. Particularmente para peptídeos de AML, em três experiências representativas, as células puras estavam presentes em 3,82%, 14,2% e 14,8%. As células de memória terminalmente diferenciadas estavam presentes em 3,82%, 3% e 6,7%. Enquanto isso, o componente de memória central e efetor das células específicas do antígeno foi 92,3%, 82,8% e 78,52%.

[0137] As células foram caracterizadas pelo fenótipo de ativação, a saber, coloração para IL-2 (proliferação e memória), IFN-y (ativando outras células T, memória, regulação positiva de MHC), TNF-a (pró- inflamatório) e CD107A (liberação de granzimas atividade citotóxica). Ver FIGURA 1. Como mostrado, a maioria das células possui 3 ou até 4 funções. Por exemplo, 32,5% das células produzem IL-2 e IFN-y após a ativação e 94,2% das células produzem TNF-a e CD107a após a ativação.

[0138] As células espectadoras específicas para antígenos virais foram quantificadas adicionalmente por coloração com tetrâmero. A FIGURA 8 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 7 após enriquecimento e expansão específicos para MART-1. A FIGURA 9 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 14 após enriquecimento e expansão específicos para MART-1. Essas células também são amplamente de fenótipo da memória central e efetora. FIGURA 10 mostra a presença de células T espectadoras específicas para vírus no dia 14 após enriquecimento e expansão específicos para AML. A FIGURA 11 mostra a detecção de células T espectadoras específicas para CMV durante o processo de enriquecimento e expansão específico de MART-1. À porcentagem de células espectadoras específicas do vírus permanece constante até o Dia 14 (entre 0,5 e 1%), enquanto o número e a porcentagem de células T específicas para MART-1 aumentam dramaticamente.

[0139] A FIGURA 12 mostra a detecção de células espectadoras específicas de vírus no Dia 14 após enriquecimento e expansão específicos de MART-1 usando um coquetel de fator de crescimento de células T recombinante (IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, 11-21, IFN -y e MIP1-B), demonstra manutenção e expansão espectadora de células T virais específicas direcionadas a múltiplos epítopos além de Adeno, CMV, EBV e influenza.

[0140] Como mostrado na Figura 13A e Figura 13B, as células T específicas de Mart-1 foram geradas pelo processo de enriquecimento e expansão, na presença das seguintes citocinas durante a expansão: IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y e IL1-B. A composição deste coquetel de citocinas é mostrada na Tabela 1. Tabela 1: Coquetel de citocinas para a fase de expansão Citocinas Atividade "específica | Atividade específica na nos meios de cultura | solução de estoque 50X finais (IU/ml) (IU/ml)

[0141] Nesta experiência, 6,74 x 10º linfócitos CD8+ de um doador saudável foram enriquecidos como descrito anteriormente. Após o enriquecimento, havia 2,81 x 10º células no total. No dia 14 de expansão, havia 5,28 x 10º de células totais, mostrando uma expansão de 1,88 vez do total de células. Essas células expandidas no dia 14 foram — 35% específicas para MART-1 e cerca de 94% viáveis (Figura 13B). As células específicas de MART-1 foram expandidas cerca de 2776 vezes, assumindo que cerca de 1 em 105º células precursoras foram específicas de MART-1.

[0142] Na avaliação da cultura total, as células T apresentaram um fenótipo de cerca de 66% de memória central e cerca de 32% de memória efetora. Menos de 2% das células foram puras e a quantidade de células Temra foi insignificante. Além disso, as células específicas de MART-1 tinham cerca de 89% de memória central e cerca de 9% de memória efetora, com menos de 2% de células puras e um número desprezível de TemRA.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição celular isolada para imunoterapia adotiva, a composição caracterizada pelo fato de que compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável: pelo menos 10º células T CD8+ específicas pra um ou mais antígenos de peptídeo de alvo, em que pelo menos 20% de células T na composição exibem um fenótipo de memória central ou memória efetora.

2. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células T CD8+ são específicas para de 1 a 100 antígenos de peptídeo de alvo.

3. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a especificidade de célula T em direção a um antígeno de peptídeo de alvo na composição é definida por coloração de multímero de MHC.

4. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os antígenos de peptídeo de alvo são antígenos associados a tumor.

5. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que um ou mais antígenos de peptídeo de alvo são neoantígenos derivados de tumor ou específicos de tumor.

6. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que um ou mais antígenos de peptídeo de alvo são antígenos bacterianos, virais, fúngicos ou parasíticos.

7. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende células T CD8+ específicas para pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco antígenos de peptídeo de alvo.

8. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos antígenos de peptídeo de alvo é reconhecido por uma célula T precursora de baixa frequência.

9. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de pelo menos 90% de células T.

10. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de pelo menos 98% de células T.

11. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de pelo menos 5% de células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo.

12. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de pelo menos 10% de células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo.

13. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de pelo menos 15% de células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo.

14. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a composição de célula compreende ainda células T CD8+ específicas para patógenos bacterianos, virais e/ou fúngicos.

15. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que as células T CD8+ específicas para patógenos bacterianos, virais ou fúngicos incluem células T específicas para antígenos de influenza, CMV, EBV e/ou adenovírus.

16. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que as células T são de pelo menos 30% de células T de memória central e efetora.

17. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que as células T são de pelo menos 50% de células T de memória central e efetora.

18. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que as células T são de pelo menos 70% de células T de memória central e efetora.

19. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que as células T são de pelo menos 80% de células T de memória central e efetora.

20. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que as células T específicas para os um ou mais antígenos-alvo são de pelo menos 50% de células T de memória central e efetora.

21. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que as células T específicas para os um ou mais antígenos-alvo são de pelo menos 60% de células T de memória central e efetora.

22. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que as células T específicas para os um ou mais antígenos-alvo são de pelo menos 70% de células T de memória central e efetora.

23. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que as células T específicas para os um ou mais antígenos-alvo são de pelo menos 80% de células T de memória central e efetora.

24. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que as células T de memória central e efetora são de 10:90 a 90:10 células de memória central para efetora.

25. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que as células T de memória central e efetora são de 25:75 a 75:25 de células de memória central para efetora.

26. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que as células de memória central e efetora são de 40:60 a 60:40 de células de memória central para efetora.

27. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que as células T são menos de 20% terminalmente diferenciadas.

28. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que as células T são menos de 10% terminalmente diferenciadas.

29. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que as células T são menos de 10% terminalmente diferenciadas.

30. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos 20% de células puras.

31. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos 10% de células puras.

32. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos 5% de células puras.

33. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos 1,5% de células puras.

34. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo fato de que compreende ainda células-tronco de memória T.

35. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 5% a cerca de 25% de células-tronco de memória T.

36. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que as células T CD8+ exibem um fenótipo polifuncional mediante ativação.

37. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de menos de 10% de células T CD4+.

38. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de menos de 5% de células T CD4+.

39. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de menos de 2% de células T CD4+.

40. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de menos de 1,5% de células T CD4+.

41. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a composição de célula é de menos de 1% de células T CD4+.

42. Composição de célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizada pelo fato de que a composição não compreende células T expressando um receptor de antígeno quimérico ou um TCR recombinante.

43. Composição de célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizada pelo fato de que a composição é produzida por enriquecimento de células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo de células de fonte; e/ou expansão de células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo de células de fonte.

44. Composição de célula, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as células de fonte são de um paciente ou um doador combinado em HLA.

45. Composição de célula, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as células de doador são isoladas por leucaferese.

46. Composição de célula, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as células de fonte são isoladas de tumor de um paciente.

47. Composição de célula, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as células de fonte são uma fração de buffy coat.

48. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizada pelo fato de que a fonte de célula é esgotada para células T CD4+ antes do enriquecimento ou da expansão.

49. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, caracterizada pelo fato de que as células de fonte são CD8+ enriquecidas.

50. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 49, caracterizada pelo fato de que a fonte de célula é de célula NK esgotada.

51. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 50, caracterizada pelo fato de que as

7H células T específicas de antígeno são enriquecidas por aAPCs tendo um ligando classe | de MHC e opcionalmente um ligando coestimulatório.

52. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a aAPCs compreende um ligando coestimulatório que é um ligando que liga CD28.

53. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o ligando coestimulatório é um anticorpo monoclonal, ou porção do mesmo, que é um agonista para CD28.

54. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que o enriquecimento é enriquecimento — magnético “com aAPCs paramagnéticas e em que as células e aAPCs são opcionalmente incubadas na presença de um campo magnético por pelo menos um minuto.

55. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que o enriquecimento é enriquecimento — magnético “com aAPCs paramagnéticos e em que as células e aAPCs são opcionalmente incubadas na presença de um campo magnético por pelo menos cinco horas ou a pela duração da cultura.

56. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizada pelo fato de que as células e aAPCs são incubados na presença de um campo magnético por não mais que cerca de cindo horas.

57. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que as células T específicas de antígeno são enriquecidas e/ou expandidas sem o uso de um campo magnético.

58. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 53, caracterizada pelo fato de que as células enriquecidas são expandidas em cultura por de 1 a 4 semanas.

59. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas em cultura na presença de um ou mais de MIP-1B6, IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, 11-15, 11-21 e INF-y e, opcionalmente, 11-10.

60. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas em cultura na presença de dois ou três de MIP-1B8, IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, 11-15, 11-21 e INF-y e, opcionalmente, 11-10.

61. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas em cultura na presença de um, dois, três, quatro ou cinco de MIP-16, IL-16, IL-2, IL-4, IL-6, 11-21 e INF-y e, opcionalmente, IL-

10.

62. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas em cultura na presença de pelo uma citocina selecionada de MIP-1G6, IL-18 e IL-6 e, opcionalmente, I1L-10.

63. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas na presença de IL-4.

64. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas na presença de IL-4 e IL-6.

65. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas na presença de IL-4 e IL-1B.

66. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas na presença de IL-4, IL-6 e IL-1B.

67. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas na presença de IL-2, IL-4 e IL-6.

68. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as células são expandidas em cultura na presença de IL-2, IL-4, IL-6, INF-y e IL-IB e, opcionalmente, IL-10.

69. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizada pelo fato de que aAPCs funcionais são não detectáveis na composição ou a composição compreende menos de 1% do material de aAPC.

70. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada pelo fato de que um ou mais antígenos de peptídeo de alvo são selecionados de epítopos de peptídeo de Survivina, WT-1, PRAME, Ciclina A1 e PR3.

71. Composição celular isolada adequada para imunoterapia adotiva, a composição caracterizada pelo fato de que compreende, em um transportador farmaceuticamente aceitável: pelo menos 90% de células T CD8+ e menos de 5% de células T CD4+; as células CD8+ compreendendo pelo menos 10º células T CD8+ específicas para de 1 a 10 antígenos de peptídeo de alvo e células T CD8+ específicas para patógenos bacterianos, virais, fúngicos e/ou parasíticos.

em que pelo menos 30% das células T CD8+ são células T de memória central e memória efetora com uma razão de 25:75 a 75:25 e com menos de 10% das células T CD8+ sendo células T terminalmente diferenciadas e menos de 10% das células CD8+ sendo células puras; e em que pelo menos 50% das células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo são células T de memória central e memória efetora com uma razão de 25:75 a 75:25, são menos de 10% de células T terminalmente diferenciadas e são menos de 10% de células puras.

72. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 95% de células T CD8+ e menos de 2% de células T CD4+.

73. Composição celular isolada, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 107 ou 10º células T CD8+ específicas para os antígenos de peptídeo de alvo.

74. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 73, caracterizada pelo fato de que compreende menos de 5% de células T terminalmente diferenciadas e/ou menos de 5% de células puras.

75. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 73, caracterizada pelo fato de que compreende ainda 5% a cerca de 20% de células tronco de memória T.

76. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 75, caracterizada pelo fato de que os antígenos de peptídeo de alvo são antígenos associados a tumor e são, opcionalmente, associados com malignidade hematológica.

77. Composição celular isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 76, caracterizada pelo fato de que um ou mais antígenos de peptídeo de alvo são selecionados de epítopos de peptídeo de Survivina, WT-1, PRAME, Ciclina A1 e PR3.

78. Método para tratar um paciente com câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição celular como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77 a um paciente em necessidade.

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o paciente tem um câncer hematológico.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o câncer hematológico recidivou após transplante de célula tronco alogênica.

81. Método, de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizado pelo fato de que o paciente tem leucemia mielógena aguda (AML) ou síndrome mielodisplásica.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 81, caracterizado pelo fato de que o paciente também sofreu terapia de linfoeliminação ou terapia citorredutiva, ou terapia imunomoduladora antes da administração da terapia de célula.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que a terapia de célula ainda pode ser fornecida com ou sem suporte de citocina pós-tratamento.