BR112016027198B1 - Método para tratar água usada em uma aplicação de aquacultura - Google Patents
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Abstract
um método para tratar e melhorar a qualidade da água de uma lagoa usada para cultura de espécies aquáticas para aplicações de aquacultura adicionando à água da lagoa bactérias ativas que são preferivelmente cultivadas no local em combinação com um agente de intensificação de nitrificação, tal como carbonato de cálcio ou algas marinhas calcificadas, e um modificador de área de superfície de reação, tal como algas marinhas calcificadas ou partículas ou fragmentos de plástico ou metal.
Description
“MÉTODO PARA TRATAR ÁGUA USADA EM UMA APLICAÇÃO DE AQUACULTURA”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119 (e) do
Pedido Provisório US No. 62/002.476 depositado em 23 de maio de 2014.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
1. Campo da invenção [002] Esta invenção refere-se ao tratamento de água de lagoa de aquicultura para reduzir o desperdício orgânico, amônia e a pressão de doença em uma aplicação de animal de água.
2. Descrição da técnica relacionada [003] A aquicultura refere-se à criação de espécies aquáticas que são utilizadas como uma fonte de alimento humana ou animal. A técnica aplica alguns tipos de controle ao ambiente natural das espécies criadas para melhorar colheitas gerais. Isto pode incluir a incubação artificial de espécies para aumentar a colheita comercial de animais no meio selvagem, incubação e criação da espécie em lagoas fechadas e a incubação e criação de espécies em áreas fechadas drenadas de forma tidual adjacentes à costa. Os problemas associados a este processo incluem: a poluição que é descarregada da instalação de criação e irá deteriorar a qualidade da água ao redor; perda de produto devido à qualidade da água deteriorada na instalação de captação; e aumento da pressão da doença associada com microrganismos patogênicos na instalação de criação. Tais problemas podem ser identificados por meio de testes ou monitoramento de uma variedade de parâmetros, incluindo pH, condutividade, amônia, nitrato, fosfato e alcalinidade. A condutividade é um indicador do teor de sal, quantidades superiores a 1200 ppm já não são consideradas água doce; uma quantidade ideal é de 700 ppm e varia de 300 a 1200 ppm. Os níveis de amônia medem a quantidade de oxigênio disponível para os peixes. Níveis elevados de amônia bloqueiam a transferência de
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 24/48 / 19 oxigênio no peixe das brânquias para o sangue; no entanto, é também um produto de seus resíduos metabólicos. Enquanto a amônia de resíduos de peixe muitas vezes não é suficientemente concentrada para ser tóxica em si, os piscicultores devem monitorar de perto os níveis de amônia devido à alta concentração de peixes por lagoa. O oxigênio é consumido por bactérias nitrificantes na lagoa que quebram a amônia tóxica para uma forma não tóxica; entretanto, este uso maciço do oxigênio reduz o oxigênio disponível para a captação pelo peixe. Níveis de amônia > 1 ppm são considerados tóxicos para a vida dos peixes. Adicionalmente, os níveis de nitrato são examinados para determinar a quantidade de fertilizante vegetal na água. Nitrato é altamente lixiviável do solo circundante e pode ser prejudicial para as crianças pequenas e mulheres grávidas. Nitrato torna-se nitrito no trato GI e interage com a capacidade do sangue para transportar oxigênio. O nível máximo de contaminação por nitrato é de 10 ppm. A alcalinidade é a medida da capacidade de uma lagoa ou lago para neutralizar o ácido sem uma mudança no pH. Alcalinidade irá diminuir ao longo do tempo devido a bactérias; no entanto um nível ideal é de 100 ppm com intervalo aceitável de 50 a 200 ppm. O fosfato encontrado em lagoas e lagos são em grande parte de resíduos humanos e animais. Fertilizante run-off é uma importante fonte de fosfato encontrado em campo de golfe e lagoas decorativas. Níveis elevados provocam um aumento da taxa de eutrofização, o que, por sua vez, aumenta a produção de lamas. Níveis de moderação de fosfato podem estimular o crescimento das plantas causando um aumento na produção de algas; níveis de > 0,1 ppm é uma indicação de crescimento acelerado das plantas e é considerado fora dos níveis aceitáveis.
[004] As tecnologias atuais para resolver estes problemas incluem biorremediação, antibióticos e aditivos químicos. As tecnologias típicas de biorremediação incluem a aplicação de bactérias suplementares à água para melhorar as atividades microbiológicas para melhorar a qualidade da água. É
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 25/48 / 19 também conhecida a utilização de nitrifícadores para melhorar o processo de nitrifícação para converter a amônia tóxica em nitrato não tóxico. Aditivos químicos são adicionados para melhorar a qualidade da água e auxiliar as atividades microbiológicas, fornecendo nutrientes extras e alcalinidade. São adicionados antibióticos para inibir o crescimento dos microrganismos patogênicos. Os problemas associados às tecnologias atuais incluem o alto custo e o mau desempenho da melhoria da qualidade da água com as bactérias suplementares inativas, atividades de baixa nitrificação devido à existência de resíduos orgânicos e falta de locais de cultivo nitrificantes, bioacumulação de antibióticos nas espécies aquáticas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] O método da invenção proporciona uma abordagem econômica para libertar bactérias ativas para a água de lagoa (ou uma lagoa de cultura) em uma instalação de aquacultura para degradar o resíduo orgânico e inibir o crescimento de microrganismos patogênicos sem bioacumulação. O método da invenção reduz a pressão da doença nos animais de água, resultando em colheitas melhoradas das espécies criadas na operação de aquicultura. A adição de um agente de intensificação de nitrificação como aqui descrito como parte do método proporciona uma fonte de alcalinidade estável e local de crescimento extra para o nitrificador para promover a atividade de nitrificação e redução de amônia.
[006] O método da invenção inclui desejavelmente a administração de bactérias ativas, incluindo opcionalmente uma bactéria probiótica, mais preferencialmente gerada a partir de um biogerador no local utilizando material de partida de bactérias sólido, em uma aplicação de aquacultura. Tais biogeradores e os seus métodos de utilização estão descritos, por exemplo, nas patentes dos Estados Unidos da América Nos 6.335.191; 7.081.361; 7.635.587; 8.093.040; e 8.551.762, cujos conteúdos são incorporados por referência nesta descrição para facilitar a prática da invenção.
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Adicionalmente, uma composição probiótica e um sistema de liberação tal como divulgado no pedido US No. de série 14/524 858 depositado em 27 de outubro de 2014, que é aqui incorporado por referência, é uma composição probiótica preferida e sistema de liberação para essa composição, mas outros probióticos e sistemas de liberação podem ser utilizados.
[007] As bactérias vegetativas ativas descarregadas do biogerador podem ser fornecidas diretamente para lagoas de crescimento ou podem ser acumuladas e diluídas com água da lagoa ou outro diluente apropriado de forma semelhante, tal como água de um sistema de água municipal, antes de descarregar para lagoas de cultura. A diluição pode auxiliar no fornecimento da solução de tratamento que flui do biogerador para a lagoa de cultura, se o biogerador estiver localizado a alguma distância da lagoa de cultura. As bactérias ativas irão degradar os resíduos orgânicos e inibirão o crescimento dos microrganismos patogênicos na água das instalações aquícolas, sem necessidade de adição (ou redução da quantidade) de tratamentos químicos e antibióticos utilizados na lagoa de cultura. A invenção também deseja incluir, de forma desejável, a aplicação simultânea de pelo menos um agente de intensificação de nitrificação nas lagoas de crescimento. Agentes de intensificação de nitrificação aumentam a atividade de bactérias nitrificantes naturalmente encontradas na água para diminuir o nível de amônia. Estes agentes de nitrificação compreendem agentes de intensificação da alcalinidade que aumentam a alcalinidade da água, que é necessária para a nitrificação (7 partes de alcalinidade para 1 parte de amônia) e/ou agentes modificadores da área de superfície para adicionar superfícies para que as bactérias nitrificantes cresçam, desde que bactérias nitrificantes cresçam como biofilmes e precisam de superfícies às quais podem ser conectadas. Os agentes de intensificação da alcalinidade podem incluir, por exemplo, carbonato de cálcio, algas calcificadas ou outros aditivos semelhantes. Estes agentes podem ser adicionados a uma quantidade superior à dissolução para
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 27/48 / 19 proporcionar uma fonte contínua de alcalinidade à medida que se dissolvem lentamente. Certos agentes de nitrifícação, tais como algas calcificadas, algas marinhas atuam tanto como um agente de intensificação de alcalinidade e um agente modificador de área de superfície, proporcionando tanto alcalinidade como área superficial elevada, proporcionando uma superfície de suporte para biofilmes de nitrificadores a crescerem. As algas calcificadas também atuam como fonte de micronutrientes para as bactérias. Outros agentes de intensificação da nitrificação atuam apenas como agentes modificadores da área de superfície, tais como peças de plástico ou de metal, ou outros materiais similarmente eficazes para aumentar a área de superfície sobre a qual podem ocorrer reações e interações favoráveis. Um ou mais agentes que atuam apenas como modificadores da área de superfície (e não intensificadores da alcalinidade) podem também ser adicionados à lagoa de cultura, quer sozinhos quer preferencialmente em combinação com um ou mais agentes de intensificação da alcalinidade; contudo, um agente que atua apenas como um intensificador da área de superfície não se degrade na lagoa de cultura e não seja adicionado a cada batelada de solução de bactérias. Tais agentes que atuam apenas como modificadores da área de superfície seriam preferencialmente adicionados apenas uma vez a uma lagoa de cultura. Agentes que agem como agentes de intensificação da alcalinidade seriam adicionados à lagoa de cultura contemporaneamente com uma batelada de bactérias em uma base periódica, tal como sazonalmente (uma vez por estação ou uma vez em cada verão, duas vezes por ano, etc.) ou conforme necessário. Tal como aqui utilizado, o termo contemporâneo pretende significar a ou cerca do tempo em que um a batelada de bactérias vegetativas e outros componentes ou agentes são adicionados à lagoa de cultura ou outro meio de crescimento em que as espécies aquáticas são cultivadas em uma instalação de aquacultura.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 28/48 / 19 [008] Os gráficos que mostram os resultados de um estudo laboratorial são apresentados nas seguintes figuras:
Figura 1 é um gráfico dos níveis de nitrato; Figura 2 é um gráfico dos níveis de orto-fosfato; Figura 3 é um gráfico de turbidez.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS [009] Acredita-se que os gêneros de bactérias adequados para utilização no método da invenção incluem uma ou mais espécies do gênero Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Lueconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Megasphaera, Pseudomonas e
Propionibacterium. As bactérias probióticas que podem ser geradas no local incluem qualquer uma ou mais das seguintes: Bacillus amylophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacteriodes ruminocola, Bacteriodes ruminocola, Bacterioides suis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Enterococcus cremoris, Enterococcus diacetylactis, Enterococcus faecium, Enterococcus intermedius, Enterococcus lactis, Enterococcus thermophiles, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgancus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Leuconostoc mesenteroides, Megasphaera elsdennii, Pediococcus acidilacticii, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus pentosaceus, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii, e Propionibacterium shermanii.
[0010] Um dispositivo de distribuição e de crescimento de bactérias satisfatório para utilização no método da invenção incluirá um biogerador no local como referido acima ou qualquer outra fonte igualmente eficaz para as
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Ί / 19 bactérias. Mais preferencialmente, o biogerador no local utiliza material de partida de bactérias sólidas para gerar uma solução de bactérias a ser descarregada para a lagoa de cultura, com a solução possuindo preferencialmente cerca de 1x109 a 1 x 1010 cfu/ml de espécies de bactérias vegetativas. Vários biogeradores podem ser proporcionados para fornecer grandes quantidades de bactérias para a lagoa de cultura, para proporcionar diferentes espécies de bactérias para a lagoa de cultura ou em momentos diferentes ou de taxas, ou para o espaço fora da descarga de uma solução de bactérias em torno do perímetro da lagoa de cultura para auxiliar na dispersão das bactérias através da lagoa. Uma bomba ou outro dispositivo de mistura pode também ser adicionado à lagoa de cultura (se não já no lugar) para auxiliar na dispersão da solução de bactérias (e intensificadores de nitrificação ou intensificadores da área de superfície) ao longo da lagoa de cultura. O biogerador no local é de preferência configurado para conter uma quantidade de material de partida de bactérias em forma sólida ou líquida e misturada com nutrientes de modo a que várias bateladas de uma solução de bactérias podem ser descarregadas em intervalos periódicos ao longo de um período prolongado de tempo antes de o material de partida precisa ser reabastecido. Por exemplo, o biogerador pode conter cerca de 37 gramas de material de partida contendo 1x108 cfu/g para descarregar uma solução de bactérias contendo cerca de 1 x1010 cfu/ml uma vez a cada 24 horas durante 60 dias. Nutrientes e água são adicionados no biogerador, juntamente com o material de partida para crescer uma batelada de solução de bactérias para ser periodicamente descarregada para a lagoa de cultura. Mais preferencialmente, é utilizada uma fonte de água estéril ou tratada (tal como água potável de um abastecimento de água municipal) para fornecer água ao biogerador. Podem também ser utilizadas fontes de água no local, tais como a lagoa de cultura, mas as bactérias já presentes nessa água (e mesmo níveis baixos de bactérias na água de um abastecimento de água municipal) podem competir com as
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8/19 bactérias no material de partida enquanto crescendo no biogerador, resultando em uma batelada menor de cfu/ml das bactérias benéficas e uma proliferação de bactérias nocivas. Um material de partida preferido é de FREE FLOW em pelotas ou FREE FLOW líquido e nutrientes BioAmp comercialmente disponíveis a partir EcoBionics e FlexFill respectivamente, mas também podem ser utilizados outros materiais de partida, dependendo das espécies de bactérias desejadas.
[00011] De preferência, uma solução de bactérias é descarregada do biogerador ou biogeradores uma vez a cada 12 a 36 horas e mais preferencialmente cerca de uma vez a cada 24 horas para a lagoa de cultura durante o curso de um ciclo de tratamento. Mais preferencialmente, cerca de 3000 ml de solução de bactérias contendo cerca de lxlO10 cuf/ml dosados em tomo de uma vez a cada 24 horas serão suficientes para tratar uma lagoa de cultura contendo 100.000 galões de água (cerca de 0,079 1 de solução por 10.000 1 de água na lagoa de cultura). Outros volumes de solução de bactérias e intervalos de dosagem podem ser utilizados para tratar lagoas de cultura de diferentes tamanhos como será compreendido pelos peritos na técnica. Um ciclo de tratamento é de preferência contínuo com o biogerador funcionando ao longo do ano (com exceção de paragens periódicas para manutenção ou reabastecimento do iniciador de bactérias e nutrientes). Podem ser utilizados outros intervalos de dosagem e quantidades de solução de bactérias, dependendo das condições da lagoa, das espécies aquáticas envolvidas, da temperatura da lagoa de cultura e de outros fatores que serão entendidos pelos especialistas na técnica.
[00012] As bactérias geradas no local no biogerador podem incluir uma ou mais bactérias probióticas. Além de bactérias geradas no local no biogerador, uma solução probiótica compreendendo qualquer bactéria probiótica conhecida (tal como Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus ou Bacillus subtilis), um tensoativo adequado para ingestão por animais e espécies aquáticas (tais como Polysorbate 80), pode ser adicionado um
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9/19 conservante (tal como sorbato de potássio de ácido sórbico, sorbato de sódio, sorbato de cálcio, benzoato de sódio ou ácido enzoico) e um espessante (tal como goma de guar ou goma xantana) em água (mais preferencialmente água estéril) à lagoa de cultura. Tais composições probióticas, e métodos de distribuição para essas composições, são divulgados no pedido de patente US No. 14/524.858 depositado em 27 de outubro de 2014, o qual é aqui incorporado por referência.
[00013] Com pelo menos uma dose (ou batelada) de solução de bactérias descarregada para a lagoa de cultura, um ou mais agentes de intensificação de nitrificação são de preferência adicionados contemporaneamente. Podem ser adicionados periodicamente agentes de aumento da alcalinidade, incluindo carbonato de cálcio ou algas calcificadas, tal como sazonalmente ou conforme necessário para reduzir fosfatos, e não com cada dose de bactérias. Os agentes podem ser adicionados a uma quantidade superior à dissolução para proporcionar uma fonte contínua de alcalinidade à medida que se dissolvem lentamente. Os agentes de intensificação de alcalinidade de dissolução lenta, tais como algas calcificadas, também atuam como um modificador de área de superfície, proporcionando uma superfície de suporte para biofilmes de bactérias nitrificantes para crescer e também ajudam na distribuição de nutrientes. Adicionalmente, agentes que atuam apenas como modificadores da área de superfície (tais como pedaços de metal ou plástico) podem ser adicionados à lagoa de cultura conforme necessário para reduzir o nitrogênio ou fósforo, juntamente com uma solução de batelada ou dose de bactérias e um ou mais agentes de intensificação da alcalinidade, mas são preferencialmente adicionados apenas uma vez e não com cada dose de solução de bactérias. Estes agentes de intensificação de superfície proporcionam de forma semelhante uma superfície de suporte para biofilmes das bactérias adicionadas para cultivar, o que ajuda no desenvolvimento mais rápido das
Petição 870180143348, de 22/10/2018, pág. 12/20 / 19 bactérias benéficas. Mais preferencialmente, cerca de 100 libras (45,36 kg) de tais agentes de intensificação de nitrificação são adicionadas por 7,5 milhões de galões (28.390,59 m3) da lagoa de cultura, e esta quantidade pode ser escalonada para outros volumes de lagoa de cultura. Os métodos de dispersão preferidos para os agentes de intensificação da nitrificação podem incluir a utilização de dispositivos automatizados ou aplicação manual à água nas lagoas de cultura. Os dispositivos automatizados ou de acionamento manual úteis para a radiodifusão ou de outro modo dispersar pelo menos um agente de intensificação da nitrificação na forma de grânulos, glóbulos ou partículas estão comercialmente disponíveis e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Adicionalmente, estes agentes de intensificação da nitrificação podem ser dispersos através de uma lagoa utilizando o sistema e método de aditivo autodispersante, que emprega materiais efervescentes juntamente com o agente de tratamento em embalagens solúveis em água, descrito no pedido de patente US N0. 14/689.790 depositado em 17 de abril de 2015, que é aqui incorporado por referência.
[00014] As aplicações adequadas para o método da invenção incluem, por exemplo e sem limitação, vários tipos de aplicações de aquacultura tais como criadouros, lagoas e aquicultura de fluxo de maré. A utilização combinada de bactérias vegetativas, de preferência cultivadas no local, e pelo menos um auxiliar de intensificação da nitrificação, tal como carbonato de cálcio, algas calcificadas ou outro material que sejam igualmente eficazes para tratamento rentável de água utilizada em aplicações de aquacultura para tratar resíduos orgânicos, amônia e microrganismo patogênico, bem como problemas gerais de qualidade da água. Acredita-se que a eficácia do presente método para atingir estes objetivos é ainda melhorada pela adição de algas calcificadas ou outras peças de plástico ou de metal, partículas ou fragmentos que aumentam a área de superfície disponível sobre a qual podem ocorrer interações ou reações.
Petição 870190021859, de 07/03/2019, pág. 10/13
11/19 [00015] Foi realizado um estudo de laboratório para avaliar os benefícios da adição de bactérias benéficas e agentes de intensificação da nitrificação à água da lagoa. Um dos objetivos do estudo foi avaliar a eficácia de bactérias adicionadas (mistura para lagoas comercialmente disponíveis da EcoBionics) como inibidor ou herbicida contra a produção de algas. Este estudo empregou o uso de seis béqueres de 2 litros, cada um cheio com 1,5 1 de água de origem retirada de um tanque de peixes estabelecido com algas presentes. Cada béquer também continha um peixe de ouro do tanque de origem, pedra de ar, fonte de luz que alternava 12 horas em seguida, 12 horas de folga, e tampa de vidro do relógio para reduzir a perda de evaporação. Uma solução de bactérias de mistura de lagoas foi gerada num biogerador BIO-Amp™ utilizando 37 g de pastilhas Pond Plus após um ciclo de crescimento de 24 horas no biogerador, uma alíquota de solução de bactérias foi obtida e diluída para manter uma razão de 3 1 de mistura da lagoa : 579024 galões de água da lagoa (0,079 1 de mistura da lagoa por 57.643 1 de água na lagoa de cultura), no entanto, uma proporção preferida a ser empregada no campo é 3 1 de mistura da lagoa: 100.000 galões de água da lagoa (0,079 1 de mistura da lagoa por 10.000 1 de água na lagoa de cultura). Com base nesta proporção, foram adicionados cerca de 0,4 μΐ de solução de bactérias de mistura de lagoas a específicos dos béqueres com 1,5 1 de água de tanque de peixes. Alga calcificada, foi adicionada a béqueres específicos de acordo com instruções do fabricante com base em taxas de clarificação; o que equivale a 0,045 g de alga calcificada por 1,5 1 de água. Uma quantidade igual de carbonato de cálcio foi adicionada a alguns dos béqueres. Os aditivos em cada béquer foram os seguintes:
TABELA 1
| Béquer 1 | 0,4 μί de mistura da lagoa e 1,5 1 de água da fonte somente |
| Béquer 2 | 0,045 g de alga calcificada e 1,5 1 de água da fonte somente |
| Béquer 3 | 0,4 μΐ de mistura da lagoa, 0,045 g de alga calcificada, e 1,5 1 de água da fonte somente |
| Béquer 4 | 0.045 g de carbonato de cálcio e 1,5 1 de água da fonte somente |
| Béquer 5 | 0,4 μΐ de mistura da lagoa, 0,045 g de carbonato de cálcio, e 1,5 1 de água da fonte |
| Béquer 6 | Servido como o controle negativo e continha somente 1,5 1 de água da fonte |
[00016] Cada béquer de ensaio foi tratado de acordo com um esquema de dosagem preferido que seria utilizado no campo. Os béqueres 1, 3 e 5 com
Petição 870180143348, de 22/10/2018, pág. 13/20 / 19 mistura da lagoa seriam tratados (dosados) uma vez por semana com um adicional de 0,4 pl de mistura da lagoa. Dependendo das condições da lagoa de cultura, outros esquemas de dosagem podem ser usados no campo. As algas calcificadas e o carbonato de cálcio foram adicionados apenas uma vez no início deste estudo, no entanto, a dosagem adicional pode ser utilizada no campo.
[0017] Uma amostra de pré-tratamento (antes da adição de solução de bactéria de mistura da lagoa, algas calcificadas ou carbonato de cálcio) foi retirada de cada béquer e analisada para obter uma linha de base para comparação com os resultados pós-tratamento. A análise química foi realizada uma vez por semana utilizando amostras de 200 a 300 ml de cada béquer. Estas medições semanais incluíram análise de pH, condutividade, nitrato, orto fosfato, alcalinidade total e níveis de amônia. Uma vez por mês a turbidez foi examinada e foram tiradas fotografias para avaliar alterações no crescimento de algas e clareza total. O tratamento e a análise dos béqueres foram continuados durante um total de três meses; novamente para espelhar o comprimento do estudo de campo.
[0018] A análise de dados foi realizada utilizando Excel 2003, utilizando um teste t de duas caudas com duas amostras comparando os números de pré-tratamento versus pós-tratamento com um nível de confiança de 95%. As duas amostras de teste t de duas caudas testaram a hipótese nula de nenhuma diferença nas médias de pré e pós-tratamento com uma hipótese alternativa de haver uma diferença nas médias.
Ho = μ pré-tratamento = μ pós-tratamento HA = μ pré-tratamento / μ pós-tratamento [0019] As leituras de linha de base indicaram níveis elevados de fosfato em todos os béqueres, de mais de 40 vezes do nível indicativo de crescimento acelerado de algas. Todas as outras medições estavam dentro de intervalos aceitáveis.
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 35/48 / 19
TABELA 2 - Resultados de teste T de duas amostras para Nitrato e Fosfato
| Béquer | Valor p de nitrato | % de redução de nitrato | Valor p de fosfato | % de redução de fosfato |
| 1 (mistura da lagoa somente) | 0,88 | 20 | 0,47 | 38 |
| 2 (alga calcificada somente) | 0,01* | 79 | 0,02* | 73 |
| 3 (mistura da lagoa + alga calcificada) | 0,04* | 76 | 0,07 | 66 |
| 4 (carbonato de cálcio somente) | 0,03* | 77 | 0,05 | 66 |
| 5 (mistura da lagoa + carbonato de cálcio) | 0,24 | 52 | 0,02* | 72 |
| 6 (controle) | 0,90 | aumenta 25 | 0,68 | 19 |
* Indica um resultado significativo [0020] O béquer de teste contendo apenas os grânulos de mistura bacteriana não mostrou nenhuma alteração estatisticamente significativa ao longo do período de estudo de três meses. Os níveis de fosfato diminuíram ao fim de duas semanas, mas no período de um mês voltaram aos níveis anteriores ao tratamento. Nitrato níveis espelharam aqueles do fosfato. De todos os béqueres de teste, apenas o béquer 1 apresentou níveis de nitrato e fosfato semelhantes ao controle negativo. Isto indica um efeito mínimo sobre os principais indicadores químicos da saúde da lagoa quando se utiliza apenas bactérias.
[0021] Os dois béqueres contendo algas calcificadas apresentaram alterações estatisticamente significativas nos meios pré versus pós-tratamento. Houve uma queda significativa nos níveis de nitrato de 79% e 76% com valores de p 0,01 e 0,04 no béquer 2 e 3, respectivamente. Os níveis de fosfato também caíram significativamente no béquer 2 em 74% com um valor de p de 0,02. O béquer contendo algas calcificadas e grânulos mostrou uma redução de fosfato de 66%, no entanto, este valor não foi significativo (ver Tabela 2). É importante notar que essa falta de significância estatística pode estar sujeita à baixa limitação do tamanho da amostra deste estudo. Este estudo não testou alterações nas bactérias patogênicas nas amostras, mas a adição da solução de bactérias da mistura da lagoa seria de esperar para reduzir esses números através da concorrência. Adicionalmente, acredita-se que a adição de uma solução de bactérias de um biogerador para uma lagoa de cultura real de acordo com uma forma de realização preferida da invenção obteria melhores resultados do que no estudo laboratorial porque as bactérias
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 36/48 / 19 na solução de bactérias podem atuar sinergicamente com as bactérias da nitrificação já presentes na lagoa de cultura e as bactérias adicionadas na solução de bactérias podem ajudar a consumir resíduos na água para reduzir os níveis de amônia. Similar aos béqueres de algas calcificadas, os dois béqueres que continham carbonato de cálcio mostraram uma diferença significativa nos meios pré versus pós-tratamento. No béquer 4, os níveis de nitrato caíram 77% com um valor de p de 0,03. Enquanto que o béquer 5 que continha carbonato de cálcio e grânulos bacterianos apresentou uma diminuição significativa nos níveis de fosfato de 72%, valor de p 0,02 (ver Tabela 2). O carbonato de cálcio pode ser um substituto adequado para algas calcificadas no tratamento da aquicultura. Béqueres com algas calcificadas ou carbonato de cálcio realizaram aqueles sem. O béquer 5, que continha grânulos de mistura bacteriana e carbonato de cálcio, tinha uma média de póstratamento significativamente menor dos níveis de fosfato e o menor efeito no pH. No entanto, os béqueres 2 e 5 apresentaram quedas estatisticamente significativas nos níveis de fosfato.
[0022] A turvação examinada ao longo deste estudo mostrou uma diminuição contínua em todos os béqueres de teste. Ao comparar imagens de pré-tratamento a pós, há um aumento na presença de algas em todos os béqueres, no entanto, no segundo mês houve evidência de morte de algas em dois béqueres. O béquer 4 contendo carbonato de cálcio e o béquer 6 (controle) ambos pareciam de cor amarela indicando um sistema de algas mortas. A morte de algas é um problema comum experimentado após uma flor de algas inicial, como o oxigênio na água é esgotado; apesar da presença da pedra de ar. Como as algas morreram, houve um aumento acentuado nos níveis de nitrato. Isto foi evidente pelo aumento dos níveis de nitrato acima do pré-tratamento neste mês, aumentando 14% e 38% no béquer 4 e 6, respectivamente. Até o último mês, os níveis de nitrato no béquer 4 recuperaram e diminuíram embora o sistema ainda tivesse uma cor verde
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15/19 escuro, amarelada. O nitrato continuou a aumentar para 6x o nível de contaminação no béquer 6.
[00023] Realizou-se também um estudo de campo com o objetivo de melhorar a saúde e a clareza gerais da lagoa, ao mesmo tempo em que reduziu a lama, em várias lagoas. Embora este estudo não tenha sido específico para a aquicultura (como as lagoas do estudo eram ornamentais ou recreativas e não para a criação e colheita de espécies aquáticas), fornece algumas informações úteis sobre a adição de bactérias e agentes de intensificação da nitrifícação. O estudo incluiu cinco lagoas dentro e ao redor de Irving, Texas; as lagoas, identificadas como Lagoas 1 a 5 variaram de 23.400 ft3 (662,61 m3) a 720.131 ft3 (20.391,84 m3). A duração deste estudo foi de sete meses. Uma a duas vezes por semana, uma amostra de água superficial de 200 a 300 ml foi tomada do lado da margem de cada lagoa. Estas amostras foram analisadas quanto ao pH, alcalinidade, nitrato, fosfato, amônia, condutividade, turbidez e concentrações de E. coli spp. A análise de fosfato, amônia e turbidez foi realizada utilizando um colorímetro Hach DR890. A determinação de E. coli spp foi realizada utilizando meios especializados para o crescimento de coliformes (3M Petrifilm 6404) incubados a 35°C durante 48 horas.
[00024] Uma vez por mês, cada lagoa foi amostrada quanto à profundidade de lama, limpidez e oxigênio dissolvido (OD). Estas medições foram obtidas de um pequeno barco em dois a quatro locais, marcado por coordenadas do GPS para obter uma amostragem representativa. A profundidade de lama foi medida em polegadas usando um juiz de lama; cada localização do GPS foi amostrada três a quatro vezes com a média tomada. O oxigênio dissolvido foi medido em ppm a partir da camada inferior e novamente a 18 (45,72 cm) da superfície utilizando uma sonda Hach LDO com um medidor Hach HQ30d. A limpidez foi determinada em %/pés utilizando um disco de Secchi, que deu uma medição empírica. Além disso, uma vez por mês, fotografias foram tiradas em cada lagoa em dois a quatro
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16/19 locais, novamente marcados por coordenadas do GPS, para dar um ponto de vista patrono de condições de superfície total.
[00025] Foi instalado um biogerador com controle climático BioAMP™ 750 em cada local para a dosagem diária no local de uma mistura de bactérias especializada em lagoas. Os esporos do Bacillus spp. foram peletizados utilizando uma fórmula de FREE-FLOW™ modificada; os grânulos foram alimentados no vaso de cultura onde cresceram em condições ótimas durante 24 horas e foram então dispersas diretamente para a lagoa. A manutenção do BioAMP 750 teve de ser modificada a partir do protocolo padrão, uma vez que o hipoclorito de sódio (lixívia) é considerado tóxico para as águas superficiais e não é permitido pela cidade de Irving para utilização. Para obter um efeito de branqueamento semelhante ao tratamento de branqueamento padrão, 155 g de bicarbonato de sódio (bicarbonato de sódio) foram utilizados para remover o excesso de biofilme e limpar os vasos de cultura. Além da manutenção mensal, os biogeradores foram monitorados quanto a qualquer mau funcionamento e capacidade de manter a temperatura programada apesar de uma temperatura ambiente superior a 100°F (37,78°C).
[00026] Como complemento ao tratamento bacteriano, foi também aplicada algas calcificadas a cada lagoa. A quantidade de algas calcificadas dadas dependia do volume em uma proporção de 100 lbs a 1.000.000 ft3 de água (16,02 kg a 10.000 m3). As algas calcificadas foram dosadas utilizando embalagens solúveis em água contendo um par efervescente e as algas calcificadas como descrito no pedido de patente US No. 14/689 790.
[00027] Cada lagoa de estudo foi dada a mesma quantidade de bactérias diariamente (30 trilhões de CFU). Uma matriz de correlação revelou que a profundidade de lama era inversamente relacionada com a taxa de dose. Duas das lagoas menores tiveram a maior redução observada nos níveis de lama e limpidez, bem como, a maior dose diária de bactérias a 2 x 107 CFU/1 e 7 x 106 CFU/1, respectivamente. A limpidez, conforme observado, apresenta
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17/19 efeitos positivos em todas as lagoas, independentemente do tamanho. A limpidez foi de aproximadamente 100% nas três lagoas menores deste estudo. Por outro lado, as duas maiores lagoas só alcançaram limpidez de 20% até o final deste estudo.
[00028] Utilizou-se um teste t de 2 amostras unidimensionais para avaliar se os níveis de lama diminuíram significativamente após o tratamento. Um valor p de 0,006 encontrou uma diminuição média estatisticamente significativa de 31%. Ho: μ pré-tratamento = μ pós-tratamento, Ha: μ prétratamento> μ pós-tratamento. Esta redução média observada equivale a uma redução média de 3 polegadas (7,62 cm) da camada de lama. Adicionalmente, cada lagoa neste estudo experimentou uma diminuição no nível de lama quando comparado com o pré-tratamento (ver Tabela 3).
TABELA 3 - Alterações em PO4, NO3 e Lama por Lagoa
| Lagoa | %Δ PO4 | %Δ NO3 | %Δ Lama |
| 1 | -19 | -71 | -45 |
| 2 | -77 | -100 | -18 |
| 3 | -40 | 0 | -16 |
| 4 | -70 | -100 | -37 |
| 5 | -48 | 0 | -43 |
| Média | -52 | -91 | -31 |
[00029] A variação média observada em E. coli spp. foi uma redução de 59%. E importante notar que a faixa completa incluiu um aumento de 145% para uma diminuição de 100%. Uma faixa tão vasta associada a um pequeno tamanho de amostra tornou difícil determinar a eficácia do tratamento na concentração de E. coli spp.. Três das cinco lagoas de estudo experimentaram um aumento de concentrações de E. coli spp.; entretanto, os outros dois lagos viram uma diminuição dramática; entretanto o aumento é acreditado ser o resultado do run-off da água de chuva nas lagoas.
[00030] O efeito total deste tratamento sobre as concentrações de fosfato foi examinado, comparando os níveis do pré-tratamento com póstratamento. Verificou-se que os dados não eram paramétricos e foi utilizado um teste unilateral de Mann-Whitney para determinar se as concentrações de fosfato diminuíram significativamente após o tratamento. Ho: μ préPetição 870180143348, de 22/10/2018, pág. 16/20 / 19 tratamento = μ pós-tratamento, Ha: μ pré-tratamento> μ pós-tratamento. Um valor de p de 0,0000 foi observado, indicando que a diminuição total de 52% nos níveis de fosfato após o tratamento foi estatisticamente significativa. Exames detalhados de mudanças no nível de fosfato por lagoa também revelaram diminuições significativas. Cada lagoa tratada viu uma diminuição nas concentrações de fosfato variando de 19% a 77% (ver Tabela 3). A média de redução de 52% foi semelhante à redução de 57% observada na fase I deste estudo. Isto indica que o aumento na frequência de dosagem bacteriana pode não estar associada com a diminuição das concentrações de fosfato. Além disso, observou-se uma diminuição acentuada dos níveis de fosfato diretamente após a aplicação de algas calcificadas. A primeira dose foi administrada na primavera, com a segunda administrada no verão, depois que os níveis de fosfato começaram a subir em junho. A natureza não química, de natureza ecológica do produto em pó oferece resultados promissores para o controle de concentrações de fosfato.
[0031] Similarmente, os níveis de nitrato foram examinados usando um teste unilateral de Mann-Whitney para avaliar se as concentrações de nitrato diminuíram significativamente após o tratamento. H0: μ pré-tratamento = μ pós-tratamento, Ha: μ pré-tratamento > μ pós-tratamento. Com um valor p de 0,0000 foi determinado que a redução de 91% na concentração era estatisticamente significativa (ver Tabela 3). Para o efeito, as concentrações de nitrato de base estavam abaixo dos níveis recomendados, pelo que não foram previstas reduções, muito menos uma redução estatisticamente significativa de 91%. Além disso, cada lagoa de estudo que tinha nitrato detectável foi significativamente reduzida para valores abaixo dos limites de detecção de 0,01 ppm ao mês 4. Esta foi uma grande melhoria em relação à redução observada na Fase I (~ 69%) e indica que o aumento da frequência de dosagem bacteriana teve um efeito direto sobre estas concentrações. No geral, este estudo demonstrou que o tratamento intensificado com bactérias e algas
Petição 870170003851, de 19/01/2017, pág. 41/48 / 19 calcificadas aumentou a saúde da lagoa, como medido por proxies químicos e uma diminuição no nível de lama.
[0032] Os especialistas na técnica apreciarão também ao ler esta descrição, que podem ser feitas modificações e alterações nas composições probióticas e na metodologia e sistema para distribuição de composições probióticas dentro do âmbito da invenção e pretende-se que a âmbito da invenção aqui revelada seja limitado apenas pela interpretação mais ampla das reivindicações anexas às quais os inventores têm o direito legal.
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para tratar água em uma lagoa de cultura usada em uma aplicação de aquacultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende:gerar uma batelada de bactérias ativas em um biogerador uma vez a cada 12 a 36 horas durante o curso de um ciclo de tratamento, em que o biogerador é localizado próximo à lagoa de cultura usada na aplicação de aquacultura e em que as bactérias ativas são úteis para remediar a água por degradação de resíduos orgânicos e inibição da cultura de bactérias patogênicas;adicionar cada batelada de solução de bactérias ativas na água na lagoa de cultura;adicionar um primeiro agente de intensificação de nitrificação compreendendo partículas ou fragmentos de plástico ou metal ou ambos à água na lagoa de cultura ao mesmo tempo com pelo menos uma das bateladas de bactérias ativas; e em que a bactéria ativa é selecionada a partir do grupo que consiste de Bacillus, Bactericides, Bifidobacterium, Lueconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Megasphaera, Pseudomonas e Propionibacterium.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as bactérias são selecionadas do grupo que consiste em Bacillus amylophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacteriodes ruminocola, Bacteriodes ruminocola, Bacterioides suis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Enterococcus cremoris, Enterococcus diacetylactis, Enterococcus faecium, Enterococcus intermedius, Enterococcus lactis, Enterococcus thermophiles, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri,Petição 870190021859, de 07/03/2019, pág. 11/13Lactobacillus bulgancus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Leuconostoc mesenteroides, Megasphaera elsdennii, Pediococcus acidilacticii, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus pentosaceus, Propionibacterium acidipropionici,Propionibacterium freudenreichii, e Propionibacterium shermanii.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de bactérias ativas é diluída antes de serem adicionadas na água.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente adicionar um segundo agente de intensificação de nitrificação consistindo de carbonato de cálcio, algas marinhas calcificadas, ou ambos à água na lagoa de cultura ao mesmo tempo com pelo menos uma das bateladas de bactérias ativas.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de intensificação de nitrificação é provido na forma de grânulos, glóbulos ou partículas e em que o agente de intensificação de nitrificação é adicionado uma vez por estação.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as etapas de adicionar bactéria e adicionar segundo agentes de intensificação de nitrificação reduzem o nível de nitrato ou o nível de fosfato ou ambos na água na lagoa de cultura em pelo menos 50% comparado ao nível anterior a essas etapas.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender ainda misturar ou bombear a água na lagoa de cultura para dispersar a bactéria adicionada, o primeiro agente de intensificação de nitrificação ou o segundo agente de intensificação de nitrificação ou uma combinação dos mesmos e em que os primeiro e segundo agentes dePetição 870190021859, de 07/03/2019, pág. 12/13 intensificação de nitrificação não são adicionados a cada batelada de solução de bactérias.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de intensificação de nitrificação é algas marinhas calcificadas que são adicionadas à água na lagoa de cultura a uma taxa de 16,02 kg por 10.000 m3 de água.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um volume de cada batelada de solução de bactéria ativa é 0,079 l de solução por 10.000 l de água na lagoa de cultura.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda gerar uma primeira batelada de solução de bactéria ativa em um primeiro biogerador uma vez a cada 12 a 36 horas durante o curso de um ciclo de tratamento;gerar uma ou mais outras bateladas de solução de bactéria ativa em um ou mais biogeradores uma vez a cada 12 a 36 horas durante o curso de um ciclo de tratamento; e adicionar cada batelada de solução de bactérias ativas proveniente dos biogeradores na água na lagoa de cultura.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a primeira batelada de solução de bactéria ativa compreende uma primeira espécie de bactéria e a uma ou mais outras bateladas de solução de bactéria ativa compreende uma segunda espécie de bactéria diferente da primeira espécie de bactéria.
- 12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as etapas de geração geram coletivamente bateladas de 0,079 l de solução por 10.000 - 57.643 l de água da lagoa de cultura sendo tratada.
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