BR112015027704B1 - Composto, uso do mesmo e composição farmacêutica antibacteriana - Google Patents

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Abstract

métodos e compostos de infecções bacterianas. a invenção proporciona compostos da fórmula i, e métodos de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana em um sujeito utilizando um composto da fórmula i. a invenção também proporciona a utilização de um composto da fórmula i na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana num sujeito. a invenção proporciona ainda um dispositivo médico quando utilizado em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito e a um dispositivo médico que compreende a composição da invenção.

Description

COMPOSTO, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA ANTIBACTERIANA
[0001] Esta invenção refere-se a compostos da Fórmula I, métodos de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana num indivíduo utilizando um composto da Fórmula I, a utilização de um composto da Fórmula I na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana num indivíduo, e dispositivos médicos quando usados num método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana num indivíduo.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[0002] Um aumento significativo na prevalência de resistência a múltiplas drogas em patógenos Gram-positivo (G+ve) (Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e Streptococcus pneumoniae) e Gram-negativo (G-ve) (Escherichia colil, Enterobacter spp., Salmonella spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa) causadores de doença, coincidiu com um declínio global sem precedentes do investimento em novos medicamentos anti-infecciosos. Há poucas alternativas atualmente registradas para infecções bacterianas multidroga resistentes (MDR), forçando os médicos a considerar medicamentos de geração anterior, tais como colistina com espectro estreito e um potencial considerável para efeitos colaterais tóxicos. Além disso, existem menos novas classes de agentes terapêuticos anti-infecciosos que se deslocam através do canal de desenvolvimento de drogas.
[0003] Desde o ano de 2000, um período de quase 15 anos, apenas 5 novos modos de ação (MOA) para agentes antibacterianos foram aprovados pelo FDA dos EUA - linezolida (uma oxazolidinona), em 2000, daptomicina (um lipopéptido) em 2003, retapamulina (uma pleuromutilina) em 2007, fidaxomicina (uma tiacumicina de macrólido) em 2011, e bedaquilina (uma diarilquinolina) em 2012. Notavelmente, nenhum destes agentes tem atividade significativa contra bactérias gram-negativas. Nenhum agente antibacteriano de MOA foi aprovado em 2013 e até à data em 2014, apenas tedizolida e dalbavancina, ambos sendo análogos de classes existentes, têm sido recomendados para aprovação nos EUA. Embora existam mais de 300 medicamentos anti-infecciosos em vários estágios de desenvolvimento, a grande maioria destes medicamentos são previamente aprovados compostos antibacterianos ou seus derivados que estão submetidos a estudos para novas indicações.
[0004] Além disso, a prevalência de multidroga resistência em patógenos de animais específicos, juntamente com uma maior regulamentação do registro e uso de antimicrobianos em animais, fez com que os veterinários se tornassem cada vez mais dependentes das classes tradicionais de agentes antimicrobianos. O risco de transferência de organismos zoonóticos MDR a partir de animais para seres humanos também levou a pedidos de novas restrições sobre o uso de algumas drogas antibacterianas recentemente registradas, como as fluoroquinolonas e a terceira e quarta geração de cefalosporinas.
Epidemiologia do desenvolvimento de resistência antibacteriana em agentes patogênicos de seres humanos e animais
[0005] Grande parte da evolução no desenvolvimento de resistência é impulsionada por mudanças na epidemiologia de organismos-chave MDR. Uma vez que se restringe apenas a hospitais de seres humanos e instalações de cuidados a idosos, as cepas resistentes à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) estão agora sendo isoladas da comunidade em proporções alarmantes. Além disso, cepas de MRSA adquiridas na comunidade são mais propensas a portar a toxina de leucocidina Panton-Valentine (PVL), um fator de virulência ligado a lesões dos tecidos cutâneos, bem como uma pneumonia necrotizante, fulminante, rápida, com mortalidade associada significativa. Recentemente as cepas de MRSA tornaram-se adaptados aos hospedeiros em várias espécies de animais principais incluindo pecuária, cavalos e animais de estimação e casos regulares de transferência de humano para animal e de animal para humano, estão sendo documentados. Isto tem consequências importantes para a transmissão de cepa e de saúde pública. Uma pesquisa recente de 751 veterinários australianos para o transporte nasal MRSA descobriu que um notável 21,4% dos veterinários eqüinos foram MRSA-positivos em comparação com 4,9% dos veterinários de pequenos animais e 0,9% de veterinários com pouco contato animal. Essas mudanças ecológicas de MRSA em conjunto com o surgimento de resistência aos novos medicamentos desenvolvidos especificamente para MRSA, como linezolida confirma que a novos anti-infecciosos MRSA são urgentemente necessários. Além disso, os hospitais que utilizam a vancomicina para o tratamento de MRSA em seguida, têm de lidar com surtos de infecções de enterococos resistentes à vancomicina (VRE) em seus pacientes, mais uma vez com escolhas entre antimicrobianos alternativos limitados.
[0006] A emergência global e propagação dentro da comunidade de bactérias Gram-negativas (G-ve) MDR altamente virulentas como E. coli O25b:ST131 confirma que agentes patogênicos bacterianos podem evoluir simultaneamente determinantes de virulência e de resistência. Ecoando a epidemiologia MRSA recente, E. coli O25b:ST131, uma causa importante de infecções do trato urinário e na corrente sanguínea em seres humanos, ela foi isolada das infecções extra-intestinais em animais de estimação, e aves domésticas. A importância cada vez maior de E. coli O25b:ST131 e outros MDR de Enterobacteriaceae com resistência combinada às fluoroquinolonas e espectro estendido de beta-lactâmicos e carbapenens é outra tendência preocupante, especialmente considerando houve poucos avanços recentes no desenvolvimento dos anti-infecciosos do espectro G-ve além de avanços incrementais na família carbapenem.
[0007] A Organização Mundial de Saúde identificou a resistência aos antibióticos como uma das três principais ameaças futuras para a saúde global. Um relatório recente do Centro Norte-Americano para Controle e Prevenção de Doenças (CDC) estimou que "nos Estados Unidos, mais de dois milhões de pessoas adoecem todos os anos com infecções resistentes aos antibióticos, com pelo menos 23 mil mortes como resultado." Os custos médicos extras, só nos EUA, associados ao tratamento e gestão de um único caso de infecção resistente a antibióticos são estimados entre US $ 18.588 e US $ 29.069 por ano, resultando em um custo direto global para o sistema de saúde norte-americano de mais de US $ 20 bilhões anualmente. Além disso, o custo para as famílias norte-americanas em termos de perda de produtividade é estimado em mais de US $ 35 bilhões por ano. Vinte e cinco mil pacientes na União Europeia (UE) ainda morrem anualmente da infecção com a bactéria MDR apesar de muitos países da União Europeia possuírem as melhores práticas de estratégias de vigilância hospitalar e controle de infecção do mundo. Os custos da UE a partir de despesas de saúde e perda de produtividade associada às infecções MDR são estimados em pelo menos € 1,5 bilhão por ano.
[0008] Há uma necessidade clínica não satisfeita de agentes antibacterianos com novos mecanismos de ação para complementar e substituir agentes antibacterianos disponíveis atualmente, cuja eficácia é cada vez mais posta em causa por mecanismos de resistência antibacterianos. Adicionalmente continua a existir uma necessidade de antibacterianos alternativos no tratamento de infecção por bactérias multirresistentes. No entanto, conforme relatado pelo Infectious Diseases Society of America e o European Centre for Disease Control and Prevention, alguns novos medicamentos estão sendo desenvolvidos que oferecem resultados promissores em relação aos tratamentos existentes (Infectious Diseases Society of America 2010, Clinical Infectious Diseases, 50(8):
1081-1083).
[0009] É um objetivo da presente invenção de ultrapassar pelo menos uma das deficiências do estado da técnica.
[0010] A discussão da técnica de fundamento estabelecida acima destina-se apenas à facilitar a compreensão da presente invenção. A discussão não é um reconhecimento ou admissão que qualquer material referido é ou era parte do conhecimento geral comum como na data de prioridade do pedido.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo:
Figure img0001
[0012] Numa modalidade preferida, R1 é H, cicloalquilo, Fórmula II, ou Fórmula III;
Figure img0002
em que R3 é H, NH2, NHNH2, O-CH2CH3, NH-C (O) -fenilo, NH-clorofenilo, NH-CH2-clorofenil, NH-N = CH-cicloalquilo, Fórmula IV, Fórmula V ou Fórmula VI;
Figure img0003
em que A0 é N, C, CH, ou A0 é C e A0 está ligado a R4, via R2, para formar um anel de triazol;
em que A1 é N, C, NH, =CH-CH=N-, =(C6H5)C-CH=N-, ou Fórmula VII;
Figure img0004
A2 é N, C, NH, N-C(O)-fenil, ou Fórmula VII;
em que A3, A4, A5, A6 A7, A8, A11, A12, A13, A14, A15, A16 , A17, A18, A19,A20, A21 A23, A24, A25, A26 e A27 são independentemente C, O, N, NH, S;
em que A9 é C, O, N, NH, N-C(O)-O-CH2-CH3, N-C(O)-O-CH(CH3)2, N-C(O)-NH-CH2-CH3, N-C(O)-NH-CH2-fenil, N-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2 CH2-CH3, N-C(O)-CH2-furan-2-il;
em que A10 é C, NH, -N=CH-CH=, -N=CH-C(C6H5)=;
em que A22 é -CH(CH3)-, -N-CH-, -N-C(CH3)-, N-C(CH2OH)-;
R2 é H, COOH, CH2NH2, CH2OH, CH2NHNH2, metilo, etilo, propilo, butilo, ciclopentilo, ou Fórmula VII e R2 são R4 estão ligados entre si para formar uma pirimidina, pirazina ou anel de triazina, ou R2 e R9 estão ligados em conjunto para formar um anel oxindol pirrolidinilo;
em que R4 é N, NH, O, S, ou R4 e A0 estão ligados, via R2, para formar um anel de triazol, ou R4 é N e R4 e R2 estão ligados em conjunto para formar um anel de pirimidina;
em que R7 é H, Cl, Br, F, OH, CH3, OCH3, SCH3, CN, CCH, CF3, OCF3, SCF3, NO2, butil, t-butil, dimetilamino, fenil, n-propil, i-propil, -NH-C (O) -CH3, -CH = CH-COOH, piperazin-1-il, ou R7 e R8 estão ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel heterocíclico ou um anel benzeno;
em que R6, R8, R14, R16, R25 e R27 são independentemente H, OH, Cl, F, Br, CH3, CN, OCH3, COOH, NO2, CF3, R8 e R7 se ligam em conjunto para formar um anel substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, alifático, anel heterocíclico, ou um anel benzeno, R14 e R15 são ligados em conjunto para formar um anel substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, alifático, anel heterocíclico ou um anel benzeno, R8 e R9 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel de benzeno ou anel heterocíclico, ou R14 e R13 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel heterocíclico ou um anel benzeno;
em que R5, R9, R17, R24 e R28 são, independentemente, H, O, OH, Cl, F, Br, NH2, CH3, CF3, OCH3, CN, NO2, fenil, -NH-CH (OH) -CH3, -NH-C (O) -CH3, ou R9 e R8 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel de benzeno ou anel heterocíclico, ou R13 e R14 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel heterocíclico ou um anel benzeno;
em que R10, R11, R19, R20, R22 e R23 são independentemente H, Cl, ou Br, ou R10 e R11 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel de benzeno ou anel heterocíclico, ou R19 e R20 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel de benzeno ou anel heterocíclico, ou R22 e R23 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel heterocíclico ou um anel benzeno;
em que R12, R18 e R21 são independentemente H, COOH, CH2NH2, CH2OH, metil, etil, propil, butil, ciclopentil, ou R12 e R13 são ligados em conjunto para formar um anel oxindol pirrolidinil;
em que R15 e R26 são independentemente H, Cl, Br, F, OH, CH3, OCH3, SCH3, CN, CF3, OCF3, SCF3, NO2, CCH, nbutil, t-butil, dimetilamino, fenil, n-propil, i-propil, -NH-C (O) -CH3, -CH = CH-COOH, piperazin-1-il, ou R15 e R14 são ligados em conjunto para formar um anel alifático substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, anel heterocíclico ou um anel benzeno; e
em que "---" é uma ligação dupla ou uma ligação simples.
[0013] O composto da Fórmula I é de preferência um sal cloreto.
[0014] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um composto, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir da lista dos compostos apresentados na Figura 1. Quando um sal é apresentado na Figura 1, a invenção abrange tanto o sal como apresentado e quanto a base livre do referido sal, e os estereoisômeros, tautômeros, outros sais farmaceuticamente aceitáveis, e também outros pró-fármacos da base livre.
[0015] De preferência, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo,
em que A0 é C;
em que A1 é N; ou Fórmula VII;
em que A2 é N; ou NH;
em que A3, A4, A6, A7, A11, A12, A14, A15, são N; ou C;
em que A5, A13, A23, A24,A25,A26 e A27 são C;
em que A8 e A21 são S;
em que A9 é NH;
em que A10 é N;
em que A22 é -N-CH-; -N-C(CH3)-; ou -N-C(CH2OH)-;
em que R1 é H; Fórmula II; Fórmula III; cicloalquil;
em que R2 é H; metil; etil; CH2NHNH2; CH2OH; butil; ciclopentil; ou Fórmula VII e R2 está ligado a R4, para formar um anel de pirimidina;
em que R3 é NH2; Fórmula IV; Fórmula V; Fórmula VI; NH2, NH-N = CH-cicloalquil; ou O-CH2CH3;
em que R4 é NH; O; S; ou R4 é N e R4 e R2 são ligados em conjunto para formar um anel de pirimidina;
em que R7 é H; F; Cl; CF3; metil; R7 e R8 estão ligados entre si para formar, um anel de benzeno não substituído; OH; tbutil; fenil; dimetilamino; ipropil; n-propil; CN; CCH; n-butil; SCH3; R7 e R8 são ligados em conjunto para formar um anel heterocíclico não substituído, insaturado; OCH3; Br; OCF3; piperazin-1-il; ou SCF3;
em que R6, R8, R14, e R16 são, independentemente, H; OH; F; OCH3; CF3; metil; Cl; CN; Br; R8 e R7 estão ligados entre si para formar, um anel de benzeno não substituído; R8 e R7 são ligados em conjunto para formar um anel heterocíclico não substituído, insaturado; R14 e R15 estão ligados entre si para formar, um anel de benzeno não substituído; ou R14 e R15 são ligados em conjunto para formar um anel heterocíclico não substituído, insaturado;
em que R5, R9, R13, e R17 são, independentemente, H; OH; NH2; Cl; F; OCH3; OH; -NH-CH (OH) -CH3;
em que R12 é H; metil; etil; CH2OH; ou ciclopentil;
em que R15 é H; F; Cl; CF3; metil; R7 e R8 estão ligados entre si para formar um anel de benzeno não substituído; OH; tbutil; fenil; dimetilamino; ipropil; n-propil; CN; CCH; n-butil; SCH3; R15 e R14 são ligados em conjunto para formar um anel heterocíclico não substituído, insaturado; OCH3; Br; OCF3; piperazin-1-il; ou SCF3;
em que R24 e R28 são independentemente H; OH; ou Cl;
em que R25 e R27 são independentemente H; ou OH;
em que R26 é H; CH3; Br; Cl; OH; dimetilamino; -O-P(O)(OEt)2; CF3; ou F; e
em que "----" independentemente, uma única ou uma ligação dupla.
[0016] Mais preferivelmente, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir do grupo que compreende: NCL008; NCL009; NCL023; NCL025; NCL026; NCL029; NCL036; NCL037; NCL039; NCL040; NCL050; NCL061; NCL064; NCL065; NCL068; NCL075; NCL076; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL085; NCL086; NCL088; NCL089; NCL090; NCL092; NCL094; NCL095; NCL097; NCL098; NCL099; NCL101; NCL104; NCL105; NCL106; NCL108; NCL111; NCL112; NCL114; NCL115; NCL116; NCL118; NCL119; NCL121; NCL122; NCL123; NCL124; NCL125; NCL126; NCL130; NCL131; NCL132; NCL133; NCL135; NCL136; NCL137; NCL138; NCL139; NCL140; NCL141; NCL144; NCL145; NCL146; NCL147; NCL148; NCL150; NCL152; NCL153; NCL154; NCL156; NCL157; NCL158; NCL159; NCL161; NCL162; NCL164; NCL165; NCL166; NCL167; NCL168; NCL169; NCL170; NCL171; NCL172; NCL173; NCL174; NCL176; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL193; NCL194; NCL195; NCL196; NCL197; NCL198; NCL199; NCL200; NCL201; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL206; NCL207; NCL208; NCL209; NCL210; NCL211; NCL212; NCL213; NCL215; NCL216; NCL217; NCL218; NCL219; NCL220; NCL221; NCL222; NCL223; NCL224; NCL225; NCL226; NCL227; NCL228; NCL229; e NCL230.
[0017] Ainda mais preferencialmente, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir do grupo que compreende: NCL040; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL088; NCL089; NCL097; NCL099; NCL123; NCL146; NCL157; NCL158; NCL177; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL199; NCL202; NCL204; NCL205; NCL215; NCL216; NCL217; NCL219; e NCL221.
[0018] Ainda mais preferivelmente, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir do grupo que compreende: NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL089; NCL097; NCL157; NCL158; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL199; NCL204; NCL216; NCL217; NCL219; e NCL221.
[0019] Ainda mais preferencialmente, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir do grupo que compreende: NCL089; NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL216; NCL219; e NCL221.
[0020] Mais preferivelmente, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, selecionado a partir do grupo que compreende: NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL195; e NCL196.
[0021] Numa modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que o composto não é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: NCL812, NCL001, NCL002, NCL003, NCL004, NCL005, NCL006, NCL007, NCL010, NCL011, NCL012, NCL013, NCL014, NCL015, NCL016, NCL017, NCL018, NCL019, NCL020, NCL021, NCL022, NCL024, NCL027, NCL028, NCL030, NCL031, NCL032, NCL033, NCL034, NCL035, NCL038, NCL041, NCL042, NCL043, NCL044, NCL045, NCL046, NCL047, NCL048, NCL049, NCL051, NCL052, NCL053, NCL054, NCL055, NCL056, NCL057, NCL058, NCL059, NCL060, NCL062, NCL063, NCL066, NCL067, NCL069, NCL070, NCL071, NCL072, NCL073, NCL074, NCL077, NCL082, NCL083, NCL087, NCL091, NCL093, NCL096, NCL100, NCL102, NCL103, NCL107, NCL109, NCL110, NCL113, NCL117, NCL120, NCL127, NCL128, NCL129, NCL134, NCL142, NCL143, NCL149, NCL151, NCL155, NCL160, NCL163, NCL175, NCL182, NCL191, NCL192, e NCL214.
[0022] Em um aspecto preferido da invenção, o composto da Fórmula I não é robenidina (também referenciada na presente relatório descritivo como NCL812 e também conhecido como 1,3-bis [(E) - (4-clorofenil) metilenoamino] guanidina), que tem uma estrutura como se segue:
Figure img0005
[0023] Numa modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R9, R12, R13, R15, R16, R17 são H; R4 é O; R8 e R14 são CF3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e toda Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0006
[0024] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N e A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R7, e R8 são H; R4 é NH; R9 é Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1 e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0007
[0025] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e toda Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0008
[0026] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7,R9, R12, R13, R15, R16, R17 são H; R4 é NH; R8 e R14 são F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e toda Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0009
[0027] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R8, R12, R14, R15, R16, R17 são H; R4 é NH; R9 e R13 são OCH3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e toda Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0010
[0028] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R9, R12, R13, R15, R16, R17 são H; R4 é NH; R8 e R14 são OCH3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e toda Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0011
[0029] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R8 e R9 são H; R4 é NH; R7 é Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0012
[0030] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0013
[0031] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são metil; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0014
[0032] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R8, R12, R14, R15, R16, R17 são H; R4 é NH; R9 e R13 são metil; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0015
[0033] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15 são C; R2, R5, R6, R7, R9, R12, R13, R15 R16 e R17 são H; R4 é NH; R8 e R14 são metil; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0016
[0034] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R8, e R9 são H; R4 é NH; R7 é CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0017
[0035] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R7, e R9 são H; R4 é NH; R8 é CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0018
[0036] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R8, e R9 são H; R4 é NH; R7 é metil; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0019
[0037] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R7, e R9 são H; R4 é NH; R8 é Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0020
[0038] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, saõ C; R2, R5, R6, R7, R9, R12, R13, R15, R16, R17 são H; R4 é NH; R8 e R14 são Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0021
[0039] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16, R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0022
[0040] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0023
[0041] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NHNH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2 é metil, R5, R6, R8 e R9 são H; R4 é NH; R7 é Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0024
[0042] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R9, R12, R13, R15, R16, e R17 são H; R4 é S; R8 e R14 são Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0025
[0043] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N;A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2, R5, R6, R8, e R9 são H; R4 é NH; R7 é Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0026
[0044] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NHNH2; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R2 é metil; R5, R6, R8, e R9 são H; R4 é NH; R7 é CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0027
[0045] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7, R15 e R17 são Cl; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0028
[0046] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R15 é CF3; R17 é F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL078):
Figure img0029
[0047] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R15 é F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL079):
Figure img0030
[0048] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R12 é metil; R15 é CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL080):
Figure img0031
[0049] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8 R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; R12 é metil; e “----” na Fórmula I A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0032
[0050] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R15, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R17 são Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0033
[0051] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; R17 é F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL084):
Figure img0034
[0052] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R15, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R14 é CN; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0035
[0053] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R15, e R16 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R17 é F; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0036
[0054] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 é Cl; R15 é CF3; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL089):
Figure img0037
[0055] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R9, R12, R13, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R8 são ligados em conjunto para formar um anel de benzeno, não substituído; R14 e R15 são ligados em conjunto para formar um anel de benzeno, não substituído; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0038
[0056] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; A1 é N; A2 é NH; R1 é ciclohexil; R3 é NH-N=CH-ciclohexil; R4 é NH; R2 é H; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1 é uma ligação dupla. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0039
[0057] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, , A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R9, R12, R13 e R17 são H; R4 é NH; R6, R7, R8, R14, R15, e R16 saõ OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL097):
Figure img0040
[0058] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são t-butil; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0041
[0059] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R7, R8, R9, R12, R13, R14, e R15 são H; R4 é NH; R5, R6, R16, e R17 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0042
[0060] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R8, R12, R14, e R17 são H; R4 é NH; R6, R7, R9, R13, R15, e R16 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0043
[0061] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R12, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7, R8, R9, R13, R14, e R15 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL097):
Figure img0044
[0062] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R6, R7, R8, R9, R12, R13, R14, R15, e R16 são H; R4 é NH; R5 e R17 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0045
[0063] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, ^ A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R7, R8, R9, R12, R13, R14, R15, e R17 são H; R4 é NH; R6 e R16 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0046
[0064] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R8, R9, R12, R13, R14, e R17 são H; R4 é NH; R6, R7, R15, e R16 são OH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----” são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0047
[0065] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são fenil; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0048
[0066] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são dimetilamino; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0049
[0067] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R8 R9, R12, R13, R14, e R17 são H; R4 é NH; R6 e R16 são OCH3; R7 e R15 são OH; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0050
[0068] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11,A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são i-propil; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0051
[0069] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são n-propil; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0052
[0070] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R8, R9, R12, R13, R14, e R17 são H; R4 é NH; R6, R7, R15, e R16 são F; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0053
[0071] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são CCH; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0054
[0072] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R7, R8, R9, R12, R13, R14, R15, e R17 são H; R4 é NH; R6 e R16 são Br; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0055
[0073] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são butil; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0056
[0074] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 is -C(C6H5)-CH-N- e A10 is -N=CH- C(C6H5)=; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R7, R8, R9, R12, R13, R14, R15, R16, e R17 são H; R4 é NH; e “----” na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0057
[0075] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são CH3S; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0058
[0076] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula III; R3 é a Fórmula VI; A0 é C; R2 e R21 são H; A1 e A20 são N; A2 e A19 são NH; A8 e A21 são S; R4 é NH; R10 e R11 são ligados em conjunto para formar um anel de benzeno substituído; R22 e R23 são ligados em conjunto para formar um anel de benzeno substituído; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula III e Fórmula VI “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0059
[0077] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R7, R8, R9, R13, R14, R15, R16, e R17 são H; R4 é NH; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0060
[0078] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R9, R12, R13, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R8 são ligados em conjunto para formar um anel não substituído, heterocíclico; R14 e R15 são ligados em conjunto para formar um anel heterocíclico não substituído, insaturado; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0061
[0079] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 é =CH-CH=N- e A10 é -N-(CH)2-; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são OCH3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0062
[0080] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são OH; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0063
[0081] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são etil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0064
[0082] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5 A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Br; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0065
[0083] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R12, R14, R16, e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; R9 e R13 são NH2; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL157):
Figure img0066
[0084] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são etil; R5 e R17 são OH; R6, R8, R9, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL158):
Figure img0067
[0085] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são ciclopentil; R5 e R17 são OH; R6, R8, R9, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; e “—“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “—“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0068
[0086] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são OCF3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0069
[0087] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são piperazin-1-il; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0070
[0088] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é O-CH2-CH3; A1 é N; A2 é NH; A0, A3, A4, A5, A6 e A7 são C; R2 é metil; R5, R6, R8, e R9 são H; R4 é NH; R7 é Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0071
[0089] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R5, R6, R8, R9, R12, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são SCF3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0072
[0090] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R6, R8, R9, R12, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; R5 e R17 são -NH-CH(OH)-CH3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui:
Figure img0073
[0091] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é Cl. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL179):
Figure img0074
[0092] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é NH2; A1 é N; A2 e R4 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, e A7 são C; R5, R6, R8, e R9 são H; R2 é butil; R7 é Cl; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, e toda Fórmula II “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL188):
Figure img0075
[0093] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é CH3. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL195):
Figure img0076
[0094] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é OH. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL196):
Figure img0077
[0095] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é Br. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL193):
Figure img0078
[0096] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R26, R27 e R28 são H; e A23, A24, A25, A26 e A27 são C. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL199):
Figure img0079
[0097] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-C(CH3)-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é Cl. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL204):
Figure img0080
[0098] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2, R6, R8 R9, R12, R13, R14, e R16 são H; R4 é NH; R7 e R15 são Cl; R5 e R17 são F; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL216):
Figure img0081
[0099] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são CH3; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL217):
Figure img0082
[00100] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que R1 é a Fórmula II; R3 é a Fórmula IV; A1 e A10 são N; A2 e A9 são NH; A0, A3, A4, A5, A6, A7, A11 A12, A13, A14 e A15, são C; R2 e R12 são metil; R5, R6, R8, R9, R13, R14, R16 e R17 são H; R4 é NH; R7 e R15 são t-butil; e “----“ na Fórmula I entre A0 e A1, toda Fórmula II e Fórmula IV “----“ são ligações duplas. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL219):
Figure img0083
[00101] Numa outra modalidade preferida da invenção, o composto é um composto da Fórmula I, ou um estereoisômero, tautômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo, em que A0 é C; R1 é H; A2 e R4 são N; R3 é NH2; A1 é a Fórmula VII; R2 é a Fórmula VII e R2 está ligado a R4, formando um anel de pirimidina; “----“ na Fórmula I entre R2 e A0, e entre A1 e A2 são ligações duplas; A22 é -N-CH-; R24, R25, R27 e R28 são H; A23, A24, A25, A26 e A27 são C; e R26 é CF3. Um exemplo de um composto desta modalidade da invenção inclui (NCL221):
Figure img0084
[00102] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um método para tratamento ou prevenção de uma colonização ou infecção bacteriana num indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula I, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma no indivíduo. Neste aspecto, a infecção bacteriana é causada por um agente bacteriano. O método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana ou colonização num indivíduo, pode também compreender a administração das composições farmacêuticas ou veterinárias da invenção.
[00103] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionada a utilização de um composto da Fórmula I, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, caracterizado por ser na fabricação de medicamento para o tratamento de uma infecção ou colonização bacteriana num indivíduo. Neste aspecto, a infecção bacteriana é causada por um agente bacteriano.
[00104] O indivíduo pode ser qualquer indivíduo capaz de colonização e infecção por bactérias. O indivíduo pode ser um mamífero, ou pode ser písceo ou aviário. De preferência, o indivíduo é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, seres humanos, caninos, felinos, bovinos, ovinos, caprinos, outras espécies de ruminantes, porcina, equina, avícola, ou písceo.
[00105] O composto da Fórmula I pode ser administrado ao indivíduo numa dose selecionada a partir do grupo que compreende de 0,1 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal, de preferência 1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, e mais preferivelmente 5 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal. O composto da Fórmula I pode ser administrado ao indivíduo utilizando um esquema de dosagem selecionado a partir do grupo que consiste em: a cada hora, 3 vezes por dia; duas vezes por dia; diária; a cada dois dias; duas vezes por semana; uma vez por semana; uma vez quinzenalmente; uma vez por mês; uma vez a cada dois meses ou por taxa constante ou infusão de taxa variável. De preferência, o composto da Fórmula I é administrado até a colonização ou os sinais e sintomas de infecção ou colonização serem pelo menos parcialmente tratados ou atenuados.
[00106] Numa modalidade, a concentração do composto da Fórmula I (ou um metabolito) no sangue do indivíduo após o tratamento está dentro de uma gama selecionada de entre o grupo que compreende, mas não se limitando a: entre 0,1 e 10 ug/ml em 2 horas, 1 e 200 ug/mL após 12 horas; entre 0,1 e 5 ug/ml após 24 horas; entre 0,01 e 2 ug/ml após 48 horas; entre 0,0001 e 1 ug/ml após 72 horas. De preferência, a concentração é selecionada a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a: menos do que 200 ug/ml após 12 horas; menos do que 5 ug/ml após 24 horas; menos do que 1 ug/L após 48 horas e menos de 0,5 ug/mL após 72 horas.
[00107] O agente causador da infecção bacteriana é um agente bacteriano. Numa modalidade preferida, o agente não é uma espécie de protozoário. Numa modalidade preferida, o agente não é um protozoário de coccídios. Mais preferencialmente, o agente não é Clostridium perfringens nem uma espécie de bactérias heterotróficas presentes em amostras de solo coletadas por Hansen et al de Jyndevad Dinamarca como discutido nos seguintes documentos: Hansen et al. 2012, Chemosphere, 86:212-215; e Hansen et al. 2009, Environmental Pollution 157:474-480.
[00108] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-negativo. Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo. Numa outra modalidade, o agente bacteriano não tem parede celular. Numa outra modalidade, a infecção bacteriana é causada por uma mistura de pelo menos dois agentes selecionados a partir do grupo que consiste em: bactérias gram negativas, gram positivas e agentes bacterianos sem parede celular.
[00109] O agente bacteriano causando a infecção bacteriana pode ser um agente bacteriano gram-positivo selecionado a partir do grupo que inclui, mas não se limitando a, Staphylococcus spp, Streptococci, Enterococcus spp, Leuconostoc spp, Corynebacterium spp, Arcanobacteria spp, Trueperella spp, Rhodococcus spp, Bacillus spp, Anaerobic Cocci, Bacilos de não esporulação Gram-positivos anaeróbios, Actinomyces spp, Clostridium spp, Nocardia spp, Erysipelothrix spp, Listeria spp, Kytococcus spp, Mycoplasma spp, Ureaplasma spp, e Mycobacterium spp.
[00110] Numa modalidade, o agente bacteriano é gram positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Staphylococcus spp. Exemplos de Staphylococcus spp incluem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus hominis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus simulans, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus condimenti, Staphylococcus delphini, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus fleurettii, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus muscae, Staphylococcus nepalensis, Staphylococcus piscifermentans, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simiae, Staphylococcus succinus, e Staphylococcus vitulinus.
[00111] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Streptococcus spp. Exemplos de Streptococcus spp incluemStreptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus cricetus, Streptococcus cristatus , Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus equi subsp. equi, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus ferus, Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (formerly Streptococcus bovis biotipo i), Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus (antigamente Streptococcus bovis biotipo ii/2), Streptococcus gordonii, Streptococcus hyointestinalis, Streptococcus hyovaginalis, Streptococcus infantarius, Streptococcus infantarius subsp infantarius, Streptococcus infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus lutetiensis (antigamente Streptococcus bovis biotipo ii.1), Streptococcus macaccae, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus pseudintermedius, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus vestibularis, e Streptococci (Deficiente) Variante Nutricionalmente (Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans, eGranulicatella para-adiacens) e espécies relacionadas tais como Rothia mucilaginosa (antigamenteStomatococcus mucilaginosus ) e Pediococcus.
[00112] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Enterococcus spp. Exemplos de Enterococcus spp incluem Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus durans, Enterococcus avium, Enterococcus raffinosus, Enterococcus pallens, Enterococcus gilvus, Enterococcus cecorum, Enterococcus malodoratus, Enterococcus italicus, Enterococcus sanguinicola, Enterococcus mundtii, Enterococcus casseliflavus/flavescens, Enterococcus dispar, Enterococcus hirae, Enterococcus pseudoavium, e Enterococcus bovis.
[00113] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Leuconostoc spp. Exemplos de Leuconostoc spp incluem Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc citreum, e Leuconostoc lactis.
[00114] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Corynebacterium spp. Exemplos de Corynebacterium spp incluem Corynebacterium spp não lipofílico, fermentativo, tais comoCorynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium confusum, Corynebacterium cystidis, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium simulans, Corynebacterium sundvallense, Corynebacterium thomssensii, Corynebacterium freneyi, e Corynebacterium aurimucosum, não lipofílico, não fermentativo Corynebacterium spp tais como Corynebacterium afermentans afermentans, Corynebacterium auris, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, e Corynebacterium propinquum e lipofílicoCorynebacterium spp tais como Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium afermentans lipophilum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium tuberculostearum, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium bovis, CDC coryneform grupos F-1 e G, e Corynebacterium lipophiloflavum, e outras Corynebacterium spp tais como Turicella, Arthrobacter, Brevibacterium, Dermabacter, Rothia, Oerskovia, Microbacterium, e Leifsonia aquatica.
[00115] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Arcanobacteria spp. Exemplos de Arcanobacteria spp incluem A. haemolyticum, A. pyogenes (agora denominadas como Trueperella pyogenes, originalmente denominadas como Actinomyces pyogenes), e A. bernardiae.
[00116] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Rhodococcus spp. Exemplos de Rhodococcus spp incluem Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus fasciens, e Rhodococcus rhodochrous.
[00117] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Gordonia spp.
[00118] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Tsukamurella spp.
[00119] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Acholeplasma spp.
[00120] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Actinobactéria tais como Crossiella equi.
[00121] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Bacillus spp. Exemplos de Bacillus spp incluem Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Brevibacillus brevis, Brevibacillus laterosporus, ePaenibacillus alvei.
[00122] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Anaerobic Cocci. Exemplos de Anaerobic Cocci incluem Anaerococcus murdochii, Anaerococcus prevotii, Anaerococcus tetradius, Anaerococcus octavius, Anaerococcus hydrogenalis, Anaerococcus lactolyticus, Anaerococcus vaginalis, Atopobium parvulum, Finegoldia magna, Gallicola barnesae, Gemella asaccharolytica, Gemella bergeri, Gemella cuniculi, Gemella haemolysans, Gemella morbillorum, Gemella palaticanis, Gemella sanguinis, Parvimonas micra, Peptococcus niger, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptoniphilus indolicus, Peptoniphilus harei, Peptoniphilus ivorii, Peptoniphilus lacrimalis, Peptoniphilus olsenii, Peptostreptococcus stomatis, Peptostreptococcus anaerobius, Ruminococcus productus, Slackia heliotrinireducens, e Staphylococcus saccharolyticus.
[00123] Em outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Bacilli Não Esporulação Gram-Positivo Anaeróbico. Exemplos de Bacilli Não Esporulação Gram-Positivo Anaeróbico incluem Alloscardovia omnicolens, espécies de Atopobium (tais comoAtopobium minutum, Atopobium rimae, Atopobium parvulum, e Atopobium vaginae), Bifidobacteria (tais como Bifidobacteria adolescentis, Bifidobacteria dentium, Bifidobacteria scardovii), Catabacter hongkongensis, Collinsella aerofaciens, Eggerthella (tais como Eggerthella lenta, Eggerthella hongkongensis e Eggerthella sinensis), Eubacterium e espécies relacionadas (tais como Eubacterium nodatum, Eubacterium tenue, Eubacterium brachy, Eubacterium infirmum, Eubacterium minutum, Eubacterium nodatum, Eubacterium saphenum, Eubacterium sulci, Filifactor alocis, Mogibacterium timidum, Mogibacterium vescum, Pseudoramibacter alactolyticus, Bulleidia extructa, eSolobacterium moorei), espécies de Lactobacillus (tais como Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus iners eLactobacillus ultunensis), espécies de Mobiluncus (tais como Mobiluncus curtisii, Mobiluncus mulieris), Moryella indoligenes, espécies orais de Olsenella (tais como Olsenella uli e Olsenella profuse), Oribacterium sinus, Propionibacterium (tais como Propionibacterium acnes e Propionibacterium propionicum), Slackia exigua, e Turicibacter sanguine.
[00124] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Actinomyces spp. Exemplos de Actinomyces spp incluem Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii, Actinomyces viscosus, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces meyeri, eActinomyces gerencseriae (antigamenteActinomyces israelii sorotipo II), Actinomyces europaeus, Actinomyces neuii, Actinomyces radingae, Actinomyces graevenitzii, Actinomyces hordeovulneris, Actinomyces turicensis, Actinomyces georgiae, Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes, Arcanobacterium (Actinomyces) bernardiae, Actinomyces funkei, Actinomyces lingnae, Actinomyces houstonensis, eActinomyces cardiffensis.
[00125] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Clostridium spp. Exemplos de Clostridium spp incluem Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium botulinum (tipos A, B, C, D, E, F, G), Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium novyi (tipo A), Clostridium novyi (tipo B), Clostridium perfringens, Clostridium pefringens (tipos A-E), Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium sphenoides, Clostridium tertium, eClostridium tetani.
[00126] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Nocardia spp. Exemplos de Nocardia spp incluem Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, e Nocardia transvalensis.
[00127] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Erysipelothrix spp, tais como Erysipelothrix rhusiopathiae.
[00128] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Listeria spp, tais como Listeria monocytogenes.
[00129] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Kytococcus spp, tais como Kytococcus schroeteri.
[00130] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Mycobacterium spp. Exemplos de Mycobacterium spp incluem Mycobacterium abscessus, Mycobacterium arupense, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aubagnense, Complexo de Mycobacterium avium, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium branderi, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chimaera, Mycobacterium colombiense, Mycobacterium conceptionense, Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium elephantis, Mycobacterium farcinogenes, Mycobacterium florentinum, Grupo de Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium genavense, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium heckeshornense, Mycobacterium heidelbergense, Mycobacterium houstonense, Mycobacterium immunogenum, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium senegalense, Mycobacterium africanum, Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lacus, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium mageritense, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium microti, Mycobacterium montefiorense (enguias), Mycobacterium moracense, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium nebraskense, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium novocastrense, Mycobacterium palustre, Mycobacterium parmense, Mycobacterium phlei, Mycobacterium phocaicum, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium porcinum, Mycobacterium pseudoshottsii (peixes), Mycobacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium saskatchewanense, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium senuense, Mycobacterium septicum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae/chromogenicum complex, Mycobacterium triplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium wolinskyi, e Mycobacterium xenopi.
[00131] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Trueperella spp. Exemplos de Trueperella spp incluem Trueperella abortisuis, Trueperella bernardiae, Trueperella bialowiezensis, Trueperella bonasi, Trueperella pyogenes (Arcanobacterium pyogenes).
[00132] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-positivo, gram-negativo ou não tem uma parede celular e selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes patogênicos de pecuária. Exemplos de agentes patogênicos de pecuária incluem Actinobaculum suis, Actinomyces bovis, Arcanobacterium pyogenes, Bacillus anthracis, cereus, licheniformis, pumilus, melaninogenicus, subtilis, Clostridium botulinum, chauvoei, haemolyticum, novyi, perfringens, septicum, sordellii, tetani, colinum, Corynebacterium pseudotuberculosis, renale, Dermatophilus congolensis, Enterococcus spp (tais como E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium, E. hirae), Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria ivanovii, grayi, innocua, seeligeri, welshimeri, monocytogenes, Mycobacterium avium, bovis, paratuberculosis (Doença de Johne), Mycoplasma (tais como capricolum subsp. capripneumoniae, subsp. capricolum, M. mycoides subsp mycoides, M. agalactiae, M. ovipneumoniae, M. conjunctivae, M. arginini, M. bovis, e M. putrefaciens) Mycoplasma bovis, dispar, mycoides subsp. mycoides (tal como Peripneumonia contagiosa dos bovinos CBPP) Mycoplasma gallisepticum (MG), iowae meleagridis (MM), synoviae (MS) Mycoplasma haemosuis (antigamente Eperythrozoon suis), alkalescens, bovigenitalum, bovirhinis, bovoculi, californicum, canadense, cynos, equigenitalium, gateae, haemocanis, haemofelis, hyopneumoniae, hyorhinis, hyosynoviae, iowae, leachii, meleagridis, mycoides subsp capri, wenyonii, suis, Rhodococcus equi, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus felis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus warneri, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, Staphylococcus capitis subsp. capitis, Staphylococcus capitis subsp. urealyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus delphini, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Streptococcus uberis, Streptococcus canis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis, Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus equi (Streptococcus equi subsp equi), Streptococcus equisimilis (Streptococcus dysgalactiae subsp equisimilis), porcinus, suis, zooepidemicus, Streptococcus zooepidemicus (Streptococcus equi subsp zooepidemicus), Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Eubacterium, Peptococcus indolicus, e Peptostreptococcus anaerobius; e várias espécies dos seguintes gêneros Gram negativos: Actinobacillus, Aeromonas, Anaplasma, Arcobacter, Avibacterium, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Capnocytophaga, Chlamydia, Chlamydophila, Chryseobacterium, Coxiella, Cytophaga, Dichelobacter, Edwardsiella, Ehrlichia, Escherichia, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Klebsiella, Lawsonia, Leptospira, Mannheimia, Megasphaera, Moraxella, Neorickettsia, Nicoletella, Ornithobacterium, Pasteurella, Photobacterium, Piscichlamydia, Piscirickettsia, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Riemerella, Salmonella, Streptobacillus, Tenacibaculum, Vibrio, e Yersinia.
[00133] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes patogênicos das espécies de animais de estimação tais como gatos, cães e cavalos. Exemplos de tais agentes patogênicos incluem patógenos equídeos como Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Corynebacterium pseudotuberculosis, Clostridium piliforme, Actinomyces bovis, Staphylococcus aureus, β-haemolytic Steptococcus spp, Dermatophilus congolense, Clostridiium tetani, e Clostridium botulinum. Outros exemplos incluem patógenos de cães e gatos como Staphylococcus spp, Estreptococo spp, Clostridium spp, Actinomyces spp, Enterococcus spp, Nocardia spp, Mycoplasma spp, e Mycobacterium spp.
[00134] Numa outra modalidade, o agente bacteriano é gram-negativo e selecionado a partir do grupo consistindo nas seguintes espécies e famílias representativas: Acetobacteraceae:- Roseomonas cervicalis; Roseomonas fauriae; Roseomonas gilardii. -- Aeromonadaceae:-Aeromonas allosaccharophila; Aeromonas aquariorum; Aeromonas caviae; Aeromonas hydrophila (e subespécies); Aeromonas salmonicida; Aeromonas shubertii; Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria). -- Alcaligenaceae:- Achromobacter xylosoxidans; Alcaligenes faecalis; Bordetella ansorpii; Bordetella avium; Bordetella bronchiseptica; Bordetella hinzii; Bordetella holmesii; Bordetella parapertussis; Bordetella pertussis; Bordetella petrii; Bordetella trematum; Oligella ureolytica; Oligella urethralis. -- Anaplasmataceae:- Anaplasma phagocytophilum; Anaplasma platys; Anaplasma bovis; Anaplasma centrale; Anaplasma marginale; Anaplasma odocoilei; Anaplasma ovis; Ehrlichia canis; Ehrlichia chaffeensis; Ehrlichia ewingii; Ehrlichia muris; Ehrlichia ovina; Ehrlichia ruminantium; Neoehrlichia lotoris; Neoehrlichia mikurensis; Neorickettsia helminthoeca; Neorickettsia risticii; Neorickettsia sennetsu; Wolbachia pipientis. -- Armatimonadaceae:-Armatimonas rosea. -- Bacteroidaceae:- Bacteroides forsythus; Bacteroides fragilis; Bacteroides melaninogenicus; Bacteroides ruber; Bacteroides urealtyicus. -- Bartonellaceae:- Bartonella alsatica; Bartonella australis; Bartonella bacilliformis; Bartonella birtlesii; Bartonella bovis; Bartonella capreoli; Bartonella chomelii; Bartonella clarridgeiae; Bartonella doshiae; Bartonella elizabethae; Bartonella grahamii; Bartonella henselae; Bartonella koehlerae; Bartonella peromysci; Bartonella phoceensis; Bartonella quintana; Bartonella rattimassiliensis; Bartonella rochalimae; Bartonella schoenbuchensis; Bartonella talpae; Bartonella tamiae; Bartonella taylorii; Bartonella tribocorum; Bartonella vinsonii subsp . berkhoffii; Bartonella vinsonii subsp. arupensis; Bartonella vinsonii subsp. vinsonii. --Bdellovibrionaceae:- Bdellovibrio spp. -- Brachyspiraceae:- Brachyspira spp incluindo Brachyspira hampsonii, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira murdochii, Brachyspira pilosicoli. -- Brucellaceae:- Brucella abortus; Brucella canis; Brucella ceti; Brucella melitensis; Brucella ovis; Brucella pinnipedialis; Brucella suis; Ochrobactrum anthropi; Ochrobactrum intermedium. --Burkholderiaceae:- Burkholderia aboris; Burkholderia ambifaria (genomovar VII); Burkholderia anthina (genomovar VIII); Burkholderia cenocepacia (genomovar III); Burkholderia cepacia (genomovar I); Burkholderia diffusa; Burkholderia dolosa (genomovar VI); Burkholderia latens; Burkholderia mallei; Burkholderia metallica; Burkholderia multivorans (genomovar II); Burkholderia pseudomallei; Burkholderia pyrrocinia (genomovar IX); Burkholderia seminalis; Burkholderia stabilis (genomovar IV); Burkholderia ubonensis (genomovar X); Burkholderia vietnamiensis (genomovar V); Cupriavidus pauculus; Cupriavidus gilardii; Ralstonia pickettii; Ralstonia mannitolilytica; Sphaerotilus hippei; Sphaerotilus montanus; Sphaerotilus natans. -- Campylobacteraceae:- Arcobacter spp incluindo Arcobacter skirrowii; Campylobacter coli; Campylobacter concisus; Campylobacter curvus; Campylobacter fetus; Campylobacter gracilis; Campylobacter helveticus; Campylobacter hominis; Campylobacter hyointestinalis; Campylobacter insulaenigrae; Campylobacter jejuni; Campylobacter lanienae; Campylobacter lari; Campylobacter laridis; Campylobacter mucosalis; Campylobacter rectus; Campylobacter showae; Campylobacter sputorum; Campylobacter upsaliensis. -- Candidatus:- Piscichlamydia salmonis. -- Cardiobacteriaceae:- Cardiobacterium hominis; Cardiobacterium valvarum; Dichelobacter nodosus. -- Chlamydiaceae:-Chlamydia spp incluindo Chlamydia avium, Chlamydia gallinacea, Chlamydia muridarum, Chlamydia suis, Chlamydia trachomatis; Chlamydophila spp incluindo Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae, e Chlamydophila felis. -- Chthonomonadaceae:- Chthonomonas calidirosea. -- Comamonadaceae:- Comamonas testosteroni; Verminephrobacter spp. -- Coxiellaceae:- Coxiella burnetii. -- Cytophagaceae:- Cytophaga columnaris; Cytophaga hutchinsonii; Flexibacter echinicida; Flexibacter elegans; Flexibacter flexilis; Flexibacter litoralis; Flexibacter polymorphus; Flexibacter roseolus; Flexibacter ruber. --Desulfovibrionaceae:- Bilophila wadsworthia; Lawsonia intracellularis. -Enterobacteriaceae:- Cedecea davisae; Cedecea lapagei; Cedecea neteri; amalonaticus; Citrobacter diversus; Citrobacter freundii; Citrobacter koseri; Cronobacter condimenti; Cronobacter dublinensis; Cronobacter helveticus; Cronobacter malonaticus; Cronobacter muytjensii; Cronobacter pulveris; Cronobacter sakazakii; Cronobacter turicensis; Cronobacter universalis; Cronobacter zurichensis; Edwardsiella ictaluri; Edwardsiella tarda; Enterobacter aerogenes; Enterobacter agglomerans; Enterobacter cloacae; Enterobacter cowanii; Escherichia albertii; Escherichia coli, incluindo AIEC = aderente invasivo E. coli, EaggEC = enteroaggregative E. coli; EHEC = enterohemorrhagic E. coli; EIEC = enteroinvasivo E. coli; EPEC = enteropatogênico E. coli; ETEC = enterotoxigênico E. coli; ExPEC = extraintestinal patogênico E. coli, NMEC = neonatal meningite E. coli, NTEC = necrotoxigênico E. coli, UPEC = uropatogênico E. coli.; Escherichia fergusonii; Ewingella americana; Hafnia alvei; Hafnia paralvei; Klebsiella granulomatis; Klebsiella oxytoca; Klebsiella pneumoniae; Kluyvera ascorbata; Kluyvera cryocrescens; Morganella morganii; Pantoea (antigamente Enterobacter) agglomerans; Photorhabdus asymbiotica; Plesiomonas shigelloides; Proteus mirabilis; Proteus penneri; Proteus vulgaris; Providencia alcalifaciens; Providencia rettgeri; Providencia stuartii; Raoultella electrica; Raoultella ornithinolytica; Raoultella planticola; Raoultella terrigena; Salmonella bongori, Salmonella enterica subespécies enterica (muitos sorotipos); Serratia liquifaciens; Serratia marcesans; Shigella boydii; Shigella dysenteriae; Shigella flexneri; Shigella sonnei; Yersinia enterocolitica; Yersinia pestis; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia ruckeri. -- Fimbriimonadaceae:- Fimbriimonas ginsengisoli. --Flavobacteriaceae:- Bergeyella zoohelcum; Capnocytophaga canimorsus; Capnocytophaga cynodegmi; Capnocytophaga gingivalis; Capnocytophaga granulosa; Capnocytophaga haemolytica; Capnocytophaga leadbetteri; Capnocytophaga ochracea; Capnocytophaga sputigena; Chryseobacterium indologenes; Chryseobacterium piscicola; Elizabethkingia meningoseptica; Flavobacterium branchiophilum; Flavobacterium columnare; Flavobacterium oncorhynchi; Flavobacterium piscicida; Flavobacterium psychrophilum; Myroides odoratus; Myroides odoratimimus; Ornithobacterium rhinotracheale; Riemerella anatipestifer; Riemerella columbina; Riemerella columbipharyngis; Tenacibaculum dicentrarchi; Tenacibaculum discolour; Tenacibaculum gallaicum; Tenacibaculum maritimum; Tenacibaculum soleae; Weeksella virosa. -- Francisellaceae:- Francisella tularensis subsp. tularensis; Francisella tularensis subsp. holarctica; Francisella tularensis subsp. novicida; Francisella philomiragia; Francisella noatunensis; Francisella noatunensis subsp. orientalis (também denominado de Francisella asiatica). -- Fusobacteriaceae:- Fusobacterium spp. incluindo Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum, Fuso-bacterium polymorphum. -- Helicobacteraceae:- Helicobacter cinaedi; Helicobacter fennelliae; Helicobacter pylori. -- Legionellaceae:- Legionella pneumophila e outras espécies incluindo; Legionella anisa; Legionella birminghamensis; Legionella bozemannii; Legionella cincinnatiensis; Legionella dumoffii; Legionella feeleii; Legionella gormanii; Legionella hackeliae; Legionella jordanis; Legionella lansingensis; Legionella longbeachae; Legionella maceachernii; Legionella micdadei; Legionella oakridgensis; Legionella parisiensis; Legionella sainthelens; Legionella tusconensis; Legionella wadsworthii; Legionella waltersii. -- Leptospiraceae:- Leptospira alexanderi (incluindo Leptospira alexanderi serovar Hebdomadis, Leptospira alexanderi serovar Manhao 3); Leptospira alstoni (incluindo Leptospira alstoni serovar Pingchang, Leptospira alstoni serovar Sichuan); Leptospira biflexa (incluindo Leptospira biflexa serovar Ancona, Leptospira biflexa serovar Canela); Leptospira borgpetersenii (incluindo Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo, Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii serovar Pomona, Leptospira borgpetersenii serovar Tarassovi); Leptospira broomii (incluindo Leptospira broomii serovar Hurstbridge); Leptospira fainei (incluindo Leptospira fainei serovar Hurstbridge); Leptospira idonii; Leptospira inadai (incluindo Leptospira inadai serovar Lyme, Leptospira inadai serovar Malaya); Leptospira interrogans (incluindo Leptospira interrogans serovar Australis, Leptospira interrogans serovar Autumnalis, Leptospira interrogans serovar Bratislava, Leptospira interrogans serovar Canicola, Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa, Leptospira interrogans serovar Hardjo, Leptospira interrogans serovar Hardjo-bovis, Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans serovar Pomona, Leptospira interrogans serovar Pyrogenes, Leptospira interrogans serovar Tarassovi); Leptospira kirschneri (incluindo Leptospira kirschneri serovar Bulgarica, Leptospira kirschneri serovar Cynopteri, Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa); Leptospira kmetyi; Leptospira licerasiae; Leptospira meyeri (incluindo Leptospira meyeri serovar Sofia); Leptospira noguchii (incluindo Leptospira noguchii serovar Panama, Leptospira noguchii serovar Pomona); Leptospira santarosai; Leptospira terpstrae; Leptospira vanthielii; Leptospira weilii (incluindo Leptospira weilii serovar Celledoni, Leptospira weilii serovar Sarmin); Leptospira wolbachii; Leptospira wolffii; Leptospira yanagawae. --Leptotrichiaceae:- Leptotrichia buccalis; Streptobacillus moniliformis. --Methylobacteriaceae:- Grupo de Methylobacterium extorquens; Methylobacterium fujisawaense; Methylobacterium mesophilicum; Methylobacterium zatmanii. -- Moraxellaceae:- Acinetobacter baumannii (genomic species 2); Acinetobacter baylyi; Acinetobacter bouvetii; Acinetobacter calcoaceticus (espécies genômicas 1); Acinetobacter gerneri; Acinetobacter grimontii; Acinetobacter haemolyticus (espécies genômicas 4); Acinetobacter johnsonii (espécies genômicas 7); Acinetobacter junii (espécies genômicas 5); Acinetobacter lwoffi (espécies genômicas 8/9); Acinetobacter parvus; Acinetobacter radioresistens (espécies genômicas 12); Acinetobacter schindleri; Acinetobacter tandoii; Acinetobacter tjernbergiae; Acinetobacter towneri; Acinetobacter ursingii; Acinetobacter venetianus; Moraxella atlantae; Moraxella boevrei; Moraxella bovis; Moraxella bovoculi; Moraxella canis; Moraxella caprae; Moraxella catarrhalis; Moraxella caviae; Moraxella cuniculi; Moraxella equi; Moraxella lacunata; Moraxella lincolnii; Moraxella macacae; Moraxella nonliquefaciens; Moraxella oblonga; Moraxella osloensis; Moraxella ovis; Moraxella phenylpyruvica; Moraxella pluranimalium; Moraxella porci. --Moritellaceae:- Moritella abyssi; Moritella dasanensis; Moritella japonica; Moritella marina; Moritella pro-funda; Moritella viscosa; Moritella yayanosii. -- Neisseriaceae:- Chromobacterium violaceum; Eikenella corrodens; Kingella denitrificans, Kingella kingae, Kingella oralis, Kingella potus; Neisseria cinerea; Neisseria elongata; Neisseria flavescens; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria lactamica; Neisseria meningitidis; Neisseria mucosa; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria subflava; Neisseria weaver; Vitreoscilla spp. -- Nitrosomonadaceae:- Nitrosomonas eutropha; Nitrosomonas halophila; Nitrosomonas oligotropha. --Pasteurellaceae:- Actinobacillus actinomycetemcomitans; Actinobacillus equuli; Actinobacillus lignieresii; Actinobacillus pleuropneumoniae; Actinobacillus seminis; Actinobacillus succinogenes; Actinobacillus ureae; Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aggregatibacter segnis, Aggregatibacter aphrophilus; Avibacterium avium; Avibacterium endocarditidis; Avibacterium gallinarum; Avibacterium paragallinarum; Avibacterium volantium; Bibersteinia trehalose; Gallibacterium anatis; Gallibacterium genomospecies 1; Gallibacterium genomospecies 2; Gallibacterium genomospecies 3; Gallibacterium group V; Gallibacterium melopsittaci; Gallibacterium salpingitidis; Gallibacterium trehalosifermentans; Haemophilus aegyptius; Haemophilus avium; Haemophilus ducreyi; Haemophilus haemolyticus; Haemophilus influenzae; Haemophilus parahaemolyticus; Haemophilus parainfluenzae; Haemophilus parasuis; Histophilus somni; Mannheimia caviae; Mannheimia glucosida; Mannheimia granulomatis; Mannheimia haemolytica; Mannheimia ruminalis; Mannheimia varigena; Nicoletella semolina; Pasteurella aerogenes; Pasteurella bettyae; Pasteurella caballi; Pasteurella canis; Pasteurella dagmatis; Pasteurella multocida (subspecies multocida, septicum, gallicida); Pasteurella pneumotropica; Pasteurella stomatis; Pasteurella trehalosi. --Piscirickettsiaceae:- Piscirickettsia salmonis. -- Plesiomonadaceae:-Plesiomonas shigelloides. -- Polyangiaceae:- Sorangium cellulosum. --Porphyromonadaceae:- Dysgonomonas capnocytophagoides; Dysgonomonas gadei; Dysgonomonas hofstadii; Dysgonomonas mossii; Dysgonomonas oryzarvi; Dysgonomonas wimpennyi; Porphyromonas gingivalis. -- Prevotellaceae:- Prevotella spp.incluindo Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica. -- Pseudomonadaceae:- Chryseomonas luteola; Pseudomonas aeruginosa; Pseudomonas luteola; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas putida; Pseudomonas stutzeri; Pseudomonas oryzihabitans. -- Rhizobiaceae:- Agrobacterium tumefaciens; Rhizobium radiobacter. -- Rickettsiaceae:- Orientia chuto; Orientia tsutsugamushi; Rickettsia aeschlimannii; Rickettsia africae; Rickettsia akari; Rickettsia argasii; Rickettsia asiatica; Rickettsia australis; Rickettsia bellii; Rickettsia canadensis; Rickettsia conorii; Rickettsia cooleyi; Rickettsia felis; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia helvetica; Rickettsia honei; Rickettsia hoogstraalii; Rickettsia hulinensis; Rickettsia hulinii; Rickettsia japonica; Rickettsia marmionii; Rickettsia martinet; Rickettsia massiliae; Rickettsia monacensis; Rickettsia montanensis; Rickettsia monteiroi; Rickettsia moreli; Rickettsia parkeri; Rickettsia peacockii; Rickettsia philipii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia raoultii; Rickettsia rhipicephali; Rickettsia rickettsii; Rickettsia sibirica subgroup; Rickettsia slovaca; Rickettsia tamurae; Rickettsia typhi. -- Shewanellaceae:- Shewanella putrefaciens. --Sphingomonadaceae:- Sphingobacterium multivorum; Sphingobacterium spiritivorum; Sphingomonas paucimobilis. -- Spirillaceae:- Spirillum minus; Spirillum volutans; Spirillum winogradskyi. -- Spirochaetaceae:- Borrelia afzelii; Borrelia anserina; Borrelia bissettii; Borrelia burgdorferi; Borrelia coriaceae; Borrelia duttonii; Borrelia garinii; Borrelia hermsii; Borrelia hispanica; Borrelia japonica; Borrelia lonestari; Borrelia lusitaniae; Borrelia miyamotoi; Borrelia parkeri; Borrelia persica; Borrelia recurrentis; Borrelia spielmanii; Borrelia turicatae; Borrelia turicatae; Borrelia valaisiana; Treponema carateum; Treponema pallidum ssp. endemicum; Treponema pallidum ssp. pallidum; Treponema pallidum ssp. pertenue. --Succinivibrionaceae:- Anaerobiospirillum spp. -- Sutterellaceae:- Sutterella spp incluindo Sutterella wadsworthia. -- Thermaceae:- Meiothermus spp. --Thermotogaceae:- Thermotoga neapolitana. -- Veillonellaceae:- Dialister spp; Megamonas spp; Megasphaera spp; Pectinatus spp; Pelosinus spp; Propionispora spp; Sporomusa spp; Veillonella spp.; Zymophilus spp. --Vibrionaceae:- Photobacterium damselae; Vibrio adaptatus; Vibrio alginolyticus; Vibrio azasii; Vibrio campbellii; Vibrio cholera; Vibrio damsel; Vibrio fluvialis; Vibrio furnisii; Vibrio hollisae; Vibrio metchnikovii; Vibrio mimicus; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnificus. -- Wolbachieae:-Wolbachia spp. -- Xanthomonadaceae:- Luteimonas aestuarii; Luteimonas aquatica; Luteimonas composti; Luteimonas lutimaris; Luteimonas marina; Luteimonas mephitis; Luteimonas vadosa; Pseudoxanthomonas broegbernensis; Pseudoxanthomonas japonensis; Stenotrophomonas maltophilia; Stenotrophomonas nitritireducens.
[00135] Mais preferencialmente, o agente bacteriano causador da infecção bacteriana é gram-negativo e é selecionado a partir do grupo que compreende: Acinetobacter espécie, Aeromonas hydrophila, Citrobacter espécie, Enterobacter espécie, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, eStenotrophomonas maltophilia.
[00136] Numa outra modalidade preferida, o agente bacteriano causador da infecção ou colonização bacteriana é resistente a um antibiótico convencional utilizado para tratar a colonização ou infecção. Numa modalidade preferida, o agente bacteriano é resistente a um composto selecionado a partir do grupo que compreende: um ou mais dos aminoglicósidos (por exemplo, gentamicina, tobramicina, amicacina, netilmicina ou); cefalosporinas anti-MRSA (por exemplo ceftarolina); penicilinas antipseudomonas inibidores de +β-lactamase (por exemplo ácido ticarcilina-clavulânico ou piperacilina-tazobactam); carbapenemos (por exemplo ertapenem, imipenem, meropenem ou doripenem); cefalosporinas de espectro não-estendido; e cefalosporinas de 1a e 2a geração (por exemplo cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo cefotaxima ou ceftriaxona); cefamicinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetano); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina); inibidores da via defolato (por exemplo trimetoprim-sulfametoxazol); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); monobactamas (por exemplo aztreonam); penicilinas (por exemplo ampicilina); penicilinas inibidores de +β-lactamase (por exemplo ácido amoxicilina-clavulânico ou ampicilina-sulbactam); fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); polimixinas (por exemplo colistina); e tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). De preferência, o agente bacteriano resistente a estes compostos é gram negativo.
[00137] De preferência, o agente bacteriano é resistente a um composto selecionado a partir do grupo que compreende: penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, monobactamas e outros antibióticos β-lactâmicos, fusidanas, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, estreptograminas, tetraciclinas, glicilciclinas, cloranfenicóis e outros fenicóis, macrolídeos e quetólidos, lincosamidas, oxazolidinonas, aminociclitóis, polimixinas, glicopeptídeos, lipopeptídeos, bacitracina, mupiricina, pleuromutilinas, rifamicinas, sulfonamidas e trimetoprim. Preferivelmente, o composto é selecionado a partir do grupo que compreende: beta lactamas, glicopéptidos, lipopéptidos, macrolidos, tetraciclinas e oxazolidinonas. De preferência, o agente bacteriano é resistente ao composto quando o composto é numa gama de concentrações selecionadas a partir do seguinte: 0,001 μg/mL - 10.000 μg/mL; 0,01 μg/mL - 1000 μg/mL; 0,10 μg/mL - 100 μg/mL; e 1 μg/mL - 50 μg/mL.
[00138] Numa outra modalidade preferida, o agente causador da infecção bacteriana bacteriana é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, bactérias gram positivas. O microorganismo é preferivelmente um agente bacteriano gram-positivo selecionado a partir do grupo que compreende Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, e Clostridium difficile.
[00139] Numa modalidade preferida, oagente bacteriano não tem parede celular. De preferência, o agente bacteriano é selecionado a partir do grupo que compreende: Mycoplasma spp, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma amphoriforme, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovigenitalum, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma buccale, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum, Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mycoplasma conjunctivae, Mycoplasma cynos, Mycoplasma dispar, Mycoplasma equigenitalium, Mycoplasma faucium, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans (incognitus str.), Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma gateae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemosuis (antigamente Eperythrozoon suis), Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowae meleagridis (MM), Mycoplasma iowae, Mycoplasma leachii, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma mycoides subsp capri, Mycoplasma mycoides subsp mycoides, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (tal como Peripneumonia contagiosa dos bovinos CBPP), Mycoplasma orale, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma ovis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma putrefaciens, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Mycoplasma suis, Mycoplasma synoviae (MS), Mycoplasma wenyonii, Mycoplasma, Ureaplasma spp, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma, eUreoplasma diversum.
[00140] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Staphylococcus aureus.
[00141] Numa outra modalidade preferida, o agente bacteriano é resistente a um composto selecionado a partir do grupo que compreende: um ou mais aminoglicosídeos (por exemplo gentamicina); ansamicinas (por exemplo a rifampicina); cefalosporinas anti-MRSA (por exemplo ceftarolina); anti-estafilococos β-lactamas (ou cefamicinas) (por exemplo oxacilina ou cefoxitina); carbapenemos (por exemplo ertapenem, imipenem, meropenem ou doripenem); cefalosporinas de espectro não-estendido; cefalosporinas de 1a e 2a geração (por exemplo cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo cefotaxima ou ceftriaxona); cefamicinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetano); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina ou moxifloxacina); inibidores da via de folato (por exemplo trimetoprim-sulfametoxazol); fucidanos (por exemplo, ácido fusídico); glicopéptidos (por exemplo, vancomicina, teicoplanina ou telavancina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lincosamidas (por exemplo clindamicina); lipopeptídeos (por exemplo daptomicina); macrolídeos (por exemplo, eritromicina); oxazolidinonas, (por exemplo linezolida ou tedizolida); fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); estreptograminas (por exemplo quinupristina-dalfopristina); e tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). De preferência, o agente bacteriano resistente a estes compostos é gram positivo.
[00142] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae pode ser uma cepa que é resistente a um ou mais de β-lactamas e macrolídeos.
[00143] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus pyogenes.
[00144] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Streptococcus agalactiae.
[00145] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é ouEnterococcus faecium ou Enterococcus faecalis. Enterococcus faecium ou Enterococcus faecalis pode ser uma cepa que é resistente a aminoglicósidos (por exemplo, gentamicina (nível elevado) ou estreptomicina (por exemplo, estreptomicina (nível elevado)); carbapenemos (por exemplo, imipenema, meropenema ou doripenema); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina, levofloxacina ou moxifloxacina); glicopéptidos (por exemplo vancomicina ou teicoplanina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lipopeptídeos (por exemplo daptomicina); oxazolidinonas (por exemplo linezolida); penicilinas (por exemplo ampicilina); estreptograminas (por exemplo quinupristina-dalfopristina); tetraciclina (por exemplo doxiciclina ou minociclina).
[00146] Numa outra modalidade mais preferida, o agente bacteriano é Clostridium difficile.
[00147] A infecção bacteriana no indivíduo pode causar uma doença selecionada a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, pneumonia nosocomial causada por Staphylococcus aureus (MDR, XDR, PDR ou cepas sensíveis ou resistentes à meticilina), ou doenças pneumocócicas invasivas, tais como pneumonia, bronquite, sinusite aguda, otite média, conjuntivite, meningite, bacteremia, sepse, osteomielite, artrite séptica, endocardite, peritonite, pericardite, celulite e abscesso cerebral causada por Streptococcus pneumoniae (incluindo cepas resistentes a múltiplas drogas [MDRSP] como aqueles resistentes à β-lactamas e macrolídeos) , infecções complicadas na pele e estrutura da pele, incluindo infecções do pé diabético, com ou sem osteomielite concomitante, causadas por Staphylococcus aureus (cepas sensíveis e resistentes à meticilina), Streptococcus pyogenes, ou Streptococcus agalactiae, e infecções cutâneas da estrutura da pele causadas por Staphylococcus aureus (cepas sensíveis e resistentes à meticilina) ou pneumonia adquirida na comunidade de Streptococcus pyogenes, causada pelo Streptococcus pneumoniae (incluindo cepas resistentes a múltiplas drogas [MDRSP], incluindo casos com bacteremia simultânea , ou Staphylococcus aureus (cepas sensíveis e resistentes à meticilina) e Staphylococcus aureus infecções de corrente sanguínea (bacteremia), incluindo aqueles com endocardite infecciosa do lado direito, causada pelos isolados suscetíveis à meticilina e resistentes à meticilina, infecções enterococas resistentes à vancomicina, incluindo casos com bacteriemia concomitante e tratamento de Clostridium difficileassociada à diarreia (CDAD).
[00148] Organismos gram negativos são as causas importantes de muitas doenças infecciosas em seres humanos e outras espécies de animais. Infecções ósseas e articulares (Os organismos Gram-negativos ou bactérias mistas, são uma causa importante de osteomielite vertebral e artrite séptica), infecções do sistema cardiovascular (incluindo endocardite causada pelo grupo HACEK - Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae), infecções do sistema nervoso central (as causas mais comuns da meningite bacteriana são Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e, em crianças de tenra idade não vacinadas, Haemophilus influenzae tipo b (Hib), em recém-nascidos e crianças com menos de 3 meses de idade, Streptococcus agalactiae (grupo B streptococcus), Escherichia coli e outros bastões gram-negativos aeróbicos são importantes patógenos, abscesso cerebral ou empiema subdural, o(s) organismo(s) infectante(s) varia(m) com a causa subjacente de predisposição mas onde o local provável de origem é o ouvido, bacilos entéricos Gram-negativos são comumente envolvidos),infecções oculares (patógenos comuns incluem Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae ou Chlamydia trachomatis), infecções do trato gastrointestinal (uma vasta gama de agentes patogênicos estão implicados, incluindo Escherichia coli (ETEC) enterotoxigênica, Salmonella, Campylobacter, Shigella, Vibrio cholera eYersinia enterocolitica), infecções genitais (vaginose bacteriana é uma síndrome clínica polimicrobiana com altas concentrações de bactérias anaeróbicas (por exemplo espécies deMobiluncus ) e outras bactérias exigentes (incluindoGardnerella vaginalis e Atopobium vaginae), eMycoplasma hominis; doença inflamatória pélvica não-adquirida sexualmente (PID) é geralmente causada por flora vaginal misto, incluindo anaeróbios, bactérias Gram-negativas facultativas e Mycoplasma hominis, enquanto PID sexualmente adquirida é geralmente iniciada por C. trachomatis ou N. gonorrhoeae com crescente evidência de que a infecção de M. genitaliumestá envolvido em uma minoria significativa de casos), infecções intra-abdominais (peritonite devido a víscera perfurada geralmente é uma infecção polimicrobiana com aeróbias e anaeróbias da flora intestinal enquanto peritonite bacteriana espontânea (SBP) é geralmente causada por entérico bacilos Gram-negativos, tais como espécies de Escherichia coli eKlebsiella , Klebsiella pneumoniae é uma causa cada vez mais identificada de abscesso hepático), pneumonia adquirida na comunidade (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) psittaci, Haemophilus influenza, bacilos Gram-negativos aeróbicos incluindo Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Burkholderia pseudomallei), otitis externa (incluindo aguda difusa) (culturas de bactérias comumente rendem espécies dePseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, eProteus eKlebsiella ), otitis media (incluindo aguda) (agentes patogênicos bacterianos comuns incluem Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae eMoraxella catarrhalis), sepsia (incluindo grave) (incluindoAcinetobacter baumannii, sepsia gonocócica disseminada, Bactérias gram-negativas entéricas, Neisseria meningitidis (sepsia meningocócica) ePseudomonas aeruginosa), infecções sistêmicas (febres manchadas (Rickettsia) e tifo rural (Orientia), brucelose, Doença da arranhadura do gato e outras infecções de Bartonella , leptospirose, doença de Lyme, melioidose, febre Q, Febre tifóide e paratifóide (febres entéricas), infecções do trato urinário (cistite aguda, pielonefrite aguda, infecções recorrentes do trato urinário e bacteriúria associada à ateter e infecções do trato urinário).
[00149] Nos seres humanos, bactérias gram negativas são causas comuns de infecções intra-abdominais (IAIS), infecções do trato urinário (UTIs), pneumonia adquirida no hospital, e bacteremia. Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) são importantes patógenos no ambiente hospitalar, sendo responsável por 27% de todos os patógenos e 70% de todos os agentes patogênicos Gram-negativos causadores de infecções associadas aos cuidados de saúde [Sievert DM, Ricks P, Edwards Jr, et al. Patógenos resistentes aos antimicrobianos associados a infecções associadas aos cuidados de saúde: resumo dos dados notificados à Rede Nacional de Segurança de Saúde nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças, 2009-2010. Infect Control Hosp Epidemiol. 2013;34:1-14.].
[00150] Bactérias gram-negativas estão mostrando as crescentes taxas de resistência a terapias atuais. A produção de enzimas de β- lactamase de espectro estendido (ESBL) é um mecanismo comum da resistência. As taxas de E. coli e K. pneumoniae produtoras de ESBL aumentaram substancialmente, com o resultado de que estas bactérias são cada vez mais resistentes a agentes antimicrobianos amplamente utilizados.
[00151] P. aeruginosa é a causa Gram-negativa mais comum de pneumonia nosocomial e a segunda causa mais comum de infecções do trato urinário (UTIs) relacionadas ao cateter nos EUA.
[00152] E. coli é a causa mais comum de infecções do trato urinário. Casos de UTIs causadas por cada vez mais E. coli e K. pneumoniae bem como P. aeruginosa, inclusive cepas de MDR, estão aumentando. E. coli eK. pneumoniae produtoras de ESBL são também frequentemente isoladas em pacientes com IAI complicada (cIAI).
[00153] P. aeruginosa é um agente patogênico clinicamente desafiador e virulento que pode ser uma causa de infecções comuns em seres humanos, como a pneumonia nosocomial, UTI, IAI, e infecções da corrente sanguínea. P. aeruginosa é o organismo Gram-negativo mais comum causando pneumonia associada à ventilação e a segunda causa mais comum de infecções do trato urinário (UTIs) associadas a cateter.
[00154] O aumento do número de infecções causadas por bactérias Gram-negativas é acompanhado por aumento das taxas de resistência. As opções de tratamento para enfrentar este desafio são cada vez mais limitadas. Existe uma necessidade crucial para novos antibióticos para atender as necessidades dos pacientes, agora e no futuro.
[00155] Num aspecto preferido, mais do que um composto da invenção é administrado ao indivíduo.
[00156] Numa outra modalidade preferida, um composto da invenção, ou um sal terapeuticamente aceitável disso, é administrado conjuntamente com um composto ou agente que remove ou elimina ou reduz substancialmente a integridade da parede celular bacteriana do agente. Como um exemplo, o composto é selecionado a partir do grupo consistindo em: β lactamas, fosfomicina, lisozima, polimixinas e agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA). Como exemplo, o agente é um agente imunológico (tal como um anticorpo ou vacina) que reduz a integridade da parede celular. Numa modalidade preferida, o composto, ou um sal terapeuticamente aceitável disso, é administrado conjuntamente com um composto que elimina ou remove substancialmente ou enfraquece a integridade da parede celular externa de um agente bacteriano gram negativo.
[00157] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica antibacteriana que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula I, ou um sal terapeuticamente aceitável disso. De preferência, a composição é uma composição farmacêutica anti-bacteriana.
[00158] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma composição veterinária antibacteriana que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula I, ou um sal terapeuticamente aceitável disso. De preferência, a composição é uma composição veterinária anti-bacteriana.
[00159] A composição farmacêutica pode incluir, opcionalmente, um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. A composição veterinária pode incluir, opcionalmente, um excipiente ou veículo veterinariamente aceitável.
[00160] A composição farmacêutica ou veterinária, da presente invenção contém de preferência um composto da Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, a uma concentração selecionada a partir do grupo que consiste em: 1 mg/g a 500 mg/g; De 5 mg a 400 mg/g; 10 mg/g a 200 mg/g; 20 mg/g a 100 mg/g; 30 mg/g a 70 mg/g; e 40 mg/g a 60 mg/g.
[00161] Em outra modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária compreende impurezas, em que a quantidade de impurezas, tal como uma percentagem do peso total da composição é selecionada a partir do grupo constituído por: menos de 20% de impurezas (por peso total da composição); menos de 15% de impurezas; menos de 10% de impurezas; menos de 8% de impurezas; menos de 5% de impurezas; menos de 4% de impurezas; menos de 3% de impurezas; menos de 2% de impurezas; menos de 1% de impurezas: menos de 0,5% de impurezas; menos de 0,1% de impurezas. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária compreende impurezas microbianas ou metabolitos secundários, em que a quantidade de impurezas microbianas como uma percentagem do peso total da composição é selecionada a partir do grupo que consiste em: menos de 5%; menos de 4%; menos de 3%; menos de 2%; menos de 1%; menos de 0,5%; menos de 0,1%; menos de 0,01%; menos de 0,001%. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária é estéril e armazenada em um recipiente selado e esterilizado. Numa modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária contém nenhum nível detectável de contaminação microbiana.
[00162] A composição farmacêutica ou veterinária da presente invenção pode compreender ainda um agente antimicrobiano. O outro agente antimicrobiano pode ser um agente antifúngico ou um agente antibacteriano. O método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana ou colonização num indivíduo, pode também compreender a administração de um composto da invenção com um outro agente antimicrobiano.
[00163] A composição farmacêutica ou veterinária da presente invenção pode compreender mais do que um composto da invenção. Por exemplo, uma combinação de compostos. O método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana ou colonização num indivíduo, pode também compreender a administração de mais do que um composto da invenção.
[00164] Numa modalidade, o agente antifúngico é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, agentes que ocorrem naturalmente, incluindo Equinocandinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina), Polienos (Anfotericina B, Candicidina, Filipina, Fungicromina (Pentamicina), Haquimicina, Hamicina, Lucensomicina, Mepartricina, Natamicina, Nistatina, Pecilocina, Perimicina), e outros agentes antifúngicos que ocorrem naturalmente incluindo Griseofulvina, Oligomicinas, Pirrolnitrina, Sicanina, e Viridina. O agente antifúngico pode ser um composto sintético selecionado entre o grupo que compreende, mas não se limitando a, Alilaminas (butenafina, naftifina, terbinafina) Imidazóis (bifonazol, butoconazol, Clormidazol, Climbazol, Croconazol (Cloconazol), clotrimazol, Eberconazol, Econazol, enilconazol, fenticonazol, Flutrimazol, Fosfluconazol, isoconazol, cetoconazol, lanoconazol, Luliconazol, Miconazol, Neticonazol, Omoconazol, Oxiconazol Nitrato, Parconazol, sertaconazol, sulconazol, Tioconazol), Tiocarbamatos (Liranaftato, tolciclato, Tolindato, Tolnaftato), Triazóiss (fluconazol, Isavuconazol, itraconazol, Posaconazol, ravuconazol, saperconazol, terconazol, Voriconazol), e outros agentes sintéticos, tais como Acrisorcina, Amorolfina, Bromosalicilchloranilida (Bromoclorosalicilanilida), Buclosamida, Cálcio Propionato, Clorfenesina, Ciclopirox, Cloxiquin (Cloxiquina), Coparafinado, Exalamida, Flucitosina, haloprogina, Hexetidina, Loflucarbano, Nifuratel, Nifuroxima, Piroctona, iodeto de potássio, ácido propiônico, Piritiona, salicilanilida, Paraclorobenzoato de sódio, propionato de sódio, sulbentina, Tenonitrozol, triacetina, Trimetrexato, ácido undecilénico (ácido undecenóico), e propionato de zinco.
[00165] A composição da invenção pode compreender um adjuvante de antibiótico selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, Inibidores de β-lactamase (Avibactam, Clavulanato, Sulbactam, Sultamicilina, Tazobactam), Inibidores de Dipeptidase Renal (Cilastatina), e Protetor Renal (Betamipron).
[00166] Numa modalidade, a composição da invenção compreende um antibiótico adicional selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, 2,4-DIAMINOPIRIMIDINAS, incluindo Baquiloprima, Brodimoprima, Iclaprima, Ormetoprima, Pirimetamina, Tetroxoprima, Trimetoprima; AMINOCUMARINAS, incluindo Novobiocina; AMINOCICLITÓIS, incluindo Espectinomicina,; AMINOGLICOSÍDEOS, incluindo Amicacina, Apramicina, Arbecacina, Becanamicina, Butirosina, Dibecacina, Dihidrostreptomicina, Etimicina, Fortimicinas (Astromicina), Framicetina, Gentamicina, Higromicina B, Isepamicina, Canamicina, Micronomicina, Neomicina, Netilmicina, Paromomicina, Plazomicina, Ribostamicina, Sisomicina, Estreptomicina, Tobramicina, Verdamicina; AMINOMETILCICLINAS, incluindo Omadaciclina; AMFENICÓIS, incluindo Azidamfenicol, Cloramfenicol, Florfenicol, Tiamfenicol; ANSAMICINAS, incluindo Rifabutina, Rifamida, Rifampina (Rifampicina), Rifamicina, Rifapentina, Rifaximina; AGENTES ANTI-SÉPTICOS, incluindo derivados de Acridina (incluindo acriflavina, aminoacridina, etacridina, proflavina), Bispiridinas (incluindo octenidina dihidrocloreto), Salicilanilidas bromadas (incluindo bromsalanos), Clorexidina, derivados de Fenol (incluindo timol e triclosano), Compostos de amônio quaternário (incluindo Cloreto de Amônio de Alquildimetiletilbenzil, cloreto de benzalcônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzetônio, cetrimônio); AGENTES ANTITUBERCULOSOS, incluindo Cicloserina, Delamanida, Etambutol, Etionamida, Isoniazida (Fitivazida), Morinamida, Ácido p-Aminossalicílico (PAS), Protionamida, Pirazinamida, Terizidona, Tioacetazona, Tiocarlida; ARSENICAIS, including Ácido Arsanílico, Roxarsona; BACTERIOCINAS, incluindo Nisina, Brilacidina (PMX-30063); CARBACEFEMAS β-LACTÂMICOS, incluindo Loracarbefa; CARBAPENEMAS Β-LACTÂMICOS, incluindo Biapenem, Doripenem, Ertapenem, Faropenem, Imipenem, Meropenem, Panipenem, Razupenem, Ritipenem, Sulopenem, Tebipenem, Tomopenem; CEFALOSPORINAS Β-LACTÂMICAS, incluindo Cefacetrilea, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefaloglicina, Cefalônio, Cefaloridina, Cefalotina, Cefamandol, Cefapirina, Cefatrizina, Cefazaflur, Cefazedona, Cefazolina, Cefcapena, Cefdinir, Cefditorena, Cefepima, Cefetameto, Cefixima, Cefmenoxima, Cefodizima, Cefonicida, Cefoperazona, Ceforanida, Cefoselis, Cefotaxima, Cefotiam, Cefovecina, Cefozoprano, Cefpimizol, Cefpiramida, Cefpiroma, Cefpodoxima, Cefprozil, Cefquinoma, Cefradina, Cefroxadina, Cefsulodina, Ceftarolina, Ceftazidima, Cefteram, Ceftezol, Ceftibuteno, Ceftiofur, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftolozano, Ceftradina, Ceftrezol, Ceftriaxona, Ceftroxadina, Cefuroxima, Cefuzonam, Pivcefalexina; CEFAMICINAS Β-LACTÂMICAS, incluindo Cefbuperazona, Cefmetazol, Cefminox, Cefotetano, Cefoxitina; MONOBACTÂMICOS Β-LACTÂMICOS, incluindo Aztreonam, Carumonam, Tigemonam; OXACEFENS Β-LACTÂMICOS, incluindo Flomoxef, Latamoxef, Moxalactam; PENICILINAS Β-LACTÂMICAS, incluindo Amdinocilina (Mecilinam), Amoxicilina, Ampicilina, Apalcilina, Aspoxicilina, Azidocilina, Azlocilina, Bacampicilalina, Carbenicilina, Carindacilina, Ciclacilina, Penicilina de Clemizol, Clometocilina, Cloxacilina, Ciclacilina, Dicloxacilina, Epicilina, Fenbenicilina, Floxacilina (Flucloxacilina), Hetacilina, Lenampicilina, Mecilinama, Metampicilina, Sódio de Meticilina, Mezlocilina, Nafcilina, Oxacilina, Penamecilina, Iodidrato de Penetamato, Penicilina G, Penicilina G Benzatina, Procaína de Penicilina G, Penicilina N, Penicilina O, Penicilina V, Potássio de Feneticilina, Piperacilina, Pivampicilina, Pivmecilinam, Propicilina, Quinacilina, Sulbenicilina, Sultamicilina, Talampicilina, Temocilin, Ticarcilina; BICICLOMICINAS, incluindo Bicozamicina; AGENTES ANTIBACTERIANOS QUE CONTÊM BORO, incluindo AN3365 (aminometilbenzoxaboróis), GSK2251052 (inibidores de leucil-tRNA sintetase); ÉTERES CICLÍCOS, incluindo Fosfomicina; INIBIDORES DA SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS (FabI), AFN-1252, MUT056399, FAB-001; FLUOROQUINOLONAS, incluindo Avarofloxacina, Balofloxacina, Besifloxacina, Chinfloxacina, Cinoxacina, Ciprofloxacina, Clinafloxacina, Danofloxacina, Delafloxacina, Difloxacina, Enoxacina, Enrofloxacina, Finafloxacina, Fleroxacina, Flumequina, Garenoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Grepafloxacina, Ibafloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Marbofloxacina, Miloxacina, Moxifloxacina, Nadifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Orbifloxacina, Pazufloxacina, Pefloxacina, Pradofloxacina, Prulifloxacina, Rosoxacina, Rufloxacina, Sarafloxacina, Sitafloxacina, Sparfloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Trovafloxacina, Zabofloxacina; FUSIDANAS, incluindo Ácisdo Fusídico; GLICOLIPODEPSIPEPTÍDEO, incluindo Ramoplanina; GLICOPEPTÍDEOS, incluindo Avoparcina, Dalbavancina, Norvancomicina, Oritavancina, Teicoplanina, Telavancina, Vancomicina,; GLICOFOSFOLIPÍDIOS, incluindo Bambermicinas (bambermicina, moenomicinas, flavofosfolipol); GLICILCICLINAS, incluindo Tigeciclina; HÍBRIDOS, Cadazolídio (Oxazolidinona-quinolona), TD-1792 (glicopeptídeo-cefalosporina); LINCOSAMIDAS, incluindo Clindamicina, Lincomicina, Pirlimicina; LIPOPEPTÍDEOS, incluindo Daptomicina, Surotomicina; MACROLÍDEOS, incluindo Azitromicina, Carbomicina, Cetromicina, Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Fidaxomicina, Fluritromicina, Gamitromicina, Josamicina, Quitasamicina, Leucomicina, Meleumicina, Midecamicinas, Miocamicina, Mirosamicina, Oleandomicina, Primicina, Roquitamicina, Rosaramicina, Roxitromicina, Sedecamicina, Solitromicina, Espiramicina, Telitromicina, Terdecamicina, Tildipirosina, Tilmicosina, Troleandomicina, Tulatromicina, Tilosina, Tilvalosina; NITROFURANOS, incluindo Furaltadona, Furazidina, Furazolidona, Cloreto de Furazólio, Nifuratel, Nifu rfolina, Nifuroxazida, Nifurpirinol, Nifurtoinol, Nifurzida, Nitrofural, Nitrofurantoína, Nitrofurazona; NITROIMIDAZÓIS, incluindo Dimetridazol, Metronidazol, Ornidazol, Ronidazol, Secnidazol, Tinidazol; OLIGOSSACARÍDEOS, incluindo Avilamicina, Everninomicina; OUTROS AGENTES ANTIBACTERIANOS, incluindo Auriclosena, Cloroxina, Clorquinaldol, Clioquinol, Clofoctol, Halquinol, Lotilibcina, Ácido Mandélico, Metenamina (hexamina), Nitazol, Nitroxolina, Perclozona, Taurolidina, Ácido Tenóico, Xibornol; OXAZOLIDINONAS, incluindo Eperezolida, Linezolida, Posizolida, Radezolida, Sutezolida, Tedizolida (Torezolida); INIBIDORES DE DEFORMILASE DE PEPTÍDEO, incluindo GSK1322322; PEPTÍDEOS, incluindo Omiganano, Pexiganano; PLEUROMUTILINAS, incluindo Retapamulina, Tiamulina, Valnemulina; IONÓFOROS DE POLIÉTER, incluindo Laidlomicina, Lasalocida, Maduramicina, Monensina, Narasina, Salinomicina, Semduramicina; POLIMIXINAS, incluindo Colistina, Polimixina B; POLIPEPTÍDEOS, incluindo Amfomicina, Bacitracina, Capreomicina, Enduracidina, Enramicina, Enviomicina, Fusafungina, Gramicidina(s), Iseganano, Magaíninas, Nosiheptídeo, Ristocetina, Tiostreptona, Tuberactinomicina, Tirocidina, Tirotricina, Viomicina; ÁCIDOS PSEUDOMÔNICOS, incluindo Mupirocina; QUINOLONAS, incluindo Ácido Nalidíxico, Nemonoxacina, Ácido Oxolínico, Ozenoxacina, Ácido Pipemídico, Ácido Piromídico; QUINOXALINAS, incluindo Carbadox, Olaquindox; RIMINOFENAZINAS, incluindo Clofazimina; ESTATINAS, incluindo Atorvastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Mevastatina, Pitavastatina, Pravastatina, Rosuvastatina, Simvastatina; ESTREPTOGRAMINAS, incluindo Dalfopristina, Flopristina, Linopristina, Pristinamicina, Quinupristina, Virginiamicina; ESTREPTOTRICINAS, incluindo Nurseotricina; SULFONAMIDAS, incluindo Acetil Sulfametoxipirazina, Cloramina-B, Cloramina-T, Dicloramina T, Formosulfatiazol, Mafenida, N4-Sulfanililsulfanilamida, Noprilsulfamida, N-Sulfanilil-3,4-xilamida, Ormaosulfatiazol, Fitalilsulfacetamida, Fitalilsulfatiazol, Salazosulfadimidina, Sucinilsulfatiazol, Sulfabenzamida, Sulfacarbamida, Sulfacetamida, Sulfaclorpiridazina, Sulfacrisoidina, Sulfaclozina, Sulfacitina, Sulfadiazina, Sulfadicramida, Sulfadimetoxina, Sulfadimidina, Sulfadoxina, Sulfaetidol, Sulfaguanidina, Sulfaguanol, Sulfalena, Ácido Sulfalóxico, Sulfamerazina, Sulfaméter, Sulfametazina, Sulfametizol, Sulfametomidina, Sulfametoxazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfametiltiazol, Sulfametopirazina, Sulfametrol, Sulfamidocrisoidina, Sulfamonometoxina, Sulfamoxol, Sulfanilamida, Sulfanililureia, Sulfaperina, Sulfafenazol, Sulfaproxilina, Sulfapirazina, Sulfapiridina, Sulfaquinoxalina, Sulfatiazol, Sulfatioureia, Sulfatroxazol, Sulfisomidina, Sulfisoxazol (Sulfafurazol); SULFONAS, incluindo Acediasulfona, Dapsona, Sódio de Glicosulfona, p-Sulfanililbenzilamina, Sucisulfona, Ácido Sulfanílico, Sódio de Sulfoxona, Tiazolsulfona; TETRACICLINAS, incluindo Clortetraciclina, Clomociclina, Demeclociclina, Doxiciclina, Eravaciclina, Guameciclina, Limeciclina, Meclociclina, Metaciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Penimepiciclina, Pipaciclina, Rolitetraciclina, Sareciclina, Tetraciclina.
[00167] A composição da invenção pode compreender ainda um excipiente selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limitando a, aglutinantes e adjuvantes de compressão, revestimentos e filmes, diluentes de agentes corantes e veículos desintegrantes, agentes emulsionantes e agentes de solubilização, sabores e adoçantes, repelentes, agentes de deslizamento e lubrificantes, plastificantes, conservantes, propulsores, solventes, estabilizantes, agentes de suspensão e intensificadores da viscosidade.
[00168] De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionado um dispositivo médico quando utilizado em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana no indivíduo.
[00169] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um dispositivo médico que compreende a composição da invenção. A composição da invenção pode ser qualquer forma de libertação lenta, e/ou sob a forma de um revestimento do dispositivo médico.
[00170] O dispositivo médico pode estar numa forma selecionada a partir do grupo que compreende: um implante, um emplastro, um curativo, e outras preparações aplicadas a uma infecção bacteriana num indivíduo.
[00171] De acordo com outro aspecto da invenção, proporciona-se um método de matar bactérias, o método inclui a etapa de contato das bactérias com um composto da invenção, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma.
[00172] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada a utilização de um composto da invenção, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma, para matar as bactérias, o referido uso compreende a etapa de contato das bactérias com um composto da invenção, ou um sal terapeuticamente aceitável da mesma.
[00173] Os termos aqui utilizados terão os respectivos significados habituais na técnica, a menos que especificado. Tal como aqui utilizado, o termo robenidina, NCL812 (também conhecido como 1,3-bis [(E) - (4-clorofenil) metilenoamino] guanidina) refere-se a um composto possuindo a seguinte estrutura química:
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BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00174] Outras características da presente invenção são mais completamente descritas na seguinte descrição de várias modalidades não limitativas da mesma. Esta descrição está incluído apenas para efeitos de exemplificação da presente invenção. Ela não deve ser entendida como uma restrição no âmbito do resumo amplo, divulgação ou descrição da invenção tal como definido acima. A descrição será feita com referência aos desenhos anexos, nos quais:
A Figura 1 apresenta o nome químico e a estrutura química dos compostos NCL001 para NCL230;
A Figura 2 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a síntese de DNA em macromolecular Staphylococcus aureus de acordo com o exemplo 2;
A Figura 3 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de RNA em macromolecular Staphylococcus aureus de acordo com o exemplo 2;
A Figura 4 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de proteínas em macromolecular Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2;
A Figura 5 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a síntese de parede celular em macromolecular Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2;
A Figura 6 mostra um gráfico do efeito de NCL812 na síntese de lipídio em macromolecular Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2;
A Figura 7 mostra um gráfico resumindo o efeito de NCL812 sobre a síntese macromolecular em Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 2;
A Figura 8 mostra um gráfico do efeito de NCL812 sobre a libertação de ATP a partir de Staphylococcus aureus (ATCC29213) de acordo com o exemplo 3;
A Figura 9 mostra um gráfico que mostra os picos médios de ponto de fusão para a trama derivada negativa -dF/dT depois de PCR quantitativo em tempo real do gene mecA em S. aureus resistente à meticilina, isolados agrupados por mec complexos de genes, um grupo A (n = 4), B (n = 10), C2 (n = 4) e não classificada (n = 2). Grupos indicados com diferentes expoentes são significativamente diferentes (P <0,05), de acordo com o Exemplo 4;
A Figura 10 mostra um gráfico das densidades ópticas do controle de crescimento não suplementado, ampicilina e diferentes concentrações de agente antibacteriano contra NCL812 sensível à meticilina S. aureus ATCC 49775 utilizando a metodologia de microdiluição de caldo de acordo com o exemplo 4. As concentrações de NCL812 testadas foram no MIC e quatro vezes o MIC determinado sob condições de teste, até 24 h de incubação. Ampicilina foi testada em MIC. A atividade bactericida foi testada em 0, 1,2, 4, 8, 12, e 24 h para antibacterianos;
A Figura 11 mostra um gráfico de curvas cinéticas de matança sensível à meticilina S. aureus ATCC 49775 demonstrando atividade bactericida de NCL812 utilizando a metodologia de macrodiluição do Clinical and Laboratory Standards Institute em um frasco de 10 ml de acordo com o exemplo 4. As concentrações de agentes antibacterianos foram testadas em 1 χ e 4 χ do MIC determinado sob condições de ensaio. A atividade bactericida foi determinada a 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 h após a adição antibacteriana. A atividade bactericida foi definida como uma redução de 3log10 (99,9%) no número de bactérias viáveis a partir do tamanho inicial de inoculo;
A Figura 12 mostra um gráfico que indica a alteração de pH durante ensaio de diluição em caldo de macro- S. pneumoniae cepa D39 expostos a 4 μg/ml em NCL812 e 0,0023 μg/ml de ampicilina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 13 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 14 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL062 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 15 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 14 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 16 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 14 horas de S. pneumoniae epa D39 tratada com NCL062 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 17 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 14 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 18 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812, adotado a partir da Figura 43, de acordo com o exemplo 5;
A Figura 19 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL062, adotado a partir da Figura 44, de acordo com o exemplo 5;
A Figura 20 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 21 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com eritromicina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 22 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 e 5% de cloreto de colina;
A Figura 23 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 e 5% de cloreto de colina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 24 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL062 e 5% de cloreto de colina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 25 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 12 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL062 e 5% de cloreto de colina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 26 mostra um gráfico que ilustra o tempo de morte de 48 horas de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina e cloreto de colina de acordo com o exemplo 5;
A Figura 27 mostra um gráfico da relação de MBC da D39 tratada com NCL812 ou NCL062 durante 48 horas de acordo com o exemplo 5;
A Figura 28 mostra um gráfico que ilustra a concentração relativa mínima bactericida (MBC) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina durante um período de tempo de 48 h de acordo com o exemplo 5;
A Figura 29 mostra um gráfico que ilustra a relação de MBC para S. pneumoniae cepa D39 tratada com eritromicina ao longo de um período de tempo de 48 horas de acordo com o exemplo 5;
A Figura 30 mostra um gráfico que ilustra a contagem de viáveis (log10CFU/ml) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com NCL812 a partir de uma macro-diluição de caldo de tempo de matança de mais de 24 horas de acordo com o exemplo 5;
A Figura 31 mostra um gráfico que ilustra a contagem de viáveis (log10CFU/ml) de S. pneumoniae cepa D39 tratada com ampicilina a partir de uma macro-diluição de caldo de tempo de matança de mais de 24 horas de acordo com o exemplo 5;
A Figura 32 é um gráfico de barras que ilustra a espessura da membrana de célula média de tratados e não tratados D39 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 33 é um gráfico de barras que ilustra a média da largura do espaço periplasmático tratado (16 μg/ml NCL812) e as amostras não tratadas D39 de acordo com o exemplo 5;
A Figura 34 mostra a cinética da matança de MRSA 580 isolados obtidos a diferentes concentrações de NCL812 ao longo de um período de 8 horas de acordo com o exemplo 7;
A Figura 35 mostra a cinética da matança de MRSA 580 a diferentes concentrações de NCL812 ao longo de um período de 24 horas de acordo com o exemplo 7;
A Figura 36 mostra a cinética da matança de MRSA 698 a diferentes concentrações de NCL812 ao longo de um período de 24 horas de acordo com o exemplo 7;
A Figura 37 mostra a cinética da matança de VRE 26c(dc) a diferentes concentrações de NCL812 ao longo de um período de 24 horas de acordo com o exemplo 7;
A Figura 38 mostra a cinética da matança de VRE 16c(dc) a diferentes concentrações de NCL812 ao longo de um período de 24 horas de acordo com o exemplo 8;
A Figura 39 mostra o ensaio da matança cinética de Staphylococcus aureus KC01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação de acordo com o exemplo 8;
A Figura 40 mostra o ensaio de matança cinética de Enterococcus faecalis USA01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação de acordo com o exemplo 8; e
A Figura 41 é um gráfico que ilustra a libertação cumulativa de NCL812 e NCL099 da Formulação B de acordo com o exemplo 10;
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES Geral
[00175] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, é para ser entendido que a invenção não é limitada a métodos exemplificados particulares ou composições aqui divulgados. Também deve ser compreendido que a terminologia empregada neste documento é usada com a finalidade de descrever modalidades particulares da invenção apenas e não se destina a ser limitante.
[00176] Todas as publicações aqui referidas, incluindo patentes ou pedidos de patente, são incorporadas por referência na sua totalidade. No entanto, as aplicações que são aqui mencionadas são referidas simplesmente com a finalidade de descrever e revelar os procedimentos, protocolos e reagentes referidos na publicação que podem ter sidos usados em ligação com a invenção. A citação de qualquer publicação aqui referida não é para ser interpretada como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antecipar esta revelação por virtude de invenção anterior.
[00177] Além disso, a realização da presente invenção faz uso de, a menos que indicado de outro modo, técnicas microbiológicas convencionais dentro da técnica. Tais técnicas convencionais são conhecidas pela pessoa versada na técnica.
[00178] Tal como aqui usado, e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o", "a" incluem o plural a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[00179] Salvo indicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente compreendido por um indivíduo versado na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados para realizar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos.
[00180] A invenção aqui descrita pode incluir uma ou mais gamas de valores (por exemplo, tamanho, concentração, etc.) de dose. Uma gama de valores será entendida como incluindo todos os valores dentro da gama, incluindo os valores que definem a gama de valores, e adjacentes à gama que conduzam à mesma ou substancialmente o mesmo resultado que os valores imediatamente adjacentes a esse valor que definem o limite da gama.
[00181] As composições farmacêuticas ou veterinárias da invenção podem ser administradas numa variedade de dosagens unitárias dependendo do método de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, e outros medicamentos administrados. Por exemplo, a forma de dosagem unitária adequada para administração oral inclui formas sólidas de dosagem, tais como pós, comprimidos, pílulas e cápsulas, e formas de dosagem líquidas, tais como elixires, xaropes, soluções e suspensões. Os ingredientes ativos podem também ser administrados parentericamente em formas de dosagem líquidas estéreis. As cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente ativo e ingredientes inativos, tais como portadores em pó, glicose, lactose, sacarose, manitol, amido, celulose ou derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, sacarina de sódio, talco, carbonato de magnésio, e semelhantes.
[00182] A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui utilizado refere-se a uma quantidade suficiente para inibir o crescimento bacteriano associado a uma infecção bacteriana ou colonização. Isto é, a referência à administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula I de acordo com os métodos ou composições da presente invenção refere-se a um efeito terapêutico em que a atividade bactericida ou bacteriostática substancial provoca uma inibição substancial de infecção bacteriana. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade suficiente da composição para fornecer o resultado biológico, terapêutico e/ou profiláctico desejado. Os resultados desejados incluem a eliminação da infecção bacteriana ou colonização ou redução e/ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Uma quantidade eficaz, em qualquer caso individual pode ser determinada por um versado na técnica utilizando a experimentação de rotina. Em relação a uma composição farmacêutica ou veterinária, as quantidades eficazes podem ser dosagens que são recomendadas na modulação de um estado de doença ou dos seus sintomas ou sinais. As quantidades eficazes variam dependendo da composição usada e da via de administração utilizada. As quantidades eficazes são rotineiramente otimizadas em consideração das características farmacocinéticas e farmacodinâmicas, bem como vários fatores de um determinado paciente, como idade, peso, sexo, etc e da área afetada pela doença ou doença causando micróbios.
[00183] Como aqui referido, os termos "tratamento" ou "tratar" referem-se à remoção total ou parcial dos sintomas e sinais da doença. Por exemplo, no tratamento de uma infecção bacteriana ou da colonização, o tratamento remove completamente ou parcialmente os sinais da infecção. De preferência, no tratamento de infecção, o tratamento reduz ou elimina o agente patogênico bacteriano infectante levando a cura microbiana.
[00184] Como aqui referido, o termo "bactérias" refere-se a membros de um grande domínio de microrganismos procarióticos. Normalmente alguns micrômetros de comprimento, as bactérias têm um número de formas, variando de esferas de hastes e espirais e podem estar presentes como células individuais ou presente em cadeias lineares ou grupos de números e forma variáveis. De preferência, os termos "bactérias" e seu adjetivo "bacteriano" referem-se a bactérias como Staphylococcus spp, Streptocccus spp, Bacilo spp, Enterococcus spp, Listeria spp e anaeróbios bactérias Gram positivas; Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp e Pseudomonas spp Gram negativas; e as bactérias livres da parede celular, tais como Mycoplasma spp e Ureaplasma spp. Os termos podem se referir a uma cepa sensível aos antibióticos ou uma cepa resistente aos antibióticos. Numa modalidade preferida, os termos referem-se a MRSA ou MRSP. Numa outra modalidade preferida, os termos referem-se a MDR Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterococcus spp, Clostridium difficile, Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp e Pseudomonas spp.
[00185] Aqui referido, o termo "bactérias resistentes a meticilina" (tais como resistentes à meticilina Staphylococcus) refere-se ao isolado de bactéria que demonstra a resistência a qualquer dose para todos os β lactamas, incluindo penicilinas, carbapenemos e em primeiro lugar às cefalosporinas de quarta geração, mas não para as cefalosporinas de quinta geração de anti-MRSA (por exemplo ceftarolina). Multi-resistente (MDR) é definida como não susceptibilidade adquirida para pelo menos um agente em três ou mais categorias antimicrobianas, extensivamente resistentes a drogas (XDR) é definida como não-susceptibilidade a, pelo menos, um agente em todos, mas dois ou menos categorias antimicrobianas (isto é, isolados bacterianos permanecem susceptíveis a apenas uma ou duas categorias) e pandroga-resistente (PDR) é definida como não susceptibilidade a todos os agentes em todas as categorias antimicrobianas atualmente disponíveis.
[00186] Um exemplo de suscetíveis, MDR, XDR e PDR bactérias inclui o seguinte. Tipo selvagem, os isolados não expostos antibacterianas de Staphylococcus aureus que são susceptíveis de ser susceptível a todas as seguintes categorias antibacterianas (e agentes): aminoglicosidos (por exemplo, gentamicina); ansamicinas (por exemplo rifampicina); cefalosporinas anti-MRSA (por exemplo ceftarolina); anti-estafilococos B-lactamas (por exemplo oxacilina ou cefoxitina); carbapenemos (por exemplo ertapenem, imipenem, meropenem ou doripenem); cefalosporinas de espectro não-estendido; cefalosporinas de 1a e 2a geração (por exemplo cefazolina ou cefuroxima); cefalosporinas de espectro estendido; cefalosporinas de 3a e 4a geração (por exemplo cefotaxima ou ceftriaxona); cefamicinas (por exemplo cefoxitina ou cefotetano); fluoroquinolonas (por exemplo ciprofloxacina ou moxifloxacina); inibidores da via de folato (por exemplo trimetoprim-sulfametoxazol); fucidanos (por exemplo, ácido fusídico); glicopéptidos (por exemplo, vancomicina, teicoplanina ou telavancina); glicilciclinas (por exemplo tigeciclina); lincosamidas (por exemplo clindamicina); lipopéptidos (por exemplo daptomicina); macrolídeos (por exemplo, eritromicina); oxazolidinonas, (por exemplo linezolida ou tedizolida); fenicóis (por exemplo cloranfenicol); ácidos fosfônicos (por exemplo fosfomicina); estreptograminas (por exemplo quinupristina-dalfopristina); e tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina ou minociclina). Os isolados que não são susceptíveis a mais do que um agente em mais de três categorias antimicrobianas são classificadas como MDR (todos os MRSA, por exemplo, satisfazem a definição de MDR). Os isolados que não são suscetíveis a mais de um agente em todos, menos uma ou duas categorias antimicrobianas, são classificados como XDR. Os isolados que não são sensíveis a todos os agentes antibacterianos listados são de PDR.
[00187] Sais farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis incluem sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos compostos da presente invenção e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis. Em muitos casos, os compostos aqui descritos são capazes de formar sais ácidos e/ou básicos em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxilo ou grupos similares a isso. Sais de adição de base aceitáveis podem ser preparados a partir de bases orgânicas e inorgânicas. Sais derivados de bases inorgânicas incluem, a título de exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, amônia, cálcio e magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não estão limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, tais como por meio de exemplo apenas, alquilaminas, dialquilaminas, trialquilaminas, alquilaminas substituídas, di(alquil substituído) aminas, tri(alquil substituído) aminas, alcenilaminas, dialcenilaminas, trialcenilaminas, alcenilaminas substituídas, di(alcenil substituído) aminas, tri (alcenil substituído) aminas, cicloalquilaminas, di(cicloalquil) aminas, tri(cicloalquil) aminas, cicloalquilaminas substituído, cicloalquilaminas dissubstituídos, cicloalquilaminas trissubstituídos, cicloalcenilaminas, di(cicloalcenil) aminas, tri(cicloalcenil) aminas, cicloalcenilaminas substituídas, cicloalcenilaminas dissubstituídos, cicloalcenilaminas trissubstituídas, arilaminas, aminas de diarilo, aminas de triarilo, heteroarilaminas, diheteroarilaminas, aminas heterocíclicas, triheteroarilaminas, aminas triheterocíclicas, aminas diheterocíclicas misto, di- e tri-aminas em que pelo menos dois dos substituintes na amina são diferentes e são selecionados a partir do grupo que consiste em alquil, alquil substituído, alcenil, alcenil substituído, cicloalquil, cicloalquil substituído, cicloalcenil, cicloalcenil substituído, aril, heteroaril, heterocíclico, e similares. Estão também incluídas aminas onde dois ou três substituintes, juntamente com o nitrogênio amino, formam um grupo heterocíclicos ou heteroaril.
[00188] Sais de adição de ácido farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis podem ser preparados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Os ácidos inorgânicos que podem ser utilizados incluem, a título de exemplo apenas, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e outros semelhantes. Os ácidos orgânicos que podem ser utilizados incluem, a título de exemplo apenas, o ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanesulfónico ácido, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico e afins.
[00189] Os sais farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis ou dos compostos úteis na presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto de origem, que contém uma fração básica ou ácida, por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo as formas livres de ácido ou base destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico ou uma mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos tais como o éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrilo são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences. 17° ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), p. 1418, cuja divulgação do qual é incorporada por referência. Exemplos de tais sais aceitáveis são o iodeto, acetato, acetato de fenilo, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, brometo, isobutirato, fenilbutirato, γ-hidroxibutirato, β-hidroxibutirato, butino-l,4-dioato, hexino-l,4-dioato, hexino-1,6-dioato, caproato, caprilato, cloreto, cinamato, citrato, decanoato, formato, fumarato, glicolato, heptanoato , hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, fitalato, tereftalato, fosfato, mono-hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato, fenilpropionato, salicilato, sebacato, sucinato , suberato, sulfato, bissulfato, pirossulfato, sulfito, bissulfito, sulfonato, benzenossulfonato, p- bromofenilsulfonato, clorobenzenossulfonato, propanossulfonato, etanossulfonato, 2-hidroxietanossulfonato, meranossulfonato, naftaleno-I-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, p-toluenossulfonato, xilenossulfonato , tartarato, e outros semelhantes.
[00190] As composições farmacêuticas ou veterinárias da presente invenção podem ser formuladas de um modo convencional, em conjunto com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis, se desejado, em formas adequadas para administração oral, parentérica, ou tópica. Os modos de administração parentérica podem incluir, por exemplo, injeção intramuscular, administração subcutânea e intravenosa, administração oral, administração tópica e administração direta aos sítios da infeção, tais como intra-ocular, intra-aural, intra-uterina, nasal, intramamária, intraperitoneal, intralesional, etc.
[00191] As composições farmacêuticas ou veterinárias da presente invenção podem ser formuladas para administração oral. Ingredientes inativos tradicionais podem ser adicionados para fornecer a cor desejável, paladar, estabilidade, capacidade de tampão, dispersão ou outras características desejáveis conhecidas. Exemplos incluem óxido de ferro vermelho, gel de sílica, sulfato de laurel de sódio, dióxido de titânio, tinta branca comestível e semelhantes. Diluentes convencionais podem ser utilizados para fazer comprimidos prensados. Tanto os comprimidos quanto as cápsulas podem ser fabricados na forma de composições de libertação prolongada para a libertação contínua de medicação durante um período de tempo. Os comprimidos prensados podem estar na forma de comprimidos revestidos com açúcar ou revestidos com uma película, ou comprimidos com revestimento entérico para desintegração seletiva no trato gastrointestinal. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem conter corantes e/ou aromatizantes para aumentar a aceitação do paciente. Como um exemplo, a formulação oral que compreende compostos da invenção pode ser um comprimido que compreende qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: hidrogenofosfato de cálcio di-hidratado, celulose microcristalina, lactose, celulose metil hidroxipropil, e talco.
[00192] As composições aqui descritas podem estar na forma de uma formulação líquida. Exemplos de composições líquidas preferidas incluem soluções, emulsões, soluções para injeção, soluções contidas em cápsulas. A formulação líquida pode compreender uma solução que inclui um agente terapêutico dissolvido num solvente. De um modo geral, qualquer solvente que tenha o efeito desejado pode ser usado em que o agente terapêutico dissolve-se e que possa ser administrada a um indivíduo. Geralmente, qualquer concentração de agente terapêutico que tem o efeito desejado pode ser usado. A formulação em algumas variações é uma solução que é insaturada, saturada ou uma solução supersaturada. O solvente pode ser um solvente puro ou pode ser uma mistura de componentes de solvente líquido. Em algumas variações a solução formada é uma in situformulação de gelificação. Os solventes e os tipos de soluções que podem ser utilizadas são bem conhecidas para aqueles versados em tecnologias de administração de drogas.
[00193] A composição aqui descrita pode ser na forma de uma suspensão líquida. As suspensões líquidas podem ser preparadas de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Exemplos de suspensões líquidas incluem micro-emulsões, a formação de compostos complexantes, estabilizadores e suspensões. A suspensão líquida pode estar na forma não diluída ou concentrada. As suspensões líquidas para uso oral podem conter conservantes apropriados, antioxidantes, e outros excipientes conhecidos na técnica funcionamento como um ou mais dos agentes de dispersão, agentes de suspensão, agentes espessantes, agentes emulsionantes, agentes molhantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes aromatizantes e edulcorantes , agentes corantes, e semelhantes. A suspensão líquida pode conter glicerol e água.
[00194] A composição aqui descrita pode ser na forma de uma pasta oral. A pasta oral pode ser preparada de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica.
[00195] A composição é aqui descrita pode ser na forma de uma formulação líquida injetável, tal como a injeção intra-muscular, e preparada utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a formulação líquida pode conter polivinilpirrolidona K30 e água.
[00196] A composição é aqui descrita pode ser na forma de preparações tópicas. A preparação tópica pode ser na forma de uma loção ou um creme, preparado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma loção pode ser formulada com uma base aquosa ou oleosa e pode incluir um ou mais excipientes conhecidos na técnica, funcionando como intensificadores de viscosidade, agentes emulsionantes, fragrâncias ou perfumes, agentes conservantes, agentes quelantes, modificadores de pH, antioxidantes, e semelhantes. Por exemplo, a formulação tópica compreendendo um ou mais compostos da invenção pode ser um gel que compreende qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: PEG 8000, PEG 4000, PEG 200, glicerol, glicol de propileno. O composto NCL812 pode ainda ser formulado numa dispersão sólida utilizando Soluplus® (BASF, www.soluplus.com) e formulado com qualquer um, ou uma combinação dos seguintes excipientes: PEG 8000, PEG 4000, PEG 200, glicerol e glicol de propileno.
[00197] Para administração em aerossol, a composição da invenção é fornecida em forma finamente dividida juntamente com um tensioactivo não tóxico e um propulsor. O agente tensioactivo é de preferência solúvel no propulsor. Tais agentes tensioactivos podem incluir ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos.
[00198] As composições da invenção podem, alternativamente, ser formuladas para administração através de injeção. Como um exemplo, o composto é administrado através de injeção por qualquer uma das seguintes vias: intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea.
[00199] As composições da invenção podem, alternativamente, ser formuladas usando técnicas de administração de fármacos de nanotecnologia, tais como aqueles conhecidos na técnica. Sistemas de administração de fármacos à base de nanotecnologia tem a vantagem de melhorar a biodisponibilidade, a adesão do paciente e reduzindo os efeitos colaterais.
[00200] A formulação da composição da invenção inclui a preparação de nanopartículas sob a forma de nanossuspensões ou nano-emulsões, com base na solubilidade do composto. Nanossuspensões são dispersões de partículas de droga nanométricos preparados pela tecnologia de bottom-up ou top-down e estabilizados com excipientes adequados. Esta abordagem pode ser aplicada aos compostos da invenção que podem ter uma fraca solubilidade aquosa e lipídica, a fim de melhorar a saturação de solubilidade e melhorar as características de dissolução. Um exemplo desta técnica é estabelecido no Sharma e Garg (2010) (fármaco puro e nanotecnologia à base de polímero para a melhor solubilidade, estabilidade, biodisponibilidade e direcionamento de drogas anti-HIV. Advanced Drug Delivery Reviews, 62: p. 491-502). Saturação solubilidade será entendido como sendo uma constante de composto específico que depende da temperatura, das propriedades do meio de dissolução, e de tamanho de partícula (<1-2 μm).
[00201] A composição da invenção pode ser fornecida sob a forma de uma nanossuspensão. Para nanossuspensões, o aumento da área da superfície pode conduzir a um aumento na solubilidade de saturação. Nanossuspensões são sistemas de administração de fármacos coloidais, que consiste em partículas inferior a 1 μm. As composições da invenção podem estar na forma de suspensões, incluindo nanossuspensões nanocristalinas, nanopartículas de lípidos sólidos (SLNs), nanopartículas poliméricas, nanocápsulas, micelas poliméricas e dendrímeros. Nanossuspensões podem ser preparadas usando uma abordagem de top-down, onde as partículas maiores podem ser reduzidas a dimensões nanométricas por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo moagem úmida e homogeneização de alta pressão. Alternativamente, nanossuspensões podem ser preparadas utilizando uma técnica de bottom-up, quando a precipitação controlada de partículas pode ser realizada a partir da solução.
[00202] A composição da invenção pode ser fornecida sob a forma de uma nano-emulsão. Nano-emulsões são tipicamente sistemas bifásicos claros de óleo-em-água ou água-em-óleo, com um tamanho de gotícula na gama de 100-500 nm, e com compostos de interesse presente na fase hidrófoba. A preparação de nano-emulsões pode melhorar a solubilidade de dos compostos da invenção aqui descritos, que conduz a uma melhor biodisponibilidade. Suspensões nanométricas podem incluir agentes de estabilização estérica ou eletrostática, tais como polímeros e surfactantes. As composições sob a forma de SLNs podem compreender lípidos biodegradáveis, tais como os triglicéridos, os esteróides, as ceras e emulsionantes, tais como lecitina de soja, lecitina de ovo, e poloxâmeros. A preparação de uma preparação SLN pode envolver a dissolução/dispersão de drogas em lípidos derretidos seguido de homogeneização quente ou frio. Se homogeneização quente for usada, a fase lipídica fundida pode ser dispersa numa fase aquosa e uma emulsão preparada. Isto pode ser solidificado por arrefecimento para conseguir SLNs. Se homogeneização fria for usada, a fase lipídica pode ser solidificada em nitrogênio líquido e moído para o tamanho mícron. O pó resultante pode ser submetido à homogeneização de alta pressão numa solução aquosa de surfactante.
[00203] Os Compostos da Fórmula I como aqui descritos podem ser dissolvidos em óleos/lípidos líquidos e estabilizados numa formulação de emulsão. Nano-emulsões podem ser preparadas usando técnicas de redução de gotícula de alta e baixa energia. Métodos de alta energia podem incluir homogeneização de alta pressão, ultra-som e microfluidização. Se o método de baixa energia for usado, a difusão de solvente e de inversão de fase irá gerar uma nano-emulsão espontânea. Os lípidos utilizados nas nano-emulsões podem ser selecionados a partir do grupo compreendendo triglicéridos, óleo de soja, óleo de açafroa, e óleo de sésamo. Outros componentes, tais como emulsionantes, antioxidantes, modificadores de pH e conservantes podem também ser adicionados.
[00204] A composição pode estar na forma de uma formulação de libertação controlada, e pode incluir um polímero degradável ou não-degradável, hidrogel, organogel, ou outra construção física que modifica a libertação do composto. Entende-se que tais formulações podem incluir ingredientes inativos adicionais que são adicionados para fornecer a cor desejável, estabilidade, capacidade de tampão, dispersão ou outras características desejáveis conhecidas. Tais formulações podem ainda incluir lipossomas, tais como emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões fosfolipídicas, camadas lamelares e semelhantes. Os lipossomas para utilização na invenção podem ser formados a partir de lípidos que formam vesículas padrão, incluindo geralmente fosfolípidos neutros e negativamente carregados e um esterol, tal como colesterol.
[00205] As formulações da invenção podem ter a vantagem de solubilidade aumentada e/ou a estabilidade dos compostos, particularmente para as formulações preparadas utilizando técnicas de nanotecnologia. Este aumento da estabilidade e/ou a estabilidade dos compostos da Fórmula I pode melhorar a biodisponibilidade da droga e aumentar a exposição para formas de dosagem oral e/ou parentérica.
[00206] Em toda esta especificação, salvo indicação em contrário, a palavra "compreende", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro declarado ou grupos de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: As concentrações inibitórias mínimas (MIC) para NCL812 em Staphylococcus aureus (MRSA) resistente à meticilina, Enterococcus spp. (VRE) resistente à vancomicina e Streptococcus pneumoniae. Específico
[00207] Como é aparente a partir do resumo anterior da invenção, a invenção refere-se aos compostos de Fórmula I, aos métodos de tratamento de uma infecção bacteriana, ao uso e aos dispositivos médicos.
[00208] Este estudo foi realizado para determinar as concentrações inibitórias mínimas (MIC) para um agente antibacteriano, NCL812. O agente antibacteriano representa um potencial de nova classe de drogas, com um espectro estreito percebido de atividade contra bactérias e um novo mecanismo de ação. Este estudo incidiu sobre os isolados recentes de três principais patógenos oportunistas de humanos onde o desenvolvimento da resistência antibacteriana a classes antibacterianas existentes é problemática: Staphylococcus aureus (MRSA) resistente à meticilina, Enterococcus spp. (VRE) resistente à vancomicina e Streptococcus pneumoniae.
[00209] Neste exemplo, concentrações inibitórias mínimas (MICs) de NCL812 foram determinadas para 61 isolados clínicos australianos (composto por 21 MRSA, 20 putativo VRE e 20 isolados de S. pneumoniae). Descobriu-se que os perfis de MIC para NCL812 foram muito consistentes, com valores de MIC50 e MIC90 de 4 μg/mL registrados para cada uma das espécies testadas.
Materiais e Métodos Coleta e Identificação do Isolado Bacteriano
[00210] Sessenta e um isolados de teste foram provenientes de laboratórios de microbiologia de diagnóstico clínico. Os isolados de MRSA foram originalmente cultivados em Brilliance MRSA Chromogenic Agar (Oxoid) seletivo. Colônias suspeitas foram selecionadas com base na sua aparência de colônias em agar e esta identificação quanto Staphylococcus aureus foi determinada utilizando características de colônias em ágar de sangue de carneiro não seletivo (SBA) e características fenotípicas, como a coloração de Gram, teste de catalase positiva, teste de coagulase positiva (teste da coagulase em tubo utilizando plasma de coelho) e fator de aglutinação (aglutinação com o teste de látex de Oxoid Staphytect), teste de Voges Proskauer positivo, e a capacidade de produzir ácido a partir de trealose. Uma tela de resistência à cefoxitina positiva confirmou os isolados como MRSA. Todos os isolados de Enterococcus foram submetidos a um padrão de identificação bioquímica. A perfilagem bioquímica provisoriamente identificou quatro dos VRE isolados de Enterococcus faecalis e o restante na forma de Enterococcus faecium. Todos os isolados de S. pneumoniae foram identificados com base nos perfis bioquímicos padrão.
Preparação de Antibacterianos
[00211] Grau analítico do NCL812 (lote 20081214), com uma potência definida de 1000 mg/g (ou seja, 100%) foi obtido. O pó foi armazenado a uma temperatura de -20°C. Alíquotas (1 ml) da solução de caldo (25,6 mg/ml) foram preparadas em DMSO e armazenadas a -80°C e descongeladas imediatamente antes da utilização.
Preparação de placas de 96 poços de microtitulação para o teste de MIC de microdiluição de caldo usando NCL812
[00212] O Caldo de Mueller Hinton (CAMHB) ajustado para catião foi preparado utilizando 100 mL de caldo de Mueller Hinton estéril (pH ajustado). Para cada volume de 100 mL, 125 μL de solução de caldo de cálcio (10 mg de Ca2+ por ml) e 43 μL de uma solução de caldo de magnésio (10 mg de Mg2+ por ml) foi adicionado assepticamente. Caldo suficiente é produzido para o uso diário, com porções não utilizadas sendo armazenadas a 4°C durante a noite.
[00213] Bandejas de microdiluição com 4% de sangue de cavalo lisado em CAMHB foi preparado por lise de sangue de cavalo (Oxoid) por congelação e descongelação repetidas (3-4 vezes) e misturando assepticamente o sangue de cavalo lisado (LHB) 50:50 com água destilada estéril. Uma suspensão isenta de células foi obtida por centrifugação de 50% de LHB a 16.000 x g (7000 rpm) durante 20 min. O sobrenadante foi decantado, recentrifugado e armazenado congelado. 50% de LHB foi diluído com CAMHB para se obter uma concentração final de 4% (7 mL de LHB em 93 mL de CAMHB). 4% de LHB-CAMHB foi usado em vez de CAMHB em todas as etapas na preparação das placas de microdiluição e preparação de soluções antimicrobianas para espécies de Streptococcus.
[00214] A solução de trabalho de caldo antibiótico de NCL812 foi preparada para uma concentração de 25,60 mg/mL. A potência foi descrita como 1,000 mg/g ou 100%. O pó foi dissolvido em 10 mL de DMSO e volumes de 1 ml foram divididos em alíquotas para tubos Eppendorf e armazenados a -80°C. Quando adicionado ao CAMHB, um precipitado nebuloso se formou, e foi bem agitado antes e durante alíquotas.
[00215] Uma solução de caldo de ampicilina foi preparada à concentração de 25,60 mg/mL. A ampicilina foi usada para o controle de qualidade interna. A ampicilina em pó foi dissolvida em 4 ml de tampão de fosfato pH 8,0, 0,1 mol/L, em seguida, diluído em 6 ml de tampão de fosfato pH 6,0, 0,1 mol/L. Volumes de 1 ml foram divididos em alíquotas para tubos Eppendorf e armazenados a -80°C.
[00216] Para Staphylococcus aureus, uma solução de trabalho de 256 μg/ml foi preparada por diluição de soluções de caldo, tal como descrito acima de 1:100 em CAMHB (100 μL em 9,9 mL). Quando 90 μL foi adicionado a cada poço 12, houve uma diluição de 1:2, de modo que poço 12 tivesse 128 μg/ml de antibiótico. A gama de antimicrobiana foi calculada como 0,25 μg/ml (poço 3) a 128 μg/ml (poço 12).
[00217] Para espécies de Enterococcus , uma solução de trabalho de 64 μg/mL foi preparada por diluição de soluções de caldo, tal como descrito acima de 1: 400 em CAMHB (100 μL em 9,9 mL, depois dilui-se ainda mais isto 1: 4). Quando 90 μL foi adicionado ao poço 12, houve uma diluição de 1:2, de modo que poço 12 tivesse 32 μg/ml de antibiótico.
[00218] Para Streptococcus pneumoniae, uma solução de trabalho de 64 μg/ml foi preparada por diluição de soluções de caldo, tal como descrito acima de 1: 400 em 4% de LHB-CAMHB (100 μL em 9,9 mL, em seguida diluindo ainda mais isto 1: 4). Quando 90 μL Mars adicionado ao poço 12, houve uma diluição de 1:2, de modo que poço 12 tivesse 32 μg/ml de antibiótico.
[00219] As diluições em série foram preparadas em placas de 96 poços foram criadas numa câmara de segurança de acordo com métodos convencionais na técnica. Resumindo: 90 μL da solução de trabalho antibiótica foi adicionada a cada poço na Coluna 12 da placa, e bem misturada, antes de 90 μL ser transferido para a coluna 11. As soluções foram misturadas novamente, e, em seguida, transferidas para a coluna seguinte, como anteriormente, dando continuidade às diluições através da coluna 3. Misturando o poço requer a retirada e expulsão de 90 μL em cada poço 3-4 vezes antes de retirar e transferir os 90 μL para o próximo poço. Coluna 2 (controle positivo bacteriano) e a coluna 1 (controle negativo) não fazem parte da diluição em série. As bandejas foram constituídas da seguinte forma: 2 cepas foram testadas em duplicado em uma bandeja, de tal modo que uma cepa foi localizada em linhas A a D, cepa 2 foi localizada em linhas E a H, etc. MIC (μg/mL) interpretativo padrão para ampicilina utilizando cepas de controle é mostrado na Tabela 1 abaixo. Staphylococcus aureus ATCC 29213 MIC de gama aceitável para ampicilina = 0,5 a 2 μg/mL, Enterococcus faecalis ATCC 29212 MIC de gama aceitável para ampicilina = 0,5 a 2 μg/mL, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 MIC de gama aceitável para ampicilina = 0,06 a 0,25 μg/mL
Tabela 1: MIC (μg/mL) interpretativo padrão para ampicilina utilizando cepas de controle de acordo com o Exemplo 1.
Figure img0086
Preparação da suspensão bacteriana para o método de MIC em microdiluição de caldo.
[00220] Culturas frescas de bactérias foram preparadas para o ensaio em placas de agar com sangue de ovelha (SBA), e a incubação durante a noite a 37°C como se segue; 2-3 colônias de cada cepa em 7 ml de solução salina estéril, e OD600 medido como uma indicação da densidade (aprox. 0,5 x 108 CFU/mL ou 0,5 padrão McFarland). A suspensão bacteriana foi ajustada para uma absorvância final de 0,08 para 0,100, utilizando solução salina para atingir a densidade correta, e como a do branco. Dentro de 15 minutos após a preparação, a suspensão bacteriana ajustada com solução salina estéril de 1:20 (1 mL em 19 mL de solução salina estéril) para alcançar uma concentração bacteriana final de 4 a 5 x 106 CFU/ml. A solução bacteriana foi colocada numa calha estéril e 10 μL de solução bacteriana adicionada aos poços de 2 até 12 em cada linha necessária (diluição de 1:10, com concentração final de bactérias nos poços = 5 x 105 CFU/ml). A bandeja foi selada e incubada a 37°C durante 18-24 h. A pureza da suspensão bacteriana foi confirmada por retirar 50 μL da diluição de 1:20 para uma placa de SBA, que foi incubada a 37°C durante 18 h e analisada. Contagens viáveis foram realizadas para assegurar que a concentração correta de bactérias tenha sido adicionada aos poços. A solução bacteriana diluída (4 a 5 x 106 CFU/ml) foi diluída 1:10 para baixo através da adição de 100 μL a 900 μL de solução salina estéril em tubos estéreis, e as diluições em série 1:10 continuaram durante 5 tubos. 100 μL (4-5 gotas) da 4a e 5a diluição (tubo 4 = 105 e tubo 5 = 106 CFU/ml) foi preparada em duplicado, em torno de placas de ágar pré-seca de PCA e incubado a 37°C durante a noite. No dia seguinte, o número de colônias nas placas foi contado e a contagem média de 100 μL obtida. O estudo foi multiplicado por 10 para obter uma contagem de bactérias viáveis por mL.
Descrição e identificação de isolados
[00221] Os isolados de MRSA foram originalmente cultivados em Brilliance MRSA Chromogenic Agar (Oxoid) seletivo. Colônias suspeitas foram selecionadas com base na sua aparência de colônias em agar e esta identificação quanto Staphylococcus aureus foi determinada utilizando características de colônias em SBA não seletivo e características fenotípicas, como a coloração de Gram, teste de catalase positiva, teste de coagulase positiva (teste da coagulase em tubo utilizando plasma de coelho) e fator de aglutinação (aglutinação com o teste de látex de Oxoid Staphytect), teste de Voges Proskauer positivo, e a capacidade de produzir ácido a partir de trealose. Uma tela de resistência à cefoxitina positiva confirmou os isolados como MRSA.
[00222] Complexos clonais de MRSA foram determinados por tipagem molecular rápida. Duas das cepas não podiam ser digitadas utilizando o método rápido, como mostrado na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2: uma tabela que mostra os complexos clonais de MRSA de acordo com o Exemplo 1.
Figure img0087
Figure img0088
NA: Não Aplicável; TBD: Os isolados não podiam ser digitados usando o método rápido e estão atualmente sendo identificados usando a metodologia tradicional.
[00223] Todos os isolados de Enterococcus foram submetidos a uma identificação bioquímica simplificada baseado em Quinn et al. (1994, Clinical Veterinary Microbiology, Mosby Ltd, Nova York). A perfilagem bioquímica provisoriamente identificou quatro dos VRE isolados de Enterococcus faecalis e o restante na forma de possivelmente Enterococcus faecium. Todos os isolados deS. pneumoniae foram identificados com base nos perfis bioquímicos padrão.
Produto de ensaio e armazenamento
[00224] Grau analítico de NCL812 (lote 20081214), com uma potência definida de 1000 mg/g (ou seja, 100%) foi obtido e o pó foi armazenado a uma temperatura de -20°C. Alíquotas (1 ml) da solução de caldo (25,6 mg/ml) foram preparadas em DMSO e armazenadas a -80°C e descongeladas imediatamente antes da utilização.
Determinação da concentração mínima inibitória
[00225] As concentrações inibitórias mínimas (μg/ml) foram determinadas usando o método de micro-diluição em caldo recomendado pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Seventh Edition. CLSI M7-A7, 2006; Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard - Second Edition. CLSI M31-A2, 2002; Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; CLSI M2-A9, 2006).
[00226] MIC foi considerado como a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que inibiu completamente o crescimento do organismo nos poços de microtitulação tal como detectado pelo olho nu. Pontos de ruptura de MIC foram determinados por avaliação visual e, em seguida confirmados utilizando um leitor de placas ELISA, e medindo os níveis de absorvância a 450 nm. O crescimento bacteriano (turbidez) nos poços com antimicrobiano foi comparado com a quantidade de crescimento (turbidez) no poço de controle de crescimento (sem antimicrobiano). Todos os isolados foram testados em duplicado, caso houvesse uma diferença maior do que uma diluição de duas vezes nos resultados, o teste era repetido uma terceira vez. A pureza dos isolados foi acompanhada de perto durante os testes por subcultura do inóculo bacteriano preparado em SBA. Os organismos de controle (Enterococcus faecalis cepa ATCC 29212, S. aureus cepa ATCC 29213 e S. pneumoniae cepa ATCC 49619) foram usados em todo o teste para monitorizar o controle da qualidade. As MICs das cepas de controle para a ampicilina antimicrobiana (gama 1,0, 2,0 e 0,06 μg/mL, respectivamente) foram determinadas para cada teste executado como um controle de qualidade interno. A gama de MIC50, MIC90 MIC (mínimo e máximo) foram calculados para cada um dos grupos de bactérias.
Resultados
[00227] Os valores de MIC de ampicilina obtidos para as cepas de controle de ATCC estavam dentro da faixa normal esperada na base das recomendações do CLSI. Os valores de NCL812 e MIC de ampicilina para cada isolado são indicados na Tabela 3 (isolados de MRSA), Tabela 4 (isolados de VRE) e Tabela 5 (isolados de S. pneumoniae ) abaixo. MIC50, MIC90, modo de MIC e gama de MIC para cada uma das espécies de bactérias testadas estão apresentados na Tabela 6 abaixo. MIC50 é considerado como sendo a concentração mais baixa que inibe o crescimento visível de 50% dos isolados. MIC90 é considerado como sendo a concentração mais baixa que inibe o crescimento visível de 90% dos isolados. O modo de MIC é o valor de MIC que mais comumente ocorre e gama de MIC os valores mínimos e máximos de MIC obtidos.
Tabela 3: As concentrações inibitórias mínimas para os isolados individuais de Staphylococcus aureus de acordo com o Exemplo 1.
Figure img0089
Tabela 4: As concentrações inibitórias mínimas para os isolados individuais de Enterococcus de acordo com o Exemplo 1.
Figure img0090
Tabela 5: As concentrações inibitórias mínimas para os isolados individuais de Streptococcus pneumoniae de acordo com o Exemplo 1.
Figure img0091
Tabela 6: NCL812 MIC50, MIC90, o modo de MIC e a gama de MIC para isolados australianos de MRSA, VRE e S. pneumoniae.
Figure img0092
* Modo - o valor MIC que mais ocorre comumente
§ MICs de ampicilina comparativos estão, mostrados entre parêntesis
[00228] Os valores de MIC NCL812 foram consistentes dentro e entre cada uma das três espécies. Os valores de MIC50 e MIC90 foram ambos iguais (4 μg/ml) para os isolados de MRSA, VRE e S. pneumoniae , com menos de 10% dos isolados demonstrando valores de MIC tanto de 12 diluições abaixo ou apenas uma diluição acima desse valor.
[00229] Com base nestes resultados, NCL812 representa uma nova antibacteriana.
EXEMPLO 2: Efeito de NCL812 na Síntese Macromolecular de Staphylococcus aureus Materiais e Métodos Composto de Teste
[00230] O composto de teste NCL812 foi transportado para a instalação experimental sob condições de temperatura ambiente e, em seguida, armazenado de 2-8°C até serem ensaiados. As soluções stock foram preparadas por dissolução de pó seco NCL812 em 100% de DMSO a uma concentração de 6.400 μg/mL. Vancomicina (Cat. # 1134335), Rifampicina (Cat. # R-7382) e Cerulenina (Cat. # C-2389) foram todos obtidos a partir de Sigma, Ciprofloxacina foi obtida a partir de USP (Cat. # 1134335) e linezolida foi obtida da ChemPacific (Cat. # 35710).
Teste de Concentração Inibitória Mínima
[00231] O método de ensaio de MIC seguido pelo procedimento descrito através de Clinical and Laboratory Standards Institute ou CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Eighth Edition. Documento CLSI M07-A8 [ISBN 156238-689-1]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Estrada, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19.087-19898, EUA, 2009), e empregou manipuladores de líquido automatizados para realizar diluições em série e transferências líquidas. O meio empregado para o ensaio de MIC foi Mueller Hinton II Broth (MHB II- Becton Dickinson, Sparks, MD; n° Cat 212322; Lot 9044411). S. aureus ATCC 29213 serviu como cepas de controle de qualidade, e linezolida foi utilizada como antibiótico de controle de qualidade para validar o ensaio. NCL812 e linezolida foram ambos dissolvidos em 100% de DMSO antes da adição ao meio de crescimento.
Ensaios de Síntese Macromolecular As condições de bactéria e de crescimento
[00232] O efeito de NCL812 em DNA de célula total, RNA, parede celular, proteína e síntese de lípido foi investigada usando S. aureus ATCC 29213. As células foram cultivadas a 35°C durante a noite em agar de soja tripticase. Uma colônia da placa foi usada para inocular 10 ml de Mueller Hinton II (MHBII), e a cultura foi cultivada para o fase de crescimento exponencial prematuramente (OD600 = 0,2 a 0,3) enquanto incubada num agitador a 35°C e 200 rpm.
DNA, RNA e a síntese de proteína
[00233] Quando as células atingiram fase exponencial precocemente, a 100 μl da cultura foi adicionada a poços em triplicado contendo várias concentrações do composto de teste ou dos antibióticos controle (5 μl) a 20× a concentração final em 100% de DMSO. Uma cultura tratada com 5% de DMSO tratada serviu como controle "sem fármaco" para todas as experiências. As células foram adicionadas em MHBII a 105% para compensar o volume de fármaco adicionado a cada reação ou em meio mínimo M9 para reações de síntese de proteína. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, ou [3H] timidina (síntese de DNA), [3H] uridina (síntese do ARN) ou [3H] leucina (síntese de proteína) foi adicionado a 0,5-1,0 μCi por reação, dependendo da experiência. As reações foram deixadas prosseguir à temperatura ambiente durante 15-30 minutos e em seguida interrompidas pela adição de 12 μl de 5% de ácido tricloroacético frio (TCA) ou 5% de ácidos TCA/2% de ácidos casamino (síntese de proteína única). As reações foram incubadas em gelo durante 30 min e o material precipitado de TCA foi coletado em um filtro de 25 mm GF/A. Depois de se lavar três vezes com 5 ml de 5% de TCA a frio, os filtros foram lavados duas vezes com 5 mL de 100% de etanol, deixados secar, e, em seguida, contados utilizando um contador de cintilação líquida Beckman LS3801.
Síntese da parede celular
[00234] As células bacterianas em fase de crescimento exponencial precocemente foram transferidas para meio mínimo M9 e adicionadas a tubos de 1,5 mL de Eppendorf (100 μl/tubo) contendo várias concentrações do composto de teste ou dos antibióticos controle (5 μl) em 20× a concentração final em 100% de DMSO conforme acima. Seguindo uma incubação de 5 min a 37°C, [14C]N-acetilglucosamina (0,4 μCi/reação) foi adicionada a cada tubo e incubada durante 45 min num bloco de aquecimento de 37°C. As reações foram interrompidas através da adição de 100 μl de 8% de SDS a cada tubo. As reações foram, então, aquecidas a 95°C durante 30 min num bloco de aquecimento, resfriadas, centrifugadas brevemente, e manchadas em filtros de HA pré-umedecidos (0,45 μΜ). Depois de se lavar três vezes com 5 mL de 0,1% de SDS, os filtros foram lavados duas vezes com 5 ml de água deionizada, deixados secar, e, em seguida, contados utilizando um contador de cintilação líquida Beckman LS3801.
Síntese de lipídeo
[00235] Células bacterianas foram cultivadas até à fase de crescimento exponencial precoce em caldo MHBII e adicionou-se 1,5 mL (Eppendorf tubos em triplicado) contendo várias concentrações de antibióticos do composto de teste ou de controlo, conforme descrito acima. Após a 5 min. de incubação à temperatura ambiente, [3H] glicerol foi adicionado a 0,5 μCi por reação.
[00236] As reações foram deixadas prosseguir à temperatura ambiente durante 15 min e, em seguida, interrompida pela adição de 375 μl de clorofórmio/metanol (1:2), seguido pela rotação durante 20 segundos após cada adição. Clorofórmio (125 μL) foi então adicionado a cada reação, submetido a vórtice, seguido pela adição de 125 μl de dH2O agitação em vórtice. As reações foram centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 min e, em seguida, 150 μl da fase orgânica foi transferida para um frasco de cintilação e deixada secar numa coifa por, pelo menos, 1 h. As amostras foram, então, contadas através de contagem de cintilação líquida.
Resultados
[00237] Teste de sensibilidade foi realizado com NCL812 e S. aureus ATCC 29213 para determinar a concentração de fármaco necessária nos ensaios de síntese macromolecular.
[00238] Tabela 7 mostra que a MIC para NCL812 era 4 μg/mL, enquanto o agente de controle de qualidade linezolida dentro do alcance do controle de qualidade estabelecido pela CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Nineteenth Informational Supplement. Documento CLSI M100-S20 [ISBN 1-56238-716-2]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, EUA, 2010). Precipitação de NCL812 foi observada a >8 pg/mL em placas que foram preparados de um modo idêntico, mas não receberam um inoculo de S. aureus. Estudos de inibição de síntese macromolecular foram realizadas utilizando concentrações de NCL812 que foram equivalentes a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 vezes o valor de MIC (4 μg/ ml) para S. aureus ATCC 29213 (Figuras 11-16).
Tabela 7: Os valores das Concentrações Inibitória Mínima para NCL812 (robenidina) e linezolida contra Staphylococcus aureus ATCC29213 de acordo com o Exemplo 2.
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[00239] A Figura 2 mostra o efeito da NCL812 na síntese do DNA. NCL812 não demonstrou nenhuma inibição em 0,25 vezes MIC, 40% de inibição em 0,5 vezes, e aproximadamente 95% de inibição em MIC. Isso é comparado à ciprofloxacina de controle que mostrou aproximadamente 51% em 8 vezes MIC (0,5 μg/ mL). Os resultados para a inibição de NCL812 da síntese de RNA foram muito semelhantes aos estudo de síntese de DNA, com rifampicina servindo como o controle positivo (Figura 3. Deve se observar que a precipitação foi observada em 4 a 8 vezes MIC no caldo de Mueller Hinton II utilizado nos ensaios de síntese DNA e RNA.
[00240] A síntese da proteína foi inibida de uma maneira dependente da dose em 0,25, 0,5, e 1 vezes o valor de MIC NCL812 mostrando até 97% de inibição na MIC (Figura 4. A linezolida demonstraram cerca de 61% de inibição da síntese de proteínas em 8 vezes o MIC (2 μg/ mL). Precipitação de NCL812 ocorreu em 4 e 8 vezes o MIC no ensaio de síntese de proteína.
[00241] Na Figura 5 NCL812 também mostrou uma certa inibição dependente da dose da síntese da parede celular, embora houvesse um grande aumento na inibição de 1 a 2 vezes a MIC. No entanto, a inibição caiu para aproximadamente 68% e 52% em quatro vezes e oito vezes a MIC, respectivamente. A precipitação de NCL812 ocorreu em 2, 4, e 8-vezes a MIC no meio mínimo M9 utilizado para o ensaio de síntese da parede celular, e que é a causa mais provável da diminuição da inibição. Em comparação, a vancomicina de controle positivo mostrou 96% de inibição em 8 vezes a MIC (2 μg/mL). NCL812 demonstrou um perfil de inibição similar contra a síntese lipídica conforme mostrado para a síntese de DNA e RNA, chegando aproximadamente a 90% de inibição a MIC (Figura 6). A cerulenina inibidora de controle positivo demonstrou 72% de inibição em 8 vezes a MIC (32 μg/mL).
[00242] A Figura 7 representa um composto de todas as cinco reações de síntese macromolecular. Pode ser observado que as curvas de inibição foram similares para cada uma das vias, o que sugere uma inibição global das diversas vias simultaneamente por NCL812. É possível que NCL812 alveje a membrana celular, causando fuga de íons essenciais e/ou metabolitos, conduzindo, desse modo, a um desligamento global das vias de síntese celular.
[00243] Em resumo, NCL812 inibidiu DNA, RNA, proteínas, parede celular, e vias de lípidos numa cultura em crescimento de S. aureus. Embora algumas instâncias da inibição dependente de dose das vias tenham sido observadas, todas as cinco reações de síntese macromoleculares foram similarmente sensíveis à NCL812.
EXEMPLO 3: Efeito de NCL812 na liberação de ATP a partir de Staphylococcus aureus Materiais e Métodos Composto de Teste
[00244] O composto de teste NCL812 foi transportado sob condições de temperatura ambiente e, em seguida, armazenado de 2-8°C até serem ensaiados. As soluções stock foram preparadas por dissolução de pó seco NCL812 em 100% de DMSO a uma concentração de 1.600 μg/mL. A polimixina B foi obtida a partir de Sigma (Cat. # P-4932).
Organismo de teste
[00245] S. aureus ATCC 29213 foi originalmente adquirido junto à American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Ensaio de Libertação de ATP
[00246] O ensaio CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilidade Assay (Promega) foi utilizado para medir o fuga de ATP das bactérias. As culturas foram cultivadas até à fase exponencial precocemente (0,2 - 0,3 OD600) de Mueller-Hinton II e, em seguida, tratadas com sete concentrações diferentes de qualquer NCL812 ou polimixina B (controle positivo), utilizando MIC para cada composto conforme uma guia (0, 0,25, 0,5, 1,2, 3, 4, ou 8 vezes MIC). O controle negativo recebeu 2% de DMSO, o que representou a concentração final de DMSO em cada ensaio. Após uma exposição de 30 min ao fármaco, as células foram sedimentadas através de centrifugação e o sobrenadante foi analisado para a presença de ATP. Os resultados foram expressos como a concentração de ATP liberada para o meio (μM).
Resultados
[00247] Determinou-se, anteriormente, a MIC para NCL812 como sendo de 4 μg/mL. O ensaio de liberação de ATP é realizado por meio de crescimento de S. aureus até a fase exponencial e, então, adicionando a droga em múltiplos da MIC numa tentativa de detectar uma resposta dependente da dose.
[00248] Conforme mostrado na Figura 8 a ATP liberada de polimixina B de controle positivo a partir das células de S. aureus de uma forma dependente da dose com liberação máxima de aproxidamente 0,34 μM de ATP em 8 vezes MIC (256 μg/mL). Liberação de ATP na presença de NCL812 foi dependente da dose em 0,5 - 1 vezes MIC, resultando na liberação máxima (0,33 μM) observada em MIC (4 μg/ml). A liberação de ATP na verdade diminuiu depois de 2 a 8 vezes a MIC. Deve ser observado que em estudos anteriores, a precipitação de NCL812 foi observada em 4 a 8 vezes MIC em Mueller Hinton broth II.
[00249] Em resumo, NCL812 demonstrou liberação dependente da dose de ATP a partir as células de S. aureus crescendo ativamente. A liberação de ATP a partir das células para o meio de crescimento chegou a níveis máximos no valor de MIC, e isso foi seguido por uma diminuição na liberação de ATP em doses mais elevadas. Os dados indicaram que NCL812 podem interagir com a membrana celular de S. aureus, provocando fugas de metabolitos vitais, tais como ATP.
EXEMPLO 4: In vitro atividade antibacteriana de NCL812 contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina e sensível à meticilina. Materiais e Métodos Agentes antimicrobianos
[00250] As alíquotas da solução stock de NCL812 (25,6 mg/ml) foram preparadas em DMSO, armazenadas a -80 °C e descongeladas imediatamente antes do uso. Stock ampicilina foi obtida a partir de Sigma-Aldrich (Austrália). Discos antimicrobianos foram obtidos junto à Thermo Fisher Scientific (Austrália).
Microrganismos
[00251] Isolados clínicos de MRSA que representavam os tipos de seqüência mais comuns de MRSA tanto adquirida em hospital (HA) quanto associada à comunidade (CA) na Austrália foram obtidos e estão descritos na Tabela 8 abaixo. O organismo de controle de S. aureus ATCC 49775 foi usado. A identificação de isolato foi confirmada por metodologias fenotípicas convencionais, incluindo o teste de coagulase em lâmina, teste de Vogues-Proskauer, sensibilidade a polimixina B (300 unidades), e aglutinação em lâmina de látex Staphytect Plus Protein A (Thermo Fisher Scientific Australia). As bactérias foram armazenadas a -80°C em 40% de caldo de glicerol e rotineiramente cultivadas a partir de estoque em agar com sangue de ovelha (SBA) incubadas a 37°C. Em experiências subsequentes, apenas culturas frescas <24 h foram usadas.
Tabela 8: Staphylococcus aureus nome de clone/isolado, tipo, origem, antibiograma, estado de resistência à clindamicina, tipo de seqüência multi-locus (MLST), tipo de cromossomo de cassete estafilocócica (SCCmec), complexo clonal, estado leucocidina Panton-Valentine (PVL), e tipo de spa para os isolados usados de acordo com o exemplo 4.
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MSSA; S. aureussensível à meticilina. HA-MRSA; S. aureusresistente à meticilina adquirida de hospital. CA-MRSA; S. aureusresistente à meticilina associada à comunidade. Em; Eritromicina. Ci; Ciprofloxacina. Gn; Gentamicina. Tm; Trimetoprima. Te; Tetraciclina. FA; Ácido Fusídico. Rf; Rifampicina. Mp; Mupirocina
Resistotipagem de isolado
[00252] A criação de perfil de susceptibilidade a antibiótico da coleta de isolado foi realizado utilizando-se difusão em disco de Kirby-Bauer, conforme recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) em agar de Mueller-Hinton. Os isolados foram cultivados durante a noite em SBA a 37°C. As colónias foram suspensas em solução salina fisiológica. A turbidez foi ajustado para um padrão McFarland de 0,5 e as suspensões foram espalhados sobre o meio. Os discos de antibiótico de acordo com a Tabela 9 foram transferidos para o meio inoculado e analisados após 24 h de incubação a 37°C. Os isolados rotulado como MRSA que não foram resistentes a β-lactama na base do teste de Kirby-Bauer foram cultivados a partir de estoque em contagem de placa suplementada com agar com 5 μg/ml de ampicilina e submetidos ao tese de repetição, conforme a expressão de PBP2a pode ser induzida por exposição a agentes antimicrobianos β-lactama.
Tabela 9: Tamanhos interpretativos do diâmetro da zona de agente antibacteriano para a difusão em disco Kirby-Bauer, como usado no Exemplo 4
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A detecção molecular da proteína A e os genes mecA para confirmar o estado de MRSA
[00253] As identidades de isolado foram confirmadas de maneira genotípica usando um teste de reação em cadeia da polimerase duplex (PCR) alvejando os genes spa (proteína A) emecA (resistência à meticilina). Além disso, os isolados foram testados em um Sybr green PCR em tempo real mecA espa . Aproximadamente dez colônias de cada subcultura bacteriana durante a noite foram suspensas em 1 χ solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) e submetidas a vórtices. Os isolados foram sujeitos a extração de DNA usando o QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Austrália) seguindo os protocolos de fabricante. O model de DNA foi eluído em 50 μl de tampão de eluição e ou usado diretamente em PCR, ou armazenado a -20 °C antes da amplificação de DNA que usa os iniciadores spa diretos (5-TGATACAGTAAATGACATTG-3') e reversos (5'-TTCTTATCAACAACAAGTTC-3') iniciadores e mecA diretos (5'-TTCGTGTCTTTTAATAAGTGAGG-3') e reversos (5'- ATGAAGTGGTAAATGGTAATATCG-3') iniciadores (Invitrogen, Austrália). A amplificação de PCR convencional foi realizada em um volume de 20 μl contendo 10 μl HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, Austrália), 0,5 μΜ de cada iniciador spa 0,2 μΜ de cada iniciador mecA e 3 μΙ de DNA extraído. Um termociclador automatizado (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad) foi usado para amplificação por PCR dos genes spa e mecA de acordo com as seguintes condições: Estágio PCR (ativação da enzima a 95 °C durante 300 s, seguido de 38 rodadas de amplificação de 94 °C por 30 s (desnaturação), 50 °C por 30 s (recozimento) e 72 °C por 38 s (extensão) e depois uma fase de arrefecimento de 20 °C até necessário); Estágio PCR em tempo real (ativação da enzima a 95 °C durante 300 s, seguido de 40 rodadas de amplificação de 95 °C por 15 s (desnaturação), 50 °C durante 20 s (recozimento) e 70 °C por 40 s (extensão), uma única rodada a 95 °C durante 5 s, uma única rodada a 55 °C durante 20 s, curva de fusão contínua de 95 °C a 0 °C e um período de arrefecimento de 40 °C por 30 s. Os produtos amplificados de mecA e spa de 325 e 120 pb, respectivamente, foram detectados por coloração com GelRed seguido de electroforese em géis de agarose de 2%.
Teste de concentração inibitória mínima
[00254] As atividades in vitro de NCL812, e ampicilina como um controle positivo, foram determinadas por microdiluição de caldo como recomendado pelo CLSI em caldo de Mueller-Hinton II ajustado por cátion. As placas de microtitulação contendo duas vezes de diluições de cada agente antimicrobiano foram inoculados com ~105 CFU/ml de cada isolado, em um volume final de 100 μl. As placas foram incubadas durante 24 h a 37 °C. A turbidez (absorvância a OD600) foi medida utilizando um espectrofotômetro de microplaca Bio-Rad Benchmark Plus em Microplate Manager® versão 5.2.1 (Bio-Rad). Os pontos de viragem de concentração inibidora mínima (MIC) foram definidos conforme a concentração mais baixa antimicrobiana avaliada pelo espectrofotômetro que inibiu o crescimento bacteriano. ATCC 49775 foi incluído na coleta de isolado como um organismo de controle usando pontos de interrupção definidos pelo CLSI. MIC50, MIC90 (concentrações que inibiram o crescimento de menos de 50% e 90% dos organismos totais, respectivamente) e a faixa de MIC (mínimo e máximo) foram calculadas para o perfil de susceptibilidade antimicrobiana da coleta de isolado.
Atividade bactericida
[00255] A atividade bactericida NCL812 foi estabelecida através da determinação da concentração bactericida mínima (MBC) e análises de tempo de eliminação usando as diretrizes do CLSI. A MBC foi definida como a concentração mais baixa do fármaco na qual 99,95% do inoculo original foi eliminado.
[00256] Os ensaios de tempo de eliminação para ATCC 49775 foram realizados em caldo de Mueller-Hinton II ajustado para cátion em placas de microtitulação e, novamente, em 10 ml de volumes para os ensaios de macrodiluição em concentrações antimicrobianas equivalentes a 1× e 4× da MIC. A atividade bactericida nos ensaios de macrodiluição foi identificada como uma redução de 3 log10 do tamanho do inoculo inicial. As bactérias foram cultivadas durante a noite a 37 °C em SBA. As colônias foram suspensas em caldo e a turbidez foi ajustada a um padrão McFarland de 0,5 para obter uma suspensão bacteriana de ~105 CFU/ml. As suspensões bacterianas foram incubadas a 37 °C com agitação. As alíquotas foram removidas 0, 1, 2, 4, 8, 12, e 24 h após a adição antimicrobiana, diluídas, plaqueadas em SBA e incubadas durante 48 h a 37 °C para determinação da contagem viável. As curvas de crescimento de turbidimétricas para S. aureus foram obtidas para os ensaios de placa de microtitulação através de monitorização das alterações da densidade óptica utilizando um espectrofotômetro de microplaca de Bio-Rad Benchmark Plus a 600 nm. As densidades ópticas foram medidas 0, 1, 2, 4, 8, 12, e 24 h após a adição antimicrobiana.
Metodologia estatística
[00257] Os dados microbiológicos foram interpretados usando as diretrizes do CLSI. Os dados foram examinados usando o teste t de Student, teste exato de Fisher, análise de variância e um modelo linear generalizado para os testes de efeitos entre indivíduos onde apropriado. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 0,05 no IBM SPSS® versão 19.0.
Resultados Confirmação da identidade de Staphylococcus aureus e Estado de mecA
[00258] Testes de aglutinação de látex confirmaram que todos os 30 isolados eram proteína A positiva. Os isolados testaram positivo para a atividade coagulase usando aglutinação. Os testes de resistência de Voges-Proskauer e polimixina B confirmaram que todos os isolados eram S. aureus exceto para um único isolado sensível à meticilina; MSSA DE-25, como mostrado na Tabela 10 abaixo. Com base na amplificação de PCR de gene spa , esse isolado não foi identificado como um isolado de S. aureus apesar de testar positivo na aglutinação em látex de proteína A e testes de coagulase em lâmina. Esta Staphylococcus spp. de origem canina foi identificada como Staphylococcus pseudintermedius com base nas características bioquímicas. Os resultados de PCR em tempo real e convencionais de mecA confirmaram que 66,66% dos isolados foram classificados como resistentes à meticilina com base na possessão do gene mecA. Não houve diferenças significativas entre a capacidade de PCR convencional e em tempo real para detectar o gene mecA (P>0,05).
Tabela 10: Percentagem de presuntivamente identificado S. aureus relatórios isolados positivos para fenotípico selecionado e ensaios genotípicos de acordo com o Exemplo 4.
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HA-MRSA; S. aureus adquirida em hospital. CA-MRSA; S. aureus associada à comunidade. S. aureus isolados foram identificados como testes positivos para a proteína A aglutinação do látex (proteína A), deslize coagulase, Voges-Proskauer e testes de resistência à polimixina B, bem como um teste positivo para a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e em tempo real da amplificação por PCR do gene spa. Os isolados de S. aureus resistentes à meticilina foram identificados como isolados de teste positivo com os critérios descritos acima, bem como positivo para PCR e PCR em tempo real do gene mecA.
Tabela 11 A resistência dos isolados de S. aureus para agentes antibacterianos, utilizando o método de difusão em disco de Kirby-Bauer de acordo com o Exemplo 4.
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HA-MRSA; S. aureusresistente à meticilina adquirida de hospital. CA-MRSA; S. aureusresistente à meticilina associada à comunidade.
Perfis de susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus aureus
[00259] Os ensaios de susceptibilidade antimicrobiana revelou que isolados de HA-MRSA teve a maior prevalência média da resistência a múltiplas classes de antimicrobianos (P<0,000). Os isolados de CA-MRSA eram os mais resistentes em seguida (P <0,007), seguido por staphylococci sensível à meticilina (P <0,037), como mostrado na Tabela 11 acima. A resistência à oxacilina foi expressa em apenas 80,00% e 10,00% dos isolados de HA-MRSA e CA-MRSA, respectivamente. A resistência á cefotetano foi expressa em 80,00% e 20,00% dos isolados de HA-MRSA e CA-MRSA, respectivamente. Embora oxacilina e cefotetano não diferiram de forma significativa na sua capacidade de detectarMRSA (P> 0,05), a detecção foi significativamente melhorada quando se usa PCR de mecA quando comparado com a difusão em disco (P<0,013). A maioria dos isolados de HA-MRSA expressaram resistência ao ácido amoxicilina-clavulânico, cefotetano, cefalexina, clindamicina, eritromicina, oxacilina, e penicilina-G, ao passo que a maioria dos CA-MRSA isolados eram resistentes a clindamicina, eritromicina, e penicilina-G . Nenhum dos isolados testados foram resistentes à vancomicina. No geral, os fenótipos de resistência mais prevalentes foram penicilina-G (83,33%), eritromicina (73,33%) e clindamicina (43,33%), enquanto apenas isolados sozinhos (3,33%) foram resistentes ao sulfametoxazol-trimetoprim e rifampicina.
interações complexas de gene mec
[00260] Todos os isolados de MRSA pertencentes ao complexo A de gene mec expressaram resistência ambos oxacilina e cefotetano, como mostrado na Tabela 12 abaixo. No entanto, apenas 20% de isolados de MRSA de complexo B de gene mec foram fenotipicamente resistentes a esses antimicrobianos. Dentre os isolados de MRSA pertencentes ao complexo C2 de gene mec apenas um único isolado de resistência à meticilina expressa a oxacilina e apenas dois isolados expressaram resistência ao cefotetano. Isolados de MRSA não classificada expressaram plena resistência à oxacilina e cefotetano.
Tabela 12: Número e porcentagem de complexos de genes mec identificados em 20 cepas de S. aureus classificadas como resistentes à meticilina de acordo com o exemplo 4
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Cromossoma respectiva da cassete estafilocócica (SCCmec) complexos e tipos que expressam resistência fenotípica à oxacilina e cefotetano são indicados, bem como em tempo real o status de mecA e o pico negativo médio de dF/dT obtidos a partir de análise de ponto de fusão de PCR em tempo real do gene mecA
[00261] Os picos de ponto de fusão para plot derivado de PCR em tempo real de mecA dF/dT diferiram entre complexo de gene mec (P<0,003) (Figura 9. Em média, os isolados de complexo B de gene, mec e os isolados não classificados demonstraram picos de ponto de fusão mais elevados que outros tipos de SCCmec (P<0,012).
As propriedades físicas dos antimicrobianos de teste e comparação dos resultados de concentração inibitória mínima de teste análogo inicial
[00262] Antimicrobianos de teste foram selecionados com base na solubilidade e atividade antimicrobiana a partir de estudos preliminares. Precipitados nebulosos foram observados quando ambos NCL812 foram dissolvidos em caldo ajustado para catião de Mueller-Hinton II, como mostrado na Tabela 13 abaixo. Depois dos testes da atividade de estrutura inicias em cada análogo sintetizado, encontrou-se que NCL812 tem valores de MIC consistentes no presente estudo.
Tabela 13: Características de NCL812 antibacteriano e a ampicilina antibacteriana de β-lactama de acordo com o Exemplo 4.
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Detalhando a solubilidade antibacteriana em dimetil-sulfóxido (DMSO), a solubilidade em caldo de Mueller-Hinton II ajustado para catiões (CAMHB), e as concentrações inibitórias mínimas médias (CIM) ^g/ml a 24 h) contra S. aureus resistente à meticilina (MRSA) determinadas a partir de estudos preliminares e os valores determinados durante este estudo. ATCC 49775; isolado de S. aureus resistentes à meticilina e cepa de controle ATCC. MRSA580; isolado de S. aureus resistente à meticilina #580. MRSA698; isolado de S. aureus resistente à meticilina #698
Atividade antibacteriana in vitro: concentrações inibitórias mínimas
[00263] Os valores MIC50 e MIC90 para o composto de chumbo NCL812 (4- e 4-8 pg/mL) estão indicados na Tabela 14 abaixo. Os valores de MIC diferiram através da classificação de S. aureus (suscetível, HA ou CA-MRSA) (P<0,005). Em muitos casos, NCL812 aumentou significativamente a atividade contra CA-MRSA e staphylococci suscetível a meticilina através de uma diluição quando comparado a HA-MRSA (P<0,002 e P<0,020, respectivamente), porém, não houve diferenças significativas entre os valores de MIC para staphylococci suscetível a meticilina e CA-MRSA (P> 0,05). Os valores de MIC de ampicilina obtidos para a cepa de controle de ATCC estavam dentro da faixa normal esperada na base das diretrizes do CLSl.
Tabela 14: In vitro das atividades do novo NCL812 antibacteriano e a ampicilina antibacteriana contra β-lactama S. aureus isolados clínicos de acordo com o Exemplo 4.
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HA-MRSA; S. aureus resistente à meticilina adquirida de hospital. CA-MRSA; S. aureusresistente à meticilina associada à comunidade. MIC; concentração inibitória mínima (μg/ml). MBC; concentração bactericida mínima (μg/ml). gama MIC/MBC; mínimo e máximo de MIC/MBC para todos os isolados. MIC/MBC50; MIC/MBC em que 50% dos isolados são inibidos. MIC/MBC90; MIC/MBC em que 90% dos isolados são inibidos
Atividade antibacteriana in vitro: concentrações bactericidas mínimas
[00264] Os MBCs determinados a partir de NCL812 foram equivalentes ao MIC para 93,33% e 83,33% de isolados S. aureus , respectivamente (Tabela 14). Em todos os casos restantes, MBCs foram uma diluição mais elevada. Para NCL812, MBCs variou de 2-8 μg/mL e 416 pg/mL, respectivamente.
Estudos de tempo de eliminação
[00265] Em comparação com a curva de crescimento turbidimétrico de ATCC 49775, nenhum crescimento bacteriano visível foi observado quando ATCC 49775 foi inoculado em caldo de Mueller Hinton II ajustado para cátion suplementado com NCL812 em 1× e 4× de MIC em ensaios de microdiluição (P<0,033 e P<0,038, respectivamente) (Figura 10).
[00266] Quando analisados em ensaios de macrodiluição de 10 mL, o caldo suplementado com antibióticos a 1× e 4× de MIC e inoculado com ATCC 49775 exibiu contagens viáveis significativamente reduzidas para ambas as concentrações de NCL812 quando em comparação ao controle de crescimento (0,000<P<0,008) (Figure 11). Além disso, os perfis de tempo de eliminiação de cada concentração de NCL812 não diferiram significativamente (P> 0,05). Ambas as concentrações permaneceram bactericidas até aproximadamente 8-12 h após a adição de agente antimicrobiano, em que foi observado o recrescimento bacteriano. Uma variação considerável na atividade de eliminação de NCL812 foi observada a partir de 8-24 h. Embora NCL812 não fosse mais bactericida por 24 h, as contagens viáveis observadas em 1* de MIC permaneceram significativamente mais baixas do que os obtidos do caldo não suplementado (P <0,046).
[00267] Em resumo, o exemplo apresentado acima demonstrou atividade bactericida através tanto contra staphylococci suscetíveis a meticilina como contra MRSA. Os valores de MIC e MBC foram consistentemente baixas em toda a seleção dos isolados (gama de MICgama 2-8 μg/mL). NCL812 manteve boa atividade antimicrobiana in vitro contra isolados de MRSA multirresistentes a fármacos comuns, incluindo a epidemia EMRSA-15 UK, EMRSA-16, e EMRSA-17, EMRSA-1 irlandês, EMRSA-3 AUS, HA-MRSA NY/JAPÃO epidêmico, e clones de CA-MRSA predominantes. NCL812 também foi ativo contra um isolado de S. pseudintermedius que foi originalmente identificado como uma cepa de S. aureus .
[00268] Os testes preliminares sugerem que NCL812 alveja a membrana celular de S. aureus causando liberação dependente da dose dos metabolitos vitais, como, por exemplo, ATP. O rompimento da proteínas ou bicamada de membrana bacteriana que são essenciais para a função da membrana na bactérias é um alvo para vários agentes antimicrobianos grandes que são ubíquos na natureza; incluindo glicolipidos, lipopéptidos, lipoproteínas, ácidos gordos, lípidos neutros, fosfolípidos e biosurfactantes. Embora NCL812 seja um composto sintético de massa molecular baixa (≤500 Da), parece exercer uma atividade bactericida de um modo semelhante a outros agentes antimicrobianos que têm como alvo a membrana da célula Gram-positiva, incluindo o daptomicina de agente antimicrobiano cíclico de lipodepsipeptídeo de alto peso molecular, ou o HT61 derivado das quinolonas de baixa massa molecular, cuja estrutura química não está disponível. Muitos desses agentes antibacterianos lipofílicos também não são eficazes contra microrganismos Gram-negativos devido à presença da membrana bicamada de lipídio externa, que contém os canais porina estreitas que reduzem a penetração de líquido de alguns compostos dentro da célula.
[00269] A insolubilidade do NCL812 até mesmo em baixas concentrações em meios microbiológicos pode refletir a natureza anfipática e oligomérica do presente agente antimicrobiano e sugere que a verdadeira MIC pode ser muito menor do que o observado, uma vez que é provável que se trata apenas de NCL812 na solução que é biologicamente ativo. Em estudos tempo de eliminação, NCL812 exerceu atividade bactericida in vitro rápida contra ATCC 49775. Mais uma vez, estes resultados são consistentes com um perfil de tempo de morte dos inibidores da função da membrana celular, tais como daptomicina e HT61.
[00270] É importante salientar, a aparente meia-vida in vitro curta desse agente antimicrobiano resultou no recrescimento bacteriano observado 12 h após a adição de agente antimicrobiano. Isso sugere que, se uma população bacteriana viável sobrevive à exposição inicial ao NCL812 antes da inativação do agente antimicrobiano, o recrescimento bacteriano irá ocorrer. O desenvolvimento de resistência a NCL812 nesses estudos foi excluída como bactérias de teste restante susceptíveis a NCL812 seguinte a coleta, lavagem e testes de MIC. Embora a meia-vida aparentemente curta in vitro de NCL812 possa ser uma característica desejável para futura aplicação in vivo , ela sugere que NCL812 deve ser administrado a cada 8 h em experiências de segurança e eficácia in vivo futuras para manter a concentração sistêmica adequada, embora fosse aparecer a partir do perfil de tempo de eliminação que a série de compostos de NCL são antimicrobianos dependentes da concentração em vez de dependente do tempo.
[00271] Para superar o fenótipo sensível à meticilina, estendendo o tempo de incubação de difusão em disco de 24 a 48 h compensa a desrepressão lenta do gene mecR . Embora os efeitos da incubação mais longa não foram examinadas, e o tamanho pequeno de amostra dos isolados de MRSA impediu uma investigação mais aprofundada nas interações complexas de mec ; técnicas genéticas foram de sensibilidade significativamente maior quando em comparação aos fenotípicos para a confirmação do estado de mecA dos isolados nesse estudo. Embora as técnicas genéticas não sejam sempre empregadas como um método de rotina para a detecção de MRSA, identificação de PCR em tempo real da presença do gene mecA em uma Staphylococcus spp. isolado continua sendo o padrão ouro de diagnóstico.
EXEMPLO 5: In vitro farmacodinâmica de um novo agente antimicrobiano para Streptococcus pneumoniae. Materiais e Métodos Susceptibilidade aos antimicrobianos pneumocócica Cepas pneumocócica e condições de crescimento
[00272] Vinte isolados pneumocócicos que compreenderam seis cepas caracterizadas de laboratório e 14 isolados clínicos foram objeto deste estudo (P9/6A, P21/3, WCH16/6A, WCH43/4, WCH46/4, WCH57/8, WCH77/5, WCH86/4, WCH89/7, WCH92/4, WCH137/6A, WCH158/19F, WCH184/19F e WCH211/11; cepa/sorotipo, respectivamente). Outros isolados utilizados neste exemplo foram os seguintes: A66.1/3 (Francis et al., 2001. Infect Immun. 69: 3350-2358); EF3030/19F (Briles et al., 2003 J. Infec. Diseases. 188:339-348); L82016/6B (Briles et al., 2000 Infect Immun. 68:796-800); TIGR4/4 (Tettlelin et al., 2001 Science 293:498-506); e WU2/3 (Briles et al., 1981 J. Exp Med. 153:694-705). Ver Tabela 15 abaixo para as características fenotípicas dos isolados utilizados neste estudo. A Coleção Nacional de Culturas de Tipo (NCTC) da cepa de controle D39 (Avery et al., 2010 Nature Reviews Microbiology 8: 260-271) foi utilizada como um controle de crescimento para todos os ensaios de MIC e MBC. Posteriormente, D39 foi designado para cinética de eliminação, ensaios de ponto de resistência e estudos de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), visto que é uma cepa de laboratório bem documentado com uma patogênesein vivo definida (Tabela 15) que exibiu MICs e MBCs de NCL812 consistentes.
Tabela 15: Isolados de pneumococos e sua descrição fenotípica de acordo com o Exemplo 5.
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ND = Não Determinado.
[00273] Para todos os ensaios in vitro , os isolados de pneumococos frescos foram cultivados durante a noite (O/N) em placas de agar de sangue de cavalo (HBA) (39 g/L de base de agar de sangue Columbia [Oxoid] 5% de [v/v] sangue desfibrinado de cavalo [Oxoid] a 37 °C com 5% de CO2 suplementado). O ágar de sangue Mueller-Hinton com 5% de sangue de carneiro desfibrinado (MHSBA Roseworthy Mídia and Blood Service) foi usado para análise de difusão em disco conforme dirigido pelas normas Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Os pneumococos foram rotineiramente cultivadas em calda que consiste em 4% de sangue de cavalo lisado (LHB) com Cation Adjusted Mueller Hinton Broth (CAHMB, [Difco]) a 37 °C, com 5% de CO2suplementado. O caldo de soro de cavalo (HSB, 10% (v/v) de soro de cavalo dador em caldo nutriente [10 g/L de peptona, 10 g/L Lab Lemco (Oxiod) e 5g/L de NaCl]) foi usado também em alguns ensaios de MIC. Os isolados foram armazenados em HSB a -80 ° C.
Estoque de antibióticos e reagentes
[00274] NCL812 foi fornecido na forma de pó seco. Um total de 256 mg foi dispensado em 10 ml de 100% de DMSO para fazer um stock estoque de 25,6 mg/ml, que foi, então, diluída 1:100 em CAHMB para produzir um estoque de trabalho final de 256 μg/ml. Pó seco de ampicilina foi de Sigma A0166. O estoque de 25,6 mg/ml original foi diluído em solução salina 1:100, 1:4, 1:20 e finalmente 01:16 em CAMHB para produzir um estoque de trabalho final de 0,18 μg/ml. A eritromicina foi adquirida da Sigma Aldrich e cloreto de colina foi de Roche Diagnostics. Vinte microlitros de 0,05 μg/ml de eritromicina foram diluídos 1:25 em 4,980 mL de CAMHB para render um estoque de trabalho final de 0,2 μg/ml. O cloreto de colina (0,5%) foi adicionado a 4% de LHB:CAMHB para ensaios cinéticos de eliminação específicos.
Definindo susceptibilidade antimicrobiano dos isolados de pneumocócica
[00275] A susceptibilidade de isolado para 12 antimicrobianos diferentes (Tabela 16) foi determinada pelos métodos de CLSI e European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Os agentes antimicrobianos foram selecionados com base nas orientações de CLSI e EUCAST. As suspensões bacterianas normalizadas foram espalhadas em MHSBA usando um cotonete estéril. Suspensões bacterianas de Streptococcus pneumoniae foram normalizadas para um OD600 entre 0,08 e 0,1 usando um espectrofotômetro e, então, diluída 1:20. As colonias bacterianas foram tomadas a partir de uma placa de agar de sangue de cavalo O/N. Para assegurar a pureza da suspensão bacteriana 1:20, 50 μL foram semeados de maneira espalhada no agar de sangue de cavalo e incubados O/N a 37 °C com 5% de CO2. A CFU foi calculada e comparada às contagens iniciais. Discos de antibióticos (adquirido da Sigma Aldrich) foram colocados utilizando um dispensador de disco (adquirido da Oxoid) de acordo com as normas CLSI. As placas de MHSBA foram incubadas durante 16 h - 24 h a 37 °C em 5% de CO2. As zonas de inibição total foram medidas em triplicado ao milímetro mais próximo utilizando uma régua no crescimento refletido em luz natural, e o modo foi representado como o diâmetro para cada isolado. Os isolados de pneumocócica foram classificados como sensível, intermediário (I) ou resistente (R) através das normas de CLSI e das faixas de controle de qualidade (QC) (Tabela 16).
Tabela 16: Antibacterianos utilizados para análise de difusão em disco com as normas interpretativas dos diâmetros da zona (mm) de acordo com o Exemplo 5.
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[00276] ° Os diâmetros de zona para outros agentes antimicrobianos além de Ciprofloxacina para S. pneumoniae foram determinados através das normas do CLSl.
* Os diâmetros de zona para susceptibilidade antimicrobiana de Ciprofloxacina Determinação de NCL812 MIC50, MIC90, gama de MIC e MBC50, MBC90, gama de MBC
[00277] MICs para NCL812 para todos os isolados listados na Tabela 15 foram determinadas através da medição de OD600 (espectrofotômetro Spectramax, Molecular Devices Corporation) como um indicador de crescimento bacteriano usando bandejas de microtítulo de 96 poços após a incubação durante 24 horas a 37°C em 5% de CO2. Diluições de Micro-caldo e bandejas de 96 poços são preparadas pelo seguinte método: 90μL de 4% de LHB: CAMHB é aliquotado em todas as cavidades usando uma pipeta multicanal. 90 μl de estoques antimicrobianos funcionais não foram diluídos em série através da bandeja por meio de uma diluição de 1:2. Os controles de caldo negativos e controle de diluição foram tomados em conta ao dispor de uma bandeja de 96 poços.] 10 μL de suspensão bacteriana foi, então, adicionada aos poços apropriados na bandeja de 96 poços. Os controles positivos (sem agente antimicrobiano), negativos (sem agente antimicrobiano ou bactérias) e de diluição negativa (um controle de diluição em série de agente antimicrobianos e de caldo) foram incluídos em cada ensaio. MBC e contagens de placas para ensaios cinéticos de eliminação foram determinadas por aliquotagem de 20 μL de cada poço da bandeja de microtitulação de 96 poços em HBA, e incubando a 37 °C com 5% de CO2. A MBC foi determinada por uma inibição de 99,95% de S. pneumoniae, levando em conta o fator de diluição. MICs e MBCs foram determinadas em quadruplicado e o modo foi tomado como o valor representativo. A gama de MIC50, MIC90 e MIC e a gama de MBC50, MBC90 e MBC foram determinadas de acordo com as normas de CLSI. MIC50 e MIC90, ou MBC50 e MBC90, são definidos pelas concentrações mais baixas que, quando todas as MICs e MBCs dos isolados estão dispostas do menor para o maior, inibiram 50 e 90 percentil da quantidade total dos isolados, respectivamente.
Os estudos de tempo de eliminação de diluição de micro-caldo com NCL812 usando cepa D39
[00278] As suspensões bacterianas foram adicionados em triplicado a uma bandeja de microtitulação de 96 poços contendo NCL812 com uma concentração inicial de 128 μg/ml e diluídas em série em 1:2, sequencialmente a uma concentração de 0,25 μg/ml. Os controles de diluição negativos foram subtraídos do valor médio de crescimento para se obter um indicador adequado da produção bacteriana geral. A bandeja de 96 poços foi incubada a 37 ° C em 5% de CO2 e OD600 realizada a leitura a cada 2 horas durante as primeiras 12 horas, seguido das últimas leituras a 24 e 48 h. Para suplementar ainda mais os dados, uma experiência separada na qual uma bandeja de 96 poços foi lida automaticamente em intervalos de meia hora usando um espectrofotômetro (espectrofotômetro Spectramax, Molecular Devices Corporation) durante 14 horas foi realizado para confirmar as tendências das curvas de crescimento observadas a partir dos estudos de diluição de micro-caldo originais.
Estudos de tempo de eliminação de MBC com NCL812 usando cepa D39
[00279] Os ensaios cinéticos de eliminação de MBC envolveram a preparação de três bandejas de 96 poços de microtítulo. Em pontos de tempo específicos, as aliquotas obtidas a partir dessas bandejas forneceram contagens viáveis após a incubação a 37 °C em 5% de CO2 em HBA, e a MBC foi determinada após 24 horas de crescimento.
Os estudos de tempo de eliminação de diluição de macro-caldo do D39 com NCL812
[00280] As suspensões bacterianas e estoques antibióticos funcionais foram preparados conforme descrito acima. [Para a preparação das diluições macro-caldo, tubos de 20 ml foram enchidos, cada um, com 9 ml de 4% de LHB:CAMHB. 9 ml de um estoque antimicrobiana funcional foi diluído por 1:2 quando adicionado a um dos tubos e, em seguida, diluído em série a partir de uma concentração decrescente do agente antimicrobiano. 1 mL de suspensão bacterianas, pneumoniae foi adicionada aos tubos adequados, incluindo o controle positivo. Os tubos foram incubados a 37 ° C com 5% de CO2 com a inclinação manual suave dos tubos tratados com NCL812 a cada 10 minutos para as primeiras 12 h. A cada 2-3 horas durante as primeiras 12 horas de crescimento e, então, em 24 horas e 48 horas, 50 μL de cada suspensão bacteriana foi plaqueada de forma espalhada em HBA e incubada a 37 °C com 5% de CO2 durante 16-24 h.]
[00281] Tabela 17 abaixo indica as concentrações utilizadas para cada antimicrobiana. As culturas foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 com a inclinação manual suave a cada 10 minutos para as primeiras 12 h. Contagens viáveis a partir de alíquotas de 50 uL de cada concentração foram lidas após incubação à temperatura de 37 °C em 5% de CO2 durante 24 h. O pH de cada amostra foi medido em pontos de tempo específicos usando as tiras indicadoras de pH. Crescimento confluente foi definido quando mais de 1000 colônias foram contadas por placa. Um efeito bactericida foi definido como uma redução de 1000 vezes (99,9%) da suspensão de células inicial, determinado a 24 horas para cada concentração.
Tabela 17: Concentrações de agente antibacteriano usadas em ensaios de diluição de macro-caldo de acordo com o Exemplo 5.
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Ponto do ensaio de resistência para NCL812
[00282] As diluições de macro-caldo foram preparadas tal como acima. As culturas de caldo da cepa D39 (10 ml) foram incubadas na presença de 2 μg/ml e 4 μg/ml de NCL812, e 0,022 μg/ml da Ampicilina durante 6 h a 37 °C em 5% de CO2. As amostras foram centrifugadas a uma força centrífuga relativa (RCF) de 101,45 x g durante 10 minutos e lavada em 50 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes para remover qualquer agente antimicrobiano residual e/ou produtos finais bacterianos e o meio. Bactérias lavadas foram ressuspensas e MICs foram realizados.
Efeito de NCL812 na ultra-estrutura de membrana de célula D39 Microscopia Eletrônica de Transmissão
[00283] A aparência morfológica e a análise morfométrica da membrana celular foi determinada usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As suspensões bacterianas e 10 ml de culturas do D39 foram preparados conforme anteriormente. As amostras foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 com a inclinação manual suave das culturas a cada 10 min. As culturas foram expostas a ambos 1 μg/ml, 4 μg/ml ou 16 μg/ml de NCL812 e colhidas em 6 ou 12 horas por centrifugação a 101,45 ×g durante 20 minutos e lavadas duas vezes em 50 mls de PBS. Os pontos de tempo críticos para o trabalho de TEM foram determinados mediante análise das tendências nas curvas de crescimento produzidas a partir dos estudos de cinéticas de eliminação. As amostras foram ressuspensas em PBS contendo 20% de glicerol e armazenadas a -80 °C até serem necessárias. Antes de fixação, 20% de glicerol foi removido por centrifugação e lavado em gelo três vezes em 50 mL de PBS.
[00284] As amostras foram fixadas usando protocolos modificados definidos por um estudo anterior que examinam a ultraestrutura da parede celular de S. pneumoniae (Hammerschmidt, S. et al. 2005. Infect Immun 73:4653-4667). Um processo de fixação de vermelho de ósmio de formaldeído com glutaraldeido rutênio com base em lisina-acetato envolvido na fixação dos peletes bacterianos com uma solução de tampão de cacodilato contendo 2% de formaldeído, 2,5% de glutaraldeido, 0,075% de vermelho de rutênio e 0,075 M de acetato de lisina durante 1 hora. Após a lavagem com tampão cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio três vezes, uma segunda fixação em solução tampão de cacodilato contendo 2% de formaldeído, 2,5% de glutaraldeido e 0,075% de vermelho de rutênio foi realizada durante 1,5 horas. As células foram subsequentemente lavadas três vezes com tampão de cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio e foram submetidas a uma fixação final em 1% de tetróxido de ósmio em cacodilato contendo 0,075% de vermelho de rutênio durante 1 h. As amostras foram, então, lavadas três vezes em tampão de cacodilato contendo apenas 0,075% de vermelho de rutênio.
[00285] As amostras foram lavadas e desidratadas utilizando uma série graduada de etanol (70, 90, 95 e 100%) por 10-20 min, duas vezes a cada etapa. As amostras foram infiltradas usando 50:50 de resina de LR White em etanol a 100% durante 1 hr, e subsequentemente lavada com 100% de resina de LR White durante 1 hr e deixou O/N em uma terceira mudança de 100% LR branco para assegurar a infiltração adequada de resina. As amostras foram em seguida embutidas na resina LR White fresca e incubadas a 50 °C durante 48 horas. As seções foram cortadas a 1 μm usando uma faca de vidro, coradas com azul de toluideno e visualizadas sob um microscópio de luz a 400x para identificar a presença de pneumococos coloridos. Pelo menos quatro seções ultra-finas foram, então, cortadas a 90 nm usando uma faca de diamante e colocadas em grades de matriz, uma seção por grade. As seções ultra-finas foram, então, coloridas com acetato de uranilo e citrato de chumbo alternativamente em intervalos de 5 min, seguido de três lavagens com água destilada entre cada exposição. As seções coloridas foram depois colocadas em grades e visualizadas entre 25000x e 130000x em um Philips CM100 Transmission Electron Microscope. As imagens foram obtidas com uma ampliação de 130000 vezes e analisadas usando analySIS [Olympus Soft Imaging Systems].
Análise estatística
[00286] As análises estatísticas foram realizadas utilizando programa de estatísticas GraphPad Prism (5th ed, GraphPad Software Inc.) para Windows. Para curvas de crescimento, os dados apresentados foram a média e o erro padrão da média (SEM) (representada como barras de erro) para cada ponto dos dados exceto para os estudos de diluição macro-caldo onde várias repetições não poderiam ser obtidas, devido aos altos custos envolvidos nesse ensaio . Testes t-desemparelhados de calda dupla foram realizados.
Resultados Farmacodinâmica do NCL812 em S. pneumoniae A analise de disgusão em disco de controle de qualidade para 20 isolados de S. pneumoniae
[00287] Apesar de nove dos doze antimicrobianos utilizados para análise de difusão em disco tenham faixas de QC estabelecidas através de EUCAST, as faixas de QC não foram definidas para amoxicilina-clavulanato, claritromicina e clindamicina (Tabela 18 e Tabela 19). WCH16 e WCH184 foram resistentes a pelo menos dois antimicrobianos, enquanto que EF3030 e WCH137 foram intermediários e resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol, respectivamente (Tabela 19). Os outros dezesseis isolados restantes foram sensíveis a todos os doze antimicrobianos. A sensibilidade à ampicilina foi confirmada para cada isolado, permitindo o uso de ampicilina como um controle positivo em ensaios de diluição de micro-caldo posteriores
(Tabela 18).
Tabela 18: Susceptibilidade antibacteriana de 20 isolados de S. pneumoniae para seis antibacterianos
diferentes de acordo com o Exemplo 5.
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Células azuis representam isolados sensíveis; células laranja representam isolados (I) intermediários; células verdes representam isolados (R) resistentes.
Tabela 19: Susceptibilidade antibacteriana de 20 isolados de S. pneumoniae para seis antibacterianos diferentes de acordo com o Exemplo 5.
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Células azuis representam isolados sensíveis; células laranja representam isolados (I) intermediários; células verdes representam isolados (R) resistentes.
Solubilidade e atividade de NCL812 e NCL062 em diferentes mídias
[00288] NCL812 visualmente parecia ter maior solubilidade em DMSO a 100% em comparação com NCL062 e só desenvolveu turbidez quando foi adicionalmente diluída em CAMHB ou PBS (Tabela 20). Embora um diluente de CAMHB para NCL062 parecia ser transparente por inspeção visual (Tabela 20), outros estudos sobre NCL062 com um diluente de CAMHB resultou em confluência completa em ensaios de diluição em micro-caldo para seis isolados de S. pneumoniae em comparação com o crescimento com os diluentes de DMSO (Tabela 21 e Tabela 22).
Tabela 20: A análise visual de NCL812 e NCL062 e a solubilidade de ampicilina de acordo com o Exemplo 5.
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Tabela 21: MICs individuais de cada isolado para NCL062 pneumocócica acordo com o Exemplo 5
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Tabela 22: A diferença na atividade de NCL812 e NCL062 em diferentes meios utilizando a diluição de micro-caldo para se obter um MIC como um preditor de acordo com o Exemplo 5.
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[00289] Crescimento da cepa D39 de S. pneumoniae em um ensaio MIC para NCL812 usando 10% de HSB (220 mls de soro de cavalo é filtrado a 10% em 180mls de caldo nutriente de Lemco), resultou em um aumento de três vezes na MIC para D39 tratada com NCL812 e NCL062 (Tabela 23) com um aumento de duas vezes para a ampicilina positiva controle. Não houve nenhuma alteração notável na MIC para D39 com diferentes condições de armazenamento das bandejas de microtitulação de 96 poços pré-preparadas (Tabela 24). Durante as diluições macro-caldo, o pH do meio não se alterou em comparação aos controles apropriados (Figura 12).
Tabela 23: Crescimento da cepa D39 de S. pneumoniae em um ensaio MIC para NCL812 e NCL062 usando caldo complementado por soro de cavalo
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[00290] Tabela 24: Armazenamento de bandejas de microtitulação preparadas para diluição de micro-caldo não altera MIC de D39 de acordo com o Exemplo 5.
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Determinação de sensibilidade de S. pneumoniae in vitro ao NCL812 e NCL062 Determinação da faixa de MIC de NCL812 e NCL06250, MIC90, MIC
[00291] NCL812 exibiu um MIC50 e MIC90 MIC90 de 8 mcg/mL e faixa de MIC de 4-8 μg/mL ao passo que para NCL062 estes valores foram maiores e mais variáveis (Tabela 25 e Tabela 26). A MIC para ampicilina foi comparável com os resultados publicados recentes usando diluição de micro-caldo como um ponto final para a resistência antimicrobiana em isolados pneumocócicos, confirmando, assim, a precisão das MICs obtidas para NCL812 e NCL062 (Tabelas 25 a 26 e Figura 13).
Tabela 25: Faixa de MIC50, MIC90, MBC50, MBC90 e MIC para todos os isolados tratados com NCL812, NCL062, e ampicilina de acordo com o Exemplo 5.
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Tabela 26: MICs de NCL812 de cada isolado pneumocócico de acordo com o Exemplo 5.
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Determinação da faixa NCL812 e NCL062 MBC50, MBC90, MBC
[00292] Concentrações bactericidas mínimas (CBM50, MBC90 e faixa MBC respectivamente) foram determinadas para NCL812 e ampicilina para todos os vinte isolados (Tabelas 25 a Tabela 26). A faixa MBC50, MBC90, e MBC foi menor e mais consistente para NCL812 comparado com NCL062 (Tabela 25).
Tempo de diluição de micro-caldo matam estudos de D39 tratado com NCL812 e NCL062
[00293] D39 exposta à concentrações sub-inibitórias (≤ 2 μg/ml) de NCL812 ou NCL062 cresceu de forma semelhante aos controles não expostos em um período de 48 h (Figura 13 e 14. Concentrações mais elevadas de NCL812 e NCL062 (≥ 16 μg/ml) resultaram em não crescimento bacteriano durante 48 h (Figura 14 e 15. Estas características de crescimento foram validadas por um estudo cinético de micro-caldo utilizando um espectrofotômetro Spectramax, que mede o crescimento (representado como OD600) em intervalos de meia-hora a 14 h para NCL812, NCL062 e ampicilina (Figuras 15 a 17. Houve uma diferença aproximada de seis horas entre o início do crescimento exponencial para D39 tratada com NCL812 e D39 tratada com NCL062 (Figuras 13, 14, 18 e 19).
[00294] O crescimento de D39 tratada com NCL812 ou NCL062 foi comparado com D39 tratada com ampicilina ou eritromicina em período de 48 h (Figuras 20 e 21). D39 tratada com ampicilina apresentou crescimento semelhante a D39 exposto a NCL812 ou NCL062 em período de 48 h (Figura 20). D39 tratado com eritromicina produziu muitas curvas de crescimento diferentes de NCL812 e NCL062 onde foi observado uma maior diferença no crescimento entre as concentrações (Figura 21). A adição de 5% de cloreto de colina aos meios em um período de 48 h resultou em nenhuma diferença significativa no crescimento de NCL812 e NCL062 comparado com os controles positivos e de crescimento (Figuras 22 a 26).
Ponto de testes de resistência
[00295] D39 tratada com ≤4 μg/mL NCL812 entrou numa fase logarítmica de crescimento em 6 h (Figura 13 e 18), conforme mostrado em quatro experiências independentes. A possibilidade de resistência antimicrobiana a NCL812 entre 5 e 6 h, foi investigada determinando ainda MICs em D39 expostos a 2 μg/mL de NCL812, 4 μg/mL de NCL812 e 0,0225 μg/mL de ampicilina, durante 6 h. Os resultados mostraram um aumento significativo na MIC para todas as amostras de D39 expostas ao NCL812 comparado com os controles de crescimento e ampicilina (Tabela 27).
Tabela 27: MICs de D39 expostas a 2 μg/mL ou 4 μg/mL de NCL812 durante 6 horas de acordo com o Exemplo 5.
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* Controle do crescimento de D39: Cepa de ò. pneumoniae D39 cresceu por 6 horas em 4% LHB: CAMHB.
** Controle do crescimento 2 de D39: Cepa de S. pneumoniae D39 em HBA O/N, ressuspensos em solução salina (0,1 OD600) e diluído 1/20 em solução salina estéril.
Diluições de micro-caldo por medição de MBC relativa em pontos de tempo específicos
[00296] MBCs relativos foram determinados em intervalos de tempo específicos a partir de ensaios de diluição em caldo incubados durante 48 h para NCL812 e NCL062 (Figura 27) e ampicilina e eritromicina antimicrobianas de controle (As Figuras 20 e 21). Foram determinadas MICs de ampicilina e eritromicina para D39 (Tabelas 26 e 28). As características comparativas do crescimento de ampicilina, e a eritromicina são descritas (Figuras 28 e 29). Ampicilina e eritromicina demonstraram uma redução dependente de tempo em bactérias. NCL062 exibiu rápida ação bactericida, com uma imediata (dentro do primeiro 10 min de administração) MBC de 8 μg/mL (Figura 27). Embora houvesse inconsistências nos MBCs para NCL062 entre 5 e 12 h, NCL062 manteve uma constante concentração bactericida (4 μg/mL) entre 24 e 48 h. NCL812 exibiu rápida ação bactericida, evidenciada por uma diminuição de aproximadamente 3 vezes em MBC dentro de 5 h (Figura 27). Uma concentração bactericida consistente (8 μg/ml) foi mantida durante 48 h para NCL812.
[00297] Tabela 28: MIC e MBC para eritromicina com D39 de acordo com o Exemplo 5.
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Estudos time-kill de diluição de macro-caldo de D39 com NCL812 e NCL062
[00298] Contagens viáveis para cada ponto de tempo foram representadas como uma redução de log10 CFU/mL para NCL812 (Figura 30) e ampicilina (Figura 31). Foi observado um crescimento confluente consistente (determinado por um limite de 2×104 CFU) para os controles não expostos e 2 μg/mL NCL812. Foi observada atividade bactericida completa (definida por uma redução de 3log10 em CFU) para 128 μg/mL de NCL812 por uma redução de 4log10 de CFU em 3 h e concentrações de 16 μg/mL e 64 μg/mL NCL812 foram eficazes ao eliminar o crescimento bacteriano dentro de 8 horas (Figura 30). NCL812 em 4 μg/mL e 8 μg/mL parecia estar inativado em 11 h após a exposição, conforme o aumento do crescimento da cepa de D39 após este ponto de tempo observado (Figura 20 e 31). As contagens viáveis da cepa de D39 tratadas com ampicilina demonstrou consistência para este ensaio especial, mostrando uma constante diminuição na mortandade dependente do tempo por 48 h (Figura 31).
Microscopia eletrônica de transmissão
[00299] A análise morfométrica revelou mudanças significativas na membrana celular na cepa de D39 exposta a 16 μg/mL de NCL812 por 6 h em comparação aos controles de crescimento. As amostras tratadas com 4 μg/ml, bem como culturas de 12 h não foram consideradas para análise morfométrica devido à falta de células bacterianas disponíveis em cada seção. As amostras tratadas possuíam membranas celulares significativamente mais espessas (6,43 ± 0,29 nm) em comparação com asamostras não tratadas (4,35 ± 0,24 nm) (p <0,0001) (Figuras 32 e 29). O espaço periplásmico (espaço intracelular entre a membrana celular e a parede celular) de D39 tratada com 16 μg/ml NCL812 foi significativamente mais larga (4,54 ± 0,096 nm) em comparação com asamostras não tratadas (3,91 ± 0,14 nm) (p <0,001) (Figuras 29 e 33).
[00300] Tabela 29: Estudos morfométricos sobre ultra estruturas de D39 tratadaa com NCL812 durante 6 horas de acordo com o Exemplo 5.
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[00301] Em resumo, NCL812 produziu MICs altamente consistentes e MBCs equivalentes para a coleta de cepas de S. pneumoniae, confirmando que é bactericida contra este organismo.. Em experimentos cinéticos de morte, os quais mediram o MBC relativo por um período de 48 h, chegou-se ao um efeito bactericida consistente na D39 após 6 h de exposição inicial ao NCL812.
[00302] Esta demonstração de atividade bactericida é o primeiro a ser observado na S. pneumoniae. Isto demonstra que o NCL812 é eficaz contra a pneumocócica in vitro.
[00303] Ligação competitiva entre os componentes no sangue, soro ou caldo diminuiu a atividade antimicrobiana do NCL. Isso se refletiu no aumento da MIC observada entre diferentes tipos de caldo e diluentes. Após a conclusão desses estudos, pesquisa independente recente confirmou precipitação de NCL812 em PBS e relatou completa solubilidade em água contendo 4% de DMSO, após diluição inicial em 100% de DMSO. A NCL812 solúvel em água irá melhorar significativamente in vivo a biodisponibilidade e interação negativa entre as proteínas do sangue ou soro.
[00304] Com base nas conclusões deste estudo, NCL812 exibe um mecanismo de ação contra S. pneumoniae que é diferente das classes de β-lactamas ou macrolídeos, conforme aparenta exibir atividade bactericida dependente da concentração em oposição às qualidades dependentes do tempo.. Identificar a concentração sérica farmacocinética máxima do NCL812 in vivo auxiliará a confirmação de sua atividade farmacodinâmica dependente da concentração. Além disso, a adição de cloreto de colina no meio confirmou que o mecanismo de ação para NCL não está associado à afinidade em relação a proteínas de ligação de colina de parede celular e, portanto, não pode se associar à parede celular.
[00305] A análise morfométrica da membrana celular e do espaço periplasmático de D39 tratado com 16 μg/ml de NCL812 durante 6 horas mostrou que a membrana celular e o espaço periplasmático foi maior em amostras tratadas, em comparação com as amostras de controle. O aumento aparente no tamanho da membrana pode ser devido a uma acumulação do material intracelular denso de elétrons abaixo da membrana celular. O aumento no tamanho do espaço periplasmático pode ter sido devido a uma ruptura da membrana celular, potencialmente pela despolarização ou inibição de ATP. O mecanismo de ação de NCL812 pode não ser dependente de cálcio, como parece que nenhuma ligação competitiva entre NCL812 e vermelho de rutênio, um inibidor de canais de cálcio das bicamadas lipídicas, foi observada em micrografias eletrônicas.
[00306] Concluindo, este estudo in vitro demonstrou que o NCL812 tem mais características desejáveis como um antimicrobiano bactericida dependente de concentração de ação rápida que parece ter como alvo a membrana celular de S. pneumoniae. Essas características são desejáveis para o tratamento de infecções agudas por pneumococos. Como o NCL812 pode possuir um mecanismo de ação que tem como alvo a membrana celular, atuará muito mais rapidamente do que os agentes antimicrobianos dependentes do tempo, como as β-lactamas e os macrolídeos e, potencialmente, poderiam ser mais eficazes do que outros agentes antimicrobianos dependentes da concentração bactericida tais como fluoroquinolonas que têm alvos intracelulares.
EXEMPLO 6: Caracterização de isolados resistentes à meticilina e sensíveis à meticilina do Staphylococcus pseudintermedius da Austrália e de eficácia preliminar in vitro de um novo composto anti-estafilocócico Materiais e Métodos Coleta e identificação da amostra do Staphylococcus pseudintermedius sensível à meticilina (MSSP) e Staphylococcus pseudintermedius resistente à meticilina (RMSP)
[00307] Um total de 23 isolados de Staphylococcus pseudintermedius foram obtidos a partir de cães (Table 30).
Tabela 30: Isolados de Staphylococcus pseudintermedius testados de acordo com o Exemplo 6.
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[00308] Foram coletadas para estudo dez Staphylococcus pseudintermedius sensíveis à meticilina e 13 resistentes à meticilina. Os isolados foram classificados fenotipicamente como resistentes à meticilina com base na resistência in vitro à oxacilina e geneticamente para a presença dos genes mecA de acordo com o procedimentos padrão.
[00309] Foram realizados testes de susceptibilidade de oxacilina e cefoxitina com uso da técnica de difusão em disco e testes epsilométricos. A identificação do gene mecA foi realizada utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR)
[00310] Foram realizados testes de suscetibilidade de difusão em disco CLSI em 23 isolados de Sp. para os seguintes agentes antimicrobianos: penicilina, amoxicilina, eritromicina, gentamicina, clindamicina, ciprofloxacina, cefalexina, cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina, vancomicina, cefotetano, moxifloxacina e rifampicina.
[00311] Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (MIC) e de concentração bactericida mínima (MBC) utilizando uma metodologia CLSI para NCL812, que também incluiu ampicilina como um controle. Foram então testados compostos anti-estafilocócicos contra todos os 23 isolados, e as concentrações inibitórias mínimas (MIC) foram determinadas de acordo com protocolos padrão. Após as MICs serem determinadas, foram realizadas concentrações mínimas bactericidas para determinar se esses compostos são bacteriostáticos ou bactericidas.
Resultados
[00312] O gene mecA estava presente em 13 isolados de MRSP e negativa em 10 MSSP (Tabelas 30 e 31). Todos os isolados MRSP eram resistentes à oxacilina baseado na difusão em disco (<17 mm) e E-test MIC (≥0,5 mg/L).
Tabela 31: Isolados de Staphylococcus pseudintermedius testados de acordo com o Exemplo 6.
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[00313] Quando o ponto de ruptura da resistência à cefoxitina foi fixado em <24 mm, 3/13 (23%) e 5/13 (38%) do MRSP testado foram respectivamente suscetíveis à cefoxitina. Quando o ponto de ruptura de resistência à cefoxitina foi fixado em <30 mm, apenas 1/13 (7,7%) do MRSP testado foi suscetível (Tabelas 30 e 31).
[00314] Os isolados de MRSP foram resistentes à múltiplas classes de antibióticos. Dentre os 13 isolados de MRSP, todos os 13 foram sensíveis à rifampicina. 3/13 (23%) foram sensíveis ao cloranfenicol; 10/13 (77%) foi sensíveis à vancomicina (Tabelas 30 e 31).
[00315] Curiosamente, 3/13 (23%) dos isolados de MRSP foram sensíveis à amoxicilina; 8/13 (62%) foram sensíveis à cefalotina; 12/13 (92%) sensíveis ao cefotetano e 12/13 (92%) sensíveis à moxifloxacina (Tabelas 30 e 31).
[00316] Todos os 23 isolados foram sensíveis ao NCL812 com base nas MICs. Além disso, o NCL812 mostrou-se ser bactericida com base nas concentrações bactericidas mínimas (MBC).
[00317] Constatou-se que a faixa de MIC do NCL812 contra isolados de Staphylococcus pseudintermedius está entre 1 μg/mL e 4 μg/mL (Tabela 32). Constatou-se que a MIC50 e MIC90 do NCL812 contra os isolados de Staphylococcus pseudintermedius ser 2 pg/mL e 4 pg/mL, respectivamente (Tabela 33). Constatou-se que o modo MIC e faixa de MIC de NCL812 contra os isolados de Staphylococcus pseudintermedius são 2 μg/ml e 1-4 μg/ml respectivamente (Tabela 33).
Tabela 32: MICs de NCL812 e ampicilina contra os isolados de Staphylococcus pseudintermediusde acordo com o Exemplo 6.
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Tabela 33: MIC50, MIC90, o modo MIC, MIC uma faixa de NCL812 contra isolados de Staphylococcus pseudintermedius de acordo com o Exemplo 6.
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[00318] Staphylococcus pseudintermedius resistente à meticilina (MRSP) são um problema emergente em cães, gatos e cavalos. Duas grandes linhagens clonais de MRSP foram encontradas em cães na Europa (ST 71) e na América do Norte (ST 68). Houve também relatos de MRSP afetando cães no Japão e um único caso de MRSP afetando um funcionário de veterinária em Hong Kong.
[00319] Neste estudo, os isolados de MRSP foram determinados utilizando uma combinação da presença do gene mecA na resistência in vitro à oxacilina. A susceptibilidade à cefoxitina tem sido utilizada como um substituto para a oxacilina em Staphylococcus aureus resistente à meticilina. No entanto, os testes de difusão em disco com cefoxitina usando diretrizes interpretativas recomendadas para isolados humanos de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e estafilococos de coagulase negativa são confiáveis na identificação de MRSP. Um ponto de ruptura de resistência à cefoxitina de ≤30 mm = resistente e ≥31 = suscetível foi proposto por Bemis e outro, 2012 [Bemis, DA, RD Jones, et al. (2012). "Avaliação do ponto de ruptura de difusão em disco com cefoxitina para detecção de resistência à meticilina em isolados de Staphylococcus pseudintermedius de cães." Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 24 (5): 964-967]. Este estudo está de acordo que este ponto de ruptura pode ser mais confiável na previsão de Staphylococcus pseudintermediusresistente à meticilina.
[00320] Isolados de MRSP são geralmente resistentes a múltiplas classes de antibióticos. Cultura bacteriana e susceptibilidades aos antibióticos são, portanto, recomendadas para todas as infecções MRSP suspeitas, a fim de permitir a seleção adequada de antibióticos. Uma limitação observada neste estudo é a aparente sensibilidade in vitro de isolados de MRSP à amoxicilina e cefalosporinas (cefalotina e cefotetan).
[00321] NCL812 foi eficaz contra todos os 23 isolados de ambos, MSSP e RMSP. Um estudo em maior escala se justifica ao confirmar a eficácia de NCL812 contra Staphylococcus pseudintermedius pois pode fornecer uma opção alternativa segura de antibiótico para infecções de MRSP emergente em animais domésticos.
EXEMPLO 7: Preparação e testes de NCL812 análogos (também conhecidos como compostos do invento). Materiais e Métodos NCL812 Foi obtido NCL812 de grau analítico com potência definida de 960 mg/g (ou seja, 96%). O pó foi armazenado em um recipiente de amostra selado ao abrigo da luz solar direta e em temperatura ambiente no local de estudo. Alíquotas (1 ml) da solução de reserva (contendo 25,6 mg/ml de NCL812 em DMSO) foram preparadas e armazenadas a -80 °C e descongeladas imediatamente antes da utilização. Síntese e Testes de NCL812 Análogos
[00322] NCL001 para NCL230, análogos, como identificados na Figura 1, foram sintetizados utilizando métodos padronizados. Conforme exemplo, os métodos utilizados para fabricação de compostos NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL195; NCL196 e são os seguintes:
NCL 097 (2,2'-bis [(3,4,5-trihidroxifenil) metileno] cloridrato de di-hidrazida carbonimidica)
[00323] Uma suspensão de 3,4,5-trihidroxibenzaldeída (412,0 mg, 2,673 mmol, 2,21 eq.) e N,N- cloridrato -diaminoguanidina (152,0 mg, 1,211 mmol) em EtOH (5 mL) foi submetida a irradiação de microondas (150 W), a 100° C durante 10 min. A reação foi então deixada para resfriar em temperatura ambiente. O precipitado resultante foi coletado e lavado com EtOH refrigerada (5 mL) e Et2O (5 mL) para se obter di-hidrazida carbonimidica (369,0 mg, 77%) na forma de um M.P. sólido castanho claro. 292° C (Decomp.).1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,06 (br s, 6H), 8,25 -8,01 (m, 4H), 6,83 (s, 4H). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 152.2, 149.7, 146.2, 136.5, 123.7, 107.4. LRMS(ESI+): 361.95 [M + 1]+.
NCL157 (2,2'-bis [(2-amino-4-clorofenil) metileno] cloridrato de di-hidrazida carbonimidica)
[00324] Síntese de 2-amino-4-cloro-N-metoxi-N-metilbenzamida. A uma solução de ácido 2-amino-4-clorobenzóico (5,6691 g, 33,041 mmol), cloridrato de N,0-dimetilhidroxilamina (5,7504 g, 58,954 mmol, 1,78 eq.), N-(3-dimetilaminopropil) -N'Cloridrato de etilcarbodiimida (7,7925 g, 40,649 mmol, 1,23 eq.) e hidrato de N-hidroxibenzotriazol (5,2371 g, 38,793 mmol (base anidra), 1,17 eq.) em DMF (100 mL) foi adicionada diisopropiletilamina (18,0 mL, 13,4 g, 104 mmol, 3,15 eq.) e a solução castanha foi agitada à temperatura ambiente durante 7 h. A reação foi então concentrada a vácuo antes da diluição com NaOH 1M (100 mL) e extrair com CH2Cl2 (3 x 100 mL) Os extratos orgânicos combinados foram lavados com HCl 1 M (100 mL) antes da secagem em MgSO4 e concentrando a vácuo para se obter um xarope castanho. Este óleo foi então seco a 60°C sob alto vácuo para se obter a amida de Weinreb bruta (7,021 g, 99%) como um xarope castanho que se cristalizou em repouso. O material bruto foi utilizado sem purificação adicional. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 18 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 3.48 (s, 3H), 3.24 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.2, 148.4, 137.1, 130.6, 116.6, 116.1, 115.0, 61.1,34.0.
[00325] Síntese de 2-amino-4-clorobenzaldeído. 2-amino-4-cloro-N-metoxi-N-metilbenzamida bruto (751,1 mg, 3,532 mmol) foi dividido em ca. lotes de 120 mg e cada um deles dissolvidos em THF (10 mL) e resfriado a 0° C antes LiAlH4 (2M em THF, 0,5 mL) foi adicionado a cada, e as soluções agitadas durante 16 h, permitindo que as reações atinjam a temperatura ambiente. As reações foram resfriadas com solução saturada NH4Cl (1 mL) antes de serem combinadas, diluídas om NaHCO3 saturado (160 mL) e extraídas com CHCl3 (2 x 150 mL, 1 x 75 mL). Os orgânicos combinados foram secos em MgSO4 e concentrada a vácuo para se obter o benzaldeído bruto (463,3 mg, 85%) como cristais amarelo/laranja. O material bruto foi utilizado sem purificação adicional. 1H (400 MHz, CD3OD) 9,77 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,83 - 6,71 (m, 1H), 6,63 (dd, J = 8,4, 1,9 Hz, 1H). 13C RMN (101 MHz, CD3OD) ô 194,6, 153,0, 142,5, 138,4, 118,3, 116,8, 116,1.
[00326] Síntese de 2,2'-bis [(2-amino-4-clorofenil) metileno] cloridrato de di-hidrazida carbonimidica. Uma suspensão de 2- amino-4-clorobenzaldeído (128,0 mg, 0,823 mmol, 1,78 eq.) E N,N'-cloridrato de diaminoguanidina (58,0 mg, 0,462 mmol) em EtOH (2 mL) foi submetida a irradiação de microondas (100 W) a 60° C durante 5 minutos. A maior parte do solvente foi então removida a vácuo, EtOH (1 mL) foi adicionado e o frasco foi transferido para o congelador efetuar a cristalização. O precipitado resultante foi recolhido e lavado com EtOH (1 mL) para se obter a di-hidrazida carbonimidica (21,0 mg, 13%) como um sólido amarelo pálido. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,71 (br s, 2H), 8,40 (s, 2H), 8,37 (s, 2H), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,87 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 6,73 (br s, 4H), 6,59 (dd, J = 8,3, 2,0 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 152,1, 151,5, 148,9, 136,0, 134,7, 115,1, 114,5, 112,8.
NCL179 (4,6-bis (2 - ((E) -4-clorobenzilideno) hidrazinil) pirimidin-2-amina)
[00327] Uma suspensão de 2-amino-4,6-di-hidrazinilapirimidina (67,3 mg, 0,434 mmol) e 4-clorobenzaldeído (198,8 mg, 1,414 mmol, 3,26 eq.) em EtOH (25 mL) foi aquecida a refluxo durante 16 h. Após este tempo, o condensador foi removido e a solução foi concentrada para aprox. 1 mL e o precipitado resultante foi filtrado a quente e lavado com Et2O (10 mL) para se obter o aminopirimidina (42,8 mg, 25%) na forma de um pó amorfo esbranquiçado. M.P. 275° C (decomp.). 1'H RMN (400 MHz, DMSO) δ 10,70 (s, 2H), 8,02 (s, 2H), 7,67 (d, J = 8,4 Hz, 4H), 7,52 (d, J = 8,4 Hz, 4H), 6,28 (s, 1H), 5,85 (s, 2H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) ô 162,8, 162,6, 138,8, 134,1, 133,1, 128,9, 127,6, 73,5.
NCL188 ((E) -2- (1- (4-clorofenil) pentilideno) cloridato de hidrazina-1-carboximidamida)
[00328] Uma suspensão de 1- (4-clorofenil)pentanona (1,8319 g, 9,3146 mmol, 1,95 eq.) e cloridrato de aminoguanidina (527,6 mg, 4,773 mmol) em EtOH (15 mL) foi aquecida a 65° C durante 16 h. O produto bruto foi resfriado até a temperatura ambiente antes de ser diluído com Et2O (60 mL) e resfriou-se até 0° C para precipitar o cloridrato de aminoguanidina que não reagiu (174,5 mg). Os licores mãe foram então concentrados a vácuo e o resíduo foi dissolvido em Et2O (20 mL). A solução foi então fervida e foram adicionados hexanos (10 mL) para se obter a caboximidamida como um creme sólido. 1H RMN (400 MHz, DMSO) δ 11,54 (s, 1H), 7,99 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,90 (s, 3H), 7,47 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 2,91 - 2,82 (m, 2H), 1,48 - 1,32 (m, 4H), 0,89 - 0,84 (m, 3H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) δ 156,2, 153,8, 134,8, 134,4, 128,7, 128,4, 28,1, 26,6, 22,0, 13,8
NCL195 (4,6-bis (2 - ((E) -4-metilbenzilideno) hidrazinil) pirimidina-2-amina)
Uma suspensão de 2-amino-4,6-di-hidrazinopirimidina (58,9 mg, 0,380 mmol) e 4-metilbenzaldeído (0,10 mL, 100 mg, 0,832 mmol, 2,19 eq.) em EtOH (4 mL) foi aquecida a refluxo durante 16 h . A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente antes de se recolher o precipitado tipo sedimento, lavando com Et2O (20 mL). Os 'sedimentos' foram então triturados e o sólido foi ainda lavado com Et2O (10 mL) para se obter a pirimidina (85,8 mg, 63%) como um pó branco "macio". MP 274-276 ° C. 1H RMN (400 MHz, DMSO) δ 10,51 (s, 2H), 8,00 (s, 2H), 7,54 (d, J = 8,0 Hz, 4H), 7,26 (d, J = 7,9 Hz, 4H), 6,26 (s , 1H), 5,77 (s, 2H), 2,34 (s, 6H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) ô 162,8, 162,6, 140,1, 138,4, 132,5, 129,4, 126,0, 73,3, 21,0.
NCL196 (4,4 '- ((1E,1'E) - ((2-aminopirimidina-4,6-diil)bis(hidrazina-2-il-1 ilideno)bis(metanililideno)) difenol)
[00329] Uma suspensão de 2-amino-4,6-di-hidrazinopirimidina (70,4 mg, 0,454 mmol) e 4-hidroxibenzaldeído (140,3 mg, 1,149 mmol, 2,53 eq.) em EtOH (3 mL) foi aquecida a refluxo durante 16 h. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente antes de se recolher o precipitado, lavando com Et2O (25 mL), para se obter a pirimidina (91,4 mg, 55%) como um pó esbranquiçado. M.P. 298° C (decomp.). 1H RMN (400 MHz, DMSO) δ 10,31 (s, 2H), 9,74 (s, 2H), 7,94 (s, 2H), 7,48 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,83 (d, J = 8,6 Hz , 4H), 6,20 (s, 1H), 5,70 (s, 2H). 13C (101 MHz, DMSO) δ 162,7, 162,5, 158,3, 140,5, 127,7, 126,3, 115,7, 73,0.
Testes de MIC
[00330] As concentrações inibitórias mínimas (μg/ml) foram determinadas usando o método de micro-diluição em caldo recomendado pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI). Pontos de ruptura de MIC foram determinados por avaliação visual e, em seguida confirmados utilizando um leitor de placas ELISA, e medindo os níveis de absorvância a 600 nm. O crescimento bacteriano (turbidez) nos poços com antimicrobiano foi comparado com a quantidade de crescimento (turbidez) no poço de controle de crescimento (sem antimicrobiano). Todos os isolados foram testados em duplicado, caso houvesse uma diferença maior do que uma diluição de duas vezes nos resultados, o teste era repetido uma terceira vez. A pureza dos isolados foi acompanhada de perto durante os testes por subcultura do inóculo bacteriano preparado em ágar com sangue de ovelha (SBA). As MICs das cepas de controle para a ampicilina antimicrobiana foram determinadas para cada teste executado como um controle de qualidade interno. As MIC50, MIC90 e faixa de MIC (mínima e máxima) foram calculadas para cada um dos grupos de bactérias.
Atividade de NCL812 e MIC contra bactérias gram-negativas
[00331] A atividade de NCL812 contra bactérias gram-negativas foi avaliada usando o método de micro-diluição em caldo recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), e os valores de MIC (μg/mL) durante NCL812 e ampicilina foram determinados.
Determinação da Concentração Bactericida Mínima (MBC) Metodologia CLSI
[00332] Resumidamente, 10 uL dos conteúdos de cada poço a partir das MIC foi inoculado em uma placa de Columbia SBA e incubado a 37° C durante 48 h. As placas foram examinadas passadas 24 horas e 48 horas e a MBC foi registada como a concentração mais baixa de NCL812 em que não foram observadas colônias de bactérias na placa (ou inibição significativa do crescimento foi observado em comparação com o controle) (CLSI 2005).
Ensaios cinética de eliminação (MRSA e VRE)
[00333] MRSA/VRE foram crescidas durante a noite em Columbia SBA a 37° C. Algumas colônias de bactérias foram então suspensas em CAMHB e ajustadas a uma densidade ótica de 0,08 a 0,10. A suspensão bacteriana foi diluída 1:10. Um mililitro da bactéria foi adicionado a 9 mL de CAMHB contendo várias concentrações (até 4 x MIC) de NCL812, para alcançar uma concentração bacteriana final de 1 a 3x106 CFU/ml. Os tubos foram incubados a 37° C a fim de determinar o número de bactérias viáveis presentes em vários pontos no tempo, uma alíquota de 100 μL foi removida de cada tubo e diluído em solução salina normal. Em seguida, 100 μL de cada diluição foram espalhadas em ágar de contagem de colônias, em duplicado, e incubadas durante 48 h a 37°C. Após 24 horas, as quantidades de colônias presentes em cada placa foram contadas e, portanto, a quantidade de bactérias viáveis presentes na suspensão inicial enumerados. As placas foram novamente verificadas após 48 horas.
Estudos sinergéticos com outras classes de agentes antimicrobianos.
[00334] O método quadriculado (Gunics e outros, 2000 Int. J. Antimicrob. Agents. 14: 239-42) foi utilizado para encontrar as interações (sinergia, antagonismo, sem efeito) de NCL812 em combinação com tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina (macrólido), ampicilina (β-lactâmicos de amplo espectro), gentamicina (aminoglicósido), a ciprofloxacina ( fluoroquinolona), sulfametoxazol (sulfonamidas), ou penicilina G (β-lactâmicos de espectro reduzido). Para experiências iniciais, uma cepa de laboratório de Staphylococcus aureus T3-129 foi usada, no entanto, esta cepa produziu resultados inconsistentes para alguns dos antimicrobianos e uma nova cepa de MK1 designado de Staphylococcus spp. (identificação definitiva das espécies atualmente em andamento) que era sensível a todos os antibióticos testados foi usada em testes subsequentes.
[00335] Em primeiro lugar, a MIC de cada antibiótico sozinho foi determinada de acordo com as diretrizes padrão de CLSI. Em segundo lugar, a combinação de NCL812 com cada um dos antibióticos acima mencionados foi testada em duplicado. Para avaliar o efeito da combinação da concentração inibidora fracionária (FIC) foi calculada para cada antibiótico como segue:
FIC de antibiótico testado = MIC de antibiótico testado em combinação/MIC de antibiótico único.
FIC de NCL812 = MIC de NCL812 em combinação/MIC de NCL812 único.
FICI = Índice de FIC = FIC de NCL812 + FIC de cada antibiótico testado.
[00336] De acordo com as diretrizes do quadriculado, Sinergia (S) foi definida como uma FICI<0.5. Nenhum efeito (NE) foi definido como 0,5<FICI<4. Antagonismo (A) foi definida como uma 4<FICI.
Testes de NCL812 Análogos
[00337] NCL812 análogos foram armazenados a 4°C até serem testados. MICs foram determinadas contra duas cepas de MRSA, duas cepas de VRE e uma cepa cada um E. coli e Pseudomonas aeruginosa.
Resultados Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC)
[00338] Os valores comparativos de NCL812 e ampicilina de MIC (μg/mL) para 21 isolados de MRSA foram obtidos. Os resultados para as experiências iniciais (Fase I), e testes de repetição (Fase II) são mostrados na Tabela 34. Cada teste de MIC foi realizado em duplicado.
Tabela 34: Valores de NCL812 e ampicilina de MIC (μg/ml) para 21 isolados de MRSA obtidos de acordo com o Exemplo 7.
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Tabela 35: Valores comparativos de NCL812 e ampicilina de MIC (μg/ml) para 13 isolados de VRE obtidos de acordo com o Exemplo 7.
Figure img0132
[00339] Os valores comparativos de NCL812 e MIC de ampicilina (μg/mL) para 13 isolados de VRE foram obtidos. Os resultados para as experiências iniciais (Fase I), e testes de repetição (Fase II) são mostrados na Tabela 35. Cada teste de MIC foi realizado em duplicado.
[00340] NCL812 MIC50, MIC90, modo de MIC e faixa de MIC foram obtidos para os isolados australianos de MRSA e VRE, como mostrado na Tabela 6 Os valores comparativos de MIC para ampicilina são mostrados entre parênteses.
Atividade de NCL812 e MIC contra bactérias gram-negativas
[00341] Os valores comparativos de NCL812 e MIC de ampicilina (μg/mL) para Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella arizonae foram obtidos, como mostrado na Tabela 36. Cada teste de MIC foi realizado em duplicado.
Tabela 36: Valores comparativos de NCL812 e MIC de ampicilina (μg/ml) para Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella arizonae obtidos de acordo com o Exemplo 7.
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[00342] A atividade antimicrobiana de NCL812 contra as bactérias gram-negativas selecionados foi > 128 μg/ml.
Determinação da Concentração Bactericida Mínima (MBC)
[00343] Os resultados de MBC para isolados de MRSA são mostrados na Tabela 37 que mostra os valores MBC de NCL812 (μg/mL) para 20 isolados de MRSA. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado iniciando a partir da concentração MIC de NCL812 a 16 vezes de MIC. Para todos os isolados, a MBC foi igual à MIC. No entanto, o crescimento inconsistente em placas de ágar foi registrado para algumas concentrações.
Tabela 37: Valores MBC de NCL812 (μg/ml) durante isolados de 20 MRSA de acordo com o Exemplo 7.
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GB = Crescimento Bacteriano em Ágar com Sangue de Ovelha
N** = Não cultivado em Ágar com Sangue de Ovelha
[00344] Os resultados para 10 isolados de VRE estão apresentados na Tabela 38. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado iniciando a partir da concentração MIC de NCL812 a 32 vezes de MIC. Tal como acontece com os isolados de MRSA testados, a MBC parece ser igual à MIC. No entanto, com os isolados de VRE, foi observada uma anomalia nas concentrações mais altas de NCL812. Existe uma inibição significativa do crescimento em concentrações perto da MIC, mas o aumento da concentração de NCL812, bactérias parecem ser menos sujeitas à inibição. Números elevados de bactérias foram observadas nas placas em concentrações de NCL812 >16 μg/mL.
Tabela 38: Valores MBC de NCL812 (μg/ml) para 10 isolados de VRE de acordo com o Exemplo 7.
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*Número de bactérias crescendo após 24 horas por ml da amostra (CFU/ml); M = muitas bactérias crescendo na placa (número demasiadamente alto para a contagem)
[00345] NCL812 foi verificado ser bactericida contra bactérias gram-positivas em concentrações equivalentes para a MIC.
Ensaios cinéticos de eliminação (MRSA e VRE)
[00346] Em experiências preliminares, as contagens de colônias foram realizadas em t = 15, 30, 45 e 60 min. Nenhumas alterações significativas na concentração bacteriana foram observados nestes pontos de tempo, sugerindo que não é NCL812 rapidamente bactericida (por comparação, a oritavancin alipoglocopeptídea (McKay et ai. (2009) J. Antimicrob. Chemother. 63 (6): 1191-1199) causou uma redução de 3log10na contagem viável em uma hora de exposição a uma concentração equivalente à Cmax). Portanto, para futuros experimentos, pontos de tempo de amostragem foram estendidos para um, e depois, dois intervalos de uma hora.
[00347] Nas experiências iniciais, para MRSA, houve em 4 h uma redução de pelo menos 2,5log10 CFU/ml em comparação com o controle de crescimento. Às 8 h houve pelo menos uma diferença de 3,5log10 UFC/mL entre o controle e as bactérias expostas ao NCL812. Após 24 h, os números de bactérias presentes em todas as concentrações de NCL812 não foram significativamente diferentes do controle. Houve uma redução consistente no número de bactérias em concentrações de NCL812 a partir de 4-16 μg/ml, até 8 h, mas o mesmo não foi observado em concentrações superiores a 16 μg/mL. Em comparação, os agentes antimicrobianos mais bactericidas, usados ou sendo desenvolvidos para o tratamento de MRSA e VRE (oritavancina, daptomicina, vancomicina) são rapidamente bactericida alcançando reduções de log semelhantes em 1 h de exposição em uma forma dependente de concentração (McKay e outros, 2009). Em experiências cinéticas de eliminação antimicrobianos bacteriostáticos recomendados para o tratamento de infecções por MRSA e VRE (teicoplanina e linezolida apenas diminuem marginalmente a contagem e crescimento viáveis).
[00348] Para VRE a diminuição observada na CFU/ml de bactérias expostas ao NCL812 foi menor do que para a MRSA. Às 4 h havia aproximadamente uma redução de 2log10 na contagem viável em comparação com o controle, e às 8 horas havia aproximadamente uma redução de 2,5log10 . No entanto, às 24 horas o crescimento de bactérias já não era tão significativamente reduzido em comparação com o controle. Os números bacterianos aumentaram após 8 h de incubação e este efeito pareceu a ser mais acentuado com concentrações crescentes de NCL812.
[00349] A cinética de eliminação de MRSA 580 foi obtida em diferentes concentrações de NCL812 por um período de 8 h, como mostrado na Figura 34 A cinética de eliminação de MRSA 580 em diferentes concentrações de NCL812 por um período de 24 horas é mostrada na Figura 35 Após 4 h de incubação, o meio foi mudado para meio fresco contendo a mesma concentração de NCL812.
[00350] A cinética de eliminação do MRSA 698 em diferentes concentrações de NCL812 por um período de 24 horas é mostrada na Figura 36 Após 4 h de incubação, o meio foi mudado para meio fresco contendo a mesma concentração de NCL812.
[00351] A cinética de eliminação de VRE 26c (DC), em diferentes concentrações de NCL812 por um período de 24 horas são apresentados naFigura 37.
[00352] A cinética de eliminação de VRE 16c (DC), em diferentes concentrações de NCL812 por um período de 24 horas são apresentados naFigura 38.
Teste para a resistência bacteriana no NCL812
[00353] Testes preliminares foram realizados para determinar se a resistência bacteriana pode explicar as observações de crescimento bacteriano em concentrações mais elevadas de NCL812 e o aumento no número de bactérias em experiências de cinética de eliminação em 24 h de incubação. Bactérias (MRSA) crescendo em altas concentrações de NCL812, na bandeja de micro título do poço 96, foram sub-cultivadas em SBA e incubadas durante 24 h, em seguida, testes de MIC foram realizados. Não houve alteração na MIC destas bactérias. Bactérias crescendo em caldo utilizado em experiências cinéticas de eliminação também foram testadas para qualquer mudança na MIC. Nenhuma mudança foi observada.
[00354] Além disso, as bactérias expostas ao NCL812 em concentrações elevadas foram, em seguida, sub-cultivadas na placa de contagem de ágar contendo NCL812 (64 μg/mL e 128 μg/mL), e incubadas durante 24 h a 37° C. As bactérias crescendo na placa foram então utilizadas para a execução de um teste de MIC. Ainda não houve alteração na MIC da bactéria.
[00355] Resumindo, o NCL812 tem atividade bactericida contra MRSA, que é menos pronunciado contra as cepas de VRE. O efeito bactericida não é rápido em comparação com agentes antimicrobianos bactericidas desenvolvidos para infecções MRSA e VRE (daptomicina, oratovancina, vancomicina). Resultados bactericidas aberrantes em concentrações mais elevadas de NCL812 não são indicativos de desenvolvimento de resistência, mas pode estar relacionado com a perda de atividade. O teste de estabilidade do composto em meio de caldo deve ser realizado antes de explorar estes resultados interessantes, mas atualmente inexplicáveis. Isso incluirá um exame detalhado da literatura para determinar se este fenômeno é observado em outras classes de agentes antimicrobianos. Neste caso, um exame mais detalhado da cinética de eliminação entre 8 e 24 h será necessário. Curvas de eliminação de NCL812 para MRSA e VRE sugerem mais atividade bactericida em comparação com os antimicrobianos bacteriostáticos (linezolida, teicoplanina). Curvas de eliminação devem agora ser geradas para Streptococcus pneumoniae uma vez que problemas de estabilidade de NCL812 são investigados, como por exemplo com linezolida, conforme alguns agentes anti-bacterianos podem ser bacteriostáticos contra algumas bactérias e bactericida contra os outros.
Estudos sinergéticos com outras classes de agentes antimicrobianos.
[00356] MICs, FICs, FICI e a interação entre NCL812 e oito antibióticos são mostrados na Tabela 39. Nenhum dos oito compostos testados, que representam classes distintas de agente antimicrobiano apresentaram interação positiva (sinergismo) ou interação negativa (antagonismo) com NCL812 consistente com um efeito aditivo quando agentes anti-bacterianos são adicionados ao NCL812.
Tabela 39: MICs, FICs, FICI e a interação entre NCL812 e oito antibióticos de acordo com o Exemplo 7.
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1 Cepa T3-29 de S. aureus
2 Cepa MK1 de Staphylococcus spp.
FIC1 = MIC de anitbiótico em combinação com NCL812/MIC de somente antibiótico
FIC2 = MIC de NCL812 em combinação com Antibiótico/MIC de somente NCL812
FICI = índice FIC
Testes de NCL812 Análogos
[00357] As estruturas químicas de NCL001 para NCL230 análogos são apresentados naFigura 1.
[00358] MICs de NCL812 e NCL001-07 análogos são mostrados na Tabela 40.
[00359] MICs de NCL071 a 171 análogos são mostrados na Tabela 41 .
[00360] MICs de NCL171 a 230 análogos são mostrados naTabela 42.
Tabela 40: MICs de NCL812 e NCL001-070 análogos de acordo com o Exemplo 7.
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Tabela 41: MICs de NCL071-170 de acordo com o Exemplo 7.
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Tabela 42: MICs de NCL171-230 de acordo com o Exemplo 7.
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[00361] Os NCL análogos que mostram o maior nivel de atividade antibacteriana gram-negativa, incluídos NCL030 (especialmente Pseudomonas), NCL041, NCL043, NCL044 (especialmente Pseudomonas), NCL052 (especialmente Pseudomonas), e NCL053 (especialmente Pseudomonas), NCL097 (especialmente Pseudomonas), e NCL196 NCL188 (especialmente E. coli).
[00362] Os NCL análogos que mostram maior atividade contra MRSA, incluídos: NCL021; NCL023; NCL029; NCL030; NCL035; NCL038; NCL039; NCL040; NCL041; NCL043; NCL044; NCL052; NCL054; NCL062; NCL069; NCL072; NCL073; NCL074; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL082; NCL084; NCL088; NCL089; NCL093; NCL094; NCL097; NCL099; NCL101; NCL104; NCL107; NCL108; NCL111; NCL113; NCL117; NCL120; NCL121; NCL123; NCL136; NCL138; NCL140; NCL143; NCL146; NCL150; NCL151; NCL153; NCL155; NCL157; NCL158; NCL159; NCL160; NCL161; NCL166; NCL168; NCL169; NCL171; NCL172; NCL173; NCL174; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL182; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL191; NCL192; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL199; NCL201; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL207; NCL215; NCL216; NCL217; NCL219; NCL220; e NCL221.
[00363] Os NCL análogos que mostram maior atividade contra VRE, incluídos: NCL011; NCL021; NCL023; NCL029; NCL030; NCL035; NCL038; NCL039; NCL040; NCL041; NCL043; NCL044; NCL052; NCL054; NCL061; NCL062; NCL069; NCL070; NCL072; NCL073; NCL074; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL082; NCL084; NCL088; NCL093; NCL094; NCL097; NCL099; NCL101; NCL105; NCL107; NCL108; NCL111; NCL112; NCL113; NCL117; NCL120; NCL121; NCL123; NCL126; NCL131; NCL136; NCL140; NCL141; NCL143; NCL146; NCL151; NCL153; NCL155; NCL157; NCL158; NCL159; NCL160; NCL161; NCL166; NCL168; NCL169; NCL171; NCL173; NCL174; NCL175; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL182; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL191; NCL192; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL210; NCL212; NCL215; NCL216; NCL217; NCL218; NCL219; NCL220; e NCL221.
[00364] A classificação do bioensaio dos análogos testados é mostrado na Tabela 43.
Tabela 43: A classificação do bioensaio dos análogos testados de acordo com o Exemplo 7.
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EXEMPLO 8: Os efeitos de NCL812 em isolados sensíveis de antimicrobianos de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis Materiais e Métodos Informações de cepa
[00365] Dois isolados de Staphylococcus aureus foram utilizados nas experiências seguintes; S. aureus MK01 uma cepa de pele humana, e S. aureus KC01 uma cepa de pele equina. Estes isolados foram identificados pela coloração de Gram cepa e métodos bioquímicos, incluindo o kit comercial Remel Staphaurex. Um isolado de Enterococcus faecalis (USA01) não foi identificada como uma cepa de VRE. Conforme este isolado foi previamente anteriormente diferenciado, não foi submetido a mais testes, exceto para observação de pureza, crescimento característico em ágar de sangue.
Investigação de Concentração Bactericida Mínima (MBC) Metodologia CLSI
[00366] Resumidamente, 10 uL dos conteúdos de cada poço a partir das MIC foi inoculado em uma placa de Columbia SBA e incubados a 37° C durante 48 h. As placas foram examinadas passadas 24 horas e 48 horas e a MBC foi registada como a concentração mais baixa de NCL812 em que não foram observadas colônias de bactérias na placa (ou inibição significativa do crescimento foi observado em comparação com o controle) (CLSI 2005).
Ensaios cinéticos de eliminação para Método S. aureus KC01 & E. faecalis USA01
[00367] S. aureus KC01 e E. faecalis USA01, não determinados para serem MRSA ou VRE, respectivamente, foram cultivados durante a noite em SBA Columbia a 37° C. Algumas colônias de bactérias foram, então, suspensas em CAMHB (caldo de Mueller Hinton ajustado para cátion) e ajustado para OD600 de 0,08 a 0,10. A suspensão bacteriana foi diluída 1:10. Um mililitro da bactéria foi adicionado a 9 ml de CAMHB contendo várias concentrações (até 4*MIC) de NCL, para alcançar uma concentração bacteriana final de 1 a 3×106 CFU/mL. Os tubos foram incubados a 37° C, com agitação constante. A fim de determinar o número de bactérias viáveis presentes em vários pontos no tempo, uma alíquota de 100 μL foi removida de cada tubo e diluída. Em seguida, 100 μL de cada diluição foram espalhados em ágar de contagem de colônias, em duplicado, e incubados durante 48 h a 37° C. Após 24 horas, os números de colônias presentes em cada placa foram contados e, portanto, o número de bactérias viáveis presentes na suspensão inicial enumerados. As placas foram novamente verificadas após 48 horas.
Resultados Concentração Inibitória Mínima (MIC)
[00368] A MIC DE NCL812 para isolados de S. aureus MK01 e KC01, e E. faecalis USA01 foi investigada. Os resultados foram os seguintes: S. aureus MK01 = 4-8 μg/mL, S. aureus KC01 = 2 μg/mL, E. faecalis USA 01 = 4 μg/mL.
[00369] Os isolados de S. aureus MK01 e KC01 foram investigados e nenhum crescimento, ou crescimento somente em baixas concentrações de NCL812 (2 μg/ml), foi observado, indicando que NCL812 é bactericida contra S. aureus. Para os isolados de E. faecalis testados (USA01), no entanto, o crescimento das bactérias foi observado em todas as concentrações de NCL812 testadas. Houve uma redução óbvia na quantidade de bactérias com o aumento da concentração, mas o crescimento estava presente se comparado a nenhum crescimento de S. aureus. Um resumo desses resultados pode ser visto na Tabela 45. A Tabela 45 mostra os resultados para os testes MBC de NCL812 em dois isolados não-MRSA S. aureus e um isolado não-VRE E. faecalis . Cada teste MBC foi realizado em duplicado. Nenhuma alteração nos resultados foi observada em 48 h. A Tabela 37 mostra os valores MBC de NCL812 (μg/mL) para 20 isolados de MRSA.. Cada teste de MBC foi realizado em duplicado iniciando a partir da concentração de MIC de NCL812 a 16 vezes de MIC. A Tabela 38 mostra os valores MBC de NCL812 (μg/ml) para 10 isolados de VRE. Cada teste MBC foi realizado em duplicado iniciando a partir da concentração MIC de NCL812 a 32 vezes de MIC.
Tabela 45: Testes MBC de NCL812 em dois isolados não-MRSA Staphylococcus aureus e um isolado não-VRE Enterococcus faecalis de acordo com o Exemplo 8.
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+ = Crescimento em Agar com Sangue de Ovelha; 0 = Nenhum Crescimento em Agar com Sangue de Ovelha; N = Não Cultivado; Números entre Parênteses são o Número de Bactérias que Crescem após 24 horas por ml de amostra (CFU/ml)
Ensaios cinéticos de eliminação para Método S. aureus KC01 & E.faecalis USA01
[00370] Contagens de colônias foram realizadas em t = 0, 120, 240, e 360 minutos, então, novamente em 24 h. No ponto no tempo de 2 h S. aureus KC01 mostrou um mínimo de redução de 2,5log10 nos números de bactérias de números iniciais, e maior que uma redução de 3log10 em comparação com o controle no mesmo ponto no tempo. Um mínimo de uma redução de 2log10 ainda estava evidente em 6 h de incubação, no entanto, após 24 h a quantidade de bactérias presentes aumentou, e isso não foi significativamente diferente do controle.
[00371] Resultados semelhantes foram obtidos com E. faecalis, no entanto, a redução na quantidade de bactérias observada era menor que para S. aureus KC01. Uma redução de 2log10 em CFU/mL foi observada em 2 h, em comparação ao controle de crescimento. No entanto, a redução em CFU/mL em comparação com os números bacterianos originais foi apenas maior que 1log10. Em concentrações de 4-16 μg/mL de NCL812 essa redução nos números de bactérias permaneceu consistente até ao ponto no tempo de 6 h. Em concentrações de 32 e 64 μg/mL, no entanto, houve aproximadamente de uma elevação de 1log10 nos números de bactérias em relação ao mesmo período no tempo. Em 24 h as quantidades de bactérias em todas as concentrações aumentou para quase o mesmo nível que o controle de crescimento.
[00372] Os resultados observados com essas cepas de S. aureus e E. faecalis são consistentes com os resultados observados para o ensaio cinético de eliminação para todos os isolados de MRSA e VRE testados. O ensaio cinético de eliminação de Staphylococcus aureus KC01 em diferentes concentrações de NCL812, até 24 h de incubação são mostrados na Figura 39. O ensaio cinético de eliminação de Enterococcus faecalis em diferentes concentrações de NCL812, com até 24 h de incubação são mostrados na Figura 40.
EXEMPLO 9: Formulações dos Compostos
[00373] As seguintes formulações foram preparadas utilizando métodos padrão.
Formulação A - Formulação Tópica - Gel à base de PEG com compostos da invenção
4,0 g PEG 4000;
3,5 g PEG 200;
0,6 g propileno glicol
1,9 g de água; e
0,204 g de composto (por exemplo, NCL099)
[00374] PEG 4000, PEG 200 e propileno glicol foram misturados e aquecidos a 150° C e até que todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. O composto foi adicionado à água e sonicado durante 30 minutos até estar completamente suspenso. A solução do Composto e soluções em gel foram misturadas e resfriadas e solidificadas. A formulação A demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina.
Formulação A - Formulação Tópica - Gel à base de PEG com compostos da invenção
3,0 g de PEG 4000;
1,0 g de PEG 8000;
3,0 g de PEG 200;
1,0 g de propileno glicol;
1,9 g de água; e
0,202 g do Composto (por exemplo, NCL099)
[00375] PEG 4000, PEG 8000, PEG 200 e propileno glicol foram misturados e aquecidos a 150° C e até que todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. Composto (por exemplo, NCL099) foi adicionado à água e sonicado durante 30 minutos até estarem completamente suspensos. A solução do Composto e soluções em gel foram misturadas e resfriadas e solidificadas. A formulação B demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina.
Formulação C - Formulação Tópica - Gel com base em PEG com Composto-Soluplus
2,5 g de PEG 4000;
4,0 g de PEG 200;
2,5 g de propileno glicol;
1,0 g de água; e
1,8 g de dispersão sólida do Composto-Soluplus.
[00376] Soluplus foi adquirido por BASF (www.soluplus.com). Composto-Soluplus foi preparado utilizando métodos padrão na técnica. PEG 4000, PEG 200, Composto-SoluPlus e propileno glicol foram misturados e aquecidos a 150° C e até que todos os cristais sólidos fossem dissolvidos. Foi adicionada água e, em seguida, a solução foi sonicada. A solução foi deixada para esfriar e solidificar. A Formulação C demonstrou uma viscosidade aceitável, facilidade de aplicação na pele, suspensão e consistência uniforme e textura fina.
Formulação D - Formulação para Comprimido
30 mg de hidrogenofosfato de cálcio di-hidratado;
80 mg de Celulose microcristalina
50mg de Lactose;
8mg de Hidroxipropilmetilcelulose
1,5 mg de Talco
10 mg de composto (por exemplo, NCL099)
[00377] Os excipientes foram pesados e misturados durante 5 minutos. A mistura foi alimentada a um funil de alimentação de uma máquina de prensa de comprimidos e a máquina foi operada de acordo com procedimentos padrão na técnica. Formulação D demonstrou uma dureza, desintegração e friabilidade aceitável para comprimido.
Formulação E - Suspensão Oral
2,0 ml de Glicerol;
1,5 ml de Etanol absoluto;
600mg de NCL812; e
Para Veículo de 60ml (Ora Sweet e Ora Plus, 1:1).
[00378] Pó de NCL 812 foi peneirado por uma peneira de 75μm. 600 mg de NCL812 peneirado foi misturado com 2,0 ml de glicerol e 1,5 ml de etanol absoluto. A mistura foi colocada em uma argamassa e moída manualmente até que todo NCL812 fosse suspenso uniformemente. A suspensão foi sonicada durante 30 minutos. Veículo (55 ml de mistura de Ora Sweet e Ora Plus) foi então adicionado à suspensão e moído durante mais 10 minutos. O volume foi completado com a mistura de Ora Plus e Ora Sweet a 60 ml transferindo para uma proveta
[00379] A Formulação E demonstrou suspensão aceitável e demonstrou estabilidade a curto prazo aceitável.
Formulação F - Injeção Intramuscular
20 mg/ml de Polivinilpirrolidona K30 (PVPK30);
0.09mg/ml de NCL812; e
50ml de água.
[00380] Dois por cento de solução w/v de PVP K30 foi preparada pela adição de 1,0 g de PVP K30 a 50 ml de água MilliQ. A solução foi então colocada num sonicador durante 30 minutos para equilibrar, e 4,5 mg de NCL 812 foi adicionado à solução de PVP e colocadas numa agitadora incubadora a uma velocidade máxima de 10 rpm por um período de 24 horas, com a temperatura controlada de 25 ± 1° C. A solução foi transferida para frascos de 5 ml e verificada quanto à clareza, aparência, pH e estabilidade a curto prazo. O pH da solução foi de 7,25.
[00381] A Formulação F demonstrou uma transparência e estabilidade aceitáveis a curto prazo.
EXEMPLO 10: Liberação de NCL812 e NCL099 da Formulação B.
[00382] O objetivo deste estudo foi medir a liberação de NCL812 e NCL099 da Formulação B preparada no Exemplo 9.
[00383] Células de difusão de Franz foram utilizadas para quantificar a taxa de liberação a partir de NCL812 e NCL099 a partir de suas formulações tópicas. Cinco mililitros de etanol absoluto, o qual foi escolhido como o meio de liberação desejado, foram carregados na câmara receptora. A temperatura do fluído receptor foi mantida constante, a 32 ± 1° C utilizando uma camisa de água. Membranas de acetilcelulose, com tamanho de poro de 0,45 μm (Pall Corporation) foram selecionadas e colocadas entre a câmara doadora e receptora. Seguido por isso, um número de amostras de teste (Formulação B) foi carregado dentro da câmara doadora. Um mililitro de fluído receptor foi coletado em intervalos de tempo regulares de 0,25, 0,50, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 24 horas, através da porta de amostragem. Um mililitro de etanol absoluto fresco foi imediatamente devolvido para a câmara receptora. UV-HPLC foi utilizado para analisar o conteúdo dos fluídos receptores obtidos.
[00384] A Figura 41 apresenta a liberação cumulativa de NCL812 e NCL099 ao longo do tempo. Este estudo demonstra que a Formulação B fornece um perfil de liberação aceitável para NCL812 e NCL099.
EXEMPLO 11: Listas de Espectroscopia de NMRA dos Compostos NCL812, NCL001-NCL230
[00385] A Espectroscopia de NMR foi realizada em compostos NCL812, NCL001-NCL230 usando métodos padrão na técnica. As listas de espectroscopia de NMR são apresentados na Tabela 46.
Tabela 46: Listas de Espectroscopia de NMR dos Compostos NCL812, NCL001-NCL230
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EXEMPLO 12: Tratamento de uma infecção bacteriana in vivo pela administração de NCL812 ou NCL099.
[00386] O objetivo deste estudo foi determinar a eficácia de um Produto Veterinário Experimental contendo NCL812 ou NCL099 no tratamento de uma infecção de pele em camundongos.
[00387] Resumo do Modelo: Um sistema de modelo animal útil deve ser clinicamente relevante, experimentalmente robusto, eticamente aceitável, conveniente para executar e deve fornecer resultados confiáveis e reprodutíveis. Existem diversos modelos animais de infecção tópica de pele que têm sido descritos, incluindo o modelo de pele inflamada com óleo de cróton (Akiyama, H., H. Kanzaki, Y. Abe, J. Tada e J. Arata (1994). "Infecção por staphylococcus aureus em pele inflamada por óleo de cróton em camundongos." Journal of Dermatological Science 8(1): 1-10), o modelo de pele queimada (Stieritz, DD, A. Bondi, D. McDermott e EB Michaels (1982). "Um modelo de camundongo queimado para avaliação de atividade anti-pseudomonas de agentes tópicos." Journal of Antimicrobial Chemotherapy 9 (2): 133-140), o modelo de sutura de feridas de pele (McRipley, RJ e RR Whitney (1976). "Caracterização e Quantificação de Infecções de Feridas Cirúrgicas Experimentais Usadas para Avaliar Agentes Tópicos Antibacterianos." Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia 10 (1): 38-44), o modelo de extração por fita de pele (Kugelberg, E., T. Norström, TK Petersen, T. Duvold, DI Andersson e Hughes D. (2005). "Estabelecimento de um Modelo de Infecção de Pele Superficial em Camundongos Usando Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes." Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia 49(8): 3435-3441) e o método de corte de bisturi linear de espessura total (Guo, Y., RI Ramos, JS Cho, NP Donegan, AL Cheung e LS Miller (2013). "Imagem de Bioluminescência In Vivo para Avaliar Antibióticos Tópicos e Sistemáticos contra Feridas de Pele Infectadas por Staphylococcus aureus de Comunidades Adquiridas Resistentes à Meticilina em Camundongos." Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia 57(2): 855-863)
[00388] Estudos preliminares antes da realização do estudo atual estabeleceram um novo método de infecção de pele que surgiu de um estudo detalhado dos modelos acima mencionados. Resumidamente, os camundongos do estudo são anestesiados, um pedaço da pele dorsal é removida para revelar a pele e uma área circular de pele é removida com um perfurador manual, deixando uma ferida no dorso com uma cavidade central. A ferida é infectada com uma quantidade conhecida do organismo de desafio. Aproximadamente de quatro a seis horas após a infecção, a ferida é ou tratada topicamente com uma formulação do veículo ou uma formulação ativa. A ferida na pele infectada é retratada a cada 12 horas para um total de 14 tratamentos. Os camundongos são humanamente eutanasiados, a área da ferida infectada original é dissecada e removida e o seu conteúdo bacteriano quantificado por meio de testes microbiológicos padronizados. Desta forma, a alteração na concentração bacteriana devido ao tratamento com a formulação ativa pode ser prontamente determinada através do exame da redução da carga bacteriana em comparação com o controle de veículo.
Materiais e Métodos Preparação do Inóculo de Infecção
[00389] Culturas frescas de bactéria Staphylococcus aureus foram cultivadas em Ágar com Sangue de Ovelha a 37° C durante 16 a 18 horas. Algumas colônias típicas foram selecionadas e suspensas em 10 ml de Caldo de Soja Tríptico e incubadas durante a noite numa incubadora com agitação (240 rpm) a 37° C. A suspensão foi submetida a vórtice durante a noite e diluída (1:100) em caldo de soja tríptico fresco (100 μl [0,1 mL] em 9,9 ml de caldo). A suspensão fresca foi incubada durante 3 horas numa incubadora com agitação (conforme acima), a fim de obter bactérias em fase semi-logarítmica. As bactérias foram peletizadas através de centrifugação a 7.500 rpm durante 10 minutos. Caldo sobrenadante foi removido e as bactérias suspensas em 10 ml de Salina Tamponada com Fosfato (PBS). Esses passos foram repetidos mais duas vezes. A densidade da suspensão foi verificada pela medição da absorvância em 600 nm, usando espectrofotômetro com solução salina como um branco, para confirmar a densidade alvo em uma leitura de aproximadamente 0,100, consistente com uma densidade bacteriana de 2,5 x 107 CFU/ml. A suspensão foi colocada em um rack posicionado em uma caixa de transporte bloqueável com um bloco de gelo para manter a refrigeração durante o transporte, seguido pelo armazenamento em câmara resfriada após a chegada ao laboratório de infecção de pele de camundongo. A suspensão final foi bem misturada antes de inocular as feridas de pele criadas nos camundongos.
[00390] A fim de assegurar a pureza e a precisão da suspensão, os passos a seguir foram realizados antes da colocação na caixa de segurança.
[00391] A pureza da suspensão bacteriana assegurada através de espalhamento de 100 μl da suspensão final em uma placa de SBA (ágar com sangue de ovelha) que foi incubada a 37° C durante 18 horas e examinadas para confirmar o crescimento uniforme de um tipo de colônia. ontagens de viáveis foram efetuadas na suspensão final preparando-se solução salina em tubos de Eppendorf (aproximadamente 900 μl por tubo), removendo 100 μl da amostra e adicionando ao primeiro tubo de Eppendorf, submetendo a mistura a vórtice, e repetindo usando o 2° tubo de Eppendorf contendo a solução salina. Este processo foi continuado para 5 - 6 tubos. Finalmente, 100 μl da 5a e 6a diluições foram plaqueadas em ágar de contagem, incubadas a 37°C durante 18 horas e realizadas contagens de colônias para confirmar que CFU/ml foi de aproximadamente 2,5 x 107. Após a inoculação das feridas, esse processo foi repetido para assegurar que não nenhuma contaminação ou diminuição nas contagens viáveis tenha ocorrido durante o tempo de cirurgia.
Procedimento Cirúrgico de Ferida de Pele
[00392] Cada camundongo foi colocado dentro da câmara de indução e a anestesia induzida usando 2% de isoflurano. Os olhos de cada camundongo anestesiado foram cobertos com lubrificante ocular veterinário, a fim de evitar a desidratação da córnea. Cada camundongo foi removido da câmara de indução e colocado na área cirúrgica, na frente do cone de nariz estético individual. Enquanto sob anestesia, cada camundongo foi monitorado para avaliação da profundidade da anestesia (resposta à dor, reflexo de piscar, tônus muscular esquelético) e função respiratória e cardíaca. O pelo da pele dorsal foi raspado da área cirúrgica com aparadores mecânicos. A área raspada foi limpa usando 70% de etanol aplicado em papel toalha seguido por 10% p/v de solução de iodopovidona . Uma vez que a solução de iodo foi seca, uma injeção subcutânea do agente anti-inflamatório não esteróide meloxicam foi administrada. A pele dorsal foi pinçada suavemente para permitir a criação de uma ferida de espessura total circular usando perfurador de orelha/biópsia. Camundongos tratados com controle de veículo e NCL812 e NCL099 tinham feridas inoculadas com 10 ul de suspensão bacteriana utilizando uma micropipeta (2,5 x 105 CFU/10 ul). Uma vez que a suspensão bacteriana foi seca, os camundongos foram colocados em caixas individuais de recuperação marcadas com o número do camundongo. O tempo de inoculação foi registrado. Os pesos corporais iniciais de cada camundongo foram registrados na ficha de classificação adequada. Os camundongos recuperaram plena consciência dentro de 5 minutos. Os camundongos recuperados foram devolvidos ao alojamento individual e monitorados de hora em hora para complicações pós-cirúrgicas ou anestésicas.
Cuidados Pós-Cirúrgicos (4 horas após a cirurgia)
[00393] Os camundongos foram avaliados para as complicações pós-cirúrgicas e as observações foram registadas na folha de registo clínico. Cada camundongo foi cuidadosamente removido do IVC e colocado dentro de um recipiente de avaliação, evitando manipulação ou toque excessivo do local cirúrgico. Uma vez o camundongo dentro do recipiente de avaliação, ele foi avaliado e as observações registradas na folha de registo clínico pós-cirúrgico. Sempre que os pontos de ruptura de bem-estar sugeridos foram alcançados, a analgesia pós-operatória foi administrada e registrada na folha de registo clínico.
Monitoramento Animal e Cuidados Diários
[00394] Administração de Antibióticos (07:00 e 18:00 h). A primeira administração de pomada de veículo ou NCL812 ou NCL099 ocorreu 4 horas após a cirurgia. Cada recipiente de pomada foi pesada antes da administração e o peso registado. Cada camundongo foi cuidadosamente contido. A pomada (veículo ou NCL812 ou NCL099) foi aplicada à área da lesão e o camundongo foi devolvido à IVC, onde cada um foi observado para assegurar que a pomada não fosse removida imediatamente por escovação. O peso do recipiente da pomada pós-administração foi registrado. O veículo e produtos de NCL ativos foram aplicados sobre a ferida da pele cada 12 horas após a primeira administração, para um total de 14 tratamentos consecutivos. Ambos os produtos NCL812 e NCL099 (Formulação B, tal como apresentado no Exemplo 9) continham os respectivos ingredientes ativos a uma concentração de 20 mg/g. Aproximadamente 0,1 a 0,2 g de pomada foi aplicada em cada ocasião, proporcionando uma dose tópica total de NCL812 ou NCL099 entre 28 e 56 mg ao camundongo pesando entre 18 g e 25 g.
[00395] Acompanhamento Diário. O acompanhamento de cada camundongo teve lugar uma vez por dia por volta das 12:00 h. Cada camundongo cuidadosamente removido de IVC e colocado dentro de um recipiente de observação, evitando manipulação ou toque excessivo do local cirúrgico. A pelagem, postura, olhos, comportamento, vocalização e atividade enquanto no recipiente foram cuidadosamente avaliadas e as observações registradas na ficha de avaliação. As fezes (tanto no piso de gaiola quanto no recipiente) foram examinadas quanto à consistência e as observações registradas. O peso de cada camundongo foi determinado enquanto estava no recipiente e as alterações no peso corporal calculadas e registadas. O recipiente de observação foi desinfectado com etanol e separado para secar enquanto um recipiente fresco foi usado para o próximo camundongo. A cada dois dias, os camundongos foram novamente anestesiados usado 2% de isoflurano e fotografados com uma régua para o referenciamento de tamanho. Essas fotos foram usadas para avaliar o tamanho da lesão e a progressão da infecção durante o período de teste.
Análise de tecidos e avaliação da eficácia antibacteriana
[00396] No final do período de avaliação da ferida de 7 dias, todos os camundongos de teste foram eutanasiados antes da coleta da ferida para exame post mortem. A ferida foi dissecada do dorso de cada camundongo. A amostra foi colocada num tubo de amostra e pesada antes de 1 ml de PBS e grânulos de homogeneização de tecidos estéreis serem adicionados. As amostras de tecido foram homogeneizadas durante 10 minutos usando um homogeneizador de tecidos (Next Advance Bullet Blender) e, em seguida, agitadas em vórtice durante aproximadamente 30 segundos. 100 ul de sobrenadante foi removido e colocado em um tubo de Eppendorf contendo 900 uL de PBS. Esse procedimento foi repetido utilizando diluições em série para um total de 8 diluições. Finalmente, 100 μl de cada diluição foi pipetada em um ágar de contagem em placa, em duplicado, e incubada durante a noite a 37° C. Dez microlitros da suspensão original foram colocados em ágar com sangue de ovelha para avaliar a pureza da cultura e incubados durante a noite a 37° C. No dia seguinte, contagens viáveis foram realizadas utilizando placas de ágar de contagem em placa incubada e a identidade de taphylococcus aureus (organismos de desafio) como a cepa colhida foi confirmada.
Resultados
[00397] A contagem média de colônias por grama de tecido observada no grupo tratado com veículo foi 5.888.436 (6.77 log10). A contagem média de colônias por grama de tecido observada no grupo NCL812 foi 141.254 (5.15 log10). A contagem média de colônias por grama de tecido observada em camundongos tratados com NCL099 foi 1.318 (3,12log10). As unidades formadoras de colônias log10 por grama de tecido e a redução percentual estão resumidos na tabela a seguir.
Tabela 47: Unidades formadoras de colônias de log10 por grama de tecido e a redução percentual a seguir à administração tópica de veículo e de tratamento.
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[00398] É evidente a partir desta tabela que o tratamento com qualquer NCL812 ou NCL099 leva a reduções de alto nível no número de infecções por Staphylococcus aureus. Estes resultados demonstram o tratamento eficaz de uma colonização bacteriana ou infecção in vivo por administração de compostos da invenção.

Claims (10)

  1. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em:
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-fluorofenil)metileno] carbonimídica (NCL023);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-cianofenil)metileno] carbonimídica (NCL025);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-cianofenil)metileno] carbonimídica (NCL026);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-metoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL029);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis {[2- (trifluorometil) fenil] metileno} carbonimídica (NCL036);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[3-(trifluorometil)fenil]metileno}carbonimídica (NCL037);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-metilfenil)metileno] carbonimídica (NCL039);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-metilfenil)metileno] carbonimídica (NCL040);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{1-[4-(trifluorometil)fenil]etilideno} carbonimídica (NCL061);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[1-(4-clorofenil)etilideno]-2'-{1-[4-(trifluorometil)fenil]metileno} carbonimídica (NCL068);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-{1-[4-(trifluorometil)fenil]etilideno}-2'-{[4-(trifluorometil)fenil]metileno} carbonimídica (NCL075);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(4-clorofenil)metileno]-2'-[(4-metilfenil)metileno] carbonimídica (NCL076);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-{[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]metileno}-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL078);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(4-clorofenil)metileno]-2'-[(4-fluorofenil)metileno]carbonimídica (NCL079);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-{1-[4-(trifluorometil)fenil]etilideno}-2'-[(4-clorofenil)metileno]carbonimídica (NCL080);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[1-(4-clorofenil)etilideno]-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL081);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(2-fluoro-4-clorofenil)metileno]-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL084);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(2-cianofenil)metileno]-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL085);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(3-cianofenil)metileno]-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL086);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[(2-fluorofenil)metileno]-2'-[(4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL088);
    Cloridrato de di-hidrazida 2-[1-(4-clorofenil)etilideno]-2'-{1-[4-
    (trifluorometil)fenil]etilideno} carbonimídica (NCL089);
    Cloridrato de hidrazina carboximidamida de N-benzoil-1-benzoila-2-[(2-clorofenil)metileno] (NCL090);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(ciclo-hexilmetileno) carbonimídica (NCL094);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(3-furanilmetileno) carbonimídica (NCL095);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3,4,5-trihidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL097);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-carboxifenil)metileno] carbonimídica (NCL098);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[4-(1,1-dimetiletil)fenil]metileno} carbonimídica (NCL099);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2,3-dihidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL101);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2,4,5-trihidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL104);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2,3,4-trihidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL105);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4,5-dihidroxi-3-metoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL106);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-hidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL108);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3,4-dihidroxifenil)metileno] carbonimídica (NCL111);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis([1,1'-bifenil]-4-ilmetileno) carbonimídica (NCL112);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3,5-diclorofenil)metileno] carbonimídica (NCL114);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3,4-dimetoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL115);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis([1,1'-bifenil]-2-ilmetileno) carbonimídica (NCL116);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2,5-fluorofenil)metileno] carbonimídica (NCL118);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-acetamidofenil)metileno] carbonimídica (NCL119);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-propilfenil)metileno] carbonimídica (NCL121);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-hidróxi-3-nitrofenil)metileno] carbonimídica (NCL122);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3,4-difluorofenil)metileno] carbonimídica (NCL123);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-hidróxi-1-naftalenil)metileno] carbonimídica (NCL124);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-hidroxi-4-metoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL125);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-etinilfenil)metileno] carbonimídica (NCL126);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-bromo-4,5-dimetoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL130);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(3-bromofenil)metileno] carbonimídica(NCL131);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-cloro-6-fluoro-2H-1-benzopiran-3-il)metileno] carbonimídica (NCL132);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-bromo-2-furanil)metileno]carbonimídica (NCL133);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-bromo-4,5-dimetoxifenil)metileno] carbonimídica (NCL135);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(4-butilfenil)metileno] carbonimídica (NCL136);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2,6-diclorofenil)metileno] carbonimídica (NCL137);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(2,3-difenil-2-propenilideno) carbonimídica(NCL138);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(3-quinolinilmetileno) carbonimídica (NCL139);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[4-(metilsulfanil)fenil]metileno} carbonimídica (NCL140);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(5-clorobenzo[b]tien-3-il)metileno] carbonimídica (NCL141);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(5-bromo-2-furanil)metileno] carbonimídica (NCL144);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(5-cloro-2-furanil)metileno] carbonimídica (NCL145);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(1H-indol-5-ilmetileno) carbonimídica (NCL146);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(2-quinoxalinilmetileno) carbonimídica (NCL147);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[4-(carboxipropenil)fenil]metileno} carbonimídica (NCL148);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[3-(4-metoxilfenil)-2-propenilideno]carbonimídica (NCL150);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-hidróxi-3-metilfenil)metileno]carbonimídica (NCL152);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(4-clorofenil)propilideno] carbonimídica (NCL153);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(4-clorofenil)pentilideno]carbonimídica (NCL154);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(4-clorofenil)butilideno]carbonimídica (NCL156);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-amino-4-clorofenil)metileno] carbonimídica (NCL157);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(2-hidróxi-4-clorofenil)propilideno]carbonimídica (NCL158);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[(2-hidróxi-4-clorofenil)(ciclopentil)metileno] carbonimídica (NCL159);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(4-piperazinilfenil)etilideno]carbonimídica (NCL161);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(2-amino-4-clorofenil)etilideno]carbonimídica (NCL164);
    Triloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(1-fenil-2-aminoetilideno) (NCL165);carbonimídica
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[4-(trifluorometilsulfanil)fenil]metileno}carbonimídica (NCL166);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(fenilcarboximetileno) carbonimídica (NCL167);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis{[2-(1-hidroxietilamino)-4-clorofenil]metileno} carbonimídica (NCL168);
    Di-hidrazida de 2,2'-bis[(2-amino-4-clorofenil)metileno]carbonimídica (NCL169);
    Di-hidrazida de 2,2'-bis[(2-acetamido-4-clorofenil)metileno]carbonimídica (NCL170);
    Di-hidrazida de 2,2'-bis{[4-(dimetilamino)-2-hidroxifenil]metileno} carbonimídica (NCL171);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-Bis[1-(2-piridinil)etilideno]carbonimídica (NCL172);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis[1-(4-cloro-2-hidroxifenil)etilideno] carbonimídica (NCL173);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-bis(4-cloro-2-hidroxifenilmetileno)carbonimídica (NCL174);
    Cloridrato de di-hidrazida 2,2'-Bis(2-aminopiridin-3-ilmetileno) carbonimídica (NCL176);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidamida (E)-2-(1-(4-clorofenil)pentilideno) (NCL188);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidamida (Z)-2-(1-(4-clorofenil)-2-hidraziniletilideno) (NCL190);
    Cloridrato de ácido (Z) -2- (2-carbamimidoil-hidrazono)-2-fenilacético (NCL192);
    4,6-bis(2-((E)-4-bromobenzilideno)hidrazinil)pirimidin-2-amina (NCL193);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidi-hidrazida (E)-N’-((E)-[1-(4-cloro-2-fluorofenil)etilideno)- 2-(1-(4-cloro-2- fluorofenil)etilideno) (NCL215);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidi-hidrazida N',2-bis((E)-4-cloro-2-fluorobenzilideno) (NCL216);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidi-hidrazida N',2-bis((E)-1-(p-tolil)etilideno) (NCL217);
    Cloridrato de hidrazina-1-carboximidi-hidrazida (E)-N'-((E)-1-(4-(terc-butil)fenil)etilideno)-2-(1-(4-(terc-butil)fenil)etilideno) (NCL219);
    2-((E)-4-clorobenzilideno)-1-((E)-N'-((E)-4-clorobenzilideno)carbamohidrazonoil)-N-etil-hidrazina-1- carboxamida (NCL226);
    N-benzil-2-((E)-4-clorobenzilideno)-1-((E)-N'-((E)-4-clorobenzilideno)carbamo-hidrazonoil)hidrazina-1-carboxamida (NCL227);
    2-((E)-4-clorobenzilideno)-1-((E)-N'-((E)-4-clorobenzilideno)carbamohidrazonoil)-N-hexil-hidrazina-1-carboxamida (NCL228);
    2-((E)-4-clorobenzilideno)-1-((E)-N'-((E)-4-clorobenzilideno)carbamohidrazonoil)-N-(furan-2- ilmetil)hidrazina-1-carboxamida (NCL229);
    e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
  2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que compreende: NCL146; NCL157; NCL158; NCL193; NCL216; NCL217; NCL219.
  3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal de cloreto.
  4. Uso de um composto, conforme definido na reivindicação 1, ou um sal terapeuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma colonização bacteriana ou infecção em um indivíduo.
  5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente bacteriano é:
    • i) Gram-positivo; e/ou
    • ii) selecionado a partir do grupo que compreende: Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis e Clostridium difficile.
  6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente bacteriano é:
    • i) Gram-negativo; e/ou
    • ii) selecionado a partir do grupo que compreende: espécies de Acinetobacter, Aeromonas hydrophila, espécies de Citrobacter, espécies de Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, espécies de Neisseria e Stenotrophomonas maltophilia.
  7. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente bacteriano não tem parede celular.
  8. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto conforme definido na reivindicação 1, ou um sal terapeuticamente aceitável do mesmo, é fabricado para administração por via oral, por via parental ou por via tópica.
  9. Composição farmacêutica antibacteriana, caracterizada pelo fato de compreender o composto conforme definido na reivindicação 1, ou um sal terapeuticamente aceitável do mesmo, e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
  10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração por via oral, administração por via parenteral ou administração por via tópica.
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