BR112018006145B1 - Sistema para realizar análise e seleção de esperma e método para classificação de células espermáticas - Google Patents
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Abstract
a invenção provê um sistema (1) para realizar análise e seleção de esperma com base na morfologia de célula espermática de células espermáticas (6) em um fluido (5), o sistema (1) compreendendo: (i) um canal de fluxo de fluido (2) para transportar o dito fluido (5), o canal de fluxo de fluido (2) compreendendo uma entrada (10), uma zona de análise (40) configurada à jusante da dita entrada (10) e compreendendo um primeiro par de eletrodos (41) compreendendo uma primeira distância intra-eletrodos (dl), uma zona de classificação (50) configurada à jusante da dita zona de análise (40) e compreendendo um dispositivo de classificação (51), e saídas (80, 90,...) configuradas à jusante da dita zona de classificação (50); (ii) uma fonte elétrica (140) configurada para prover um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos (41); (iii) um dispositivo de medição (150) acoplado de maneira funcional ao primeiro par de eletrodos (41) e configurado para medir uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido (5) entre o primeiro par de eletrodos, e para prover dados de impedância dependentes do tempo; em que o dispositivo de classificação (51) é configurado para classificar células espermáticas (6) ao direcionar a célula espermática (6) na zona de classificação (50) a uma das saídas (80, 90,...) com base em uma comparação em um estágio de comparação do dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos.
Description
[001] A invenção se refere a um sistema para classificação de células espermáticas assim como a um método para classificação de células espermáticas. A invenção também se refere a um produto de esperma.
[002] A manutenção da morfologia e motilidade de esperma para aumentar a taxa de sucesso da inseminação artificial é conhecida na técnica, e é, por exemplo, descrita no documento WO2004053465A2. Neste documento, um método e dispositivo para testar a motilidade de esperma em uma direção para frente e densidade de esperma ativo em uma amostra de sêmen são descritos. O dispositivo inclui uma estrutura microfluídica tendo um reservatório de amostra, uma região de coleta a jusante e um microcanal que se estende entre eles. O microcanal é dimensionado para restringir esperma de amostra ao movimento de direção única dentro do canal, de modo que o esperma em uma amostra de sêmen colocada no reservatório de amostra entre e migre ao longo do microcanal em direção à e à região de coleta. Também é incluído um detector para detectar a presença de esperma marcado no microcanal ou região de coleta, e uma unidade de componentes eletrônicos conectada de maneira operacional ao detector para (i) receber sinais de detector, (ii) com base nos sinais de detector recebidos, determinação de motilidade de esperma e densidade na amostra de esperma, e (iii) exibição de informações relacionadas à motilidade e densidade de esperma.
[003] O documento EP2508253A1 descreve um dispositivo de canal incluindo um canal de tamanho nano através do qual única molécula flui, pelo menos um par de eletrodos disposto próximo ao canal de tamanho nano, e uma fonte de energia de CA que aplica uma tensão CA aos eletrodos. Este dispositivo de canal é útil para identificar moléculas uma por uma. Além disso, um dispositivo de canal é descrito, incluindo um canal de tamanho nano através do qual única molécula flui, uma parte de ramificação, e uma pluralidade de canais de ramificação, em que (i) um par de eletrodos é disposto próximo ao canal de tamanho nano, de modo a prensar o canal de tamanho nano entre os eletrodos, ou (ii) um eletrodo do par de eletrodos está localizado próximo ao canal de tamanho nano, enquanto o outro está disposto próximo aos canais de ramificação. Este dispositivo de canal é útil para classificar única molécula. O dispositivo de canal atinge a identificação ou classificação em uma precisão de 100% em princípio. Um equipamento de tratamento de amostra, de acordo com os inventores, inclui um dispositivo de canal, uma seção de medição, e uma seção de processamento aritmético. A seção de medição aplica uma tensão (CC ou CA) entre os eletrodos de um par de eletrodos instalado no canal de tamanho nano, e mede um sinal elétrico quando a única molécula passar entre os eletrodos para identificar a molécula.
[004] O documento EP2211164 A1 descreve que as propriedades elétricas de soluções de partícula podem ser investigadas em uma única partícula ao utilizar canais microfluídicos. A impedância pode ser medida pelo canal utilizando pelo menos um par de eletrodos condutores, pelo menos um eletrodo de um par sendo um eletrodo dedilhado tendo uma pluralidade de dedos. O padrão dos eletrodos dedilhados cria uma forma de sinal de medição mais longa e mais complicada que leva a uma melhoria significativa da sensibilidade de medição. Uma aplicação para a tecnologia proposta é melhorar significativamente a sensibilidade de medição de medições de impedância em células sanguíneas, levando a uma melhor diferenciação entre diferentes tipos de leucócitos. Melhor sensibilidade de medição também permite a medição de partículas menores e maior produção.
[005] O documento US2005/0118705 A1 descreve equipamento e métodos para realizar microanálise de partículas utilizando um chip de sistema microelétrico-mecânico (MEMS) para interrogar eletricamente as partículas. O chip de MEMS é fabricado tipicamente utilizando técnicas de microusinagem litográficas conhecidas, empregadas, por exemplo, na indústria de semicondutor. Um substrato carrega uma pluralidade de microeletrodos dispostos em uma zona de detecção e espaçados ao longo de um eixo de um microcanal. O microcanal é dimensionado em seção transversal para fazer com que as partículas carregadas por um fluido se movimentem além dos eletrodos em um único processo. A impedância é medida entre um ou mais pares de eletrodos para determinar a presença de uma partícula na zona de detecção.
[006] O documento US2013/0256197 A1 descreve um dispositivo de canal de fluxo que inclui um canal de fluxo no qual um fluido contendo uma partícula flui, uma pluralidade de canais de ramificação do canal de fluxo, e uma unidade de eletrodo. A unidade de eletrodo inclui um primeiro eletrodo tendo uma primeira área e um segundo eletrodo tendo uma segunda área diferente da primeira área e é configurada para formar um campo elétrico de guia no canal de fluxo, que guia a partícula a um canal de ramificação predeterminado da pluralidade de canais de ramificação. O segundo eletrodo é oposto ao primeiro eletrodo, de modo que o canal de fluxo seja prensado entre o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo.
[007] O documento US2014/0248621 A1 descreve dispositivos microfluídicos e métodos que utilizam células, como células neoplásicas, células-tronco, células sanguíneas para pré-processamento, classificação para diversos testes biodiagnósticos ou aplicações terapêuticas. A detecção elétrica microfluídica, como a medição de potencial ou corrente ou fenômeno de campo, como fluidos imiscíveis, fluidos inertes são utilizados como a base para o processamento celular e molecular (por exemplo, caracterização, classificação, isolamento, processamento, amplificação) de diferentes partículas, composições ou bioespécies químicas (por exemplo, diferentes células, células contendo diferentes substâncias, diferentes partículas, diferentes composições bioquímicas, proteínas, enzimas etc.). Especificamente, o documento descreve poucos esquemas de classificação para células-tronco, sangue total e células neoplásicas de circulação e, também, extração de soro do sangue total.
[008] Segerink et al. descreve em “On-chip determination of spermatozoa concentration using electrical impedance measurements” Lab on a Chip vol. 10 (8), (2010) um chip microfluídico para determinar a concentração de espermatozóide no sêmen. Para o método, um microcanal com um par de eletrodos planar que permite a detecção de espermatozóide passando nos eletrodos, utilizando medições de impedância elétricas. É ainda descrito que as células que não sejam espermatozóide no sêmen também causam uma alteração na impedância ao passar pelos eletrodos, interferindo na contagem de espermatozóide. A alteração na impedância elétrica é relacionada ao tamanho das células que passam pelos eletrodos, permitindo a diferenciação entre espermatozóide e células HL- 60 suspensas no meio de lavagem ou contas de poliestireno.
[009] A inseminação artificial (AI) é uma técnica bem estabelecida na indústria animal para produção de rebanho. A seleção de amostras de esperma para AI tem base na concentração de esperma, motilidade e morfologia celular. Todos os fatores apresentaram impacto na taxa de sucesso da fertilização e a abundância de prole. Portanto, AI centraliza satisfação a altos padrões para fornecer amostras de esperma de alta qualidade para garantir alta probabilidade de fertilização após AI. Alguns exemplos de critérios para rejeição de amostra de esperma são uma baixa motilidade de célula espermática (menos que 60% de motilidade progressiva ou 70% de motilidade (ambos para porcos e gado), na amostra fresca), em baixa concentração geral, e um alto número de células espermáticas morfologicamente anormais (>15-20%). Um defeito de esperma que ocorre frequentemente é a presença de uma gota citoplasmática no flagelo do esperma. Esta gota é parte do citoplasma dos espermatídeos, que não foi removida do flagelo no final da espermiogênese. Gotas citoplasmáticas são comumente encontradas em uma das duas posições. Próximo à cabeça da célula espermática, gotas citoplasmáticas proximais podem ser encontradas, enquanto denominadas gotas distais podem estar presentes na cauda, distante da cabeça. Embora o efeito de retenção de citoplasma residual na infertilidade humana seja um assunto controverso clinicamente, muitas fontes apresentam a contribuição de um conteúdo de gota, especialmente, conteúdo de gota distal, na subfertilidade em espécies domésticas. Portanto, amostras de esperma (gado e porco) contendo mais de 20% de células com gotas citoplasmáticas são retiradas (em geral) da AI. No processo de seleção, um alto número de células espermáticas saudáveis, morfologicamente normais é descartado. Infelizmente, técnicas de refinamento de esperma de rotina, como a centrifugação de densidade de esperma e flutuação de esperma, não são adequadas para a recuperação destas células espermáticas para fins de AI.
[010] Uma abordagem potencial para obter estas células espermáticas saudáveis e morfologicamente normais de amostras descartadas é o uso de tecnologia microfluídica. Sistemas microfluídicos têm sido utilizados para a manipulação, análise e enriquecimento de células espermáticas com motilidade, viáveis.
[011] Entretanto, sistemas conhecidos não visam ser capazes de realizar análise e seleção de esperma com base na morfologia celular (no nível de única célula). A classificação de morfologicamente normal e morfologicamente anormal, como células espermáticas contendo gota citoplasmática, não é um processo simples, pois ambas as espécies são bem semelhantes. Um critério plausível para diferenciar estas espécies é a massa celular total, uma vez que anormalidades possam afetar, e, especialmente, conteúdo de gota citoplasmática afetarão essa propriedade.
[012] Com isso, é um aspecto da invenção prover um sistema alternativo para classificação de células biológicas e, especialmente, células espermáticas, que, ainda, preferencialmente, evita de maneira pelo menos parcial uma ou mais das desvantagens descritas acima. Pelo menos parte do sistema pode ser compreendido em um chip. É um aspecto adicional da invenção prover um método para classificação de células espermáticas, especialmente, para realizar análise e seleção de esperma com base em uma característica da célula, especialmente, morfologia da célula (no nível de única célula) para com isso, preferencialmente, evitar de maneira pelo menos parcial uma ou mais das desvantagens descritas acima.
[013] Com isso, a invenção provê, em um primeiro aspecto, um sistema, especialmente para classificação de (a) célula(s) espermática(s) em um fluido, o sistema compreendendo (i) um canal de fluxo de fluido para transportar o dito fluido, o canal de fluxo de fluido compreendendo uma entrada, uma zona de análise configurada à jusante da dita entrada e compreendendo um primeiro par de eletrodos compreendendo uma primeira distância intra-eletrodos, uma zona de classificação configurada à jusante da dita zona de análise, e (pelo menos duas) saídas configuradas à jusante da dita zona de classificação, (ii) uma fonte elétrica configurada para prover um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos, (iii) um dispositivo de medição acoplado de maneira funcional ao primeiro par de eletrodos e configurado para medir uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido entre o primeiro par de eletrodos, e para prover dados de impedância dependentes do tempo; (iv) um dispositivo de classificação configurado para classificar células espermáticas ao direcionar uma célula espermática na zona de classificação a uma das saídas com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos.
[014] Especialmente, o sistema compreende um sistema para classificação e diferenciação de células espermáticas com base em características de célula espermática, por exemplo, morfologia de célula espermática, integridade de DNA (célula espermática), anormalidades dentro do esperma, como vacúolos, deficiência de acrossoma etc. Especialmente, o sistema compreende um sistema para realizar análise e seleção de esperma com base em (a) característica(s) de célula espermática de células espermáticas (vide adicionalmente abaixo).
[015] Nas realizações, o sistema pode permitir a diferenciação de células espermáticas tendo diferentes morfologias de célula espermática uma da outra e, especialmente, classificação de maneira sucessiva das células espermáticas diferenciadas. Especialmente, o sistema compreende um sistema para realizar análise e seleção de esperma com base em morfologia de célula espermática de células espermáticas (no nível de único sinal).
[016] Especialmente, aqui, o termo “classificação”, como em “classificação de uma célula espermática”, pode se referir à diferenciação de células espermáticas e, especialmente, classificação física de maneira sucessiva, isto é, separando uma célula espermática de outra célula espermática (especialmente, com base em uma característica da célula espermática). Especialmente, o termo “classificação de uma célula espermática” pode se referir à realização de análise e seleção de esperma com base em uma característica da célula espermática, especialmente, morfologia de célula espermática. Especialmente, o termo “classificação de uma célula espermática” pode se referir à classificação entre uma primeira célula espermática e uma célula espermática adicional, com base em uma característica, especialmente, com base em uma presença da característica ou um valor da característica.
[017] Especialmente, esse sistema permite a realização de análise e seleção de esperma com base em características da célula espermática (anormais), como morfologia de célula (anormal), especialmente, no nível de única célula. Especialmente, o sistema pode ser aplicado para detectar uma célula espermática compreendendo uma anormalidade ou característica específica, como uma morfologia de esperma anormal (célula), na zona de análise e separação da célula espermática compreendendo as anormalidades ou característica específica de um fluido compreendendo células espermáticas, especialmente, uma célula espermática em uma zona de classificação configurada à jusante da zona de análise. O sucesso da diferenciação, especialmente em relação à morfologia celular, com esse sistema pode ser de mais que 65%. Com isso, esse sistema pode ser utilizado para seleção rápida e de alta qualidade, levando a substancialmente menos descarte de células espermáticas saudáveis, morfologicamente normais, que, de outra forma, seriam retiradas para AI. Uma vantagem do sistema microfluídico é que ele pode ter a escala facilmente aumentada, como por processamento paralelo no mesmo chip. Com isso, para classificação entre uma célula espermática (morfológica) normal (especialmente, uma célula espermática compreendendo uma morfologia (célula) de esperma normal) e uma célula espermática anormal ou uma célula espermática compreendendo uma característica (determinada), o sistema pode compreender especialmente duas saídas, como uma primeira saída e uma segunda saída. Especialmente, para classificação entre uma célula espermática normal, uma célula espermática anormal e, por exemplo, outro material particulado, o sistema pode compreender pelo menos três saídas. Um material particulado que pode ser compreendido no esperma é, por exemplo, resíduos. Uma célula espermática, especialmente, é (também) um material particulado. Assim, um material particulado pode compreender uma célula espermática. Um material particulado pode compreender especialmente outro material particulado, especialmente, outro material particulado pode não compreender uma célula espermática. Então, o canal de fluxo de fluido pode compreender duas ou mais saídas para classificação de esperma e/ou outro material particulado. Especialmente, os termos “normal” e “anormal”, como em “uma célula espermática normal” e “uma célula espermática anormal”, podem se referir a uma característica (vide adicionalmente abaixo) das células espermáticas (como a ausência ou presença de uma gota citoplasmática) Especialmente, uma célula espermática anormal compreende uma anomalia.
[018] O fluido pode, em realizações, compreender, por exemplo, sêmen não diluído. De maneira alternativa ou adicional, o fluido ainda pode compreender outros líquidos. O fluido pode, por exemplo, compreender sêmen diluído. Como diluente, por exemplo, água, pode ser aplicado, opcionalmente em combinação com um ou mais sais e/ou açúcares dissolvidos, como no caso de uma Beltsville Thawing Solution. O fluido pode compreender sêmen diluído, em uma variação de, por exemplo, diluição de 10-10,000 vezes. Em realizações, a concentração de esperma no fluido é selecionada da variação de 104-5,108células ml-1. Especialmente, o fluido compreende um líquido. Especialmente, o fluido permite a movimentação da célula espermática (no fluido) através do sistema, especialmente, através do canal de fluxo de fluido. O fluido (compreendendo uma célula espermática) pode ser provido na entrada do canal de fluxo de fluido, em que o fluido pode adicionalmente fluir através do canal de fluxo de fluido na direção de uma saída disposta a jusante (durante operação normal) da entrada. A entrada é especialmente configurada para permitir que um fluido entre no canal de fluxo de fluido. A entrada pode estar em conexão fluida com outro canal de fluido. A entrada pode ainda estar em conexão fluida com um recipiente (reservatório) compreendendo o fluido. Especialmente, a entrada está em conexão fluida com os meios para fornecer o fluido (compreendendo uma célula espermática), especialmente, para prover um fluxo de fluido no canal de fluxo de fluido. A entrada pode compreender uma entrada. A entrada também pode compreender mais de uma entrada. Então, o sistema pode ainda incluir uma bomba configurada para prover um fluxo do fluido através do canal de fluxo de fluido.
[019] A zona de análise é especialmente configurada para permitir que o fluido (compreendendo uma célula espermática) flua através da zona de análise (vide também abaixo) e para analisar (detectar ou medir) uma característica do fluido compreendendo a célula espermática, ou a célula espermática per se, (fluindo) na zona de análise. O sistema pode ser provido de um sensor para detectar as características do fluido (fluindo) na zona de análise. Especialmente, o sensor compreende o dispositivo de medição aqui descrito configurado para medir uma primeira impedância (e segunda impedância). O sistema, especialmente, a zona de análise, pode compreender um (primeiro) par de eletrodos para analisar uma característica, como a impedância elétrica, do fluido (fluindo) na zona de análise. De maneira adicional ou alternativa, o sistema pode compreender um sensor óptico e/ou um sensor acústico para detectar ou analisar a característica do fluido (fluindo) na zona de análise. Com base na análise, a célula espermática (e parte do fluido) pode ser direcionada a uma saída (específica) na zona de classificação.
[020] A zona de classificação é especialmente configurada para permitir o direcionamento de uma célula espermática e/ou fluido compreendendo a célula espermática a uma saída, especialmente, para separar a célula espermática de outras células espermáticas. Especialmente, o sistema compreende um dispositivo de classificação configurado para direcionar a célula espermática na zona de classificação a uma das saídas. Consequentemente, o direcionamento de uma célula espermática a uma das saídas pode compreender o direcionamento da célula espermática no fluxo de fluido a uma das saídas. Por exemplo, o direcionamento da célula espermática por forças dieletroforéticas ou outros meios, especialmente, para direcionar material (um particulado) em um fluido. De maneira alternativa ou adicional, o direcionamento de uma célula espermática a uma das saídas pode compreender o direcionamento do fluido compreendendo a célula espermática a uma das saídas. O direcionamento do fluido (compreendendo a célula espermática) pode, por exemplo, compreender direcionamento do fluxo de fluido por meio de válvulas ou fluxos de fluido adicionais ou outros meios (hidrodinâmicos) especialmente para direcionar o fluxo de fluido (compreendendo a célula espermática). Então, o dispositivo de classificação pode compreender um dispositivo para prover forças dieletroforéticas (à célula espermática) ou outros meios para direcionar especialmente um material particulado, como uma célula espermática, em um fluido na zona de classificação. Especialmente, o sistema pode compreender eletrodos para prover forças dieletroforéticas. De maneira alternativa ou adicional, o dispositivo de classificação pode compreender um dispositivo para direcionar o fluido compreendendo a célula espermática a uma das saídas, por exemplo, por meio de válvulas ou outros meios, especialmente, para direcionar um fluxo de fluido. Especialmente, o dispositivo de classificação pode compreender uma válvula.
[021] Uma (primeira) impedância, conforme descrito aqui especialmente se refere a uma (primeira) impedância elétrica. Especialmente, a impedância, conforme aqui descrita, pode se referir à impedância elétrica absoluta. A impedância (elétrica) é especialmente a resposta do (volume de) fluido entre os eletrodos do par de eletrodos que pode ser medida quando uma diferença (potencial) de tensão (CA ou CC, especialmente, CA) for introduzida pelo (primeiro) par de eletrodos para prover uma corrente (fluindo através do fluido, especialmente, entre os eletrodos do par de eletrodos) (vide abaixo). Especialmente, um sinal elétrico é provido ao primeiro par de eletrodos (e, opcionalmente, um segundo par de eletrodos, vide abaixo). Então, a impedância elétrica é especialmente uma resposta a um sinal elétrico provido aos eletrodos do par de eletrodos. A impedância elétrica é especialmente afetada por características dielétricas do (volume de) fluido entre os eletrodos. Assim, se um fluxo de fluidos entre (os eletrodos do) o par de eletrodos, as características, como as características dielétricas, do volume que é medido entre os eletrodos podem mudar no tempo e, especialmente, a impedância medida pode mudar no tempo. Consequentemente, “medição de uma (primeira) impedância como uma função de tempo do fluido entre o (primeiro) par de eletrodos” compreende a medição do valor (ou sinal) de impedância elétrica (resposta de uma diferença de potencial pelos eletrodos) do fluido (incluindo qualquer célula espermática opcional e outro material opcional) entre os eletrodos do par de eletrodos por um período de tempo (e determinar os valores (sinal) de impedância como uma função de tempo naquele período de tempo). A impedância (elétrica) (valor/sinal) é afetada pelas características dielétricas do fluido (incluindo uma possível célula espermática ou outro material particulado). Assim, quando uma célula espermática anormal ou uma célula espermática compreendendo uma característica (específica), especialmente, uma célula espermática apresentando característica (anormal) das células, afetando as características dielétricas da célula espermática, flui entre o par de eletrodos e a impedância (elétrica) é medida ao longo do tempo, o sinal medido (impedância) pode diferir substancialmente de uma forma observada de uma célula espermática normal ou uma célula espermática não compreendendo as características (específicas) e a célula espermática anormal/célula espermática compreendendo as características (específicas) pode ser identificada.
[022] Especialmente, a identificação pode ser feita em um estágio de comparação (ou estágio de identificação). Características da célula que afetam as propriedades dielétricas de uma célula espermática, por exemplo, compreendem alterações na carga na membrana de esperma, distribuição de carga pela membrana de esperma e morfologia anormal. Especialmente, morfologia anormal, como variações de tamanho, vacúolos na cabeça, ou deficiência de acrossoma, e a presença de uma gota citoplasmática pode apresentar um efeito substancial no sinal de impedância medido quando a célula espermática anormal passar entre os eletrodos.
[023] O sistema e método descritos aqui podem ser aplicados para detectar e classificar uma célula espermática compreendendo uma característica anormal ou específica afetando as características dielétricas da célula espermática. Especialmente, o sistema e o método podem ser aplicados para detectar e classificar uma célula espermática compreendendo uma anormalidade morfológica, como uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática. O sistema também pode ser configurado para (e o método conforme aqui descrito também pode compreender) selecionar a presença de uma (outra) característica específica tendo um efeito nas características dielétricas de uma célula espermática, por exemplo, (a presença de) dimensões anormais de uma célula espermática, vacúolos anormais na célula espermática, anormalidades no acrossoma, anormalidades na carga da membrana de esperma, ou (a presença de) de outras anormalidades morfológicas. Então, especialmente o sistema da invenção pode ser configurado, e o método da invenção pode ser utilizado, para classificação de uma célula espermática com base em uma ou mais características. Especialmente, a característica pode ser selecionada do grupo consistindo em uma dimensão da célula espermática, a presença de (um determinado) vacúolo na célula espermática, um acrossoma (deficiência) (na célula espermática), uma carga de uma membrana da célula espermática (a membrana de esperma), uma distribuição de carga pela membrana do esperma, uma morfologia (uma característica morfológica) (da célula espermática), a presença de uma gota citoplasmática, e a integridade de DNA).
[024] Aqui abaixo, o sistema é descrito em mais detalhes. O sistema (e método) também pode ser utilizado para (somente) medir ou analisar o esperma. Especialmente, para analisar o esperma, o dispositivo de classificação pode não ser aplicado para classificação do esperma (separando uma célula espermática de outra célula espermática) na zona de classificação. Especialmente, para essa aplicação, não é necessária zona de classificação (e dispositivo de classificação). O sistema (e método) é explicado especialmente em mais detalhes para identificação e classificação de uma célula espermática morfologicamente anormal, especialmente, uma célula espermática compreendendo uma morfologia que difere da morfologia de outras células espermáticas.
[025] Quando uma célula espermática anormal fluir entre o par de eletrodos e a impedância for medida ao longo do tempo, o sinal medido pode diferir substancialmente daquele observado de uma célula espermática normal. Assim, uma célula espermática anormal (e, também, a célula espermática normal) pode ser identificada e diferenciada (especialmente, no estágio de comparação). Especialmente, o sistema (e o método) aqui descrito é (configurado) para identificação e diferenciação de uma célula espermática com base em uma característica da célula espermática. A célula espermática (anormal) identificada pode ser direcionada a uma das saídas pelo dispositivo de classificação, enquanto uma célula espermática normal (ou célula espermática não compreendendo características específicas) pode ser direcionada a (uma das) outra(s) saída(s). Uma saída pode compreender uma abertura para sair o canal de fluxo de fluido. Uma saída pode estar em conexão fluida com um ou mais canais de fluxo de fluido adicionais, por exemplo, para direcionar a célula espermática selecionada a um estágio de processamento ou armazenamento adicional. De maneira alternativa ou adicional, uma ou mais das saídas podem estar em conexão fluida com um recipiente, especialmente para conter (um fluido compreendendo) as células espermáticas classificadas. Em uma realização, uma das saídas é configurada como uma continuação do canal de fluxo de fluido, enquanto a(s) outra(s) saída(s) é(são) configurada(s) como uma lateral ou saída do canal de fluxo de fluido principal. Especialmente, nessa realização, um fluxo de fluido padrão pode ser provido da entrada para a saída, configurada como uma continuação do canal de fluxo de fluido e uma célula espermática identificada (e/ou qualquer outro material identificado, vide abaixo) pode ser removida do fluxo de fluido principal ao direcioná-la (a célula espermática identificada e/ou outro material) à(s) (uma das) saída(s) configurada(s) como uma saída. Em outras palavras, um eixo de canal a montante dessa saída de “continuação” e um eixo de canal a jusante dela podem ser configurados substancialmente em paralelo e substancialmente sem uma distância mútua (especialmente, de maneira substancialmente mútua um alinhado ao outro).
[026] Especialmente, em uma realização compreendendo pelo menos três saídas, o sistema ainda pode ser configurado para uma classificação adicional, por exemplo, classificação entre uma célula espermática normal, uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática distal, e uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática proximal. O dispositivo de classificação ainda pode ser configurado para direcionar a célula espermática normal, por exemplo, a uma primeira saída, e as células espermáticas anormais (compreendendo, por exemplo, uma gota citoplasmática distal e uma gota citoplasmática proximal) podem ser direcionadas a uma dentre as respectivas segunda e terceira saídas e, opcionalmente, saídas adicionais (com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos). As saídas podem ser todas configuradas substancialmente na mesma localização em relação ao eixo de canal de fluxo de fluido, por exemplo, como no caso de uma bifurcação ou uma trifurcação. Especialmente, o eixo de canal de fluxo de fluido compreende o eixo longitudinal do canal de fluxo de fluido. Especialmente, o fluido que sai das diferentes saídas pode ser direcionado em diferentes direções de fluxo. Especialmente, nessa realização, um dispositivo de classificação pode ser configurado para direcionar a célula espermática a qualquer uma das saídas. Alternativamente, mais de um dispositivo de classificação pode ser configurado para direcionar a célula espermática a uma saída específica.
[027] De maneira adicional ou alternativa, as saídas também podem ser dispostas em série. Por exemplo, para classificação dos três tipos de células espermáticas mencionados acima, pode ser vantajoso, primeiro, classificar entre células espermáticas normais e anormais e direcionar todas as células espermáticas normais a uma primeira saída e todas as anormais a uma segunda saída. A segunda saída pode ser configurada à jusante da primeira saída. A jusante da segunda saída, mas no mesmo canal que a primeira saída, uma ou mais saídas adicionais podem ser configuradas. De maneira alternativa ou adicional, essa segunda saída pode compreender uma ou mais saídas adicionais, como uma terceira saída ou adicional, configurada à jusante da segunda saída em outro canal, diferente do canal compreendendo a primeira e a segunda saída. Diferentes realizações podem ser utilizadas para direcionar de maneira sucessiva as células espermáticas normais a uma primeira saída e as anormais, por exemplo, a uma segunda saída, por exemplo, com as células espermáticas compreendendo, por exemplo, uma gota citoplasmática distal a ainda uma saída adicional (específica). Em outra realização, o dispositivo de classificação pode ser configurado para direcionar uma célula espermática normal e uma célula espermática anormal, respectivamente, a uma primeira e uma segunda saída, enquanto o material (célula não espermática compreendendo) material adicional (particulado) (como resíduos celulares) compreendido no fluido pode ser direcionado a ainda outra saída (adicional).
[028] Consequentemente, em uma realização adicional, o sistema compreende (uma primeira saída, uma segunda saída e) uma saída adicional, e o dispositivo de classificação é ainda configurado para classificar um material particulado adicional ao direcionar o material particulado adicional na zona de classificação a uma das (primeira, segunda ou adicional) saídas, especialmente com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos. Especialmente, dados de referência podem compreender dados de referência para o material particulado adicional. Esse sistema pode ser especialmente de relevância quando o fluido adicionalmente puder compreender um material particulado adicional (além das células espermáticas).
[029] Nas realizações, o dispositivo de classificação é configurado para classificar células espermáticas entre células espermáticas (morfológicas) normais e células espermáticas (morfológicas) anormais, ao direcionar a célula espermática na zona de classificação a uma das saídas com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos, em que uma célula espermática anormal é direcionada a uma das saídas pelo dispositivo de classificação e uma célula espermática normal é direcionada a outra saída.
[030] A fonte elétrica pode prover uma corrente alternante aos eletrodos. A fonte elétrica também pode prover uma corrente direta aos eletrodos. A fonte eletrônica também pode prover o sinal elétrico compreendendo ondas, como uma onda sinusoidal, uma onda de bloqueio ou uma onda triangular ou dentada. Em uma realização, a fonte elétrica é compreendida em um dispositivo elétrico classificado. Ainda, em outra realização, a fonte elétrica também pode estar compreendida no dispositivo de medição (vide abaixo). Em uma realização específica, um espectroscópio de impedância compreende o dispositivo de medição assim como a fonte elétrica. Entretanto, ainda, em outra realização, um gerador de onda elétrica compreende a fonte elétrica, e o dispositivo de medição compreende um espectroscópio de impedância.
[031] Os dados de impedância dependentes do tempo providos podem compreender diferentes representações. Os dados de impedância dependentes do tempo podem, por exemplo, em uma realização, compreender uma série de dados (como uma tabela) compreendendo os dados de medição brutos, isto é, o tempo (de medição) e o respectivo sinal de impedância medido, especialmente, a respectiva parte imaginária e real do sinal medido. Em outra realização, os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender um único valor, como o sinal de impedância máximo medido (durante a medição da impedância de um fluido compreendendo uma célula espermática) ou, por exemplo, um nível de aumento de impedância (por um período de medição específico). Em uma realização adicional, os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender uma série de dados compreendendo os valores de impedâncias medidos mínimo e máximo e os respectivos momentos de medição. Ainda, em outra realização, os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender uma representação gráfica da impedância medida versus o tempo de medição, especialmente, configurado como uma curva de medição. Ainda, em uma realização adicional, os valores de impedância medidos são transformados em dados de impedância absoluta e os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender os valores absolutos da impedância (e o respectivo tempo de medição). Especialmente, o valor absoluto dos dados de impedância medida podem ser utilizados. Especialmente, em realizações, os dados de impedância dependentes do tempo compreendem os valores absolutos do sinal de impedância medido (como uma função do tempo de medição). Ainda, em outra realização, os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender as partes reais e imaginárias dos valores de impedância medidos. De maneira alternativa ou adicional, o sinal de impedância medido pode ser corrigido em relação a derivação e/ou desvio nos dados medidos; os dados de impedância dependente de tempo podem (também) compreender dados corrigidos. Ainda, em uma realização adicional, os dados de impedância dependentes do tempo compreendem pelo menos duas das representações dadas acima (realizações). Então, o dispositivo de medição especialmente pode ser configurado para prover diferentes tipos de dados de impedância dependentes do tempo, como os dados nas realizações acima. Os dados de impedância dependentes do tempo podem, assim, incluir dados medidos originalmente assim como dados processados. Ainda, os dados de impedância dependentes do tempo podem incluir uma pluralidade de dados ou, opcionalmente, até um único valor.
[032] Quando uma célula espermática normal (ou outro material particulado) fluir entre um par de eletrodos e a impedância do fluido (compreendendo a célula espermática) entre os eletrodos for medida ao longo do tempo, os dados de impedância dependentes do tempo podem ser comparados aos dados de referência predefinidos de diferentes maneiras. Em realizações, a comparação pode compreender diferentes tipos de análise de dados matemáticos e/ou estatísticos conhecidos na técnica. Os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender os dados (sinal) de (primeira) impedância medidos (bruto) ao longo do tempo e podem, por exemplo, ser analisados e comparado diretamente aos dados de referência predefinidos. Os dados de impedância dependentes do tempo também podem, no estágio de comparação, ser transformados e/ou visualizados por técnicas conhecidas na técnica e comparados aos dados de referência predefinidos. Em uma realização, os dados podem ser armazenados em uma memória (temporária) e somente o mais alto valor é utilizado para comparar com dados de referência predefinidos. Em outra realização, os valores de impedância dependente do tempo mínimos e máximos são comparados aos dados de referência predefinidos, especialmente, a diferença entre o valor de impedância máximo e mínimo pode ser calculada (no estágio de comparação) e comparado aos valores compreendidos pelos dados de referência predefinidos. Ainda, em uma realização adicional, os dados de impedância dependentes do tempo compreendem uma curva de medição (corrigida) (dados) e os dados de referência predefinidos podem compreender uma curva de impedância de referência de uma célula espermática normal e/ou uma curva de referência (dados) de uma célula espermática anormal, e a curva de impedância de medição pode ser comparada à(s) curva(s) de impedância de referência ou os dados da(s) curva(s) de impedância de referência. De maneira alternativa ou adicional, a curva de medição também pode ser provida ao modelo de melhor ajuste dos dados medidos e comparada a um modelo matemático de uma curva de impedância de referência de uma célula espermática (morfologicamente) normal e/ou um modelo matemático da curva de referência de uma célula espermática morfologicamente anormal ou diferentes tipos de células espermáticas morfologicamente anormais ou até outro material particulado. Uma curva de medição pode ser representada por dados e por uma representação gráfica dos dados. Especialmente, em realizações, uma curva de medição pode compreender dados assim como uma representação gráfica, especialmente, em que os dados podem ser utilizados por motivos de comparação e, especialmente, a representação gráfica por motivos ilustrativos. Entretanto, em outras realizações, de maneira alternativa ou adicional, a representação gráfica pode ser utilizada por motivos de comparação (somente).
[033] A invenção também inclui realizações utilizando técnicas de comparação alternativas. Se a impedância for medida ao longo do tempo quando uma célula espermática passar entre os eletrodos, no sinal medido (impedância) (ao longo do tempo), um aumento e uma redução na impedância causados pela cabeça da célula espermática podem ser observados. O aumento e uma redução na impedância podem ser (graficamente) representados por um pico. Para uma célula espermática (morfologicamente) normal, uma cauda subsequente da célula espermática passando entre os eletrodos podem ter somente um efeito no sinal de impedância medido entre os eletrodos a um grau muito limitado. Assim, uma célula espermática morfologicamente normal pode somente apresentar de maneira substancial um aumento gradual seguido por redução gradual no sinal medido (impedância) (ao longo do tempo), em que a redução pode apresentar algum alargamento. O pico pode ser substancialmente simétrico, especialmente ao utilizar um campo elétrico homogêneo entre os eletrodos. Aqui, simétrico significa que o pico ou a curva apresentam simetria sobre um eixo, isto é, a borda dianteira do pico apresenta aproximadamente a mesma forma (mas espelhada) que a borda traseira deste pico. Ademais, diversas células espermáticas (morfologicamente) normais podem apresentar um sinal medido igual substancial (impedância). Ademais, (medições de) diferentes células espermáticas normais podem apresentar substancialmente a mesma forma da curva de medição (ao longo do tempo), especialmente quando as células espermáticas fluírem substancialmente pela mesma localização entre os eletrodos. Especialmente, o termo “curva de medição” se refere a um sinal de impedância medido como uma função de tempo.
[034] Quando uma célula espermática (morfologicamente) anormal fluir entre o par de eletrodos e a impedância é medida ao longo do tempo, o sinal medido (impedância) pode diferir substancialmente do observado da célula espermática normal. Especialmente, uma anormalidade na forma da presença de uma gota citoplasmática, por exemplo, pode apresentar substancialmente o mesmo pico na curva de medição, conforme apresentada por uma célula espermática normal. Entretanto, além do pico simétrico substancial, um (pequeno) pico adicional pode estar presente na curva de medição causado pela impedância (extra) induzida pela gota citoplasmática. Logo, a gota citoplasmática pode ser representada por um (segundo) pequeno pico identificável. A gota citoplasmática também pode ser identificada por uma assimetria ou rebordo extra na curva de medição. Especialmente, o segundo pico pode ser sobreposto ao primeiro pico e pode ser identificado por um rebordo (pico) na curva de medição. Então, o sistema e método descritos aqui permitem identificar a presença da gota citoplasmática e direcionar adicionalmente a célula espermática anormal à outra saída do canal de fluxo de fluido (diferente da qual a célula espermática normal pode ser direcionada). Especialmente, uma célula espermática anormal compreende uma característica (pré)determinada, especialmente, uma gota citoplasmática. Especialmente, o sistema e método, conforme aqui descritos, podem identificar a presença da gota citoplasmática com base em uma curva de medição assimétrica para direcionar adicionalmente a célula espermática anormal a uma das saídas. Especialmente, o sistema e método, conforme aqui descrito, pode identificar uma célula espermática normal com base em uma curva substancialmente simétrica para direcionar adicionalmente a célula espermática normal a uma das saídas, especialmente enquanto direciona outro material particulado à outra saída.
[035] Para facilitar o posicionamento das células espermáticas (entre os eletrodos), uma zona de focalização opcional pode ser configurada a montante da zona de análise. Especialmente, a zona de focalização é configurada para direcionar uma célula espermática a uma localização específica no fluxo de fluido, especialmente, em direção a um eixo central do canal de fluxo de fluido, especialmente, em direção ao eixo do canal de fluxo de fluido (na localização da zona de focalização). A focalização de células espermáticas pode ser provida por adaptações especiais no canal de fluxo, como pequenas restrições ou estreitamento do canal de fluxo. A focalização pode ser ainda provida pela aplicação de ultrassom. Entretanto, descobriu-se que as células espermáticas podem ser posicionadas de maneira vantajosa sem perder a viabilidade ao sujeitar a célula espermática a um campo elétrico não uniforme. A invenção, assim, também provê que o posicionamento de uma célula espermática dentro do canal de fluxo pode ser controlado por forças dieletroforéticas (na zona de focalização).
[036] Também, na zona de classificação, uma célula espermática pode ser direcionada de maneira vantajosa a uma saída específica provendo forças dieletroforéticas à célula espermática.
[037] Consequentemente, forças dieletroforéticas podem ser providas na zona de focalização e/ou na zona de classificação para direcionar uma célula espermática. Forças dieletroforéticas podem ser providas especialmente na zona de classificação e ainda mais especialmente na zona de focalização e na zona de classificação.
[038] Então, em uma realização, o sistema, especialmente, o dispositivo de classificação, compreende um primeiro dispositivo eletromagnético para prover um campo elétrico à zona de classificação, e o primeiro dispositivo eletromagnético é configurado para direcionar a célula espermática por uma força dieletroforética (dieletroforese) (na zona de classificação). Dessa forma, a classificação das células espermáticas pode ser executada.
[039] Em uma realização adicional, o sistema compreende um segundo dispositivo eletromagnético para prover um campo elétrico à zona de focalização. Especialmente, o segundo dispositivo eletromagnético é configurado para direcionar a célula espermática por força dieletroforética, especialmente ao eixo do canal de fluxo de fluido. Dessa forma, as células espermáticas podem ser forçadas a fluir, por exemplo, substancialmente no meio do eixo de canal de fluxo de fluido.
[040] Por exemplo, a força dieletroforética pode ser provida ao aplicar um campo elétrico na variação de MHz utilizando os microeletrodos integrados no chip. Especialmente, a focalização e classificação de célula podem ser realizadas ao aplicar uma excitação sinusoidal de 10 MHz, 6VPP pelo primeiro e/ou segundo dispositivo eletromagnético e o primeiro e/ou o segundo dispositivos eletromagnéticos são configurados para prover estas excitações. Especialmente, uma força dieletroforética pode ser provida por pelo menos dois eletrodos. Especialmente, os eletrodos podem estar em contato físico com o fluido (no canal de fluxo de fluido). Em uma realização, a força dielétrica é provida por dois eletrodos, especialmente, ao aplicar um campo elétrico de CA ou CC, especialmente, um campo elétrico de CA, entre os dois eletrodos. Especialmente, uma célula espermática ou outro material particulado pode ser direcionado na direção (ou oposta à direção) das linhas de campo do campo elétrico. Em uma realização adicional, a força dieletroforética é provida por quatro eletrodos, especialmente, um primeiro conjunto de dois eletrodos e um segundo conjunto de dois eletrodos, especialmente, em que um primeiro campo elétrico (CA ou CC) é aplicado entre o primeiro conjunto de dois eletrodos e um segundo campo elétrico (CA ou CC) é aplicado entre o segundo conjunto de dois eletrodos. Especialmente, ao dispor o primeiro conjunto de eletrodos a montante do segundo conjunto de eletrodos, uma força dielétrica pode ser provida para direcionar uma célula espermática. Especialmente, os dois eletrodos do primeiro conjunto (de eletrodos) podem ser configurados respectivamente em 0° e 180° em relação ao eixo de fluxo de fluido. Especialmente, os dois eletrodos do segundo conjunto (de eletrodos) podem ser configurados respectivamente a 90° e 270° em relação ao eixo de canal de fluxo de fluido. Os dois conjuntos de eletrodos podem ser configurados pelo menos em um plano perpendicular ao eixo de canal de fluxo de fluido. Especialmente, os dois conjuntos de eletrodos podem ser configurados em dois planos perpendiculares ao eixo de canal de fluxo de fluido, especialmente, cada conjunto em um plano perpendicular ao canal de fluxo de fluido. Especialmente, dessa forma, uma célula espermática pode ser direcionada em um plano perpendicular ao eixo de canal de fluxo de fluido. Especialmente, uma célula espermática pode ser direcionada ao eixo de canal de fluxo de fluido. Em uma realização adicional, a focalização é provida por ultrassom.
[041] Uma célula espermática (morfologicamente) normal (de um touro e/ou um javali) pode ter um tamanho da cabeça de 8-9 μm em uma primeira direção paralela a um eixo longitudinal da cabeça, e 4-5 μm em uma segunda direção perpendicular ao eixo longitudinal, e menos que 1 μm em uma terceira direção perpendicular às primeira e segunda direções, e uma cauda de 40 -45 μm. Uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática também pode ter substancialmente a mesma dimensão que a célula espermática morfologicamente normal, com a exceção de que compreende uma gota, que é normalmente posicionada em alguma parte no meio da cauda da célula espermática (uma gota citoplasmática distal) ou atrás da cabeça (uma gota citoplasmática proximal). A cabeça de uma célula espermática substancialmente não é redonda, mas pode ser relativamente plana, especialmente, na terceira direção. Com isso, também pode ser vantajoso dispor uma restrição no canal de fluxo de fluido configurada para orientar a célula espermática para ser analisada tendo a cabeça em uma direção específica. Especialmente, uma restrição pode ser configurada para girar a célula espermática ao redor de seu eixo longitudinal. Especialmente, uma zona de orientação, compreendendo essa restrição, pode ser provida no canal de fluxo de fluido a jusante da zona de focalização e a montante da zona de análise. Assim, em uma realização, o sistema ainda compreende uma zona de orientação configurada à jusante da entrada e (se presente) da zona de focalização opcional e a montante da zona de análise, em que a zona de orientação compreende pelo menos uma restrição (elemento) no canal de fluxo de fluido para orientar a célula espermática. A orientação pode compreender rotação da célula espermática ao redor de seu eixo longitudinal. De maneira adicional ou alternativa, a orientação pode compreender alinhamento (do eixo longitudinal da) da célula espermática ao eixo de canal de fluxo de fluido na localização do par de eletrodos, especialmente, em que a cabeça da célula espermática é disposta mais a jusante do que a cauda. Então, a orientação pode compreender o alinhamento de uma célula espermática ao eixo de canal de fluxo de fluido, em que a cabeça da célula espermática é disposta mais a jusante do que a cauda (da célula espermática) e, especialmente, girando a célula espermática ao redor de seu eixo para prover um ângulo substancialmente constante entre a terceira direção da cabeça da célula espermática e as linhas de campo eletromagnético (entre o par de eletrodos). Foi percebido que a orientação também pode ser provida por forças dieletroforéticas. Com isso, forças dieletroforéticas podem ser utilizadas para direcionar uma célula espermática a uma direção específica. De maneira alternativa ou adicional, forças dieletroforéticas podem ser aplicadas para direcionar a posicionar uma célula espermática a uma localização específica. Especialmente, uma zona de focalização compreendendo um dispositivo eletromagnético configurado para direcionar uma célula espermática também pode prover orientação da célula espermática. Então, a funcionalidade da zona de orientação (opcional) também pode ser compreendida na zona de focalização (opcional). Especialmente em uma realização, o segundo dispositivo eletromagnético (para direcionar uma célula espermática na zona de focalização) é adicionalmente configurado para orientar a célula espermática (na zona de focalização).
[042] O sinal de impedância medido pode ser sensível a pequenos distúrbios (ruído), presentes internamente no sistema assim como distúrbios (ruído) presentes externamente ao sistema. Por exemplo, pequenas oscilações na condutividade do fluido, no sinal elétrico provido aos eletrodos, ou oscilações de qualquer radiação eletromagnética externamente do sistema, tudo pode ter um efeito no sinal de impedância medido. Então, pode ser vantajoso prover um segundo par, ou até pares adicionais, como um terceiro, um quarto, um quinto ou até um décimo par de eletrodos (a jusante do primeiro par de eletrodos) na zona de análise e medir a impedância nas localizações sucessivas na zona de análise. Pode ser vantajoso se um par de eletrodos compreender um eletrodo principal para conectar à fonte elétrica e um eletrodo de medição para conectar ao dispositivo de medição. Entretanto, a frase “par de eletrodos” (ou “par”) não se refere somente a “dois” eletrodos. Um par de eletrodos também pode se referir a um par de eletrodos compreendendo um eletrodo principal e dois ou mais eletrodos de medição. Da mesma forma, dois pares de eletrodos podem compreender somente um eletrodo principal (mútuo) e dois eletrodos de medição. Um par de eletrodos pode ainda se referir a um ou mais eletrodos primários e um ou mais eletrodos de medição. Especialmente, um eletrodo principal pode ser compreendido por um ou mais pares de eletrodos. Especialmente, utilizando dois (ou mais) pares de eletrodos, os dados de impedância dependentes do tempo (para uma célula espermática) podem ser providos com base nos sinais de impedância medidos entre o primeiro par de eletrodos e o sinal de impedância medido entre o segundo par de eletrodos (e, se presente, também entre os pares adicionais de eletrodos). Se dois (ou mais) pares de eletrodos forem utilizados no sistema, uma célula espermática pode ser detectada múltiplas vezes e informações extras sobre a célula espermática podem ser geradas, que podem ser utilizadas para reduzir o efeito de ruído. Os sinais de impedância medidos dos dois ou mais pares de eletrodos podem, por exemplo, ser ponderados para prover os dados de impedância dependentes do tempo (utilizando diferentes marcações de tempo para corrigir o tempo necessário para fluir do primeiro par de eletrodos ao(s) par(es) sucessivo(s) de eletrodos) para remover parte do ruído e/ou para melhorar uma possível correção de linha de base (desvio). Entretanto, descobriu-se surpreendentemente que ao utilizar dois pares de eletrodos e realizar medições diferenciais, o efeito de erros sistêmicos pode ser substancialmente reduzido comparado para classificar os registros de impedância. Ao subtrair (de maneira diferencial) os sinais dos dois pares de eletrodos (em que pontos de dados medidos ao mesmo tempo no primeiro par e no segundo par de eletrodos são subtraídos um do outro), um erro sistêmico que está presente dentro da espectroscopia de impedância pode ser solucionado. Especialmente, ao subtrair (de maneira diferencial) os sinais, dados de impedância dependentes do tempo de sinal diferencial podem ser providos. Utilizando um sinal diferencial, uma célula espermática de passagem pode ser representada em uma (dados de impedância dependentes do tempo configurados como) curva de medição por um pico positivo (compreendendo valores de impedância diferencial positivos) seguido por um pico negativo (compreendendo valores de impedância diferencial negativos). A forma da curva de medição (ou qualquer outro tipo de dados de impedância dependentes do tempo com base em uma diferença entre os dados medidos do primeiro e do segundo par de eletrodos) pode, então, conter informações sobre a presença de uma anormalidade, especialmente, uma célula espermática compreendendo uma morfologia anormal, como, especialmente, uma gota citoplasmática. Uma célula espermática (morfologicamente) normal pode apresentar um pico positivo e um negativo causado pela cabeça da célula espermática na curva de medição (o sinal diferencial). Especialmente, o pico negativo pode apresentar alargamento de pico causado pela cauda da célula espermática (para uma célula espermática que trafega a cabeça, primeiro, entre os eletrodos). Entretanto, uma célula espermática compreendendo uma anormalidade morfológica, como uma gota citoplasmática, pode apresentar um rebordo adicional (ou pico adicional) entre o pico negativo e o alargamento do pico negativo do sinal diferencial (impedância). Especialmente, a subtração de maneira diferencial compreende a subtração de um (segundo) ponto de dados medido em um momento no segundo par de eletrodos de um (primeiro) ponto de dados medido no dito momento no primeiro par de eletrodos (ou vice-versa). De fato, isso pode ser feito para uma pluralidade de segundos pontos de dados e primeiros pontos de dados.
[043] Então, em uma realização específica, a invenção ainda provê o sistema, em que a zona de análise ainda compreende um segundo par de eletrodos compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos e configurado em uma distância inter-eletrodos do primeiro par de eletrodos, e em que (i) a fonte elétrica é configurada para ainda prover um sinal elétrico ao segundo par de eletrodos; e (ii) o dispositivo de medição é ainda acoplado de maneira funcional ao segundo par de eletrodos e configurado para ainda medir uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido entre o segundo par de eletrodos e configurado para prover os dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e na segunda impedância. A distância inter-eletrodos é especialmente definida como a distância mais curta entre o primeiro par de eletrodos e o segundo par de eletrodos.
[044] O primeiro par de eletrodos é especialmente configurado para estarem dois lados opostos do canal de fluxo, com o canal de fluxo entre eles. Da mesma forma, o segundo par de eletrodos é especialmente configurado para estarem em dois lados opostos do canal de fluxo, com o canal de fluxo entre eles. Especialmente, a distância entre um eletrodo de um par de eletrodos e o eixo de canal de fluxo de fluido é igual à distância entre outro eletrodo do par de eletrodos e o eixo de canal de fluxo de fluido. O primeiro par de eletrodos e o segundo (opcional) par de eletrodos são especialmente configurados para estarem sem contato físico com um fluido que flui entre os eletrodos. Os eletrodos dos pares de eletrodos compreendem material condutor elétrico, como um metal ou outro material condutor. Especialmente, os eletrodos podem compreender um ou mais metais selecionados do grupo consistindo em ferro, cobre, alumínio, ouro, prata, níquel, platina, titânio, tântalo, estanho, e ligas destes. Em uma realização, os eletrodos compreendem platina e/ou titânio. Em uma realização adicional, os eletrodos (também) compreendem tântalo e/ou titânio. De maneira alternativa ou adicional, os eletrodos podem (também) compreender grafite.
[045] Especialmente, essa realização pode ser vantajosamente combinada a uma realização em que os dados relacionados à impedância dependente de tempo têm base em uma diferença entre um valor absoluto da primeira impedância em um momento e um valor absoluto da segunda impedância no dito momento. Entretanto, em outra realização, a impedância dependente do tempo pode ter base nos valores médios dos sinais (impedância) medidos do primeiro e do segundo pares de eletrodos.
[046] Os dados de impedância dependentes do tempo com base nos dois pares de eletrodos podem compreender substancialmente os mesmos dados que os providos com somente um par de eletrodos. Ademais, os dados de impedância dependentes do tempo providos em uma realização compreendendo dois pares de eletrodos podem compreender os dados com base no primeiro par de eletrodos, dados com base no segundo par de eletrodos, e dados processados com base nos dados de medição do primeiro e do segundo par de eletrodos.
[047] Também, os dados de referência predefinidos em uma realização compreendendo dois pares de eletrodos podem compreender os mesmos dados de referência com base somente em um par de eletrodos, especialmente, os dados de impedância predefinidos com base nos dois pares de eletrodos podem compreender os dados de referência em relação ao primeiro par de eletrodos, os dados de referência em relação ao segundo par de eletrodos, e dados de referência em relação aos dados processados do primeiro e do segundo par de eletrodos. Então, ao predefinir os dados de referência com base na representação dos dados de impedância dependentes do tempo, a (método para) classificação de células espermáticas, em uma realização, compreendendo um par de eletrodos e uma realização compreendendo dois pares de eletrodos é substancialmente a mesma. Especialmente, os dados de referência podem conter informações (permissão) para classificar entre células espermáticas com base em uma característica, especialmente, para classificar entre células espermáticas morfologicamente normais e células espermáticas compreendendo uma anormalidade morfológica, como uma gota citoplasmática. Especialmente, os dados de referência também podem conter informações para classificar entre uma célula espermática e um ou mais outros materiais particulados. Então, em uma realização, os dados de referência contêm informações sobre a presença e/ou ausência de uma anormalidade morfológica. Em uma realização adicional, os dados de referência contêm informações sobre a presença e/ou ausência de uma gota citoplasmática. Em uma realização adicional, os dados de referência contêm informações sobre uma característica (adicional) de células espermáticas. Ainda, em uma realização adicional, os dados de referência contêm informações sobre um material particulado, especialmente, resíduos. Ainda, os dados de referência podem incluir informações sobre um desvio de dados de referência dentro dos quais uma espécie a ser classificada pertence a uma classe específica (como esperma normal ou esperma anormal) ou fora dos quais uma espécie a ser classificada não pertence a uma classe específica (como esperma anormal ou esperma normal). Especialmente, uma característica de uma célula espermática anormal pode diferir da característica de uma célula espermática normal (conforme é conhecido pelo técnico no assunto).
[048] Então, em uma realização, a invenção provê um sistema para classificação de uma célula espermática em um fluido, especialmente, um sistema para realizar análise e seleção de célula espermática com base em uma característica da célula espermática de células espermáticas, especialmente, com base na morfologia de célula espermática de células espermáticas, o sistema compreendendo: (i) um canal de fluxo de fluido para transportar o dito fluido, o canal de fluxo de fluido compreendendo uma entrada, uma zona de análise configurada à jusante da dita entrada e compreendendo um primeiro par de eletrodos compreendendo uma primeira distância intra-eletrodos e um segundo par de eletrodos compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos e configurado em uma distância inter-eletrodos do primeiro par de eletrodos, uma zona de classificação configurada à jusante da dita zona de análise, (pelo menos duas) saídas configuradas à jusante da dita zona de classificação e, opcionalmente, uma zona de focalização configurada à jusante da dita entrada e a montante da dita zona de análise; (ii) uma fonte elétrica configurada para prover um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos e um sinal elétrico ao segundo par de eletrodos; (iii) um dispositivo de medição acoplado de maneira funcional ao primeiro par de eletrodos e ao segundo par de eletrodos e configurado para medir uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido entre o primeiro par de eletrodos e para medir uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido entre o segundo par de eletrodos, e para prover dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e na segunda impedância; (iv) um dispositivo de classificação configurado para classificar células espermáticas ao direcionar a célula espermática na zona de classificação a uma das saídas com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos.
[049] O sistema pode ser aplicado para analisar e classificar uma célula espermática em um fluido. O sistema pode ser especialmente aplicado para analisar uma célula espermática em um fluido. Especialmente para o foco de analisar uma célula espermática em um fluido, a célula espermática pode não ter necessariamente de ser classificada. Então, a invenção também provê, em um aspecto adicional, um sistema para analisar uma célula espermática em um fluido, o sistema para analisar uma célula espermática compreendendo: (i) um canal de fluxo de fluido para transportar do dito fluido, o canal de fluxo de fluido compreendendo uma entrada, uma zona de análise configurada à jusante da dita entrada e compreendendo um primeiro par de eletrodos compreendendo uma primeira distância intra-eletrodos e (opcionalmente) um segundo par de eletrodos compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos e configurado em uma distância inter-eletrodos do primeiro par de eletrodos, (uma saída configurada à jusante da dita zona de análise), e opcionalmente uma zona de focalização configurada à jusante da dita entrada e a montante da dita zona de análise; (ii) uma fonte elétrica configurada para prover um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos e (opcionalmente) um sinal elétrico ao segundo par de eletrodos; (iii) um dispositivo de medição acoplado de maneira funcional ao primeiro par de eletrodos e (opcionalmente) ao segundo par de eletrodos e configurado para medir uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido entre o primeiro par de eletrodos e (opcionalmente) medir uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido entre o segundo par de eletrodos, e prover dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e (opcionalmente) a segunda impedância; e em que a célula espermática é analisada com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos. Especialmente, a análise pode compreender a determinação de características de células espermáticas, especialmente, a quantidade de células espermáticas morfologicamente anormais no esperma. Especialmente, o sistema (especialmente, o sistema para analisar uma célula espermática em um fluido) compreende um sistema para realizar análise de célula espermática, especialmente, com base em uma característica de uma célula espermática, especialmente morfologia de célula espermática de células espermáticas.
[050] As dimensões dos sistemas descritos aqui podem ser especialmente configuradas para transportar um fluido compreendendo uma célula espermática e posicionar a célula espermática, especialmente, no centro do canal de fluxo, especialmente, no eixo de canal de fluxo de fluido na zona de focalização.
[051] Os eletrodos, ainda, são especialmente configurados para não obstruírem o fluxo de fluido no canal de fluxo. Pode ser vantajoso incorporar os eletrodos em uma parede do canal de fluxo de fluido, ou em duas paredes nos lados opostos do eixo de canal de fluxo de fluido. Em uma realização, os eletrodos são integrados na parede do canal de fluxo (na zona de análise). Especialmente, os eletrodos são micro- eletrodos. Em uma realização adicional, uma pequena região de uma parede do canal de fluxo de fluido é removida por entalhe e substituída por um metal ou outro material eletricamente condutor configurado como um eletrodo para prover um (micro)eletrodo integrado (na parede). Em uma realização, pelo menos duas pequenas regiões da parede do canal de fluxo de fluido são removidas por entalhes e substituídas por um material condutor configurado como eletrodos para prover (micro)eletrodos integrados (na parede).
[052] Eletrodos que proveem um par de eletrodos podem ser especialmente configurados em uma distância intra- eletrodo permitindo que uma célula espermática passe. Especialmente, um eletrodo pode compreender uma largura, um comprimento, e uma altura. Aqui, a distância intra-eletrodo é a menor distância entre eletrodos de um par de eletrodos. Entretanto, uma distância intra-eletrodo grande pode ter um efeito negativo na sensibilidade da medição. Então, uma diferença intra-eletrodo, preferencialmente, está na variação de maior do que (uma vez) o tamanho da cabeça de uma célula espermática e não maior que 5 vezes o tamanho de uma cabeça de uma célula espermática. Especialmente, a distância intra- eletrodo entre um par de eletrodos está na variação de 5 - 400 μm, especialmente 5 - 20 μm. Então, em uma realização, a invenção provê o sistema, em que a primeira distância intra- eletrodos é selecionada da variação de 5 - 400 μm, especialmente, na variação de 5 - 20 μm. Em uma realização adicional, a segunda distância intra-eletrodos também é selecionada da variação de 5 - 400 μm, especialmente, na variação de 5 - 20 μm. Especialmente, em realizações compreendendo um segundo par de eletrodos, a primeira distância intra-eletrodos e a segunda distância intra-eletrodos são selecionadas para serem substancialmente as mesmas. Em uma realização, a primeira distância intra-eletrodos e a segunda distância intra-eletrodos são substancialmente as mesmas, especialmente, a primeira distância intra-eletrodos e a segunda distância intra-eletrodos são substancialmente 10 μm. Em outra realização, a primeira distância intra-eletrodos e a segunda diferença intra-eletrodo são substancialmente 20 μm. Ainda, em outra realização, a primeira distância intra- eletrodos e a segunda diferença intra-eletrodo não são as mesmas. Em uma realização específica, a parede do canal de fluxo de fluido (na zona de análise) compreende os eletrodos. Especialmente, nessa realização, a (primeira e segunda) distância intra-eletrodo pode ser igual a uma dimensão específica do canal de fluxo de fluido, como uma altura, ou uma largura ou um diâmetro do canal de fluxo de fluido.
[053] O canal de fluxo de fluido aqui descrito pode compreender uma seção transversal (do canal de fluxo de fluido e aberta para fluxo de fluido) perpendicular ao eixo de canal de fluxo de fluido e compreende uma primeira dimensão do canal de fluxo de fluido e uma segunda dimensão do canal de fluxo de fluido perpendicular à primeira dimensão.
[054] Em realizações, o canal de fluxo de fluido pode compreender uma seção transversal circular ou uma seção transversal substancialmente quadrada. Especialmente, a primeira dimensão e a segunda dimensão do canal de fluxo de fluido podem ser substancialmente as mesmas.
[055] A primeira dimensão e a segunda dimensão do canal de fluxo de fluido também podem diferir entre si e a seção transversal pode, por exemplo, compreender uma seção transversal formada retangular ou até outro tipo.
[056] Especialmente, a distância intra-eletrodo é configurada para ser substancialmente igual ou ser menor que a primeira dimensão do canal de fluxo de fluido e/ou a segunda dimensão do canal de fluxo de fluido (na localização do par de eletrodo).
[057] O canal de fluxo de fluido é especialmente configurado para transportar células espermáticas, vide anteriormente. Então, as dimensões mínimas (em seção transversal) do canal de fluxo de fluido devem permitir que uma célula espermática passe. Então, a primeira dimensão do canal de fluxo de fluido e a segunda dimensão do canal de fluxo de fluido são pelo menos selecionadas para permitir uma célula espermática no canal de fluxo de fluido. O canal de fluxo de fluido ainda pode compreender restrições ou outros meios para focalizar ou orientar uma célula espermática. Então, especialmente a primeira dimensão do canal de fluxo de fluido é selecionada da variação de 5 - 400 μm, especialmente, na variação de 5 -200 μm, especialmente 5 - 100 μm, como 10 - 20 μm. A segunda dimensão do canal de fluxo de fluido é selecionada da variação de 5 - 400 μm, especialmente, na variação de 5 - 200 μm, especialmente 5 - 100 μm, como 10 - 20 μm. Então, em uma realização, a invenção provê o sistema, em que a primeira dimensão do canal de fluxo de fluido é selecionada da variação de 5 - 400 μm e a segunda dimensão do canal de fluxo de fluido é selecionada da variação de 5 - 400 μm. Especialmente, a área de seção transversal (do canal de fluxo de fluido) é de pelo menos 100 μm2, como na variação de 100 - 10,000 μm2. As diferentes zonas (zona de análise, zona de classificação, e zona de focalização opcional, e zona de orientação) no canal de fluxo podem (todas) compreender dimensões diferentes umas das outras. Especialmente, entretanto, as dimensões (da seção transversal) de uma primeira zona no lado mais a jusante da primeira zona, podem ser substancialmente iguais às dimensões (da seção transversal) no lado mais a montante de uma segunda zona que contata a primeira zona e disposta a jusante da primeira zona. Os termos “primeira dimensão” e “segunda dimensão” especialmente se referem à altura e largura, respectivamente. O canal de fluxo de fluido teria uma seção transversal quadrada ou circular, então, a primeira dimensão e segunda dimensão seriam idênticas.
[058] Para uma pequena distância entre os pares de eletrodos, uma parte significativa de uma célula espermática, como a cabeça da célula espermática, pode estar presente entre (ou detectada por) o primeiro par de eletrodos assim como entre o segundo par de eletrodos. A medição de impedância entre o primeiro par de eletrodos pode afetar a medição de impedância entre o segundo par de eletrodos, e vice- versa. Especialmente, a distância inter-eletrodo é a menor distância entre (um eletrodo de) o primeiro par de eletrodos e (um eletrodo de) o segundo par de eletrodos (ou adicional). Especialmente, se o primeiro par de eletrodos e o segundo par de eletrodos compreenderem o mesmo eletrodo (mútuo) (contrário), a distância inter-eletrodo é a menor distância entre um eletrodo, não sendo o eletrodo mútuo, do primeiro par de eletrodos, e um eletrodo, não sendo o eletrodo mútuo, do segundo par de eletrodos (ou adicional). Grandes distâncias inter-eletrodo precisam de uma zona de análise mais extensa e pode conceder perda de informações, pois as medições podem se tornar mais sensíveis a desvio. Distâncias inter-eletrodo grandes também podem precisar de uma produção reduzida, especialmente, ao realizar medições diferenciais. Especialmente, pode ser vantajoso se os dois pares de eletrodos forem configurados em uma distância inter-eletrodo em que a medição da primeira impedância não afete a medição da segunda impedância, especialmente em que a distância entre os dois eletrodos é minimizada. Então, em uma realização, a distância inter-eletrodos é selecionada da variação de 10 - 100 μm, especialmente 15 - 60 μm, como cerca de 20 - 40 μm.
[059] O chip pode ser especialmente um chip PDMS. Portanto, o canal de fluxo de fluido pode ser compreendido por um chip (PDMS).
[060] Em um segundo aspecto, a invenção provê um método para classificação de células espermáticas, especialmente entre células espermáticas compreendendo uma característica (determinada) e células espermáticas não compreendendo a característica (determinada), especialmente, entre células espermáticas (morfológicas) normais e células espermáticas (morfológicas) anormais, em que o método para classificação de células espermáticas compreende: provisão de um fluxo de fluido compreendendo uma célula espermática a um canal de fluxo de fluido, em que o canal de fluxo de fluido compreende um primeiro par de eletrodos; opcionalmente, focalizando a célula espermática no canal de fluxo de fluido; provendo um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos e medindo uma primeira impedância (elétrica) (sinal) como uma função de tempo do fluido entre o primeiro par de eletrodos para prover dados de impedância dependentes do tempo; e classificação das células espermáticas com base na comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com os dados de referência predefinidos em um estágio de comparação. Especialmente, a classificação pode compreender separar de maneira física as células espermáticas. Especialmente, a classificação tem base em uma característica de uma célula espermática, especialmente, para determinar uma morfologia da célula espermática. Então, o método é um método ex vivo.
[061] No método, a impedância (elétrica) (sinal) é medida. Especialmente, os dados de impedância dependentes do tempo compreendem a primeira impedância como uma função de tempo. Consequentemente, as células espermáticas podem ser classificadas com base na comparação de dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos, especialmente, dados de referência predefinidos compreendendo características de uma célula espermática anormal e características de uma célula espermática normal. Especialmente, a classificação de células espermáticas (entre uma célula espermática anormal e uma normal) pode ter base na comparação (a simetria) de uma curva de medição compreendendo os dados de impedância dependentes do tempo com (a simetria de) uma curva simétrica. Especialmente, a classificação das células espermáticas pode compreender a classificação entre uma célula espermática não compreendendo uma gota citoplasmática e uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática. Então, a invenção provê um método incluindo (a) um estágio de focalização opcional, (b) um estágio de análise, (c) um estágio de comparação, e (d), opcionalmente, um estágio de classificação, em que o estágio de análise do dispositivo de sensor, conforme descrito aqui, é aplicado, especialmente, o dispositivo de sensor compreendendo o dispositivo de medição configurado para prover dados de impedância dependentes do tempo.
[062] Especialmente, o método pode compreender a utilização do sistema para classificação de uma célula espermática, conforme aqui descrito. Especialmente, o sistema para classificação de uma célula espermática pode compreender o método aqui descrito.
[063] Em uma realização, o fluido compreende células espermáticas de javali. Em outra realização, o fluido compreende células espermáticas de gado, especialmente, células espermáticas de touro. Especialmente, o fluido no método e o sistema para classificação de células espermáticas, conforme aqui descritos, compreendem células espermáticas em uma concentração de 2-103 - 2-108células/ml.
[064] A espectroscopia de impedância é conhecida na técnica para análise sem marcação de células aderentes ou células em suspensão. Esta técnica foi utilizada de maneira extensa para investigar as propriedades dielétricas de células em sistemas microfluídicos. Quando uma célula espermática for introduzida entre um par de eletrodos, as propriedades capacitiva e resistiva serão alteradas pela membrana celular (capacidade) e o citoplasma da célula (resistênciacyt), respectivamente. Um efeito significativo de uma camada dupla na impedância absoluta pode ser apresentado. Devido a uma pequena área de superfície de eletrodo, a impedância pode diminuir por uma ampla variação de frequência. Entretanto, com base nas propriedades dos eletrodos, o canal de fluxo e o fluido (compreendendo uma célula espermática), em uma frequência específica, um nível resistivo pode ser formado. Foi apresentado que, no sistema e no método, conforme aqui descritos, uma frequência de medição de 1,3 MHz é uma escolha apropriada para análise de impedância de esperma nesta configuração. Em uma realização, o método é provido, em que a medição da impedância compreende a medição da impedância em uma frequência de 1,3 MHz. Ainda, pode ser vantajoso aplicar múltiplas frequências ao mesmo tempo, especialmente, frequências que não interferem uma na outra. Então, em uma realização, o método é provido, em que a medição da impedância compreende a medição da impedância em uma frequência selecionada da variação de 10 kHz - 100 MHz. Aqui, o termo “frequência” também pode se referir a uma pluralidade de (diferentes) frequências.
[065] A célula espermática no fluxo de fluido pode ser direcionada, especialmente em direção ao centro do canal de fluxo de fluido, especialmente ao eixo de canal de fluxo de fluido. Especialmente, o direcionamento (focalização) da célula espermática no centro do canal de fluxo de fluido pode melhorar a capacidade de reprodução do método. O direcionamento de uma célula espermática pode compreender o direcionamento da célula espermática no fluxo de fluido. Também pode compreender o direcionamento do fluxo de fluido incluindo a célula espermática. Com isso, em uma realização do método, a focalização da célula espermática compreende a provisão de um fluxo de fluido adicional de um direcionamento de líquido ao canal de fluxo de fluido. Ademais, em uma realização, o sistema ainda compreende uma ou mais entradas adicionais na zona de focalização configuradas para prover a fluxo adicional de um líquido de direcionamento no canal de fluxo de fluido. A provisão de um líquido de direcionamento adicional pode vantajosamente também diluir o fluido no canal de fluxo de fluido. Especialmente, em um fluido mais diluído, as células espermáticas podem ser transportadas mais distantes (em uma direção longitudinal no canal de fluxo) umas das outras, o que pode afetar positivamente a medição. De maneira alternativa ou adicional, a célula espermática pode ser direcionada no fluido, especialmente, ao aplicar forças dieletroforéticas às células espermáticas. Então, em uma realização adicional, um campo elétrico não uniforme é provido à zona de focalização, e a focalização da célula espermática compreende a provisão de um campo elétrico não uniforme à célula espermática para direcionar a célula espermática no fluxo de fluido. Especialmente, um campo elétrico não uniforme compreende uma força dieletroforética.
[066] Especialmente, um campo elétrico não uniforme também pode ser utilizado para direcionar uma célula espermática na zona de classificação para uma das saídas do canal de fluxo de fluido. Consequentemente, em uma realização adicional do método, o direcionamento da célula espermática na zona de classificação compreende a provisão de um campo elétrico não uniforme à célula espermática para redirecionar a célula espermática na zona de classificação.
[067] Em uma realização vantajosa, o método pode compreender a medição da impedância (elétrica) (sinal) em duas localizações no canal de fluxo de fluido e utilizando o sinal das duas localizações para classificar células espermáticas. Então, em uma realização adicional, a invenção provê o método, em que o fluxo de fluido compreendendo uma célula espermática é provido ao canal de fluxo e o canal de fluxo compreende o primeiro par de eletrodos e um segundo par de eletrodos, e em que o método ainda compreende a provisão de um sinal elétrico ao segundo par de eletrodos e medição de uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido entre o segundo par de eletrodos; e provisão dos dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e na segunda impedância.
[068] Ao utilizar dois pares de eletrodos, pode ser vantajoso se os dados de impedância dependentes do tempo compreenderem um sinal diferencial (curva) (vide também acima) e para classificar com base no sinal diferencial (curva) (dados). Consequentemente, em uma realização, os dados de impedância dependentes do tempo compreendem dados de sinal diferencial (curva), em que os dados de sinal diferencial (curva) são providos ao subtrair uma segunda impedância como uma função de tempo da primeira impedância como uma função do dito (mesmo) tempo, e os dados de referência predefinidos compreendem dados de referência com base em dados de sinal diferencial (curva) de células espermáticas normais e dados de referência com base em dados de sinal diferencial (curva) de células espermáticas anormais.
[069] Descobriu-se, surpreendentemente, que ao processar sistematicamente os dados de curva de sinal diferencial, células espermáticas morfologicamente anormais, especialmente compreendendo uma gota citoplasmática, podem ser separadas de células espermáticas morfológicas normais. Descobriu-se que, especialmente, após o processamento da curva de sinal diferencial (provendo uma curva de sinal diferencial processado), uma área abaixo da curva de sinal diferencial processado de células espermáticas compreendendo uma gota citoplasmática diferiu significativamente da área abaixo da curva de sinal diferencial processado de células espermáticas normais. Conforme mencionado acima, aqui, é feita referência a uma curva de medição e uma área; conforme será entendido, também, o sinal de medição (pontos de dados) pode ser utilizado, processado e integrado por um tempo de medição específico para terminar com um valor comparável à área mencionada acima. Entretanto, para explicar a realização, uma interpretação mais gráfica é dada ao utilizar os termos curva, pico etc. A comparação da área abaixo do sinal diferencial processado (curva), conforme mencionado na realização, o método compreende as seguintes etapas: - subtração do sinal medido (valores absolutos da impedância) (pontos de dados) do segundo par de eletrodos em um determinado momento (medição) do sinal medido (valores absolutos da impedância) (pontos de dados) do primeiro par de eletrodos no mesmo momento (medição), por um período de tempo relevante (em que o período de tempo relevante é selecionado e pode ser o período de tempo no qual uma presença de uma célula espermática é medida pelo primeiro e/ou o segundo par de eletrodos) para prover dados (impedância) dependentes do tempo de sinal diferencial data (impedância versus tempo de medição) (graficamente representados por uma curva de sinal diferencial compreendendo um pico positivo e um pico negativo); - determinação de B, em que B é o valor de sinal (impedância) mínimo (ou a “altura” de pico do pico negativo) dos dados dependentes do tempo de sinal diferencial; - determinação do tempo de medição (segundo), em que o valor de impedância dependente do tempo de sinal diferencial é igual a zero (graficamente, o momento no qual o primeiro pico (positivo) termina e o segundo pico (negativo) começa) e o tempo de medição correspondente em B (o tempo de medição no mínimo do valor de impedância dependente de tempo de sinal diferencial); e calcula XB, como a diferença desses valores de tempo; - processamento dos dados dependentes do tempo de sinal diferencial ao dividir todos os valores de impedância por B, e todos os valores de tempo medidos por XB, provendo os dados de sinal diferencial processado e graficamente a curva diferencial processada; - cálculo da área sob a curva de sinal diferencial processado (do pico negativo) como o número inteiro do tempo de medição processado, em que a impedância é igual a zero (para o segundo momento) (a saber, no início do segundo pico) para o momento de medição processado em que a impedância é igual a zero para o terceiro momento (a saber, o final do segundo pico) de todos os valores de sinal de impedância diferencial processado.
[070] Especialmente, a comparação da área sob a curva de sinal diferencial processado (conforme definido acima) como dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência (conhecidos) para a área sob a curva de sinal diferencial processado para células espermáticas (morfologicamente) normais e (morfologicamente) anormais pode ter base em uma realização do método para classificação de células espermáticas.
[071] Aqui, o método compreende pelo menos (o uso de) um par de eletrodos e dados de impedância dependentes do tempo com base na medição de pelo menos uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido e análise e classificação com base nos dados de impedância dependentes do tempo. De maneira adicional ou alternativa, o método pode compreender o uso de um sensor óptico e/ou um sensor acústico para detectar uma característica do fluido (compreendendo uma célula espermática) para prover informações (adicionais) para classificar a célula espermática (utilizando meios ópticos e/ou acústicos). Termos como “sensor” e “dispositivo” também podem se referir a uma pluralidade de sensores ou dispositivos, respectivamente.
[072] Em outro aspecto, a invenção também provê um método para analisar uma célula espermática em um fluido, o método compreendendo: (i) provisão de um fluxo de fluido compreendendo a célula espermática a um canal de fluxo de fluido, em que o canal de fluxo de fluido compreende um primeiro par de eletrodos e opcionalmente um segundo par de eletrodos; (ii) provisão de um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos e opcionalmente ao segundo par de eletrodos e medição de uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido (fluindo) entre o primeiro par de eletrodos e opcionalmente uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido (fluindo) entre o segundo par de eletrodos para prover dados de impedância dependentes do tempo; e (iii) comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos em um estágio de comparação.
[073] Em outro aspecto da invenção, o método, conforme aqui descrito, é utilizado para melhorar a viabilidade do esperma, especialmente em que os dados de referência contêm informações sobre a presença e/ou ausência de uma gota citoplasmática. Especialmente, o método pode ser utilizado para melhorar a viabilidade de esperma de animais de fazenda, especialmente, esperma de porcos (javalis) e esperma de gado (touros). Em realizações adicionais, uma ou mais (outras) características das células espermáticas são utilizadas para melhorar a viabilidade do esperma. Especialmente, os dados de referência podem conter informações sobre uma ou mais (outras) características.
[074] Consequentemente, em outro aspecto, a invenção também provê esperma purificado de gado (e porco) tendo menos que 10% de células espermáticas com gota citoplasmática em relação ao número total de células espermáticas, especialmente, esperma purificado de gado (e porco) capaz de obtenção pelo método aqui descrito.
[075] As realizações da invenção serão, agora, descritas somente a título de exemplo, com referência aos desenhos esquemáticos anexos nos quais símbolos de referência correspondentes indicam partes correspondentes, e nos quais:
[076] As Figuras 1a-1b retratam esquematicamente o sistema para classificação de uma célula espermática;
[077] A Figura 2 retrata esquematicamente outras realizações do sistema;
[078] As Figuras 3a-b retratam esquematicamente alguns aspectos do método para classificação de células espermáticas;
[079] A Figura 4 retrata esquematicamente uma curva de sinal diferencial;
[080] A Figura 5 retrata esquematicamente um modelo de circuito elétrico de uma realização da zona de análise sistema compreendendo dois pares de eletrodos.
[081] Símbolos de referência correspondentes utilizados na descrição e nas figuras indicam as mesmas partes ou correspondentes. Os desenhos esquemáticos não são necessariamente desenhos em escala.
[082] O método e o sistema da invenção, conforme aqui descritos, têm base especialmente em diversas funções que podem ser vantajosamente combinadas em diferentes realizações. A função principal, especialmente, compreende um sistema e um método para analisar uma característica de uma célula espermática fluindo em um canal de fluido, especialmente, analisar a célula espermática em relação a anormalidades. Especialmente, a análise compreende analisar as medições de impedância realizadas com eletrodos providos no canal de fluxo em uma zona de análise, em que a impedância de um fluido fluindo compreendendo a célula espermática ao longo do tempo é utilizada para prover dados de impedância dependentes do tempo, por exemplo, compreendendo (uma forma de) uma curva de medição de impedância. Os dados de impedância dependentes do tempo podem ser providos utilizando um par de eletrodos assim como utilizando dois pares de eletrodos ou utilizando pares adicionais de eletrodos. Aqui, uma forma de uma curva de medição de impedância pode indicar propriedades morfológicas (ou outras características) da célula individual passando pelos eletrodos ou pode indicar outro material (particulado) que passa pelos eletrodos. Especialmente, essa funcionalidade pode ser combinada a uma segunda funcionalidade, isto é, uma classificação para redirecionar uma célula espermática (anormal) a jusante da zona de análise, quando um parâmetro específico (característica) dessa célula espermática, como uma anormalidade (morfológica), for identificado. Entretanto, o sistema e método também podem ser utilizados para analisar (ou identificar) somente, sem realizar uma ação de classificação ou separação. Uma terceira funcionalidade compreende focalização, em que uma célula espermática fluindo no canal de fluxo pode ser direcionada a uma localização específica no canal de fluido, especialmente, para padronizar substancialmente a localização da célula espermática quando entrar/estiver presente na zona de análise. Essa focalização pode, por exemplo, compreender ultrassom, dieletroforese, ou o uso de diferentes fluxos de líquido (focalização hidro-dinâmica).O sistema e o método podem ser utilizados, por exemplo, para identificar a presença e/ou ausência de células espermáticas compreendendo uma gota citoplasmática em que o método é utilizado para melhorar a viabilidade do esperma. A utilização do sistema e/ou do método descritos aqui pode prover esperma purificado (gado ou porco) tendo menos que 10% de células espermáticas com gota citoplasmática em relação ao número total de células espermáticas.
[083] A Figura 1a retrata esquematicamente uma realização do sistema 1 para classificação de uma célula espermática 6 em um fluido 5, de acordo com a invenção. O sistema 1 compreendendo um canal de fluxo de fluido 2 com uma primeira dimensão 61 do canal de fluxo perpendicular ao eixo de canal de fluxo 63 para transportar o fluido 5, em que o canal de fluxo de fluido 2 compreende uma entrada 10, uma zona de análise 40 a jusante da entrada 10, uma zona de classificação 50 a jusante da zona de análise 40, e saídas 80, 90, 100, ... configuradas à jusante da zona de classificação 50. O sistema compreende pelo menos duas saídas 80, 90 (algumas vezes, também mencionadas aqui por uma primeira saída e uma segunda saída), especialmente, para classificar entre uma célula espermática normal 6a e uma célula espermática anormal 6b (por exemplo, compreendendo uma gota citoplasmática). O sistema também pode compreender vantajosamente pelo menos uma saída adicional 100, retratada com linhas tracejadas na Figura 1a. Uma terceira saída 100 pode, por exemplo, ser utilizada para um material particulado adicional 8, como para resíduos serem direcionados a ela. O direcionamento de um material particulado adicional a uma saída adicional 100 pode ter base em uma comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com os dados de referência predefinidos. Os dados de referência predefinidos podem ter base em dados para o material particulado adicional 8. Os dados de referência predefinidos também podem ter base em dados para células espermáticas 6. Especialmente, para essa comparação, os dados de impedância dependentes do tempo podem compreender a comparação dos dados aos dados de referência para células espermáticas e determinação da ausência de células espermáticas. O sistema 1 retratado também compreende uma zona de focalização opcional 20 a jusante da entrada 10 e a montante da zona de análise 40 e, também, uma zona de orientação opcional 30 para orientar a célula espermática 6, entre a zona de focalização (opcional) 20 e a zona de análise 40, em que uma célula espermática 6 pode ser orientada, por pelo menos um elemento de restrição 31, conforme retratado na realização. Em outras realizações, a zona de orientação 30 pode compreender outros elementos para orientar a célula espermática 6. Ainda, em realizações adicionais, a focalização e orientação podem ser providas em combinação em uma zona, por exemplo, se a focalização for provida por forças dieletroforéticas (vide abaixo). As realizações do sistema 1 podem compreender um par de eletrodos 41 ou dois pares de eletrodos 41, 42, respectivamente, ou ainda mais (pares de) eletrodos, em que um par de eletrodos pode compreender exatamente dois eletrodos, mas também mais que dois eletrodos, especialmente, compreendendo um eletrodo principal e pelo menos um eletrodo de medição. Nas realizações compreendendo mais de um par de eletrodos, também o eletrodo principal de um par de eletrodos pode ser compreendido em mais de um par de eletrodos. Em uma realização compreendendo um primeiro par de eletrodos 41 e um segundo par de eletrodos 42, por exemplo, o primeiro par de eletrodos pode compreender um eletrodo principal e um eletrodo de medição, e o segundo par de eletrodos pode compreender o mesmo eletrodo principal e outro eletrodo de medição. A realização retratada na Figura 1a compreende dois pares de eletrodos 41 e 42 no canal de fluxo 2, ambos, compreendendo respectivamente um eletrodo principal 41a, 42a e um eletrodo de medição 41b, 42b. O primeiro par de eletrodos 41 compreende a primeira distância intra-eletrodos d1 (entre o eletrodo principal 41a e o de medição 41b) e um segundo par de eletrodo 42 compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos d2, em que os dois pares de eletrodos são configurados em uma distância inter-eletrodos D12 (sendo a menor distância entre os eletrodos 41a e 42a, assim como a menor distância entre os eletrodos 41b e 42b) distante um do outro. Especialmente, a primeira distância intra-eletrodos d1 pode ser substancialmente igual à segunda distância intra- eletrodos d2. Especialmente se os eletrodos forem configurados na parede do canal de fluxo de fluido, a (primeira e segunda) distância intra-eletrodo d1, d2 também pode ser igual à primeira dimensão 61 do canal de fluxo de fluido 2 e/ou à segunda dimensão 62 do canal de fluxo de fluido 2.
[084] Em uma realização específica (não apresentada, entretanto, que pode ser explicada com a realização retratada na Figura 1a), o primeiro par de eletrodos 41 e o segundo par de eletrodos 42 podem compreender um eletrodo mútuo. Por exemplo, o primeiro par de eletrodos compreenderia um primeiro eletrodo 41a do primeiro par de eletrodos 41 sendo o eletrodo mútuo e um segundo eletrodo 41b do primeiro par de eletrodos 41 e o segundo par de eletrodos 42 compreenderia um primeiro eletrodo do segundo par de eletrodos 42 sendo o eletrodo mútuo 41a e um segundo eletrodo 42b do segundo par de eletrodos 42. Nessa realização, a distância inter-eletrodo D12 é definida como a menor distância entre os eletrodos dos dois pares de eletrodos, não sendo o eletrodo mútuo, especialmente, neste exemplo, sendo a distância entre 41b e 42b.
[085] Para realizar medições de impedância, uma fonte elétrica 140 é conectada ao(s) eletrodo(s) (41 isoladamente ou) 41,42 para prover um sinal elétrico a um dos eletrodos 41a, 42a de um par de eletrodos 41,42 (em realizações, pelo menos ao primeiro par de eletrodos 41, mas, em outras realizações - como na Figura 1a - também, ao segundo par de eletrodos 42). Também, um dispositivo de medição 150 é acoplado de maneira funcional aos eletrodos (41 ou) 41, 42 que são providos do sinal elétrico para medir uma impedância como uma função de tempo do fluido 5 (opcionalmente compreendendo a célula espermática 6) entre o par de eletrodos (dependendo do número de pares de eletrodos (41 ou) 41, 42 para medir uma primeira impedância como uma função de tempo ou uma primeira impedância como uma função de tempo e uma segunda impedância como uma função de tempo) para prover dados de impedância dependentes do tempo. Ao utilizar somente o primeiro par de eletrodos 41, os dados de impedância dependentes do tempo têm base na impedância medida como uma função de tempo entre o primeiro par de eletrodos 41, enquanto os dados de impedância dependentes do tempo têm base na impedância medida como uma função de tempo entre o primeiro par de eletrodos 41 e a impedância medida como uma função de tempo entre o segundo par de eletrodos 42 quando o sistema compreender dois pares de eletrodos 41, 42.
[086] Termos como “saídas 80,90,...” e “saídas 80,90,100...”, especialmente, indicam pelo menos duas saídas, embora sejam possíveis mais, e pelo menos três saídas, embora sejam possíveis mais, respectivamente.
[087] O dispositivo de classificação 51 é especialmente configurado para classificar células espermáticas 6 ao direcionar a célula espermática 6 na zona de classificação 50 a uma das saídas 80, 90, 100. ... com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos. Utilizando a realização dada na Figura 1a, a classificação pode, por exemplo, ser feita ao comparar os dados de impedância dependentes do tempo (com base na primeira impedância como uma função de tempo e uma segunda impedância como uma função de tempo) aos dados de referência (também com base nos dados de referência dos dois pares de eletrodos) para classificar células espermáticas 6. A classificação na zona de classificação 50 pode ser provida de diferentes maneiras pelo dispositivo de classificação 51. Em uma realização, o dispositivo de classificação compreende uma válvula, e a classificação pode ser provida pela válvula que controla o fluxo a uma das saídas 80, 90 (ou a uma dentre a uma ou mais saídas adicionais opcionais 100). A classificação também pode compreender classificação dieletroforética, onde um campo elétrico externo é aplicado diretamente à célula espermática 6 no fluxo de fluido 5. Na realização retratada na Figura 1a, a classificação é provida por um campo elétrico provido pelo primeiro dispositivo eletromagnético 52, em que as células espermáticas 6 são direcionadas por força dieletroforética. A classificação tem base na comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência. Especialmente, os dados de referência podem compreender informações sobre células espermáticas morfológicas normais morfológicas anormais 6, incluindo informações sobre células espermáticas 6 compreendendo uma gota citoplasmática, para classificar células espermáticas (morfológicas) normais 6a de células espermáticas (morfológicas) anormais 6b ao comparar os dados de referência com os dados de impedância dependentes do tempo na zona de comparação 50 no estágio de comparação.
[088] Preferencialmente, células espermáticas 6 (passando sequencialmente) são, todas, localizadas substancialmente na mesma localização no momento em que entram na zona de análise 40. Para permitir o posicionamento (focalização), especialmente, no eixo de canal de fluxo de fluido 63, as células espermáticas 6 na zona de focalização 20 são especialmente direcionadas por um dispositivo de focalização 21 ao eixo de canal de fluxo de fluido 63. A funcionalidade de focalização pode ser provida por forças dieletroforéticas providas por um segundo dispositivo eletromagnético 22, conforme é retratado na Figura 1a. Entretanto, a focalização também pode ser realizada por meio de hidrofocalização, em que o sistema 1 compreende pelo menos uma entrada adicional configurada para prover um fluxo de fluido adicional de um material de suporte ao canal de fluxo de fluido 2 na zona de focalização 20 e o fluido compreendendo as células espermáticas 6 é envolvido pelo material de suporte, em que o fluido compreendendo a célula espermática 6 é direcionado ao centro do canal de fluxo de fluido 2 (não apresentado na figura).
[089] A Figura 1b retrata (uma vista de cima de) uma parte de uma realização do sistema 1, em que o canal de fluxo de fluido 2 é girado por 90° pelo eixo de canal de fluxo de fluido 63 em relação ao sistema 1 retratado (em uma vista lateral) na Figura 1a. Esta realização compreende somente um primeiro par de eletrodos 41, do qual somente um eletrodo 41a é visível, conectado a um dispositivo eletrônico 140 e um dispositivo de medição 150 (para fins ilustrativos, a conexão é retratada embora o dispositivo de medição, de fato, seja conectado ao eletrodo de medição 41b que não é apresentado nesta figura). O canal de fluxo 2 ainda compreende uma entrada 10, uma zona de análise 40 e uma zona de classificação 50. As saídas 80, 90 (e 100) não são apresentadas na figura. A segunda dimensão do canal de fluxo perpendicular ao eixo de canal de fluxo de fluido e à primeira dimensão 61 (não visível) é retratada esquematicamente por referência 62.
[090] A Figura 2 retrata esquematicamente alguns aspectos adicionais das realizações do sistema 1 para classificação de uma célula espermática 6. Na Figura 2, uma realização compreendendo um canal de fluxo de fluido 2 configurado em (no) um chip 1000 é retratada. Um fluxo de fluido compreendendo células espermáticas 6 pode ser provido por um dispositivo de bombeamento 200. O canal de fluxo 2 compreende dois pares de eletrodos 41, 42 para analisar a célula espermática 6 e dois dispositivos eletromagnéticos 22, 52, também retratados esquematicamente, como eletrodos, embora os dispositivos eletromagnéticos 22, 52 possam compreender mais de um eletrodo, especialmente, para prover um campo elétrico heterogêneo. Nesta realização, o sinal elétrico é provido de um eletrodo principal 41a, 42a dos pares de eletrodos 41, 42 por (uma fonte elétrica 140) um espectroscópio de impedância 140, em que um primeiro canal de saída 142 é conectado aos eletrodos principais 41a e 42a. O espectroscópio de impedância 140 também funciona como o dispositivo de medição 150, ao que os eletrodos de medição 41b, 42b, dos pares de eletrodos 41, 42 são conectados a um primeiro canal de entrada 151 e um segundo canal de entrada 152 do dispositivo de medição 150. Nesta realização, o mesmo sinal elétrico é provido aos eletrodos principais 41a e 42a do primeiro par de eletrodos 41 e do segundo par de eletrodos 42. Outras realizações podem compreender somente um eletrodo principal 41a sendo compreendido no primeiro par de eletrodos 41 e no segundo par de eletrodos 42. Especialmente, os dois sinais de medição dos dois eletrodos 41b e 42b, nesta realização, são, ambos, classificadamente amplificados com um pré-amplificador 155. Para medições no estado diferencial, os dados de impedância absoluta do segundo par de eletrodos 42 são subtraídos do sinal do primeiro par de eletrodos 41 antes da detecção e armazenamento de pico. Um sistema de controle opcional 300 também é retratado, em que o sistema de controle pode controlar o dispositivo de bombeamento 200 e, se relevante, o dispositivo de classificação (por meio de uma fonte elétrica 140) e um dispositivo de focalização 21 (não retratado). O sistema de controle 300 também pode ser aplicado para processar o sinal medido e o sistema de controle 300 também pode compreender opções para apresentar graficamente a análise. Na figura, também, as realizações do dispositivo de focalização 21 e o dispositivo de classificação 51 são retratadas. Especialmente, o dispositivo de focalização é configurado como um segundo dispositivo eletromagnético 22, em que a funcionalidade de focalização em uma célula espermática 6 (não apresentada) é provida por um campo elétrico provido pelo segundo dispositivo eletromagnético 22 que é conectado a um gerador de forma de onda 120. O dispositivo de classificação 51 é configurado como um primeiro dispositivo eletromagnético 52, em que uma célula espermática 6 pode ser direcionada a uma das saídas 80, 90 (a um primeiro recipiente 85 ou a um segundo recipiente 95) com base na identificação na zona de análise por meio de um campo elétrico provido pelo primeiro dispositivo eletromagnético 52 que é conectado ao segundo canal de saída 141 da fonte eletrônica 140. Especialmente, o dispositivo de classificação pode ser disposto no canal de fluxo de fluido 2, como retratado na Figura 1a. Em uma realização específica, o dispositivo de classificação, especialmente compreendendo o primeiro dispositivo eletromagnético 52 é configurado fora do canal de fluxo de fluido 2. Especialmente, também, o dispositivo de focalização 21 pode ser disposto no canal de fluxo de fluido 2. Em uma realização específica, o dispositivo de focalização 21, especialmente compreendendo o segundo dispositivo eletromagnético 22 é configurado fora do canal de fluxo de fluido 2.
[091] Na Figura 2, é retratado esquematicamente um sistema utilizando dois pares de eletrodos 41, 42 e explicado acima para medição em um estado diferencial. O sistema 1, entretanto, também pode ser utilizado, aplicando somente o primeiro par de eletrodos 41 (e desconexão do segundo par de eletrodos 42) (da mesma forma, uma realização do sistema 1 compreendendo somente o primeiro conjunto de eletrodos 41 pode ser aplicada) e medição em um estado não diferencial. Especialmente, para isso, uma medição de 4 pontos pode ser realizada, em que o primeiro eletrodo 41a do primeiro par de eletrodos é conectado ao primeiro canal de saída 142 e ao segundo canal de entrada 152, enquanto o segundo eletrodo 41b do primeiro par de eletrodos é conectado diretamente ao segundo canal de entrada 142 e, ao mesmo tempo, o segundo eletrodo 41b do primeiro par de eletrodos é conectado por meio do pré- amplificador 155 ao primeiro canal de entrada 151 do dispositivo de medição 150. Essa configuração permite medir a tensão de maneira diferencial no segundo canal de entrada 152 ao conectar o primeiro e o segundo eletrodos ao segundo canal de entrada 152 e medir a corrente amplificada ao conectar o primeiro eletrodo 41a ao primeiro canal de saída 142 e o segundo eletrodo 41b ao primeiro canal de entrada 151 (por meio do pré-amplificador 155). Todas as outras conexões podem ser mantidas, conforme descrito acima. De fato, uma medição não diferencial também pode ser realizada por uma medição de 2 pontos, em que (somente) a corrente entre os eletrodos 41a, 41b de um par de eletrodos 41 é medida e a tensão é ajustada (ao conectar o canal de saída 142 ao eletrodo principal 41a, e o canal de entrada 151 por meio do pré-amplificador 155 ao eletrodo de medição 41b).
[092] Nas Figuras 3a e 3b, alguns exemplos típicos (representados graficamente) são retratados para uma curva de medição de uma célula espermática normal (Figura 3a) e uma célula espermática compreendendo uma gota citoplasmática (Figura 3b). Nas figuras, dados de medição diferencial são geralmente retratados, apresentando um primeiro pico positivo A e um segundo pico negativo B. Especialmente, a gota pode ser identificada devido a prover um rebordo extra D nos picos, graficamente, mais pronunciado no segundo pico (negativo) B.
[093] A Figura 4 apresenta uma realização para analisar os dados de impedância dependentes do tempo, especialmente, aqui, também providos (representação gráfica de) pelos dados de curva de sinal diferencial, apresentando um primeiro pico positivo A e um segundo pico negativo B. A classificação das células espermáticas 6 pode ter base na área sob a curva de medição processada, especialmente, abaixo do pico negativo B ao comparar a dita área com os dados de referência da área sob a curva (processada) para células espermáticas morfológicas normais e células espermáticas morfológicas anormais. A área sob a curva processada pode ser provida, primeiro, ao normalizar a curva de medição com base na altura do pico YBe a largura do pico XB. Especialmente, após normalizar a curva, uma diferença significativa foi descoberta para uma área sob a curva de medição processada causada por uma célula espermática anormal 6 (compreendendo a gota citoplasmática) e uma área sob a curva de medição processada causada por uma célula espermática normal 6.
[094] A Figura 5 retrata esquematicamente um Modelo de circuito elétrico (ECM) de uma realização da zona de análise 40 compreendendo dois pares de eletrodos para análise de impedância diferencial. Sem uma célula 6 entre o par de eletrodos 41, 42 (retratada no segundo par de eletrodos 42), o sistema 1 é descrito por uma interface de eletrodo-eletrólito (camada dupla) (Cdl), eletrólito (compreendendo uma resistência Rel e uma capacidade Cel) do fluido 5, os efeitos parasíticos dos microeletrodos (Cpar) e a resistência de fio (Rw). Uma célula espermática 6 passando adiciona uma capacitância de membrana celular (Cmem) e resistência de citoplasma (Rcyto) ao ECM, considerando ECM simplificado de Foster e Schwan para um esferóide de proteção única em suspensão (retratado no primeiro eletrodo 41).
[095] Chips microfluídicos foram fabricados utilizando técnicas de gravação à água de fotolitografia de rotina, jateamento e vinculação. Após a limpeza, dois discos tipo wafer de vidro borofloat (BF33, 100 mm de diâmetro, 500 e 1100 μm de espessura), microeletrodos foram fabricados após deposição de resistência, exposição e desenvolvimento, gravação à água BHF, deposição de camadas de titânio/platina (espessura de camada de 30 e 120 nm, respectivamente) e elevação de resistência. Subsequentemente, insertos para conexões fluídicas e elétricas foram jateadas a pó através de ambos os discos tipo wafer (tamanho de partícula 30μm). Após a limpeza dos discos tipo wafer utilizando ultrassom e HNO3, uma camada de chapa (20 μm, PerMX3020, Dupont) foi laminada nos discos tipo wafer de 500 μm a 80 °C. Após laminação, os discos tipo wafer foram pré-cozidos (5 min a 50 °C, 5 min a 65 °C e 10 min a 85 °C) para melhorar a adesão da chapa ao vidro. A exposição foi realizada utilizando uma fonte de UV de 12mW/cm2. Subsequentemente, um cozimento pós-exposição foi realizado (5 min a 50 °C, 5 min a 65 °C e 10 min a 85 °C). A camada de polímero foi desenvolvida utilizando um revestidor por giro. Após alinhamento dos discos tipo wafer de 500 μm em relação aos discos tipo wafer de 1100 μm utilizando uma fixação de vinculação, eles foram vinculados utilizando um fixador anódico. Subsequentemente, a pilha de discos tipo wafer foi cozida para endurecer em uma prensa aquecida. Após corte em cubos, os chips estavam prontos para uso. Dois projetos de chip diferentes foram utilizados nos experimentos descritos. Para a análise elétrica da morfologia de esperma, medições de impedância diferencial foram realizadas em um canal de 20 μm de altura e 20 μm de largura contendo dois pares de eletrodos com uma largura de eletrodo de 10 μm e uma classificação de 20 ou 40 μm. Experimentos de classificação de célula com base em impedância foram realizados em um canal de 20 μm de altura e 100 μm de largura utilizando um único par de eletrodos com uma largura de 20 ou 50 μm.
[096] Sêmen de javali fresco foi obtido de um centro de inseminação artificial local em uma concentração de 20 x 106células ml-1. As amostras foram diluídas com Beltsville Thawing Solution (BTS) a uma concentração de 5 x 106células ml-1. Antes de cada experimento, o canal microfluídico foi revestido com poli(L-lisina)-enxertada-poli(etileno glicol) (PLL-g-PEG) para impedir adesão celular. PLL-g-PEG foi enxaguada pelo canal em uma concentração de 100 μg ml-1 em água DI por pelo menos 15 min. em uma taxa de fluxo de 0,5-1 μl/min utilizando uma bomba de seringa. Solução BTS foi enxaguada por pelo menos 15 min. em uma vazão de 0,5-1 μl/min para remover a solução de revestimento restante. Subsequentemente, solução de esperma foi fluída através do canal em uma vazão de 0,5-1 μl/min. Mediante a visualização no canal microfluídico, a vazão foi alterada para 0,013 - 0,75 μl/min antes da aquisição de impedância.
[097] A impedância foi registrada utilizando um espectroscópio de impedância Zurich HF2IS equipado com um pré- amplificador HF2TA (também retratado na Figura 2). Dois modos diferentes de operação foram utilizados nos experimentos. No estado diferencial, um sinal de CA com uma amplitude de 0,5 V foi gerado na saída 1 e aplicado ao par de eletrodos diferencial dos dispositivos em teste (DUT). Os dois eletrodos correspondentes do par de eletrodos diferencial foram conectados à entrada 1 e entrada 2 do espectroscópio de impedância por meio de dois canais de amplificação de corrente classificada do pré-amp. HF2TA. No estado não diferencial, uma medição de 4 pontos foi realizada. A corrente foi amplificada utilizando o canal 1 do amplificador de corrente HF2TA à entrada 1 do espectroscópio de impedância. A tensão foi medida de maneira diferencial na entrada 2. Em ambos os estados, a impedância foi registrada utilizando uma excitação sinusoidal de 1 MHz com uma amplitude de 0,5 V, uma largura de banda de 200 Hz e uma frequência de amostra de 3598 Hz, a menos que mencionado de outra forma. Os dados de impedância registrados foram importados e processados em Matlab (R2013a, Math Works). Para medições no estado diferencial, os dados de impedância absoluta da entrada 2 foram subtraídos do sinal 1 antes da detecção e armazenamento de pico. No estado não diferencial, desvio e compensação foram removidos ao utilizar um filtro de média em movimento. Subsequentemente, picos foram detectados e classificados.
[098] A orientação e localização da célula espermática dentro dos microcanais foram processadas utilizando dieletroforese (DEP). A focalização celular foi realizada ao aplicar uma excitação sinusoidal 10 MHz, 6VPp nos eletrodos de focalização (Agilent X) a menos que mencionado de outra forma. De maneira semelhante, a classificação celular por excitação idêntica utilizando saída Aux1 do espectroscópio de impedância.
[099] Rastreamento de esperma foi realizado utilizando a função de “rastreamento de múltiplos objetos com base em movimento” das ferramentas de sistema de computador vision em Matlab. Essa função processa cada estrutura uma a uma e detecta objetos por comparação a uma base estática. Estes objetos são rastreados ao longo do tempo e atribuídos a trajetórias de objeto. Essa função prontamente disponível em Matlab foi adaptada para permitir armazenamento de dados de tempo, localização e tamanhos dos objetos. Para investigar o efeito da localização e tamanho de esperma na impedância, esses dados foram combinados aos dados de impedância adquiridos.
[100] A classificação de células espermáticas utilizando DEP com base em dados de impedância requer um sistema de controle que combina ambas as técnicas. Além disso, esse sistema deve permitir controle pela bomba de seringa e a aquisição de dados ópticos para fins de verificação. Felizmente, acionadores de instrumento virtual (VI) estão disponíveis para todos os equipamentos envolvidos. Esses acionadores cuidam da comunicação de baixo nível entre o computador (LabVIEW) e os instrumentos, e contêm funções de alto nível para controlá-los. Na inicialização de programa de controle LabVIEW, o espectroscópio de impedância, bomba e câmera são inicializados quando selecionados na interface de usuário. Após a configuração dos instrumentos e iniciação do experimento, os dados experimentais (vídeo e impedância) e relatos de instrumento são salvos automaticamente. Uma vez que o vídeo e medições de impedância são marcados de tempo dentro do programa, os arquivos de dados correspondentes são sincronizados. No modo de classificação, o programa de controle monitora a impedância ao longo do tempo. Mediante a passagem da partícula ou célula, há uma alteração na impedância.
[101] A resposta elétrica da configuração microfluídica foi investigada ao construir um modelo numérico do circuito em Matlab. Este modelo é bem descrito na literatura e tem base no modelo de circuito elétrico (ECM) simplificado de Foster e Schwan para um esferóide de proteção única na suspensão. Nas simulações, uma configuração de eletrodo paralela foi modelada sem impressão de campo nas bordas do eletrodo. Além disso, células espermáticas foram modeladas como esferóides com volume celular igual (1,21x10-15 m3).
[102] A espectroscopia de impedância é uma ferramenta comumente utilizada para análise livre de marcação de células aderentes ou células em suspensão. Esta técnica foi utilizada extensivamente para investigar as propriedades dielétricas de células em sistemas microfluídicos. A construção de um modelo de circuito elétrico (ECM) é uma maneira simples de obter conhecimento da resposta elétrica da configuração microfluídica (figura 5). As propriedades capacitivas da configuração de microeletrodo são predominantemente determinadas pela interface de eletrodo/eletrólito (Cdl), o eletrólito (Cel) e os efeitos parasíticos dos microeletrodos (Cpar). A resposta resistiva é influenciada pelos fios de condução (Rw) e a condutividade do eletrólito (Rel). Quando uma célula espermática for introduzida entre os microeletrodos, as propriedades capacitiva e resistiva serão alteradas pela membrana celular (Cmem) e o citoplasma da célula (Rcyt), respectivamente. A simulação apresentou um grande efeito da camada dupla na impedância absoluta. Devido a uma pequena área de superfície de eletrodo e uma pequena Cdl de maneira correspondente, a impedância diminuiu continuamente por uma ampla variação de frequência. Em uma frequência de aproximadamente 1,3 MHz, um nível resistivo foi formado. Uma varredura de frequência da configuração de eletrodo apresentou comportamento semelhante comparado à simulação, indicando que uma frequência de medição de 1,3 MHz é uma escolha adequada para análise de impedância de esperma nesta configuração. Nesta frequência, a simulação apresentou um aumento de impedância de aproximadamente 800 Q ao introduzir uma célula espermática entre os eletrodos.
[103] A análise de impedância foi realizada ao fluir células espermáticas através de um canal microfluídico de 20 μm de altura, 100 μm de largura com uma restrição de canal de 20 μm de largura em uma vazão entre 0,013 e 0,02 μl/min-1. A impedância foi registrada de maneira diferencial com dois pares de eletrodos com uma largura de eletrodo de 10 μm e uma classificação de eletrodo de 20. Após calcular a diferença entre as respostas elétricas de ambos os pares de eletrodos, correção basal e detecção de pico foram realizadas. A distribuição de altura de pico resultante apresentou bom acordo com a alteração simulada de impedância no caso de um único esperma passando pelos eletrodos. Entretanto, essa distribuição apresentou uma grande dispersão nos dados, variando de valores entre 200 e 2500 Q. Fatores que influenciam a amplitude desta distribuição são, por exemplo, a orientação, localização da célula e propriedades celulares. Devido a esses fatores, a alteração de impedância absoluta não é um parâmetro adequado para caracterizar diferenças morfológicas. Uma abordagem diferente é a análise da forma de pico ao longo do tempo. Uma célula espermática tem uma forma bastante distinta e seu comprimento típico é maior comparado às geometrias de microcanal (largura e comprimento) e a largura dos microeletrodos. Quando uma célula espermática for fluída através deste microcanal, a célula se alinhará por seu eixo longitudinal em relação à parede do canal. Consequentemente, as diferentes partes da célula espermática (cabeça, parte média e flagelo) passarão o campo elétrico entre os microeletrodos em diferentes pontos no tempo e afetarão a impedância registrada, da mesma forma. Como resultado, a forma de pico pode conter informações sobre a orientação celular e sua morfologia.
[104] Para testar essa hipótese, a forma de pico de impedância das células espermáticas passando foi investigada (utilizando uma classificação de eletrodo de 20 μm). Os espectros apresentaram um pico positivo e negativo (figura 3), correspondente ao esperma passando através do primeiro e segundo par de eletrodos, respectivamente. No cruzamento zero, a impedância registrada na entrada 1 e 2 é igual, em cujo ponto, a cabeça do esperma é posicionada entre os dois pares de eletrodos, aproximadamente. Os espectros apresentaram um efeito claro de orientação celular na forma de pico. Quando um esperma passar os eletrodos primeiro com a cabeça, a impedância registrada ao longo do tempo apresentou um pico positivo, pico negativo e uma leve diferença de impedância antes de retornar a zero o último correspondente à presença do flagelo do esperma entre os eletrodos. Na orientação de primeiro a cauda, essa pequena diferença de impedância foi observada antes da cabeça do esperma ter chegado no primeiro par de eletrodos. Além disso, informações sobre a morfologia celular poderiam ser extraídas dos dados. Conteúdo de gota citoplasmática no flagelo resultou na ampliação dos picos medidos. Um exemplo claro é ilustrado na Figura 3b, em que uma saliência clara no sinal é observada entre o pico mínimo e a pequena alteração de impedância correspondente ao flagelo do esperma.
[105] Uma maneira de extrair informações referentes ao conteúdo de gota citoplasmática dos dados de impedância data é analisar a área sob a curva (AUC). No total, 18 células espermáticas morfologicamente normais e 18 contendo gota foram selecionadas para análise. Utilizando Matlab, o ponto máximo (figura 4, A), mínimo (B) e que cruza zero (C) foram determinados. Subsequentemente, a AUC do pico positivo e negativo foi calculada. Ao comparar as médias de AUC dos picos negativos das duas populações utilizando um t-teste (amostra pareada), não foi encontrada diferença estatística (p = 0,52). Uma explicação plausível é o efeito da orientação, localização e velocidade da célula na AUC. A orientação (inclinação celular) e influência de localização na altura do pico e a velocidade da célula tem um efeito na amplitude do pico. Após correção da altura do pico (YB) e amplitude do pico (XB), uma diferença significativa é encontrada entre as AUCs de ambas as populações (p = 0,003), vide a tabela a seguir:
[106] A localização e velocidade da célula são parâmetros importantes para controlar o projeto de um sistema de classificação celular. A localização e velocidade de célula definidas são necessárias para realizar medições precisas da morfologia do esperma e para controlar a classificação celular após análise. A focalização dieletroforética é utilizada para controlar estes parâmetros. Para apresentar o efeito de focalização DEP na localização celular, células espermáticas foram fluídas através do canal microfluídico com e sem excitação de DEP. Sem excitação de DEP, a distribuição de células espermáticas dentro do canal é aleatória. Com excitação de DEP, as células espermáticas foram claramente deflexionadas ao meio do canal, o que é confirmado por uma pequena distribuição de localização Y. A velocidade das células espermáticas foi investigada próxima aos eletrodos de impedância. A localização e velocidade da célula foram determinadas logo após a passagem do par de eletrodos de 20 μm. Os dados de impedância foram combinados aos dados de vídeo para investigar o efeito da velocidade, orientação e localização. Primeiro de tudo, a velocidade e localização da célula foram investigadas com e sem focalização de DEP. Sem focalização, a análise imagem apresentou amplas distribuições na localização e velocidade da célula (o meio do canal foi posicionado em aproximadamente 64 μm; as bordas do canal são posicionadas em aproximadamente 12 e 116 μm). Com focalização, a amplitude dessas distribuições foi reduzida de maneira extensa, conforme pode ser observado especialmente de diferenças menores entre o valor mediano e o primeiro e terceiro valores quartis (isto é, distância entre quartis) encontradas após a focalização comparado à diferença observada sem focalização, vide tabela abaixo: É observado que não foram observados efeitos significativos da velocidade e localização de célula médias na impedância registrada.
[107] A próxima etapa no desenvolvimento de um sistema de classificação de célula livre de marcação é o projeto de um algoritmo que é capaz de classificar ativamente células espermáticas com base na detecção de impedância. Como um experimento com prova de conceito, as contas e células espermáticas foram classificadas com base na impedância. Lab VIEW foi escolhido como plataforma de desenvolvimento. Após focalização e detecção, as contas e células espermáticas devem ser classificadas ativamente. O programa LabVIEW monitora a impedância continuamente. Sempre que uma alteração na impedância for registrada, da qual a forma de pico corresponde ao modelo de pico, a largura e a altura do pico são determinadas. A largura de pico é utilizada para calcular a velocidade de partícula, a fim de prever o tempo de chegada estimado (ETA) nos eletrodos de classificação. A altura total de pico determina se uma partícula é classificada ou não. Esta seleção tem base na janela de interesse (WOI) de impedância. Neste exemplo, contas de poliestireno de 3 μm serão separadas das células espermáticas. Uma mistura de células espermáticas e contas foi fluida através do canal microfluídico em uma vazão de aproximadamente 0,025 μl/min-1. A WOI de impedância foi ajustada a 4-8 Ohm, que corresponde à alteração de impedância quando uma conta passar pelos eletrodos. A alteração de impedância média de células espermáticas é de aproximadamente 17 Ohms, o que é acima da WOI. Sempre que uma alteração de impedância de uma partícula for detectada, que se ajusta dentro da WOI, os eletrodos DEP são ativados para classificar a partícula no canal superior. Quando as contas passarem pelos eletrodos, picos de impedância foram registrados dentro da WOI, consequentemente, a classificação das contas ativamente no canal superior na divisão de canal. Sempre que células espermáticas ou resíduos passarem os eletrodos de detecção, a impedância registrada foi acima ou abaixo da WOI. Como resultado, células espermáticas e resíduos foram coletados no canal inferior sem ser deflexionada pelos eletrodos de classificação. A velocidade de classificação no experimento descrito foi baixa (< 1 de célula espermática s-1) devido à baixa concentração de contas e de espermas e pequenas vazões. Além disso, a velocidade de classificação desse sistema é limitada a aproximadamente 5 células s-1 devido às limitações na velocidade computacional do software LabVIEW. Entretanto, a classificação foi aproximadamente 100% eficaz.
[108] O termo “substancialmente”, aqui, como em “consiste substancialmente”, será entendido pelo técnico no assunto. O termo “substancialmente” também pode incluir realizações com “inteiramente”, “completamente”, “tudo” etc. Então, nas realizações, o advérbio substancialmente também pode ser removido. Quando aplicável, o termo “substancialmente” também pode se referir a 90% ou mais, como 95% ou mais, especialmente 99% ou mais, ainda mais especialmente 99,5% ou mais, incluindo 100%. O termo “compreendem” inclui também realizações em que o termo “compreende” significa “consiste em”. O termo “e/ou” especialmente se refere a um ou mais dos itens mencionados antes e após de “e/ou”. Por exemplo, uma frase “item 1 e/ou item 2” e frases semelhantes podem se referir a um ou mais dentre o item 1 e item 2. O termo “compreendendo” pode, em uma realização, referir-se a “consistindo em”, mas pode, em outra realização, também se referir a “contendo pelo menos a espécie definida e, opcionalmente, uma ou mais outras espécies”.
[109] Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares na descrição e nas reivindicações são utilizados para diferenciar entre elementos semelhantes e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim utilizados são substituíveis entre si sob circunstâncias adequadas e, nessas realizações da invenção descritas aqui, são capazes de operação em outras sequências do que as descritas ou ilustradas aqui.
[110] Os dispositivos aqui são, dentre outros, descritos durante a operação. Conforme será claro ao técnico no assunto, a invenção não é limitada aos métodos de operação ou dispositivos em operação. Deve ser observado que as realizações mencionadas acima ilustram ou invés de limitar a invenção, e que os técnicos no assunto serão capazes de projetar muitas realizações alternativas sem desviar do escopo das reivindicações anexas. Nas reivindicações, quaisquer sinais de referência colocados entre parênteses não devem ser construídos como limitantes da reivindicação.
[111] O uso do verbo “compreender” e suas conjugações não exclui a presença de elementos ou etapas diferentes das declaradas em uma reivindicação. O artigo “o/a” ou “um/uma” antecedendo um elemento não exclui a presença de uma pluralidade desses elementos.
[112] A invenção pode ser implementada por meio de hardware compreendendo diversos elementos diferentes, e por meio de um computador adequadamente programado. Na reivindicação de dispositivo enumerando diversos meios, diversos desses meios podem ser incorporados por um e pelo mesmo item de hardware. O mero fato de que determinadas medidas são mencionadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não pode ser utilizada como vantagem.
[113] A invenção ainda se aplica a um dispositivo compreendendo um ou mais dos aspectos caracterizantes descritos na descrição e/ou apresentados nos desenhos anexos.
[114] A invenção ainda pertence a um método ou processo compreendendo um ou mais dos aspectos caracterizantes descritos na descrição e/ou apresentados nos desenhos anexos.
[115] Os diversos aspectos discutidos nesta patente podem ser combinados, a fim de prover vantagens adicionais. Ainda, o técnico no assunto entenderá que as realizações podem ser combinadas, e que, também mais de duas realizações podem ser combinadas. Além disso, alguns dos aspectos podem formar a base para um ou mais pedidos de divisão.
Claims (17)
1. SISTEMA (1) PARA REALIZAR ANÁLISE E SELEÇÃO DE ESPERMA, com base na morfologia de célula espermática das células espermáticas (6) em um fluido (5), sendo o sistema (1) caracterizado por compreender: (i) um canal de fluxo de fluido (2) para transportar o dito fluido (5), o canal de fluxo de fluido (2) compreendendo uma entrada (10), uma zona de análise (40) configurada à jusante da dita entrada (10) e compreendendo um primeiro par de eletrodos (41) compreendendo uma primeira distância intra-eletrodos (d1) e um segundo par de eletrodos (42) compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos (d2) e configurado em uma distância inter-eletrodos (D12) do primeiro par de eletrodos (41), uma zona de classificação (50) configurada à jusante da dita zona de análise (40), e saídas (80,90,...) configuradas à jusante da dita zona de classificação (50); (ii) uma fonte elétrica (140) configurada para prover um sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos (41) e um sinal elétrico ao segundo par de eletrodos (42); (iii) um dispositivo de medição (150) acoplado de maneira funcional ao primeiro par de eletrodos (41) e acoplado de maneira funcional ao segundo par de eletrodos (42), e configurado para medir uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido (5) entre o primeiro par de eletrodos (41) e para medir uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido (5) entre o segundo par de eletrodos (42) e para prover os dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e na segunda impedância, em que os dados de impedância dependentes do tempo compreendem dados de curva de sinal diferencial, em que os dados de curva de sinal diferencial são providos ao subtrair uma segunda impedância como uma função de tempo da primeira impedância como uma função do dito tempo; (iv) um dispositivo de classificação (51) configurado para classificar células espermáticas (6) entre células espermáticas morfológicas normais e células espermáticas morfológicas anormais ao direcionar a célula espermática (6) na zona de classificação (50) a uma das saídas (80,90,...) com base em uma comparação em um estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos, em que no estágio de comparação, uma curva de sinal diferencial dos dados da curva de sinal diferencial é comparada com uma curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais.
2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no estágio de comparação: (i) uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal é comparada com uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais, em que a curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais mostra um pico positivo e negativo, e em que a curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais um pico adicional entre o pico negativo e o alargamento do pico negativo; ou (ii) uma área sob a curva de sinal diferencial é comparada com uma área sob a curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma área sob a curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais.
3. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o fluido (5) é caracterizado por ainda compreender um material particulado adicional (8), em que o sistema compreende uma saída adicional (100), e em que o dispositivo de classificação (51) é ainda configurado para classificar o material particulado adicional (8) ao direcionar o material particulado adicional (8) na zona de classificação (50) a uma das saídas (80,90,100,...) com base em uma comparação no estágio de comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos.
4. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ainda compreender uma zona de focalização (20) configurada a montante da dita zona de análise (40) e a jusante da dita entrada (10), e um segundo dispositivo eletromagnético (22) para prover um campo elétrico à zona de focalização (20), em que o dispositivo de classificação (51) compreende um primeiro dispositivo eletromagnético (52) para prover um campo elétrico à zona de classificação (50), e o primeiro dispositivo eletromagnético (52) é configurado para direcionar a célula espermática (6) por força dieletroforética a uma das saídas (80, 90, ..), e o segundo dispositivo eletromagnético (22) é configurado para direcionar a célula espermática (6) na zona de focalização por força dieletroforética.
5. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por uma primeira dimensão (61) selecionada dentre altura e largura do canal de fluxo de fluido (2) ser selecionada da variação de 5 - 400 μm e uma segunda dimensão (62) selecionada dentre largura e altura do canal de fluxo de fluido ser selecionada da variação de 5 - 400 μm, e em que uma área de seção transversal é selecionada da variação de 100 - 10.000 μm2.
6. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos dados de referência conterem informações sobre a presença ou ausência de uma gota citoplasmática.
7. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela distância inter- eletrodos (D12) ser selecionada da variação de 10 - 100 μm e os dados de impedância dependentes do tempo terem base em uma diferença entre um valor absoluto da primeira impedância em um momento e um valor absoluto da segunda impedância no dito momento.
8. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por (i) o primeiro par de eletrodos (41) ser configurado em dois lados opostos do canal de fluxo (2), com o canal de fluxo (2) entre eles, e (ii) o segundo par de eletrodos (42) ser configurado em dois lados opostos do canal de fluxo (2), com o canal de fluxo (2) entre eles, em que a primeira distância intra-eletrodo (d1) e a segunda distância intra-eletrodo (d2) são substancialmente as mesmas.
9. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dispositivo de classificação (51) direcionar uma célula espermática anormal para uma das saídas (80, 90, ...) e uma célula espermática normal para outra saída (80, 90, ...).
10. MÉTODO PARA CLASSIFICAÇÃO DE CÉLULAS ESPERMÁTICAS (6) em um fluido (5) entre células espermáticas morfológicas normais e células espermáticas morfológicas anormais, sendo o método caracterizado por compreender: (i) provisão de um fluxo de fluido compreendendo as células espermáticas (6) a um canal de fluxo de fluido (2), em que o canal de fluxo de fluido (2) compreende um primeiro par de eletrodos (41) e um segundo par de eletrodos (42) compreendendo uma segunda distância intra-eletrodos (d2) e configurado em uma distância inter-eletrodos (D12) do primeiro par de eletrodos (41); (ii) provisão de um primeiro sinal elétrico ao primeiro par de eletrodos (41) e prover um segundo sinal elétrico ao segundo par de eletrodos (42); (iii) medição de uma primeira impedância como uma função de tempo do fluido (5) entre o primeiro par de eletrodos (41) e medição de uma segunda impedância como uma função de tempo do fluido (5) entre o segundo par de eletrodos (42) e para prover os dados de impedância dependentes do tempo com base na primeira impedância e na segunda impedância, em que os dados de impedância dependentes do tempo compreendem dados de curva de sinal diferencial, em que os dados de curva de sinal diferencial são providos ao subtrair uma segunda impedância como uma função de tempo da primeira impedância como uma função do dito tempo; (iv) classificação das células espermáticas (6) entre células espermáticas morfológicas normais e células espermáticas morfológicas anormais com base na comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos em um estágio de comparação, em que no estágio de comparação, uma curva de sinal diferencial dos dados da curva de sinal diferencial é comparada com uma curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por, no estágio de comparação: (i) uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal é comparada com uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma forma da curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais, em que a curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas normais mostra um pico positivo e negativo, e em que a curva de sinal diferencial de dados de curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais um pico adicional entre o pico negativo e o alargamento do pico negativo; ou (ii) uma área sob a curva de sinal diferencial é comparada com uma área sob a curva de sinal diferencial de células espermáticas normais e uma área sob a curva de sinal diferencial de células espermáticas anormais.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela comparação, no estágio de comparação, compreender comparar uma área processada sob a curva de sinal diferencial com dados de referência de uma área processada sob a curva de sinal diferencial para células espermáticas morfológicas normais e para células espermáticas morfológicas anormais, em que as áreas processadas sob as curvas são fornecidas por normalizar a respectiva curva de sinal diferencial com base em uma altura de pico (YB) e uma largura de pico (XB), em que a altura de pico (YB) é um valor de sinal de impedância mínimo de um pico negativo da respectiva curva e a largura de pico (XB) é o tempo de medição correspondente na altura do pico (YB) menos o tempo de medição correspondente a um início do pico negativo.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por ainda compreender a focalização da célula espermática (6) no canal de fluxo de fluido (2) em uma localização a montante do primeiro par de eletrodos (41) e em que a focalização da célula espermática (6) compreende (i) provisão de um fluxo de fluido adicional de um material de suporte ao canal de fluxo de fluido (2) para envolver a célula espermática (6) com o fluxo de fluido adicional ou (ii) provisão de um campo elétrico não uniforme à célula espermática (6) para direcionar a célula espermática (6) no fluxo de fluido.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que a medição da impedância é caracterizada por compreender a medição da impedância em uma frequência selecionada da variação de 10 kHz - 100 MHz.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pela classificação de células espermáticas (6) com base na comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com dados de referência predefinidos compreender a comparação dos dados de impedância dependentes do tempo com uma curva simétrica.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 15, em que o fluido (5) é caracterizado por compreender células espermáticas (6) em uma concentração de 2»103 - 2»108células/ml e em que as células espermáticas são selecionadas do grupo de célula espermática de gado consistindo em células espermáticas de javali (6) e células espermáticas de touro.
17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado por, durante a seleção, uma célula espermática anormal ser direcionada para uma das saídas e uma célula espermática normal ser direcionada para outra saída.
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