BR112016016342B1

BR112016016342B1 - Polipeptídeo variante possuindo atividade de lactase, método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase, composição, uso de um polipeptídeo variante e processo para a produção de um produto lácteo

Info

Publication number: BR112016016342B1
Application number: BR112016016342-7A
Authority: BR
Inventors: René Marcel De Jong; Ulrike Maria Müller; Petrus Jacobus Theodorus Dekker
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2023-05-09
Also published as: US20180320156A1; AU2015206094A1; EP3094723B1; ES2670422T3; WO2015107050A1; JP6632526B2; CN105899659A; EP3094723A1; BR112016016342A2; US9994837B2; DK3094723T3; US20160333331A1; NZ720283A; AU2015206094B2; MX2016009149A; US10612013B2; EP3339433A1; JP2017507644A

Abstract

VARIANTES DE ENZIMA MELHORADAS. A invenção se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase. A invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo variante, a um construto de ácido nucleico que compreende a dita sequência de ácido nucleico, a um vetor de expressão recombinante que compreende o dito construto de ácido nucleico e a uma célula hospedeira recombinante que compreende o dito vetor de expressão. Além disso, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de lactase por meio do uso de tal célula hospedeira. Ademais, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase. A invenção se refere, ainda, a uma composição que compreende uma variante de lactase, ao uso de tal variante de lactase ou ao uso de uma composição que contém variante de lactase na preparação de um produto lácteo, a um processo para a produção de um produto lácteo e ao produto lácteo resultante.

Description

Campo da invenção

[001] A invenção se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase. A invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo variante, a um construto de ácido nucleico que compreende a dita sequência de ácido nucleico, a um vetor de expressão recombinante que compreende o dito construto de ácido nucleico e a uma célula hospedeira recombinante que compreende o dito vetor de expressão. Além disso, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de lactase com o uso de tal célula hospedeira. Ademais, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase. A invenção se refere, ainda, a uma composição que compreende uma variante de lactase, ao uso de tal variante de lactase ou ao uso de uma composição que contém variante de lactase na preparação de um produto lácteo, a um processo para a produção de um produto lácteo e ao produto lácteo resultante.

Antecedentes da invenção

[002] Esta invenção se refere à lactase. A lactase ou a beta-galactosidase (E.C: 3.2.1.23) é uma enzima, a qual catalisa a hidrólise de lactose (um dissacarídeo) em seus monossacarídeos componentes glicose e galactose. A lactose está presente em produtos lácteos e, mais especificamente, em leite, leite desnatado, creme, sorvete, produtos de leite fermentado, como iogurte, muito queijos novos e outros produtos lácteos. A ruptura de lactose ocorre na parede intestinal de mamíferos jovens (entres os quais estão os seres humanos) através da presença natural de lactase. Apenas uma pequena parte da população adulta não perdeu essa propriedade e ainda consegue digerir lactose. Os problemas nutricionais e funcionais causados pela lactose na maioria dos adultos se devem a uma falta de lactase e são bem conhecidos e descritos. Os membros de tais populações não conseguem hidrolisar lactose, a qual, nesses casos, passa para o intestino grosso, onde resulta em desidratação, absorção de cálcio insuficiente, flatulência, eructação e cólicas e, em casos graves, até mesmo diarreia aquosa explosiva.

[003] Uma aplicação industrial importante da lactase se dá na produção de produtos lácteos hidrolisados por lactose para indivíduos intolerantes à lactose. Tais produtos lácteos hidrolisados incluem leite pasteurizado, leite UHT e leite reconstituído a partir de todos ou parte de seus constituintes originais com ou sem etapas de processamento intermediárias, como hidrólise de proteína. O tratamento com lactase pode ser realizado antes ou após o tratamento térmico do leite. O tratamento com lactase pode ser realizado adicionando-se a enzima ao leite ou a um de seus constituintes que contêm lactose.

[004] As propriedades de solubilidade da lactose são tais que podem levar à sua cristalização quando presente a uma alta concentração, resultando em uma textura arenosa ou áspera em produtos lácteos, como leite condensado, leite evaporado, leite seco, leite congelado, sorvete, e em produtos de confeitaria com um alto teor de leite. Uma hidrólise total ou parcial de lactose por lactase elimina esse problema, fornecendo produtos com uma textura homogênea e, como resultado, uma maior aceitação do consumidor.

[005] Outra aplicação industrial de lactase se dá no aumento do sabor doce em produtos que contêm lactose, como leite ou iogurte. A hidrólise de lactose em tais produtos resulta em um sabor doce intensificado como resultado da produção de glicose, embora o valor calórico do produto não aumente. Ao contrário, o uso da lactase também pode diminuir a adição de açúcar em produtos lácteos adoçados, sem comprometer o sabor doce.

[006] Outra aplicação industrial de lactase é a hidrólise de produtos de lactose que contêm componentes lácteos, como pão. A lactose é adicionada em tais produtos para intensificar o sabor, reter umidade, fornecer escurecimento e melhorar propriedades de torração. Os xaropes de lactose hidrolisados são promissores em termos de, por exemplo, melhora de desenvolvimento de cor de crosta, melhora de sabor e aroma, modificação de textura, extensão de vida de prateleira e fortalecimento da estrutura do pão.

[007] A hidrólise de lactose por lactase em produtos de leite fermentado, como iogurte, irá aumentar o sabor doce. Além disso, quando a lactase é adicionada antes do início do processo fermentativo, pode aumentar a taxa de desenvolvimento ácido e, então, reduzir os períodos de processamento. O tratamento com lactase de produtos lácteos ou derivados de leite, como soro de leite, torna tais produtos adequados para aplicação em ração animal e alimento para animais para animais intolerantes à lactose, como gatos. A hidrólise de lactose permite a fabricação de soro de leite de maior concentração e, ao mesmo tempo, evita problemas intestinais, similares àqueles descritos anteriormente para pacientes com deficiência de lactose. Soro de leite hidrolisado por lactose é concentrado para produzir um xarope contendo 70 a 75 % de sólidos e é usado como um ingrediente alimentício em sorvete, produtos de panificação e produtos de confeitaria.

[008] As lactases foram descritas e isoladas de uma grande variedade de organismos, incluindo micro-organismos. A lactase é, com frequência, um componente intracelular de micro-organismos, como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces e, especialmente, K. fragilis e K.lactis, e outras leveduras, como aquelas dos gêneros Candida, Torula e Torulopsis, são uma fonte comum de lactases de levedura, enquanto bactérias B. coagulans, B. circulans ou ácido lácticas são fontes bem conhecidas de lactases bacterianas. Diversas preparações comerciais de lactase, derivadas daqueles organismos, estão disponíveis, como Maxilact® (de K. lactis, produzido por DSM, Delft, Holanda). Essas lactases são as denominadas lactases neutras, já que têm um pH ideal entre pH = 6 e pH = 8.

[009] Embora as lactases neutras de levedura sejam frequentemente usadas na indústria para produzir produtos lácteos sem lactose ou com redução de lactose, o custo de utilização para o tratamento enzimático é, com frequência, alto. As principais razões para o custo de utilização relativamente alto das enzimas são: •A fim de manter condições higiênicas na usina de produção, a incubação é realizada a uma baixa temperatura. Nessa temperatura, as lactases industrialmente usadas não são muito ativas e devem ser adicionadas a uma dosagem relativamente alta. •As lactases atualmente usadas são inibidas por seus produtos, especialmente, galactose, em estágios posteriores da incubação com lactase. Quando os produtos com uma baixa concentração de lactose residual são exigidos, enzimas extras têm que ser adicionadas para compensar a redução da atividade devido ao acúmulo de galactose. •A lactase atualmente usada tem uma atividade específica relativamente baixa em leite, o que exige o uso de uma alta dosagem de enzima na aplicação.

[0010] Consequentemente, a dosagem de enzima e o custo para produzir produtos com redução de lactose e sem lactose são relativamente altos.

[0011] É evidente que há uma necessidade por uma ou múltipla(s) variante(s) de lactase capaz(es) de superar pelo menos uma das desvantagens mencionadas acima.

Sumário da invenção

[0012] A invenção se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, isto é, a uma variante de lactase. Uma variante de lactase da invenção pode ter uma ou mais propriedades melhoradas em comparação a um polipeptídeo de referência, sendo que o polipeptídeo de referência tipicamente tem atividade de lactase. Um polipeptídeo de referência pode ter uma lactase do tipo selvagem, por exemplo, a lactase de K. lactis. Polipeptídeos variantes da invenção podem ser denominados como “variante de lactase”, uma “lactase melhorada” e similares. Variantes de lactase neutra de Kluyveromyces foram geradas, as quais têm propriedades que resultam em uma redução do custo de utilização de tais lactases na produção de produtos lácteos com redução de lactose ou sem lactose. Uma variante de lactase com uma propriedade melhorada relevante para a produção de laticínios pode demonstrar: • uma maior atividade específica em ONPG; • uma maior atividade específica em lactose; • uma maior atividade em lactose em leite a uma baixa temperatura; • uma redução em inibição de galactose; e/ou • uma maior produção de GOS em leite.

[0013] Cada uma dessas melhoras pode ser determinada em comparação a um polipeptídeo de referência. Além disso, um polipeptídeo variante da invenção pode ter pelo menos 2 ou 3 ou 4 propriedades melhoradas em comparação a um polipeptídeo de referência. A Tabela 1 fornece exemplos de combinações de propriedades melhoradas.

[0014] De acordo com a invenção, é fornecido, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0015] A invenção também fornece: - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma variante da invenção; - um construto de ácido nucleico que compreende tal sequência de ácido nucleico ligada de modo operável a uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão de uma lactase em um hospedeiro de expressão adequado; - um vetor de expressão recombinante que compreende tal construto de ácido nucleico; e - uma célula hospedeira recombinante que compreende tal vetor de expressão.

[0016] A invenção também se refere a um método para produzir uma lactase que compreende cultivar a célula hospedeira da invenção sob condições favoráveis à produção da lactase e recuperar a lactase.

[0017] Ademais, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase, sendo que o método compreende: a) selecionar um polipeptídeo que tem atividade de lactase; b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2; c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais como definido em b); d) preparar a variante resultante das etapas a) a c); e) determinar uma propriedade da variante; e f) selecionar uma variante que tem uma propriedade alterada em comparação à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2 e selecionar uma variante que tem pelo menos 60 % identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 para produzir, desse modo, uma variante de polipeptídeo de lactase.

[0018] Além disso, a invenção se refere a: - uma composição que compreende a variante da invenção ou obtenível por um método da invenção; - uso de uma lactase variante de acordo com a invenção ou de uma composição da invenção na preparação de um produto lácteo; - um processo para a produção de um produto lácteo, sendo que tal método compreende adicionar uma quantidade eficaz de uma lactase variante de acordo com a invenção ou de uma composição da invenção ao leite e realizar etapas adicionais adequadas de fabricação de produtos lácteos; e - um produto lácteo obtenível por tal processo ou uso. Breve descrição da listagem de sequências

[0019] SEQ ID NO 1 define a sequência de ácido nucleico da sequência genética de lactase do tipo selvagem de K. lactis

[0020] SEQ ID NO: 2 define a sequência de aminoácido da sequência de lactase de K. lactis.

Descrição detalhada da invenção

[0021] Ao longo do presente relatório descritivo e dos desenhos anexos, as palavras "compreender”, "incluir" e “ter” e variações, como "compreende", "que compreende", "inclui" e "que inclui" devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros, não especificamente citados, quando o contexto permite.

[0022] Os artigos "um" e "uma" são usados no presente documento para se referirem a um ou mais do que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Com fins exemplificativos, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0023] No presente documento, “lactase” ou betagalactosidase (E.C. 3.2.1.23) é uma enzima, a qual catalisa a hidrólise de lactose (um dissacarídeo) em seus monossacarídeos componentes glicose e galactose. Galacto- oligossacarídeos (GOS) podem ser formados durante essa reação devido à atividade de transferase da enzima lactase.

[0024] A lactase é encontrada no intestino de mamíferos jovens, em plantas, fungos, leveduras e bactérias.

[0025] A lactase pode ser uma lactase neutra ou ácida. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo variante da invenção tem atividade de lactase neutra, isto é, tem seu pH ideal entre pH=6 e pH=8.

[0026] A lactase pode ser uma lactase produzida de modo intracelular ou extracelular. Em uma modalidade preferencial, a lactase é uma lactase produzida de modo intracelular.

[0027] Uma codificação de gene ou cDNA para lactase, por exemplo, uma variante da invenção, pode ser clonada e superexpressa em um organismo hospedeiro. Organismos hospedeiros bem conhecidos que podem ser usados para superexpressão de lactase incluem Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Escherichia coli, Pichia, Saccharomyces, Yarrowia, Neurospora, Lactococcus ou Bacillus.

[0028] No presente documento, posições que podem ser substituídas para alcançar uma variante da invenção são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 que é a lactase de K. lactis.

[0029] A invenção se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase. O polipeptídeo de referência pode ser tipicamente um polipeptídeo do tipo selvagem que tem atividade de lactase, como a lactase da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência relacionada. O polipeptídeo de referência também pode ser denominado como um polipeptídeo de origem ou polipeptídeo de comparação.

[0030] Mais especificamente, a invenção se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0031] Um polipeptídeo de referência do tipo selvagem pode ser obtido a partir de qualquer organismo adequado. Tipicamente, um polipeptídeo de referência do tipo selvagem pode ser obtido a partir de um micro-organismo, de preferência, um em que a lactase é produzida naturalmente.

[0032] Tal micro-organismo inclui levedura, como Kluyveromyces. Um polipeptídeo de referência pode ser uma sequência do tipo selvagem de K. lactis.

[0033] De preferência, o polipeptídeo de referência é a lactase definida em SEQ ID NO: 2.

[0034] Um polipeptídeo variante como descrita no presente documento é tipicamente um polipeptídeo de ocorrência não natural.

[0035] De acordo com a invenção, é fornecido, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende A sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0036] Um polipeptídeo variante terá tipicamente pelo menos uma propriedade melhorada em comparação a um polipeptídeo de referência, em particular, em relação a uma propriedade relevante ao uso do polipeptídeo variante em um processo para preparar um produto lácteo.

[0037] Em particular, a propriedade melhorada pode se relacionar à atividade ou atividade específica ou a uma redução de inibição de galactose ou a uma maior produção de GOS no leite.

[0038] A Tabela 1 define posições que influenciam propriedades específicas das variantes de lactase da invenção. Tabela 1: Substituições preferenciais definidas em relação à SEQ ID NO:2. Propriedades diferenciais, como atividade específica em ONPG ou lactose como substrato, atividade no leite a uma baixa temperatura, redução de inibição da atividade de lactase por galactose e uma maior produção de galacto-oligossacarídeo no leite, são indicadas

[0039] Um polipeptídeo variante da invenção pode demonstrar uma maior atividade específica em ONPG.

[0040] A invenção fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em ONPG em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0041] De preferência, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 415, 483, 619, 621, 622 ou 633 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em ONPG em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. É preferencial que seja pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 415 e/ou 619, sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2.

[0042] Mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de T415C, T415A, A483S, V619I, I621V, M622L ou T633G, sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em ONPG em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. A substituição de T415C e/ou V619I é preferencial, sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2.

[0043] Outro polipeptídeo variante da invenção pode demonstrar uma maior atividade específica em lactose. Já que a lactose é o substrato natural em produtos lácteos de lactase, uma maior atividade específica do polipeptídeo variante pode resultar em uma redução da dosagem exigida da enzima e, portanto, pode resultar um menor custo do tratamento. Reduzindo-se a dosagem de enzima na aplicação, a quantidade de atividades secundárias adicionadas também é reduzida e, portanto, uma maior qualidade do produto lácteo final deve ser esperada.

[0044] A invenção fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em lactose em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0045] De preferência, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 415, 440 ou 483 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em lactose em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. É preferencial que seja pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 415 e/ou 483 (essa preferência é baseada na análise de variantes de lactase que compreendem uma combinação de substituições), sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2.

[0046] Mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de T415C, T415A, Y440F ou A483S, sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em lactose em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. A substituição de T415A, T415C e/ou A483S é preferencial (essa preferência é baseada na análise de variantes de lactase que compreendem uma combinação de substituições), sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2.

[0047] Ainda mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos duas, três, quatro ou cinco substituições de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma maior atividade específica em lactose em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0048] Exemplos de tais mutantes são mutantes 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, como descrito na Tabela 5.

[0049] Ainda, outro polipeptídeo variante da invenção pode demonstrar uma maior atividade em lactose no leite, de preferência, a baixas temperaturas (de preferência, as ditas baixas temperaturas estão na faixa de 4 a 12 °C) . Já que as lactases são frequentemente usadas no leite a uma baixa temperatura, uma atividade aumentada do polipeptídeo variante nessa aplicação específica pode resultar na redução da dosagem de enzima e, desse modo, pode reduzir os custos. Adicionalmente, uma maior atividade do polipeptídeo variante pode resultar em uma redução no tempo de processamento do leite e, portanto, reduz o risco de uma possível deterioração microbiana.

[0050] A invenção fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0051] De preferência, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258,263, 274, 284, 297, 440, 619, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. Uma substituição de (pelo menos) um resíduo de aminoácido correspondente ao aminoácido 440 é preferencial, sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2 (essa preferência é baseada na análise de variantes de lactase que compreendem uma combinação de substituições). Uma combinação preferencial de substituições é uma substituição na posição 440 e 619.

[0052] Mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de D233V, D257G, A258T, N263S, K274E, N284S, E297G, Y440F, V619I, T633G, L862V ou A1004P sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2. Uma substituição de (pelo menos) Y440F é preferencial, sendo que a dita posição é definida com referência à SEQ ID NO: 2 (essa preferência é baseada na análise de variantes de lactase que compreendem uma combinação de substituições). Uma combinação preferencial de substituições é Y440F+V619I.

[0053] No entanto, a presença de pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 440, 619, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 é suficiente parar obter um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase e que mostra, ainda, uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura, também é mostrado, no presente documento, que polipeptídeos variantes com mutação dupla ou tripla também demonstram atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura.

[0054] Como resultado, a invenção também fornece u polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que o variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, que compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos duas substituições selecionadas a partir de 263, 274 ou 284 (mais preferencialmente, N263S, K274E ou N284S), sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0055] A invenção fornece, ainda, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, que compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende substituições nas posições 263, 274 e 284 (de preferência, as ditas substituições são N263S, K274E e N284S) sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0056] A invenção fornece, ainda, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, que compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende substituições nas posições 257 e 297 (de preferência, as ditas substituições são D257G e E297G), sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0057] A invenção também fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos três, quatro ou cinco substituições de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma atividade aumentada em lactose no leite a uma baixa temperatura em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0058] Exemplos de tais mutantes são os mutantes 15, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, como descrito na Tabela 5.

[0059] Ainda, um polipeptídeo variante adicional da invenção pode demonstrar uma redução da inibição de galactose. A inibição de galactose resulta em uma hidrólise vagarosa de lactose em pontos no tempo posteriores, quando a concentração de lactose está baixa e quando a concentração de galactose está alta. Seria desejável, então, uma enzima lactase que tenha inibição de galactose reduzida, especialmente quando se deseja produzir um produto lácteo em que a concentração de lactose é menor do que 0,5 g/l.

[0060] A invenção fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma inibição de galactose diminuída em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0061] De preferência, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 619, 621 ou 622 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma inibição de galactose diminuída em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0062] Mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de V619I, I621V ou M622L sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma inibição de galactose diminuída em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0063] Ainda, um polipeptídeo variante adicional da invenção pode demonstrar produção de GOS aumentada no leite. Os GOS (galacto-oligossacarídeos) são prebióticos que são definidos como ingredientes alimentícios não digeríveis que afetam de modo benéfico o hospedeiro estimulando o crescimento e/ou a atividade de bactérias benéficas no cólon. Nem todas as lactases são igualmente adequadas para preparar os GOS. Seria desejável ter outra enzima lactase que fosse capaz de acumular GOS à baixa concentração de lactose que está presente no leite (< 50 g/l).

[0064] A invenção fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma produção de GOS aumentada no leite em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0065] De preferência, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 619 ou 622 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma produção de GOS aumentada no leite em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0066] Mais preferencialmente, a invenção fornece um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de V619I ou M622L sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante demonstra uma produção de GOS aumentada no leite em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0067] Uma lactase variante da invenção também pode compreender modificações adicionais em comparação à original nas posições diferentes daquelas especificada acima, por exemplo, uma ou mais substituições, adições ou deleções adicionais. Uma variante da invenção pode compreender uma combinação de diferentes tipos de modificação dessa ordem. Uma variante pode compreender uma, duas, três, quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30 ou mais de tais modificações (que podem ser todas do mesmo tipo ou podem ser de diferentes tipos de modificação). Tipicamente, as modificações adicionais podem ser substituições. A invenção também fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase e em que o dito polipeptídeo variante compreende substituições adicionais diferentes daquelas definidas e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0068] Uma variante de acordo com a invenção (por exemplo, uma variante que tem uma ou mais substituição, como definido na Tabela 1 ou Tabela 2) pode ter pelo menos cerca de 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 80 % de homologia/identidade com o polipeptídeo de lactase de referência, como a lactase de SEQ ID NO: 2, por exemplo, pelo menos cerca de 85 % de homologia com o polipeptídeo de origem, como pelo menos cerca de 90 % de homologia com o polipeptídeo de origem, pelo menos 95 % de homologia com o polipeptídeo de origem, pelo menos cerca de 98 % de homologia com o polipeptídeo de origem ou pelo menos cerca de 99 % de homologia com o polipeptídeo de origem. Tal variante terá tipicamente uma ou mais substituição ou conjuntos de substituições, como definido na Tabela 1 ou Tabela 2.

[0069] A invenção também fornece, então, um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase e em que a dita variante tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0070] A variante da invenção irá reter tipicamente a atividade de lactase. Ou seja, uma variante da invenção será tipicamente capaz de converter lactose em glicose e galactose ou uma variante da invenção será tipicamente capaz de converter lactose em glicose e galactose e capaz de formar GOS. Uma variante da invenção é aquela que é tipicamente capaz de realizar uma conversão enzimática de lactose e que pode ser usada na preparação de um produto lácteo, como um leite ou iogurte.

[0071] De preferência, uma variante da invenção irá exibir tipicamente propriedades melhoradas em comparação ao polipeptídeo de lactase de referência a partir do qual é derivada. Tal propriedade melhorada será tipicamente aquela que é relevante se a variante fosse usada como definido abaixo, por exemplo, em um método para preparar um produto lácteo.

[0072] Um polipeptídeo variante que exibe uma propriedade que é melhorada em relação à lactase de referência é aquela que demonstra uma redução ou um aumento mensurável na propriedade relevante, tipicamente de modo que a variante seja mais adequada de usar como definido abaixo, por exemplo, em um método para a produção de um produto lácteo.

[0073] A propriedade pode ser, então, diminuída em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 % pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 %. De modo alternativo, a propriedade pode ser aumentada em pelo menos 10 %, pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 100 %, pelo menos, 200 %, pelo menos 500 % ou pelo menos 1000 %. A diminuição ou o aumento percentual nesse contexto representa a diminuição ou o aumento percentual em comparação ao polipeptídeo de lactase de referência. É bem conhecido pela pessoa versada na técnica como tais alterações de porcentagem podem ser medidas - é uma comparação da atividade da lactase de referência e da lactase variante.

[0074] As variantes descritas no presente documento são coletivamente compreendidas nos termos “um polipeptídeo de acordo com a invenção” ou “uma variante de acordo com a invenção”.

[0075] Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado de modo alternado como exigido pelo contexto para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados por ligações peptídicas. A palavra "polipeptídeo" é usada no presente documento para cadeias que contenham mais de cerca de sete resíduos de aminoácido. Todos os oligopeptídeos e fórmulas de polipeptídeo ou sequências no presente documento são escritos da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para o terminal carboxi. O código de uma letra de aminoácidos usados no presente documento é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0076] Um polipeptídeo da invenção pode estar uma forma isolada, como uma forma substancialmente isolada. Polipeptídeo ou proteína "isolada" se refere a um polipeptídeo ou uma proteína removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas produzidos de modo recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção já que são polipeptídeos recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada. Um polipeptídeo variante de acordo com a invenção pode ser recuperado e purificado a partir de culturas celulares recombinantes por métodos conhecidos na técnica.

[0077] Polipeptídeos da presente invenção incluem produtos de procedimentos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células bacterianas, fúngicas, vegetais superiores, de levedura, de insetos e de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos, como resultado de processos mediados por hospedeiro.

[0078] A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos variantes de acordo com a invenção. Tais fragmentos são considerados como abrangidos pelo termo “uma variante da invenção”.

[0079] Fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo variante da invenção incluem polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácido suficientemente idênticas ou derivadas da sequência de aminoácido de uma proteína variante da invenção que inclui menos aminoácidos do que a proteína de comprimento total, porém, que exibe pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento total correspondente. Tipicamente, fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína variante da invenção. Um fragmento biologicamente ativo de uma proteína da invenção pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, outras porções biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da invenção.

[0080] Tipicamente, um fragmento de proteína da invenção irá compreender uma ou mais das substituições definidas no presente documento.

[0081] A invenção também apresenta fragmentos de ácido nucleico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima (tais fragmentos biologicamente ativos são, por si sós, variantes da invenção).

[0082] A presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos variantes da invenção. A invenção também fornece, então, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[0083] A invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um domínio funcional de um polipeptídeo variante da invenção. Tipicamente, tal domínio irá compreender uma ou mais das substituições descritas no presente documento.

[0084] Em uma modalidade da invenção, a sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma sequência de aminoácido que tem uma ou mais truncamentos, e/ou pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção de um aminoácido em comparação à lactase de origem. Tal polipeptídeo irá compreender tipicamente, no entanto, uma ou mais das substituições descritas no presente documento.

[0085] Como usado no presente documento, os termos “gene” e “gene recombinante” se referem a moléculas de ácido nucleico que incluem um quadro de leitura aberta que codifica uma variante, como descrito no presente documento. Um gene pode incluir sequências de codificação, sequências de não codificação, íntrons e sequências reguladoras. Ou seja, um “gene”, como usado no presente documento, pode se referir a uma molécula de ácido nucleico isolada, como definido no presente documento. Consequentemente, o termo “gene”, no contexto do presente pedido, não se refere apenas a sequências de ocorrência natural.

[0086] Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser gerada com o uso de técnicas padrão de biologia molecular bem conhecidas por aqueles que são versados na técnica consideradas em conjunto com as informações de sequência fornecidas no presente documento.

[0087] Por exemplo, com o uso de técnicas sintéticas padrão, a molécula de ácido nucleico exigida pode se sintetizada novamente. Tal processo sintético será tipicamente um processo automatizado.

[0088] De modo alternativo, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser gerada com o uso de mutagênese sítio-direcionada de uma molécula de ácido nucleico existente, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico do tipo selvagem. A mutagênese sítio-direcionada pode ser realizada com o uso de diversas técnicas bem conhecidas por aqueles que são versados na técnica.

[0089] Em tal método, mencionado no presente documento meramente com fins exemplificativos, a PCR é realizada em um modelo de plasmídeo com o uso de "iniciadores" de oligonucleotídeo que codificam a substituição desejada. Já que os iniciadores são as extremidades de filamentos recém- sintetizados, caso haja um erro de emparelhamento durante o primeiro ciclo na ligação do filamento de DNA modelo, após aquela primeira fase, o filamento baseado em iniciador (contendo a mutação) estaria a uma concentração igual ao modelo original. Após ciclos sucessivos, esse cresceria exponencialmente e, após 25, excederia o filamento original sem mutação na região de 8 milhões: 1, resultando em uma solução quase homogênea de fragmentos ampliados com mutação. O DNA modelo pode ser, então, eliminado por digestão enzimática, por exemplo, com o uso de uma enzima de restrição que cliva apenas DNA metilado, como Dpn1. O modelo, o qual é derivado de uma preparação de plasmídeo por lise alcalina e, portanto, é metilado, é destruído nessa etapa, porém, o plasmídeo com mutação é preservado, já que foi gerado in vitro e é não metilado como resultado.

[0090] Em tal método, mais de uma mutação (que codifica uma substituição como descrito no presente documento) pode ser introduzido em uma molécula de ácido nucleico em uma reação PCR única, por exemplo, com o uso de um ou mais oligonucleotídeos, sendo que cada um compreende um ou mais erros de emparelhamento. De modo alternativo, mais de uma mutação pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucleico realizando-se mais de uma reação PCR, sendo que cada reação introduz uma ou mais mutações, para que os ácidos nucleicos alterados sejam introduzidos no ácido nucleico de uma maneira iterativa e sequencial.

[0091] Um ácido nucleico da invenção pode ser gerado com o uso de cDNA, mRNA ou, de modo alternativo, DNA genômico, como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeo incompatibilizados adequados de acordo com a técnica de mutagênese sítio-direcionada descrita acima. Uma molécula de ácido nucleico derivada desse modo pode ser clonada em um vetor adequado e distinguida por análise de sequência de DNA.

[0092] Uma sequência de ácido nucleico da invenção pode compreender uma ou mais deleções, isto é, gaps, em comparação à lactase de origem. Tais deleções/gaps também podem ser geradas com o uso de mutagênese sítio-direcionada usando oligonucleotídeos adequados. As técnicas para gerar tais deleções são bem conhecidas por aqueles que são versados na técnica.

[0093] Além disso, oligonucleotídeos correspondentes ou hibridizáveis a sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padrão, por exemplo, com o uso de um sintetizador de DNA automatizado.

[0094] Ademais, moléculas de ácido nucleico complementares são incluídas na presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico que é complementar à outra sequência de nucleotídeo é aquela que é suficientemente complementar à outra sequência de nucleotídeo de tal modo que possa se hibridizar à outra sequência de nucleotídeo, formando, desse modo, um dúplex estável.

[0095] Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma variante da invenção, ou um fragmento biologicamente ativo ou domínio desse, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da invenção e fragmentos de tais moléculas de ácido nucleico adequadas para uso como iniciadores de PCR para a ampliação ou mutação de moléculas de ácido nucleico, como para a preparação de moléculas de ácido nucleico da invenção.

[0096] Um “polinucleotídeo isolado” ou “ácido nucleico isolado” é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguo a ambas as sequências de codificação com as quais é imediatamente contíguo (um na extremidade 5’ e um na extremidade 3’) no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual é derivado. Desse modo, em uma modalidade, um ácido nucleico isolado inclui algumas ou todas as sequências não codificadores em 5’ (por exemplo, promotor) que são imediatamente contíguas à sequência codificadora. O termo inclui, portanto, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus em replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endonuclease de restrição) independentemente de outras sequências. Também inclui um DNA recombinante que faz parte de um gene híbrido que codifica um polipeptídeo adicional que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursores químicos ou outras substâncias químicas (quando quimicamente sintetizado). Além disso, um “fragmento de ácido nucleico isolado” é um fragmento de ácido nucleico que não é de ocorrência natural como um fragmento e não seria encontrado no estado natural.

[0097] Como usado no presente documento, os termos “polinucleotídeo” ou “molécula de ácido nucleico” são destinados a incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerado com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ter filamento único ou filamento duplo, porém, de preferência, é um DNA de filamento duplo. O ácido nucleico pode ser sintetizado com o uso de análogos de oligonucleotídeo ou derivados (por exemplo, nucleotídeos inosina ou fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucleicos que têm capacidades alteradas de pareamento de bases ou resistência aumentada a nucleases.

[0098] Outra modalidade da invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que é antissenso a uma molécula de ácido nucleico da invenção.

[0099] Os termos “homologia” ou “identidade percentual” são usados de modo alternado no presente documento. Para o propósito desta invenção, é definido no presente documento que, a fim de determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácido ou duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideais (por exemplo, gaps podem ser introduzidos na sequência de um primeiro aminoácido ou ácido nucleico para um alinhamento ideal com uma segunda sequência de ácido nucleico ou aminoácido). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeo em posições correspondentes de aminoácido ou nucleotídeo são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo menos resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então, as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/ número total de posições (isto é, posições sobrepostas) x 100). De preferência, as duas sequências têm o mesmo comprimento.

[00100] Uma comparação de sequência pode ser realizada por todo o comprimento das duas sequências sendo comparadas ou pelo fragmento das duas sequências. Tipicamente, a comparação será realizada por todo o comprimento das duas sequências sendo comparadas. No entanto, a identidade de sequência pode ser realizada por uma região de, por exemplo, vinte, cinquenta, cem ou mais resíduos de aminoácido contíguos.

[00101] A pessoa versada na técnica estará ciente do fato de que diversos programas de computador diferentes estão disponíveis para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e a determinação de identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferencial, a identidade percentual entre duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido é determinada com o uso de algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 a 453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote do software Accelrys GCG (disponível em http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A pessoa versada na técnica irá observar que todos esses diferentes parâmetros produzirão resultados ligeiramente diferentes, porém, a identidade percentual total de duas sequências não é significantemente alterada quando diferentes algoritmos são usados.

[00102] As sequências de proteína ou sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser usadas, ainda, como uma “sequência de consulta” para realizar uma busca em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar outros membros de família ou sequências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas com o uso dos programas BLASTN e BLASTP (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTP, pontuação= 50, extensão de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas a moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, o BLAST Intervalado pode ser utilizado, como descrita em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389 a 3402. Ao utilizar os programas BLAST e BLAST Intervalado, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTP e BLASTN) podem ser usados. Consultar a página do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[00103] A invenção fornece, ainda, um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo variante que tem atividade de lactase, em que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que compreende a sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dos aminoácidos 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e sendo que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação a um polipeptídeo de referência que tem atividade de lactase (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2, em que a dita sequência de ácido nucleico é ligada de modo operável a uma ou mais sequências de controle capaz de direcionar a expressão de uma lactase em uma célula hospedeira de expressão adequada.

[00104] Outro aspecto da invenção pertence a vetores, de preferência, vetores de expressão, contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de lactase variante da invenção.

[00105] Como usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um laço de DNA de filamento duplo circular ao qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais de mamífero) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente ao genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais são ligados operativamente. Tais vetores são denominados no presente documento como “vetores de expressão”. Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de modo alternado no presente documento já que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção é destinada a incluir tais outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados de replicação defeituosa), os quais têm funções equivalentes.

[00106] Os vetores de expressão recombinante da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, as quais são operativamente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Em um vetor de expressão recombinante, “operativamente ligado” é destinado a significar que a sequência de nucleotídeo de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) de uma maneira que permita a expressão da sequência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor for introduzido na célula hospedeira). O termo “sequência reguladora” é destinado a incluir promotores, potenciadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão da sequência de nucleotídeo apenas em uma certa célula hospedeira (por exemplo, sequências reguladoras tecido- específicas). Será observado por aqueles que são versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores, como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir, desse modo, proteínas ou peptídeos, codificados por ácido nucleicos, como descrito no presente documento (por exemplo, uma variante de lactase de SEQ ID NO: 2, por exemplo, um equivalente ou fragmento funcional, ou uma proteína de fusão que compreende uma ou mais de tais variantes).

[00107] Os vetores de expressão recombinante da invenção podem ser projetados para expressão de proteínas variantes da invenção em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, uma proteína variante da invenção pode ser expressa em células bacterianas, como E. coli, células de insetos (com o uso de vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamífero. As células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, Gene Expressão Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). De modo alternativo, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, com o uso de sequências reguladoras de promotores T7 e polimerase T7.

[00108] Vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossomais, epissomais e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, levedura, epissoma, elementos cromossomais de levedura, vírus, como baculovírus, papova vírus, vírus vaccinia, adenovírus, vírus da bouba aviária, vírus da pseudoraiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações desses, como aqueles derivados de plasmídeo e elementos genéticos de bacteriófago, como cosmídeos e fagomídeos.

[00109] O inserto de DNA deve ser operativamente ligado a um promotor adequado, como o promotor PL de fago lambda, os promotores lac, trp e tac de E. coli, os promotores SV40 precoces e tardios e promotores de LTRs retrovirais, para citar alguns. Outros promotores adequados serão conhecidos por a pessoa versada na técnica. Em uma modalidade específica, são preferenciais promotores que sejam capazes de direcionar um alto nível de expressão de lactase em fungos filamentosos. Tais promotores são conhecidos na técnica. Os construtos de expressão podem conter sítios para iniciação, terminação de transcrição, e, na região transcrita, um sítio de ligação de ribossoma para tradução. A porção de codificação das transcrições maduras expressas pelos construtos irá incluir um AUG de iniciação de tradução no início e um códon de parada adequadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

[00110] O DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por meio de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Como usado no presente documento, os termos “transformação” e “transfecção” são destinados a se referir a uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica para introduzir ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo coprecipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção mediada por lipídeo catiônico ou eletroporação. Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais laboratoriais.

[00111] Para uma transfecção estável de células de mamífero, it sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usados, apenas uma pequena fração de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente ao gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferenciais incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metatrexato. O ácido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetor que aquele que codifica uma proteína variante da invenção ou pode ser introduzido em um vetor separado. Células transfectadas de modo estável com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármaco (por exemplo, células que têm o gene marcador selecionável incorporado irão sobreviver, enquanto as outras células morrem).

[00112] A expressão de proteínas em procariotas é frequentemente realizada em E. coli com vetores que contêm promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam diversos aminoácidos a uma proteína codificada nesses, por exemplo, ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão têm tipicamente três propósitos: 1) aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligante em purificação por afinidade. Com frequência, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção química de fusão e na proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante a partir da porção química de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão.

[00113] Como indicado, os vetores de expressão irão conter, de preferência, marcadores selecionáveis. Tais marcadores incluem resistência à dihidrofolato redutase ou neomicina para cultura celular eucariótica e resistência à tetracilina ou ampicilina para cultivar em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros adequados incluem células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium e certas espécies de Bacillus, como B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis e B. clausii; células fíngicas, como a espécie Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. oryzae e A. nidulans, e/ou a espécie Fusarium, como F. venenatum, e/ou a espécie Trichoderma, como T. reesei; células de levedura, como Kluyveromyces, por exemplo, K. lactis e K. marxianus e/ou Pichia, por exemplo, P. pastoris, e/ou Saccharomyces, por exemplo, S. cerevisiae, e/ou Hansenula, por exemplo, H. polymorpha; células de insetos, como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais, como CHO, COS e melanoma de Bowes; e células vegetais. Meios de cultura e condições adequados para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica.

[00114] Vetores preferenciais para uso em bactérias são, por exemplo, apresentados no documento WO-A1-2004/074468, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência. Outros vetores adequados serão prontamente evidentes para a pessoa versada na técnica.

[00115] Promotores bacterianos conhecidos adequados para uso na presente invenção incluem os promotores apresentados no documento WO-A1-2004/074468, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência.

[00116] A transcrição do DNA que codifica uma variante da presente invenção por eucariotas superiores pode ser aumentada inserindo-se uma sequência potenciadora no vetor. Os potenciadores são elementos cis-atuantes de DNA, usualmente cerca de 10 a 300 pb que atuam para aumentar atividade transcricional de um promotor em um dado tipo de célula hospedeira. Exemplos de potenciadores incluem o potenciador SV40, o qual está localizado no lado tardio da origem de replicação a 100 a 270 pb, o potenciador de promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e potenciadores de adenovírus.

[00117] Para a secreção da proteína traduzida em lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplasmático ou no ambiente extracelular, o sinal de secreção adequado pode ser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser endógenos ao polipeptídeo ou podem ser sinais heterólogos.

[00118] Uma variante da invenção pode ser expressa em forma de tal modo que possa incluir regiões funcionais heterólogas adicionais, por exemplo, sinais de secreção. Uma variante da invenção também pode compreender, por exemplo, uma região de aminoácidos adicional, particularmente, aminoácidos carregados, adicionados ao N-terminal do polipeptídeo, por exemplo, para melhorar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o manuseio e armazenamento subsequentes. Além disso, as porções químicas de peptídeo podem ser adicionadas a uma variante da invenção para facilitar a purificação, por exemplo, pela adição de resíduos de histidina ou uma etiqueta T7.

[00119] As variantes da invenção, como proteínas da presente invenção ou equivalentes funcionais dessas, por exemplo, porções biologicamente ativas e fragmentos dessas, podem ser operativamente ligadas a uma variante não polipeptídica (por exemplo, sequências de aminoácido heterólogas) para formar proteínas de fusão. Uma "variante não polipeptídica", neste contexto, se refere a um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido correspondente a uma proteína que não é substancialmente homóloga a uma variante de lactase da invenção.

[00120] Em uma proteína de fusão, a variante da invenção pode corresponder a uma sequência de comprimento total ou um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade preferencial, uma proteína de fusão da invenção compreende pelo menos duas porções biologicamente ativas. Na proteína de fusão, o termo "operativamente ligado" é destinado a indicar que o polipeptídeo variante e a variante não polipeptídica são fundidos em quadro entre si. A variante não polipeptídica pode ser fundida ao N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo variante.

[00121] A expressão e a secreção de uma lactase variante podem ser melhoradas expressando-se a variante na forma de uma proteína de fusão. Neste contexto, uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma proteína de fusão que compreende lactase. Mais especificamente, o parceiro de fusão pode ser glucoamilase ou um fragmento desse. Em uma modalidade, a lactase, ou uma proteína de fusão dessa, é secretada pela membrana da célula hospedeira.

[00122] Por exemplo, em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a sequência variante (ou sequências variantes) é fundida ao C-terminal das sequências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de uma variante recombinante de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a proteína de fusão é uma variante da invenção que contém uma sequência de sinal heteróloga em seu N- terminal. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos e levedura), a expressão e/ou a secreção de uma variante da invenção podem ser aumentadas através do uso de uma sequência de sinal heteróloga.

[00123] Em outro exemplo, a sequência secretora gp67 da proteína do envelope do baculovírus pode ser usada como uma sequência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). Outros exemplos de sequências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as sequências secretoras de melitina e fosfatase alcalina placentária humana (Stratagene; La Jolla, Califórnia). Ainda em outro exemplo, sequências de sinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinal secretor phoA (Sambrook et al., supra) e o sinal secretor A de proteína (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nova Jersey).

[00124] Uma sequência de sinal pode ser usada para facilitar a secreção e o isolamento de uma variante da invenção. Sequências de sinal são tipicamente distinguidas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, os quais são geralmente clivados a partir da proteína madura durante a secreção em um ou mais eventos de clivagem. Tais peptídeos de sinal contêm sítios de processamento que permitem a clivagem da sequência de sinal a partir das proteínas maduras à medida que passam pela trajetória secretora. A sequência de sinal pode direcionar a secreção da variante, como a partir de um hospedeiro eucariótico no qual o vetor de expressão é transformado, e a sequência de sinal pode ser, então, subsequente ou simultaneamente clivada. A variante da invenção pode ser, então, prontamente purificada a partir do meio extracelular por métodos conhecidos. De modo alternativo, a sequência de sinal pode ser ligada à variante de interesse com o uso de uma sequência, a qual facilita a purificação, como com um domínio GST. Então, por exemplo, a sequência que codifica a variante da invenção pode ser fundida a uma sequência marcadora, como uma sequência que codifica um peptídeo, a qual facilita a purificação da variante fundida da invenção. Em certas modalidades preferenciais desse aspecto da invenção, a sequência marcadora é um peptídeo hexa-histidina, como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, sendo que muitos desses estão comercialmente disponíveis. Como descrita em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821 a 824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina fornece uma purificação conveniente da proteína de fusão. A etiqueta HA é outro peptídeo útil para purificação que corresponde a um derivado de epítopo de proteína hemaglutinina da influenza, que foi descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por exemplo.

[00125] Uma proteína de fusão da invenção pode ser produzida por técnicas padrão de DNA recombinante. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificam as diferentes sequências de polipeptídeo são ligadas em quadro de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, com o uso de terminais com extremidade cega ou extremidade alternada para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais adequados, preenchimento de extremidades coesas, como adequado, tratamento de fosfatase alcalina para impedir união indesejável e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores de DNA automatizados. De modo alternativo, a ampliação de PCR de fragmentos de gene pode ser realizada com o uso de iniciadores âncora, os quais resultam em saliências complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subsequentemente anelados e reampliados para gerar uma sequência de gene quimérico (consultar, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão estão comercialmente disponíveis que já codificam uma porção química de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico que codifica variante pode ser clonado em tal vetor de expressão de tal modo que a porção química de fusão seja ligada em quadro à dita variante.

[00126] Os termos “equivalentes funcionais” e “variantes funcionais” são usados de modo alternado no presente documento. Equivalentes funcionais de acordo com a invenção são fragmentos de DNA isolados que codificam um polipeptídeo que exibe uma função particular de uma variante, como definido no presente documento. Equivalentes funcionais também abrangem, portanto, fragmentos biologicamente ativos e são eles próprios abrangidos no termo “uma variante” da invenção.

[00127] De preferência, um equivalente funcional da invenção compreende uma ou mais das substituições descritas no presente documento. No entanto, um equivalente funcional pode compreender uma ou mais modificações além das substituições descritas acima.

[00128] Equivalentes funcionais de ácido nucleico podem conter tipicamente mutações silenciosas ou mutações que não alteram a função biológica de polipeptídeo codificado. Consequentemente, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codifica uma proteína de lactase variante que contém alterações em resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica particular. Tais proteínas variantes que diferem em sequência de aminoácido da sequência de lactase de origem a partir da qual são derivadas retêm, ainda, pelo menos uma atividade biológica dessas, de preferência, retêm pelo menos atividade de lactase. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína, em que a proteína compreende uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga de pelo menos cerca de 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de homologia à sequência de aminoácido de referência (por exemplo, aquela mostrada na SEQ ID NO: 2).

[00129] Como definido no presente documento, o termo “substancialmente homóloga” se refere a uma primeira sequência de aminoácido ou nucleotídeo que contém um número suficiente ou mínimo de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral similar) a uma segunda sequência de aminoácido ou nucleotídeo de tal modo que a primeira e a segunda sequências de aminoácido ou nucleotídeo tenham um domínio comum. Por exemplo, sequências de aminoácido ou nucleotídeo que contêm um domínio comum que tem cerca de 60 %, de preferência 65 %, mais preferencialmente 70 %, ainda mais preferencialmente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade ou mais são definidas no presente documento como suficientemente idênticas.

[00130] Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que alterações podem ser introduzidas por mutação nas sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção, resultando, desse modo, em alterações na sequência de aminoácido da proteína resultante sem alterar substancialmente a função de tal proteína.

[00131] Consequentemente, uma variante de lactase da invenção é, de preferência, uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de homologia à sequência de aminoácido de referência, por exemplo, aquela mostrada na SEQ ID NO: 2, e tipicamente também retém pelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo de referência. Variantes da invenção, por exemplo, equivalentes funcionais de uma proteína de acordo com a invenção, também podem ser identificadas, por exemplo, por bibliotecas combinatórias de triagem de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, da proteína da invenção para atividade de lactase. Em uma modalidade, uma biblioteca variegada de variantes é gerada por mutagênese combinatória no nível de ácido nucleico. Uma biblioteca variegada de variantes pode ser produzida, por exemplo, ligando-se enzimaticamente uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em sequências de gene de tal modo que um conjunto degenerado de sequências de proteína potenciais seja expressível como polipeptídeos individuais, ou de modo alternativo, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fago). Há uma variedade de métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes potenciais dos polipeptídeos da invenção a partir de uma sequência de oligonucleotídeo degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

[00132] Além disso, as bibliotecas de fragmentos da sequência que codifica a polipeptídeo da invenção podem ser usadas para gerar uma população variegada de polipeptídeos para triar uma seleção subsequente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de sequência codificadora pode ser gerada tratando-se um fragmento de PCR de filamento duplo da sequência codificadora de interesse com uma nuclease sob condições em que o corte ocorre apenas cerca de uma vez por molécula, desnaturando-se o DNA de filamento duplo, renaturando-se o DNA para formar DNA de filamento duplo que pode incluir pares senso/antissenso de diferentes produtos cortados, removendo-se porções de filamento único de dúplexes reformados por tratamento com S1 nuclease, e ligando-se a biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Através desse método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada, a qual codifica N-terminal e fragmentos internos de vários tamanhos da proteína de interesse.

[00133] Diversas técnicas são conhecidas na técnica para triar produtos genéticos de bibliotecas combinatórias produzidas por mutações de ponto de truncamento, e para triar bibliotecas de cDNA para produtos genéticos que têm uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente usadas, as quais são suscetíveis à análise de alto rendimento, para triar grandes bibliotecas de gene incluem tipicamente a clonagem de biblioteca de gene em vetores de expressão replicáveis, transformando células adequadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressando os genes combinatórios sob condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. A mutagênese de conjunto recursivo (REM), uma técnica que melhora a frequência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de triagem para identificar variantes de uma proteína da invenção (Arkin e Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811 a 7815; Delgrave et al. (1993) Proteína Engineering 6(3): 327 a 331).

[00134] Fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção também podem compreender polinucleotídeos que não codificam polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como sondas ou iniciadores para uma reação PCR.

[00135] Ácidos nucleicos de acordo com a invenção, independentemente de codificarem polipeptídeos funcionais ou não funcionais, podem ser usados como sondas de hibridização ou iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os usos das moléculas de ácido nucleico da presente invenção que não codificam um polipeptídeo que tem atividade de lactase incluem, entre outros, (1) hibridização in situ (por exemplo, FISH) a separações cromossômicas de metáfase para fornecer uma localização cromossômica precisa de um gene que codifica lactase, como descrito em Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nova York (1988); (2) análise Northern blot para detectar a expressão de mRNA de lactase em tecidos e/ou células específicos; e (3) sondas e iniciadores que podem ser usados como uma ferramenta de diagnóstico para analisar a presença de um ácido nucleico hibridizável a tal sonda ou iniciador em uma dada amostra biológica (por exemplo, tecido).

[00136] Variantes de uma dada enzima lactase de referência podem ser obtidas através do seguinte procedimento padrão: - Mutagênese (suscetível a erro, oligo dopado, oligo submetido a spiking) ou síntese de variantes - Transformação em, por exemplo, E.coli ou K. lactis - Cultivo de transformantes, seleção de transformantes - Expressão - Purificação e concentração ideais - Triagem primária - Identificação de uma variante melhorada (por exemplo, em relação à atividade específica)

[00137] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase de acordo com a invenção, sendo que o método compreende: a) selecionar um polipeptídeo de lactase de referência; b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dentre 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2; c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, como definido em b); d) preparar a variante resultante das etapas a) a c); e) determinar uma propriedade da variante, por exemplo, como definido nos Exemplos; e f) selecionar uma variante que tem uma propriedade alterada em comparação ao polipeptídeo de lactase de referência e sendo que a dita variante tem pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

[00138] Em uma modalidade preferencial, no método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase de acordo com a invenção, o polipeptídeo de lactase de referência tem a sequência definida em SEQ ID NO: 2.

[00139] Mais preferencialmente na etapa b) do método de acordo com a invenção, pelo menos um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dentre 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004 é substituído, sendo que as ditas posições são definidas com referência à SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo de referência pode ter pelo menos cerca de 80 % de homologia com SEQ ID NO: 2.

[00140] Em outra modalidade, a invenção apresenta células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucleico abrangido pela invenção. Uma "célula transformada" ou “célula recombinante” é uma célula na qual (ou em um antecedente dessa) foi introduzida, por meio de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucleico de acordo com a invenção. Ambas as células procarióticas e eucarióticas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, levedura e similares, são especialmente preferenciais células de leveduras, por exemplo, K. lactis. Células hospedeiras também incluem, porém, sem limitação, linhagens celulares de mamífero, como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e linhagens celulares do plexo coroide.

[00141] Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são espécies bacterianas gram-positivas, como Bacillaceae incluindo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium e Bacillus thuringiensis, espécies Streptomyces, como Streptomyces murinus, espécie bacteriana de ácido láctico, incluindo Lactococcus spp. como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., incluindo Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp. e Streptococcus spp. De modo alternativo, cepas de uma espécie bacteriana gram-negativa, como uma espécie que pertence a Enterobacteriaceae, incluindo E. coli, ou a Pseudomonadaceae, podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.

[00142] Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado de modo vantajoso a partir de uma espécie de Saccharomyces, incluindo Saccharomyces cerevisiae ou uma espécie que pertence a Schizosaccharomyces. Além disso, organismos hospedeiros de levedura úteis incluem Pichia spp., como espécie metilotrófica dessa, incluindo Pichia pastoris, e Kluyveromyces spp., incluindo Kluyveromyces lactis.

[00143] Organismos hospedeiros adequados entre fungos filamentosos incluem as espécies de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophtora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium ou Trichoderma, como, por exemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans ou Aspergillus niger, incluindo Aspergillus nigervar. awamori, Fusarium bactridioides, Fusarium cereals, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichiodes, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola langinosa, Mucor miehei, Myceliophtora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium chrysogenum, Penicillium camenbertii, Penicillium purpurogenum, Rhizomucor miehei, Thielavia terestris, Tricho- derma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesii ou Trochoderma viride.

[00144] Uma célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto codificado pela sequência de ácido nucleico incorporada de uma maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e tal processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem facilitar um funcionamento ideal da proteína codificada.

[00145] Várias células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para processamento pós-traducional e modificação de proteínas e produtos genéticos. As linhagens celulares ou sistemas de hospedeiro adequados familiares para aqueles que são versados na técnica de biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidas para garantir a modificação e o processamento desejados e corretor da proteína estranha expressa. Com essa finalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento adequado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto genético podem ser usadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.

[00146] Se desejado, uma linhagem celular transfectada de modo estável pode produzir uma variante de acordo com a invenção. Diversos vetores adequados para transfecção estável de células de mamífero estão disponíveis para o público, métodos para construir tais linhagens celulares também são publicamente conhecidos, por exemplo, em Ausubel et al. (supra).

[00147] A presente invenção apresenta, ainda, uma composição que compreende as variantes de lactase de acordo com a invenção. A invenção fornece, então, uma composição que compreende o polipeptídeo variante, como descrito no presente documento, e pelo menos um componente selecionado a partir de sal (como cloreto de sódio ou potássio), conservante, um poliol (como glicerol), íons metálicos (como íons de magnésio ou manganês).

[00148] A composição pode compreender opcionalmente outros ingredientes, como, por exemplo, outras enzimas. Tal composição pode compreender o polipeptídeo variante da invenção ou um polipeptídeo variante obtenível por um método da invenção para identificar uma lactase variante.

[00149] Além da lactase variante, e uma ou mais enzimas adicionais, se estiver presente, uma composição de acordo com a invenção pode compreender aditivos que são convencionalmente usados em preparações de lactase, como, por exemplo, KCI ou glicerol.

[00150] A invenção se refere, ainda, ao uso de um polipeptídeo variante da invenção ou uma composição da invenção na preparação de um produto lácteo.

[00151] A invenção também se refere a um processo para a produção de um produto lácteo, sendo que tal método compreende adicionar uma quantidade eficaz de um polipeptídeo variante ou uma composição da invenção ao leite e permitir que o polipeptídeo variante exerça sua atividade enzimática.

[00152] A invenção se refere a um produto lácteo obtenível por tal processo.

[00153] Como usado no presente documento, um produto lácteo abrange qualquer composição que seja produzida a partir de leite, por exemplo, proteína caseína e/ou soro de leite. Exemplos são leite, produtos derivados de leite, produtos de leite fermentado (por exemplo, iogurte), leite condensado, leite UHT, leite evaporado, leite em pó, leite congelado, sorvete, creme, manteiga, leitelho, soro de leite; e/ou queijo. O produto também pode ser um hidrolisado ou um produto obtido por fracionamento do leite ou soro de leite, como caseinato, concentrado de proteína de leite, concentrado de proteína de soro de leite (WPC), isolado de proteína de soro de leite (WPI) ou permeado de soro de leite (concentrado) e produtos produzidos a partir desse.

[00154] O leite é, por exemplo, obtido de vaca, búfalo, cabra, ovelha, camelo, burro, cavalo, rena, alce ou iaque.

[00155] Uma referência no presente documento a um documento de patente ou outra matéria que é dada como técnica anterior não deve ser considerada como admissão de que aquele documento ou matéria fosse conhecida ou que as informações que essa contém faça parte do conhecimento comum geral a partir da data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[00156] A invenção será elucidada agora com referência aos exemplos a seguir sem que seja, no entanto, limitada a esses.

Exemplos Material geral e métodos Técnicas moleculares e genéticas

[00157] Técnicas biológicas genéticas e moleculares padrão são conhecidas na técnica (por exemplo, Maniatis et al. ”Molecular cloning: a laboratory manual” (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller ”Experiments in molecular genetics” (1972) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook e Russell ”Molecular cloning: a laboratory manual” (3a edição)” (2001) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel “Current protocols in molecular biology” (1987) Green Publishing e Wiley Interscience, Nova York).

Plasmídeos e Cepas

[00158] pBAD/HisA foi obtido junto à InvitrogenTM (LifeTechnologies Corporation, Carlsbad, CA, USA). A cepa deficiente em beta-galactosidase Escherichia coli BW25113 ((araD-araB)567, lacZ4787(::rrnB-3), -, rph-1, (rhaD- rhaB)568, hsdR514) (Datsenko KA, Wanner BL (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640 a 6645) foi usada para a expressão das variantes de beta-galactosidase de Kluyveromyces lactis.

Meio

[00159] O meio 2xPY (16 g/l BD BBL™ Phytone™ Peptone, 10 g/l de Extrato de Levedura, 5 g/l de NaCl) foi usado para crescimento de Escherichia coli. Antibióticos (100 micrograma/ml de ampicilina) foram suplementados para manter plasmídeos. Para indução de expressão genética, L-arabinose foi usada a 0,02 % de concentração final.

Exemplo 1: construtos de DNA e transformação

[00160] Os construtos de DNA sintéticos foram projetados para serem iniciados com um sítio de restrição BbsI, resultando em uma saliência compatível com NcoI, e serem terminados com um sítio de restrição BbsI após o códon de parada, resultando em uma saliência compatível com HindIII. Os sítios de restrição BbsI internos foram removidos no projeto do construto de DNA sintético. Como exemplo, um fragmento de DNA que codifica a sequência de betagalactosidase de K. lactis do tipo selvagem é listado como SEQ ID NO: 1. Todas as variantes foram projetadas de uma maneira similar e clonadas como fragmentos de BbsI nos sítios NcoI/HindIII do vetor de expressão pBAD/HisA.

[00161] As alterações de aminoácido que foram introduzidas nas 14 variantes que são mostradas na Tabela 2. A posição da alteração é indicada em comparação à sequência de aminoácido de beta-galactosidase de K. lactis do tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Algumas variantes têm múltiplas alterações introduzidas na sequência de aminoácido da proteína beta-galactosidase, como a variante #8 e #7. Um gene do tipo selvagem que codifica a proteína beta-galactosidase inalterada também foi usado em clonagem genética e em transformação e foi usado posteriormente para comparar com enzimas produzidas com os genes de variante. Tabela 2: Alterações de aminoácido introduzidas na sequência de proteína de beta-galactosidase de K. lactis. Aminoácidos são mostrados de acordo com a referência de uma letra.

[00162] A transformação de E. coli BW25113 foi realizada com o uso do kit de transformação de E.coli Zymo Research Z- CompetentTM e conjunto de tampão (T3001). As cepas de E. coli transformadas foram plaqueadas em placas de ágar 2xPY que contêm 100 μg/ml de ampicilina, 0,02 % de L-arabinose e 40 μg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosida (X- Gal), e incubadas a 30 °C de um dia para o outro.

[00163] X-gal é um análogo de lactose e hidrolisado pela enzima -galactosidase. X-gal, quando clivado por - galactosidase, produz galactose e 5-bromo-4-cloro-3- hidroxiindol. O último é dimerizado, então, espontaneamente e é oxidado em 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo, um produto intensamente azul que é insolúvel. As placas foram armazenadas a 4 °C por pelo menos 24 horas para permitir a formação da cor azul mediante hidrólise de X-Gal. Já que a cepa de E. coli do tipo selvagem BW25113 não tem atividade de -galactosidase devido à deleção do operon lac, formação de expressão ativa confirmada de cor azul da variante de - galactosidase escolhida. De cada construto, três transformantes de formação de cor azul foram testados para a produção de -galactosidase o uso de cultivo de 24 cavidades em pequena escala (exemplo 2), e o melhor transformante de produção foi selecionado para uma caracterização adicional de enzima. Exemplo 2: Cultivo e preparação de amostras de enzima beta-galactosidase

[00164] Os transformantes de E.coli BW25113 que expressam um gene de beta-galactosidase variante foram replicados a partir placas de ágar em placas com 96 cavidades (NUNC 267334, NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca) com 200 μl de 2*PY e 100 μg/ml de ampicilina sucedidos por uma incubação de um dia para o outro a 30 °C, 550 rpm e 80 % de umidade em um agitador INFORS HT Microtron (Infors AG, Bottmingen, Suíça). 15 μl dessas pré-culturas foram usados para inocular placas de 24 cavidades (AXYGPDW10ML24CLIDS, Axygen™, Corning, NY 14831 USA) que compreende 3 ml de 2*PY com 100 μg/ml de ampicilina. As placas de 24 cavidades foram cobertas com um Breathseal (6786051, greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha) e incubadas a 30 °C, 550 rpm e 80 % de umidade em um agitador INFORS HT Microtron até que uma densidade óptica de 600 nm de 0,4 a 0,6 fosse alcançada. Então, a L-arabinose foi adicionada a uma concentração final de 0,02 % e as placas de 24 cavidades foram incubadas adicionalmente por 20 a 24 horas a 2 0 °C, 750 rpm e 80 % de umidade no agitador INFORS HT Microtron. As placas de 24 cavidades foram centrifugadas por 10 minutos a 2750 rpm e 4 °C e o sobrenadante foi removido decantando-se a placa. Os péletes de célula obtidos foram armazenados a -20 °C por pelo menos 24 horas. Os péletes de célula congelados foram ressuspensos em 1 ml de tampão de extração (Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, MgSO4 0,2 mM, 2 mg/ml de lisozima, 0,1 mg/ml de DNAse I, coquetel de inibidor 1x Complete Protease (sem EDTA, Roche)) com o uso de um vórtice, incubados à temperatura ambiente por 30 minutos sucedidos por centrifugação por 10 minutos a 2750 rpm e 4 °C. o sobrenadante que compreende a beta-galactosidase superexpressa (Extrato Sem Célula, CFE) foi formulada com a adição de 1 volume de glicerol e usada nos diferentes ensaios de atividade. Exemplo 3: Determinação da quantidade de proteína lactase

[00165] A quantidade de proteína lactase produzida por E. coli foi determinada com o uso de HP-SEC (Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation). Para tanto, 2 μl dos extratos sem célula (CFE) do Exemplo 1 foram carregados em um BEH200, coluna sec de 1,7 μm com 4,6 X 150 mm (Waters). A fase móvel consistia em 100 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,32) e foi mantida a um fluxo de 0,1 ml/min. A temperatura da coluna foi mantida a 25 °C, enquanto o fluxo foi mantido a 0,1 ml/min. A eluição de proteína foi seguida medindo-se a absorbância a 280 nm. Já que a proteína lactase é maior do que a maioria das outras proteínas no CFE, esse foi o primeiro pico de proteína que foi eluído a partir da coluna sob essas condições. A área sob esse pico foi calculada e quantificada por comparação a um padrão de albumina do soro bovino (BSA). Os resultados dessa quantificação são usados para o cálculo da atividade (específica) das proteínas, como descrito nos Exemplos 4 a 7. Tabela 3A: Resultados da análise da atividade (específica) das variantes nos vários ensaios descritos nos Exemplos 4 a 7. Valores que são significantemente (p<0,05) maiores ou menores (% de inibição) do que a média de lactases do tipo selvagem (6 amostras) estão marcados.

Tabela 3B: Resultados da análise da atividade (específica) das variantes nos vários ensaios descritos nos Exemplos 4 a 7. Os valores da Tabela 3A são expressos como valores relativos em comparação aos valores da enzima do tipo selvagem no mesmo ensaio.

Exemplo 4: Determinação de atividade em ONPG como substrato

[00166] A determinação de atividade com o uso de o- nitrofenil--D-galactopiranosida (ONPG) como o substrato era essencialmente de acordo com o procedimento descrito no Código dos Produtos Químicos Alimentícios (FCC 8a edição, p1319 a 1320: Atividade de -galactosidase de lactase (neutra)).

[00167] As amostras produzidas no Exemplo 2 foram diluídas 200 vezes até ~0,1 unidades neutras de lactase (NLU) por ml com o uso de tampão A (fosfato de potássio 100 mM (pH 6,5) que contém EDTA 0,05 mM, MgSO4 0,1 mM e 0,2 % (P/V) Triton X100). O mesmo tampão, porém, sem Triton X100, é usado para a preparação do substrato (50 mg de o-nitrofenil--D- galactopiranosida (Sigma-Aldrich) em 20 ml). Após pré-aquecer o substrato, os seguintes são misturados: 125 μl de substrato e 25 μl de amostra. Permite-se que a reação proceda por 10 minutos a 37 °C, sendo que, após isso, a reação é interrompida pela adição de 25 μl de carbonato de sódio (30 g/l) e 20 μl de água ultrapura. A absorbância resultante a 405 nm pode ser usada e comparada à curva de calibração deita a partir de o-nitrofenol (ONP). As medições ocorreram em um analisador clínico Konelab (Thermo Scientific Arena 30). O cálculo da atividade foi realizado como descrito no Código de Produtos Químicos Alimentícios e corrigido quanto à diferença na temperatura do ensaio. O fator de correção era de 1,25 e foi estabelecido empiricamente. A atividade específica das diferentes variantes de lactase foi determinada dividindo-se esses valores pela dosagem de proteína (como determinado no Exemplo 3) no ensaio e o resultado é mostrado na Tabela 3. Exemplo 5: Determinação de atividade em lactose como substrato

[00168] As amostras foram diluídas a ~0,4 de NLU/ml em tampão B (fosfato de sódio 100 mM (pH 6,5) que contém EDTA 0,05 mM e MgSO4 1 mM). O substrato consistia em 4,8 % de monoidrato de lactose dissolvido em tampão B. A mistura de enzima consistia em 780 unidades de peroxidase de rábano silvestre (Sigma Aldrich), 0,25 unidades de glicose oxidase (DSM) e 12,5 mg (+/- 1 mg) de sal de diamônio de ácido 2,2- Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS, Sigma Aldrich) em um total de 10 ml de tampão B. O ensaio é medido relativamente contra uma diluição em série de lactase neutra (0,1 a 0,8 de NLU/ml). Para que a reação ocorra, os seguintes são transferidos para uma cavidade de uma placa de microtitulação padrão: 25 l de tampão B, 25 l de amostra ou padrão, 25 l de mistura de enzima. Após a pré-incubação por 10 minutos, 175 l de substrato são adicionados e a reação é medida em um leitor MTP (Tecan Infinity M1000) a 420 nm e 30 °C por 30 minutos. A absorbância é medida a cada 30 segundos e a inclinação por cinco pontos de dados (2,5 minutos) foi calculada. A inclinação máxima sobre o ensaio completo é usada para calcular a atividade. Essa inclinação máxima é expressa como mol de glicose produzida por lactase por min sob as condições descritas no presente documento (LACU). A atividade específica das diferentes variantes de lactase é calculada dividindo-se esses valores pela concentração de proteína em mg/ml (como determinado no Exemplo 3) no ensaio. A atividade específica em LACU/mg dessas variantes de lactase é mostrada na Tabela 3. Uma alta atividade específica em lactose pode levar a uma menor dosagem da enzima em aplicações possíveis. Exemplo 6: Determinação de atividade na presença de galactose

[00169] As amostras foram diluídas a ~0,4 de NLU/ml em tampão B. O substrato consistia em 4,8 % de monoidrato de lactose dissolvido em tampão B. A mistura de enzima consistia em 780 unidades de peroxidase de rábano silvestre (Sigma Aldrich), 0,25 unidades de glicose oxidase (DSM) e 12,5 mg (+/- 1 mg) de sal de diamômio de ácido 2,2-Azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS, Sigma Aldrich) em um total de 10 ml de tampão B. O tampão de inibição C consistia em galactose 1500 mM (pureza > 99,9 %) em tampão B. O ensaio é medido relativamente contra uma diluição em série de lactase neutra (0,1 a 0,8 de NLU/ml). Para que a reação ocorra, os seguintes são transferidos para uma cavidade de uma placa de microtitulação padrão: 25 l de tampão C (exceto pelos padrões), 25 l de amostra ou padrão, 25 l de mistura de enzima. Após a pré-incubação por 10 minutos, 175 l de substrato são adicionados e a reação é medida em um leitor MTP a 420 nm e 30 °C por 30 minutos. A absorbância é medida a cada 30 segundos e a inclinação por cinco pontos de dados foi calculada. A inclinação máxima sobre o ensaio completo é usada para calcular a atividade. Essa inclinação máxima é expressa como mol de glicose produzida por lactase por min sob as condições descritas no presente documento (LACGU). A atividade específica em LACGU/mg das diferentes variantes de lactase é calculada dividindo-se esses valores pela concentração de proteína em mg/ml (como determinado no Exemplo 3) no ensaio e os resultados são mostrados na Tabela 3.

[00170] A porcentagem de inibição por galactose é calculada com o uso da fórmula % de inibição = 100 * ( x - y )/x em que x significa a atividade específica em LACU/mg de lactase, como descrito no Exemplo 5, e y significa a atividade específica em LACGU/mg de lactase, como descrito no Exemplo 6. Os resultados do cálculo da % de inibição são mostrados na Tabela 3. Uma baixa % de inibição pode levar a uma maior atividade em condições na aplicação em que a concentração de lactose é baixa e a concentração de galactose é alta, quando uma baixa concentração de lactose residual é exigida. Exemplo 7: Determinação de atividade no leite a uma baixa temperatura

[00171] 1 ml de leite UHT semidesnatado comercial (Campina) foi misturado com 0,2 ml de enzima (~20 NLU/ml) como produzido no Exemplo 2, em placas de microtitulação com cavidade profunda. As amostras foram incubadas sob condições estáticas por 4, 24 ou 48 horas a 6 °C. Após essa incubação, as reações foram finalizadas por um tratamento térmico a 90 °C por 6 minutos, sendo que, após isso, as amostras foram diretamente posicionadas em um congelador a -20 °C até a análise. A preparação da amostra para RMN foi realizada como a seguir: 48 l de HCl 4,0 M foram adicionados e as placas foram vedadas e misturadas por inclinação. Então, as placas foram agitadas por 20 minutos a 600 rpm e subsequentemente centrifugadas por 10 minutos a 4750 rpm. A partir do sobrenadante límpido, 0,3 ml foram transferidos para uma nova placa e combinados com 0,2 ml de uma solução que contém 20 g/l de ácido maleico (padrão interno) e 40 g/l de EDTA em D2O. As placas foram vedadas, misturadas por inclinação e brevemente centrifugadas. Após a liofilização, o resíduo foi dissolvido em 0,05 ml de D2O e a liofilização foi repetida. O resíduo seco foi dissolvido em 0,7 ml de D2O, foi novamente liofilizado de um dia para o outro e novamente dissolvido e, 0,7 ml de D2O. Após uma mistura cuidadosa, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 4750 rpm e 0,6 ml foram transferidos para um tubo de RMN. As amostras foram medidas em um espectrômetro Bruker Avance III equipado com uma criosonda que opera a uma frequência de próton de 700 MHz a uma temperatura de sonda de 17,85 °C (290 K). As amostras foram medidas em uma única vez com o uso de 8 varreduras e um atraso de 30 segundos. Para o espectro de RMN, os seguintes compostos foram quantificados: Lactose ( = 4,67 (d)), glicose = 4,64 (d), galactose = 4,58 (d) e galacto oligossacarídeo (GOS, integral da área de = 4,52 a aproximadamente = 4,38). Na Tabela 3, a quantidade de glicose detectada após 4 horas de incubação por mg de enzima adicionada é indicada. Além disso, a quantidade de GOS após 48 horas, quando a maior parte da lactose é hidrolisada e pouca lactose residual é deixada (<0,5 g/l), é mostrada.

[00172] Uma alta atividade de hidrólise de lactose da enzima no leite a uma baixa temperatura (4 a 12 °C) pode levar a uma dosagem reduzida da enzima em tal aplicação relevante para a indústria de laticínios e, portanto, a um custo reduzido. Uma produção de GOS aumentada pode levar a um efeito prebiótico do leite produzido. Exemplo 8: Combinações de variantes de lactase

[00173] Diferentes combinações de mutações no gene da lactase foram geradas como descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que múltiplas alterações de aminoácido foram combinadas no produto de expressão de um construto de gene. As diferentes variantes que contêm essas alterações de aminoácido combinadas são mostradas na Tabela 4. A posição da alteração é indicada em comparação à sequência de aminoácido de beta-galactosidase de K. lactis do tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Tabela 4: Alterações de aminoácido introduzidas na sequência de proteína de beta-galactosidase de K. lactis. Aminoácidos são mostrados de acordo com a referência de uma letra.

[00174] Novamente, os genes de lactase modificados foram expressos em E. coli e a proteína lactase foi isolada como descrito no Exemplo 2. A quantidade de proteína lactase que foi expressa foi determinada como descrito no Exemplo 3. A atividade dessas amostras de enzima na hidrólise de lactose foi determinada como descrito no Exemplo 5 e comparada à atividade da enzima do tipo selvagem expressa e isolada exatamente do mesmo modo. Além disso, a atividade das amostras de enzima na hidrólise de lactose no leite a uma baixa temperatura após 4 horas foi determinada como descrito no Exemplo 7.

[00175] A atividade específica das diferentes variantes de lactase é calculada dividindo-se os valores medidos pela concentração de proteína lactase em mg/ml no ensaio. A atividade específica dessas variantes de lactase em ambos os ensaios foi expressa como atividade relativa em comparação à atividade da enzima do tipo selvagem obtida nos mesmos ensaios. Para tanto, a atividade específica da lactase do tipo selvagem foi definida a 100 em ambos os ensaios, e as atividades específicas calculadas das variantes foram relacionadas a essa. Os resultados dessa análise são mostrados na Tabela 5. Tabela 5: Resultados da análise da atividade (específica) das variantes nos vários ensaios. Os valores que são mostrados em relação ao valor encontrado com lactase do tipo selvagem, os quais são significantemente maiores (p<0,05) do que a média de lactases do tipo selvagem, estão marcados.

[00176] Para essa análise, pode-se deduzir que diversas variantes de combinação mostram uma hidrólise de lactose vantajosa em ambos os ensaios.

Claims

1. Polipeptídeo variante possuindo atividade de lactase caracterizado pelo fato de que a variante tem uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à lactase que consiste na sequência definida em SEQ ID NO: 2, compreende substituição de D233V, D257G/E297G, A258T, N263S/K274E/N284S, T415C, T415A, Y440F, A483S, V619I, I621V, M622L, T633G, L862V e/ou A1004P, as ditas posições sendo definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que a variante tem uma ou mais propriedades alteradas selecionadas de uma maior atividade específica em ONPG; uma maior atividade específica em lactose; uma maior atividade em lactose em leite; uma redução em inibição de galactose; e uma maior produção de GOS em leite em comparação com um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase.

2. Polipeptídeo variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de referência é a lactase da SEQ ID NO:2.

3. Polipeptídeo variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo variante é um polipeptídeo de ocorrência não natural.

4. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a variante demonstra atividade específica aumentada em ONPG em comparação a um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase e compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de T415C, T415A, A483S, V619I, I621V, M622L ou T633G.

5. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a variante demonstra atividade específica aumentada em lactose em comparação com um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase e compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de T415C, T415A, Y440F ou A483S.

6. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a variante demonstra atividade aumentada em lactose no leite em comparação com um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase e compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de D233V, D257G, A258T, N263S, K274E, N284S, E297G, Y440F, V619I, T633G, L862V ou A1004P.

7. Polipeptídeo variante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos duas substituições selecionadas a partir de N263S, K274E ou N284S.

8. Polipeptídeo variante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos substituições D257G e E297G.

9. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a variante demonstra inibição de galactose diminuída em comparação com um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase e compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de V619I, I621V ou M622L.

10. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a variante demonstra produção de GOS aumentada no leite em comparação com um polipeptídeo de referência possuindo atividade de lactase e compreende uma sequência de aminoácido que, quando alinhada à sequência definida em SEQ ID NO:2, compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir de V619I ou M622L.

11. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender substituições adicionais diferentes daquelas conforme definidas na reivindicação 1.

12. Método para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender: (a) selecionar um polipeptídeo possuindo atividade de lactase; (b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um dentre 233, 257, 258, 263, 274, 284, 297, 415, 440, 483, 619, 621, 622, 633, 862 ou 1004, a dita posição sendo definida com referência à SEQ ID NO:2; (c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, conforme definido em (b); (d) preparar a variante resultante das etapas (a) a (c); (e) determinar uma propriedade da variante; (f) selecionar uma variante possuindo uma propriedade alterada em comparação à lactase compreendendo a sequência definida em SEQ ID NO:2, desse modo para produzir uma variante de polipeptídeo de lactase.

13. Composição caracterizada por compreender o polipeptídeo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e pelo menos um componente selecionado a partir de sal, conservante, poliol ou íons de metal.

14. Uso de um polipeptídeo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou de uma composição, conforme definida na reivindicação 13, caracterizado por ser na preparação de um produto lácteo com baixo teor de lactose ou sem lactose.

15. Processo para a produção de um produto lácteo caracterizado por compreender adicionar uma quantidade eficaz de um polipeptídeo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou de uma composição, conforme definida na reivindicação 13, a um produto lácteo e permitir que o polipeptídeo exerça sua atividade enzimática.