BR112014031616B1

BR112014031616B1 - Fenoxietil piperidina, seu sal de cloridrato, e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112014031616B1
Application number: BR112014031616-3A
Authority: BR
Inventors: Matthew Allen Schiffler; Jeremy Schulenburg York
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2022-06-21
Also published as: MX345324B; IL236219A; MY173878A; GT201400288A; EA201492255A1; AP2014008164A0; CN104411684B; AU2013280875B2; MA37686A1; HK1203937A1; EP2867207A1; EP2867207B1; RS56452B1; US20150126555A1; SG11201408641UA; IL236219A0; PL2867207T3; MX2014015953A; JP6127136B2; ME02840B

Abstract

FENOXIETIL PIPERIDINA, SEU SAL DE CLORIDRATO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a um composto da Fórmula II; Fórmula II em que X é: R1 é H, -CN, ou F; R2 é H ou metila; R3 é H; e R4 é H, metila, ou etila; ou R3 e R4 juntos formam um anel de ciclopropila; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Description

[001] A presente invenção se refere a novos compostos de feno-xietil piperidina, a composições farmacêuticas compreendendo os compostos, a métodos de usar os compostos para tratar transtornos fisiológicos, e a intermediários e processos úteis na síntese dos compostos.

[002] A presente invenção está no campo de tratamento de condições inflamatórias, tais como artrite, incluindo osteoartrite e artrite reumatoide, e incluindo ainda dor associada com estas condições. Artrite afeta milhões de pacientes só nos Estados Unidos e é uma principal causa de incapacidade. Os tratamentos frequentemente incluem NSAIDs (fármacos anti-inflamatórios não esteroidais) ou inibidores de COX-2, que podem produzir efeitos colaterais cardiovasculares e/ou gastrointestinais adversos. Como tal, pacientes que têm um perfil cardiovascular deficiente, tal como hipertensão, podem ser impedidos de usar NSAIDs ou inibidores de COX-2. Assim, existe uma necessidade por um tratamento alternativo de osteoartrite e artrite reumatoide, preferivelmente sem os efeitos colaterais dos tratamentos correntes.

[003] Quatro subtipos de receptor de prostaglandina E2 (PGE2) foram identificados como os seguintes: EP1, EP2, EP3, e EP4. Foi divulgado que EP4 é o receptor primário envolvido em dor inflamatória nas articulações em modelos de roedor de artrite reumatoide e osteo- artrite (Ver, por exemplo, J. Pharmacol. Exp. Ther., 325, 425 (2008)). Consequentemente, um antagonista de EP4 seletivo pode ser útil em tratar artrite, incluindo dor artrítica. Além disso, foi sugerido que visto que o antagonismo de EP4 não interfere com a biossíntese de prosta- noides, tais como PGI2 e TxA2, um antagonista de EP4 seletivo pode não possuir os efeitos colaterais cardiovasculares potenciais observa- dos com NSAIDs e inibidores de COX-2. (Ver, por exemplo, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21, 484 (2011)).

[004] A WO 2013/004290 divulga derivados de amina cíclicos como antagonistas do receptor de EP4. A US 2005/0250818 divulga certos compostos de aril e heteroaril amida orto substituídos que são antagonistas seletivos do receptor de EP4 com atividade analgésica. Além disso, a WO 2011/102149 divulga certos compostos que são antagonistas de EP4 seletivos que são úteis em tratar doenças mediadas por IL-23.

[005] A presente invenção fornece novos compostos que são inibidores seletivos de EP4 em relação a EP1, EP2, e EP3. Além disso, a presente invenção fornece novos compostos com o potencial para efeitos colaterais cardiovasculares ou gastrointestinais reduzidos em comparação a NSAIDs tradicionais.

[006] Consequentemente, a presente invenção fornece um com posto da Fórmula II:

em que X é:

R1 é H, -CN, ou F; R2 é H ou metila; R3is H; e R4 é H, metila, ou etila; ou R3 e R4 juntos formam um anel de ciclopropila; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

[007] A presente invenção fornece ainda um composto da Fórmu la I:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

[008] A presente invenção também fornece um método de tartar artrite em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. A presente invenção também fornece um método de tratar os- teoartrite em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Além disso, a presente invenção também fornece um método de tratar artrite reumatoide em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. A presente invenção também fornece um método de tratar dor associada com artrite em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. A presente invenção fornece ainda um método de tratar dor associada com osteoar- trite ou artrite reumatoide em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceu- ticamente aceitável deste.

[009] Além disso, a invenção fornece um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste para o uso em terapia, em particular para o tratamento de osteoartrite. Além disso, a invenção fornece um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste para o uso no tratamento de artrite reumatoide. A invenção também fornece um composto ou sal farmaceuticamente aceitável deste para o uso no tratamento de dor associada com osteoartrite ou artrite reumatoide. Além disso, a invenção fornece o uso de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite. A invenção fornece o uso de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceutica- mente aceitável deste, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de artrite reumatoide. A presente invenção também fornece o uso de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de dor associada com osteoartrite ou artrite reuma- toide.

[0010] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em combinação com um ou mais carregadores, diluentes, ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma forma de realização particular, a composição compreende ainda um ou mais outros agentes terapêuticos. Esta invenção também abrange novos intermediários e processos para a síntese de um composto da Fórmula I ou Fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

[0011] Além disso, a invenção inclui um método de tratar condições inflamatórias tais como artrite, incluindo osteoartrite e artrite reu- matoide, em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um antagonista de uma prostaglandina pró-inflamatória, tal como um antagonista de EP4, em combinação com uma quantidade eficaz de um mo- dulador de um receptor de lipoxina ou resolvina, tal como um modula- dor de BLT-1, BLT-2, ALX/FPR1, GPR32, CysLT1, CysLT2, ou ChemR23.

[0012] Um outro aspecto da invenção inclui um método de tartar doença inflamatória tal como artrite, incluindo osteoartrite e artrite reumatoide, em um paciente, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um inibidor de uma prostaglandina sintase pró-inflamatória, tal como um inibidor de mPGES-1, em combinação com uma quantidade eficaz de um modulador de um receptor de lipoxina ou resolvina, tal como um modulador de BLT-1, BLT-2, ALX/FPR1, GPR32, CysLT1, CysLT2, ou ChemR23.

[0013] Como usado aqui, os termos "tratar" ou "para tratar" inclui proibir, restringir, reduzir, parar, ou reverter a progressão ou severidade de um sintoma ou transtorno existentes.

[0014] Como usado aqui, o termo "paciente" se refere a um mamífero, tal como um camundongo, porquinho-da-índia, rato, cachorro, ou ser humano. É entendido que o paciente preferido é um ser humano.

[0015] Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere à quantidade ou dose do composto da invenção, ou um sal farmaceuti- camente aceitável deste que, em administração de dose única ou múltipla ao paciente, fornece o efeito desejado no paciente sob diagnose ou tratamento.

[0016] Uma quantidade eficaz pode ser facilmente determinada pelo diagnosticador responsável, como uma pessoa habilitada na técnica, pelo uso de técnicas conhecidas e observando-se os resultados obtidos sob circunstâncias análogas. Em determinar a quantidade eficaz para um paciente, vários fatores são considerados pelo diagnosti- cador responsável, incluindo, mas não limitados a: a espécie de mamífero; seu tamanho, idade, e saúde geral; a doença ou transtorno específicos envolvidos; o grau de ou envolvimento ou a severidade da doença ou transtorno; a resposta do paciente individual; o composto particular administrado; o modo de administração; as características de biodisponibilidade da preparação administrada; o regime de dose sele-cionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

[0017] Os compostos da Fórmula I ou da Fórmula II, ou sal farma-ceuticamente aceitável destes, são geralmente eficazes em uma faixa de dosagem ampla. Por exemplo, dosagens por dia normalmente caem dentro da faixa de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo. Em alguns exemplos níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa supracitada podem ser mais do que adequados, embora em outros casos doses ainda maiores podem ser utilizadas com efeitos colaterais aceitáveis, e portanto a faixa de dosagem acima não é intencionada a limitar o escopo da invenção de qualquer modo.

[0018] Os compostos da invenção são preferivelmente formulados como composições farmacêuticas administradas por qualquer via que torna o composto biodisponível. O mais preferivelmente, tais composições são para administração oral. Tais composições farmacêuticas e processos para preparar as mesmas são bem conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21a Edição, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0019] Os compostos da Fórmula I e Fórmula II são particularmente úteis nos métodos de tratamento da invenção, mas certos grupos, substituintes, e configurações são preferidos para os compostos das Fórmulas I e II. Os parágrafos seguintes descrevem tais grupos, subs- tituintes, e configurações preferidos. Será entendido que estas preferências são aplicáveis tanto aos métodos de tratamento quanto aos novos compostos da invenção.

[0020] É preferido que R1 seja H, R2 seja H, R3 seja H, e X seja:

[0021] É preferido ainda que quando R3 for H, que R4 seja metila.

[0022] É preferido ainda que X seja

[0023] Ácido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-Fenoxietil) piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoico da estrutura seguinte:

e os sais farmaceuticamente aceitáveis deste são especialmente pre-feridos.

[0024] Cloridrato do ácido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil) piperidi-na-2-carbonil] amino] etil] benzoico é ainda especialmente preferido.

[0025] Como usado aqui, "kPag" se refere a quilopascais mano-métricos; "Boc" se refere a um grupo de proteção de terc-butóxi carbo nila; "DMEM" se refere a Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; "ACN" se refere a acetonitrila; "DMSO" se refere a sulfóxido de dimeti- la; "DMF" se refere a N,N-dimetilformamida; "EtOH" se refere a etanol; "THF" se refere a tetraidrofurano; "MeOH" se refere a metanol; "EtO- Ac" se refere a acetato de etila; "Et2O" se refere a éter dietílico; "TBME" se refere a éter metil terc-butílico; "BOP" se refere a hexafluo- rofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfônio; "NaHMDS" se refere a bis(trimetilsilil)amida sódica; "PGE2" se refere a prostaglan- dina E2; "FBS" se refere a Soro bovino fetal; "IBMX" se refere a (3- isobutil-1-metilxanthine); "MES" se refere a ácido (2-(N-morfolino) eta- nossulfônico; "HEPES" se refere a (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin- 1-il] etanossulfônico); "HTRF" se refere a tecnologia resolvida no tempo de fluorescência homogênea; "HEK" se refere a rim embrionário humano; "HBSS" se refere a solução salina balanceada de Hank; "EC80" se refere à concentração de um agente que produz 80 % da eficácia máxima possível para este agente; e "IC50" se refere à concentração de um agente que produz 50 % da resposta inibitória máxima possível para este agente.

[0026] Sais farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para prepara-los são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201 - 217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427 – 435 (2000); e Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Phar-maceutical Sciences, 66: 1 - 19, (1977). Uma pessoa habilitada na técnica de síntese avaliará que os compostos da Fórmula I e Fórmula II são facilmente convertidos a e podem ser isolados como um sal far- maceuticamente aceitável, tal como um sal de cloridrato, usando técnicas e condições bem conhecidas a uma pessoa de habilidade co- mum na técnica. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica de síntese avaliará que os compostos da Fórmula I e Fórmula II são facilmente convertidos a e podem ser isolados como a base livre ou o ácido livre correspondentes do sal farmaceuticamente aceitável correspondente.

[0027] A presente invenção considera todos os enantiômeros ou diastereômeros individuais, assim como misturas dos enantiômeros e diastereômeros dos ditos compostos incluindo racematos. Isômeros, enantiômeros, ou diastereômeros individuais podem ser separados ou dissolvidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica em qualquer ponto conveniente na síntese dos compostos da presente invenção por métodos tais como técnicas de cristalização seletivas ou cro- matografia quiral (Ver, por exemplo, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, e E.L. Eliel e S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley- Interscience, 1994).

[0028] O composto da presente invenção, ou sais farmaceutica-mente aceitáveis deste, podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, alguns dos quais são ilustrados nos esquemas, preparações, e exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas em diferentes modos, ou em combinação com etapas de diferentes esquemas, para preparar o composto da Fórmula I, ou sal farmaceuti- camente aceitável deste. Os produtos de cada etapa nos esquemas abaixo podem ser recuperados por métodos convencionais, incluindo extração, evaporação, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, e cristalização. Os reagentes e materiais de partida estão prontamente disponíveis a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Todos os substituintes, a menos que de outro modo especificado, são como pre-viamente definidos. É entendido que estes esquemas, preparações, e exemplos não são intencionados a ser limitantes ao escopo da invenção de modo algum.Esquema 1

Preparação 1

[0029] Síntese de (S)-N-terc-butoxicarbonil-1-(4-bromofenil) etila- mina.

[0030] Esquema 1, Etapa A: A uma solução em agitação de (-)-1-(4-bromofenil)etilamina (1,00 g, 5,0 mmol) em diclorometano (10 mL) a 0 °C, adicionar di-terc-butildicarbonato (1,09 g, 5,0 mmol). Permitir que a mistura de reação aqueça até a temperatura ambiente, depois agitar por duas horas. À mistura em agitação, adicionar ácido clorídrico aquoso 1 M (25 mL), seguido por Et2O (25 mL). Separar as camadas, e extrair a camada aquosa com Et2O (2 x 25 mL). Combinar as camadas orgânicas, lavar com NaCl aquoso saturado (25 mL), secar a camada orgânica em MgSO4, filtrar para remover os sólidos, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (1,50 g, 99 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) (79Br/81Br) 244/246 (M + 2H - t-Bu)+, 322/324 (M + Na)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,46-7,43 (m, 2H), 7,19-7,15 (m, 2H), 4,814,65 (m, 1H), 1,48-1,36 (m, 12H).

[0031] Preparar o composto seguinte essencialmente pelo método da Preparação 1, usando 1-(4-bromofenil)ciclopropanamina no lugar de (-)-1-(4-bromofenil)etilamina:

Preparação 3

[0032] Síntese de (S)-4-(1-terc-butoxicarbonilaminoetil)benzoate de metila.

[0033] Esquema 1, Etapa B: A uma autoclave Parr com agitação mecânica, adicionar Pd(OAc)2 (120 mg, 0,53 mmol), 1,1’-bis (difenilfos- fino) ferroceno (355 mg, 0,64 mmol), (S)-N-terc-butoxicarbonil-1-(4- bromofenil) etilamina (1,50 g, 5,0 mmol), CH3CN anidro (45 mL), CH3OH anidro (30 mL), e trietilamina (1,9 mL, 13,63 mmol). Vedar o vaso e pressurizar com monóxido de carbono a 724 kPag. Aquecer o vaso até 85 °C e agitar a mistura durante a noite. Ventilar o vaso de reação (Cuidado - gás venenoso!) e transferir para um frasco de fundo redondo, enxaguando com CH3OH. Concentrar a mistura sob pressão reduzida para fornecer um resíduo laranja. Adicionar água (50 mL), depois extrair com EtOAc (2 x 50 mL). Lavar as fases orgânicas combinadas com NaCl aquoso saturado (25 mL), depois separar as camadas, secar a fase orgânica em MgSO4, filtrar para remover os sólidos, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. Purificar o produto por cromatografia instantânea em sílica-gel eluindo com um gradiente de 0 % a 60 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (1,00 g, 72 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 224 (M + 2H - t-Bu)+, 302 (M + Na)+, 581 (2M + Na)+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,89 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 4,64 (dq, J = 7,4, 6,8 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,34 (br s, 9H), 1,28 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

[0034] Preparar o composto seguinte essencialmente pelo método da Preparação 3, usando N-[1-(4-bromofenil)ciclopropil]carbamato de terc-butila no lugar de (S)-N-terc-butoxicarbonil-1-(4-bromofenil) etila- mina:

Preparação 5

[0035] Síntese de cloridrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de me-tila.

[0036] Esquema 1, Etapa C: Ao (S)-4-(1-terc-butoxicarbonilaminoetil) benzoato de metila (1,00 g, 3,58 mmol), adicionar cloreto de hidrogênio (4 M em dioxano, 5 mL, 20 mmol) e agitar a mistura resultante na temperatura ambiente por uma hora. Concentrar a mistura sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (750 mg, 97 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,57 (br s, 3H), 7,99 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,47 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 1,50 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

[0037] Preparar o composto seguinte essencialmente pelo método da Preparação 5, usando 4-[1-(terc-butoxicarbonilamino) ciclopropil] benzoato de metila no lugar de (S)-4-(1-terc-butoxicarbonilaminoetil) benzoato de metila:

Esquema 2

Preparação 7

[0038] Síntese de 1-(2,2-dimetoxietóxi)-4-fluorobenzeno.

[0039] Esquema 2, Etapa A: Dissolver 4-fluorofenol (5,5 g, 49,1 mmol) em acetonitrila (49 mL) e tratar a solução com 2-bromo-1,1- dimetoxietano (11,6 mL, 98,1 mmol) e K2CO3 (16,95 g, 122,7 mmol). Aquecer a solução até o refluxo com agitação por cinco dias. Filtrar a mistura, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Submeter o ma-terial bruto resultante à cromatografia em sílica-gel eluindo com um gradiente de 0 % a 50 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo incolor (5,85 g, 60 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 218 (M + NH4)+, 223 (M + Na)+.Esquema 3

Preparação 8

[0040] Síntese de (2,2-dimetoxietóxi)ciclo-hexano.

[0041] Esquema 3, Etapa A: Dissolver ciclo-hexanol (2,00 mL, 19,1 mmol) em DMF (9,6 mL), depois adicionar NaHMDS (solução 1 M em THF, 21,0 mL, 21,0 mmol), e agitar a solução na temperatura ambiente por 5 min. Adicionar 2-bromo-1,1-dimetoxietano (2,26 mL, 19,1 mmol), depois agitar a mistura na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio por três dias. Diluir a mistura com EtOAc (250 mL) e lavar com NaCl aquoso saturado (2 x 250 mL). Secar a fase orgânica em MgSO4, filtrar, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida. Submeter o material bruto resultante à cromatografia em sílica-gel eluindo com um gradiente de 0 % a 10 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo amarelo claro (1,10 g, 31 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 4,47 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 3,49 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 3,39 (s, 6H), 3,25 (tt, J = 9,2, 3,7 Hz, 1H), 1,94-1,87 (m, 2H), 1,76-1,69 (m, 2H), 1,55-1,49 (m, 1H), 1,34-1,17 (m, 5H). Esquema 4

Preparação 9

[0042] Síntese de 2-(4-fluorofenóxi)acetaldeído.

[0043] Esquema 4, Etapa A: Dissolver 1-(2,2-dimetoxietóxi)-4- fluorobenzeno (1,00 g, 4,99 mmol) em clorofórmio (5,0 mL) e tratar a mistura com ácido trifluoroacético (0,755 mL, 9,99 mmol). Agitar a mis-tura na temperatura ambiente por dois dias, depois aquecer até 65 °C e agitar por 4 h. Concentrar a mistura sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo incolor em pureza de cerca de 70 %, como indicado por análise de 1H RMN (550 mg, 71 % de rendimento não corrigido). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 9,85 (t, J = 0,5 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 8,9, 8,5 Hz, 2H), 6,85 (dd, J = 9,5, 4,3 Hz, 2H), 4,55 (br s, 2H).Esquema 5

Preparação 10

[0044] Síntese de 2-(ciclo-hexilóxi)acetaldeído.

[0045] Esquema 5, Etapa A: Acidificar uma mistura de (2,2-dimetoxietóxi) ciclo-hexano e água (30 mL) a um pH de 1,0 com ácido sulfúrico (solução aquosa 9,0 M), e conectar a mistura a uma cabeça de destilação de caminho curto. Reduzir a pressão para 26,7 kPa e aquecer a mistura até 100 °C por 1 h. Resfriar a mistura até a temperatura ambiente, depois extrair a camada aquosa com TBME (2 x 75 mL). Lavar as camadas orgânicas combinadas com NaHCO3 aquoso saturado (75 mL) e NaCl aquoso saturado (75 mL). Secar a fase orgânica em MgSO4, filtrar, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (634 mg, 51 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 9,73 (t, J = 1,0 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 1,0 Hz, 2H), 3,31 (tt, J = 9,2, 3,9 Hz, 1H), 1,95-1,89 (m, 2H), 1,79-1,68 (m, 2H), 1,57-1,50 (m, 1H), 1,39-1,20 (m, 5H).Esquema 6

Preparação 11

[0046] Síntese de (R)-1-(2-fenoxietil) piperidina-2-carboxilato de metila.

[0047] Esquema 6, Etapa A: Dissolver (R)-piperidina-2-carboxilato de metila (5,00 g, 34,9 mmol) em DMF (87 mL) e tratar com K2CO3 (14,48 g, 104,8 mmol) e β-bromofenetol (7,16 g, 34,9 mmol). Agitar a mistura durante a noite a 100 °C. Resfriar a mistura até a temperatura ambiente e adicionar EtOAc (250 mL). Lavar a fase orgânica com água (4 x 100 mL) e NaCi aquoso saturado (100 mL). Secar a fase orgânica em K2CO3, filtrar para remover os sólidos, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer um óleo amarelo. Submeter este material bruto à cromatografia cintilante em sílica-gel eluindo com um gradiente de 20 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo incolor em pureza de cerca de 90 % por análise de 1H RMN (6,50 g, 64 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 264 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,27 (dd, J = 8,5, 7,3 Hz, 2H), 6,93 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,10 (t ap, J = 6,1 Hz, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,29 (dd, J = 8,4, 4,0 Hz, 1H), 3,14 (app dt, J = 11,3, 6,4 Hz, 1H), 2,95 (app dt, J = 13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,89 (app dt, J = 13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,42 (ddd, J = 11,6, 7,9, 3,7 Hz, 1H), 1,90-1,82 (m, 1H), 1,79 (t apd, J = 8,9, 3,8 Hz, 1H), 1,67-1,59 (m, 3H), 1,39 (t apd, J = 8,8, 4,0 Hz, 1H).Preparação 12

[0048] Síntese de cloridrato de ácido de (R)-1-(2-fenoxietil) piperi-dina carboxílico.

[0049] Esquema 6, Etapa B: Na temperatura ambiente, dissolver (R)-1-(2-fenoxietil)piperidina-2-carboxilato de metila (6,50 g, 22,2 mmol) em THF (11,1 mL) e adicionar NaOH (solução aquosa 5 M, 8,89 mL, 44,4 mmol) e aquecer até 65 °C durante a noite com agitação. Adicionar cloreto de hidrogênio (solução aquosa 5 M) até que o pH da fase aquosa atinja 1,0. Lavar a fase aquosa com CH2CI2 (3 x 75 mL). Concentrar a fase aquosa sob pressão reduzida para fornecer um sólido branco. Triturar o sólido com EtOH (50 mL), filtrar para remover os sais em sus-pensão, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (5,17 g, 81 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 250 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 7,31 (dd, J = 8,8, 7,5 Hz, 2H), 7,02-6,97 (m, 3H), 4,47 (ddd acoplado a AB, J = 11,5, 7,1, 3,0 Hz, 1H), 4,38 (ddd acoplado a AB, J = 11,8, 6,3, 3,1 Hz, 1H), 4,15 (dd, J = 11,2, 2,8 Hz, 1H), 3,80 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,73-3,68 (m, 2H), 3,29 (t apd, J = 13,2, 3,8 Hz, 1H), 2,35 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,00-1,80 (m, 4H), 1,68 (t ap, J = 13,1 Hz, 1H). Esquema 7

Preparação 13

[0050] Síntese de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil) piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoato de metila.

[0051] Esquema 7, Etapa A: Dissolver cloridrato do ácido (R)-1-(2-fenoxietil)piperidina carboxílico (750 mg, 2,62 mmol) e cloridrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de metila (566 mg, 2,62 mmol) em DMF (5,25 mL) na temperatura ambiente. Adicionar trietilamina (1,65 mL, 11,81 mmol), depois BOP (1,51 g, 3,41 mmol). Agitar a mistura na temperatura ambiente por 3 h, depois diluir com EtOAc (25 mL). Lavar a mistura com LiCl aquoso saturado (2 x 25 mL). Secar a camada orgânica em MgSO4, filtrar para remover os sólidos, e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o óleo amarelo-alaranjado resultante à cromatografia cintilante em sílica-gel, eluindo com um gradiente de 0 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (930 mg, 86 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 411 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,24 (dd, J = 8,8, 7,4 Hz, 2H), 6,89 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 6,85 (dd, J = 8,8, 1,0 Hz, 2H), 4,96 (app pentet, J = 7,2 Hz, 1H), 4,05-3,98 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,11 (app dt, J = 11,4, 3,7 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 7,2, 2,8 Hz, 1H), 2,77 (app q, J = 6,8 Hz, 1H), 2,50 (app dt, J = 11,2, 6,8 Hz, 1H), 2,15 (t apd, J = 11,6, 2,8 Hz, 1H), 1,68-1,61 (m, 2H), 1,59-1,40 (m, 3H), 1,36 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,27-1,18 (m, 1H).

[0052] Preparar os compostos seguintes essencialmente pelo mé todo da Preparação 13, usando os sais de amônio apropriados no lugar de cloridrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de metila:

Esquema 8

Preparação 17

[0053] Síntese de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-1-terc-butoxicarbonil-2-carbonil] amino]etil]benzoato de metila.

[0054] Esquema 8, Etapa A: A uma mistura a 0 °C de ácido (R)-N-terc-butoxicarbonilpipecólico (20,0 g, 87,2 mmol) e CH2Cl2 (400 mL), adicionar trietilamina (13,4 mL, 96,0 mmol). Depois, adicionar cloro- formiato de isobutila (12,5 mL, 96,0 mmol) em uma forma às gotas e agitar por 20 minutos. Adicionar 4-[(S)-aminoetil]benzoato de metila (17,2 g, 96,0 mmol), depois deixar a mistura aquecer até a temperatura ambiente e agitar por uma hora. Adicionar água (300 mL), depois separar as camadas e lavar a camada orgânica com KHSO4 aquoso 1 M (200 mL), seguido por NaCl aquoso saturado (200 mL). Separar as camadas orgânicas e secar em MgSO4, depois filtrar para remover os sólidos e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo incolor (34,0 g, 100 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 291 (M - Boc + 2H)+, 413 (M + Na)+. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,99 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 5,14 (app pentet, J = 7,1 Hz, 1H), 4,72 (br s, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,40 (dd, J = 6,2, 5,8 Hz, 1H), 2,63 (t apd, J = 6,9, 2,4 Hz, 1H), 2,25 (br s, 1H), 1,75 (t apq, J =13,4, 6,7 Hz, 1H), 1,63-1,50 (m, 3H), 1,47 (s, 9H), 1,38 (t ap, J = 5,6 Hz, 1H), 0,91 (d, J = 6,6 Hz, 3H).Preparação 18

[0055] Síntese de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoato de metila

[0056] Esquema 8, Etapa B: A uma mistura a 0 °C de EtOAc (136 mL) e EtOH (55,8 mL), adicionar cloreto de acetila (62,0 mL, 871 mmol) em uma forma às gotas, depois deixar a mistura aquecer até a temperatura ambiente durante uma duração de 30 minutos. Adicionar uma solução de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-1-terc-butoxicarbonil-2- carbonil] amino]etil]benzoato de metila (34,0 g, 87,1 mmol) em EtOAc (136 mL), depois agitar a mistura de reação na temperatura ambiente por uma hora. Extrair a mistura com água (2 x 100 mL), depois adicionar 32 % de solução de amônia aquosa às camadas aquosas combinadas até que o pH atingisse 10. Extrair a mistura com TBME (2 x 200 mL), depois secar as camadas orgânicas combinadas em MgSO4, filtrar para remover os sólidos, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (20,2 g, 80 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 291 (M + H)+, 581 (2M + H)+. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,00 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,15 (br d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,14 (app pentet, J = 7,4 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,23 (dd, J = 9,9, 3,3 Hz, 1H), 3,01 (app dt, J = 11,8, 3,5 Hz, 1H), 2,68 (ddd, J = 12,1, 10,7, 3,0 Hz, 1H), 1,98-1,90 (m, 1H), 1,61-1,52 (m, 1H), 1,48 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,43-1,34 (m, 2H). Preparação 19

[0057] Síntese de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil) piperidina-2-carbonil] amino etil] benzoato de metila.

[0058] Esquema 8, Etapa C: A uma suspensão de sílica-gel (100 g) em CH2Cl2 (705 mL) na temperatura ambiente, adicionar uma solução de NaIO4 (35,0 g, 161,9 mmol) em água (235 mL) em uma forma às gotas. Agitar a mistura por 30 minutos, depois adicionar 1,2-diidróxi- 3-fenoxipropano (21,5 g, 121,4 mmol), e agitar a mistura por um adicional de 30 minutos. Filtrar a mistura para remover os sólidos, e separar as camadas do filtrado. Secar a camada orgânica em MgSO4, e filtrar para remover os sólidos. Ao filtrado, adicionar 4-[(1S)-1-[[(2R)- piperidina-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila (23,5 g, 80,9 mmol), seguido por triacetoxiboroidreto de sódio (35,7 g, 161,9 mmol) em pequenas porções. Agitar por uma hora na temperatura ambiente, depois adicionar uma solução de amônia aquosa a 32 % até que o pH atinja 10. Separar as camadas, e secar a fase orgânica em MgSO4. Filtrar para remover os sólidos, depois concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer o material bruto. Dissolver o material em EtOAc (300 mL) e filtrar através de uma almofada de sílica-gel (30 g). Concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer 36 g de material. Adicionar TBME (180 mL) e aquecer até 50 °C. Enquanto mantendo a temperatura em 50 °C, adicionar hexanos (360 mL) durante 15 minutos, depois agitar por uma hora. Permitir que a mistura resfrie até a temperatura ambiente, depois isolar os sólidos por filtração e secar sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um só- lido branco (16,7 g, 50 % de rendimento).Esquema 9

Preparação 20

[0059] Síntese de cloridrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoato de metila.

[0060] Esquema 9, Etapa A: Tratar 4-[(1 S)-1-[[(2R)-piperidina-1-terc-butoxicarbonil-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila (7,80 g, 19,98 mmol) com ácido clorídrico (solução 4 M em 1,4-dioxano, 25,0 mL, 99,9 mmol) e agitar a mistura resultante na temperatura ambiente por 1 h. Concentrar a mistura sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (6,0 g, 92 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 291 (M + H)+, 581 (2M + H)+, 603 (2M + Na)+. Preparação 21

[0061] Síntese de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-(4-fluorofenóxi) etil) piperidi-na-2-carbonil] amino]etil]benzoato de metila.

[0062] Esquema 9, Etapa B: Agitar uma mistura de cloridrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila (650 mg, 1,99 mmol) e 2-(4-fluorofenóxi)acetaldeído (337 mg, 2,19 mmol) em DCE (9,9 mL) na temperatura ambiente por 30 min. Adicionar ácido acético (0,113 mL, 1,99 mmol) e triacetoxiboroidreto de sódio (590 mg, 2,78 mmol) e agitar na temperatura ambiente por três dias. Extinguir a reação com NaHCO3 aquoso saturado (25 mL) e extrair a camada aquosa com EtOAc (2 x 25 mL). Lavar as camadas orgânicas com-binadas com NaCl aquoso saturado (25 mL), depois secar a fase or-gânica em MgSO4, filtrar, e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o óleo resultante à cromatografia cintilante em sílica-gel, eluindo com um gradiente de 0 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (600 mg, 70 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 429 (M + H)+, 451 (M + Na)+.

[0063] Preparar os compostos seguintes essencialmente pelo método da Preparação 21, usando os aldeídos apropriados no lugar de 2- (4-fluorofenóxi)acetaldeído:

Esquema 10

Preparação 25

[0064] Síntese de trifluoroacetato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2- fenoxietil)piperidínio-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila.

[0065] Esquema 10, Etapa A: Agitar uma mistura de cloridrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoato de metila (150 mg, 0,46 mmol), 1-fenóxi-2-propanona (69 μL, 0,50 mmol), DCE (2,3 mL), ácido acético (26 μL, 0,46 mmol), e triacetoxiboroidreto de sódio (136 mg, 0,64 mmol) a 65 °C por dois dias. Extinguir a reação com NaHCO3 aquoso saturado (75 mL) e extrair a camada aquosa com EtOAc (75 mL). Secar a fase orgânica em Na2SO4, filtrar, e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o material bruto à cromatogra- fia de fase reversa em sílica-gel C18, eluindo com 0,1 % de TFA em um gradiente de 5 % a 50 % de ACN/água. Concentrar as frações contendo o produto desejado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um óleo amarelo claro em uma mistura 2:1 de di- astereômeros (24 mg, 10 % de rendimento). Espectro de massa (m/z) 425 (M + H)+ Esquema 11

Exemplo 1

[0066] Síntese de cloridrato do ácido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil) piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoico.

[0067] Esquema 11, Etapa A: Dissolver 4-[(1 S)-1-[[(2R)-1-(2- fenoxietil) piperidina-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila (930 mg, 2,27 mmol) em THF (4,0 mL) e CH3OH (4,0 mL) na temperatura ambiente. Adicionar NaOH (solução aquosa 1 M, 4,5 mL, 4,5 mmol), depois agitar a mistura resultante na temperatura ambiente por três dias. Concentrar a mistura de reação sob pressão reduzida para fornecer um sólido gomoso. Adicionar cloreto de hidrogênio (solução 4 M em dioxano, 2 mL, 8 mmol), e agitar vigorosamente por 10 minutos. Remover os sólidos em suspensão por filtração, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para fornecer um sólido branco. Triturar o sólido em éter dietílico em ebulição (25 mL), e isolar os sólidos em suspensão por filtração para fornecer o composto do título (650 mg, 66 % de rendimento) como um sólido branco. Espectro de massa (m/z): 397 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,89 (br s, 1H), 10,08 (br s, 1H), 9,41 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,47 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,26 (dd, J = 8,4, 7,6 Hz, 2H), 6,96 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 5,02 (app pentet, J = 7,1 Hz, 1H), 4,34-4,21 (m, 2H), 4,03 (t ap, J = 10,2 Hz, 1H), 3,57 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 3,48-3,39 (m, 1H), 3,37-3,18 (m, 2H), 2,15 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 1,82-1,66 (m, 4H), 1,50-1,43 (m, 1H), 1,39 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

[0068] Preparar os compostos seguintes essencialmente pelo método do Exemplo 1, usando os ésteres metílicos apropriados no lugar de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidina-2-carbonil] amino] etil] benzoato de metila:

Esquema 12

Exemplo 9

[0069] Síntese de trifluoroacetato do ácido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoxietil)piperidínio-2-carbonil]amino]etil]benzoico.

[0070] Esquema 12, Etapa A: Dissolver trifluoroacetato de 4-[(1 S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoxietil)piperidínio-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metila (24 mg, 0,045 mmol) em THF (226 μL) e tratar a mistura com metanol (226 μL) e hidróxido de sódio (solução aquosa 1 N, 170 μL, 0,17 mmol). Agitar a mistura durante a noite na temperatura ambiente, depois concentrar sob pressão reduzida para fornecer um sólido gomoso. Submeter o material bruto à cro- matografia de fase reversa em sílica-gel C18, eluindo com 0,1 % de TFA em um gradiente de 5 % a 50 % de ACN/água para fornecer duas frações separadas, cada uma contendo um diastereômero separado do produto. Concentrar cada fração sob pressão reduzida, dissolver cada em um volume mínimo de metanol, triturar cada uma com éter dietílico (5 mL), e concentrar cada uma sob pressão reduzida para fornecer o Isômero 1 (3,0 mg, 13 % de rendimento) e o Isômero 2 (1,1 mg, 5 % de rendimento) do composto do título como sólidos brancos.

[0071] Exemplo 9a: Isômero maior (Isômero 1). Espectro de massa (m/z): 411 (M + H)+. 1H RMN (DMSO-d6) δ 9,75 (br s), 9,30 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,337,25 (m, 2H), 7,04-6,95 (m, 3H), 5,03 (app p, J = 6,8 Hz, 1H), 4,35-4,24 (m, 2H), 4,07 (dd, J = 12,1, 3,5 Hz, 1H), 3,74-3,65 (m, 1H), 3,52 (br d, J = 12,5 Hz, 1H), 3,11-2,99 (m, 1H), 2,15 (br d, J = 12,4 Hz, 1H), 1,891,71 (m, 4H), 1,52-1,45 (m, 1H), 1,40 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,33 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

[0072] Exemplo 9b: Isômero menor (Isômero 2). Espectro de massa (m/z): 411 (M + H)+.

[0073] É facilmente avaliado por uma pessoa de habilidade comum na técnica que os sais de HCl dos exemplos 1 a 9 são facilmente convertidos às bases livres correspondentes utilizando condições bem conhecidas na técnica.

Ligação in vitro a EP1, EP2, EP3 e EP4 humanos

[0074] As membranas hEP1 e hEP4 são preparadas a partir de células HEK293 recombinantes estavelmente expressando os receptores EP1 (número de acesso no Genbank AY275470) ou EP4 (número de acesso no Genbank AY429109) humanos. As membranas hEP2 e hEP3 são preparadas a partir de células HEK293 transitoriamente transfectadas com os plasmídeos do receptor EP2 (número de acesso no Genbank AY275471) ou EP3 (isoforma VI: número de acesso no Genbank AY429108). Pelotas celulares congeladas são homogeneizadas em tampão de homogeneização usando um homogeneizador de Teflon/vidro. A proteína de membrana é separada em alíquotas e congelada rapidamente em gelo seco antes de armazenar a -80 °C. O tampão de homogeneização continha 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 250 mM de sacarose, 1 mM de EDTA, 0,3 mM de indometacina e plus Complete™, com EDTA, obtido da Roche Molecular Biochemicals (Número do Catálogo 1 697 498).

[0075] Valores de Kd para a ligação de [3H]-PGE2 a cada receptor são determinados por estudos de ligação de saturação ou competição homóloga. Os compostos são testados em um formato de 96 reserva-tórios usando uma série de diluição de três vezes para gerar uma curva de 10 pontos. O composto diluído é incubado com 20 μg/reservat0rio de EP1, 10 μg/reservat0rio de EP2, 1 ug/reservatório de EP3 ou 10 a 20 μg/reservat0rio de membrana EP4 por 90 minutos a 25 °C na presença de 0,3 a 0,5 nM [3H]-PGE2 (PerkinElmer, 118 a 180 Ci/mmol). A reação de ligação é realizada em 200 μL de tampão MES (10 mM de MES no pH 6,0 com KOH, 10 mM de MgCl2 e 1 mM de EDTA) usando placas de reservatório profundo de 96 reservatórios com 0,5 mL de poliestireno. A ligação não específica é calculada comparando-se a ligação na presença e ausência de 2 μM de PGE2. As membranas são colhidas por filtração (colheitadeira TomTek), lavadas 4 vezes com tampão frio (10 mM de MES no pH 6,0 com KOH, 10 mM de MgCl2), secas em uma estufa a 60 °C, e a radioatividade é quantificada como contagens por minuto (CPM) usando um detector TopCount. A porcentagem de ligação específica é calculada como a porcentagem da ligação na ausência de qualquer inibidor, corrigida para ligação na presença de 2 μM de PGE2. Os dados são analisados usando uma equação logística não linear de 4 parâmetros (Equação ABase 205) como mostrado: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)AD)))) onde, y = % de inibição específica, A = fundo da curva; B = topo da curva; C = IC50 relativa = concentração causando 50 % de inibição com base na faixa dos dados do topo ao fundo; D = Coeficiente de Hill = inclinação da curva. Conversão de Ki de valores de IC50 (Ki = IC50/(1 + [L]/Kd) onde [L] é a concentração de ligando). Os compostos dos Exemplos 1 a 9 aqui são testados essencialmente como descritos acima e exibem um valor de Ki para hEP4 mais baixo do que cerca de 1 μM. Tabela 1: Ligação in vitro do Exemplo 1 a EP1, EP2, EP3 e EP4 humanos

[0076] Mais especificamente, seguindo os procedimentos essenci almente como descritos acima, os dados na tabela 1 demonstram que o composto do Exemplo 1 liga-se a hEP4 em concentrações nanomo- lares baixas. Os dados na tabela 1 também demonstram que o composto do Exemplo 1 liga-se a hEP4 mais fortemente do que a hEP1, hEP2, e hEP3 indicando seletividade pra o receptor hEP4.

Atividade de antagonista funcional de EP4 humano in vitro

[0077] Ensaios são conduzidos em células HEK293 recombinantes que expressam estavelmente o receptor EP4 humano. As linhagens de células são mantidas cultivando-se em DMEM com cloridrato com alto teor de glicose e piridoxina (Invitrogen) suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES, 500 μg/mL de geneticina e 2 mM de L-glutamina. Culturas confluentes são cultivadas a 37 °C em uma atmosfera contendo 5 % de CO2. As células são colhidas usando 2,5 % de Tripsina-EDTA, colocadas em suspensão em meio de congelamento (FBS com 6 % de DMSO) em 107 células/mL e alíquotas são armazenadas em nitrogênio líquido. Exatamente antes do ensaio, as células são descongeladas em DMEM, centrifugadas, e recolocadas em suspensão em tampão cAMP.

[0078] A inibição da produção de cAMP estimulada com PGE2 por antagonistas de EP4 é medida usando HTRF (catálogo Cisbio # 62AM4PEB). Uma alíquota equivalente a 4000 células é incubada com 50 μL de tampão de ensaio de cAMP contendo PGE2 em uma concentração predeterminada para produzir uma EC80 (0,188 nM de PGE2 da Sigma, catálogo # P5640 - 10 mg) e antagonistas de EP4 na temperatura ambiente por 20 minutos. O tampão de ensaio de cAMP contém 500 mL de HBSS, 0,1 % de BSA, 20 mM de HEPES e 200 μM de IBMX (Sigma I5879). CJ-042794 (ácido 4-{(1S)-1-[({5-cloro-2-[(4-fluorofenil)óxi]fenil}carbonil)amino]etil}benzoico) serve como um controle positivo. Para medir os níveis de cAMP, conjugado de cAMP-d2 e conjugado de anti cAMP-criptato em tampão de lise são incubados com as células tratadas na temperatura ambiente por 1 hora. O sinal de HTRF é detectado usando um leitor de placa EnVision® (Perkin- Elmer) para calcular a razão de fluorescência em 665 nm àquela em 620 nm. Os dados brutos são convertidos à quantidade de cAMP (pmol/reservatório) usando uma curva padrão de cAMP gerada para cada experimento. Os dados são analisados usando uma equação logística não linear de 4 parâmetros (Equação ABase 205) como mostrado: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)AD)))) onde, y = % de inibição específica, A = Fundo da curva, B = Topo da curva, C = IC50 Relativa = concentração causando 50 % de inibição com base na faixa dos dados do topo ao fundo, D = Hill, Inclinação = inclinação da curva.

[0079] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, os compostos dos Exemplos 1 a 9 aqui são testados essenci-almente como descritos acima e exibem uma IC50 mais baixa do que cerca de 1 μM. Mais especificamente, seguindo os procedimentos es-sencialmente como descritos acima, o Exemplo 1 tem uma IC50 de 6,9 + 2,5 nM (n = 5) medida para EP4 humano. Isto demonstra que os compostos dos Exemplos 1 a 9 são antagonistas potentes de EP4 humano in vitro.

Atividade de antagonista funcional de EP4 de rato in vitro

[0080] O cDNA de EP4 de rato (Acesso no Genebank # NM_03276) é clonado em vetor pcDNA 3.1 e subsequentemente trans- fectado em células HEK293 para a expressão do receptor. O clone es-tável de EP4 de rato é aumentado e depois congelado como banco de células para a triagem de compostos no futuro. Para testar os compos- tos antagonistas de EP4 em células rEP4, descongelar as células con-geladas e depois as células recolocadas em suspensão em tampão de ensaio de cAMP. O tampão de cAMP é fabricado por HBSS sem Ver-melho de fenol (Hyclone, SH30268) suplementado com 20 mM de HEPES (Hyclone, SH30237), 0,1 % de BSA (Gibco, 15260) e 125 μM de IBMX (Sigma, I5879). As células são plaqueadas em placas pretas de poliestireno de fundo plano de meia área com 96 reservatórios (Costar 3694). Os compostos são serialmente diluídos com DMSO para fornecer curvas de resposta de concentração de 10 pontos. Depois os compostos diluídos são adicionados em tampão de ensaio de cAMP que contém PGE2 (Cayman 14010, em uma concentração predeterminada para produzir uma EC80) em razão de DMSO/tampão em 1/100. As células são tratadas com compostos na presença de PGE2 (concentração EC80) por 30 minutos na temperatura ambiente. Os níveis de cAMP gerados das células são quantificados por um kit de ensaio HTRF de cAMP (Cisbio 62AM4PEC). As placas são lidas em um leitor de placa EnVision usando o protocolo otimizado com HTRF (Per- kinElmer). IC50s são calculadas usando ajuste de curva de resposta de dose sigmoide, de regressão não linear Graphpad Prisma (v. 4).

[0081] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, os compostos dos Exemplos 1 a 9 aqui são testados essenci-almente como descritos acima e exibem uma IC50 mais baixa do que cerca de 1 μM. Mais especificamente, seguindo os procedimentos es-sencialmente como descritos acima, o composto do Exemplo 1 tem uma IC50 de 15 nM medida para EP4 de rato. Isto demonstra que os compostos dos Exemplos 1 a 9 são antagonistas potentes de EP4 de rato in vitro.

Atividade de antagonista in vitro em sangue total humano

[0082] Acredita-se que os efeitos inibitórios de PGE2 sobre a produção de TNFα induzida por LPS a partir de macrófagos/monócitos sejam mediados por receptores EP4 (Ver Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226 - 232 (2008)). A capacidade do composto do Exemplo 1 de re-verter o efeito inibitório de PGE2 sobre a produção de TNFα induzida por LPS em sangue total humano é um indício de atividade funcional.

[0083] O sangue é coletado de doadores voluntários normais em tubos heparina sódica do tipo vacutainer. Os doadores não têm que tomar NSAIDs ou celecoxib dentro de 48 horas ou glicocorticoides dentro de duas semanas antes da doação. Todos os tubos/doador são misturados em tubos de centrífuga cônicos Falcon de 50 mL e 98 μL/reservat0rio são distribuídos em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios (Falcon 3072). Os compostos são diluídos em DMSO a 100 X final e 1 μL/reservat0rio em triplicata é adicionado ao sangue para fornecer curvas de resposta de concentração de 7 pontos. O sangue é pré-tratado com os compostos a 37 °C, em uma atmosfera umedecida com CO2 a 5 %, por 30 minutos, depois do que 1 μL/reservat0rio de uma solução de 1 mg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma 0111:B4) em 0,2 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA)/PBS tanto com quanto sem 1 mM de PGE2 (Cayman 14010) é adicionado para fornecer uma concentração de LPS final de 10 μg/mL tanto com quanto sem 10 nM de PGE2. As placas são incubadas por 20 a 24 horas a 37 °C em uma atmosfera umedecida, com CO2 a 5 %. As placas são centrifugadas em 1800 x g por 10 minutos a 22 °C, em uma centrífuga Eppendorf 5810R. O plasma é removido da camada celular e é transferido para placas de polipropileno de fundo em v. Níveis de TNFα em 2 μL de plasma são quantificados por um imunoen- saio enzimático comercialmente disponível (R&D Systems DY210), usando placas Immulon 4 HBX (Thermo 3855) e substrato de 3,3’,5,5’ tetrametilbifenil-4,4’-diamina (KPL 50-76-03). As placas são lidas em A450-A650 em um leitor de placa (Molecular Devices Versamax) usando o software SOFTmaxPRO (v. 4.3.1). IC50s são calculadas usando re gressão não linear Graphpad Prisma (v. 4), com ajuste de curva de resposta de dose sigmoide. Os resultados são expressados como a média geométrica ± desvio padrão; n = número de determinações in-dependentes.

[0084] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, os compostos dos Exemplos 1 a 9 aqui foram testados essen-cialmente como descritos acima e exibiram uma IC50 mais baixa do que cerca de 1 μM. Mais especificamente, seguindo os procedimentos essencialmente como descrito acima, o composto do Exemplo 1 tem uma IC50 de 123 + 88 nM (n = 12). Isto demonstra que os compostos dos Exemplos 1 a 9 são antagonistas de EP4 potentes no ensaio de indução de TNFα de sangue humano.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que é:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

3. Sal de cloridrato do composto, como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é:

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em combinação com um ou mais veículos, diluentes, ou excipientes far- maceuticamente aceitáveis.