BR112017009616B1 - Método aperfeiçoado para determinação de micro-organismos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se à determinação do teor de micro-organismos em um material que compreende celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel. O material compreendendo celulose é pré-tratado enzimaticamente e os micro-organismos são determinados utilizando tecnologia baseada no procedimento de Reação em Cadeia por Polimerase (PCR).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um método para a determinação do teor de micro-organismos em material compreendendo celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA CORRELACIONADA
[002] Papel e papelão são materiais de embalagem importantes usados em muitos campos da indústria. A embalagem com papel ou papelão pode fornecer proteção física ou química para o(s) objeto(s) fechado(s); também, podem fornecer informações e melhorar a comercialização e controle das porções dos objetos. O papel e o papelão têm também uma longa história na indústria alimentar, em uma infinidade de usos, incluindo embalagens. Como material de embalagem, o papel geralmente entra em contato direto com os alimentos. Os recipientes de papel e papelão são utilizados para alimentos secos, líquidos e produtos congelados. Embalagem de papel é comumente usado também para fast food e doces, embalagens farmacêuticas, embalagens de cigarros, embalagens de luxo e produtos gráficos de alta classe. A embalagem com papel é também comumente usada para fastfood e doces, embalagens farmacêuticas, embalagens de cigarros, embalagens de luxo e produtos gráficos de alta classe. A embalagem protege o conteúdo contra a ação de fatores perigosos do ambiente, desse nodo, prolongando a vida útil dos conteúdos embalados. O requisito de higiene para produtos de papelão para embalagem de consumo é extremamente elevado.
[003] Papel e papelão são geralmente compostos principalmente de fibras de celulose, carbonato de cálcio, amido e hemicelulose. Todos estes são componentes naturais e podem servir como meio de crescimento para micro-organismos contaminantes. A circulação de água com alto teor de nutrientes e amido é uma origem comum de infecção microbiana.
[004] Tradicionalmente, a pureza microbiana de uma substância tem sido avaliada utilizando métodos microbiológicos que requerem a cultura de uma amostra do material ou superfície a ser analisada. A composição e as condições de cultura (temperatura, tempo, meio) têm impacto na precisão do método. A amostra para análise quantitativa deve ser diluída, a tal ponto que se podem contar as colônias individuais formadas por células. Podem haver dúzias ou, no máximo, algumas centenas de células na amostra estudada. A contagem de colônias em amostras paralelas pode ser muito variada e, consequentemente, a reprodutibilidade é ruim. Assim, a precisão ou confiabilidade não é satisfatória. Além disso, os métodos microbianos são tipicamente trabalhosos e demorados e, portanto, não são ideais para o acompanhamento (monitoramento) da pureza dos pacotes de papel e papelão.
[005] Os métodos baseados na reação em cadeia por polimerase (PCR) para identificar um micro-organismo em um processo de fabricação de papel, inclusive de uma folha de papel, são conhecidos a partir, por exemplo, da Patente US 8.613.837 e Pedido de Patente US 2013/189152.
[006] Uma vez que os presentes métodos são trabalhosos, consumidores de tempo e a precisão e sensibilidade dos mesmos não são satisfatórias, há uma necessidade de métodos aperfeiçoados para determinar a pureza microbiológica do material de papel e papelão. OBJETIVOS E RESUMO DA INVENÇÃO
[007] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um método aperfeiçoado para a determinação de micro-organismos contaminantes em um material compreendendo celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel. Esse objetivo é alcançado pela presente invenção, conforme será descrito e reivindicado abaixo.
[008] O primeiro aspecto da invenção compreende um método para a determinação de um teor de micro-organismos em um material compreendendo celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel. As características do referido método são apresentadas na parte que caracteriza a reivindicação 1.
[009] O segundo aspecto da invenção compreende a utilização de celulase no pré-tratamento de material compreendendo celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel, antes da determinação de micro-organismos utilizando o procedimento de PCR quantitativo.
[010] O método permite um acompanhamento simples e preciso da pureza microbiológica do material que compreende celulose, dentro do âmbito da indústria de polpa e papel e, também, dos materiais de papel e papelão resultantes, tais como, materiais de embalagem de consumo, especialmente materiais de embalagem de alimentos. Desse modo, a higiene do material de embalagem é intensificada, uma vez que possíveis contaminantes podem ser detectados numa fase inicial.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[011] A figura 1 mostra uma comparação da análise de qPCR para bactérias em papelão inoculado, suspensas em um tampão e submetidas a uma filtração por compressão e cultura tradicional, para a determinação de microorganismos.
[012] A figura 2 mostra uma comparação da análise de qPCR para bactérias em papelão inoculado, suspensas em um tampão e submetidas a uma filtração por centrifugação de saco e cultura tradicional, para a determinação de micro-organismos.
[013] As figuras 3a e 3b mostram uma comparação entre o método de acordo com a presente invenção e um método tradicional baseado em cultura, para a determinação de micro-organismos em dois papéis ou papelões diferentes.
[014] A figura 4 mostra uma comparação do método para a determinação de micro-organismos, primeiro em papelão, utilizando qPCR sem pré-tratamento enzimático, depois, de acordo com a presente invenção, e por último, utilizando um método baseado em cultura tradicional.
[015] A figura 5 mostra uma comparação da determinação de micro-organismos utilizando uma cultura tradicional, qPCR, sem pré-tratamento enzimático, filtração por compressão como pré-tratamento, centrifugação com saco de filtração como pré-tratamento, e o método de acordo com a presente invenção utilizando duas diferentes preparações de celulase comercial mista.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[016] Os inventores verificaram, de forma surpreendente, que a determinação com base no procedimento de PCR de pureza microbiológica de material compreendendo celulose dentro do âmbito da indústria de polpa e papel pode ser notavelmente aumentada através de pré-tratamento enzimático da amostra. O pré-tratamento enzimático permite a detecção quantitativa usando PCR, também quando os níveis de micro-organismos contaminantes são muito baixos.
[017] De acordo com a invenção, a determinação de um teor de micro-organismos em um material compreendendo celulose dentro do âmbito da indústria de polpa e papel compreende as etapas de: (a) proporcionar uma suspensão de uma amostra do material compreendendo celulose; e (b) tratar a suspensão da etapa (a) com uma ou mais preparações enzimáticas tendo atividade de celulase; e (c) separar os micro-organismos da suspensão tratada na etapa (b) com enzima; e (d) isolar os ácidos nucleicos dos micro-organismos separados na etapa (c); e (e) realizar uma análise pelo procedimento de Reação em Cadeia por Polimerase (PCR) dos ácidos nucleicos isolados na etapa (d), em que o resultado da PCR indica o teor de micro-organismos da amostra.
[018] Conforme é conhecido no segmento da técnica, um resultado de PCR positivo indica a presença de um determinado ácido nucleico e, desse modo, de um determinado micro-organismo, enquanto o procedimento de qPCR é utilizado para a determinação dos níveis de micro-organismos.
[019] Nesse contexto, deve ser entendido que "um teor de microrganismos" abrange tanto o teor de microorganismo qualitativo (por exemplo, identificando a cepa microbiana), como quantitativo (por exemplo, a quantidade de unidades formadoras de colônias de bactérias) da amostra. A determinação do teor de micro-organismos quantitativo e qualitativo em um material de amostra pode ser feita independentemente ou em conjunto. O teor qualitativo pode ser medido utilizando primers específicos para certos gêneros ou espécies. A presença do produto de PCR indica a presença do micro-organismo e pode ser determinada utilizando eletroforese de gel ou, preferivelmente, utilizando análises do equipamento qPCR. Quando necessário, a determinação quantitativa é realizada utilizando o equipamento qPCR e controles conhecidos. Podem ser utilizados primers de amplo espectro ou primers específicos.
[020] De acordo com a presente invenção, a expressão "material compreendendo celulose dentro do âmbito da indústria de polpa e papel" significa materiais contendo celulose dentro da indústria de polpa e papel, incluindo matérias-primas, material celulósico durante o processo de fabricação e os produtos finais. Exemplos de materiais compreendendo celulose (materiais celulósicos) são, sem qualquer limitação aos mesmos, aparas de madeira, polpa mecânica e vários papéis e papelões. A polpa, vários papéis e papelões são os materiais preferidos. O papelão de consumo é particularmente preferido e o papelão de embalagem para alimentos e líquidos é o material contendo celulose mais preferido.
[021] Nesse sentido, o termo "papelão de consumo" inclui papelão de embalagem em geral, papelão de embalagem de alimentos e de embalagem não alimentícia, papelão de embalagem de líquidos, papelão de embalagem de produtos farmacêuticos, papelão de cigarro e papelão para gráfica. O papel ou papelão a ser testado quanto à pureza microbiológica pode ser de camada única ou de múltiplas camadas, assim como, revestido ou não revestido. O papel ou papelão contém fibras celulósicas e, opcionalmente, uma quantidade variável de hemicelulose além de outros constituintes e/ou revestimentos. O teor ou revestimento de hemicelulose pode afetar a composição ótima da preparação enzimática. O material de papel e papelão preferido é o papelão de embalagem de consumo, especialmente, o papelão de embalagem para líquidos e material alimentar.
[022] A suspensão pode ser tomada diretamente de uma fase aquosa do processo de fabricação. No entanto, quando a suspensão é derivada de um processo ou de um produto aquoso, tem de ser assegurado que a solução seja adequada para a atividade de preparação enzimática nas etapas seguintes. Se necessário, o tampão pode ser alterado.
[023] Uma amostra do material potencialmente contaminado compreendendo celulose pode ser colocada em suspensão em uma solução, tipicamente, uma solução tampão adequada para a atividade da preparação enzimática a ser utilizada. O material de papel ou papelão pode ser dividido antes da etapa de suspensão, por exemplo, usando tesouras. Normalmente, a etapa de suspensão do material de papel ou papelão é intensificada por meio de moagem mecânica e/ou, por exemplo, turbilhonamento. Um exemplo de um método preferido de colocar em suspensão uma amostra pode ser encontrado na publicação “Standard Methods for the Examination of Dairy Products ”, 17a. edição, publicada pela APHA. As amostras derivadas de processos de polpação podem ser submetidas a um tratamento enzimático sem moagem mecânica. No entanto, em alguns casos, o tampão da suspensão tem de ser alterado, de modo a satisfazer as necessidades da atividade enzimática na etapa seguinte.
[024] Em seguida, coloca-se em contacto uma quantidade gravimétrica de uma suspensão preferivelmente homogeneizada com uma preparação enzimática contendo uma ou mais atividades de celulase e, opcionalmente, de hemicelulase. Tipicamente, a preparação enzimática é adicionada à suspensão.
[025] A suspensão é tratada com enzimas celulolíticas, a fim de aumentar a separação de micro-organismos e material fibroso. A preparação enzimática, de acordo com a presente invenção, contém pelo menos uma enzima possuindo atividade de celulase. Opcionalmente, a preparação enzimática contém ainda atividades de hemicelulase. A preparação enzimática pode também ser uma mistura de enzimas possuindo atividades de celulase e, opcionalmente, uma ou mais atividades de hemicelulase. A preparação enzimática contendo diversas atividades de celulase é preferivelmente enriquecida com uma ou mais atividades de endoglucanase. As enzimas celulase podem ser endocelulases, tais como, as endoglucanases (EC 3.2.1.4), ou as celobiohidrolases exoativas (EC 3.2.1.91), sem que sejam a estas restritas, e podem também ter outras atividades celulolíticas e/ou hemicelulolíticas, ou qualquer mistura das mesmas. As endoglucanases são preferidas. As atividades de endoglucanase da família cel5 são especialmente úteis. As hemicelulases podem ser, por exemplo, xilanases (EC 3.2.1.8) ou mananases, ou qualquer das suas misturas. Um exemplo de uma mistura enzimática comercialmente disponível útil na presente invenção é “Ecostone L900” (AB Enzymes, Finlândia), que é uma mistura de celulase de Trichoderma enriquecida com cel5.
[026] O tratamento enzimático é suave para os micro-organismos vivos e reduz a necessidade de moagem mecânica extensa. Além disso, melhora a separação dos micro-organismos e fibras nos substratos de papel ou papelão, pelo que, a sensibilidade e a precisão da determinação são aumentadas.
[027] De preferência, a preparação da enzima é dosada com um ligeiro excesso, de modo a assegurar a separação adequada dos micro-organismos e fibras no material compreendendo celulose. As condições, por exemplo, de pH, temperatura e tempo de incubação para o tratamento enzimático (definido como a etapa (b) acima) devem ser adequadas para a atividade da referida preparação enzimática. O tratamento enzimático também mostra melhor repetibilidade do que os métodos mecânicos de maceração. Após o tratamento enzimático, a suspensão permite a separação dos micro-organismos do material contendo celulose utilizando, por exemplo, centrifugação de saco de filtração.
[028] A quantidade de impurezas microbiológicas contaminantes (isto é, a quantidade de micro-organismos) na polpa derivada de um processo de fabricação que funciona adequadamente, ou a partir da obtenção de papel ou papelão utilizando um processo de fabricação que funciona adequadamente, é tipicamente muito baixa. Assim, é necessário separar os micro-organismos das fibras restantes. Em princípio, qualquer método conhecido para recuperar os micro-organismos pode ser utilizado, mas a centrifugação com saco de filtração é o método mais preferido. Um saco de filtro de centrífuga irá recuperar os micro-organismos vivos, mas as fibras restantes residuais serão descarregadas. Um tamanho de poro adequado para o saco de filtro pode ser selecionado por um especialista na técnica e pode ser, por exemplo, de 50 micrômetros.
[029] Em seguida, as células separadas podem ser tratadas com monoazida de propídio (PMA). A PMA penetra nas membranas das células mortas e reage com os ácidos nucleicos, resultando em DNA que não pode ser amplificado por PCR. Assim, apenas o DNA de células viáveis pode ser determinado.
[030] Em seguida, os ácidos nucleicos dos microorganismos separados são isolados. Novamente, qualquer método conhecido pode ser usado. Um exemplo de um protocolo adequado é descrito em Rinttilã et al.
[031] Finalmente, o material de ácido nucleico isolado é conduzido para uma análise de PCR, usualmente a PCR quantitativa (qPCR). A qPCR permite a determinação quantitativa e qualitativa de micro-organismos contaminantes. Um especialista versado na técnica é capaz de selecionar primers de PCR adequados para, por exemplo, determinação bacteriana total; assim, por exemplo, primers para amplificar a região 16S rDNA são utilizáveis na determinação do teor bacteriano total. Também é possível utilizar primers específicos para certos gêneros ou espécies de micro-organismos (uma análise qualitativa, opcionalmente, também, com um resultado quantitativo). Amostras com curva de amplificação superior ao ciclo limite, antes de um controle não modelo, e uma curva de fusão válida indicam a presença de micro-organismos. Um resultado quantitativo de PCR é calculado utilizando padrões com uma quantidade/concentração conhecida de microorganismos.
[032] Quando comparado aos métodos de cultura tradicionalmente usados, o método qPCR é notavelmente mais rápido e não tão intensivo em mão de obra quanto a cultura. O método da invenção é também bastante sensível e permite a detecção de pequenas alterações na pureza microbiana do material. Assim, por exemplo, considera-se que um material de embalagem de líquido é microbiologicamente puro quando a contagem total de bactérias por grama de papelão de embalagem de líquido é inferior a 250 unidades formadoras de colônias (cfu/g) (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17a edição, publicações APHA ). Assim, a sensibilidade e o baixo limite de detecção são essenciais para a condição de utilização do método.
[033] Maior precisão, especificidade e condição de uso do método de determinação permitem o acompanhamento contínuo do material produzido no local de fabricação, e um fácil acompanhamento ou testes aleatórios, antes de usar o material de embalagem. Desse modo, o método de acordo com a invenção melhora a segurança e a higiene das embalagens de consumo. Além disso, as impurezas microbiológicas nos processos de fabricação são prejudiciais ao processo e ao produto resultante. A detecção precoce de um possível aumento da contagem microbiana torna mais fácil, por exemplo, evitar a formação de depósitos microbianos.
[034] O método aqui descrito é adequado para a determinação de qualquer tipo de micro-organismo. O método é especialmente adequado para a determinação de bactérias, especialmente de espécies de Bacillus e espécies dentro do grupo Bacillus D. Também é possível determinar fungos contaminantes e mofo.
[035] A utilização de enzima celulase no pré- tratamento de um material compreendendo celulose dentro do âmbito da indústria de polpa e papel, antes da determinação de micro-organismos utilizando PCR quantitativa, está também dentro do escopo da presente invenção. A enzima celulase pode ser utilizada isoladamente ou em combinação com outras enzimas celulase e/ou com uma ou mais enzimas hemicelulase. Tanto as preparações de celulase misturada, como as chamadas preparações de celulase integrais tendo várias atividades hidrolíticas, bem como, as celulases possuindo apenas uma ou duas atividades principais, podem ser utilizadas no âmbito da presente invenção. Tal como é conhecido na técnica, o tipo de celulase é dependente do tipo de material fibroso. Em um uso mais preferido, papel ou material de papelão é pré-tratado com enzima endoglucanase antes da determinação quantitativa de microrganismos. Conforme é conhecido no segmento da técnica, o tipo de celulase é dependente do tipo do material fibroso. Em uma utilização mais preferida, papel ou material de papelão é pré-tratado com enzima endoglucanase, antes da determinação quantitativa de microorganismos.
[036] A seguir, a invenção será ilustrada por meio de exemplos não limitativos. Deve ser entendido que as modalidades apresentadas na descrição acima e nos exemplos são apenas para fins ilustrativos, sendo possíveis várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção.
Exemplos Exemplo 1: Inoculação do Papelão de Embalagem
[037] Uma cepa bacteriana pertencente ao grupo Bacillus D foi cultivada em TSB (caldo de soja tríptico) durante a noite à temperatura de 37°C. Para assegurar a viabilidade, as bactérias foram colhidas durante a fase de crescimento exponencial. A partir do caldo de crescimento primário, um volume de 5 mL foi transferido para 500 mL de caldo fresco e incubado a 37°C durante 6 horas. As células bacterianas foram divididas em tubos tipo falcão, de 10 x 50 mL e colhidas por centrifugação. Todas as 10 pastilhas bacterianas foram novamente suspensas em 5 mL de tampão de ácido cítrico estéril (0,05 M, pH 5,0) e combinadas juntas e com completação até 200 mL ("material bacteriano"). O material bacteriano foi adicionado a uma mistura de papelão-tampão com uma concentração de 20 μL para inóculo baixo e 200 μL para inóculo meio-baixo.
[038] Um papelão de embalagem foi inoculado com dois níveis da cepa Bacillus pertencentes ao grupo Bacillus D (Inóculo baixo e meio-baixo). A cultura foi realizada de acordo com o protocolo padrão da FDA (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17a. edição, publicações da APHA). A diluição em série de Bacillus cultivada, conforme explicado acima, foi utilizada para inoculantes; o alto nível foi submetido à diluição de 1:10, e, em seguida, os níveis meio-alto, meio-baixo e baixo foram diluídos, respectivamente, de modo que o inoculante de nível baixo foi diluído de 1:10.000.
Exemplo 2: Tratamento com Monoazida de Propídio
[039] Para o tratamento com monoazida de propídio, uma pastilha contendo células bacterianas foi dissolvida com um vórtice manual para até 1980 μL de NaCl a 0,9%. Em seguida, o líquido resultante foi transferido para um tubo Eppendorf de 2 mL e adicionou-se 2 0 μL de uma solução de reação de PMA (monoazida de propídio). Os tubos foram agitados manualmente para misturar as amostras e depois incubados durante 5 minutos no escuro à temperatura ambiente, sem agitação. Após a incubação, os tubos foram invertidos para homogeneizar as amostras, colocados lateralmente em elementos frios sob uma lâmpada de 500 W e iluminados durante 5 min. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 20000 x g, a + 4°C durante 10 minutos (centrífuga Eppendorf 5804 R) e o sobrenadante foi despejado. Após centrifugação, a pastilha foi seca em um dissecador a vácuo, à temperatura de 45°C durante 20 minutos, e dissolvida em 45 μL de tampão Tris-EDTA à temperatura de 55°C durante 1,5-2 horas.
Exemplo 3: Extração de DNA e Procedimento de qPCR
[040] A extração de DNA para células isoladas a partir do material fibroso foi essencialmente realizada como descrito por Rinttilã et al. (2004). Em resumo, os reagentes de lise foram adicionados ao tubo com esferas de vidro e o batedor de esferas FastPrep foi utilizado três vezes à velocidade de 6,5 m/s, durante 1 minuto. Os tubos foram incubados a 65°C durante 20 minutos, com agitação de vórtice, usando um dispositivo Thermomixer de 2 em 2 minutos. Os tubos foram incubados a 65°C durante 20 minutos, agitados em vórtice com um dispositivo Thermomixer de 2 em 2 minutos. Em seguida, adicionaram-se 800 μL de uma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (24:23:1), e misturou-se e centrifugou-se a 10000 g durante 5 minutos. Transferiu-se 600 μL de fase líquida para um novo tubo e extraiu-se com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Depois, 270 μL de isopropanol a 100% foram adicionados para precipitar o DNA e o líquido foi removido após centrifugação de 20000 g, à temperatura de +4°C, durante 15 minutos. A pastilha foi lavada duas vezes com 1 mL (-20°C) de etanol a 70%, e centrifugada com 20000 g, à temperatura de +4°C durante 5 minutos. Após centrifugação, a pastilha foi seca em um dissecador a vácuo, à temperatura de 45°C, durante 20 minutos, e dissolvida em 45 μL de tampão Tris- EDTA à temperatura de 55°C, durante 1,5-2 horas.
[041] As amostras de DNA foram diluídas 1:2, 1:4 e 1:8 para a análise de qPCR. Os primers de largo espectro, conforme descrito em Nadkarni et al., 2002, foram utilizados durante 40 ciclos com uma temperatura de recozimento de 60°C. Os resultados das amostras foram calculados de acordo com uma curva padrão baseada em padrões diluídos por 10 vezes.
Exemplo 4: Filtração por Compressão
[042] Um papelão de embalagem foi inoculado com dois níveis de cepas do grupo Bacillus D. Low e Mid-Low) como descrito no Exemplo 1 foi homogeneizado com um misturador Waring em tampão e prensado com filtrado por compressão para separar o sólido e a fase líquida. O resultado de qPCR a partir do filtrado obtido a partir de uma filtração por compressão representou apenas 21 e 1 1% do resultado da cultura para o nível de inoculação Baixo e Médio-Baixo, respectivamente, ver Figura 1. Um nível de inoculação de grau baixo e médio-baixo, conforme descrito no Exemplo 1, foi homogeneizado com um misturador Waring com um tampão, e comprimido com filtrado por compressão para separar o sólido e a fase líquida. O resultado de qPCR a partir do filtrado obtido a partir de uma filtração por compressão representou apenas 21 e 11% do resultado da cultura para o nível de inoculação baixo e médio-baixo, respectivamente (ver Figura 1). Um resultado muito mais baixo do filtrado por compressão do que o resultado da cultura indica que a filtração por compressão não é um método de separação adequado para micróbios do papelão de embalagem.
Exemplo 5: Centrifugação por meio de saco de filtração é um método de separação inadequado para micróbios
[043] Um papelão de embalagem (10 g) foi cortado em pequenos pedaços com tesoura estéril, excluindo as bordas da amostra do papelão. As peças resultantes foram misturadas com 300 mL de tampão de ácido cítrico (0,05 M, pH 5) e homogeneizadas em um misturador Waring. A seguir, transferiu-se uma quantidade gravimétrica conhecida do papelão de embalagem umedecido e homogeneizado (35 ± 0,1 g) para tubos de Falcon de 50 mL contendo um saco de filtro (saco de filtro F57 para pesquisas de fibra e pesquisas in vitro, Ankom Technology), com posterior filtração por centrifugação. Idealmente, a matriz indissolúvel seria aprisionada no saco de filtro enquanto as bactérias sedimentariam na pastilha. No entanto, o resultado de qPCR representou 27% do resultado da cultura, indicando que a centrifugação exclusiva de saco de filtração não é um método de separação adequado para micróbios de papelão de embalagem suspenso em uma solução. O resultado usando qPCR e cultura é mostrado na Figura 2.
Exemplo 6: Tratamento Enzimático
[044] Quatro preparações enzimáticas contendo atividades celulolíticas (as chamadas "celulases completas" ou "celulases misturadas") foram testadas em relação à capacidade de quebrar as amostras de papelão suspensas em um tampão. As enzimas testadas foram Ecostone L900 (Enzimas AB), Optimase™ CX40L, Optimase™ CX60L e Multifect (Genencor). As principais atividades de acordo com os anúncios dos fabricantes e outras informações disponíveis ao público são as seguintes: Ecostone L900 é uma preparação de Trichoderma celulase enriquecida de cel5. A preparação enzimática Optimase™ CX 40L contém celulase e hemicelulases como principais atividades enzimáticas. A Optimase CX60L contém múltiplas atividades enzimáticas, mas é padronizada com base na sua atividade na carboximetilcelulose (CMC). A xilanase é a principal atividade do Multifect.
[045] Para assegurar que as atividades enzimáticas não limitariam a decomposição do substrato do papelão, foram realizadas as seguintes séries de ensaios (ver Tabela 1), em que a proporção do volume da enzima para a massa de papelão variou de 5 a 15x10-5. A eficiência não se alterou, mesmo que mais quantidade de enzima por papelão tenha sido fornecida, o que indica que já um menor volume continha tanta enzima que a atividade enzimática não limitava a desagregação do papelão.
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[046] Todas as enzimas foram aplicadas na forma de volume máximo, para que a atividade da enzima não limitasse a quebra do substrato do papelão. A temperatura de incubação, o pH e outras condições foram ajustadas para uma faixa ótima para cada enzima, de acordo com as recomendações dos fabricantes. A capacidade das enzimas para romper o substrato do papelão foi estimada visualmente e as duas enzimas com celulose como atividade principal foram superiores às outras duas, indicando que as celuloses são preferidas em relação às hemicelulases.
Exemplo 7: Análise de papelões de embalagem implementados com Reação em Cadeia por Polimerase quantitativa (qPCR).
[047] Dois diferentes papelões de embalagem foram inoculados com quatro níveis de cepas do grupo Bacillus D (graus de inoculação baixo, médio-baixo, médio-alto, e alto), conforme descrito no Exemplo 1. A cultura foi realizada de acordo com o protocolo padrão da FDA (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17a edição, publicações da APHA). Para a análise de qPCR, os papelões de embalagem (10 g) foram cortados em pequenos pedaços com tesoura estéril, excluindo as bordas da amostra do papelão. As peças resultantes foram misturadas com 300 mL de tampão de ácido cítrico (0,05 M, pH 5) e homogeneizadas em um misturador Waring. A seguir, transferiu-se uma quantidade gravimétrica conhecida do papelão de embalagem umedecido e homogeneizado (35 ± 0,1 g) para um frasco de armazenamento, depois, incubada em um agitador de incubação a 40°C com uma enzima celulase (AB Enzymes, Ecostone L900). A amostra foi transferida para tubos de Falcon de 50 mL contendo um saco de filtro e filtrada por centrifugação. A matriz indissolúvel foi aprisionada no saco de filtro enquanto as bactérias sedimentavam na pastilha. As amostras para as quais as células viáveis foram medidas foram tratadas com monoazida de propídio no estágio de pastilha, antes da adição dos reagentes de lise. Os resultados de qPCR mostrados nas Figuras 3a e 3b mostraram excelente linearidade e baixo desvio padrão entre as amostras replicadas. Estes resultados também estavam em linha com os resultados da cultura, isto é, mostraram boa recuperação e precisão (90 e 97%, respectivamente). A experiência foi repetida várias vezes utilizando diversos papelões sem inoculação. Os resultados obtidos com o tratamento enzimático e qPCR foram compatíveis com os respectivos resultados da cultura. Devido a um nível bastante baixo de micróbios endógenos, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas. Os dados não são mostrados.
Exemplo 8: Comparação da determinação por cultura e qPCR, com e sem pré-tratamento de celulase.
[048] A cultura após a suspensão da amostra de papelão mostrou um nível microbiano mais elevado do que da reação em cadeia por polimerase quantitativa, quando não é aplicado um pré-tratamento da enzima antes da extração do DNA e análise de qPCR. O pré-tratamento com celulose antes da extração de DNA e análise de qPCR, no entanto, mostra boa concordância com o resultado da cultura. A centrifugação com saco de filtração foi utilizada para a separação de micróbios antes de qPCR. Os resultados são mostrados na Figura 4.
Exemplo 9: Pré-tratamento enzimático em comparação com outros pré-tratamentos
[049] A cultura das amostras do papelão de embalagem foi realizada de acordo com o protocolo padrão da FDA (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17a. edição, publicações da APHA). A filtração por compressão foi realizada conforme descrito no Exemplo 1 e a centrifugação com saco de filtração conforme descrito no Exemplo 5. O tratamento enzimático utilizando Ecostone L900 comercial foi realizado conforme descrito no Exemplo 7.
[050] As amostras pré-tratadas com celulase mostraram um nível respectivo à cultura (semelhante ou ligeiramente superior), enquanto que outros tipos de pré- tratamento (filtração por compressão e centrifugação com saco de filtração) e amostras sem pré-tratamento mostraram um nível mais baixo em comparação com a cultura. Os resultados são mostrados na Figura 5. REFERÊNCIAS DE LITERATURA - Nadkarni M. A., F. E. Martin, N. A. Jacques, e N. Hunter, 2002; Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set ; Microbiology, 148:257-266. - Rinttilã T., Kassinen A., Malinen E., Krogius L., Palva A.; Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR; J. Appl. Microbiol. 2004; 97(6): 1 166-1 177. - Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17a. edição, APHA publications. 2004.

Claims (12)

1. Método para determinação do teor de microorganismos em um material que compreende celulose, na indústria de polpa e papel, o método caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer uma suspensão de uma amostra do material compreendendo celulose; e (b) tratar a suspensão com uma ou mais preparações enzimáticas com atividade de celulase; e (c) separar os micro-organismos da suspensão tratada com enzima; e (d) isolar ácidos nucleicos dos micro-organismos separados; e (e) realizar uma análise por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) dos ácidos nucleicos isolados, em que o resultado do PCR indica o teor de micro-organismos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão é fornecida colocando uma amostra em suspensão em uma solução.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a atividade de celulase é uma mistura de atividades de celulase.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a atividade de celulase é pelo menos uma atividade de endoglucanase.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação enzimática contém ainda atividade ou atividades de hemicelulase.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos são separados da suspensão por meio de centrifugação de saco de filtração.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o material compreendendo celulose consiste em um papelão para consumidor, preferivelmente, um papelão para a indústria alimentícia.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo pertence ao domínio das bactérias.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria representa uma espécie Bacillus.
10. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o microrganismo consiste em um fungo ou mofo.
11. Uso de celulase caracterizado por ser no pré- tratamento de um material compreendendo celulose, na indústria de polpa e papel, antes da determinação de microorganismos usando PCR.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o material de papel ou papelão é pré-tratado com enzima endoglucanase, antes de uma determinação quantitativa de micro-organismos.
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