BR112019014227A2 - Método para aumentar a razão de ácidos graxos, cassete de expressão de dna recombinante, vetor recombinante, célula hospedeira e cepa de levedura mutante - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a cepas de levedura mutante, em particular cepas yarrowia mutante, capazes de produzir ácidos graxos de cadeia média em comparação com a cepa de levedura oleaginosa precursora a partir da qual a dita cepa de levedura oleaginosa mutante deriva. esta invenção também se refere a meios e métodos para obter estas cepas de levedura mutante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA AUMENTAR A RAZÃO DE ÁCIDOS GRAXOS, CASSETE DE EXPRESSÃO DE DNA RECOMBINANTE, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA E CEPA DE LEVEDURA MUTANTE” [001] A presente invenção refere-se a cepas de levedura mutante, em particular cepas Yarrowia mutante, capazes de produzir ácidos graxos de cadeia média em comparação com cepa tipo selvagem (WT). A presente invenção também se refere a meios e métodos para obter estas cepas de levedura mutante.

[002] Uso de fontes alternativas para querosene com base em óleo é crucial para a competitividade da indústria aeronáutica, o crescimento econômico e o desenvolvimento sustentável. O querosene é composto de cadeias de carbono que tipicamente contêm entre 6 e 16 átomos de carbono por molécula. Desde 2005, a indústria da aviação intensifica intensamente as pesquisas para a produção sustentável de combustível de aviação com requisitos muito rigorosos: segurança, “substituição” para permitir misturas com Carborreator tradicional, alto desempenho com especificações internacionais, benefício no ciclo de vida completo do carbono, necessidades de água doce e produção de alimentos, nenhum impacto sobre a biodiversidade. A este respeito, os lipídios de produção microbiana constituem uma via muito promissora que envolve microrganismos oleaginosos como um contribuinte valioso para o desenvolvimento de combustíveis sustentáveis.

[003] As sintases de ácidos graxos (FAS) são sistemas de proteínas que integram todas as etapas enzimáticas da síntese de ácidos graxos. Dois sistemas FAS diferentes são encontrados na natureza. A FAS tipo I, encontrada em fungos e animais, são proteínas multifuncionais gigantes. A FAS animal consiste de um homodímero de uma única cadeia polipeptídica multifuncional. A FAS fúngica é um dodecâmero feito de 2 cadeias polipeptídicas diferentes (seis subunidades alfa e seis subunidades beta). FAS Tipo II encontradas em procariontes e plantas são constituídos por 9 proteínas individuais, cada uma codificada por genes distintos. No entanto, as reações enzimáticas subjacentes são conservadas entre esses dois

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2/42 sistemas (Leibundgut et al, 2008).

[004] A síntese de ácidos graxos é iniciada quando uma porção acetila da acetil coenzima A (CoA) é transferida para o grupo tiol do braço fosfopantetina da proteína transportadora de acila (ACP) pela acetil transferase (AT) e transportada para o sítio catalítico da sintetase de cetoacila (KS) Subsequentemente, após a transferência de uma porção malonil de malonil-CoA para ACP por maloniltransferase (MT), o KS catalisa a condensação descarboxilada da porção malonilada ligada a ACP com o grupo iniciador de acetila. O produto β-cetoacil-ACP é então modificado em sua posição β-carbono por uma sequência de três reações. Primeiro, a cetoredutase (KR) reduz a um intermediário β-hidroxila; segundo, uma desidratase (DH) libera uma molécula de água produzindo uma porção β-enoil, que, na terceira etapa, é reduzida pelo enoil redutase (ER) para produzir uma cadeia acila saturada alongada por uma unidade de dois carbonos. Este produto acila serve então como substrato primário para a condensação pelo KS com outro malonil-ACP na próxima ronda de alongamento. Cada ciclo resulta em um alongamento de 2 carbonos da cadeia acila. O ciclo de reação é repetido até um comprimento de cadeia de C16 ou C18 ser atingido e os produtos finais de palmitato ou estearato são liberados. A FAS fúngica utiliza um acetil transferase mono-funcional (AT) para transferir a acetila de partida para ACP e uma transferase malonil/palmitoil bi-funcional (TPM), que carrega o ACP com grupos malonil e transfere de volta para os produtos para a coenzima A para liberação como ésteres de CoA.

[005] Alguns organismos produzem naturalmente ácidos graxos de comprimento curto a médio. Os ácidos graxos octanoico (8: 0), decanoico (10: 0) e dodecanoico (12: 0) são encontrados em formas esterificadas na maioria das gorduras do leite, incluindo as de não-ruminantes. Eles também são componentes principais de alguns óleos de sementes em particular, como óleo de coco, óleo de palmiste e espécies de Cuphea.

[006] Dependendo do sistema de FAS abrigado pelo organismo, a determinação do comprimento da cadeia de substrato não parece ser conduzida pelo mesmo

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3/42 mecanismo. No sistema de FASH, no qual o ciclo de alongamento termina com a hidrólise do acil-ACP, a tioesterase é a enzima envolvida na especificidade do comprimento da cadeia (Jing et al, 2011; Schiitt et al, 1998). No sistema de FASI fúngico, a tioesterase não está presente e o ciclo de alongamento termina com a transferência do acil-ACP para uma coenzima A. A enzima MPT responsável por essa atividade, não parece ser a régua molecular para determinar o comprimento da cadeia (Leibundgut et ah, 2008).

[007] Entre os microrganismos produtores de lipídios, a Yarrowia lipolytica é a mais estudada, com uma extensa caixa de ferramentas para a engenharia metabólica. A Y. lipolytica é uma levedura oleaginosa, capaz de produzir e acumular grande quantidade de lipídios, respondendo por mais de 50% do seu peso seco (Beopoulos et al, 2009). Y. lipolytica mas mais geralmente espécies de Yarrowia, naturalmente produzem lipídios com ácido graxo de cadeia longa contendo 16 e 18 carbonos. A Y. lipolytica demonstrou ser adequada para fermentações em grande escala (LedesmaAmaro e Nicaud, 2016). Devido a estas capacidades, e sendo reconhecido como um organismo GRAS (Geralmente Considerado como Seguro), esta levedura é um organismo promissor para o desenvolvimento de várias aplicações, incluindo a produção de proteínas recombinantes, metabólitos e óleos com alto valor agregado (Madzak, 2015). No que diz respeito às suas propriedades para sintetizar e acumular lipídios, Y. lipolytica é um organismo de escolha para a produção de biocombustíveis como uma alternativa de óleo vegetal extraído de plantas ou combustíveis fósseis.

[008] Os inventores desenvolveram, por genoma e engenharia enzimática, cepas de Yarrowia lipolytica capazes de produzir ácidos graxos de cadeia média (MCFA), que podem ser úteis para a sua utilização a jusante como bioquerosene. Cepas geneticamente modificadas de Y. lipolytica em que o gene aFAS endógeno foi eliminado e em que foi expresso o mutante I1220F ou I1220M aFAS, foram capazes de modular o perfil de ácidos Graxos (FA) em relação aos Ácidos Graxos de Cadeia Média (MCFA), em particular de sintetizar comprimento da cadeia média compreendendo 12 carbonos, tal como ácido láurico, também conhecido como ácido

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4/42 dodecanoico ou 14 carbonos, tal como ácido mirístico, também conhecido como ácido tetradecanoico.

[009] Na presente invenção:

- Ácidos graxos de cadeia curta referem-se a Ácidos graxos com um comprimento de cadeia de hidroxicarbono menor do que 8 carbonos,

- Ácidos graxos de cadeia média referem-se a Ácidos graxos com um comprimento de cadeia de hidroxicarbono compreende entre 8 e 15 carbonos,

- Ácidos graxos de cadeia longa referem-se a Ácidos graxos com um comprimento de cadeia de hidroxicarbono de e além de 16 carbonos.

[010] A FAS citosólica de levedura (EC 2.3.1.86) catalisa a síntese de ácido graxo a partir de acetil-CoA e malonil-CoA. É composto de duas subunidades, Fasl (FAS) e Fas2 (aFAS), que são organizadas como um complexo hexamérico α6β6. FAS carrega atividades de acetil transferase, enoil redutase, desidratase, malonil-palmitoil transferase e aFAS possui atividades de proteína transportadora de acila, 3cetoredutase, 3-cetosintase e da fosfopantetamina transferase. O espectro de ácido graxo em levedura consiste principalmente de ácidos graxos C16 e C18.

[011] Os métodos para determinar se uma enzima é uma síntese de ácido graxo (FAS) são conhecidos na técnica. Por via de exemplo, um pode usar o método descrito em Stoops etal. 1978.

[012] Na presente invenção, a numeração de aminoácido de uma proteína de aFAS de levedura é feita com referência à proteína de aFAS de Yarrowia lipolytica disponível na base de dados GenBank com o número de acesso YALI0_B19382g denominada como SEQ ID NO: 1 (YALI_aFAS). A numeração de resíduo de aminoácidos de uma proteína de aFAS conhecida pode ser feita alinhando-se a sequência de aminoácido da dita proteína de aFAS conhecida com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (YALI_aFAS). O alinhamento de duas sequências de aminoácidos pode ser realizado usando os programas MUSCLE (Edgar, 2004).

[013] Tal alinhamento permite a identificação dos resíduos de aminoácidos correspondentes à posição 1220 e 1305 da sequência SEQ ID NO: 1.

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5/42 [014] O resíduo de aminoácidos nas posições 1220 e 1305 de proteína de aFAS de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO: 1) são respectivamente isoleucina (I) e serina (S). A proteína de aFASs de leveduras e o resíduo de aminoácidos nas posições correspondentes respectivamente às posições 1220 e 1305 de aFAS de Yarrowia lipolytica são mencionadas na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1.

Levedura	Número de acesso Gen Bank	SE Q ID NO: 1	% de identidad e de sequênci a para SEQ ID NO: 1	Resíduo de aminoácido correspondent e ao resíduo de aminoácido na posição 1220 em aFAS de Yarrowia lipolytica	Resíduo de aminoácido correspondent e ao o resíduo de aminoácido na posição 1305 em aFAS de Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica *	YAL10_B 19382g	1	100	I	S
Rhodotorula sp. JG-lb.	KWU43709.1	2	52	I	G
Rhodotorula toruloides *	XP_016272387. 1	3	51	I	G
Candida albicans	KHC55685.1	4	65	V	G
Candida tropicalis *	XP_002548204. 1	5	65	V	G
Trichosporon oleaginosus *	KLT39273.1	6	52	M	G

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Levedura	Número de acesso Gen Bank	SE Q ID NO: 1	% de identidad e de sequênci a para SEQ ID NO: 1	Resíduo de aminoácido correspondent e ao resíduo de aminoácido na posição 1220 em aFAS de Yarrowia lipolytica	Resíduo de aminoácido correspondent e ao o resíduo de aminoácido na posição 1305 em aFAS de Yarrowia lipolytica
Cryptococcus neoformans	XP_012049943. 1	7	52	M	G
Cryptococcus gatin'	KIR51369.1	8	51	M	G
Saccharomyce s cerevisiae	AJW 19346.1	9	63	V	G

*Levedura oleaginosa [015] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para aumentar a razão de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 16 carbonos (ácidos graxos C16) para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou para aumentar a quantidade de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8-C15), produzida por uma cepa de levedura, preferencialmente uma cepa de levedura oleaginosa, mais preferencialmente uma cepa Yarrowia, mais preferencialmente uma cepa Yarrowia lipolytica, em comparação com a cepa de levedura precursora a partir da qual a dita cepa de levedura deriva, compreendendo expressar na dita cepa de levedura uma subunidade alfa de síntese de ácido graxo mutada (aFAS), em que o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao

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7/42 resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido de impedimento estérico maior, e, opcionalmente, em que o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1305 na SEQ ID NO: 1 é substituído com qualquer outro aminoácido, mais preferencialmente treonina (T).

[016] Consequentemente, um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F), histidina (H), metionina (M), triptofano (W) e tirosina (Y) tem um impedimento estérico maior do que a isoleucina (I), quando a aFAS não mutada é de Yarrowia lipolytica.

[017] De acordo com uma modalidade particular da invenção, aFAS mutada é como a seguir:

- quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada é isoleucina (I) então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F), histidina (H), metionina (M), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W),

- quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada é valina (V) então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em isoleucina (I), fenilalanina (F), histidina (H), metionina (M), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W),

- quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada é metionina (M) então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F), histidina (H), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W).

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8/42 [018] De acordo com uma outra modalidade particular da invenção, a aFAS mutada é derivada de aFAS de tipo selvagem de uma levedura, preferencialmente de uma levedura oleaginosa, mais preferencialmente de uma levedura pertencente ao gênero selecionado a partir do grupo consistindo em Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Saccharomyces e [019] Yarrowia, o mais preferencialmente de Yarrowia, em particular de Yarrowia lipolytica.

[020] De acordo com uma modalidade mais particular da invenção, a cepa de levedura oleaginosa é selecionada a partir do grupo consistindo em uma cepa Y. lipolytica, Y. galli, Y. yakushimensis, Y. alimentaria e Y. phangngensis, preferencialmente uma cepa Y. lipolytica. A sequência de aminoácido da aFAS não mutada tem pelo menos 50 % de identidade, ou por ordem de preferência crescente pelo menos 51 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 82 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade, com a sequência de aminoácido de aFAS de Yarrowia lipolytica de SEQ ID NO: 1 (Y. lipolytica aFAS YALI0_B19382p).

[021] A menos que especificado de outro modo, a percentagem de identidade entre duas sequências de proteína que são aqui mencionadas é calculada a partir dos resultados do BLAST realizados nos websites NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ou no GRYC (http://gryc.inra.fr/) usando o programa BlastP com os parâmetros padrão BLOSUM62 como descrito em Altschul etal. (1997).

[022] Vantajosamente, a aFAS não mutada tendo pelo menos 50 % de identidade com o polipeptídeo de sequência SEQ ID NO: 1 (aFAS Y. lipolytica YALI0_B 19382p) é derivada de uma aFAS de tipo selvagem a partir de uma levedura, preferencialmente de uma levedura oleaginosa, mais preferencialmente a partir de uma levedura pertencente ao gênero selecionado do grupo consistindo de Yarrowia, Rhodotorula, Candida, Trichosporon, Cryptococcus e Saccharomyces, mais preferencialmente da Yarrowia, em particular da Yarrowia lipolytica.

[023] A sequência nucleotídica correspondente à proteína aFAS de Yarrowia

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9/42 lipolytica é a sequência SEQ ID NO: 10.

[024] Em uma modalidade preferida, a aFAS mutada é derivada a partir da sequência de aminoácido de consenso SEQ ID NO: 11, em que o resíduo de aminoácido na posição 1230 na SEQ ID NO: 11 e correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido de impedimento estérico maior, e, opcionalmente, em que o resíduo de aminoácido na posição 1315 na SEQ ID NO: 11 e correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1305 na SEQ ID NO: 1 é substituído com qualquer outro aminoácido.

[025] Mais preferencialmente, a aFAS mutada é derivada a partir de aFAS selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.

[026] Em uma modalidade particular da invenção, a aFAS mutada é uma aFAS autóloga mutada.

[027] Uma aFAS autóloga é definida como uma aFAS a partir da dita cepa de levedura em que a aFAS mutada é expressa.

[028] Em uma modalidade preferida da invenção, o método da invenção compreende a expressão em uma cepa de levedura definida acima, uma subunidade alfa de síntese de ácido graxo mutada (aFAS), em que o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido de impedimento estérico maior, e em que o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1305 na SEQ ID NO: 1 é substituído com treonina (T).

[029] Em uma modalidade preferida da invenção, a razão de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12 ou 14 carbonos (C12 ou C14 ácidos graxos), preferencialmente C14 ácidos graxos, para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) é aumentada e/ou a quantidade de ácidos graxos de cadeia média tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12 carbonos ou 14 carbonos (C12 ou C14 ácidos graxos) é aumentada.

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10/42 [030] Em uma modalidade mais preferida da invenção, o ácido graxo tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 14 carbonos é ácido mirístico (ácido tetradecanoico) e o ácido graxo tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12 carbonos é ácido láurico (ácido dodecanoico).

[031] Vantajosamente, a substituição do resíduo de aminoácidos correspondente ao resíduo de aminoácidos nas posições 1220 e/ou 1305 da dita aFAS é obtida por mutagênese dirigida ao local do gene aFAS alvejando o códon que codifica o resíduo de aminoácidos correspondente ao resíduo de aminoácidos nas ditas posições 1220 e/ou 1305.

[032] A expressão de uma subunidade alfa de síntese de ácido graxo mutada (aFAS) como definida acima em uma cepa de levedura, em particular em uma cepa Yarrowia em que gene aFAS é inibido, de acordo com a presente invenção pode ser obtida de várias maneiras por métodos conhecidos por si.

[033] A expressão da dita subunidade alfa de sintase de ácido graxo mutada (aFAS) pode ser realizada colocando uma ou mais (preferencialmente duas ou três) cópias da sequência de codificação (CDS) da sequência que codifica a dita aFAS mutada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. As ditas sequências reguladoras incluem sequências promotoras, localizadas a montante (na posição 5') da ORF da sequência que codifica as ditas sequências aFAS e de terminação mutadas, localizadas a jusante (na posição 3') da ORF da sequência que codifica a referida enzima.

[034] As sequências de promotor que podem ser utilizadas em levedura são bem conhecidos dos especialistas na técnica e podem corresponder em particular a promotores indutíveis ou constitutivos. Exemplos de promotores que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, incluem o promotor de um gene Y. lipolytica que é fortemente reprimido pela glucose e é indutível pelos ácidos graxos ou triglicerídeos tais como o promotor do gene POX2 que codifica a oxidase 2 de acilCoA. (AOX2) de Y. lipolytica e o promotor do gene LIP2 descrito no Pedido Internacional WO 01/83773. Pode-se também, utilizar o promotor do gene FBA1 que

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11/42 codifica a aldolase de frutose-bisfosfato (consultar, Pedido de Patente US 2005/0130280), o promotor do gene GPM que codifica o fosfoglicerato mutase (consultar, Pedido Internacional WO 2006/0019297), o promotor do gene YAT1 que codifica o amônio transportador (consultar, Pedido US 2006/0094102), o promotor do gene GPAT que codifica o glicerol-3-fosfato de O-aciltransferase (consultar, Pedido US 2006/0057690), o promotor do gene TEF (Müller et al., 1998; Pedido US 2001/6265185), o promotor híbrido hp4d (descrito no Pedido Internacional WO 96/41889), o promotor híbrido XPR2 descrito em Mazdak et al. (2000) ou os promotores híbridos UAS1-TEF ou UAStef-TEF descritos em Blazeck et al. (2011, 2013, 2014).

[035] Vantajosamente, o promotor é o promotor do gene TEF.

[036] As sequências de terminação que podem ser utilizadas em levedura são também bem conhecidas pessoas habilitadas na técnica. Exemplos de sequências de terminação que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção incluem a sequência de terminação do gene PGK1 e a sequência de terminação do gene LIP2 descrito no Pedido Internacional WO 01/83773.

[037] As ditas cópias do gene que codifica a dita aFAS mutada sob o controle de sequências reguladoras, tais como as descritas acima, podem ser transportadas por um vetor epissômico, isto é, capaz de se replicar na cepa de levedura ou pode ser introduzido no genoma da levedura como um cassete de expressão linear por recombinação homóloga ou não homóloga.

[038] Para a introdução por recombinação homóloga, a sequência da aFAS (do tipo selvagem) é substituída pela sequência da aFAS mutada como aquelas descritas acima. A pessoa habilitada pode substituir a cópia do gene que codifica a aFAS no genoma bem como as suas próprias sequências reguladoras, transformando geneticamente a cepa de levedura com um polinucleotídeo linear compreendendo a ORF da sequência que codifica para a referida aFAS mutada, opcionalmente sob o controle de sequências reguladoras tais como as descritas acima. Vantajosamente, o dito polinucleotídeo é flanqueado por sequências que são homólogas às sequências

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12/42 localizadas em cada lado do dito gene cromossômico que codifica a dita aFAS. Marcadores de seleção podem ser inseridos entre as sequências, garantindo a recombinação para permitir, após a transformação, isolar as células nas quais ocorreu a integração do fragmento, identificando os marcadores correspondentes. Vantajosamente também, as sequências de promotor e de terminação pertencem a um gene diferente do gene que codifica a aFAS a ser expressa de modo a minimizar o risco de recombinação indesejada no genoma da cepa de levedura.

[039] A expressão da dita subunidade alfa de sintase de ácido graxo mutada (aFAS) pode também ser obtida introduzindo nas cepas de levedura cópias do gene que codifica a dita aFAS mutada sob o controle de sequências reguladoras tais como as descritas acima. As ditas cópias que codificam a dita aFAS mutada podem ser transportadas por um vetor epissômico, isto é, capaz de se replicar na cepa de levedura. Para a introdução por recombinação homóloga, outro locus do genoma da levedura, por exemplo, o genoma da Yarrowia podería ser alvejado (Madzak et al., 2004). Neste caso, o polinucleotídeo compreendendo o gene que codifica a dita aFAS mutada sob o controle de regiões reguladoras é integrado por integração direcionada. As ditas cópias adicionais podem também ser transportadas por fragmentos de PCR cujas extremidades são homólogas a um determinado locus da cepa de levedura, permitindo integrar as ditas cópias no genoma da levedura por recombinação homóloga. As ditas cópias adicionais também podem ser transportadas por vetores de auto clonagem ou fragmentos de PCR, em que as extremidades têm uma região zeta ausente do genoma da levedura, permitindo a integração das ditas cópias no genoma da levedura, por exemplo, genoma da Yarrowia, por inserção aleatória conforme descrito no Pedido US 2012/0034652.

[040] A integração direcionada de um gene no genoma de uma célula de levedura uma técnica de biologia molecular bem conhecida das pessoas habilitadas na técnica: um fragmento de ADN clonado em um vetor de integração, introduzido na célula a ser transformada, em que o dito fragmento de ADN se integra por recombinação homóloga em uma região alvo do genoma receptor (Orr- Weaver etal,

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1981).

[041] Um método vantajoso de acordo com a presente invenção consiste em transformar geneticamente a dita cepa de levedura com um cassete do dito gene aFAS endógeno. Um cassete de integração adequada para expressão do gene aFAS contém sequências específicas para transformação genômica aleatória e um marcador de seleção.

[042] O cassete de integração pode transportar o gene selvagem aFAS de tipo mutado. A invenção mostra que a integração aleatória da cópia de tipo selvagem do gene aFAS no genoma de AaFAS restaura o crescimento da cepa sem complementação de ácidos graxos, mostrando que o gene aFAS, aleatoriamente incorporado no genoma e sob o controle do promotor constitutivo de pTEF é corretamente expresso e processado até a formação do complexo de FAS ativo.

[043] De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, o método compreende ainda inibir na dita cepa de levedura, em particular a dita cepa oleaginosa, a expressão e/ou a atividade das proteínas elongase endógenas, em particular elongase 1 (EL01; EC 2.3.1.199) tendo pelo menos 50 % de identidade ou por ordem de preferência crescente pelo menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade, com o polipeptídeo de sequência SEQ ID NO: 12 (YALI_EL01) e/ou da elongase 2 endógena (ELO2; EC 2.3.1.199) tendo pelo menos 50 % de identidade ou por ordem de preferência crescente pelo menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade, com o polipeptídeo de seguência SEQ ID NO: 13 (YALI_ELO2). A elongase 1 a partir da cepa Y. Upolytica (YALI_EL01) de SEQ ID NO: 14 é codificada em Y. Upolytica pelo gene YALI0B20196p.

[044] A elongase 2 a partir da cepa Y. Upolitica (YALI_ELO2) de SEQ ID NO: 15 é codificada em Y. Upolytica pelo gene YALI0F06754p.

[045] De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, o método compreende ainda inibir na dita cepa de levedura a expressão e/ou a atividade da subunidade alfa de síntese de ácido graxo endógeno (EC 2.3.1.86).

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14/42 [046] A inibição da expressão e/ou atividade das proteínas aFAS e/ou elongase endógenas, em particular da elongase 1 (EL01) e/ou da elongase 2 (EL02), pode ser total ou parcial e envolver toda a proteína ou um domínio particular da proteína. Por exemplo, a inibição da expressão e/ou atividade da aFAS endógena pode ser parcial e diz respeito ao domínio da sintase de cetoacila (KS) da aFAS. A sintase de cetoacila (KS) (EC 3.2.1.41) pertence à subunidade alfa da aFAS. É uma beta-cetoacil[proteína transportadora de acila] sintase e catalisa a reação acil- [proteína transportadora de acila] + malonil- [proteína transportadora de acila] -> 3-oxoacil[proteína transportadora de acila] + CO2 + [proteína transportadora de acila.

[047] A inibição da expressão e/ou atividade da aFAS endógena e/ou proteínas elongase, em particular elongase 1 (EL01) ou elongase 2 (EL02) pode ser obtida em várias maneiras pelos métodos conhecidos em por si só pela pessoa habilitada na técnica. O termo inibir a expressão de uma aFAS endógena e/ou proteínas elongase em uma cepa de levedura refere-se a diminuir a quantidade da dita enzima produzida em uma cepa de levedura em comparação com uma cepa de levedura de referência (controle) em que a expressão da dita aFAS endógena e/ou proteínas elongase não é inibida e a partir da qual a cepa mutante deriva. O termo inibir a atividade de uma aFAS endógena e/ou proteínas elongase em uma cepa de levedura refere-se a diminuir a atividade enzimática da dita enzima em comparação com uma cepa de levedura de referência (controle) em que a atividade da dita aFAS endógena e/ou proteínas elongase não é inibida e a partir da qual a cepa mutante deriva.

[048] Esta inibição pode ser obtida por mutagênese do gene endógeno que codifica a dita aFAS (gene aFAS), parcial ou totalmente ou do gene endógeno que codifica as ditas proteínas alongase utilizando tecnologia de DNA recombinante ou mutagênese aleatória. Isto pode ser obtido por várias técnicas, realizadas ao nível do DNA, mRNA ou proteína, para inibir a expressão e/ou a atividade das proteínas aFAS e/ou elongase.

[049] A mutagênese do gene aFAS endógena pode também ser realizada usando agentes físicos (por exemplo radiação) ou agentes químicos. Essa

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15/42 mutagênese também possibilita a introdução de uma ou mais mutações pontuais no gene aFAS. Ao nível de DNA, mRNA, esta inibição, que pode resultar em uma modificação da atividade ou na especificidade da proteína, pode ser conseguida por deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos, mutagênese sítioespecífica, mutagênese aleatória, alvejamento de lesões locais induzidas em genomas (LAVAGEM), técnicas de knock-out, tesoura molecular (nucleases) (TALEN, CRISPR/Cas9 ...) ou silenciamento gênico usando, por exemplo, interferência de RNA, antessentido, aptâmeros, e semelhantes.

[050] Esta inibição pode também ser obtida por inserção de uma sequência estranha no gene aFAS e/ou nos genes da elongase, por exemplo, através de mutagênese por transposão utilizando elementos genéticos móveis chamados transposões, que podem ser de origem natural ou artificial.

[051] A mutagênese do gene endógeno que codifica a dita aFAS e/ou proteínas elongase pode ser realizada ao nível da sequência de codificação ou das sequências para regular a expressão deste gene, em particular ao nível do promotor, resultando em uma inibição de transcrição ou tradução das ditas proteínas aFAS e/ou elongase. [052] Esta inibição também pode ser obtida pelo uso de inibidores específicos para diminuir a atividade enzimática.

[053] A mutagênese do gene aFAS endógeno e/ou genes da elongase pode ser realizada por engenharia genética. É, por exemplo, possível eliminar todo ou parte do dito gene ou domínio e/ou inserir uma sequência exógena. Os métodos para eliminar ou inserir uma determinada sequência genética em levedura, em particular em Y. lipolytica, são bem conhecidos das pessoas habilitadas na técnica (para revisão, ver Barth e Gaillardin, 1996; Madzak et al., 2004). A título de exemplo, pode-se utilizar o modo referido como POP IN/POP OUT que foi utilizado em leveduras, em particular em Y. lipolytica, para eliminar os genes LEU2e XPR2 (Barth e Gaillardin, 1996). Podese também utilizar o método SEP (Maftahi etal, 1996) que foi adaptado em Y. lipolytica para a deleção dos genes POX(Wang etal., 1999). Pode-se também usar o método SEP/Cre desenvolvido por Fickers etal. (2003) e descrito no Pedido Internacional WO

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2006/064131. Além disso, métodos para inibir a expressão e/ou a atividade de uma enzima em leveduras são descritos no Pedido Internacional WO 2012/001144.

[054] Um método vantajoso de acordo com a presente invenção consiste em substituir a sequência de codificação do gene aFAS endógeno parcial ou totalmente e/ou genes elongase com um cassete de expressão contendo a sequência de um gene que codifica um marcador selecionável, como descrito em Fickers et al. (2003). Também é possível introduzir uma ou mais mutações pontuais no gene aFAS endógena e/ou genes de elongase, resultando num desvio no quadro de leitura, e/ou introduzir um códon de paragem na sequência e/ou inibir a transcrição ou a tradução do gene aFAS endógena e/ou genes de elongase. Outro método vantajoso de acordo com a presente invenção consiste em transformar geneticamente a dita cepa de levedura com um cassete de ruptura do dito gene aFAS endógeno e do gene endógeno codificando a elongase 1 e/ou do gene endógeno que codifica a elongase

2. Um cassete de ruptura adequado para interromper o gene aFAS endógeno que contém sequências específicas para recombinação homóloga e inserção dirigida ao local, e um marcador de seleção.

[055] A mutagênese do gene aFAS endógeno e/ou genes da elongase também pode ser realizada utilizando agentes físicos (por exemplo radiação) ou agentes químicos. Esta mutagênese também possibilita a introdução de uma ou mais mutações pontuais nos genes aFAS e/ou elongase.

[056] O gene aFAS mutado e/ou os genes da elongase mutados podem ser amplificados, por exemplo, por PCR, utilizando iniciadores específicos para o dito gene.

[057] É possível utilizar qualquer método de seleção conhecido pelas pessoas habilitadas na técnica que seja compatível com o gene marcador (ou genes) utilizado. Os marcadores selecionáveis que permitem a complementação de uma auxotrofia, também vulgarmente designados por marcadores auxotróficos, são bem conhecidos dos especialistas na técnica no campo da transformação de leveduras. O marcador selecionável URA3 é bem conhecido pessoas habilitadas na técnica. Mais

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17/42 especificamente, uma cepa de levedura na qual o gene LIRA3 (sequência disponível no banco de dados Genolevures (http://genolevures.org/) sob o nome YALI0E26741g ou o banco de dados UniProt sob o número de acesso Q12724), codificando orotidina5'-fosfato descarboxilase, é inativado (por exemplo, por deleção), não será capaz de crescer em um meio não suplementado com uracila. A integração do marcador selecionável UFIA3 nesta cepa de levedura permitirá então restaurar o crescimento desta cepa em um meio livre de uracila. O marcador selecionável de LELI2 descrito em particular na Patente US 4937189 é também bem conhecido pelas pessoas habilitadas na técnica. Mais especificamente, uma cepa de levedura na qual o gene LEU2 (por exemplo, YALI0C00407g em Y. lipolytica), que codifica a β-isopropilmalato desidrogenase, é inativada (por exemplo, por deleção), não será capaz de crescer em um meio não suplementado com leucina. Tal como anteriormente, a integração do marcador selecionável de LELI2 nesta cepa de levedura tornará então possível restaurar o crescimento desta cepa em um meio não suplementado com leucina. O marcador selecionável ADE2 é também bem conhecido pelos habilitados na técnica. Uma cepa de levedura na qual o gene ADE2 (por exemplo, YALI0B23188g em Y. lipolytica), codificando fosforibosilaminoimidazol carboxilase, é inativado (por exemplo, por deleção), não será capaz de crescer em um meio não suplementado com adenina. Aqui, novamente, a integração do marcador selecionável ADE2 nesta cepa de levedura permitirá então restaurar o crescimento desta cepa em um meio não suplementado com adenina. Leu <> Ura <> cepas auxotróficas de Y. lipolytica foram descritas por Barth e Gaillardin, 1996.

[058] As cepas de levedura oleaginosas são bem conhecidas na técnica (Ratledge etal., 1994 e 2005). Elas naturalmente acumulam lipídios para mais de 20% do seu peso seco. Incluem o gênero Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium {por exemplo, Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula {por exemplo, Rhodotorula glutinis), Trichosporon e Yarrowia. De acordo com esta modalidade, a cepa Yarrowia preferencialmente selecionada do grupo consistindo em uma cepa de Y. lipolytica, Y. galli, Y. yakushimensis, Y. alimentaria e Y. phangngensis,

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18/42 mais preferencialmente uma cepa Y. lipolytica.

[059] A dita levedura pode ser geneticamente modificada para acumular lipídios. Isso pode ser feito por:

- prevenir a degradação/remobilização de lipídios (TAG). Por exemplo, inibindo a expressão e/ou a atividade de pelo menos uma lipase endógena, preferencialmente uma lipase de triglicerídeo (TGL), mais preferencialmente a lipase TGL4 {por exemplo, em Y. lipolytica: YALIOFIOOlOg) e/ou lipase TGL3 {por exemplo, em Y. lipolytica: YALI0D17534g). Um método para inibir a expressão de TGL3 e TGL4 em uma cepa de Y. lipolytica é descrito em Dulermo etal, 2013;

- prevenir a degradação de ácidos graxos inibindo a oxidação beta. As enzimas envolvidas na oxidação beta em leveduras são, por exemplo, as isoformas endógenas das enzimas acil-coenzima A (AOX, EC 6.2.1.3) ou enzima MFE (YALI0E15378g). Em Y. lipolytica, 6 genes {POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 e POX6, respectivamente YALI0E32835g, YALI0F10857g, YALI0D24750g,

YALI0E27654g, YALI0C23859g e YALI0E06567g) codificam estas isoformas. A dita inibição pode ser total ou parcial. Um método de inibição da expressão da AOX endógena 6 em uma cepa de Y. lipolytica é descrito em Beopoulos et al, 2008 e nos Pedidos Internacionais WO 2006/064131, WO 2010/004141 e WO 2012/001144;

- prevenir a biogênese do peroxissoma. Como a oxidação beta ocorre no peroxissoma, várias estratégias para bloquear a biogênese do peroxissoma podem ser consideradas através da deleção dos genes PEX3, PEX10e PEX11, por exemplo (US 20090117253 Al e Dulermo et al., 2015)

- melhorar o acúmulo de lipídios, aumentando a incorporação de ácidos graxos no TAG. A dita cepa de levedura possuindo propriedades melhoradas para a acumulação de lipídios pode ser uma cepa de levedura mutante, preferencialmente uma cepa mutante de Y. lipolytica, em que pelo menos uma proteína, de preferência pelo menos uma proteína endógena ou autóloga, selecionada do grupo consistindo de uma acil-CoA: diacilglicerol aciltransferase 2 (codificada por DGA1), uma acil-CoA: diacilglicerol aciltransferase 1 (codificada por DGA2), uma glicerol-3 desidrogenase

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19/42 de fosfato NAD + (codificada por GPDT), uma acetil-CoA carboxilase (codificada por ACC1) é superexpressa. Um método de sobre-expressão dos genes endógenos DGA1, DGA2, GPD1 e ACC1 e inibição da expressão e/ou atividade dos genes endógenos GUT2, TGL4 e PEX10 em uma cepa Y. lipolytica é descrita no Pedido Internacional WO 2014/136028.

[060] Um método de superexpressão dos genes endógenos DGA2, GPD1 e HXK1, e inibição da expressão e/ou atividade do gene endógeno TGL4 em uma cepa de Y. lipolytica é descrita em Lazar etal, 2014.

[061] Os métodos para transformar a levedura são também bem conhecidos dos habilitados na técnica e são descritos, inter alia, pela pessoa habilitado na técnica e são descritos, inter alia, por Ito etal. (1983), Klebe etal. (1983) e Gysler etal. (1990). [062] Qualquer método de transferência de genes conhecido na técnica pode ser usado para introduzir um gene que codifica uma enzima. Preferencialmente, pode-se utilizar o método com acetato de lítio e polietilenoglicol descrito por Gaillardin et al., (1987) e Le Dali etal., (1994).

[063] Um método preferido para expressar a dita aFAS mutada em uma cepa de levedura compreende introduzir no genoma da dita cepa de levedura uma construção de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica codificando a dita aFAS mutada, colocada sob o controle de um promotor.

[064] O método para expressar genes em Yarrowia lipolytica é bem conhecido como descrito no exemplo em Nicaud etal. (2002; 2012).

[065] A presente invenção também fornece meios para expressar em uma cepa de levedura oleaginosa, preferencialmente, uma cepa Yarrowia, de um modo mais preferido, uma Y. lipolytica, uma aFAS mutada, como definido acima.

[066] Isto inclui, em particular, construções de DNA recombinante para expressar uma aFAS mutada como definida acima em uma célula de levedura, em particular em uma célula de Yarrowia. Estas construções de ADN podem ser obtidas e introduzidas na dita cepa de levedura pelas técnicas bem conhecidas de DNA recombinante e engenharia genética.

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20/42 [067] As construções de DNA recombinante da invenção incluem, em particular, cassetes de expressão recombinante, compreendendo urn polinucleotideo que codifica uma aFAS mutada como definido acima sob o controle de um promotor adequado, tal como o promotor funcional em uma célula de levedura, como definido acima.

[068] Os cassetes de expressão geralmente também incluem um terminador de transcrição, tal como descrito acima. Podem também incluir outras sequências reguladoras, tais como sequências potenciadoras da transcrição.

[069] As construções de DNA recombinante da invenção também incluem vetores recombinantes contendo cassetes de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica uma aFAS mutada como definido acima sob controle de transcrição de um promotor adequado, tal como um promotor de levedura {por exemplo, Yarrowia). Os vetores recombinantes da invenção também podem incluir outras sequências de interesse, tais como, por exemplo, um ou mais genes marcadores, que permitem a seleção de células de levedura transformadas.

[070] A invenção também compreende células hospedeiras contendo uma construção de DNA recombinante da invenção. Estas células hospedeiras podem ser células procarióticas (tais como células bacterianas) ou células eucarióticas, preferencialmente células de levedura.

[071] A presente invenção também fornece uma cepa de levedura mutante, preferencialmente uma cepa de levedura oleaginosa mutante, mais preferencialmente uma cepa Yarrowia, ainda mais preferencialmente uma cepa Y. lipolytica, capaz de produzir uma razão aumentada de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 16 carbonos (ácidos graxos C16) para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou uma quantidade aumentada de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8-C15), em comparação com a cepa de levedura oleaginosa precursora a partir da qual a dita cepa de levedura oleaginosa mutante deriva, em que a dita cepa de levedura mutante expressa uma aFAS mutada como definida acima e

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21/42 opcionalmente em que a expressão e/ou a atividade das elongases 1 e/ou 2 endógenas como definida acima é inibida e/ou a expressão e/ou a atividade da aFAS endógena é inibida na dita cepa de levedura mutante.

[072] A dita cepa de levedura mutante pode ser obtenível pelo método para obter uma cepa de levedura oleaginosa capaz de produzir ácido mirístico (ácido tetradecanoico) de acordo com a invenção como descrito acima.

[073] A cepa de levedura mutante da invenção inclui não apenas a célula de levedura resultante a partir da inicial mutagênese ou transgênese, mas também os seus descendentes, desde que a aFAS mutada como definida acima seja expressa e opcionalmente até que a expressão e/ou a atividade da aFAS endógena e/ou das elongases 1 e/ou 2 endógenas é inibida.

[074] A presente invenção também fornece uma cepa de levedura mutante, preferencialmente uma cepa de levedura oleaginosa, mais preferencialmente cepa Yarrowia, ainda mais preferencialmente uma cepa Y. lipolytica, em que a razão de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 16 carbonos (ácidos graxos C16) para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou uma quantidade aumentada de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8-C15), em comparação com a cepa de levedura oleaginosa precursora a partir da qual a dita cepa de levedura oleaginosa mutante deriva, compreendendo, estavelmente integrada em seu genoma, pelo menos um DNA recombinante de construção para expressar aFAS mutada como definida acima e opcionalmente em que a expressão e/ou a atividade da aFAS endógena e/ou das elongases 1 e/ou 2 endógenas é inibida. De acordo com uma outra modalidade particular da invenção, a cepa de levedura da cepa de levedura mutante é derivada de preferencialmente de uma levedura oleaginosa, mais preferencialmente de uma levedura pertencente ao gênero selecionado a partir do grupo consistindo em Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Saccharomyces e Yarrowia, o mais preferencialmente de Yarrowia, em particular de Yarrowia lipolytica.

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22/42 [075] De acordo com uma modalidade mais particular da invenção, a cepa de levedura oleaginosa é selecionada a partir do grupo consistindo em uma cepa Y. lipolytica, Y. galli, Y. yakushimensis, Y. alimentaria e Y. phangngensis, preferencialmente uma cepa Y. lipolytica.

[076] Os métodos para o crescimento de cepas oleaginosas de levedura são bem conhecidos na técnica, por exemplo, pode-se utilizar uma tecnologia de fermentação de levedura oleaginosa (Aggelis etal, 1999, Papanikolaou etal. 2006).

[077] As cepas de leveduras mutantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas com complementação de ácidos graxos.

[078] A cepa de levedura mutante da invenção pode ser cultivada em lotes repetidos alimentados em culturas contínuas como célula planctônica ou biofilme (isto é, crescimento de células na superfície ou dentro de um suporte sólido).

[079] A presente invenção será entendida mais claramente a partir da descrição adicional que se segue, que se refere a exemplos não limitativos que ilustram a expressão de uma síntese de ácido graxo mutada em Y. lipolytica.

[080] A Figura 1 mostra o perfil de ácidos graxos em mg/1 para as cepas mutadas SAFAS + aFASH 220F clone A, B e C depois de 5 dias de cultura em meio mínimo.

[081] A Figura 2 mostra o perfil de ácidos graxos em mg/ml para a cepa SAFAS transformada com aFASwt ou com aFAS mutada depois de cinco dias de cultura em meio mínimo complementado ou não com ácido oleico (AO). /: Meio mínimo não inoculado complementado com ácido oleico; IW: cepa SAFAS + aFASII220W; IWST: cepa SAFAS + aFAS II220W/S1305T; MM AO: meio mínimo complementado com ácido oleico; peso: cepa SAFAS + aFASwt; MM: meio mínimo sem complementação. [082] A Figura 3 mostra o perfil de ácidos graxos em mg/ml para a cepa SAFAS transformada com aFASwt ou com aFAS mutada depois de cinco dias de cultura em meio mínimo. Peso: cepa SAFAS + aFASwt; II220F: cepa SAFAS + aFASII220F; II220M: cepa SAFAS + aFASII220M; II220F/S1305T: cepa SAFAS + aFAS //220F/S1305T.

[083] A Figura 4 mostra o mapa de plasmídeo do plasmídeo shuttle

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JMP62Leu2expTEF incluindo a gene aFAS de Y. lipolytica.

[084] A Figura 5 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle pL68BT.

[085] A Figura 6 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle pLH 8BT.

[086] A Figura 7 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle pL68TAL_KSI.

[087] A Figura 8 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle pU18TAL_KSr.

[088] A Figura 9 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle TOPO-ELO1 PUT.

[089] A Figura 10 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle TOPOEL02-PLT.

[090] A Figura 11 mostra o mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle pUB4-CRE. [091] A Figura 12 mostra o perfil de FA em mg/ml para cada mutante (a letra representa o aminoácido que substitui o resíduo I na posição 1220. Por exemplo, E: mutante I1220E). Ácidos graxos foram extraídos das células e meio.

[092] A Figura 13: mostra o perfil de FA em mg/ml para cada mutante (a letra representa o aminoácido que substitui o resíduo I na posição 1220. Por exemplo, Y: mutante I1220Y). Ácidos graxos foram extraídos das células e meio.

[093] A Figura 14: mostra o perfil de FA em mg/ml para a cepa JMY1233_FASdepois de 5 dias de cultura em meio mínimo suplementado com metilC14 (MM mC14) ou Ácido oleico (MM AO). Ácidos graxos foram extraídos das células.

[094] A Figura 15: Perfil FA em mg/ml para a cepa JMY1233_FASII220F (SE) e a cepa JMY1233_AELO1AELO2_FASII220F depois de 5 dias de cultura em meio mínimo. Ácidos graxos foram extraídos das células e meio.

EXEMPLO 1: YARROWIA LIPOLYTICA MUTANTES COM ENGENDRADO SÍNTESE DE ÁCIDO GRAXO PARA PRODUZIR ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA MÉDIA

1. Materiais e Métodos

A. Meio

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24/42 [095] O meio rico YPD (extrato de levedura 10g/L, bactopeptona 10g/L, glicose 10g/L) foi utilizado para o crescimento de células antes da extração genômica e para culturas iniciais. O meio mínimo YNB (glicose 10 g/L, YNB sem AA 1,7 g/1, NH4C1 5 g/L, tampão fosfato pH 6,8 50 mM, agarose 15 g/l) foi usado para selecionar colônias após a transformação. Quando necessário, 0 ácido oleico preparado em Tween® 40 foi adicionado a 0,1% final. Para 0 crescimento de células para análise do conteúdo lipídico, utilizou-se 0 meio mínimo específico para 0 acúmulo de lipídios (glicose (80 g/L), sulfato de amônio (1,5 g/L), tampão fosfato (100 mM), oligoelementos: C0CI2 0, 5 mg/L, CuSo4 0,9 mg/L, Na2MoÜ4 0,06 mg/L, CaCb 23 mg/L, H3BO3 3 mg/L, MnSÜ4

3,8 mg/L, MgSÜ4 10 mg/L, ZnSÜ4 40 mg/L, FeSÜ4 40 mg/L , vitaminas (D-biotina 0,05 mg/L, Pantotenato 1 mg/L, ácido nicotínico 1 mg/L, Myo inositol 25 mg/L, cloridrato de tiamina 1 mg/L, cloridrato de piridoxol 1 mg/L, ácido p-aminobenzoico 0,2 mg/l) Para os mutantes que necessitaram de ácido oleico para crescer, foi adicionado 0,1%.

b. Cepas [096] A cepa JMY3776 (Genótipo MATa URA3 - 302 LEU2 - 270 XPR2 - 322 Aphdl Amfe Atgl4 +TEF ylDGA2 + TEF GPD1) divulgado em Pedido Internacional WO 2014136028 Al foi suprimido de seu gene aFAS (SEQ ID NO: 10) por recombinação homóloga conduzindo à cepa AAFAS JMY4368 (Genótipo MATa URA3 - 302 LEU2270 XPR2- 322 Aphdl Amfe Atgl4 +TEF ylDGA2 + TEF GPD1 + PTFAS2). O cassete de deleção da sequência SEQ ID NO: 16 foi tipicamente gerado por amplificação por PCR de acordo com Fickers etal. (2003).

c. Plasmídeos [097] Os genes foram clonados no plasmídeo JMP62Leu2expTEF (Beopoulos et al., 2014) albergando uma origem replicativa e um gene de resistência à canamicina para proliferação e seleção de plasmídeos em E. coli e 0 gene codificador da proteína LELI2 para seleção em Y. lipolytica.

[098] O mapa do plasmídeo do plasmídeo shuttle JMP62Leu2expTEF incluindo 0 gene FAS de Y. lipolytica (JMP62Leu2expTEFaFAS) mostrado na Figura 4.

d. Cassete de expressão e transformação

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25/42 [099] Paralelamente, todo o gene aFAS (SEQ ID NO: 10; amplificado a partir do DNA genômico da cepa POId; Barth e Gaillardin, 1996 com os iniciadores aFAS F e aFAS R) foi clonado no plasmídeo JMP62Leu2expTEF utilizando o líder técnico inFusion® para o plasmídeo JMP62Leu2expTEFaFAS. Para gerar o cassete para integração genômica aleatória do gene aFAS na cepa, o plasmídeo JMP62Leu2expTEFaFAS foi digerido com Notl e utilizado para transformação na cepa AaFAS. As transformações foram plaqueadas em meio YNB para uma seleção por integração do marcador Leucina. A transformação foi realizada utilizando o Kit™ Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymoresearch) seguindo as instruções do fabricante.

TABELA 2: INICIADORES USADOS NESTE ESTUDO

Iniciador	Sequência (5’ -3’)	SEQ ID NO:
alfaFAS F	ACCCGAAGGATCCCACAATGCACCCCGAAGTCGAACAAGAAC	20
alfaFAS R	ACCACAGACACCCT AGGCT ACTCG G CAACAGCAACAG COA	21
FAS S1305T F	atgatttccaggaggagacttctcaggagtttgca	22
FAS S1305T R	tgcaaactcctgagaagtctectectgga a atcat	23
FAS M1217F F	ctgttccggttccggtttcggtggtat ca ccg	24
FAS M1217F R	c^tgatacca ccga a a ccgga a cçggaacag	25
FAS M1217Y F	a actgttccggttccggtta cggtggt atcaccgcc	26
FAS M1217Y R	ggcggtgataccaccgtaaccggaaccggaacagtt	27
FASJ1220M F	tcc^tatgggt^tatgaccgccctg	28
FASJ1220M R	cagggcggteatacca cccataccgga	29
FASJ1220F F	ccggtatgggíggtiteaccgccctgt	30
FASJ1220F R	gcagggcggtgaaacca cccata ccgg	31
FASJ1220W F	tccggttccggtatgggtggttggaccgccctgcg	32

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26/42

Iniciador	Sequência (5’ -3’)	SEQ ID NO:
FASJ1220W R	cgcâgggeggtccaaccacccãtaccggãaccgga	33
KS-T7F	TGGATGGGATGCCCGACGATA	34
KS-T7 R	GAGTG ATCTCG GTCTCAG CGTT	35
HRscreening R	GGTCCTTã AACATà CCtCtg	36
WTscreening R	GGTCCTTG AACATGCCTCG C	37
KS P1	GTCGTTGAGMCAAGGCTGTTTCTG	38
KS T2	GAATTTGG ATAGTAG GGGCCACAGT	39
Matriz KS- TALEN 1F	AACG GTGGCTTCC AGTACATTCC	40
Matriz KS- TALEN 4R	TTGG ATGG CTCCGTTGÀG CATCCÁ	41
Matriz KSI1220L 3F	ATGGGTGGirTGACCGCCCTcsGaGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	42
Matriz KSI1220L2R	AGGGCGGT^GACCACCCATgCCGGAtCCaGAgCAGTTACCGACCTCGGA	43
Matriz KSI 1220V3F	ATGG GTGGT|££ACCGCCCTcaGaGGtATGTTtAAG GACCGGTTCATGGAC	44
Matriz KSI 1220V2R	AG GGCG GTGGAACCACCCATgCCG G AtCCaG AgCÁGTTACCG ACCTCG GA	45
Matriz KSI1220S3F	ATGGGTGGT£Ê£ACCGCCCTcaGaGGíATGTrtAAGGACCGGTTCATGGAC	46
Matriz KSI1220S2R	AGGGCGGTS^CCACCCAIgCCGGAtCC^GAgCAGTTACCGACCTCGGA	47

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27/42

Iniciador	Sequência (5’ -3’)	SEQ ID NO:
Matriz KSI1220P3F	ATGGGTGGTgggACCGCCCTcaGaGGtATGKtAAGGACCGGHCATGGAC	48
Matriz KSI1220P2R	AGGGCGGT^ggACCACCCATgCCGGAtCCaGAgCAGTTACCGACCTCGGA	49
Matriz KSI1220T3F	ATGGGTGGTgssACCGCCCTcaGaGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	50
Matriz KSI1220T2R	AG GGCG GTGGtACCACCCAK.CGGAtCCaG AgCAGTTACCG ACCTCG G A	51
Matriz KSI1220A3F	ATGG GTGGTjgccACCGCCCTca GaGGtATGTTtAAGGACCG GTTCATGG AC	52
Matriz KSI1220A2R	AGGGCGGTGSçACCACCCATgCCGGMCCaGAgCAGTTACCGACCTCGGA	53
Matriz KSI1220Y3F	ÂTGGGTGGTtacACCGCCCTcaGsGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	54
Matriz KSI1220Y2R	AGGGCGGTGtAACCACCCATgCCGGAtCCaGAgCAGTTACCGACCTCGGA	55
Matriz KSI1220H 3F	ATGG GTGGTçaç ACCGCCCFca GaGGt ATGTTtAAG G ACCG GTTCATGG AC	56
Matriz KSI1220H2R	AG GGCG GTGteACCACCCATgCCGGAtCCaG AgCAGTTACCG ACCTCGG A	57
Matriz KSI1220Q3F	ATGG GTGGTgagACCG CCCTcaGaG Gt ATGTTtA AG G ACCG GTTCATGG AC	58
Matriz KSI1220Q2R	AG GGCG GT^ACCACCCATgCCG GAtCCa G ÀgCAGTTÀ CCG ACCTCGG A	59

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28/42

Iniciador	Sequência (5’ -3’)	SEQ ID NO:
Matriz KSI1220N 3F	ATGGGTGGTaaçACCGCCCTcaGaGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	60
Matriz KSI1220N 2R	AGGGCGGTGttACCACCCATgCCGGAtCQiGAgCAGTTACCGACCTCGGA	61
Matriz KSI1220K3F	ATGGGTGGTaâÊACCGCCCTcaGãGGtATGTnAAGGACCGGTTCATGGAC	62
Matriz KSI1220K2R	AG GGCG GT^tACCACCCATgCCG GAtCCa G AgCÂGTFACCG ACCTCGGA	63
Matriz KSI1220D3F	ATGG GTGGTgacACCG CCCTca GaG GtATGTTtA AG GACCG GTTCATGG AC	64
Matriz KSI1220D2R	AG GGCG GTGte ACCACCCATgCCGG AtCCâG .^CAGTTACCG ACCTCG GA	65
Matriz KSI1220E 3F	ATGGGTGGT^ACCGCCCTcaGaGGtATGHtAAGGACCGGnCATGGAC	66
Matriz KSI1220E2R	AG GGCG GTctíACCACCCATgCCGG AtCCaG AgCAGTTACCGACCTCG G A	67
Matriz KSI1220C3F	ATGGGTGGTMACCGCCCTcaGaGGtATGTTtAAGGACCGGKCATGGAC	68
Matriz KSI1220C2R	AGGGCGGTÊSâACCACCCAT^CGGAtCCaGAgCAGTTACCGACCTCGGA	69
Matriz KSI1220M 3F	ATGGGTGGTâlÊACCÔCCCTcaGaGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	70
Matriz KSI 1220M 2R	AG GGCG GTCATACCACCCATgCCGGAtCCaGAgCAGTTACCG ACCTCGGA	71

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Iniciador	Sequência (5’ -3’)	SEQ ID NO:
Matriz KSI1220W3F	ATGG GTGGTtgeACCGCCCTeaGa GGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	72
Matriz KSI1220W2R	AG GGCG G T^ACCACCCATgCCGGAtCCaG AgCAGTTACCG ACCTCG G A	73
matriz KSI 1220F3F	ATGGGTGGTTTCACCGCCCrcãGãGGtATGTTtÂAGGÂCCGGTTCATGGAC	74
matriz KSI 1220F2R	AG GGCG GTGAsACCACCCATgCCG GAtCCa GAgCA GTTACCG ACCTCGGA	75
Matriz KSI1220R3F	ATGGGTGGTsgaACCGCCCTcaGaGGtATGTTtAAGGACCGGTTCATGGAC	76
Matriz KSI1220R2R	AG GGCG G TtçgACCACCCATgCCG G AtCCa G AgCAGTTACCG ACCTCGG A	77
Matriz KSI1220G3F	ATGG GTGGTsaçACCG CCCTcaGaG Gt ATGTTSA AGG ACCGGTTCATGG AC	78
Matriz KSI1220G2R	AG GGCG GTgeeACCA CCCATgCCGG AtCCaG AgCAGTTACCG ACCTCG G A	79
FAS S1305V F	cgâtgatttcca^âggaggtttcícâggôgtttgcaâac	80
FAS S1305V R	gtttgcaaacicctgagaa acctcctectgga aatcatçg	81

E. CONSTRUÇÃO DA CEPA MUTADA [0100] A mutagênese dirigida foi realizada na posição 11220 e M1217 in vitro usando o kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis da Agilent, usando o plasmídeo

JMP62LEU2expTEFaFAS como molde de DNA e os iniciadores listados na Tabela 2.

Após transformação em E. coli, extração e sequenciamento do plasmídeo, o

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30/42 plasmídeo foi digerido com Notl e utilizado para transformação em Y. lipolytica. Os clones foram selecionados para integração de Leucina em meio mínimo. Devido à auxotrofia do ácido graxo do AaFAS e ao comprimento do cassete de integração (8,6 kb), a eficiência de transformação foi geralmente baixa (em torno de 20 cfu/pg de plasmídeo). A integração do gene foi verificada por amplificação do gene aFAS a partir do DNA genômico dos clones selecionados seguidos de sequenciação. Os mutantes validados foram então avaliados quanto à sua capacidade para crescer em meio sem ácido graxo (ácido oleico) e para o seu perfil de ácido graxo após o cultivo.

F. EXTRAÇÃO DE DNA [0101] Os plasmídeos foram extraídos de células de E. coli e DNA genômico de Y. lipolytica utilizando o kit QIAprep spin miniprep™ (QIAGEN®) após as células terem crescido durante a noite em LB Canamicina ou YPD, respectivamente.

G. SEQUENCIAMENTO [0102] O sequenciamento foi realizado pelo método de Sanger (GATCBiotech<®>, LIGHTRUN™).

H. ANÁLISE DE CRESCIMENTO E ÁCIDO GRAXO [0103] Os mutantes foram cultivados em 50 ml de meio mínimo necessário para acumulação de lipídios a 28 durante 5 dias. Amostras de 2 ml foram coletadas após 5 dias para uma medida do crescimento e foram liofilizadas para posterior análise. O perfil FA foi analisado após a transmetilação. Adiciona-se 2 ml de uma solução de metanol com ácido sulfúrico a 2,5% à amostra seca em adição a 1 ml de tolueno. As amostras são aquecidas a 80 ° C por 3h. Uma vez que as amostras são resfriadas, a extração líquida bifásica ocorre utilizando 1,5 ml de NaCI e 1,5 ml de hexano. As amostras são misturadas e centrifugadas para separar a fase orgânica da fase aquosa. As análises são realizadas em fase orgânica com uma cromatografia gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS) TRACE™ 1310. Para todos os mutantes testados, os ácidos graxos foram extraídos tanto do sobrenadante quanto das células. No entanto, a quantidade detectada no sobrenadante representou menos de 1% do FA total extraído.

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2. RESULTADOS

ANÁLISE POR MUTANTE [0104] A Tabela 3 abaixo resume os mutantes construídos e o seu perfil de ácidos graxos. A posição escolhida para mutagênese, o número de clones validados para cada construção, o requisito em ácido graxo para crescimento e a sua capacidade para produzir ácido graxo de comprimento de cadeia média estão também indicados. [0105] Tabela 3: Mutações testadas em Y1_FAS. Para cada mutante, exigência em ácidos graxos para o crescimento e sua capacidade de aumentar a relação de ácidos graxos com comprimento de cadeia de hidroxicarboneto consistindo de 16 átomos de carbono (ácidos graxos C16) a ácidos graxos com cadeia de hidroxicarbonato de 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou para aumentar a quantidade de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8C15).

Mutações	Auxotrofia de ácido graxo	Aumento de razão C16/C18 FA e/ou aumento da quantidade de comprimento de cadeia média FA
PESO	não	não
MI217F	não	não
M1217Y	sim	não
II220F	não	sim
II220M	não	sim
I1220W	sim	sim
II220FS1305V	sim	não
I1220WS1305T	sim	sim
II220FS1305T	não	sim

[0106] Para cada posição para avaliar, várias variantes foram obtidas (Tabela 3) e

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32/42 foram testadas primeiro separadamente. Foi encontrada uma boa reprodutibilidade em termos de perfil FA entre as 2 ou 3 variantes portadoras da mesma mutação. Uma diferença na quantidade de FA acumulada pode, no entanto, ser encontrada entre as variantes.

EXEMPLO PARA A AFAS + AFASII220F MUTANTE [0107] Os resultados obtidos para AAFAS + aFASII220F mutantes são mostrados na Figura 1. As três variantes diferentes (A, B e C) foram validados para a integração aFASII220F depois de transformação na cepa AAFAS. A complementação do ácido oleico não foi necessária para o seu crescimento, significando que a aFAS mutada na posição 11220 estava retendo atividade suficiente para permitir o crescimento normal da cepa. As 3 variantes foram cultivadas e o teor de FA foi analisado em termos de quantidade (Figura 1). Como mencionado anteriormente, verificou-se uma boa reprodutibilidade no prazo de repartição de espécies FA: 50% do total de FA foi espécies C18 com uma maioria de C18:1,40% era C16 espécies e curiosamente cerca de 10% foi o ácido graxo de comprimento de cadeia média C14. A quantidade de C14 atingiu 0,2 mg/ml para as três variantes. Como a variante C é capaz de produzir a maior porcentagem de C14, ela foi escolhida para experimentos posteriores.

[0108] Para comparar os mutantes, decidiu-se escolher para cada posição mutada o clone que apresentou maior porcentagem de ácidos graxos de cadeia média.

RESULTADOS PARA MUTANTES AUXOTRÓFICOS PARA ÁCIDO GRAXO [0109] Os clones portadores das mutações I1220W e M1217Y não foram capazes de crescer sem complementação de ácidos graxos. Este resultado sugere que a aFAS mutada é completamente inativo e não pode produzir nenhum ácido graxo ou é ativo, mas produz espécies de ácidos graxos que não podem suportar o crescimento da cepa (comprimento da cadeia curta ou média). Para responder a essa pergunta, as variantes foram cultivadas na presença de ácido oleico para sustentar seu crescimento. Para análise do conteúdo lipídico, as células foram lavadas para fora do meio contendo o ácido oleico adicionado antes da transmetilação. Após a separação

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33/42 em GC-MS, não foi possível detectar FAs de comprimento de cadeia curta ou média para o mutante M1217Y. No entanto, para os AAFAS + aFAS II220W mutantes e AAFAS + aFAS //220W, S1305T, C14 foram produzidos e pareceram ser a única espécie de FA neossintetizada (Figura 2).

RESULTADO PARA O MUTANTE QUE SE COMPORTA COMO A CEPA DE CONTROLE [0110] O AAFAS + aFASM1217F mutante foi cultivado sem qualquer complementação com ácido graxo e analisado como indicado acima. Não foi possível encontrar nenhuma diferença no teor de FA entre esses clones e a cepa de controle AAFAS + aFASwt, indicando que essa mutação em particular não parece ter impacto na atividade da FAS.

COMPARAÇÃO ENTRE MUTANTES PRODUTORES DE MCFA [0111] Para cada mutante produtor de C14, um mutante representativo foi testado e comparado para o perfil de FA (Figura 3) [0112] Os mutantes foram cultivados sem complementação do ácido oleico junto com a cepa de controle AAFAS + aFASwt expressando uma cia de tipo selvagem do gene aFAS. Verificou-se que o AAFAS + aFASII220F mutante produziu a maior porcentagem e quantidade de C14 (9% do FA total e 0,2 mg/ml). A porcentagem de espécies C18 foi bastante reduzida em comparação com o tipo selvagem (68% a 57%), enquanto a porcentagem de espécies C16 não se alterou significativamente. Isto sugere que as espécies C14 são produzidas à custa de C18 FAs. O AAFAS + aFASII220M mutante também produziu C14 mas a um nível de 2% do total de FAs e na quantidade de 0,05 mg/ml. No entanto, a quantidade relativa de C16 FAs produzidos foi aumentada para 48% do FA total extraído em comparação com a cepa de controle que atingiu 32%. Nenhuma diferença significativa foi encontrada para a cepa mutante dupla AAFAS + aFASII220F-S1305T em comparação com a única cepa mutada AAFAS + aFASII220F. O único AAFAS + aFASII220W mutante e a cepa mutada dupla AAFAS + aFASII220W-S1305T não puderam crescer sem a complementação de FA. Cultivados em meio suplementado com ácido oleico, foram

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34/42 capazes de produzir C14 FA em um nível de 0,15 mg/ml e 0,05 mg/ml, respectivamente, após 5 dias (Figura 2).

EXEMPLO 2: CEPAS MUTANTES DE YARROWIA LIPOLYTICA COM PERFIL LIPÍDICO MODIFICADO E PRODUZINDO ÁCIDO GRAXO DE COMPRIMENTO DE CADEIA MÉDIA.

1. MATERIAIS E MÉTODOS

PROJETO TALENS E PLASMÍDEOS [0113] A substituição do FASde tipo selvagem por um FAS mutadofoi feita através de recombinação homóloga mediada por nuclease modificada. Uma Nuclease TALE (descrita e usada para simular modificações genéticas específicas (Christian et al., 2010 e Cermak etal, 2011)) foi projetada para gerar uma ruptura de fita dupla centrada na posição de Códon 11220. A TALE-Nuclease_KS codificada pelo TAL_KSr (SEQ ID NO: 17) e os plasmídeos TAL_KS1 (SEQ ID NO: 18) foi concebido para clivar a sequência de DNA (5’TGTTCCGGTTCCGGTATgggtggtatcaccgcCCTGCGAGGCATGTTCA-3’. A sequências da TAL_KS 1 e TAL_KS r correspondente foram sintetizados seguindo o kit Golden Gate TALEN (Addgene) e clonados em um plasmídeo projetado e construído para uso em Yarrowia lipolytica Os plasmídeos vazios pL68 e pU18 abrigam uma origem de replicação de levedura (ARS68 e ARS18 respectivamente), um marcador de seleção (LEU2ou LIRA3, respectivamente), além de uma origem de replicação em E. coli e do gene codificador da resistência à canamicina Os plasmídeos Shuttle pL68BT e pU18BT foram construídos a partir dos plasmídeos vazios pL18 e pU18 por inserção das sequências N-terminal e C-terminal para um andaime óptimo de TALEN entre o promotor constitutivo pTEF e o terminador Lip2. Subsequentemente, TAL_KSr e TAL_KS1 foram clonados nos plasmídeos pU18BT e pL68BT dando respectivamente pU18TAL _KSr e pL68TAL_KSI (Figuras 7 e 8). Os plasmídeos foram amplificados em E. coli, extraídos e sequências verificadas antes de utilização adicional em Yarrowia lipolytica.

PROJETO DE MATRIZ

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35/42 [0114] Foram sintetizadas 19 matrizes diferentes por fusão por PCR de dois produtos de PCR sobrepostos sintetizados utilizando iniciadores transportando as mutações desejadas substituindo o códon 11220 pelos 19 outros códons de aminoácidos (listados na Tabela 2). Além disso, quatro mutações silenciosas foram introduzidas em cada local alvo de TALEN para evitar que o TALEN se ligasse à matriz. Além disso, estas mutações silenciosas permitiram a concepção de um iniciador específico da matriz, utilizado consequentemente para o rastreio dos clones desejados, isto é, onde ocorreu a recombinação homóloga (HR) entre a matriz e o cromossoma. Como exemplo, a sequência de DNA da matriz correspondente à mutação II220F é dada na SEQ ID NO: 19.

CEPA E TRANSFORMAÇÃO [0115] A cepa Yarrowia lipolytica JMY1233 (MATa, LEU2- 270, LIRA3 - 302, XPR2 - 322, poxl-6) foi usada neste estudo. Foi suprimida da via de β-oxidação (Beopoulos et al. 2008) e é auxotrófico para Uracila e Leucina. Esta cepa é usada como uma plataforma para a engenharia de cepas produzindo lipídios novos ou originais, a βoxidação foi removida para evitar a degradação de quaisquer novos tipos de ácidos graxos produzidos pela cepa modificada. As células JMY1233 foram tornadas competentes com o Kit Frozen-EZ Yeast Transformation II™ (Zymoresearch). As transformações foram realizadas como descrito pelo fabricante utilizando 50 μΙ de células competentes e 500 ng de cada um dos plasmídeos vazios pU18BT e plasmídeos pL68BT ou TALEN pU18TAL_KSr e pL68TAL_KSI.

[0116] Para experiências de recombinação homóloga, foram usados 500 ng de matriz de sequência SEQ ID NO: 19 adicionalmente aos plasmídeos pU18BT e pL68BT ou aos plasmídeos pU18TAL_KSr e pL68TAL_KSI. Os transformantes foram selecionados em placas YNB AO para a seleção de colônias FAS + e FAS-. Após a transformação, as colônias foram cultivadas em meio rico e semeadas em placas para permitir a perda dos plasmídeos replicativos. O DNA genômico foi extraído das culturas e rastreado para o evento HR por PCR.

RASTREIO DE PCR EM DNA GENÔMICO

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36/42 [0117] Os iniciadores usos para o rastreio e a sequenciação estão listados na Tabela 2. As extrações de DNA genômico foram realizadas em culturas de 2 ml durante a noite em meio YPD usando QIAprep spin miniprep™ (Qiagen). A PCR foi realizada com 1 pl de gDNA. Para o rastreio de clones de NHEJ, os iniciadores KST7_F e KS-T7_R foram utilizados para amplificar um fragmento de 500 pb centrado na posição do códon 11220. O iniciador KS-T7_F foi então usado para sequenciar o produto de PCR. Para o rastreio dos clones experimentais de HR, utilizaram-se os iniciadores KS_P1 e HR screening_R ou WT screening_R. Os iniciadores KS_P1 e KS_T2 foram então utilizados para amplificar um fragmento de iniciador de 4000 pb e KS-T7_F utilizado para sequenciar este produto de PCR, a fim de confirmar a introdução da mutação desejada na posição 11220.

2. RESULTADOS [0118] Foram realizadas 19 transformações uso a matriz do desejo e a triagem foi focada nas pequenas colônias brancas que crescem nas placas YNB AO, que apresentaram a melhor frequência de FC e estavam presentes em todas as transformações. Para 17 mutações, pelo menos 2 clones HR positivos puderam ser identificados rapidamente por rastreio por PCR de menos de 10 colônias brancas pequenas. Em relação à transformação com as matrizes I1200R e I1220D, não foram detectadas colônias brancas pequenas. Estes aminoácidos particulares na posição 1220 podem ser deletérios para a atividade do FAS, levando ao fenótipo FAS em relação à FC. Colônias translúcidas exibindo um fenótipo FAS foram tríadas em meio rico suplementado com ácido oleico e clones positivos para HR foram encontrados.

ANÁLISE DOS MUTANTES [0119] Após os clones terem crescido durante a noite em meio líquido YPD e semeados em placas YPD, 100% dos clones tinham perdido os plasmídeos pU18TAL_KSI e pL68TAL_KSr. Todos os clones obtidos sendo URA- e LEU-, foram transformados com o plasmídeo vazio pL68 e pU18 de modo a manter a prototrofia da cepa sem manter o TALEN. Todos os clones foram cultivados em meio mínimo e o conteúdo lipídico foi extraído e analisado. Os resultados obtidos foram os seguintes:

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Quando a Isoleucina na posição 1220 foi substituída por Arg ou Asp, os mutantes necessitaram de ser complementados com ácido oleico para crescer. Isto sugere que ou a atividade do FAS está completamente perdida ou a FAS mutada não pode suportar a síntese de FA adequada para o crescimento. A análise do perfil FA para as culturas crescidas na presença de AO para complementar a falta de lipídios adequados mostrou que não ocorreu neo-síntese de FA. Para todas as outras substituições de aminoácidos na posição 1220, as células foram capazes de crescer sem adição de Ácido graxo exógeno no meio [0120] Quando Isoleucina 1220 foi substituída por resíduo de Ala, Gly, Vai, Leu, Met, Ser, Thr, Cys, Pro ou Gin, a cepa apresentou um perfil de AF globalmente semelhante ao do tipo selvagem aos 8 dias (Figura 12). Essas mutações não pareciam afetar a especificidade ou atividade da FAS, pois a acumulação era semelhante à do tipo selvagem. No entanto, a quantidade de C14 para JMY1233JI220M atingiu 0,03 mg/ml comparada com 0,007 mg/ml obtida para a cepa de tipo selvagem. Quando 1220 foi substituído por Asn, Glu ou Lys, nenhuma mudança de especificidade foi observada. No entanto, podemos notar um menor acúmulo de lipídios. Mais interessante, quando o 11220 foi substituído pelos resíduos aromáticos Trp, Tyr, Phe ou His, o perfil de FA foi modificado e foi produzida uma quantidade significativa de C14 (Figura 13). C14 atingiu 0,025 mg/ml para a cepa JMY1233J1220Y, 0,052 mg/ml para JMY1233J1220H, 0,13 mg/ml para JMY1233JI220F e 0,16 mg/ml para JMY1233J1220W. Isto corresponde respectivamente a um aumento de 4, 7, 17,5 e 29 vezes de acumulação de C14 (de DWC) em comparação com o FAS de tipo selvagem. De nota, traços de C12 também foram detectados para JMY1233J1220W. [0121 ] Conclusão: O uso de abordagem de engenharia direcionada leva à geração de cepas de Yarrowia lipolityca portadoras de FAS mutado (II220F ou I1220W) que são capazes de produzir uma quantidade maior de cadeias de ácidos graxos médios.

EXEMPLO 3: ELONGASES ELO1 DE YARROWIA LIPOLYTICA E ELQ2

ESTÃO ENVOLVIDAS NA ALONGAMENTO DAS ESPÉCIES ÁCIDOS GRAXOS

C14 E C16. UMA CEPA DE YARROWIA LIPOLYTICA COM UMA FAS MUTADA E

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ELIMINADA DAS ELONGASES ELO1E E ELQ2 MOSTRA UM PERFIL LIPÍDICO SHIFTED PARA CADEIAS MAIS CURTA.

1. MATERIAIS E MÉTODOS [0122] A cepa JMY1233 (MATa, LEU2 - 270, URA3 - 302, XPR2 - 322, poxl-6 (Beopoulos et al. (2008)) foi usada para deletar os dois genes Elongase ELO1 (YALI0B20 1696p) e ELO2 (YALI0F06754p). O respectivo cassete de ruptura ELO1PUT e ELO2-PLT foi concebido como descrito por Fickers etal., utilizando o marcador LIRA3 e LELI2, respectivamente, sendo o JMY1233 competente e transformado pelo método do acetato de lítio.

[0123] Cassetes de ruptura ELO1-PUT e ELO2-PLT foram clonados no vetor TOPO. Os plasmídeos foram digeridos com a enzima de restrição Notl HF/Pmel e utilizados para transformação. Para excisar os marcadores de seleção, a cepa foi tornada competente e transformada com o plasmídeo PUB4-Cre. Este plasmídeo transporta a recombinase Cre permitindo a excisão do marcador por recombinação dos locais LoxR e LoxP (flanqueando o marcador URA3ou LELI2).

MEIO:

As cepas foram cultivadas em 50 ml de meio mínimo necessário para o acúmulo de lipídios a 28° C por 5 dias. Quando necessário, o meio foi complementado com 0,2% de ácido oleico ou 0,2% de miristato de metila (mC14) preparado a 20% em Tergitol. Ao longo da cultura, amostras de 2 ml foram coletadas após 5 dias para uma medida do crescimento e foram liofilizadas para posterior análise. O perfil FA foi analisado após a transmetilação. Adiciona-se 2 ml de uma solução de metanol com ácido sulfúrico a 2,5% à amostra seca em adição a 1 ml de tolueno. As amostras são aquecidas a 80° C por 3h. Uma vez que as amostras são resfriadas, a extração líquida bifásica ocorre utilizando 1,5 ml de NaCI e 1,5 ml de hexano. As amostras são misturadas e centrifugadas para separar a fase orgânica da fase aquosa. As análises são realizadas em fase orgânica com uma cromatografia gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS) TRACE™ 1310. Ácidos graxos foram extraídos apenas das células.

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2. RESULTA:

CEPA JMY1233_AEL01AAELQ2:

[0124] A cepa foi feita a partir da cepa parental JMY1233 (URA-LEU-). O gene ELO1 foi primeiro deletado usando o cassete de ruptura ELO1 -PUT dando a linhagem JMY1233_AEL01 (URA + LEU-). Subsequentemente, esta cepa foi utilizada para a deleção do segundo gene ELO2 utilizando o cassete de ruptura ELO2-PLT, originando a cepa JMY1233_AEL01 AELO2 (URA + LEU +). Os marcadores LEU2e URA3 foram excisados desta cepa levando à cepa JMY1233_AELO1AAELO2 (URA- LEU-).

CEPA JMY1233_AEL01AAELQ2_FAS[0125] JMY1233_AELO1AAELO2 (URA-LEU-) foi tornada competente e foi transformada com o plasmídeo PL68TAL-KS1 e PU18TAL-KSr como descrito no exemplo 2. A transformação foi plaqueada em YNB AO para permitir o crescimento dos clones FAS (gene ccFAS) interrompida pelo NHEJ). O fenótipo dos clones FAS é facilmente perceptível, uma vez que mostra um atraso de crescimento no meio suplementado com AO. Um clone foi selecionado, o rompimento do gene FAS foi verificado por PCR e o clone selecionado foi cultivado em meio rico complementado com AO, a fim de perder ambos os plasmídeos replicativos portadores do TALEN. As cepas JMY1233 FAS- e JMY1233_AELO1AAELO2_FAS- foram então cultivadas em meio mínimo ou rico com metil-C14 (mC14) como fonte única de ácido graxo. Estas duas cepas são deficientes em atividade FAS, portanto, não são capazes de produzir o seu próprio ácido graxo. O meio precisa ser complementado com ácido graxo.

[0126] Quando usamos ácido oleico para complementar o meio em FA, ambas as cepas foram capazes de crescer na mesma proporção. No entanto, quando o mC14 foi usado para complementar o meio, apenas a cepa JMY1233_FAS- foi capaz de crescer. A extração e análise de lipídios mostraram que as espécies C16 e C18 foram produzidas a partir do mC14 fornecido no meio (figura 14). A cepa FAS deletada dos dois genes Elongase não pôde crescer em C14. Estes resultados sugerem que o C14 deve ser alongado para C16 e C18 para serem usados pelas células FAS e os genes Elongase são responsáveis por este alongamento.

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CEPA JMY1233_AELO AELO2_FASII220F [0127] JMY1233_AELO1AAELO2 (URA-LEU-) oram tornados competentes e foram transformados com o plasmídeo PL68TAL-KS1 e PU18TAL-KSr para além da matriz H220Fm como descrito no exemplo 2. Pequenas colônias brancas foram rastreadas por PCR para verificar a recombinação homóloga. Um clone identificado como HR positivo foi selecionado, a mutação II220F foi verificada por sequenciamento e o clone foi cultivado em meio rico, a fim de perder os plasmídeos replicativos portadores das TALENs.

ANÁLISE DAS CEPAS [0128] Depois de edição do genoma com o TALEN, os clones eram URA e LEU. Os clones foram transformados com os cassetes de integração contendo os marcadores L/RA3 ou LELI2. Transformações foram banhadas em YNB. As duas cepas JMY1233_FASII220F e JMY1233_AELO1AELO2_FASII220F foram cultivadas em meio Mínimo para acúmulo de lipídio como descrito no exemplo 1. O FA total foi extraído após 5 e 12 dias, os resultados são dados para o dia 5 na figura 15. A% de C14 foi inalterada entre as duas cepas. No entanto, a quantidade de C16/C16: I acumulada aumentou de 32% para 74% quando as elongases são eliminadas. Consequentemente, a quantidade de espécies de C18 AF diminuiu de 45% para 15% na cepa AELO1 AELO2_FASII220F. Isto sugere que EL01 e Elo2 estão provavelmente envolvidos no alongamento de espécies C16 em espécies C18.

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Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar a razão de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 16 carbonos (ácidos graxos C16) para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou para aumentar a quantidade de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8-C15), produzida por uma cepa de levedura, em comparação com a cepa de levedura precursora a partir da qual a dita cepa de levedura deriva, compreendendo expressar na dita cepa de levedura uma subunidade alfa de síntese de ácido graxo mutada (aFAS), caracterizado por o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 ser substituído com um resíduo de aminoácido de impedimento estérico maior e, opcionalmente, em que o resíduo de aminoácido da dita aFAS correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1305 na SEQ ID NO: 1 é substituído com qualquer outro aminoácido.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por:

   - quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada for isoleucina (I) então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F), histidina (H), metionina (M), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W),

   - quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada é valina (V) então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em isoleucina (I) fenilalanina (F), histidina (H), metionina (M), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W),

   - quando o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 da aFAS não mutada é metionina (M)

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   2/5 então é substituída com um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F), histidina (H), triptofano (W) e tirosina (Y), preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina (F) e triptofano (W).
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado por a sequência de aminoácido da aFAS não mutada ter pelo menos 50 % de identidade, ou por ordem de preferência crescente pelo menos 51 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 82 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade, com a sequência de aminoácido de aFAS de Yarrowia lipolytica de SEQ ID NO: 1.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a aFAS mutada ser derivada a partir da sequência de aminoácido de consenso SEQ ID NO: 11, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1220 na SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido de impedimento estérico maior, e, opcionalmente, em que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido na posição 1305 na SEQ ID NO: 1 é substituído com qualquer outro aminoácido.
5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por a aFAS mutada ser derivada a partir de aFAS selecionada a partir do grupo consistindo em aFAS de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.
6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, caracterizado por o resíduo de aminoácido na posição 1305 da dita aFAS ser substituída com treonina (T).
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 6, caracterizado por a razão de ácidos graxos ter um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12 ou 16 carbonos (C12 ou C 16 ácidos graxos), para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) é aumentada e/ou a quantidade de ácidos graxos de cadeia média tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12

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   3/5 carbonos ou 14 carbonos (C12 ou C14 ácidos graxos) é aumentada.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o ácido graxo ter um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 14 carbonos é ácido mirístico (ácido tetradecanoico) e o ácido graxo tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 12 carbonos é ácido láurico (ácido dodecanoico).
9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por a substituição do resíduo de aminoácidos correspondente ao resíduo de aminoácidos nas posições 1220 e/ou 1305 da dita aFAS ser obtida por mutagênese dirigida ao local do gene aFAS alvejando o códon que codifica o resíduo de aminoácidos correspondente ao resíduo de aminoácidos nas ditas posições 1220 e/ou 1305.
10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 9, caracterizado por o método compreender ainda inibir na dita cepa de levedura a expressão e/ou a atividade das proteínas elongase endógenas, em particular elongase 1 (ELO1; EC 2.3.1.199) tendo pelo menos 50 % de identidade ou por ordem de preferência crescente pelo menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade, com o polipeptídeo de sequência SEQ ID NO: 12 (YALI_EL01) e/ou da elongase 2 endógena (ELO2; EC2.3.1.199) tendo pelo menos 50 % de identidade ou por ordem de preferência crescente pelo menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade, com o polipeptídeo de sequência SEQ ID NO: 13 (YALI_ELO2).
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 9, caracterizado por o método compreender ainda inibir na dita cepa de levedura a expressão e/ou a atividade da subunidade alfa de síntese de ácido graxo endógeno (EC 2.3.1.86).
12. 12. Método de acordo com a reivindicações 10 ou a reivindicação 11, caracterizado por a dita inibição ser obtida transformando-se geneticamente a cepa

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    4/5 de levedura com um cassete de ruptura do gene endógeno que codifica a dita aFAS e do gene endógeno que codifica a dita elongase 1 ou do gene endógeno que codifica a dita elongase 2.
13. 13. Cassete de expressão de DNA recombinante, caracterizada por compreender um polinucleotídeo que codifica uma aFAS mutada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 sob o controle de um promotor adequado.
14. 14. Vetor recombinante, caracterizado por compreender um cassete de expressão de DNA recombinante da reivindicação 13.
15. 15. Célula hospedeira, caracterizada por compreender um cassete de expressão de DNA recombinante da reivindicação 13 ou um vetor recombinante da reivindicação 14.
16. 16. Cepa de levedura mutante capaz de produzir uma razão aumentada de ácidos graxos tendo um comprimento de cadeia de hidroxicarbono consistindo em 16 carbonos (C16 para ácidos graxos) para ácidos graxos tendo uma cadeia de hidroxicarbono consistindo em 18 carbonos (ácidos graxos C18) e/ou uma quantidade aumentada de ácidos graxos de comprimento de cadeia média (ácidos graxos C8C15), em comparação com a cepa de levedura oleaginosa precursora a partir da qual a dita cepa de levedura mutante deriva, caracterizada por a dita cepa de levedura mutante expressar uma aFAS mutada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e opcionalmente em que a expressão e/ou a atividade das elongases 1 e/ou 2 endógenas como defina nas reivindicações 9 ou 10 é inibida e/ou a expressão e/ou a atividade da aFAS endógena como definida na reivindicação 11 é inibida na dita cepa de levedura mutante.
17. 17. Cepa de levedura mutante, de acordo com reivindicação 16, caracterizada por compreender, estavelmente integrada em seu genoma, um cassete de expressão de DNA recombinante da reivindicação 13.
18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 11, ou a cepa de levedura mutante, de acordo com reivindicações 16 ou 17, caracterizado por a cepa de levedura pertencer ao gênero selecionado a partir do grupo consistindo em

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    Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Saccharomyces e Yarrowia.
19. 19. Método ou a cepa de levedura mutante de acordo com reivindicação 18, caracterizado por a cepa de levedura oleaginosa ser selecionada a partir do grupo consistindo em uma cepa Y. lipolytica, Y. galli, Y. yakushimensis, Y. alimentaria e Y. phangngensis, preferencialmente uma cepa Y. lipolytica.