BR112016016740B1 - Método de separação de entidades alvo de uma amostra que compreende entidades alvo e entidades não alvo - Google Patents
Método de separação de entidades alvo de uma amostra que compreende entidades alvo e entidades não alvo Download PDFInfo
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Abstract
método para separar entidades alvo de uma amostra utilizando uma composição de complexos de anticorpos tetraméricos mono-específicos acoplados a uma superfície. descrevem-se um método aprimorado para a preparação de superfícies alvo específicas e suas utilizações. em particular, as superfícies são ligadas a complexos de anticorpos tetraméricos mono-específicos antes da adição destas a uma amostra que contém entidades alvo e separação de entidades não alvo.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC §119(e) do pedido de patente provisório número de série U.S. 61/929.581, depositado em 21 de janeiro de 2014, que é incorporado neste documento por referência.
[0002] A presente divulgação refere-se a métodos para separar células que utilizam os complexos de anticorpos tetraméricos mono- específicos acoplados a uma superfície.
[0003] Em muitas aplicações, é desejável enriquecer ou, alternativamente, esgotar certas populações de células numa amostra biológica. Os campos de hematologia, imunologia e oncologia dependem de amostras de sangue periférico e suspensões de células a partir de tecidos relacionados, tais como a medula óssea, baço, timo e fígado fetal. A separação de tipos específicos de células a partir dessas amostras heterogêneas é a chave para a investigação nestes domínios. Populações puras de células do sistema imunológico, tais como as células T e as células B são necessárias para o estudo da função imune e são utilizadas em imunoterapia. Investigação dos processos celulares, moleculares e bioquímicos requer análise de certos tipos de células em isolamento. Numerosas técnicas têm sido utilizadas para isolar ou esgotar eritrócitos, subconjuntos de linfócitos, tais como células T, células B e células exterminadoras naturais (NK) e granulócitos, tais como neutrófilos, basófilos e eosinófilos.
[0004] As células hematopoiéticas e células do sistema imune foram separadas tendo como base características físicas, tais como a densidade e alvejamento direto com anticorpos monoclonais e uma superfície sólida, tal como partículas magnéticas. Há duas abordagens básicas para separar populações de células do sangue periférico e de suspensões de células relacionadas utilizando-se anticorpos monoclonais. Eles diferem no fato de serem as células desejadas ou indesejadas que se distinguem/são marcadas com o(s) anticorpo(s). Em técnicas de seleção positiva, as células desejadas são marcadas com anticorpos e removidas das células não marcadas/indesejadas restantes. Na seleção negativa, as células não desejadas são marcadas e removidas. Anticorpo e tratamento complementar e a utilização de imunotoxinas é uma técnica de seleção negativa, ao passo que triagem celular assistida por fluorescência (FACS) e a maioria das técnicas de imunoadsorção a granel podem ser adaptadas tanto para a seleção positiva quanto para a negativa. Em técnicas de imunoadsorção, as células são selecionadas com anticorpos monoclonais e, preferencialmente, ligadas a uma superfície que pode ser removida da parte restante das células, por exemplo, coluna de grânulos, frascos, partículas magnéticas e não magnéticas. Técnicas de imunoadsorção foram favorecidas tanto em uso clínico como em pesquisa porque mantém alta especificidade de alvejamento de células com anticorpos monoclonais, mas, ao contrário de FACS, elas podem ser ampliadas para lidar diretamente com o grande número de células em uma colheita clínica e evitam os perigos da utilização de reagentes citotóxicos, tais como imunotoxinas e complemento.
[0005] Separação magnética é um processo utilizado para reter seletivamente os materiais magnéticos dentro de um recipiente, tal como um tubo de centrífuga ou coluna, em um gradiente do campo magnético. Os alvos de interesse, tais como células biológicas específicas, proteínas e ácidos nucleicos, podem ser marcados magneticamente por ligação de partículas magnéticas na superfície dos alvos através de interações específicas, incluindo as interações de imuno-afinidade. Outras interações úteis incluem o receptor do fármaco-fármaco, anticorpo-antígeno, o receptor de hormônio-hormônio, receptor de fator de crescimento-fator de crescimento, carboidrato-lectina, sequência de ácido nucleico-sequência de ácido nucleico complementar, enzima-cofator ou enzima-inibidor de ligação. A suspensão, contendo os alvos de interesse dentro de um recipiente adequado é, então, exposta a gradientes de campo magnético de intensidade suficiente para separar os alvos de outras entidades na suspensão. O recipiente pode então ser lavado com um fluido apropriado para remover as entidades não marcadas, resultando numa suspensão purificada dos alvos de interesse.
[0006] O advento dos anticorpos monoclonais contra antígenos da superfície celular expandiu significativamente o potencial de distinção e separação de tipos celulares distintos. A maioria dos sistemas de marcação magnética usam partículas supramagnéticas com anticorpos monoclonais ou estreptavidina covalentemente ligada a sua superfície. Em aplicações de separação de células, essas partículas podem ser utilizadas tanto para a seleção positiva, em que as células desejadas são magneticamente marcadas, ou seleção negativa, onde a maioria das células não desejadas são marcadas magneticamente. Aplicações de separação magnética em que os alvos de interesse são proteínas ou ácidos nucleicos seriam consideradas abordagens de seleção positivas, uma vez que a entidade alvo de interesse é normalmente capturada na partícula magnética.
[0007] Vários produtos comerciais de separação celular que estão disponíveis utilizam uma partícula magnética diretamente acoplada a anticorpos (Miltenyi Biotec Inc., Gladbach, Alemanha, Life Technologies Corp., Carlsbad, USA, BD Biosciences, San Jose, USA.). Outras abordagens utilizam a marcação das células-alvo com anticorpos específicos conjugados com biotina, seguido pela adição de partículas magnéticas revestidas com estreptavidina que se ligam a anticorpos biotinilados (Miltenyi Biotec, Inc. Life Technologies, BD Biosciences, e STEMCELL Technologies Inc., Vancouver, Canadá). Outro exemplo é o sistema de separação de células EasySep™ (STEMCELL Technologies Inc.), em que um complexo de anticorpos tetramérico bi-específico é usado para reticular as partículas magnéticas para células de interesse. Complexos de anticorpos tetraméricos (TAC) são compostos de dois anticorpos monoclonais de uma primeira espécie mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie que se ligam ao fragmento Fc dos anticorpos da primeira espécie (Consulte Pat. n° U.S. 4.868.109 para Lansdorp, que é incorporada neste documento por referência, para uma descrição de TAC e métodos para a preparação dos mesmos).
[0008] Na preparação do TAC bi-específico, três TACs diferentes podem ser formados os quais compreendem a composição final de anticorpos. Se uma concentração equivalente de dois anticorpos diferentes (A e B) das primeiras espécies animais é combinada com uma quantidade equimolar do anticorpo de reticulação das segunda espécie animal (C), 25% será TAC mono-específico para o anticorpo A, 25 % será TAC mono- específico para o segundo anticorpo B, e 50% do TAC será bi-específico para os anticorpos A e B. A proporção de cada um dos anticorpos da primeira espécie pode ser manipulada para inclinar a proporção de TACs mono- específicos para TACs bi-específicos para o primeiro ou o segundo anticorpo específico para os seus respectivos antígenos alvo.
[0009] Tal como utilizado na presente invenção, um TAC mono- específico é específico para uma única entidade alvo. Numa modalidade, o TAC mono-específico contém dois anticorpos idênticos da primeira espécie de animais que reconhecem o mesmo epítopo antigênico contido em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Numa outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpos diferentes da primeira espécie animal que reconhecem epítopos diferentes no mesmo antígeno alvo e que são mantidos num arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Em ainda outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpos diferentes da primeira espécie animal que reconhecem diferentes antígenos expressos na mesma entidade alvo e que são mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc da primeira espécie animal.
[0010] O TAC mono-específico pode aumentar a valência do complexo para a sua entidade alvo, na medida em que o TAC teria quatro locais de ligação ao antígeno, em comparação com apenas dois com uma única molécula de anticorpo IgG.
[0011] As patentes que descrevem anticorpos ligados diretamente a partículas, quer diretamente quer indiretamente, através de uma interação receptor-ligante intermediária, em que qualquer um, receptor ou ligante, são em primeiro lugar acoplados à partícula magnética têm sido descritos nas patentes norte-americanas US 3970518A, US4230685, US8298782B2, US 7160723B2 e US5543289A quais são incorporadas por referência neste documento. Em cada um destes exemplos, os anticorpos simples ou múltiplos que reconhecem uma entidade alvo são acoplados a partículas utilizando técnicas convencionais que são facilmente evidentes para aqueles versados na técnica, tais como adsorção física ou conjugação química.
[0012] Adsorção física de ligantes, tais como anticorpos em superfícies sólidas, desempenha um papel crítico em diversos processos naturais e tem grande utilidade em aplicações de biomateriais. Apesar dos esforços e progressos no entendimento do fenômeno de adsorção de proteína em superfícies sólidas, há explicações muito diferentes e contraditórias quanto ao fenômeno observado que ocorre quando uma proteína adsorve sobre uma superfície sólida, como um frasco, coluna de contas ou partículas [1]. Adsorção de proteína sobre superfícies sólidas pode ser afetada por um grande número de elementos, incluindo o pH e a força iônica do tampão de reação, a temperatura da reação e do ponto isoelétrico da proteína. Além disso, o tamanho, a carga da superfície e porções reativas na superfície também contribuem grandemente para a adsorção das proteínas. Uma vez que a proteína é inicialmente adsorvida ou concentrada na superfície, pode ser covalentemente conjugada com a referida superfície.
[0013] Dependendo das condições de adsorção ou conjugação química, a orientação do anticorpo pode ser ligada numa conformação que não permite que ele se ligue funcionalmente ao seu antígeno alvo. A orientação dos anticorpos pode ser manipulada através da modificação das condições de adsorção ou reação de conjugação ou pela utilização de um intermediário que é primeiro conjugado com uma superfície que pode ajudar a orientar o anticorpo com os domínios de ligação de Fab reativos orientados para fora a partir da superfície (consultar US8298782 B2 ou US4,230,685). Mesmo no caso do acoplamento de um intermediário de ligação ao anticorpo, tal como a proteína A ou estreptavidina, o acoplamento do referido intermediário também pode ser ineficiente, resultando em eficiência de acoplamento muito aquém do ideal.
[0014] Em vista do exposto, há uma necessidade na técnica de se fornecer métodos simples e inovadores para a melhoria de métodos de acoplamento de anticorpos para a preparação de superfícies específicas para uma entidade alvo para a utilização em misturas de fraccionamento de entidades alvo e entidades não alvo.
[0015] O presente inventor desenvolveu um método para o acoplamento de complexos de anticorpos tetraméricos mono-específicos em superfícies para a utilização em misturas de fracionamento de entidades alvo e entidades não alvo. O inventor mostrou que o acoplamento de complexos de anticorpos tetramérico mono-específicos em superfícies é um aperfeiçoamento em relação aos métodos existentes de acoplamento de anticorpos monoclonais em superfícies a concentrações de anticorpos equivalentes para misturas de fracionamento de entidades alvo e entidades não alvo.
[0016] O advento dos anticorpos monoclonais contra antígenos da superfície celular expandiu significativamente o potencial de distinção e separação de tipos celulares distinto. Complexos de anticorpos tetraméricos (TAC) são compostos de dois anticorpos de uma primeira espécie animal mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal específicos para o fragmento Fc da primeira espécie (Ver Pat. n° U.S. 4.868.109 para Lansdorp, que é incorporada neste documento por referência, para uma descrição de TAC e métodos para a preparação dos mesmos). O método da divulgação demonstra o uso de TAC mono- específico acoplado a uma superfície, tal como uma partícula magnética para utilização em fracionamento de uma amostra composta de entidades alvo e entidades não alvo.
[0017] Um TAC mono-específico é específico para um único tipo de entidade alvo, tal como uma célula. Numa modalidade, o TAC mono- específico contém dois anticorpos idênticos de uma primeira espécie de animais que reconhecem o mesmo epítopo antigênico e são contidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Numa outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpo diferentes de uma primeira espécie animal que reconhecem epítopos diferentes do mesmo antígeno alvo e que são mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Em ainda outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpos diferentes da primeira espécie animal que reconhecem diferentes antígenos expressos na mesma entidade alvo e que são mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc da primeira espécie animal.
[0018] O método da invenção é uma melhoria inesperada em relação aos métodos existentes, na medida em que superfícies acopladas a TAC mono-específico são mais eficazes do que os anticorpos monoclonais acoplados a superfícies para o fracionamento de entidades alvo de uma amostra que contém entidades alvo e entidades não alvo.
[0019] Em concentrações equivalentes de anticorpos específicos da entidade alvo, TACs mono-específicos acoplados a superfícies são mais eficazes no fracionamento de uma entidade alvo a partir de uma mistura de entidades alvo e não alvo.
[0020] Numa modalidade, os métodos da invenção podem, de forma eficiente, rotular e esgotar eritrócitos de uma amostra complexa, tal como o sangue total humano.
[0021] Por conseguinte, numa modalidade, a presente invenção proporciona um método para a separação de entidades alvo de entidades não alvo numa amostra que compreende entidades alvo e entidades não alvo, o método compreende: (a) fornecer pelo menos um complexo de anticorpos tetramérico mono- específico (TAC) acoplado a uma superfície, em que o TAC é específico para as entidades alvo; (b) colocar em contato a amostra com a superfície acoplada ao TAC sob condições para permitir a ligação da superfície acoplada ao TAC às entidades alvo; e (c) separar as entidades alvo - superfície acoplada a TAC da amostra para separar as entidades alvo das entidades não alvo.
[0022] Numa modalidade, a superfície é uma partícula, tal como uma partícula magnética. Uma vantagem da abordagem de partícula magnética é que, uma vez que este é um método de separação de células imunomagnéticas, ele pode ser totalmente automatizado, reduzindo, assim, ainda mais o manuseamento da amostra e minimizando a exposição a agentes patogênicos transmissíveis pelo sangue, tais como vírus ou parasitas.
[0023] As entidades alvo podem ser células, bactérias, vírus, organelas celulares, proteínas ou ácidos nucleicos.
[0024] Numa modalidade, as células alvo são selecionadas a partir do grupo que consiste em eritrócitos, linfócitos, monócitos, granulócitos, células tumorais, células tronco, células progenitoras hematopoiéticas, células mesenquimais, células epiteliais mamarias, células neurais, células tronco endoteliais e células tronco embrionárias.
[0025] Outras características e vantagens da presente divulgação serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve- se compreender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao indicar as modalidades preferidas da divulgação atual, estão apresentando apenas como ilustrações, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do princípio e do escopo da divulgação atual se tornarão aparentes àquelas pessoas versadas na técnica desta descrição detalhada.
[0026] A divulgação será agora descrita em relação aos desenhos nos quais:
[0027] A Figura 1 mostra o esgotamento de eritrócitos do sangue total periférico humano utilizando partículas magnéticas de carboxidextrano acopladas a TAC de anti-glicoforina mono-específica A ou a anticorpos A de anti-glicoforina.
[0028] A Figura 2 compara o enriquecimento de células nucleadas de sangue periférico humano utilizando tanto o esgotamento de eritrócitos imunomagnética que se utiliza de partículas magnéticas acopladas a TAC mono-específico ou de lise de cloreto de amônia de eritrócitos.
[0029] A Figura 3 mostra a seleção positiva de granulócitos CD66b+ do sangue total periférico humano usando anti-CD66b TACs mono- específicos acoplados a partículas magnéticas.
[0030] A presente divulgação refere-se a uma composição de TAC mono-específicos acoplados a uma superfície para utilização em um método para a separação de entidades alvo a partir de uma amostra que contém entidades alvo e entidades não alvo.
[0031] Em um aspecto, a presente modalidade proporciona um método para a separação de entidades alvo de entidades não alvo numa amostra que compreende entidades alvo e entidades não alvo, o método compreende: (d) fornecer pelo menos um complexo de anticorpos tetramérico mono- específico (TAC) acoplado a uma superfície, em que o TAC é específico para as entidades alvo; (e) colocar em contato a amostra com a superfície acoplada ao TAC sob condições para permitir a ligação da superfície acoplada ao TAC às entidades alvo; e (f) separar as entidades alvo - superfície acoplada a TAC da amostra para separar as entidades alvo das entidades não alvo.
[0032] O método pode ser usado em ambos os protocolos de seleção positiva e negativa. Em um protocolo de seleção positiva, as entidades desejadas são removidas a partir de uma amostra. Em um protocolo de seleção negativa, as entidades desejadas permanecem na amostra após o protocolo de seleção, de tal modo que a amostra restante é enriquecida para as entidades desejadas.
[0033] Tal como utilizado neste documento, o termo "entidade alvo" é uma entidade que deve ser removida da amostra pelos métodos descritos neste documento. Numa modalidade preferida, a entidade de alvo é uma célula. Em um protocolo de seleção positiva, a célula desejada é a célula alvo. Em um protocolo de seleção negativa, a célula desejada não é a célula alvo. Pelo contrário, a célula desejada é uma célula não alvo.
[0034] Numa modalidade, a superfície é uma partícula. A partícula pode ser magnética ou não magnética. Um exemplo de partículas não magnéticas úteis para os métodos descritos neste documento são partículas flutuantes. Partículas flutuantes irão flutuar quando colocadas num tampão apropriado, permitindo, assim, a separação da célula alvo - complexos de partícula acoplado ao TAC de uma amostra.
[0035] Em um protocolo de separação de células de seleção negativa, as células desejadas não são marcadas com as partículas acopladas e permanecem na amostra após a remoção das células alvo marcadas pelas partículas acopladas. Por conseguinte, as células não desejadas são as "células alvo" a serem removidas da amostra e as células desejadas são "células não alvo". Em um protocolo de separação de células de seleção negativa, o TAC mono-específico irá conter anticorpos específicos para as células alvo que se deseja remover da amostra. Por conseguinte, a presente divulgação proporciona um método de separação de células por seleção negativa para enriquecer e recuperar células desejadas de uma amostra que contém as células desejadas e células não desejadas, que compreende: (A) fornecer, pelo menos, um TAC mono-específico acoplado a uma superfície, tal como uma partícula, em que o TAC é específico para as células não desejadas; (B) realizar contato entre amostra e a partícula acoplada ao TAC sob condições que permitem a ligação de partículas acopladas ao TAC às células não desejadas; e (C) separar a célula alvo - complexos de partícula acoplados ao TAC da amostra para se obter uma amostra enriquecida para as células desejadas.
[0036] Em um protocolo de seleção positiva, as células desejadas são as células alvo. Em uma seleção positiva, a composição de anticorpos conterá pelo menos um anticorpo específico para as células desejadas que se deseja remover da amostra. Por conseguinte, a presente divulgação proporciona um método de seleção positiva para e recuperar células desejadas de uma amostra que contém as células desejadas e células não desejadas, que compreende: (D) fornecer, pelo menos, um TAC mono-específico acoplado a uma superfície, em que o TAC liga-se à partícula da célula desejada; (E) realizar contato entre amostra e a partícula acoplada ao TAC sob condições que permitem a ligação de partículas acopladas ao TAC às células desejadas; (F) separar a célula desejada - complexos de partícula acoplados ao TAC da amostra para se obter uma segunda amostra enriquecida para as células desejadas ligadas às partículas acopladas; e (G) lavar a célula desejada - complexos de partículas acopladas ao TAC para se obter uma amostra purificada para as células desejadas ligadas às partículas acopladas.
[0037] Numa modalidade, o método de seleção positiva inclui a desagregação da célula desejada - complexo de partículas acopladas ao TAC para separar as células pretendidas da partícula acoplada. O complexo pode ser desagregado utilizando uma variedade de métodos que incluem, mas não se limitam a, competitivo, físico, químico, enzimático ou dissociação térmica.
[0038] As células alvo ligadas a partículas formadas na etapa (b) acima para a seleção negativa ou positiva podem ser separadas das células não alvo não magnéticas utilizando-se uma variedade de técnicas.
[0039] Na modalidade preferida, as partículas são partículas magnéticas e a amostra que contém as células alvo marcadas com partículas magnéticas é colocada num campo magnético. As células alvo marcadas com partículas magnéticas migram para o campo magnético e são mantidas no lugar, permitindo que as células não alvo não magnéticas sejam facilmente separadas das células alvo marcadas com partículas magnéticas.
[0040] Os métodos da divulgação podem ser utilizados no processamento de amostras biológicas que contêm eritrócitos, incluindo sangue (em particular, o sangue do cordão umbilical e no sangue total), medula óssea, fígado fetal, suspensões de creme leucocitário, amostras de leucaferese, efusões e suspensões de timócitos pleurais e peritoneais e esplenócitos. O método pode ser usado para esgotar eritrócitos de amostras biológicas que contém eritrócitos tais como sangue total ou medula óssea inteira.
[0041] O método da divulgação pode ser usado para preparar amostras enriquecidas de qualquer tipo de célula, incluindo, mas não se limitando a, células T, células B, células NK, células dendríticas, monócitos, basófilos, mastócitos, células progenitoras, células tronco e células de tumor.
[0042] Numa modalidade, o método da divulgação pode ser utilizado para preparar uma preparação de células a partir de amostras, tais como sangue e medula óssea, as quais são enriquecidas em um tipo de célula diferenciada selecionada, tal como células T, células B, células NK, monócitos, células dendríticas, basófilos e células de plasma. Isto irá permitir estudos específicos de interações celulares, incluindo a produção do fator de crescimento e respostas a fatores de crescimento. Também irá permitir a análise molecular e bioquímica de tipos de células específicas. Preparações de células enriquecidas em células NK, células dendríticas e células T também podem ser utilizadas em terapia imunitária contra certas doenças malignas.
[0043] A divulgação inclui as composições de anticorpos e de partículas para utilização nos métodos descritos neste documento.
[0044] O TAC mono-específico irá conter (a) um primeiro anticorpo que se liga a um antígeno na célula-alvo, ligado, indiretamente, a (b) um segundo anticorpo que se liga à mesma célula alvo. Os dois anticorpos podem ser idênticos ou serem clones de anticorpos diferentes da mesma espécie animal que reconhecem um epítopo diferente no antígeno ou diferentes antígenos expressos na mesma célula alvo.
[0045] Numa modalidade preferida, pelo menos um TAC mono- específico será diretamente acoplado a uma partícula usando-se técnicas convencionais, que são facilmente evidentes para aqueles versados na técnica, tais como adsorção física ou conjugação química.
[0046] Os termos "primeiro anticorpo" e "segundo anticorpo" significam que a composição de anticorpo inclui, pelo menos, um tipo de anticorpo (em oposição a uma molécula de anticorpo). Um tipo de anticorpo significa um anticorpo que se liga a um determinado epítopo num antígeno. Por exemplo, os anticorpos que se ligam ao antígeno CD3 são considerados um tipo de anticorpo.
[0047] Num aspecto, o TAC mono-específico da presente invenção compreende (a) um anticorpo específico para uma célula-alvo indiretamente ligada a (b) um segundo anticorpo específico para a mesma célula alvo. Por "indiretamente ligado" pretende-se significar que o anticorpo (a), e anticorpo (b) não estão diretamente ligados covalentemente um ao outro, mas estão ligados através de um radical de ligação, tal como um complexo imunológico. Numa modalidade preferida, a composição de anticorpos contém pelo um anticorpo para a célula alvo (a), que está indiretamente ligado a um segundo anticorpo específico para a mesma célula alvo (b) através da preparação de um complexo de anticorpo tetramérico mono-específico. Um complexo de anticorpos tetramérico mono-específico pode ser preparado por mistura do anticorpo monoclonal, que é capaz de se ligar às células-alvo de uma primeira espécie animal, com uma quantidade equimolar de anticorpos monoclonais de uma segunda espécie animal, que são dirigidos contra fragmentos Fc de os anticorpos da primeira espécie animal. Pode também fazer-se reagir os anticorpos da primeira espécie animal com uma quantidade cerca de equimolar do comprimento total de fragmentos F(ab')2 de anticorpos monoclonais de uma segunda espécie animal que são dirigidos contra fragmentos Fc dos anticorpos da primeira espécie animal.
[0048] O termo "pelo menos um TAC mono-específico" significa que, pelo menos, um TAC está diretamente acoplado a uma única partícula. Em uma modalidade preferida, um TAC mono-específico é específico para um único tipo de entidade alvo, tal como uma célula. Numa modalidade, o TAC mono-específico contém dois anticorpos idênticos de uma primeira espécie de animais que reconhecem o mesmo epítopo antigênico que é contido em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Numa outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpo diferentes da primeira espécie animal que reconhecem epítopos diferentes no mesmo antígeno alvo e que são mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc das primeiras espécies animais. Em ainda outra modalidade, o TAC mono-específico contém dois clones de anticorpos diferentes da primeira espécie animal que reconhecem diferentes antígenos expressos na mesma célula alvo e que são mantidos em um arranjo tetramérico por dois anticorpos de uma segunda espécie animal que reconhecem o fragmento Fc da primeira espécie animal.
[0049] As partículas acopladas ao TAC serão misturadas com a amostra em condições que permitam que, pelo menos, uma partícula acoplada ao TAC se ligue a uma célula alvo.
[0050] Numa modalidade preferida, o TAC mono-específico específico para as células alvo é diretamente acoplados à partícula usando- se técnicas convencionais, que são facilmente evidentes para aqueles versados na técnica, tais como adsorção física ou conjugação química.
[0051] Dentro do contexto da presente divulgação, os anticorpos são entendidos como incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab e F(ab')2), anticorpos quiméricos, anticorpos bifuncionais ou bi-específicos. Entende-se que os anticorpos são reativos contra um antígeno selecionado na superfície de uma célula alvo ou eritrócito se eles se ligam com uma afinidade adequada (constante de associação), por exemplo maior do que ou igual a 107 M-1.
[0052] Os anticorpos monoclonais são preferencialmente usados nas composições de anticorpos da divulgação. Os anticorpos monoclonais específicos para antígenos selecionados sobre a superfície de células nucleadas podem ser prontamente obtidos ou produzidos utilizando-se técnicas convencionais, que são facilmente evidentes para aqueles versados na técnica.
[0053] A divulgação também contempla aptâmeros ou derivados de anticorpos quiméricos, isto é, moléculas de anticorpo que combinam uma região variável animal não humana e uma região constante humana. As moléculas de anticorpo quiméricas podem incluir, por exemplo, o domínio de ligação de um anticorpo de um camundongo, rato ou outra espécie, com regiões constantes humanas. Uma variedade de abordagens para produzir anticorpos quiméricos foi descrita e pode ser utilizada para produzir anticorpos quiméricos que contêm a região variável da imunoglobulina que reconhece antígenos selecionados na superfície de células diferenciadas ou células tumorais. Consulte, por exemplo, Kim Hong e [2].
[0054] Os exemplos a seguir não limitantes são ilustrativos da presente divulgação:
[0055] Para preparar um complexo anticorpo tetramérico mono- específico para utilização no método da presente invenção, pode ser utilizado o seguinte protocolo: (a) selecionar 1 mg de anticorpo específico para um antígeno nas células alvo (por exemplo, anti-eritrócitos (glicoforina A), CD8, CD16, CD19, CD36, CD56, CD66b, etc); (B) adicionar 1 mg de anticorpo P9 ou 0,68 mg de P9 fragmento F (ab') 2 de anticorpo. Incubar durante a noite a 37 °C. Para mais informações sobre a preparação de tetrâmeros, consulte Pat. n° U.S. 4.868.109 para Lansdorp, que é incorporada por referência neste documento. Complexos de anticorpos tetraméricos mono-específico que incorporam diferentes anticorpos para antígenos expressos em diferentes células alvo são preparados separadamente.
[0056] TACs mono-específicos preparados com diferentes anticorpos são acoplados separadamente a partículas. Um coquetel de partículas acopladas é feito através da combinação de várias partículas acopladas dependendo de qual células deseja-se esgotar. A concentração dos vários TAC mono-específicos varia: tipicamente anticorpos a antígenos expressos em células nucleadas estão em 2,5-400 ug/mL em TACs mono- específicos. A composição de partícula acoplada é então diluída 20/01 nas células, de modo que as concentrações finais de cada um dos anticorpos anti-célula nas suspensões de células situem-se entre 0,125 - 20 ug/ml. A concentração final de cada partícula é entre 0,05 - 5 mg/mL.
[0057] Para preparar uma partícula com anticorpos monoclonais acoplados ou TACs mono-específicos para utilização no método da presente invenção, pode ser utilizado o seguinte protocolo: (a) selecionar 200 ug de anticorpo A anti-glicoforina separadamente ou 200 ug de anticorpo A anti- glicoforina ligado num complexo de anticorpo tetramérico com 200 ug de anticorpo P9; (b) adicionar 80 mg de partículas magnéticas de carboxidextrano; e (c) incubar durante a noite a 15-37 °C para facilitar a adsorção passiva de anticorpos ou TACs mono-específicos na partícula magnética. A composição é, em seguida, diluída de 1/20 na amostra de modo que a concentração final de anticorpo A anti-glicoforina é entre 1 - 10 ug/ml. A concentração final das partículas magnéticas é compreendida entre 0,4 - 4 mg/mL.
[0058] Numa outra modalidade, a reticulação química de anticorpos ou TACs a partículas magnéticas é realizada utilizando técnicas convencionais, que são facilmente evidentes para aqueles versados na técnica Um exemplo ilustrativo, não limitante, da presente invenção seria a reticulação EDC-NHS de TAC mono-específico A de anti-glicoforina a uma partícula magnética de carboxidextrano. A partícula acoplada ao TAC mono- específico é então diluída a 1/20 na amostra, de modo que a concentração final de anticorpo A anti-glicoforina do TAC mono-específico esteja entre 1 - 10 ug/ml.
[0059] Um protocolo de seleção negativa para o enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico do sangue total humano periférico utilizando-se de separação magnética de células é definido a seguir. 1. Adicionar 50 uL de TACs de glicoforina A mono-específicos acoplados a partículas magnéticas por mL de sangue total periférico humano. 2. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 3. Diluir amostra com um volume de tampão fosfato-salino (PBS) equivalente ao da amostra de sangue total inicial e misturar suavemente. 4. Coloque o tubo que contém a amostra em um ímã. 5. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 6. Remover as células enriquecidas da amostra, enquanto o tubo de amostra é retido no interior do ímã. 7. Adicionar um volume equivalente de partículas acopladas, como na etapa 1, na amostra enriquecida diluída 8. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 9. Coloque o tubo que contém a amostra em um ímã. 10. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 11. Remover as células enriquecidas da amostra, enquanto o tubo de amostra é retido no interior do ímã. 12. as células desejadas estão agora em um novo tubo e prontas para serem utilizadas.
[0060] Esse exemplo demonstra que os eritrócitos, que são o principal componente do sangue humano inteiro, podem ser esgotados usando o método referido acima que utiliza TAC de anti-glicoforina A mono- específico acoplado a partículas magnéticas. Como mostrado na Figura 1 B), após o esgotamento dos eritrócitos utilizando TAC glicofori-A monoespecíficos acoplado a partículas magnéticas, utilizando o método descrito acima, 99,05% de células enriquecidas são CD45+GlyA- comparado com 99,95% de CD45-Glya+ quando as partículas magnéticas sozinhas forem adicionadas ao sangue total humano.
[0061] Um protocolo de seleção positiva para isolar granulócitos do sangue total periférico humano utilizando separação magnética de células é definido a seguir. 1. Adicionar 5 uL de TACs de anti-CD66b mono-específicos acoplados a partículas magnéticas por mL de sangue total periférico humano. 2. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 3. Diluir a amostra com um volume de PBS equivalente ao da amostra de sangue total inicial e misturar suavemente. 4. Coloque o tubo que contém a amostra em um ímã. 5. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 6. Remover o sobrenadante que contém as células não desejadas da amostra, enquanto o tubo da amostra que contém as células desejadas é retido dentro do ímã. 7. Remover o tubo que contém as células desejadas do ímã e ressuspender o tubo da amostra que contém as células desejadas com PBS. 8. Repita as etapas 4-7 duas vezes mais para um total de três separações magnéticas de 5 minutos. 9. As células desejadas marcadas com as partículas acopladas estão agora prontas para uso.
[0062] Este exemplo demonstra que os granulócitos podem ser selecionadas positivamente a partir de sangue total humano usando TAC monoespecíficos anti-CD66b acoplado a partículas magnéticas. Como mostrado na Figura 3, os granulócitos podem ser selecionados positivamente e enriquecidos a 74,7% utilizando o método descrito acima.
[0063] Esse exemplo demonstra o esgotamento imunomagnética de eritrócitos de sangue humano inteiro, utilizando partículas magnéticas acopladas a anticorpos anti-glicoforina A ou Tacs de anti-glicoforina A mono- específicos (Figura 1). Os eritrócitos no sangue total humano, foram esgotados usando o método descrito no exemplo 3, utilizando ou um anticorpo monoclonal ou TAC mono-específico acoplado a partículas magnéticas específico para a glicoforina A. Tacs mono-específicos para anti- glicoforina A foram preparados tal como descrito no Exemplo 1. Partículas magnéticas acopladas com anticorpos monoclonais anti-glicoforina A ou TAC mono-específicos foram preparados tal como descrito no Exemplo 2. A) Imagens da amostra final que comparam (da esquerda para a direita) partículas magnéticas sozinhas sem quaisquer anticorpos, TAC mono- específico para anti-glicoforina A acoplado a partículas magnéticas, concentração equivalente de anticorpos monoclonais anti-glicoforina A acoplados à quantidade equivalente de partículas magnéticas e o dobro da concentração de anticorpos monoclonais anti-glicoforina A acoplados à quantidade equivalente de partículas magnéticas. A duplicação da concentração de anti-glicofrina A resulta na concentração de anticorpos totais equivalente se o anticorpo anti-camundongo IgG1 de reticulação é levado em consideração para o TAC monoespecífico. A única amostra que eficientemente esgotou eritrócito, foi a amostra separada com os TACs de anti-glicoforina A mono-específicos acoplados a partículas magnéticas. B) As amostras enriquecidas foram tingidas com anti-glicoforina A (Glya) com FITC e anti-CD45 APC e analisadas por citometria de fluxo para determinar o grau de esgotamento de eritrócitos por estimativa da percentagem de células CD45+/GlyA- na amostra enriquecida. Partículas magnéticas sozinho resultaram em 0,03% de células CD45+/GlyA-. TAC de anti-glicoforina A mono-específico acoplado a partículas magnéticas resultou em 99,05% de células CD45+/GlyA-. Em comparação, a concentração equivalente de anticorpos monoclonais anti-glicoforina A acopladoa a partículas magnéticas resultou em apenas 0,35% de células CD45+/GlyA-. Duplicar a concentração de anticorpos monoclonais de glicoforina A resultou em um pequeno aumento de células CD45+/GlyA- de 3,51%.
[0064] O exemplo demonstra que o enriquecimento imunomagnético das células nucleadas de sangue periférico humano usando TAC de glicoforina A mono-específico acoplado a partículas magnéticas resulta em frequências semelhantes de populações de células, em comparação com um procedimento de lise de cloreto de amônia mono- específico padrão (Figura 2). Os eritrócitos foram esgotados usando o método de acordo com o exemplo 3 ou lise hipotônica de cloreto de amônia padrão e lavagem. Amostras enriquecidas foram tingidas com anti-CD4 ou FITC de CD19, anti-CD8 ou CD56 PE, anti-CD3 PerCP-Cy5.5 e anti-CD45 APC e analisadas por citometria de fluxo. As amostras foram gated nas células CD45+ e as populações foram identificadas quer por FSC/SSC gating ou por expressão de marcadores de superfície de células (n = 6).
[0065] O exemplo demonstra a seleção positiva imunomagnética de granulócitos a partir de sangue humano inteiro, utilizando TAC anti-CD66b mono-específicos acoplados a partículas magnéticas, de acordo com o método descrito no exemplo 4 (Figura 3). Sangue total lisado com cloreto de amônia e as amostras selecionadas positivamente foram tingidos com anti- CD45 e analisados por citometria de fluxo. As amostras foram gated em células CD45+ e granulócitos foram identificados com base em alta FSC e gating SSC. Na amostra de sangue total inicial, 54,8% das células CD45+ eram granulócitos. Após a seleção positiva imunomagnética, 74,7% das células CD45+ eram granulócitos.
[0066] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência ao que presentemente são considerados os exemplos preferidos, deve ser entendido que o invento não está limitado aos exemplos divulgados. Pelo contrário, a invenção destina-se a abranger a várias modificações e arranjos equivalentes, incluídos dentro do espírito e escoops das reivindicações anexas.
[0067] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na sua totalidade, na mesma extensão que seriam como se cada pedido de publicação, patente ou patente individual fosse especificamente e individualmente indicados para serem incorporados por referência em sua totalidade. REFERÊNCIAS 1. Rabe, M., Verdes, D., e Seeger, S. (2011). Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces. Advances in Colloid and Interface Science. 162. 87-106. 2. Kim, JH e Hong, HJ (2012). Humanization by CDR Grafting and Specificity-Determining Residue Grafting. In P. Chames (Ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols (2a Edição, pág. 237-245). New York: Humana Press
Claims (8)
1. Método de separação de entidades alvo de uma amostra que compreende entidades alvo e entidades não alvo, caracterizado pelo fato de que referido método compreende: (a) fornecer pelo menos um complexo de anticorpo tetramérico mono- específico (TAC) acoplado a partículas magnéticas, em que o TAC é específico para as entidades alvo; (b) colocar em contato a amostra com as partículas magnéticas acoplada ao TAC mono-específico sob condições para permitir a ligação das partículas magnéticas acoplada ao TAC mono- específico às entidades alvo; e (c) separar as entidades alvo - partículas magnéticas acoplada ao TAC mono-específico da amostra para separar as entidades alvo das entidades não alvo através do posicionamento da referida amostra em um campo magnético de intensidade suficiente para separar as entidades alvo das entidades não alvo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as entidades alvo são selecionadas a partir do grupo que consiste em células, bactérias, vírus, organelas celulares, proteínas e ácidos nucleicos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as entidades alvo são células.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as células são selecionadas a partir do grupo que consiste em eritrócitos, linfócitos, monócitos, granulócitos, células tumorais, células tronco, células progenitoras hematopoiéticas, células mesenquimais, células epiteliais mamárias, células neurais, células tronco endoteliais, células progenitoras endoteliais e células tronco embrionárias.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células são eritrócitos.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o TAC mono-específico compreende anticorpos anti-glicoforina A.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a célula é granulócito.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o TAC mono-específico compreende anticorpos anti-CD66b.
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