BR112017004191B1 - Dispositivo microfluídico, e, método para purificar um analito biológico ou químico - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, E, MÉTODO PARA PURIFICAR UM ANALITO BIOLÓGICO OU QUÍMICO. Um dispositivo microfluídico é descrito tendo uma câmara encerrada contendo um filtro para purificar analitos biológicos ou químicos a partir de uma amostra biológica complexa, dita câmara alojando uma pluralidade de orifícios em adição ao dito filtro, como se segue: um primeiro orifício permitindo comunicação de gás da câmara com um gerador de vácuo, por um primeiro trajeto de fluxo; um segundo orifício permitindo comunicação de líquido da câmara com um ou mais reservatórios, por um segundo trajeto de fluxo; um terceiro orifício permitindo comunicação de gás e de líquido da câmara com ambos um ou mais recipientes receptores e um gerador de vácuo, por um terceiro trajeto de fluxo; e um filtro localizado entre o terceiro orifício e ambos o primeiro e segundo orifício, para que um fluido entrando na câmara através do primeiro e/ou segundo orifício e saindo da câmara através do terceiro orifício flui através do filtro. A invenção também se refere a um método usando o dispositivo microfluídico.
Description
[001] O método original de purificação de ácido nucleico baseado na afinidade de DNA e NA para as superfícies de sílica (adsorção em fase sólida) foi descrito por Boom et al. Atração de ácido nucleico por superfícies de sílica é promovida por uma concentração elevada de sais caotrópicos (tipicamente isotiocianato de guanidina ou cloridrato de guanidina). O método de Boom utiliza uma solução de sal caotrópico para desnaturalizar a amostra biológica e fazê-lo passar pelo filtro utilizando forças centrífugas para promover adsorção de DNA e RNA na superfície da sílica. Uma vez que os ácidos nucleicos estão ligados ao filtro, uma ou mais lavagens com tampões etanólicos são realizados para se livrar dos sais caotrópicos e outras impurezas biológicas, mantendo os ácidos nucleicos ligados (sais caotrópicos são disruptivos para a maioria dos ácidos nucleicos em aplicações a jusante). Como etapa final, depois de se livrar de etanol (com uma rotação de alta velocidade), ácidos nucleicos precisam ser reidratados usando um tampão de eluição (água ou tampão de baixa salinidade). A reidratação promove quebra de ligação do DNA e RNA da superfície de sílica e uma centrifugação final produz uma solução em que os ácidos nucleicos purificados são ressuspensos.
[002] Variações deste protocolo foram descritas em outros lugares, usando a força centrífuga ou vácuo como uma força motriz de fluxo de líquido. No entanto, todos estes métodos são bastante complicados e demorados, que compreende várias etapas de pipetagem e a aplicação sequencial de diferentes forças motrizes para controlar o fluxo de líquido, que geralmente produz uma variação elevada de rendimento entre processos de purificação repetidas.
[003] Por exemplo, em uma execução manual do protocolo de purificação por meio de vácuo, o processo de purificação consiste em 5 etapas principais, que correspondem ao fluxo de 5 líquidos diferentes através do filtro de sílica, ou seja: mistura da amostra contendo os ácidos nucleicos, tampão de lavagem 1 e tampão de lavagem 2 para enxaguar o filtro e eliminar quaisquer quantidades de contaminantes, ar para secar o filtro e eliminar quaisquer vestígios de contaminantes voláteis, e tampão de eluição para liberar os ácidos nucleicos do filtro, de modo que os NAs sejam disponíveis para aplicações a jusante (tais como a amplificação e detecção de qPCR). No final de cada etapa, a sucção a vácuo é mantida por um ou dois minutos, mesmo depois que o volume de líquido se escoa através do filtro, para garantir que quase nenhum líquido permanece dentro das fendas de filtragem antes de pipetar o próximo líquido.
[004] A reprodutibilidade do rendimento de ácidos nucleicos depende da possibilidade de reproduzir o tempo de contato da amostra e tampões com o filtro e a magnitude e distribuição do fluxo de líquido, que é dependente da perícia do operador.
[005] Portanto, é um objetivo da invenção proporcionar um dispositivo de purificação, que fornece resultados reprodutíveis de purificação independente do operador individual.
[006] Isto é realizado por um dispositivo de microfluidos e um método para a purificação de analitos biológicos ou químicos de uma amostra biológica complexa. O dispositivo de microfluidos compreende uma câmara, em que um filtro está incorporado, vários reservatórios e válvulas. O dispositivo pode ser interligado com bombas externas que são operados por um instrumento automatizado. O dispositivo e método aqui, portanto, proporcionam uma implementação de ponta a ponta automatizada do método clássico de purificação de ácido nucleico.
[007] A presente invenção se refere a um dispositivo de microfluidos tendo uma câmara encerrada contendo um filtro para purificar analitos biológicos ou químicos a partir de uma amostra biológica complexa, a dita câmara alojando uma pluralidade de orifícios em adição ao dito filtro, como se segue: um primeiro orifício permitindo comunicação de gás da câmara com um gerador de vácuo, por um primeiro trajeto de fluxo; um segundo orifício permitindo comunicação de líquido da câmara com um ou mais reservatórios, por um segundo trajeto de fluxo; um terceiro orifício permitindo comunicação de gás e de líquido da câmara com ambos um ou mais recipientes receptores e um gerador de vácuo, por um terceiro trajeto de fluxo; e um filtro localizado entre o terceiro orifício e ambos o primeiro e segundo orifício, para que um fluido entrando na câmara através do primeiro e/ou segundo orifício e saindo da câmara através do terceiro orifício flui através do filtro.
[008] A invenção aqui divulgada também se relaciona com um método de purificação de uma substância química ou biológica a partir de uma amostra biológica complexa usando o dispositivo de microfluidos aqui descrito, o método compreendendo as etapas de: (a) permitir que uma amostra de líquido entre na câmara através da segunda orifício pela aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a câmara e o primeiro reservatório, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de escoamento são abertos para as primeiras e segundas orifícios e fechada para o terceiro orifício; (b) permitir que a amostra flua através do filtro para um primeiro recipiente de recolha mediante a aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a referida primeira receber recipiente e da câmara, enquanto que as válvulas dentro das vias de fluxo são fechadas para o primeiro orifício, ventilado à pressão atmosférica durante o segundo orifício e aberto para o terceiro orifício; e (c) eluir-se o analito do filtro através da aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a câmara e um dos recipientes de recepção, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de escoamento estão abertas para as primeiras e segundas orifícios e fechadas para o terceiro orifício.
[009] A purificação pode, em princípio, ser baseada em qualquer efeito amplamente conhecido na cromatografia (por exemplo, deslocamento, afinidade, permuta catiônica, permuta aniônica, exclusão por tamanho, fase reversa e fase normal) e a sua escolha depende principalmente do analito a ser purificado. Exclusão por tamanho é, no entanto, menos preferida do que as outras técnicas, porque uma ligação permanente não pode ser alcançada no caso de a primeira técnica. Para esta última pode-se encontrar condições, sob as quais o analito a ser purificado é ligado seletivamente ao meio, enquanto que, idealmente, a outros constituintes da amostra passam através do meio sem ligação.
[0010] O dispositivo de microfluidos da presente invenção compreende uma câmara fechada que contém um filtro. Um filtro aqui significa um meio que interage diferencialmente com diferentes constituentes de uma amostra. Na cromatografia convencional tal meio geralmente seria chamado de uma fase estacionária. A interação diferencial (também chamado de particionamento) causará tempos de retenção diferenciais e, assim, um efeito de purificação, se uma amostra é movida em um tampão adequado (na cromatografia usualmente chamada fase móvel) através do referido meio.
[0011] O filtro utilizado no dispositivo aqui descrito é um que é adequado para a purificação de analitos biológicos ou químicos de uma amostra biológica complexa. O analito é a substância a ser purificada. Uma amostra biológica complexa é uma amostra que compreende, além do analito para os purificados, muitos constituintes diferentes de tamanhos variados e químicas variadas, tais como proteínas, ácidos nucleicos, hormonas, lípidos, sais. Um exemplo preferido é um lisado celular.
[0012] Em uma modalidade preferida, o filtro é feito de, ou pelo menos compreende, sílica. Por exemplo, o filtro pode estar na forma de uma membrana de sílica ou uma resina contendo ou grânulos de sílica ou grânulos revestidos de sílica. Superfícies de sílica são úteis para a separação ou a purificação de ácidos nucleicos, em particular de DNA. A sílica é conhecida por adsorver moléculas de DNA sob certas condições de sal e de pH e a adsorção de sílica tornou-se uma técnica importante para a purificação de ADN.
[0013] Em uma modalidade da invenção, o elemento de filtro está integrado na cavidade de purificação e fixado por um anel de fixação. Em uma modalidade preferida, os filtros de membrana de purificação são inseridos em uma cavidade, a qual faz parte do corpo do dispositivo de microfluidos, e o filtro de membrana é mantido na sua posição por um anel de fixação que o comprime. (Figura 2 A e D)
[0014] Em uma modalidade alternativa, a cavidade de purificação é uma parte separada que é montada no dispositivo de microfluidos e elimina a necessidade de um anel de fixação para manter o filtro de membrana no lugar. A cavidade de purificação em si fornece uma característica de aperto que fixa a cavidade e o filtro de membrana em posição, com a compressão da membrana correta (Figura 2 B e C).
[0015] Uma cavidade separada, a qual é mantida em posição, preferencialmente por uma característica de aperto, tem várias vantagens em comparação com cavidades compreendendo um anel de fixação:
[0016] Uma compressão reprodutível do filtro de membrana é realizada por uma característica de aperto. Isto garante uma compressão reprodutível, o que gera um fluxo reprodutível de líquidos através do filtro de membrana e, portanto, um rendimento reprodutível de ácidos nucleicos purificados ou outro analito purificado.
[0017] O posicionamento correto da cavidade de purificação no dispositivo de microfluidos é preferencialmente garantido pela sua característica de aperto, sem necessidade de controlar a quantidade de compressão, que é dada pelo projeto. Isto facilita a fabricação.
[0018] A cavidade de purificação elimina a necessidade de um anel de fixação, o que resulta em contaminação reduzida da amostra. Anéis de fixação interrompem o caminho fluídico e recolhem os restos de líquidos, o que cria uma contaminação entre tampões e resultados em uma certa quantidade de contaminantes no eluato purificado final, que pode inibir análise a jusante, tal como PC. Uma cavidade de purificação destacável cria uma transição suave nas suas paredes, que reduz a quantidade de contaminantes que podem ser presos à parede, tipicamente de 5 a 10 vezes
[0019] É preferido que os analitos sejam ácidos nucleicos. O termo ácido nucleico compreende mRNA (RNA mensageiro) na forma processada e não processada, tRNA (RNA de transferência), HN-RNA (RNA nuclear heterogênea), rRNA (RNA ribossomal), LNA (ácido nucleico bloqueado), mtRNA (Mitocondrial NA), nRNA (RNA nuclear), siRNA (RNA de interferência curta), snRNA (RNA nuclear pequeno), snoRNA (RNA nucleolar pequeno), scaRNA (RNA específica pequeno Cajal Body), microRNA, dsRNA (RNA de cadeia dupla), ribozima, riboswitch, ARN viral, dsDNA (DNA de cadeia dupla), ADNcs (DNA de cadeia simples), DNA de plasmídeo, DNA de cosmídeo, DNA cromossômico, DNA viral, o mtDNA (DNA mitocondrial), DNAn (DNA nuclear), snDNA (DNA nuclear pequeno) ou semelhantes, bem como todos os outros ácidos nucleicos concebíveis.
[0020] A câmara abriga uma pluralidade de orifícios além do referido filtro, como se segue: um primeiro orifício que permite a comunicação do gás da câmara com um gerador de vácuo, através de um primeiro trajeto de fluxo; um segundo orifício que permite a comunicação de líquido da câmara com um ou mais reservatórios, através de um segundo trajeto de fluxo; um terceiro orifício que permite a comunicação de gás e líquido da câmara com ambos um ou mais recipientes de recepção e um gerador de vácuo, através de um terceiro trajeto de fluxo.
[0021] O gerador de vácuo está localizado a montante da câmara. O um ou mais reservatórios também estão localizados a montante da câmara, mas em um outro caminho de fluxo que o gerador de vácuo. O um ou mais recipientes de recepção estão localizados a jusante da câmara. Mais a jusante do recipiente(s) de recepção está localizado o gerador de vácuo do terceiro trajeto de fluxo.
[0022] Os reservatório(s) geralmente compreendem pelo menos um reservatório que contém a amostra a ser purificada e, opcionalmente, um ou mais reservatórios compreendendo um ou mais tampões de lavagem e/ou um tampão de eluição e/ou um tampão de regeneração. O um ou mais recipientes geralmente compreendem, pelo menos, um recipiente para receber o analito e, opcionalmente, um ou mais recipientes para receber outros líquidos, por exemplo, o fluxo através de uma ou mais tampões de lavagem e/ou tampões de regeneração.
[0023] Um filtro está localizado entre o terceiro orifício e ambos o primeiro e segundo orifício, para que um fluido que entra na câmara através do primeiro e/ou segundo orifício e sai da câmara através do terceiro orifício flua através do filtro. Mais convenientemente, o filtro se expande através da seção transversal completa da câmara. Não é, no entanto, necessário que o meio preenche a altura total da câmara. Preferencialmente, o filtro é colocado diretamente sobre o terceiro orifício.
[0024] Prefere-se que o dispositivo seja um cartucho de microfluidos. Um cartucho significa um componente consumível que possa ser acionado por uma unidade de maiores dimensões através de uma interface apropriada. Usualmente, o aparelho contém componentes dispendiosos e/ou duráveis ou elementos que são fáceis de limpar, e uma peça de código de software para automatizar o controlo do processo. A unidade pode, alternativamente, compreender outros elementos para a realização de outros processos a montante ou a jusante da unidade de purificação.
[0025] Em uma modalidade, o dispositivo é descartável, o que significa que o dispositivo está concebido para uma única utilização, após o que é descartado. Em uma modalidade o dispositivo é reutilizável, o que normalmente necessita uma regeneração do dispositivo após cada utilização.
[0026] O dispositivo pode ainda compreender as válvulas idealmente, o gerador de vácuo é separado. O gerador de vácuo evacua a pressão da câmara, assim gerando uma pressão negativa relativa. Dependendo da configuração dos orifícios (ou seja, abertos ou fechados), um fluido é aspirado de um dos reservatórios para dentro da câmara e/ou para fora da câmara em um dos recipientes de recepção. Em uma modalidade preferida, o gerador de vácuo é uma bomba de seringa ou uma bomba de diafragma. Em uma outra modalidade preferida, o vácuo pode ser aplicado ao primeiro orifício e/ou o terceiro orifício com o mesmo gerador de vácuo.
[0027] Dispositivos microfluídicos conhecidos não incluem meios para a rastreamento da pressão no sistema. A presente invenção preferencialmente inclui um ou mais sensores de pressão. Um sensor de pressão é preferencialmente localizado no interior do terceiro trajeto de fluxo a montante dos recipientes de recepção. Um outro sensor de pressão é preferencialmente localizado dentro do primeiro trajeto de fluxo a jusante do gerador de vácuo. Os sensores de pressão acima podem ser utilizados para determinar a queda de pressão causada pelo filtro, que indica o estado fluídico do filtro. Deste modo, pode-se determinar (i) quando uma etapa do método é concluída assim minimizando tempo e tampões (por exemplo, quando o filtro está completamente seco durante uma etapa de secagem, quando o filtro está suficientemente purificado de sobras de líquido durante as etapas de purga, que vantajosamente acontecem depois do fluxo de cada líquido e antes de o fluxo do seguinte); (ii) se os líquidos já fluiram todos através do filtro, permitindo que o sistema aplique um aumento "just-in-time" da pressão de sucção se houver um aumento da resistência ao fluxo de líquido devido à densidade e viscosidade da amostra; (iii) se o filtro está entupido; e (iv) o tempo requisito para cada líquido fluir através do filtro, o que pode ser comparado com um limiar pré-determinado como um controlo para o processo de purificação.
[0028] Como descrito acima, o dispositivo descrito neste documento tem três orifícios para comunicação com a câmara: um primeiro orifício (orifício de saída de gás), um segundo orifício (abertura de entrada de líquido) e um terceiro orifício (abertura de saída de líquido/gás). Cada orifício pode ser aberto, fechado ou ventilado para a atmosfera individualmente através de uma válvula localizada no interior do respectivo trajeto de fluxo. Convenientemente, válvulas de multiorifícios são utilizadas e, se desejado, dois ou três orifícios acionados com a mesma válvula de multiorifícios. Prefere-se que o volume morto fechado pelo terceiro trajeto de fluxo entre a válvula correspondente e o filtro esteja entre 1μL e 10 mL. O fluxo controlado de líquidos (incluindo situação de ausência de fluxo para um humedecimento completo do filtro) é realizado através da aplicação de vácuo ao orifício apropriado e abrindo e fechando as válvulas adequadas em cada etapa. Isto confere uma reprodutibilidade maior ao dispositivo do que os dispositivos conhecidos, independentemente do tipo de amostra biológica.
[0029] Por exemplo, em um kit de purificação convencional com uma execução manual do protocolo de purificação por meio de vácuo, o processo de purificação consiste em cinco etapas principais, que correspondem ao fluxo de cinco líquidos diferentes através do filtro, ou seja, carregamento de uma mistura da amostra contendo os ácidos nucleicos, lavagem com tampão de lavagem 1 e tampão de lavagem 2 para enxaguar o filtro e eliminar quaisquer quantidades de contaminantes, secagem ao ar do filtro e eliminação de quaisquer vestígios de contaminantes voláteis, e eluição para liberar os ácidos nucleicos do filtro, a fim de ser ainda mais disponível para aplicações a jusante (tal como amplificação e detecção de qPC). No final de cada etapa, a sucção a vácuo é mantida por um ou dois minutos, mesmo depois que o volume de líquido se escoa pelo filtro, para garantir que quase nenhum líquido permaneça dentro das fendas do filtro antes de pipetar o próximo líquido, uma operação que é referida como "purga".
[0030] A fim de realizar o mesmo efeito, o protocolo automatizado compreende basicamente as mesmas etapas, os quais são realizados por ligação de cada orifício com os reservatórios apropriados e aplicação das diferenças de pressão apropriadas em todos os momentos, por meio de uma fonte de pressão (por exemplo, seringa ou bomba rotativa), um conjunto de válvulas, um conjunto de canais de microfluidos e um microcontrolador utilizando um software para automatizar todas as etapas.
[0031] O dispositivo de microfluidos aqui descrito é particularmente adequado para ser utilizado em métodos em que um ou mais analitos são para ser separados dos outros constituentes, ou seja, um método de purificação. Portanto, um outro objetivo da invenção é um método de purificação de um analito químico ou biológico a partir de uma amostra biológica complexa usando o dispositivo de microfluidos aqui descrito, o método compreendendo as etapas de: (a) permitir que uma amostra de líquido entre na câmara através do segundo orifício pela aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a câmara e o primeiro reservatório, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para os primeiros e segundos orifícios e fechada para o terceiro orifício; (b) permitir que a amostra flua através do filtro para um primeiro recipiente de recepção mediante a aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a referida primeira recipiente de recepção e a câmara, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são fechadas para o primeiro orifício, ventiladas à pressão atmosférica para o segundo orifício e abertas para o terceiro orifício; e (c) eluir-se o analito do filtro através da aplicação de uma diferença de pressão negativa entre a câmara e um dos recipientes de recepção, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para o primeiro e segundo orifício e fechadas para o terceiro orifício.
[0032] A pressão na etapa A pode ser gerada pelo gerador de vácuo localizado no primeiro trajeto de fluxo. A pressão na etapa B pode ser gerada pelo gerador de vácuo localizado no terceiro trajeto de fluxo.
[0033] A eluição na etapa C pode ser realizada em detalhe como se segue: i) permitir que um tampão de eluição contido em um terceiro reservatório entre na câmara através do segundo orifício por aplicar uma diferença de pressão negativa entre a câmara e o terceiro reservatório, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para o primeiro e segundo orifícios e fechadas para o terceiro orifício. A pressão pode ser gerada pelo gerador de vácuo localizado no primeiro trajeto de fluxo; e ii) permitir que o tampão de eluição esteja em contato com o filtro por um tempo predeterminado, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para o primeiro e segundo orifícios e fechadas para o terceiro orifício. Esta etapa permite a molhagem suficiente do filtro, a fim de liberar o analito desejado; e iii) permitir que o tampão de eluição (contendo o analito liberado) flua através do filtro para um segundo recipiente de recepção mediante a aplicação de uma diferença de pressão negativa entre o referido segundo recipiente da recepção e a câmara, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são fechadas para o primeiro orifício, ventiladas à pressão atmosférica para o segundo orifício e aberta para o terceiro orifício. A pressão pode ser gerada pelo gerador de vácuo do terceiro trajeto de fluxo.
[0034] Preferencialmente, o método compreende adicionalmente entre as etapas a e b a etapa de permitir que a amostra esteja em contato com o filtro por um tempo predeterminado, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para o primeiro e segundo orifícios e fechadas para o terceiro orifício.
[0035] O método pode compreender, opcionalmente, entre as etapas b e c um ou mais das seguintes etapas: (i) limpar e secar o filtro por um tempo predeterminado por aplicação de uma pressão negativa entre o terceiro trajeto de fluxo e a câmara, referida diferença de pressão negativa sendo gerada pelo gerador de vácuo localizado no terceiro trajeto de fluxo, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são fechadas para o primeiro orifício, ventiladas à pressão atmosférica para o segundo orifício e abertas para o terceiro orifício; e/ou (ii) permitir que um tampão de lavagem localizado em um segundo reservatório entre na câmara através do segundo orifício e flua através do filtro e para um recipiente de recepção por aplicar uma diferença de pressão negativa entre o referido reservatório receptor e o referido segundo reservatório, enquanto as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são abertas para o segundo e terceiro orifícios e fechadas para o primeiro orifício. A pressão pode ser gerada pelo gerador de vácuo localizado no terceiro trajeto de fluxo; e/ou (iii) permitir que o gás flua através do filtro para tempo predeterminado, por aplicar uma pressão negativa entre o terceiro trajeto de fluxo e a câmara, enquanto que as válvulas dentro dos trajetos de fluxo são fechadas para o primeiro orifício, ventiladas à pressão atmosférica para o segundo orifício e abertas para o terceiro orifício. O gás desloca o líquido e seca o filtro. A pressão pode ser gerada pelo gerador de vácuo localizado no terceiro trajeto de fluxo.
[0036] De preferência, a diferença de pressão é determinada para determinar quando uma ou mais válvulas são para ser mudadas e, assim, a próxima etapa do método é para ser realizada. Uma queda de pressão através do filtro indica que as válvulas podem ser atuadas para executar a próxima etapa do método.
[0037] É mais preferido que o fluxo de gás seque o filtro seja aplicado somente se o valor da primeira derivada da diferença de pressão entre o primeiro e segundo sensor de pressão é abaixo de um valor de limite predefinido.
[0038] A tabela 1 detalha um exemplo das etapas do método a serem executadas por um processo de purificação por meios automatizados. Diagramas fluídicos na figura mostram a configuração de orifício/válvula para cada uma das referidas etapas. Tabela 1. Protocolo detalhado para um exemplo de um processo de purificação.
[0039] A invenção tem a vantagem que automação total pode ser realizada e nenhuma manipulação manual é necessária para a conclusão do processo de purificação, assim realizando resultados reprodutíveis. Além disso, o dispositivo/processo de purificação pode ser ligado a outros dispositivos/processos a montante ou a jusante (por exemplo, lise, amplificação e detecção). Em contraste com a técnica prévia, líquidos são movidos para a câmara e para cima do filtro por meio de vácuo aplicado ao primeiro orifício, enquanto o terceiro orifício é fechado. Isto impede fluxo através do filtro enquanto permite pré-umidificação do filtro para um tempo de incubação predeterminado. Líquidos são movidos através do filtro por meio de um vácuo aplicado ao terceiro orifício, depois de abrir a válvula desse orifício. Tomados juntos, rendimentos de ácido nucleico iguais ou superiores são obtidos em comparação com métodos conhecidos. Legendas das Figuras
[0040] A Fig. 1 mostra uma coluna de purificação (1) de um kit comercial para purificação manual que consiste em um corpo de plástico (2) e um filtro de membrana (3) comprimido e mantido no lugar por um anel de fixação (10). O corpo de plástico compreende uma entrada de líquido (4) e uma saída de líquido (5).
[0041] A Fig. 2A mostra parte de um dispositivo de microfluidos (100) com uma cavidade de purificação integrada (101), e um filtro de membrana (3) mantido no lugar por um anel de fixação (10).
[0042] A Figura 2B mostra uma vista girada para o dispositivo de microfluidos (100) com uma cavidade de purificação integrada (101), e um filtro de membrana (3) mantido no lugar por um anel de fixação (10). O orifício de gás (102), orifício de entrada de líquido (103) e orifício de saída (104) ligados à cavidade de purificação (101) também são mostrados.
[0043] A Fig. 2C mostra uma cavidade de purificação separada (200).
[0044] A Fig. 2D mostra uma cavidade de purificação (200), montada em um dispositivo de microfluidos (100). A característica de aperto (201) mantém a cavidade de purificação (200) no lugar e aplica a compressão certa para o filtro de membrana (3). O orifício de gás (203), orifício de entrada de líquido (204) e orifício de saída (205) também são mostrados.
[0045] A Fig. 2E ilustra a configuração de orifícios e a direção do fluxo durante o carregamento de líquido (etapa 1) e lavagem/eluição (etapa 2). Seta sólida indica fluxo de líquido; seta pontilhada indica fluxo de gás; X indica orifício fechado por válvula.
[0046] As Fig. 3 a 11: diagramas fluídicos detalhados, mostrando a configuração de orifício/válvula para cada uma das etapas detalhadas na tabela 1. É para ser entendido que o dispositivo da presente invenção pode, mas não necessariamente compreende cada um dos elementos da figura. A descrição e/ou reinvindicações denotam os elementos essenciais. Além dos elementos referidos um ou mais elementos opcionais adicionais podem ser escolhidos independentemente uns dos outros. Os elementos opcionais são indicados a seguir. 1: gerador de vácuo 1 (por exemplo, bomba de seringa); 2: gerador de vácuo 2 (opcional, por exemplo, bomba de diafragma); 3 - 7: válvulas (por exemplo, as válvulas de múltiplos orifícios); 8 e 9: sensores de pressão (opcional); 10: câmara; 11: anel de fixação (opcional); 12: filtro; 13: recipiente de recepção de resíduos (opcional); 14: recipiente de recepção de eluatos; 15: reservatório de amostra; 16 - 17: reservatórios (opcional); 18: reservatório de tampão de eluição.
Claims (17)
1. Dispositivo microfluídico, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ou mais reservatórios (16, 17) a montante de uma cavidade de purificação (200); (b) um ou mais recipientes receptores de resíduo (13), a jusante da cavidade de purificação; (c) a cavidade de purificação definindo uma coluna fechada com forma cônica e interior oco configurada para ser destacável do dispositivo microfluídico, a cavidade de purificação separada e não continua com nenhuma das reservas ou recipientes receptores compreendendo: (i) um primeiro orifício (203) permitindo comunicação de gás da cavidade de purificação com um gerador de vácuo, por um primeiro trajeto de fluxo; (ii) um segundo orifício (204) permitindo comunicação de líquido da cavidade de purificação com o um ou mais reservatórios, por um segundo trajeto de fluxo; e (iii) um terceiro orifício (205) permitindo comunicação de gás e de líquido da cavidade de purificação com ambos os um ou mais recipientes receptores e um gerador de vácuo (1), por um terceiro trajeto de fluxo; em que o primeiro, segundo e terceiro orifícios são posicionados em uma superfície periférica externa da cavidade de purificação, e (d) um filtro (3) abrangendo uma seção transversal da cavidade de purificação ortogonal à direção do fluxo do líquido, configurado para purificar analitos biológicos ou químicos a partir de uma amostra biológica complexa e localizado adjacente ao terceiro orifício de modo que o fluido entrando na cavidade de purificação através do primeiro e/ou segundo orifício e saindo do fundo da cavidade de purificação através do terceiro orifício flua através do filtro.
2. Dispositivo microfluídico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo microfluídico é um cartucho microfluídico e é descartável ou reutilizável.
3. Dispositivo microfluídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os analitos a serem purificados são ácidos nucleicos.
4. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o filtro compreende sílica.
5. Dispositivo microfluídico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o filtro compreende uma membrana de sílica ou uma resina contendo grânulos de sílica ou grânulos revestidos com sílica.
6. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cavidade de purificação compreende uma característica de aperto (201) configurada para fixar a posição da cavidade de purificação no dispositivo microfluídico.
7. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o gerador de vácuo é uma bomba de seringa, uma bomba de diafragma ou uma combinação delas.
8. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que vácuo pode ser aplicado ao primeiro orifício e/ou terceiro orifício com o mesmo gerador de vácuo.
9. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que um sensor de pressão (9) está localizado dentro do terceiro trajeto de fluxo a montante dos recipientes receptores.
10. Dispositivo microfluídico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que outro sensor (8) de pressão está localizado dentro do primeiro trajeto de fluxo entre a cavidade de purificação e o gerador de vácuo.
11. Dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os orifícios podem ser individualmente abertos, fechados ou ventilados para a atmosfera por meio de uma ou mais válvulas de múltiplos orifícios (3-7) dentro dos seus trajetos de fluxo.
12. Dispositivo microfluídico de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o volume morto encerrado pelo terceiro trajeto fluídico entre sua válvula correspondente e o filtro está entre 1μL e 10 mL.
13. Método para purificar um analito biológico ou químico a partir de uma amostra biológica complexa usando o dispositivo microfluídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o método caracterizado pelo fato de compreende as etapas de: (a) permitir que uma amostra líquida entre na cavidade de purificação através do segundo orifício aplicando uma diferença de pressão negativa entre a cavidade de purificação e um primeiro reservatório; (b) permitir que a amostra flua através do filtro para um primeiro recipiente receptor aplicando uma diferença de pressão negativa entre o dito primeiro recipiente receptor e a cavidade de purificação; e (c) eluir o analito a partir do filtro aplicando uma diferença de pressão negativa entre a cavidade de purificação e um dos recipientes receptores.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a eluição na etapa c é realizada como se segue: (i) permitir que um tampão de eluição contido em um terceiro reservatório entre na cavidade de purificação através do segundo orifício aplicando uma diferença de pressão negativa entre a cavidade de purificação e o terceiro reservatório; (ii) permitir que o tampão de eluição esteja em contato com o filtro por um tempo de incubação predeterminado; e (iii) permitir que o tampão de eluição flua através do filtro para um segundo recipiente receptor aplicando uma diferença de pressão negativa entre o dito segundo recipiente receptor e a cavidade de purificação.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente entre as etapas a e b a etapa de permitir que a amostra esteja em contato com o filtro por um tempo de incubação predeterminado.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente entre as etapas b e c uma ou mais das seguintes etapas: (i) limpar e secar o filtro por um tempo predeterminado aplicando uma pressão negativa entre o terceiro trajeto de fluxo e a cavidade de purificação; e/ou (ii) permitir que um tampão de lavagem localizado em um segundo reservatório entre na cavidade de purificação através do segundo orifício e flua através do filtro e em um recipiente receptor aplicando uma diferença de pressão negativa entre o dito reservatório receptor e o dito segundo reservatório; e/ou (iii) permitir que gás flua através do filtro por um tempo predeterminado, aplicando pressão negativa entre o terceiro trajeto de fluxo e a cavidade de purificação.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o acionamento de uma ou mais válvulas de multiorifícios dentro do primeiro trajeto de fluxo, do segundo trajeto de fluxo, e do terceiro trajeto de fluxo por uma diferença de pressão.
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