BR112016003256B1 - Microorganismo geneticamente modificado que metaboliza fontes não convencionais de fósforo ou enxofre e método para converter um subtrato em um produto - Google Patents
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Abstract
MICRO-ORGANISMOS MODIFICADOS PARA USAR FONTES NÃO CONVENCIONAIS DE FÓSFORO OU ENXOFRE. A presente invenção refere-se a organismos geneticamente modificados, como levedura e bactérias, que têm a habilidade de metabolizar fontes de fósforo ou enxofre atípicas. Métodos de fermentação que usam os organismos geneticamente modificados também são descritos. Os métodos de fermentação são processos robustos para a bioprodução industrial de uma variedade de compostos, que incluem mercadorias, produtos de química fina e fármacos.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório n° de série U.S. 61/870.469, depositado em 27 de agosto de 2013, que está aqui incorporado, por referência.
[002] Na indústria de fermentação, meios de cultura de célula são tipicamente formulados para fornecer todos os nutrientes necessários para o crescimento de uma linhagem celular hospedeira, com ênfase particular em satisfazer as exigências de linhagem celular para carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre e outros nutrientes principais. Algumas linhagens celulares exigem componentes adicionais, incluindo aminoácidos, oligoelementos, metais e fatores de crescimento complexo. A presença desses nutrientes fornece um ambiente de crescimento adequado para o organismo de escolha e, infelizmente, para quaisquer organismos contaminantes potenciais. Nesse ambiente, o organismo de produção é exigido para competir diretamente com qualquer organismo contaminante na cultura de células.
[003] Mesmo em hospedeiros robustos, a combinação de infecções oportunistas da cultura e a carga metabólica que resulta das demandas de fabricação de produto é uma preocupação maior em operações de monocultura. A robustez industrial é tipicamente considerada como características multigênicas específicas à cepa hospedeira e, desse modo, difícil para modificar de modo previsível em organismos posteriormente no processo de desenvolvimento. A adição de inibidores de crescimento seletivos, como antibióticos bacterianos, é um método usado para criar um ambiente de fermentação mais robusto para organismos hospedeiros que são resistentes ao inibidor de crescimento. Entretanto, a adição de antibióticos é frequentemente indesejável ou inviável, e contaminações espontaneamente resistentes resultam frequentemente.
[004] Consequentemente, existe uma necessidade de características racionalmente modificadas que, quando modificadas em um organismo hospedeiro, criam um ambiente de fermentação de monocultura robusta.
[005] Em certas modalidades, a invenção se refere a um organismo geneticamente modificado, em que o organismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico que compreende qualquer uma das sequências descritas no presente documento.
[006] Em certas modalidades, a invenção se refere a um organismo geneticamente modificado, em que o organismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico; a molécula de ácido nucleico compreende um gene não nativo; e o gene não nativo codifica uma enzima não nativa selecionada a partir do grupo que consiste em NAD:fosfito oxidorredutase (fosfito desidrogenase), glicerol-3-fosfato desidrogenase (sn-glicerol 3-fosfato: NAD(+) oxidorredutase, EC 1.1.1.8), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima de degradação de organofosfato, uma fosfodiesterase, uma fosfolipase, enzima de dessulfurização, uma dibenzotiofeno-5,5- dióxido monoxigenase, uma 2-hidroxibifenil-2-sulfinato sulfinoliase, uma dibenzotiofeno monoxigenase e uma NADH-FMN oxidorredutase.
[007] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de
[008] colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[009] em que
[0010] o substrato compreende uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo;
[0011] a fração que contém fósforo compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém fósforo de qualquer uma das Fórmulas I a III;
[0012] o composto de Fórmula I é
[0013] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0014] R é -H, alquila, -OH, -OR2, -SH ou -SR2;
[0015] R1 é -H ou alquila;
[0016] Y é O ou S;
[0017] Y1 é O ou S; e
[0018] R2 é alquila;
[0019] o composto de Fórmula II é
[0020] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0021] R1 é -H ou alquila; e
[0022] Y1 é O ou S;
[0023] o composto de Fórmula III é
[0024] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0025] R3 é -H, -OH, -OR4, -SH, -SR4, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila ou heteroaralquila; e
[0026] R4 é alquila ou arila;
[0027] um organismo nativo da mesma espécie que o organismo geneticamente modificado não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de fósforo) o composto que contém fósforo; e
[0028] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[0029] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[0030] em que
[0031] o substrato compreende uma fração que contém enxofre e a fração que não contém enxofre;
[0032] a fração que contém enxofre compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém enxofre de qualquer uma das Fórmulas IV a XI;
[0033] o composto de Fórmula IV é
[0034] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0035] R5 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)-R7;
[0036] R6 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)-R7; e
[0037] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros;
[0038] o composto de Fórmula V, Fórmula VI ou Fórmula VII é
[0039] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0040] R8 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)-R7;
[0041] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros;
[0042] o composto de Fórmula VIII, Fórmula IX ou Fórmula X é
[0043] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0044] R9 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NH2, -NHR7 ou -NH- C(=O)-R7;
[0045] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros;
[0046] R10 é hidroxialquila, R9 ou -(CH2)xR9; e
[0047] x é 1, 2, 3 ou 4;
[0048] o composto de Fórmula XI é
[0049] em que, independentemente para cada ocorrência,
[0050] R9 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NH2, -NHR7 ou -NH- C(=O)-R7; e
[0051] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros;
[0052] um organismo nativo da mesma espécie que o organismo geneticamente modificado não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de enxofre) o composto que contém enxofre; e
[0053] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[0054] Em certas modalidades, a invenção se refere a um produto feito por qualquer um dos métodos supracitados.
[0055] Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que compreende um gene ligado de modo operável a um promotor, em que o gene codifica uma enzima; e a enzima é NAD:fosfito oxidorredutase (fosfito desidrogenase), glicerol-3-fosfato desidrogenase (sn-glicerol 3-fosfato: NAD(+) oxidorredutase, EC 1.1.1.8), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima de degradação de organofosfato, uma fosfodiesterase, uma fosfolipase, enzima de dessulfurização, uma dibenzotiofeno-5,5-dióxido monoxigenase, uma 2-hidroxibifenil-2-sulfinato sulfinoliase, uma dibenzotiofeno monoxigenase ou uma NADH-FMN oxidorredutase.
[0056] A Figura 1 retrata várias sequências de DNA da invenção.
[0057] A Figura 2 tabula vários organismos da invenção e aplicações potenciais exemplificativas.
[0058] A Figura 3 tabula vários organismos da invenção e aplicações potenciais exemplificativas.
[0059] A Figura 4 tabula vários compostos organofosforosos úteis como matérias-primas na invenção e a Fórmula química de cada composto.
[0060] A Figura 5 tabula vários compostos organossulfúricos úteis como matérias-primas na invenção e a Fórmula química de cada composto.
[0061] A Figura 6 retrata os nomes e estruturas de vários compostos organofosforosos úteis como matérias-primas na invenção.
[0062] A Figura 7 retrata os nomes e estruturas de vários compostos organossulfúricos úteis como matérias-primas na invenção.
[0063] A Figura 8 retrata um mapa de plasmídeo do vetor pNC273, que foi usado para construir cepa NS392.
[0064] A Figura 9 tabula a sequência de pNC273.
[0065] A Figura 10 retrata o crescimento de dois organismos (NS392 de Y. lipolytica modificado (círculos sólidos) e NS22 de S. cerevisiae do tipo selvagem (círculos abertos)) em três meios de crescimento diferentes: fosfito de potássio como a única fonte de fósforo (esquerda), fosfato de potássio como a única fonte de fósforo (meio), e fosfato de potássio mais higromicina como uma condição de controle.
[0066] A Figura 11 retrata o crescimento de NS22, S. cerevisiae do tipo selvagem, com fosfato ou fosfito como uma fonte de fósforo em meio definido. Diferentes diluições em série de 10 vezes dos inóculos foram feitas para observar a ocorrência possível de uma fase de intervalo.
[0067] A Figura 12 retrata o crescimento de NS435 com (a) fosfato (Pi) e (b) fosfito (Pt).
[0068] A Figura 13 retrata o crescimento de isolados após transferências em série de NS435 em meios de fosfito.
[0069] A Figura 14 retrata um mapa de plasmídeo de pNC360.
[0070] A Figura 15 tabula a sequência de pNC360.
[0071] A Figura 16 retrata o crescimento de NS435 com concentrações diferentes de hipofosfito.
[0072] A Figura 17 retrata NS252 + ptxD transformantes corrigidos em placas de ágar de meio definido com fosfato (Pi, esquerda) ou fosfito (Pt, direita) como fonte de fósforo. NS252 não transformado também foi corrigido.
[0073] A Figura 18 retrata um mapa de plasmídeo de pNC351.
[0074] A Figura 19 tabula a sequência de pNC351.
[0075] Em certas modalidades, uma invenção se refere a um organismo hospedeiro geneticamente modificado, em que o organismo hospedeiro geneticamente modificado tem uma habilidade não nativa para obter um nutriente de limitação de crescimento a partir de um substrato complexo; e o substrato complexo não poderia ter sido metabolizado ou usado como um nutriente pelo organismo hospedeiro nativo. Em certas modalidades, a habilidade não nativa irá dotar o organismo de uma vantagem competitiva significativa, e fornecer uma barreira principal ao sucesso de contaminantes em uma fermentação.
[0076] Em certas modalidades, organismos contêm geralmente apenas uma quantidade pequena de fósforo e enxofre (por exemplo, cerca de 3% e cerca de 1% por massa da célula, respectivamente). Então, a fim de crescer, os organismos precisam de menos desses nutrientes limitantes de crescimento conforme comparados a, por exemplo, nitrogênio.
[0077] Em certas modalidades, o organismo hospedeiro geneticamente modificado é uma bactéria, uma levedura, um fungo, algas, uma célula de mamífero ou uma célula de inseto. Em certas modalidades, o organismo hospedeiro geneticamente modificado é uma bactéria ou uma levedura.
[0078] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método de usar o organismo hospedeiro geneticamente modificado supracitado, que compreende colocar o organismo hospedeiro geneticamente modificado em contato com um meio de cultura de células modificadas. Em certas modalidades, a invenção se refere a um método de usar o organismo hospedeiro geneticamente modificado supracitado, que compreende colocar o organismo hospedeiro geneticamente modificado em contato com um meio de cultura de células modificadas, em que o organismo hospedeiro geneticamente modificado converte o meio de cultura de células em um produto. Em certas modalidades, usar essa abordagem fornece uma maneira única e direcionada para promover o crescimento do organismo hospedeiro geneticamente modificado desejado. Em certas modalidades, os métodos supracitados minimizam o crescimento de organismos contaminantes, fornecem uma vantagem competitiva valiosa e permitem gerenciamento de produção de uma faixa de produtos valiosos.
[0079] Em certas modalidades, os métodos da invenção diminuem ou eliminam a necessidade de uso de antibióticos profiláticos em culturas de levedura em grande escala. Evitar antibióticos desnecessários é um benefício importante devido a considerações ambientais emergentes e pressões sociais. Adicionalmente, em certas modalidades, o conjunto de procedimentos pode ser aplicado a sistemas bacterianos nos quais antibióticos podem não ser adicionados. Em certas modalidades, o conjunto de procedimentos pode ser aplicado para minimizar o crescimento de contaminantes de levedura selvagem que são resistentes nativamente a muitos antibióticos comumente usados.
[0080] Em certas modalidades, o organismo hospedeiro geneticamente modificado é uma levedura; e o produto é etanol, isobutanol, ácido lático, ácido succínico, eritritol, um isoprenóidee, um lipídeo e produto de enzima, um produto químico de mercadoria de base ou um produto químico de especialidade de valor alto.
[0081] Em certas modalidades, o organismo hospedeiro geneticamente modificado é uma bactéria; e o produto é butanol, etanol, isopropanol, 1,3-propanodiol (PDO), 1,4-butanodiol (BDO), ácido succínico, ácido itacônico, um produto de enzima, um poliol, um produto de proteína, um produto químico de mercadoria de base ou um produto químico de especialidade de valor alto.
[0082] Em certas modalidades, a tecnologia da invenção é aplicável na produção de uma ou mais mercadorias, produtos de química fina ou fármacos.
[0083] Conforme usado no presente documento, o termo "biomassa" se refere a um material que contém primariamente carboidrato. Biomassa também pode se referir a um material que contém polissacarídeo. Também pode se referir a um material que contém celulose, hemicelulose ou lignocelulose. Biomassa é obtida comumente a partir de, por exemplo, madeira, plantas, resíduo a partir de produtos agrícolas ou florestais, componente orgânico de refugos municipal e industrial, lamas primárias a partir da fabricação de papel, papel de refugo, madeira de refugo (por exemplo, serragem), resíduos agrícolas como palhas de milho, espigas de milho, casco de arroz, palha, bagaço de cana, amido de milho, aveia de trigo, e cevada, material de planta de refugo a partir de madeira de lei ou casca da faia, água de refugo de indústria de placas de fibra, miolo de bagaço de cana, bagaço de cana, melaços, líquido pós-fermentação, resíduos ainda furfurais, extratos de madeira de carvalho aquosos, casco de arroz, resíduos de aveia, resíduos de xilose, serragem de abeto, nafta, resíduo furfural de espiga de milho, bolas de algodão, arroz, palha, pele de feijão soja, resíduo de óleo de feijão soja, palhas de milho, caule de algodão, casco de semente de algodão, amido, batatas, batatas-doces, lactose, resíduos de polpa de madeira de refugo, cascos de semente de girassol, açúcares de hexose, açúcares de pentose, sacarose de cana de açúcar e beterrabas sacarinas, xarope de milho, cânhamo e combinações dos mencionados acima.
[0084] "Peso seco" e "peso de célula seca" significam o peso determinado na ausência relativa de água. Por exemplo, a referência a células oleaginosas como compreendendo uma porcentagem especificada de um componente particular por peso seco significa que a porcentagem é calculada com base no peso da célula após substancialmente toda a água ter sido removida.
[0085] "Gene exógeno" é um ácido nucleico que codifica a expressão de um RNA e/ou proteína que foi introduzida em uma célula (por exemplo, por transformação/transfecção), e também é chamado de um "transgene". Uma célula que compreende um gene exógeno pode ser denominada como uma célula recombinante, na qual gene(s) exógeno(s) adicional(is) pode(podem) ser introduzido(s). O gene exógeno pode ser a partir de uma espécie diferente (e, então, heteróloga), ou a partir da mesma espécie (e, então, homóloga), em relação à célula em transformação. Desse modo, um gene exógeno pode incluir um gene homólogo que ocupa uma localização diferente no genoma da célula ou está sob controle diferente em relação à cópia endógena do gene. Um gene exógeno pode estar presente em mais de uma cópia na célula. Um gene exógeno pode ser mantido em uma célula como uma inserção no genoma (nuclear ou plastídeo) ou como uma molécula epissômica.
[0086] "Vetor de expressão" ou "construto de expressão" ou "plasmídeo" ou "construto de DNA recombinante" é um veículo para introduzir um ácido nucleico em uma célula hospedeira. O ácido nucleico pode ser aquele gerado através de intervenção humana, incluindo por meios recombinantes ou síntese química direta, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem transcrição e/ou tradução de um ácido nucleico particular. O vetor de expressão pode ser uma parte de um plasmídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico ou outro veículo adequado. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito ligado de modo operável a um promotor.
[0087] "Promotor induzível" é um promotor que media a transcrição de um gene ligado de modo operável em resposta a um estímulo particular.
[0088] "Em ligação operável" é uma ligação funcional entre duas sequências de ácido nucleico, como uma sequência de controle (tipicamente um promotor) e a sequência ligada (tipicamente uma sequência que codifica uma proteína, também chamada de uma sequência de codificação). Um promotor está em ligação operável com um gene exógeno se pode mediar a transcrição do gene.
[0089] "Lisado" é uma solução que contém o conteúdo de células lisadas.
[0090] "Lise" é a quebra da membrana plasmática e, opcionalmente, da parede celular de um organismo biológico suficiente para liberar pelo menos algum conteúdo intracelular, frequentemente por mecanismos osmóticos, virais ou mecânicos que comprometem sua integridade.
[0091] "Lisar" é fazer ruptura da membrana celular e, opcionalmente, da parede celular de um organismo biológico ou célula suficiente para liberar pelo menos algum conteúdo intracelular.
[0092] "Choque osmótico" é a ruptura de células em uma solução seguida por uma redução repentina na pressão osmótica. O choque osmótico é induzido algumas vezes para liberar componentes celulares de tais células em uma solução.
[0093] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" se referem a um elemento cromossômico extra que carrega frequentemente genes que não são parte do metabolismo central da célula, e frequentemente na forma de moléculas de DNA de filamento duplo circular. Tais elementos podem ser sequências replicantes de modo autônomo, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, linear ou circular, de um DNA ou RNA de filamento único ou duplo, derivados de qualquer fonte, na qual um número de sequências de nucleotídeo foi unido ou recombinado em uma construção única que tem capacidade para introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado juntamente com sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. "Cassete de transformação" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e tem elementos, em adição ao gene estranho, que facilitam a transformação de uma célula hospedeira particular. "Cassete de expressão" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e que tem elementos em adição ao gene estranho que permite expressão acentuada do gene em um hospedeiro estranho.
[0094] "Promotor" é uma sequência de controle de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Conforme usado no presente documento, um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias próximas ao local de início de transcrição. Um promotor também inclui opcionalmente um acentuador distal ou elementos repressores, que podem ser localizados tanto quanto diversos milhares de pares de base a partir do local inicial de transcrição.
[0095] "Recombinante" é uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor que foi modificado devido à introdução de um ácido nucleico exógeno ou a alteração de um ácido nucleico nativo. Desse modo, por exemplo, células recombinantes podem expressar genes que não são constatados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressar genes nativos de modo diferente dos genes que são expressos por uma célula não recombinante. Células recombinantes podem, sem limitação, incluir ácidos nucleicos recombinantes que codificam um produto de gene ou elementos de supressão como mutações, knockouts, antissenso, RNA de interferência (RNAi) ou dsRNA que reduz os níveis de produto de gene ativo em uma célula. Um "ácido nucléico recombinante",é um ácido nucléico, formado originalmente in vitro, em geral, pela manipulação do ácido nucléico, por exemplo, com uso de polimerases, ligases, exonucleases e endonucleases ou, de outro modo, está em uma forma não encontrada normalmente na natureza. Ácidos nucleicos recombinantes podem ser produzidos, por exemplo, para colocar dois ou mais ácidos nucleicos em ligação operável. Desse modo, um ácido nucléico isolado ou um vetor de expressão formado in vitro ligando-se moléculas de DNA que não estão unidas normalmente na natureza são considerados recombinantes para propósitos desta invenção. Uma vez que um ácido nucleico recombinante é feito e introduzido em uma célula hospedeira ou organismo, pode replicar com o uso da maquinaria celular in vivo da célula hospedeira; entretanto, tais ácidos nucleicos, uma vez produzidos de modo recombinante, embora replicados subsequentemente e de modo intracelular, ainda são considerados recombinantes para propósitos dessa invenção. De modo similar, uma "proteína recombinante" é uma proteína feita com uso de conjuntos de procedimentos recombinantes, isto é, através da expressão de um ácido nucleico recombinante.
[0096] "Sonicação" é um processo de fazer ruptura de materiais biológicos, como uma célula, pelo uso de energia de onda sonora.
[0097] "Transformação" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um organismo hospedeiro ou o genoma de um organismo hospedeiro, o que resulta em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformado são denominados como organismos "recombinantes", "transgênicos" ou "transformados". Desse modo, polinucleotídeos isolados da presente invenção podem ser incorporados em construtos recombinantes, tipicamente construtos de DNA, com capacidade para introdução em e replicação em uma célula hospedeira. Tal construto pode ser um vetor que inclui um sistema de e sequências que têm capacidade para transcrição e tradução de uma sequência de codificação de polipeptídeo em uma dada célula hospedeira. Tipicamente, vetores de expressão incluem, por exemplo, um ou mais genes clonados sob o controle de transcrição de sequências regulatórias 5' e 3' e um marcador selecionável. Tais vetores também podem conter uma região regulatória promotora (por exemplo, uma região regulatória que controla expressão induzível ou constitutiva, regulada de modo ambiental ou de desenvolvimento, ou de localização específica), um local inicial de iniciação de transcrição, um local de ligação de ribossomo, um local de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.
[0098] Em certas modalidades da invenção, um micro-organismo é geneticamente modificado para melhorar ou fornecer características de crescimento de novo em uma variedade de materiais de matéria- prima.
[0099] Genes e produtos de gene podem ser introduzidos em células hospedeiras microbianas. Células hospedeiras adequadas para expressão dos genes e moléculas de ácido nucleico são hospedeiras microbianas que podem ser constatadas de modo amplo dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem sobre uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias de solvente.
[00100] Sistemas de expressão e vetores de expressão microbianos que contêm sequências regulatórias que direcionam expressão de nível alto de proteínas estranhas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Qualquer um desses pode ser usado para construir genes quiméricos para produzir qualquer um dos produtos de gene das sequências instantâneas. Esses genes quiméricos podem ser introduzidos, então, em micro-organismos apropriados através de conjuntos de procedimentos de transformação para fornecer expressão de nível alto das enzimas.
[00101] Por exemplo, um gene que codifica uma enzima pode ser clonado em um plasmídeo adequado, e a cepa parental de início supracitada como uma hospedeira pode ser transformada com o plasmídeo resultante. Essa abordagem pode aumentar o número de cópia de cada um dos genes que codificam as enzimas e, como resultado, as atividades dessas enzimas podem ser aumentadas. O plasmídeo não é particularmente limitado enquanto puder replicar de modo autônomo no micro-organismo.
[00102] Vetores ou cassetes úteis para a transformação de células hospedeiras adequadas são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete contém sequências que direcionam a transcrição e tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores adequados compreendem uma região 5' do gene que comporta controles de iniciação de transcrição e uma região 3' do fragmento de DNA que controla terminação de transcrição. É mais preferível quando ambas as regiões de controle são derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada, embora deva ser entendido que tais regiões de controle não precisam ser derivadas dos genes nativos à espécie específica escolhida como um hospedeiro de produção.
[00103] Promotores, cDNAs e 3'UTRs, assim como outros elementos dos vetores, podem ser gerados através de conjuntos de procedimentos de clonagem que usam fragmentos isolados das fontes nativas (ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3a edição, 2001, Cold Spring Harbor Press; e Patente no U.S. 4.683.202 (incorporado a título de referência)). Alternativamente, elementos podem ser gerados de modo sintético com uso de métodos conhecidos (ver, por exemplo, Gene. 16 de outubro de 1995; 164(1):49 a 53).
[00104] Recombinação homóloga é a habilidade de sequências de DNA complementares de se alinharem e trocar regiões de homologia. DNA transgênico ("doador") que contém sequências homólogas às sequências genômicas direcionadas ("modelo") é introduzido no organismo e então é submetido à recombinação no genoma no local das sequências homólogas genômicas correspondentes.
[00105] A habilidade para executar recombinação homóloga em um organismo hospedeiro tem muitas implicações práticas para o que pode ser executado no nível genético molecular e é útil na geração de um micróbio oleaginoso que pode produzir óleos adaptados. Em sua natureza, a recombinação homóloga é um evento que direciona gene de modo preciso, então, a maioria das linhas transgênicas geradas com a mesma sequência de direcionamento é essencialmente idêntica em termos de fenótipo, o que necessita a triagem de menos eventos de transformação. A recombinação homóloga também direciona eventos de inserção de gene no cromossomo hospedeiro, resultando potencialmente em estabilidade genética excelente, mesmo na ausência de seleção genética. Devido ao fato de que loci cromossômicos diferentes provavelmente farão impacto na expressão de gene, mesmo a partir de promotores heterólogos/UTRs, a recombinação homóloga pode ser um método de pesquisar loci em um ambiente de genoma não familiar e para avaliar o impacto desses ambientes na expressão de gene.
[00106] Uma abordagem de modificação genética particularmente útil que usa recombinação homóloga é para co-optar elementos regulatórios hospedeiros específicos como promotores/UTRs para acionar expressão de gene heterólogo em uma maneira altamente específica.
[00107] Devido ao fato de que a recombinação homóloga é um evento de direcionamento de gene preciso, a mesma pode ser usada para modificar precisamente qualquer (quaisquer) nucleotídeo (s) dentro de um gene ou região de interesse, enquanto regiões de flanqueamento suficientes tenham sido identificadas. Portanto, a recombinação homóloga pode ser usada como meios para modificar sequências regulatórias que fazem impacto na expressão de gene de RNA e/ou proteínas. A mesma também pode ser usada para modificar as regiões de codificação de proteína em um esforço para modificar atividades de enzima como especificidade de substrato, afinidades e Km e afetando, desse modo, a mudança desejada no metabolismo da célula hospedeira. A recombinação homóloga fornece meios poderosos para manipular o genoma hospedeiro que resulta em direcionamento de gene, conversão de gene, deleção de gene, duplicação de gene, inversão de gene e troca de elementos regulatórios de expressão de gene, como promotores, acentuadores e 3'UTRs.
[00108] A recombinação homóloga pode ser alcançada usando-se construtos de direcionamento que contêm peças de sequências endógenas para "direcionar" o gene ou região de interesse dentro do genoma de célula hospedeira endógena. Tais sequências de direcionamento podem ser localizadas 5' do gene ou região de interesse, 3' do gene/região de interesse ou até mesmo flanquear o gene/região de interesse. Tais construtos de direcionamento podem ser transformados na célula hospedeira como um DNA plasmídeo superenrolado com cadeia principal de vetor adicional, um produto PCR com cadeia principal sem vetor ou como uma molécula linearizada. Em alguns casos, pode ser vantajoso expor primeiro as sequências homólogas dentro do DNA transgênico (DNA doador) com uma enzima de restrição. Essa etapa pode aumentar a eficácia de recombinação e diminuir a ocorrência de eventos não desejados. Outros métodos de aumentar eficácia de recombinação incluem usar PCR para gerar DNA transgênico de transformação que contém extremidades lineares homólogas às sequências genômicas sendo direcionadas.
[00109] Vetores para transformação de micro-organismos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por conjuntos de procedimentos conhecidos familiares por aqueles versados na técnica em vista da revelação no presente documento. Um vetor contém tipicamente um ou mais genes, em que cada gene codifica a expressão de um produto desejado (o produto de gene) e é ligado de modo operável a uma ou mais sequências de controle que regulam a expressão de gene ou direcionam o produto de gene a uma localização particular na célula recombinante.
[00110] Essa subseção é dividida em subseções. A subseção 1 descreve sequências de controle contidas tipicamente em vetores assim como sequências de controle inovadoras fornecidas pela presente invenção. A subseção 2 descreve genes contidos tipicamente em vetores, assim como métodos de otimização de códon inovadores e genes preparados com o uso dos mesmos fornecidos pela invenção. 1.
[00111] As sequências de controle são ácidos nucleicos que regulam a expressão de uma sequência de codificação ou direcionam um produto de gene a uma localização particular dentro ou fora de uma célula. Sequências de controle que regulam a expressão incluem, por exemplo, promotores que regulam transcrição de uma sequência de codificação e terminadores que terminam a transcrição de uma sequência de codificação. Outra sequência de controle é uma sequência não traduzida 3' localizada na extremidade de uma sequência de codificação que codifica um sinal de poliadenilação. Sequências de controle que direcionam produtos de gene a localizações particulares incluem aquelas que codificam peptídeos de sinalização, que direcionam a proteína a qual os mesmos estão ligados a uma localização particular dentro ou fora da célula.
[00112] Desse modo, projeto de vetor exemplificativo para expressão de um gene exógeno em um micróbio contém uma sequência de codificação para um produto de gene desejado (por exemplo, um marcador selecionável ou uma enzima) em ligação operável com um promotor ativo em microalgas. Alternativamente, se o vetor não contém um promotor em ligação operável com a sequência de codificação de interesse, a sequência de codificação pode ser transformada nas células de modo que se tornem ligadas de modo operável a um promotor endógeno no ponto de integração de vetor.
[00113] O promotor usado para expressar um gene exógeno pode ser o promotor ligado naturalmente ao mesmo gene ou pode ser um promotor heterólogo.
[00114] Um promotor pode ser distinguido geralmente como constitutivo ou induzível. Promotores constitutivos são geralmente ativos ou funcionam para acionar a expressão em todas as vezes (ou em certas vezes no ciclo de vida de célula) no mesmo nível. Promotores induzíveis, de modo oposto, são ativos (ou tornados inativos) ou são regulados positivamente ou negativamente de modo significante apenas em resposta a um estímulo. Ambos os tipos de promotores encontram aplicação nos métodos da invenção. Promotores induzíveis úteis na invenção incluem aqueles que mediam a transcrição de um gene ligado de modo operável em resposta a um estímulo, como uma molécula pequena fornecida de modo exógeno, temperatura (calor ou frio), falta de fósforo ou enxofre em meios de cultura, etc. Promotores adequados podem ativar a transcrição de um gene essencialmente silencioso ou regular positivamente, preferencialmente de modo substancial, a transcrição de um gene ligado de modo operável que é transcrito em um nível baixo.
[00115] A inclusão de sequência de controle de região de terminação é opcional e, se empregada, então a escolha deve ser primariamente uma de conveniência, já que a região de terminação é relativamente intercambiável. A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação de transcrição (o promotor), pode ser nativa à sequência de DNA de interesse ou pode ser obtenível a partir de outra fonte. Ver, por exemplo, Chen e Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.
[00116] Tipicamente, um gene inclui um promotor, sequência de codificação e sequências de controle de terminação. Quando montada por tecnologia de DNA recombinante, um gene pode ser chamado de um cassete de expressão e pode ser flanqueado por locais de restrição para inserção conveniente em um vetor que é usado para introduzir o gene recombinante em uma célula hospedeira. O cassete de expressão pode ser flanqueado por sequências de DNA a partir do genoma ou outro alvo de ácido nucleico para facilitar a integração estável do cassete de expressão no genoma por recombinação homóloga. Alternativamente, o vetor e seu cassete de expressão podem permanecer não integrados (por exemplo, um epissoma), no caso em que o vetor inclui tipicamente uma origem de replicação, que tem capacidade para fornecer replicação do DNA de vetor heterólogo.
[00117] Um gene comum presente em um vetor é um gene que codifica uma proteína, a expressão da qual permite que a célula recombinante que contém a proteína seja diferenciada de células que não expressam a proteína. Tal gene e seu produto de gene correspondente é chamado de marcador selecionável ou marcador de seleção. Qualquer um dentre uma variedade ampla de marcadores selecionáveis pode ser empregado em um construto de transgene útil para transformar os organismos da invenção.
[00118] Para expressão ótima de uma proteína recombinante, é benéfico empregar sequências de codificação que produzem mRNA com códons usados de modo ótimo pela célula hospedeira a ser transformada. Desse modo, a expressão apropriada de transgenes pode exigir que o uso de códon do transgene corresponda à polarização de códon específico do organismo em que o transgene é expresso. Os mecanismos precisos subjacentes a esse efeito são muitos, mas incluem o balanceamento apropriado de agrupamentos de tRNA aminoacetilados disponíveis com proteínas sintetizadas na célula, acoplados com tradução mais eficaz do RNA mensageiro transgênico (mRNA) quando essa necessidade é satisfeita. Quando o uso de códon no transgene não é otimizado, agrupamentos de tRNA disponíveis não são suficientes para permitir tradução eficaz do mRNA heterólogo que resulta em paralisação de ribossomo, terminação e possível instabilidade do mRNA transgênico.
[00119] Adicionalmente, um micro-organismo geneticamente modificado pode compreender e expressar mais de um gene exógeno. Um ou mais genes podem ser expressos com uso de um promotor induzível, que permite que a temporização relativa de expressão desses genes seja controlada. A expressão dos dois ou mais genes exógenos pode estar sob controle do mesmo promotor induzível ou sob controle de promotores induzíveis diferentes. Na última situação, a expressão de um primeiro gene exógeno pode ser induzida por um primeiro período de tempo (durante o qual a expressão de um segundo gene exógeno pode ou não ser induzida) e a expressão de um segundo ou gene exógeno adicional pode ser induzida por um segundo período de tempo (durante o qual a expressão de um primeiro gene exógeno pode ou não ser induzida). São fornecidos no presente documento vetores e métodos para modificar micróbios para crescer em meios de crescimento não tradicionais.
[00120] Células podem ser transformadas por qualquer conjunto de procedimentos adequado que inclui, por exemplo, biolística, eletroporação, transformação de microesfera de vidro e transformação genética com fibras de carboneto de silício. Qualquer conjunto de procedimentos conveniente para introduzir um transgene em um micro-organismo pode ser empregado na presente invenção. A transformação pode ser alcançada, por exemplo, pelo método de D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)), o método que aumenta a permeabilidade de células recipientes para DNA com cloreto de cálcio (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), ou similares.
[00121] Exemplos de expressão de transgenes em levedura oleaginosa (por exemplo, Yarrowia lipolytica) podem ser encontrados na literatura (ver, por exemplo, Bordes et al., J Microbiol Methods, 27 de junho (2007)). Exemplos de expressão de genes exógenos em bactérias como E. coli são bem conhecidos; ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3a edição, 2001, Cold Spring Harbor Press).
[00122] Vetores para transformação de micro-organismos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por conjuntos de procedimentos conhecidos familiares por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade, um projeto de vetor exemplificativo para expressão de um gene em um micro-organismo contém um gene que codifica uma enzima em ligação operável com um promotor ativo no micro-organismo. Alternativamente, se o vetor não contém um promotor em ligação operável com o gene de interesse, o gene pode ser transformado nas células de modo que se tornem ligadas de modo operável a um promotor endógeno no ponto de integração de vetor. O vetor também pode conter um segundo gene que codifica uma proteína. Opcionalmente, um ou ambos os genes são seguidos por uma sequência não traduzida 3' que contém um sinal de poliadenilação. Cassetes de expressão codificam os dois genes que podem ser ligados fisicamente no vetor ou em vetores separados. A cotransformação de micróbios também pode ser usada, em que moléculas de vetor distintas são simultaneamente usadas para transformar células (ver, por exemplo, Protist, dezembro de 2004; 155(4):381 a 393). As células transformadas podem ser selecionadas opcionalmente cm base na habilidade para crescer na presença do antibiótico ou outro marcador selecionável sob condições nas quais as células sem o cassete de resistência não cresceriam.
[00123] Em certas modalidades, a invenção se refere ao uso de uma matéria-prima que contém fósforo atípica, que consiste essencialmente em ou consiste em um composto que contém fósforo de qualquer uma dentre as Fórmulas I a III. Em certas modalidades, um organismo não geneticamente modificado, isto é, um organismo nativo, não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de fósforo) os compostos que contêm fósforo na matéria-prima.
[00124] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm fósforo supracitadas, em que o composto que contém fósforo é um composto de Fórmula I ou um sal do mesmo:
[00125] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00126] R é -H, alquila, -OH, -OR2, -SH ou -SR2;
[00127] R1 é -H ou alquila;
[00128] Y é O ou S;
[00129] Y1 é O ou S; e
[00130] R2 é alquila.
[00131] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm fósforo supracitadas, em que o composto que contém fósforo é um composto de Fórmula II ou um sal do mesmo:
[00132] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00133] R1 é -H ou alquila; e
[00134] Y1 é O ou S.
[00135] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm fósforo supracitadas, em que o composto que contém fósforo é um composto de Fórmula III ou um sal do mesmo:
[00136] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00137] R3 é -H, -OH, -OR4, -SH, -SR4, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila ou heteroaralquila; e
[00138] R4 é alquila ou arila.
[00139] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm fósforo supracitadas, em que o composto que contém fósforo é selecionado a partir do grupo que consiste em:
[00140] Em certas modalidades, a invenção se refere ao uso de uma matéria-prima que contém enxofre atípica, que consiste essencialmente em ou consiste de um composto que contém enxofre de qualquer uma dentre as Fórmulas I a III. Em certas modalidades, um organismo não geneticamente modificado, isto é, um organismo nativo, não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de enxofre) os compostos que contêm enxofre na matéria-prima.
[00141] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm enxofre supracitadas, em que o composto que contém enxofre é um composto de Fórmula IV ou um sal do mesmo:
[00142] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00143] R5 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)-R7;
[00144] R6 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)-R7;
[00145] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros.
[00146] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm enxofre supracitadas, em que o composto que contém enxofre é um composto de Fórmula V, Fórmula VI, ou Fórmula VII ou um sal do mesmo:
[00147] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00148] R8 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NHR7 ou -NH-C(=O)- R7;
[00149] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros.
[00150] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm enxofre supracitadas, em que o composto que contém enxofre é um composto de Fórmula VIII, Fórmula IX, ou Fórmula X ou um sal do mesmo:
[00151] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00152] R9 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NH2, -NHR7 ou -NH- C(=O)-R7;
[00153] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros;
[00154] R10 é hidroxialquila, R9 ou -(CH2)xR9; e
[00155] x é 1, 2, 3 ou 4.
[00156] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm enxofre supracitadas, em que o composto que contém enxofre é um composto de Fórmula XI ou um sal do mesmo:
[00157] em que, independentemente para cada ocorrência,
[00158] R9 é -H, -OH, -OR7, -SH, -SR7, R7, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, -SO2H, -NH2, -NHR7 ou -NH- C(=O)-R7; e
[00159] R7 é cicloalquila, alquila ou arila, ou quaisquer dois R7, tomados juntos, formam um anel de 5 ou 6 membros.
[00160] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer uma das matérias-primas que contêm enxofre supracitadas, em que o composto que contém enxofre é selecionado a partir do grupo que consiste em:
[00161] Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado, em que a molécula de ácido nucleico codifica uma enzima que dota o organismo da habilidade de assimilar uma fonte de fósforo ou uma fonte de enxofre que não seria acessível de outro modo ao organismo nativo; e a enzima é NAD:fosfito oxidorredutase (fosfito desidrogenase), glicerol-3-fosfato desidrogenase (sn-glicerol 3-fosfato: NAD(+) oxidorredutase, EC 1.1.1.8), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima de degradação de organofosfato, uma fosfodiesterase, uma fosfolipase, enzima de dessulfurização, uma dibenzotiofeno-5,5-dióxido monoxigenase, uma 2-hidroxibifenil-2-sulfinato sulfinoliase, uma dibenzotiofeno monoxigenase ou uma NADH-FMN oxidorredutase.
[00162] Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado, em que a molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em Delftia acidoorans fosfodiesterase pdeA, Enterobacter aerogenes updABDE gpdQ, Flavobacterium opdA sem sequência de iniciação periplásmica, Pseudomonas aeruginosa PAO1 phoA, Pseudomonas monteilii C11 hocA, Pseudomonas stutzeri WM88 htxABCDEFHGIJKLMN, Pseudomonas stutzeri WM88 ptxABCDE, Rhodococcus dszD e Rhodococcus dszABC.
[00163] Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que tem pelo menos 85% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que tem pelo menos 90% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que tem pelo menos 95% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que tem pelo menos 99% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado que tem qualquer uma das sequências descritas no presente documento.
[00164] Um vetor recombinante compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico ligadas de modo operável a um promotor.
[00165] Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que compreende qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que tem pelo menos 85% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que tem pelo menos 90% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que tem pelo menos 95% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a um vetor recombinante que tem pelo menos 99% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento.
[00166] Em certas modalidades, a invenção se refere a um organismo geneticamente modificado, em que o organismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico ou um vetor recombinante que compreende qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante tem pelo menos 85% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante tem pelo menos 90% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante tem pelo menos 95% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante tem pelo menos 99% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências descritas no presente documento. Em certas modalidades, a invenção se refere a um organismo geneticamente modificado, em que o organismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico ou um vetor recombinante que tem qualquer uma das sequências descritas no presente documento.
[00167] Em certas modalidades, a invenção se refere a um organismo geneticamente modificado, em que o organismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico; a molécula de ácido nucleico compreende um gene não nativo; e o gene não nativo codifica uma enzima não nativa selecionada a partir do grupo que consiste em NAD:fosfito oxidorredutase (fosfito desidrogenase), glicerol-3-fosfato desidrogenase (sn-glicerol 3-fosfato: NAD(+) oxidorredutase, EC 1.1.1.8), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima de degradação de organofosfato, uma fosfodiesterase, uma fosfolipase, enzima de dessulfurização, uma dibenzotiofeno-5,5-dióxido monoxigenase, uma 2-hidroxibifenil-2-sulfinato sulfinoliase, uma dibenzotiofeno monoxigenase e uma NADH-FMN oxidorredutase.
[00168] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o gene não nativo é selecionado a partir do grupo que consiste em dszABC, dszA, dszABCD, dszB, dszC, dszD, gpdQ, hocA, htxA, htxABCDEFHGIJKLMN, htxB, htxC, htxD, htxE, htxF, htxG, htxH, htxI, htxJ, htxK, htxL, htxM, htxN, opdA, ophA, pde, pdeA, phoA, ptxABCDE, ptxD, ugpA, ugpAECB, ugpB, ugpC, ugpE, updA, updABDE, updB, updD e updE.
[00169] Qualquer organismo pode ser usado como uma fonte do gene não nativo enquanto os organismos apresentarem a atividade enzimática desejada. O gene não nativo pode ser obtido a partir de DNA cromossômico de qualquer um dos micro-organismos supracitados isolando-se um fragmento de DNA que complementa auxotrofia de uma cepa variante sem a atividade enzimática. Alternativamente, se a sequência de nucleotídeo desses genes do organismo já foi elucidada (Biochemistry, Vol. 22, páginas 5.243 a 5.249, 1983; J. Biochem. Vol. 95, páginas 909 a 916, 1984; Gene, Vol. 27, páginas 193 a 199, 1984; Microbiology, Vol. 140, páginas 1.817 a 1.828, 1994; Mol. Gene Genet. Vol. 218, páginas 330 a 339, 1989; e Molecular Microbiology, Vol. 6, páginas 317 a 326, 1992), os genes podem ser obtidos por PCR com uso de iniciadores sintetizados com base em cada uma das sequências de nucleotídeo elucidado, e o DNA de cromossomo como um modelo.
[00170] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o gene não nativo é selecionado a partir do grupo que consiste em Delftia acidoorans fosfodiesterase pdeA, Enterobacter aerogenes updABDE gpdQ, Flavobacterium opdA sem sequência de iniciação periplásmica, Pseudomonas aeruginosa PAO1 phoA, Pseudomonas monteilii C11 hocA, Pseudomonas stutzeri WM88 htxABCDEFHGIJKLMN, Pseudomonas stutzeri WM88 ptxABCDE, Rhodococcus dszD e Rhodococcus dszABC.
[00171] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o organismo geneticamente modificado é uma espécie do gênero Acetobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arxula, Aspergillus, Aurantiochytrium, Bacillus, Candida, Chlamydomonas, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Hansenula, Isochrysis, Kluyveromyces, Lactococcus, Micrococcus, Nannochloropsis, Ogataea, Paracoccus, Pavlova, Penicillium, Pichia, Pseudomonas, Rhizopus, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Streptococcus, Streptomyces, Synechococcus, Tetraselmis, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium, Trichoderma, Xanthaomonas ou Yarrowia.
[00172] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o organismo geneticamente modificado é uma espécie do gênero Aspergillus, Bacillus, Chlamydomonas, Corynebacterium, Escherichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Synechococcus ou Yarrowia.
[00173] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o organismo geneticamente modificado é selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacter, Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes eutropha, Arxula adeninivorans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus orzyae, Aspergillus terreus, Aurantiochytrium spp., Bacillus licheniforms, Bacillus metanolicus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Candida utilis, Chlamydomonas reinhardtii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Isochrysis spp., Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lactococcus lactis, Micrococcus lysodeikticus, Nannochloropsis spp., Ogataea, Paracoccus denitrificans, Pavlova spp., Penicillium chrysogenum, Pichia guilliermondii, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Pseudomonas putida, Rhizopus spp., Rhodosporidium spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Streptococcus lactis, Streptomyces, Synechococcus elongatus, Tetraselmis spp., Thermoanaerobacter spp., Thermoanaerobacterium spp., Trichoderma reesei, Xanthaomonas campestris ou Yarrowia lipolytica.
[00174] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados, em que o organismo geneticamente modificado é selecionado a partir do grupo que consiste em Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Chlamydomonas reinhardtii, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Synechococcus elongatus ou Yarrowia lipolytica.
[00175] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00176] em que
[00177] o substrato compreende uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo;
[00178] a fração que contém fósforo compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém fósforo de qualquer uma das Fórmulas I a III;
[00179] um organismo nativo da mesma espécie que o organismo geneticamente modificado não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de fósforo) o composto que contém fósforo; e
[00180] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00181] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm peso molecular baixo. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um peso molecular entre cerca de 30 Da e cerca de 800 Da. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um peso molecular entre cerca de 40 Da e cerca de 600 Da. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um peso molecular de cerca de 40 Da, cerca de 50 Da, cerca de 60 Da, cerca de 70 Da, cerca de 80 Da, cerca de 90 Da, cerca de 100 Da, cerca de 110 Da, cerca de 120 Da, cerca de 130 Da, cerca de 140 Da, cerca de 150 Da, cerca de 160 Da, cerca de 170 Da, cerca de 180 Da, cerca de 190 Da, cerca de 200 Da, cerca de 220 Da, cerca de 240 Da, cerca de 260 Da, cerca de 280 Da, cerca de 300 Da, cerca de 320 Da, cerca de 340 Da, cerca de 360 Da, cerca de 380 Da, cerca de 400 Da, cerca de 420 Da, cerca de 440 Da, cerca de 460 Da, cerca de 480 Da, cerca de 500 Da, cerca de 520 Da, cerca de 540 Da, cerca de 560 Da, cerca de 580 Da ou cerca de 600 Da.
[00182] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm menos que 12 átomos de carbono. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm menos que 8 átomos de carbono. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 átomos de carbono.
[00183] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm entre cerca 8% e cerca de 75% de fósforo em peso. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm entre cerca 15% e cerca de 47% de fósforo em peso. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm cerca de 8%, cerca de 10%, cerca de 12%, cerca de 14%, cerca de 16%, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 22%, cerca de 24%, cerca de 26%, cerca de 28%, cerca de 30%, cerca de 32%, cerca de 34%, cerca de 36%, cerca de 38%, cerca de 40%, cerca de 42%, cerca de 44%, cerca de 46%, cerca de 48%, cerca de 50%, cerca de 52%, cerca de 54%, cerca de 56%, cerca de 58%, cerca de 60%, cerca de 62%, cerca de 64%, cerca de 66%, cerca de 68%, cerca de 70%, cerca de 72% ou cerca de 74% fósforo em peso.
[00184] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) inferior a cerca de 5. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) de cerca de -0,5 a cerca de 5. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) de cerca de -0,5, cerca de 0, cerca de 0,5, cerca de 1, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 2,5, cerca de 3, cerca de 3,5, cerca de 4 ou cerca de 4,5.
[00185] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo são solúveis em água a cerca de 20 °C em uma concentração entre cerca de 0,01 g/l a cerca de 1.000 g/l. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo são solúveis em água a cerca de 20 °C em uma concentração de cerca de 0,01 g/l, cerca de 0,05 g/l, cerca de 0,1 g/l, cerca de 0,5 g/l, cerca de 1 g/l, cerca de 5 g/l, cerca de 10 g/l, cerca de 15 g/l, cerca de 20 g/l, cerca de 25 g/l, cerca de 30 g/l, cerca de 35 g/l, cerca de 40 g/l, cerca de 45 g/l, cerca de 50 g/l, cerca de 55 g/l, cerca de 60 g/l, cerca de 65 g/l, cerca de 70 g/l, cerca de 75 g/l, cerca de 80 g/l, cerca de 85 g/l, cerca de 90 g/l, cerca de 95 g/l ou cerca de 100 g/l.
[00186] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo se movem através da membrana celular por transporte passivo. Transporte passivo inclui difusão, difusão facilitada e filtração.
[00187] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo se movem através da membrana celular por transporte ativo, como, por exemplo, através de um transportador de cassete de ligação de ATP (ABC) ou outro transportador transmembrana conhecido.
[00188] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo são transportados através da membrana celular.
[00189] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo são substancialmente não biocidas.
[00190] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm fósforo são substancialmente biodegradáveis.
[00191] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que a fração que contém fósforo compreende o composto que contém fósforo em cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em peso.
[00192] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00193] em que
[00194] o substrato compreende uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo;
[00195] a fração que contém fósforo compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém fósforo selecionado consiste em:
[00196] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00197] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que a fração que contém fósforo compreende o composto que contém fósforo em cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em peso.
[00198] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00199] em que
[00200] o substrato compreende uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo;
[00201] a fração que contém fósforo consiste essencialmente em um composto que contém fósforo selecionado a partir do grupo que
[00202] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00203] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00204] em que
[00205] o substrato consiste em uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo;
[00206] a fração que contém fósforo consiste em um composto que contém fósforo selecionado a partir do grupo que consiste em H ,
[00207] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00208] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado sequestra o produto.
[00209] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que uma pluralidade de organismos geneticamente modificados é usada.
[00210] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o substrato não compreende um antibiótico.
[00211] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que um organismo não geneticamente modificado, isto é, um organismo nativo, pode não metabolizar (isto é, usar como uma fonte de fósforo) o composto que contém fósforo.
[00212] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o substrato compreende material lignocelulósico, glicose, xilose, sacarose, ácido acético, ácido fórmico, ácido lático, ácido butírico, um ácido graxo livre, dextrose, glicerol, frutose, lactose, galactose, manose, ramnose ou arabinose, ou uma combinação dos mesmos.
[00213] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o pH do substrato é de cerca de 2,5 a cerca de 10.
[00214] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entra em contato com o substrato a uma temperatura de cerca de 15 oC a cerca de 80 oC.
[00215] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entre em contato com o substrato durante um período de tempo de cerca de 6 h a cerca de 10 dias.
[00216] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entra em contato com o substrato em um fermentador.
[00217] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entra em contato com o substrato em um fermentador de tamanho industrial.
[00218] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que uma pluralidade de organismos geneticamente modificados entra em contato com uma pluralidade de substratos em uma pluralidade de fermentadores, em que a pluralidade de fermentadores é disposta em paralelo.
[00219] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o produto é etanol, isopropanol, ácido lático, um isoprenóidee, um lipídeo, um produto químico de especialidade de valor alto, butanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, ácido succínico, um produto de proteína expressa, um produto de enzima, um poliol, um produto farmacêutico, ácido itacônico ou um produto químico de especialidade de valor alto.
[00220] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00221] em que
[00222] o substrato compreende uma fração que contém enxofre e a fração que não contém enxofre;
[00223] a fração que contém enxofre compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém enxofre de qualquer uma das Fórmulas IV a XI;
[00224] um organismo nativo da mesma espécie que o organismo geneticamente modificado não poderia metabolizar (isto é, usar como uma fonte de enxofre) o composto que contém enxofre; e
[00225] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00226] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm peso molecular baixo. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um peso molecular entre cerca de 30 Da e cerca de 800 Da. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um peso molecular entre cerca de 40 Da e cerca de 600 Da. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um peso molecular de cerca de 40 Da, cerca de 50 Da, cerca de 60 Da, cerca de 70 Da, cerca de 80 Da, cerca de 90 Da, cerca de 100 Da, cerca de 110 Da, cerca de 120 Da, cerca de 130 Da, cerca de 140 Da, cerca de 150 Da, cerca de 160 Da, cerca de 170 Da, cerca de 180 Da, cerca de 190 Da, cerca de 200 Da, cerca de 220 Da, cerca de 240 Da, cerca de 260 Da, cerca de 280 Da, cerca de 300 Da, cerca de 320 Da, cerca de 340 Da, cerca de 360 Da, cerca de 380 Da, cerca de 400 Da, cerca de 420 Da, cerca de 440 Da, cerca de 460 Da, cerca de 480 Da, cerca de 500 Da, cerca de 520 Da, cerca de 540 Da, cerca de 560 Da, cerca de 580 Da ou cerca de 600 Da.
[00227] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm menos que 12 átomos de carbono. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm menos que 8 átomos de carbono. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 átomos de carbono.
[00228] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) inferior a cerca de 5. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) de cerca de -0,5 a cerca de 5. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre têm um coeficiente de partição octanol/água (log P) de cerca de -0,5, cerca de 0, cerca de 0,5, cerca de 1, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 2,5, cerca de 3, cerca de 3,5, cerca de 4 ou cerca de 4,5.
[00229] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre são solúveis em água a cerca de 20 °C em uma concentração entre cerca de 0,01 g/l a cerca de 1.000 g/l. Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre são solúveis em água a cerca de 20 °C em uma concentração de cerca de 0,01 g/l, cerca de 0,05 g/l, cerca de 0,1 g/l, cerca de 0,5 g/l, cerca de 1 g/l, cerca de 5 g/l, cerca de 10 g/l, cerca de 15 g/l, cerca de 20 g/l, cerca de 25 g/l, cerca de 30 g/l, cerca de 35 g/l, cerca de 40 g/l, cerca de 45 g/l, cerca de 50 g/l, cerca de 55 g/l, cerca de 60 g/l, cerca de 65 g/l, cerca de 70 g/l, cerca de 75 g/l, cerca de 80 g/l, cerca de 85 g/l, cerca de 90 g/l, cerca de 95 g/l ou cerca de 100 g/l.
[00230] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre se movem através da membrana celular por transporte passivo. Transporte passivo inclui difusão, difusão facilitada e filtração.
[00231] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre se movem através da membrana celular por transporte ativo, como, por exemplo, através de um transportador de cassete de ligação de ATP (ABC) ou outro transportador transmembrana conhecido.
[00232] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre são transportados através da membrana celular.
[00233] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre são substancialmente não biocidas.
[00234] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que os compostos que contêm enxofre são substancialmente biodegradáveis.
[00235] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que a fração que contém enxofre compreende o composto que contém fósforo em cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em peso.
[00236] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00237] em que
[00238] o substrato compreende uma fração que contém enxofre e uma fração que não contém fósforo;
[00239] a fração que contém enxofre compreende, em uma quantidade de cerca de 10% em peso a cerca de 100% em peso, um composto que contém enxofre selecionado a partir do grupo que consiste em:
[00240] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00241] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que a fração que contém enxofre compreende o composto que contém enxofre em cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em peso.
[00242] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00243] em que
[00244] o substrato compreende uma fração que contém enxofre e a fração que não contém enxofre;
[00245] a fração que contém enxofre consiste essencialmente em um composto que contém enxofre selecionado a partir do grupo que
[00246] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00247] Em certas modalidades, a invenção se refere a um método que compreende a etapa de colocar qualquer um dos organismos geneticamente modificados supracitados em contato com um substrato,
[00248] em que
[00249] o substrato consiste em uma fração que contém enxofre e uma fração que não contém enxofre;
[00250] a fração que contém enxofre consiste em um composto que contém enxofre selecionado a partir do grupo que consiste em
[00251] o organismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto.
[00252] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado sequestra o produto.
[00253] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que uma pluralidade de organismos geneticamente modificados é usada.
[00254] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o substrato não compreende um antibiótico.
[00255] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que um organismo não geneticamente modificado, isto é, um organismo nativo, pode não metabolizar (isto é, usar como uma fonte de enxofre) o composto que contém enxofre.
[00256] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o substrato compreende material lignocelulósico, glicose, xilose, sacarose, ácido acético, ácido fórmico, ácido lático, ácido butírico, um ácido graxo livre, dextrose, glicerol, fructose, lactose, galactose, manose, ramnose ou arabinose, ou uma combinação dos mesmos.
[00257] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o pH do substrato é de cerca de 2,5 a cerca de 10.
[00258] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entre em contato com o substrato a uma temperatura de cerca de 15 oC a cerca de 80 oC.
[00259] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entre em contato com o substrato durante um período de tempo de cerca de 6 h a cerca de 10 dias.
[00260] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entre em contato com o substrato em um fermentador.
[00261] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o organismo geneticamente modificado entre em contato com o substrato em um fermentador de tamanho industrial.
[00262] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que uma pluralidade de organismos geneticamente modificados entre em contato com uma pluralidade de substratos em uma pluralidade de fermentadores, em que a pluralidade de fermentadores é disposta em paralelo.
[00263] Em certas modalidades, a invenção se refere a qualquer um dos métodos supracitados, em que o produto é etanol, isopropanol, ácido lático, um isoprenóidee, um lipídeo, um produto químico de especialidade de valor alto, butanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, ácido succínico, um produto de proteína expressa, um produto de enzima, um poliol, um produto farmacêutico, ácido itacônico ou um produto químico de especialidade de valor alto.
[00264] Em certas modalidades, a invenção se refere a um produto feito por qualquer um dos métodos supracitados.
[00265] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção. Será entendido, entretanto, que os detalhes específicos dados em cada exemplo foram selecionados para propósitos de ilustração e não para serem interpretados de modo a limitar o escopo da invenção. Geralmente, os experimentos foram conduzidos sob condições similares a menos que seja notado.
[00266] O vetor pNC273 foi usado para construir a cepa NS392. Ver Figura 8.
[00267] O vetor pNC273 foi digerido por restrição com enzima PmeI, e o fragmento linear que contém hygR e ptxD sob controle do promotor TEF1 de Y. lipolytica e terminador CYC1 de Y. lipolytica. A transformação foi através de protocolos padrão (Chen D.C. et al., Appl Microbiol Biotechnol. Agosto de 1997; 48(2):232 a 235). Ver Figura 9.
[00268] NS392 de Yarrowia lipolytica (ptxD HYGR) e NS22 de Saccharomyces cerevisiae (tipo selvagem, HYGS) foram pré-cultivados de um dia para outro em um meio definido com fosfato de potássio a 10 mM (NS22) ou fosfito de potássio a 10 mM (NS392). Após crescimento pré-cultura, células foram lavadas duas vezes em água e adicionadas a três condições de meios experimentais em um OD600nm de 0,06 para NS22 e 0,6 para NS392. As três condições de meios foram com fosfito de potássio como única fonte de fósforo, fosfato de potássio como a única fonte de fósforo e com fosfato de potássio mais higromicina como uma condição de controle para selecionar HYGR Y. lipolytica e contra HYGS S. cerevisiae. Ver Figura 10.
[00269] Composição de Meios Definidos
[00270] Macro nutrientes g/l
[00271] Monohidrato de glicose 44
[00272] Ureia 3
[00273] MgSO47H2O 0,5
[00274] Hidrogenoftalato de potássio 1
[00275] Biftalato de sódio 4,25
[00276] Vitaminas mg/l
[00277] Biotina 0,05
[00278] Tiamina 1,0
[00279] Ácido pantotênico D 1,0
[00280] Ácido nicotínico 1,0
[00281] Mio-inositol 25
[00282] Piridoxina 1,0
[00283] Ácido p-aminobenzoico 0,2
[00284] Microelementos mg/l
[00285] EDTA 15
[00286] CaCk-β^O 7,5
[00287] (NH4)2FeSO4^6H2O 3,0
[00288] CuSO4^5H2O 0,2
[00289] ZnSO47H2O 1,0
[00290] MnSO4^H2O 0,5
[00291] Na2MoO4^2H2O 0,2
[00292] Para esse meio de base, adicionar qualquer um de g/l
[00293] KH2PO4 1,3
[00294] KH2PO3 1,2
[00295] Y. lipolytica que expressa ptxD também cresce em hipofosfito. Conforme mostrado na Tabela 1, NS18, Y. lipolytica do tipo selvagem não cresce em fosfito ou hipofosfito, e assim como NS184, uma cepa de Y. lipolytica modificada para produção de lipídeo aumentada. NS324 (criado transformando-se NS18 com pNC273) e NS392 (criado transformando-se NS184 com pNC273) podem crescer tanto em fosfito quanto em hipofosfito. Entretanto, W3110 de E. coli, que tem a habilidade nativa para converter fosfito em fosfato, não pode crescer em hipofosfito. Adicionalmente, W3110 não pôde crescer em hipofosfito pré-incubado em meio de levedura definido, o que sugere que hipofosfito não é degradado independente para fosfito por incubação no meio. Medições adicionais de crescimento com fosfato, fosfito e hipofosfito são mostradas abaixo na Tabela 2 para cepa NS324. TABELA 1
TABELA 2
[00296] S. cerevisiae do tipo selvagem foi mostrada como que não cresce com fosfito suprido como fonte de fósforo (Figura 11). Plasmídeo pNC273, que contém ptxD sob controle do promotor TEF1 de Y. lipolytica, foi transformado em NS22 de S. cerevisiae. Apesar de evidência de expressão funcional de ptxD em Y. lipolytica com o mesmo vetor, e evidência anterior de promotor TEF1 de Y. lipolytica funcionar em S. cerevisiae que expressa um marcador de resistência de antibiótico, no crescimento, foi visto com esse construto transformado com fosfito como fonte de fósforo. Subsequentemente, ptxD foi colocado sob controle do promotor TEF1 de S. cerevisiae no vetor pNC360. Com essa cepa transformada, NS435, o crescimento foi observado com um fosfito como fonte de fósforo, embora uma fase de intervalo estivesse presente. (Figura 12). Para reduzir a fase de intervalo, NS435 foi transferido em série 10 vezes em 5 ml de meio definido com fosfito de potássio a 1 mM que substitui fosfato de potássio. Transferências em série foram realizadas após as culturas alcançarem uma fase estacionária, com aproximadamente 70 gerações em ocorrência durante as transferências. A partir da passagem em série final, a cultura inteira foi aplicada por esfregaço a colônias únicas em meio ágar sólido que contém fosfito. Diversos desses isolados cresceram em meio definido com fosfato a 1 mM, lavados e elevados em meio com fosfito a 10 mM para taxa de crescimento e fase de intervalo (Figura 13). Desses, um isolado do melhor desempenho foi retido e designado NS473.
[00297] S. cerevisiae que expressa de modo funcional ptxD também cresce de modo surpreendente em hipofosfito. Conforme mostrado na Tabela 3, NS22, S. cerevisiae do tipo selvagem, não cresce em fosfito ou hipofosfito. NS435 (criado transformando-se NS22 com pNC360) pode crescer tanto em fosfito quanto em hipofosfito. Entretanto, W3110 de E. coli, que tem a habilidade nativa para converter fosfito em fosfato, não pode crescer em hipofosfito. Adicionalmente, W3110 não pôde crescer em hipofosfito pré-incubado em meio de levedura definido, o que sugere que hipofosfito não é degradado independente a fosfito por incubação no meio. Medições adicionais de crescimento com hipofosfito são mostradas abaixo na Figura 16 para a cepa NS435. TABELA 3
[00298] A cepa NS252 de A. adeninivorans, uma cepa do tipo selvagem, foi transformada com plasmídeo pNC351, que contém o gene ptxD sob controle do promotor PGK1 de A. adeninivorans. A transformação foi realizada com um protocolo de eletrotransformação com seleção em placas de meio definido com fosfito de potássio a 1 mM como fonte de fósforo (ver abaixo). Colônias cresceram em placas espalhadas com células a partir da transformação NS252 + pNC351, e 25 dessas colônias foram corrigidas em placas de ágar de meios definidos de fosfato e fosfito, e avaliadas pela presença de ptxD através da colônia PCR. 24 dentre os 25 dos transformantes putativos foram positivos para ptxD por colônia PCR, e 25 dentre os 25 exibiram crescimento rápido em placas de fosfito.
[00299] 1. Inocular 5 ml de meios YPD em um tubo de cultura de 14 ml com cepa NS252 de A. adeninivorans a partir de uma placa YPD e colocar os mesmos em um cilindro de tambor de 37 °C para incubação de um dia para o outro.
[00300] 2. Adicionar cerca de 2,5 ml da cultura de líquido de um dia para o outro em um frasco de 250 ml que contém 22,5 ml de YPD sem uso prévio e incubar no agitador a 37 °C durante 3,5 a 4 horas.
[00301] 3. Centrifugar a cultura em 3.000 rpm durante 3 min. Descartar o sobrenadante, lavar as células com água seguida por centrifugação e descartar o sobrenadante novamente.
[00302] 4. Ao pélete de célula, adicionar 2 ml de solução de acetato de lítio a 100 mM e 40 μl de ditiotreitol a 2 M. Transferir em um tubo de Eppendorf.
[00303] 5. Prender o tubo na roda a 37 °C e incubar o mesmo durante uma hora.
[00304] 6. Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 segundos, descartar o sobrenadante.
[00305] 7. Lavar as células com 1 ml de água e misturar por pipetagem suave.
[00306] 8. Centrifugar, descartar sobrenadante, lavar com sorbitol a 1 M frio, misturar por pipetagem, centrifugar e descartar o sobrenadante.
[00307] 9. Adicionar 2 ml de sorbitol a 1 M frio ao pélete de célula, colocar o mesmo em gelo.
[00308] 10. Nas cubetas de eletroporação de 0,2 cm pré-resfriadas, adicionar 40 μl das células e 5 μl do DNA a ser transformado, em concentração de DNA > 100 μg/ml de modo ideal.
[00309] 11. Fazer eletroporação a 25 μF, 200 ohms, 1,5 kV, ~4,9 a 5,0 ms constantes.
[00310] 12. Recuperar células transformadas com uso de 1 ml de YPD a 37 °C de um dia para o outro.
[00311] 13. Colocar 100 μl a 500 μl da cultura recuperada em placas seletivas apropriadas e incubar a 30 °C ou 37 °C até formação de colônia.
[00312] Todas as patentes U.S. e pedidos de patente publicados U.S. citados no presente documento estão aqui incorporados a título de referência.
[00313] Os versados na técnica reconhecerão ou poderão revelar, usando não mais que a experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalentes são destinados a serem abrangidos pelas reivindicações a seguir.
Claims (5)
1. Microorganismo geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que o microorganismo geneticamente modificado foi transformado por uma molécula de ácido nucleico; a molécula de ácido nucleico consiste em um gene não nativo consistindo em ptxD; o gene não nativo codifica NAD:fosfito oxidoredutase; e o microorganismo geneticamente modificado é uma espécie do gênero Yarrowia saccharomyces, ou Arxula.
2. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene não nativo é Pseudomonas stutzeri WM88 ptxD.
3. Microorganismo geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo geneticamente modificado é Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae ou Arxula adeninivorans.
4. Método para coverter um substrato em um produto, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar um microorganismo geneticamente modificado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em contato com um substrato, em que Y substrato compreende uma fração que contém fósforo e uma fração que não contém fósforo; a fração que contém fósforo compreende, em uma quantidade de 10% em peso a 100% em peso, um composto que contém fósforo de qualquer uma das Fórmulas I a III; o composto de Fórmula I é
em que, independentemente para cada ocorrência, R é -H, -OH, alquila, -OR2, -SH ou -SR2; R1 é -H ou alquila; Y é O ou S; Y 1 é O ou S; e R2 é alquila; o composto de Fórmula II é
em que, independentemente para cada ocorrência, R1 é -H ou alquila; e Y 1 é O ou S; o composto de Fórmula III é 
em que, independentemente para cada ocorrência, R3 é -H, -OH, -OR4, -SH, -SR4, halo, alquila, arila, heteroarila, aralquila ou heteroaralquila; e R4 é alquila ou arila; um microorganismo nativo da mesma espécie que o microorganismo geneticamente modificado não poderia metabolizar o composto que contém fósforo; e o microorganismo geneticamente modificado converte o substrato em um produto; e o produto é etanol, isopropanol, ácido lático, um isoprenóide, um lipídeo, butanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, ácido succínico, uma proteína, uma enzima, um poliol, ou ácido itacônico.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto que contém fósforo é selecionado a partir do grupo que consiste em:
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