ES2644812T3

ES2644812T3 - Compuestos de fenoxietil piperidina

Info

Publication number: ES2644812T3
Application number: ES13734248.1T
Authority: ES
Inventors: Matthew Allen Schiffler; Jeremy Schulenburg York
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2017-11-30
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: MX345324B; US9402838B2; PT2867207T; IL236219A; RS56452B1; NZ701933A; CN104411684B; GT201400288A; PE20150182A1; DOP2014000287A; BR112014031616B1; ME02840B; WO2014004229A1; CL2014003535A1; EP2867207A1; SG11201408641UA; MY173878A; US8962659B2; AP2014008164A0; SI2867207T1

Description

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DESCRIPCION

Compuestos de fenoxietil piperidina

La presente invencion se refiere a compuestos de fenoxietilpiperidina novedosos, a composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos, al uso de los compuestos para tratar trastornos fisiologicos y a intermedios y procedimientos utiles en la smtesis de los compuestos.

La presente invencion esta en el campo del tratamiento de afecciones inflamatorias, tales como artritis, incluyendo artrosis y artritis reumatoide, e incluyendo ademas dolor asociado a estas afecciones. La artritis afecta a millones de pacientes solo en los Estados Unidos y es una causa principal de incapacidad. Los tratamientos incluyen a menudo AINE (farmacos antiinflamatorios no esteroideos) o inhibidores de COX-2, que pueden producir efectos secundarios cardiovasculares y/o gastrointestinales indeseados. Como tales, los pacientes que tienen un mal perfil cardiovascular, tal como hipertension, pueden excluirse de usar AINE o inhibidores de COX-2. Por tanto, existe la necesidad de un tratamiento alternativo de artrosis y artritis reumatoide, preferiblemente sin los efectos secundarios de los tratamientos actuales.

Se han identificado 4 subtipos de receptor de prostaglandina E2 (PGE2) como los siguientes: EP1, EP2, EP3 y EP4. Se ha divulgado que EP4 es el receptor primario implicado en el dolor inflamatorio de articulaciones en modelos de roedor de artritis reumatoide y artrosis (vease, por ejemplo, J. Pharmacol. Exp. Ther., 325, 425 (2008)). Por ello, un antagonista selectivo de EP4 puede ser util para tratar la artritis, incluyendo dolor artntico. Ademas, se ha sugerido que puesto que el antagonismo de EP4 no interfiere con la biosmtesis de prostanoides, tales como PGI2 y TxA2, un antagonista selectivo de EP4 puede no poseer los efectos secundarios cardiovasculares potenciales observados con AINE e inhibidores de COX2 (vease, por ejemplo, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21,484 (2011)).

El documento WO 2013/004290 divulga derivados de amina dclicos como antagonistas del receptor EP4. El documento US 2005/0250818 divulga ciertos compuestos de arilamida y heteroarilamida orto-sustituidos que son antagonistas selectivos del receptor EP4 con actividad analgesica. Ademas, el documento WO 2011/102149 divulga ciertos compuestos que son antagonistas selectivos de EP4 que son utiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-23. El documento WO 2005/105732 divulga ciertos compuestos de metilarilamida o heteroarilamida sustituidos como antagonistas del receptor E2 de prostaglandina.

La presente invencion proporciona compuestos novedosos que son inhibidores selectivos de EP4 respecto a EP1, EP2 y EP3. Ademas, la presente invencion proporciona compuestos novedosos con el potencial de efectos secundarios cardiovasculares o gastrointestinales reducidos en comparacion con AINE tradicionales.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un compuesto de Formula II:

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en la que X es:

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R1 es H, -CN o F; R2 es H o metilo R3 es H; y

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R4 es H, metilo o etilo; o

R3 y R4 unidos forman conjuntamente un anillo ciclopropilo; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

La presente invencion proporciona ademas un compuesto de Formula I:

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

La presente invencion proporciona tambien un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia, en particular para el tratamiento de artrosis. Ademas, la invencion proporciona un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de artritis reumatoide. La invencion proporciona tambien un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento de dolor asociado a artrosis o artritis reumatoide. Ademas, la invencion proporciona el uso de un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de artrosis. La invencion proporciona el uso de un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide. La presente invencion proporciona tambien el uso de un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de dolor asociado a artrosis o artritis reumatoide.

La invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en combinacion con uno o mas veldculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables. En una realizacion particular, la composicion comprende ademas uno o mas de otros agentes terapeuticos. Esta invencion engloba tambien intermedios y procedimientos novedosos para la smtesis de un compuesto de Formula I o Formula II, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Como se usa en la presente memoria, los terminos “tratamiento” o “tratar” incluyen prohibir, impedir, retardar, detener o revertir la progresion o gravedad de un smtoma o trastorno existente.

Como se usa en la presente memoria, el termino “paciente” hace referencia a un mairnfero, tal como un raton, conejillo de Indias, rata, perro o ser humano. Se entiende que el paciente preferido es un ser humano.

Como se usa en la presente memoria, el termino “cantidad eficaz” hace referencia a la cantidad o dosis del compuesto de la invencion, o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo, que, tras administracion de dosis unica o multiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente bajo diagnostico o tratamiento.

Puede determinarse facilmente una cantidad eficaz por el diagnosticador a cargo, como especialista en la tecnica, mediante el uso de tecnicas conocidas y observando los resultados obtenidos en circunstancias analogas. En la determinacion de la cantidad eficaz para un paciente, se consideran una serie de factores por el diagnosticador a cargo incluyendo: la especie de mamffero; su tamano, edad y salud general; la enfermedad o trastorno espedfico implicado; el grado o implicacion o gravedad de la enfermedad o trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo de administracion; las caractensticas de biodisponibilidad de la preparacion administrada; el regimen de dosificacion seleccionado; el uso de medicacion concomitante y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de Formula I o Formula II, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son generalmente eficaces en un amplio intervalo de dosificacion. Por ejemplo, las dosificaciones al dfa entran normalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, pueden ser mas que adecuados niveles de dosificacion por debajo del lfmite inferior del intervalo anteriormente citado, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis aun mayores con efectos secundarios aceptables.

Los compuestos de la invencion se formulan preferiblemente en forma de composiciones farmaceuticas administradas mediante cualquier v^a que haga al compuesto biodisponible. Lo mas preferiblemente, tales composiciones son para administracion oral. Tales composiciones farmaceuticas y procedimientos para preparar las mismas son bien conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington: “The Science and Practice of Pharmacy” 5 (D.B. Troy, Editor, 21a edicion, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Los compuestos de Formula I y Formula II son particularmente utiles en los tratamientos de la invencion, pero se prefieren ciertos grupos, sustituyentes y configuraciones para los compuestos de Formulas I y II. Los siguientes parrafos describen tales grupos, sustituyentes y configuraciones preferidos. Se entendera que estas preferencias son aplicables tanto a los tratamientos como a los nuevos compuestos de la invencion.

10 Se prefiere que R1 sea H, R2 sea H, R3 sea H y X sea:

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Se prefiere ademas que, cuando R3 sea H, R4 sea metilo. Se prefiere ademas que X sea

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15 Se prefieren especialmente acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoico de la siguiente estructura:

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y las sales farmaceuticamente aceptables del mismo.

Se prefiere especialmente ademas clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-

20 carbonil]amino]etil]benzoico.

Como se usa en la presente memoria, "kPag" hace referencia a kilopascales nanometricos; “Boc” hace referencia a un grupo protector ferc-butoxicarbonilo; "DMEM" hace referencia a medio de Eagle modificado por Dulbecco; "ACN" hace referencia a acetonitrilo; "DMSO" hace referencia a dimetilsulfoxido; "DMF" hace referencia a N,N- dimetilformamida; "EtOH" hace referencia a etanol; "THF" hace referencia a tetrahidrofurano; "MeOH" hace 25 referencia a metanol; "EtOAc" hace referencia a acetato de etilo; "Et2O" hace referencia a dietileter; "TBME" hace referencia a ferc-butilmetileter; "BOP" hace referencia a hexafluorofosfato de benzotriazol-1-

iloxitris(dimetilamino)fosfonio; "NaHMDS" hace referencia a bis(trimetilsilil)amiduro de sodio; "PGE2" hace referencia a prostaglandina E2; "FBS" hace referencia a suero fetal bovino; "IBMX" hace referencia a (3-isobutil-1-metilxantina); "MES" hace referencia a acido (2-(N-morfolino)etanosulfonico; "HEPES" hace referencia a (acido 2-[4-(2- 30 hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfonico); "HTRF" hace referencia a una tecnologfa de fluorescencia homogenea resuelta en el tiempo; "HEK" hace referencia a rinon embrionario humano; "HBSS" hace referencia a solucion salina equilibrada de Hank; "CE80" hace referencia a la concentracion de un agente que produce un 80 % de la eficacia maxima posible para ese agente y “CI50” hace referencia a la concentracion de un agente que produce un 50 % de la respuesta inhibidora maxima posible para ese agente.

35 Las sales farmaceuticamente aceptables y la metodologfa comun para prepararlas son bien conocidas en la tecnica.

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Veanse, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics. 33: 201217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000) y Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Un especialista en la tecnica de la smtesis apreciara que los compuestos de Formula I y Formula II se convierten facilmente y pueden aislarse en forma de una sal farmaceuticamente aceptable tal como una sal clorhidrato, usando tecnicas y condiciones bien conocidas por un especialista en la tecnica. Ademas, un especialista en la tecnica de la smtesis apreciara que los compuestos de Formula I y Formula II se convierten facilmente en y pueden aislarse en forma de la correspondiente base libre o acido libre a partir de la sal farmaceuticamente aceptable correspondiente.

La presente invencion contempla todos los enantiomeros o diastereomeros individuales, asf como mezclas de los enantiomeros y diastereomeros de dichos compuestos, incluyendo racematos. Los isomeros individuales, enantiomeros o diastereomeros, pueden separarse o resolverse por un especialista en la tecnica en cualquier punto conveniente de la smtesis de compuestos de la presente invencion mediante procedimientos tales como tecnicas de cristalizacion selectiva o cromatograffa quiral (veanse, por ejemplo, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, y E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994).

El compuesto de la presente invencion, o sales farmaceuticamente aceptables del mismo, pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se ilustran en los esquemas, preparaciones y ejemplos siguientes. Las etapas sinteticas espedficas para cada una de las vfas descritas pueden combinarse de modos diferentes, o junto con etapas de esquemas diferentes, para preparar el compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Los productos de cada etapa en los esquemas siguientes pueden recuperarse mediante procedimientos convencionales, incluyendo extraccion, evaporacion, precipitacion, cromatograffa, filtracion, trituracion y cristalizacion. Los reactivos y materiales de partida estan facilmente disponibles para un especialista en la tecnica. Todos los sustituyentes, a menos que se especifique otra cosa, son como se definen anteriormente.

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Preparacion 1

Smtesis de (S)-W-terc-butoxicarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina.

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Esquema 1, Etapa A: Se anade dicarbonato de di-terc-butilo (1,09 g, 5,0 mmol) a una solucion agitada de (-)-1-(4- bromofenil)etilamina (1,00 g, 5,0 mmol) en diclorometano (10 ml) a 0 °C. Se deja calentar la mezcla de reaccion a temperatura ambiente y se agita entonces durante 2 horas. Se anade a la mezcla agitada acido clorlddrico acuoso 1 M (25 ml), seguido de Et2O (25 ml). Se separan las capas y se extrae la capa acuosa con Et2O (2 x 25 ml). Se combinan las capas organicas, se lavan con NaCl acuoso saturado (25 ml), se seca la capa organica sobre MgSO4, se filtra para retirar los solidos y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (1,50 g, 99 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) (79Br/81Br) 244/246 (M + 2H -1- Bu)+, 322/324 (M + Na)+. RMN-1H (400 MHz, CDCla): 8 7,46-7,43 (m, 2H), 7,19-7,15 (m, 2H), 4,81-4,65 (m, 1H), 1,48-1,36 (m, 12H).

Se prepara el siguiente compuesto esencialmente mediante el procedimiento de la Preparacion 1, usando 1-(4- bromofenil)ciclopropanamina en lugar de (-)-1-(4-bromofenil)etilamina:

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N° de prep.: Nombre qrnmico Estructura MS (m/z)

2: N-[1-(4- bromofenil)ciclopropil]carbamato de ferc-butilo rrBr BocHN^^^^ (79Br/81Br) 256/258 (M + 2H - f-Bu)+, 334/336 (M + Na)+

Preparacion 3

Smtesis de (S)-4-(1-ferc-butoxicarbonilaminoetil)benzoato de metilo

co2ch3

ch3

Esquema 1, Etapa B: Se anaden Pd(OAc)2 (120 mg, 0,53 mmol), 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (355 mg, 0,64 mmol), (S)-N-ferc-butoxicarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina (1,50 g, 5,0 mmol), CH3CN anhidro (45 ml), CH3OH anhidro (30 ml) y trietilamina (1,9 ml, 13,63 mmol) a un autoclave Parr con agitacion mecanica. Se sella el recipiente y se pone a presion de monoxido de carbono de 724 kPag. Se calienta el recipiente a 85 °C y se agita la mezcla durante una noche. Se ventila el recipiente de reaccion (precaucion: gas venenoso) y se transfiere a un matraz de fondo redondo, aclarando con CH3OH. Se concentra la mezcla a presion reducida aportando un residuo naranja. Se anade agua (50 ml) y se extrae entonces con EtOAc (2 x 50 ml). Se lavan las fases organicas combinadas con NaCl acuoso saturado (25 ml), se separan entonces las capas, se seca la fase organica sobre MgSO4, se filtra para retirar los solidos y se concentra el filtrado a presion reducida, dando el producto bruto. Se purifica el producto por cromatograffa ultrarrapida en gel de silice con un gradiente de 0 % a 60 % de EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (1,00 g, 72 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 224 (M + 2H - f-Bu)+, 302 (M + Na)+, 581 (2M + Na)+. RMN-1H (400 MHz, DMSO-cfe): 8 7,89 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,41 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 4,64 (c d, J= 7,4, 6,8 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 1,34 (s a, 9H), 1,28 (d, J= 7,2 Hz, 3H).

Se prepara el siguiente compuesto esencialmente mediante el procedimiento de la Preparacion 3, usando N-[1-(4- bromofenil)ciclopropil]carbamato de ferc-butilo en lugar de (S)-N-ferc-butoxicarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina:

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N° de prep.: Nombre qrnmico Estructura MS (m/z)

4: 4-[1-(ferc- butoxicarbonilamino)ciclopropilbenzoato de metilo O rr1 °" BocHN^J^I 236 (M + 2H-f-Bu)+, 314 (M + Na)+, 605 (2M + Na)+

Preparacion 5

Smtesis de clorhidrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de metilo.

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Esquema 1, Etapa C: Se anade cloruro de hidrogeno (4 M en dioxano, 5 ml, 20 mmol) a (S)-4-(1-ferc- butoxicarbonilaminoetil)benzoato de metilo (1,00 g, 3,58 mmol) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1 hora. Se concentra la mezcla a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (750 mg, 97 % de rendimiento). RMN-1H (400 MHz, DMSO-cfe): 8 8,57 (s a, 3H), 7,99 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,65 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 4,47 (c, J= 6,7 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 1,50 (d, J= 6,8 Hz, 3H).

Se prepara el siguiente compuesto esencialmente mediante el procedimiento de la Preparacion 5, usando 4-[1-(ferc- butoxicarbonilamino)ciclopropil]benzoato de metilo en lugar de (S)-4-(1-ferc-butoxicarbonilaminoetil)benzoato de metilo:

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N° de prep.

Nombre qmmico

Estructura

MS (m/z)

clorhidrato de benzoato de 4-[1- aminociclopropilo)

192 (M + H)+

5 Preparacion 7

Smtesis de 1-(2,2-dimetoxietoxi)-4-fluorobenceno.

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Esquema 2, Etapa A: Se disuelve 4-fluorofenol (5,5 g, 49,1 mmol) en acetonitrilo (49 ml) y se trata la solucion con 2- bromo-1,1-dimetoxietano (11,6 ml, 98,1 mmol) y K2CO3 (16,95 g, 122,7 mmol). Se calienta la solucion a reflujo con 10 agitacion durante 5 dias. Se filtra la mezcla y se concentra el filtrado a presion reducida. Se somete el material bruto resultante a cromatografia en gel de sflice, eluyendo con un gradiente de 0 % a 50 % de EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, aportando el compuesto del tflulo en forma de un aceite incoloro (5,85 g, 60 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 218 (M + NH4)+, 223 (M + Na)+.

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Preparacion 8

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Smtesis de (2,2-dimetoxietoxi)ciclohexano.

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Esquema 3, Etapa A: Se disuelve ciclohexanol (2,00 ml, 19,1 mmol) en DMF (9,6 ml), se anade entonces NaHMDS 20 (solucion 1 M en THF, 21,0 ml, 21,0 mmol) y se agita la solucion a temperatura ambiente durante 5 min. Se anade 2- bromo-1,1-dimetoxietano (2,26 ml, 19,1 mmol) y se agita entonces la mezcla a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 dias. Se diluye la mezcla con EtOAc (250 ml) y se lava con NaCl acuoso saturado (2 x 250 ml). Se seca la fase organica sobre MgSO4, se filtra y se concentra el filtrado a presion reducida. Se somete el material bruto resultante a cromatografia en gel de sflice eluyendo con un gradiente de 0 % a 10 % de

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EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, aportando el compuesto del t^tulo en forma de un aceite amarillo palido (1,10 g, 31 % de rendimiento). RMN-1H (400 MHz, CDCI3): 8 4,47 (t, J= 5,3 Hz, 1H), 3,49 (d, J= 5,3 Hz, 2H), 3,39 (s, 6H), 3,25 (tt, J= 9,2, 3,7 Hz, 1H), 1,94-1,87 (m, 2H), 1,761,69 (m, 2H), 1,55-1,49 (m, 1H), 1,34-1,17 (m, 5H).

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Esquema 4, Etapa A: Se disuelve 1-(2,2-dimetoxietoxi)-4-fluorobenceno (1,00 g, 4,99 mmol) en cloroformo (5,0 ml) y se trata la mezcla con acido trifluoroacetico (0,755 ml, 9,99 mmol). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 dfas, se calienta entonces a 65 °C y se agita durante 4 h. Se concentra la mezcla a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un aceite incoloro con aprox. 70 % de pureza, como se indica por el analisis de RMN-1H (550 mg, 71 % de rendimiento no corregido). RMN-1H (400 MHz, CDCls): 8 9,85 (t, J= 0,5 Hz, 1H), 7,00 (dd, J= 8,9, 8,5 Hz, 2H), 6,85 (dd, J= 9,5, 4,3 Hz, 2H), 4,55 (s a, 2H).

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Preparacion 10

Smtesis de 2-(ciclohexiloxi)acetaldetndo.

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Esquema 5, Etapa A: Se acidifica una mezcla de (2,2-dimetoxietoxi)ciclohexano y agua (30 ml) a un pH de 1,0 con acido sulfurico (solucion acuosa 9,0 M) y se conecta la mezcla a una cabeza de destilacion de tramo corto. Se reduce la presion a 26,7 kPa y se calienta la mezcla a 100 °C durante 1 h. Se enfna la mezcla a temperatura ambiente y se extrae entonces la capa acuosa con TBME (2 x 75 ml). Se lavan las capas organicas combinadas con NaHCO3 acuoso saturado (75 ml) y NaCl acuoso saturado (75 ml). Se seca la fase organica sobre MgSO4, se filtra y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando el compuesto del tftulo (634 mg, 51 % de rendimiento). RMN- 1H (400 MHz, CDCla): 8 9,73 (t, J= 1,0 Hz, 1H), 4,06 (d, J= 1,0 Hz, 2H), 3,31 (tt, J= 9,2, 3,9 Hz, 1H), 1,95-1,89 (m, 2H), 1,79-1,68 (m, 2H), 1,57-1,50 (m, 1H), 1,39-1,20 (m, 5H).

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Preparacion 11

Smtesis de (R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carboxilato de metilo.

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Esquema 6, Etapa A: Se disuelve (R)-piperidin-2-carboxilato de metilo (5,00 g, 34,9 mmol) en DMF (87 ml) y se trata con K2CO3 (14,48 g, 104,8 mmol) y p-bromofenetol (7,16 g, 34,9 mmol). Se agita la mezcla durante una noche a 100-°C. Se enfna la mezcla a temperatura ambiente y se anade EtOAc (250 ml). Se lava la fase organica con agua (4 x 100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml). Se seca la fase organica sobre K2CO3, se filtra para retirar los solidos y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando un aceite amarillo. Se somete este material bruto a cromatograffa ultrarrapida en gel de silice eluyendo con un gradiente de 20 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un aceite incoloro con aprox. 90 % de pureza por analisis de RMN-1H (6,50 g, 64 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 264 (M + H)+. RMN-1H (400 MHz, CDCla): 8 7,27 (dd, J= 8,5, 7,3 Hz, 2H), 6,93 (t, J= 7,3 Hz, 1H), 6,88 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 4,10 (t ap., J= 6,1 Hz, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,29 (dd, J= 8,4, 4,0 Hz, 1H), 3,14 (dt ap, J= 11,3, 6,4 Hz, 1H), 2,95 (dt ap, J= 13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,89 (dt ap, J= 13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,42 (ddd, J= 11,6, 7,9, 3,7 Hz, 1H), 1,90-1,82 (m, 1H), 1,79 (td ap, J= 8,9, 3,8 Hz, 1H), 1,67-1,59 (m, 3H), 1,39 (td ap, J= 8,8, 4,0 Hz, 1H).

Preparacion 12

Smtesis de clorhidrato del acido (R)-1-(2-fenoxietil)piperidincarboxflico.

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Esquema 6, Etapa B: A temperatura ambiente, se disuelve (R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carboxilato de metilo (6,50 g, 22,2 mmol) en THF (11,1 ml), se anade NaOH (solucion acuosa 5 M, 8,89 ml, 44,4 mmol) y se calienta a 65 °C durante una noche con agitacion. Se anade cloruro de hidrogeno (solucion acuosa 5 M) hasta que el pH de la fase acuosa alcanza 1,0. Se lava la fase acuosa con CH2Ch (3 x 75 ml). Se concentra la fase acuosa a presion reducida, aportando un solido blanco. Se tritura el solido con EtOH (50 ml), se filtra para retirar las sales suspendidas y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando el compuesto del tftulo en forma de un solido blanco (5,17 g, 81 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 250 (M + H)+. RMN-1H (400 MHz, CD3OD): 8 7,31 (dd, J= 8,8, 7,5 Hz, 2H), 7,02-6,97 (m, 3H), 4,47 (ddd acoplado con AB, J= 11,5, 7,1, 3,0 Hz, 1H), 4,38 (ddd acoplado con AB, J= 11,8, 6,3, 3,1 Hz, 1H), 4,15 (dd, J= 11,2, 2,8 Hz, 1H), 3,80 (d, J= 12,2 Hz, 1H), 3,73-3,68 (m, 2H), 3,29 (td ap, J= 13,2, 3,8 Hz, 1H), 2,35 (d, J= 13,5 Hz, 1H), 2,00-1,80 (m, 4H), 1,68 (t ap, J= 13,1 Hz, 1H).

imagen22

Preparacion 13

Smtesis de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen23

5 Esquema 7, Etapa A: Se disuelve clorhidrato del acido (R)-1-(2-fenoxietil)piperidincarbox^lico (750 mg, 2,62 mmol) y clorhidrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de metilo (566 mg, 2,62 mmol) en DMF (5,25 ml) a temperatura ambiente. Se anade trietilamina (1,65 ml, 11,81 mmol) y entonces BOP (1,51 g, 3,41 mmol). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 3 h y se diluye entonces con EtOAc (25 ml). Se lava la mezcla con LiCl acuoso saturado (2 x 25 ml). Se seca la capa organica sobre MgSO4, se filtra para retirar los solidos y se concentra a presion reducida. Se 10 somete el aceite naranja amarillento resultante a cromatograffa ultrarrapida en gel de silice, eluyendo con un gradiente de 0 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, proporcionando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (930 mg, 86 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 411 (M + H)+. RMN-1H (400 MHz, DMSO-cfe): 8 8,13 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,86 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,43 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,24 (dd, J= 8,8, 7,4 Hz, 2H), 6,89 (t, J= 8,3 Hz, 1H), 6,85 (dd, J= 8,8, 1,0 15 Hz, 2H), 4,96 (quint. ap, J= 7,2 Hz, 1H), 4,05-3,98 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,11 (dt ap, J= 11,4, 3,7 Hz, 1H), 2,81 (dd, J= 7,2, 2,8 Hz, 1H), 2,77 (c ap, J= 6,8 Hz, 1H), 2,50 (dt ap, J= 11,2, 6,8 Hz, 1H), 2,15 (td ap, J= 11,6, 2,8 Hz, 1H), 1,68-1,61 (m, 2H), 1,59-1,40 (m, 3H), 1,36 (d, J= 7,0 Hz, 3H), 1,27-1,18 (m, 1H).

Se preparan los siguientes compuestos esencialmente mediante el procedimiento de la Preparacion 13, usando las sales de amonio apropiadas en lugar de clorhidrato de (S)-4-(1-aminoetil)benzoato de metilo:

N° de prep.

Nombre qmmico

Estructura

MS (m/z)

14

4-[[[(2fi)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2- carbonil]amino]metil]benzoato de metilo

imagen24

397 (M + H)+

15

4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin- 2-carbonil]amino]propil]benzoato de metilo

imagen25

425 (M + H)+

imagen26

imagen27

4-[1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-

carbonil]amino]ciclopropil]benzoato

metilo

423 (M + H)+

Preparacion 17

Smtesis de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoxicarbonil-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen28

5 Esquema 8, Etapa A: Se anade trietilamina (13,4 ml, 96,0 mmol) a una mezcla a 0 °C de acido (R)-N-terc- butoxicarbonilpipecolico (20,0 g, 87,2 mmol) y CH2Cl2 (400 ml). Se anade entonces cloroformiato de isobutilo (12,5 ml, 96,0 mmol) gota a gota y se agita durante 20 minutos. Se anade 4-[(S)-aminoetil]benzoato de metilo (17,2 g, 96,0 mmol), se deja calentar entonces la mezcla a temperatura ambiente y se agita durante 1 hora. Se anade agua (300 ml), se separan entonces las capas y se lava la capa organica con KHSO4 acuoso 1 M (200 ml), seguido de NaCl 10 acuoso saturado (200 ml). Se separa la capa organica y se seca sobre MgSO4, se filtra entonces para retirar los solidos y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando el compuesto del titulo en forma de un aceite incoloro (34,0 g, 100 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 291 (M - Boc + 2H)+, 413 (M + Na)+. RMN-1H (300 MHz, CDCla): 8 7,99 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 5,14 (quint. ap, J= 7,1 Hz, 1H), 4,72 (s a, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,40 (dd, J= 6,2, 5,8 Hz, 1H), 2,63 (td ap, J= 6,9, 2,4 Hz, 1H), 2,25 (s a, 1H), 1,75 (tc ap, J= 13,4, 6,7 Hz, 1H), 1,6315 1,50 (m, 3H), 1,47 (s, 9H), 1,38 (t ap, J= 5,6 Hz, 1H), 0,91 (d, J= 6,6 Hz, 3H).

Preparacion 18

Smtesis de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen29

5

10

15

20

25

Esquema 8, etapa B: Se anade gota a gota cloruro de acetilo (62,0 ml, 871 mmol) a una mezcla a 0 °C de EtOAc (136 ml) y EtOH (55,8 ml), se deja calentar entonces la mezcla a temperatura ambiente durante un intervalo de 30 minutos. Se anade una solucion de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoxicarbonil-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (34,0 g, 87,1 mmol) en EtOAc (136 ml) y se agita entonces la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 1 hora. Se extrae la mezcla con agua (2 x 100 ml) y se anade entonces solucion saturada de amoniaco al 32 % a las capas acuosas combinadas hasta que el pH alcanza 10. Se extrae la mezcla con TBME (2 x 200 ml), se secan entonces las capas organicas combinadas sobre MgSO4, se filtran para retirar los solidos y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (20,2 g, 80 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 291 (M + H)+, 581 (2M + H)+. RMN-1H (300 MHz, CDCla): 8 8,00 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,37 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,15 (d a, J= 7,6 Hz, 1H), 5,14 (quint. ap, J= 7,4 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,23 (dd, J= 9,9, 3,3 Hz, 1H), 3,01 (dt ap, J= 11,8, 3,5 Hz, 1H), 2,68 (ddd, J =12,1, 10,7, 3,0 Hz, 1H), 1,98-1,90 (m, 1H), 1,61-1,52 (m, 1H), 1,48 (d, J= 7,1 Hz, 3H), 1,43-1,34 (m, 2H).

Preparacion 19

imagen30

Esquema 8, Etapa C: Se anade gota a gota una solucion de NaIO4 (35,0 g, 161,9 mmol) en agua (235 ml) a una suspension de gel de sflice (100 g) en CH2O2 (705 ml) a temperatura ambiente. Se agita la mezcla durante 30 minutos, se anade entonces 1,2-dihidroxi-3-fenoxipropano (21,5 g, 121,4 mmol) y se agita la mezcla durante 30 minutos adicionales. Se filtra la mezcla para retirar los solidos y se separan las capas del filtrado. Se seca la capa organica sobre MgSO4 y se filtra para retirar los solidos. Se anade al filtrado 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (23,5 g, 80,9 mmol), seguido de triacetoxiborohidruro de sodio (35,7 g, 161,9 mmol) en porciones pequenas. Se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y se anade entonces una solucion acuosa de amonio al 32 % hasta que el pH alcanza 10. Se separan las capas y se seca la fase organica sobre MgSO4. Se filtra para retirar los solidos y se concentra entonces el filtrado a presion reducida, dando el material bruto. Se disuelve el material en EtOAc (300 ml) y se filtra a traves de una almohadilla de gel de sflice (30 g). Se concentra el filtrado a presion reducida, aportando 36 g de material. Se anade TBME (180 ml) y se calienta a 50 °C. Manteniendo la temperatura a 50 °C, se anaden hexanos (360 ml) durante 15 minutos y se agita entonces durante 1 hora. Se deja enfriar la mezcla a temperatura ambiente, se afslan entonces los solidos por filtracion y se secan a presion reducida, aportando el compuesto del tftulo en forma de un solido blanco (16,7 g, 50 % de rendimiento).

imagen31

Preparacion 20

Smtesis de clorhidrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen32

5 Esquema 9, Etapa A: Se trata 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoxicarbonil-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (7,80 g, 19,98 mmol) con acido clorhndrico (solucion 4 M en 1,4-dioxano, 25,0 ml, 99,9 mmol) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1 h. Se concentra la mezcla a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un solido blanco (6,0 g, 92 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 291 (M + H)+, 581 (2M + H)+, 603 (2M + Na)+.

10 Preparacion 21

Smtesis de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-(4-fluorofenoxi)etil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen33

Esquema 9, Etapa B: Se agita una mezcla de clorhidrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (650 mg, 1,99 mmol) y 2-(4-fluorofenoxi)acetaldel"ndo (337 mg, 2,19 mmol) en DCE (9,9 ml) a temperatura 15 ambiente durante 30 min. Se anaden acido acetico (0,113 ml, 1,99 mmol) y triacetoxiborohidruro de sodio (590 mg, 2,78 mmol) y se agita a temperatura ambiente durante 3 dfas. Se inactiva la reaccion con NaHCO3 acuoso saturado (25 ml) y se extrae la capa acuosa con EtOAc (2 x 25 ml). Se lavan las capas organicas combinadas con NaCl acuoso saturado (25 ml), se seca entonces la fase organica sobre MgSO4, se filtra y se concentra a presion reducida. Se somete el aceite resultante a cromatograffa ultrarrapida en gel de sflice, eluyendo con un gradiente de 20 0 % a 100 % de EtOAc/hexanos. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion

reducida, proporcionando el compuesto del titulo en forma de un solido blanco (600 mg, 70 % de rendimiento).

Espectro de masas (m/z) 429 (M + H)+, 451 (M + Na)+.

Se preparan los siguientes compuestos esencialmente mediante el procedimiento de la Preparacion 21, usando los aldehndos apropiados en lugar de 2-(4-fluorofenoxi)acetaldel'ndo:

N° de prep.: Nombre qmmico Estructura MS (m/z)

22: 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-(4- cianofenoxi)etil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoato de metilo ^^^C02CH3 ^ 0 ch3 436 (M + H)+

23: 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-(2- metilfenoxi)etil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoato de metilo /5^C°2CH3 ^ 0 ch3 a:., 425 (M + H)+, 447 (M + Na)+

24: 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- ciclohexiloxietil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoato de metilo ^^C02CH3 ^ ° ch3 a° 417 (M + H)+ , 439 (M + Na)+

Esquema 10

imagen34

5 Preparacion 25

Smtesis de trifluoroacetato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo.

imagen35

Esquema 10, Etapa A: Se agita una mezcla de clorhidrato de 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato 10 de metilo (150 mg, 0,46 mmol), 1-fenoxi-2-propanona (69 pl, 0,50 mmol), DCE (2,3 ml), acido acetico (26 pl, 0,46 mmol) y triacetoxiborohidruro de sodio (136 mg, 0,64 mmol) a 65 °C durante 2 dfas. Se inactiva la reaccion con

NaHCO3 acuoso saturado (75 ml) y se extrae la capa acuosa con EtOAc (75 ml). Se seca la fase organica sobre Na2SO4, se filtra y se concentra a presion reducida. Se somete el material bruto a cromatograffa en fase inversa en gel de sflice Cl8, eluyendo con 0,1 % de TFA en un gradiente de 5 a 50 % de ACN/agua. Se concentran las fracciones que contienen el producto deseado a presion reducida, aportando el compuesto del tttulo en forma de un 5 aceite amarillo palido en una mezcla 2:1 de diastereomeros (24 mg, 10 % de rendimiento). Espectro de masas (m/z) 425 (M + H)+.

imagen36

Smtesis de clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoico.

imagen37

10 Esquema 11, Etapa A: Se disuelve 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (930 mg, 2,27 mmol) en THF (4,0 ml) y CH3OH (4,0 ml) a temperatura ambiente. Se anade NaOH (solucion acuosa 1 M, 4,5 ml, 4,5 mmol) y se agita entonces la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 dfas. Se concentra la mezcla de reaccion a presion reducida, aportando un solido gomoso. Se anade cloruro de hidrogeno (solucion 4 M en dioxano, 2 ml, 8 mmol) y se agita vigorosamente durante 10 minutos. Se retiran los solidos suspendidos por 15 filtracion y se concentra el filtrado a presion reducida, aportando un solido blanco. Se tritura el solido en dietileter a ebullicion (25 ml) y se afslan los solidos suspendidos por filtracion, aportando el compuesto del tttulo (650 mg, 66 % de rendimiento) en forma de un solido blanco. Espectro de masas (m/z): 397 (M + H)+. RMN-1H (400 MHz, DMSO- da): 8 12,89 (s a, 1H), 10,08 (s a, 1H), 9,41 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 7,88 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,47 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,26 (dd, J= 8,4, 7,6 Hz, 2H), 6,96 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 6,90 (d, J= 7,9 Hz, 2H), 5,02 (quint. ap, J= 7,1 Hz, 1H), 4,34-4,21 (m, 20 2H), 4,03 (t ap, J= 10,2 Hz, 1H), 3,57 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 3,48-3,39 (m, 1H), 3,37-3,18 (m, 2H), 2,15 (d, J= 13,5 Hz,

1H), 1,82-1,66 (m, 4H), 1,50-1,43 (m, 1H), 1,39 (d, J= 7,2 Hz, 3H).

Se preparan los siguientes compuestos esencialmente mediante el procedimiento del Ejemplo 1, usando los esteres metilicos apropiados en lugar de 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo:

N° de prep.: Nombre qmmico Estructura MS (m/z)

2: clorhidrato del acido 4-[[[(2R)-1-(2- fenoxietil)piperidin-2- carbonil]amino]metil]benzoico Q^ucr S 0 a0 HCI 383 (M + H)+

3: clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- fenoxietil)piperidin-2- carbonil]amino]propil]benzoico Q^kCT S 0 ^ CT0 HCI 411 (M + H)+

4: clorhidrato del acido 4-[1-[[(2R)-1-(2- fenoxietil)piperidin-2- carbonil]amino]ciclopropil]benzoico 0^' qt° ho. 409 (M + H)+

5: clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- (4-fluorofenoxi)etil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoico CVJ7c02H L O ch3 O HCI Xk 415 (M + H)+

6: clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- (4-cianofenoxi)etil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoico L 0 ch3 HCI X 422 (M + H)+

7: clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- (2-metilfenoxi)etil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoico CCvCC' L o ch3 HCI o ,:s) 411 (M + H)+

8: clorhidrato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2- ciclohexiloxietil)piperidin-2- carbonil]amino]etil]benzoico QW?" HCI ^ 0 CH3 403 (M + H)+

5

10

15

20

25

30

imagen38

Absoluto

COoCrK

COzH

Etapa A

O CH

CM

CH

CF3COOH

Esquema 12

Smtesis de trifluoroacetato del acido 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoico.

imagen39

Esquema 12, Etapa A: Se disuelve 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoxietil)piperidin-2-carbonil]amino]etil]benzoato de metilo (24 mg, 0,045 mmol) en THF (226 pl) y se trata la mezcla con metanol (226 pl) e hidroxido de sodio (solucion acuosa 1 N, 170 pl, 0,17 mmol). Se agita la mezcla durante una noche a temperatura ambiente y se concentra entonces a presion reducida, aportando un solido gomoso. Se somete el material bruto a cromatograffa en fase inversa en gel de silice C18, eluyendo con 0,1% de TFA en un gradiente de 5 % a 50 % de ACN/agua, aportando dos fracciones separadas, que contiene cada uno un diastereomero separado de producto. Se concentra cada fraccion a presion reducida, se disuelve cada una en un volumen mmimo de metanol, se tritura cada una con dietileter (5 ml) y se concentra cada una a presion reducida, aportando un isomero 1 (3,0 mg, 13 % de rendimiento) y un isomero 2 (1,1 mg, 5 % de rendimiento) del compuesto del tttulo en forma de solidos blancos.

Ejemplo 9a: Isomero principal (isomero 1). Espectro de masas (m/z): 411 (M + H)+. RMN-1H (DMSO-cfe) 6 9,75 (s a), 9,30 (d, J= 7,4 Hz, 1H), 7,82 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,43 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,33-7,25 (m, 2H), 7,04-6,95 (m, 3H), 503 (p ap, J= 6,8 Hz, 1H), 4,35-4,24 (m, 2H), 4,07 (dd, J= 12,1, 3,5 Hz, 1H), 3,74-3,65 (m, 1H), 3,52 (d a, J= 12,5 Hz, 1H), 3,11-2,99 (m, 1H), 2,15 (d a, J= 12,4 Hz, 1H), 1,89-171 (m, 4H), 1,52-1,45 (m, 1H), 1,40 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,33 (d, J= 6,8 Hz, 3H).

Ejemplo 9b: Isomero minoritario (isomero 2). Espectro de masas (m/z): 411 (M + H)+.

Se aprecia facilmente por un especialista en la tecnica que las sales de HCl de los ejemplos 1-9 se convierten facilmente en las correspondientes bases libres utilizando condiciones bien conocidas en la tecnica.

Union in vitro a EP1, EP2, EP3 y EP4 humanos

Se preparan membranas hEP1 y hEP4 a partir de celulas HEK293 recombinantes que expresan establemente receptores EP1 humano (numero de acceso a Genbank AY275470) o EP4 (numero de acceso a Genbank AY429109). Se preparan membranas hEP2 y hEP3 a partir de celulas HEK293 transfectadas establemente con plasmidos de receptor EP2 (numero de acceso a Genbank AY275471) o EP3 (isoforma VI: numero de acceso a Genbank AY429108). Se homogeneizan los sedimentos celulares congelados en tampon de homogeneizacion usando un homogeneizador de teflon/vidrio. Se toman alfcuotas de la protema de membrana y se congelan rapidamente en hielo seco antes de almacenamiento a -80 °C. El tampon de homogeneizacion contema Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, indometacina 0,3 mM y ademas Complete™ con EDTA, obtenido de Roche Molecular Biochemicals (numero de catalogo 1.697.498).

Se determinan los valores de Kd para la union de [3H]-PGE2 a cada receptor mediante estudios de union por saturacion o competicion homologa. Se ensayan los compuestos en formato de 96 pocillos usando una serie de

dilucion de tres veces, generando una curva de 10 puntos. Se incuba el compuesto diluido con membrana EP1 20 |jg/pocillo, EP2 10 jg/pocillo, EP3 1 jg/pocillo o EP4 10 a 20 jg/pocillo durante 90 minutos a 25 °C en presencia de [3H]-PGE2 0,3 a 0,5 nM (PerkinElmer, 118 a 180 Ci/mmol). Se efectua la reaccion de union en 200 jl de tampon MES (MES 10 mM pH 6,0 con KOH, MgCh 10 mM y EDTA 1 mM) usando 0,5 ml de placas de 96 pocillos profundos 5 de poliestireno. Se calcula la union no espedfica comparando la union en presencia y ausencia de PGE2 2 jM. Se recolectan las membranas por filtracion (recolector TomTek), se lavan 4 veces con tampon fno (MES 10 mM pH 6,0 con KOH, MgCl2 10 mM), se secan en una estufa a 60 °C y se cuantifica la radiactividad como cuentas por minuto (cpm) usando un detector TopCount. Se calcula la union espedfica porcentual como el porcentaje de union en ausencia de cualquier inhibidor, corregido por la union en presencia de PGE2 2 jM. Se analizan los datos usando 10 una ecuacion logfstica no lineal de 4 parametros (ABase Equation 205) como se muestra: y= (A+((B- A)/(1+((C/x)AD)))) donde y= % de inhibicion espedfica, A= valle de la curva; B= pico de la curva; C= CI50 relativa= concentracion que causa un 50 % de inhibicion basada en el intervalo de datos de pico a valle; D= pendiente de Hill= pendiente de la curva. K conversion a partir de los valores de CI50 (Ki= CI50/(1 + [L]/Kd) donde [L] es la concentracion de ligando). Se ensayan los compuestos de los Ejemplos 1-9 de la presente memoria esencialmente como se 15 describe anteriormente y exhiben un valor de Ki para hEP4 menor de aproximadamente 1 jM.

Tabla 1: Union in vitro del Ejemplo 1 a EP1, EP2, EP3 y EP4 humanos

Compuesto de prueba: hEP1, Ki (nM) hEP2, Ki (nM) hEP3, Ki (nM) hEP4, Ki (nM)

Ejemplo 1: >17500 1550± 1860 (n= 3) >14000 54 ± 27 (n= 7)

Mas espedficamente, siguiendo los procedimientos esencialmente como se describen anteriormente, los datos en la tabla 1 demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 se une a hEP4 a bajas concentraciones nanomolares. Los datos 20 en la tabla 1 demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 se une a hEP4 mas fuertemente que a hEP1, hEP2 y hEP3, indicando selectividad por el receptor hEP4.

Actividad antagonista funcional de EP4 humano in vitro

Se realizan ensayos en celulas HEK293 recombinantes que expresan establemente el receptor EP4 humano. Se mantienen las lmeas celulares cultivando en DMEM rico en glucosa y clorhidrato de piridoxina (Invitrogen) 25 suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS), piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM, geneticina 500 jg/ml y L-glutamina 2 mM. Se hicieron crecer los cultivos confluentes a 37 °C en una atmosfera que contiene 5 % de CO2. Se recolectan las celulas usando 2,5 % de tripsina-EDTA, se suspenden en medio de congelacion (FBS con 6 % de DMSO) a 107 celulas/ml y se almacenan alfcuotas en nitrogeno lfquido. Justo antes del ensayo, se descongelan las celulas en DMEM, se centrifugan y se resuspenden en tampon de AMPc.

30 Se mide la inhibicion de la produccion de AMPc estimulada por PGE2 por antagonistas de EP4 usando HTRF (catalogo Cisbio n° 62AM4PEB). Se incuba una alfcuota equivalente a 4000 celulas con 50 jl de tampon de ensayo de AMPc que contiene PGE2 a una concentracion predeterminada para producir una cEs0 (PGE2 0,188 nM de Sigma, n° de catalogo P5640-10 mg) y antagonistas de EP4 a temperatura ambiente durante 20 minutos. El tampon de ensayo de AMPc contiene 500 ml de HBSS, 0,1 % de BSA, HEPES 20 mM e IBMX 200 jM (Sigma 15879). El 35 CJ-042794 (acido 4-{(1S)-1-[({5-cloro-2-[(4-fluorofenil)oxi]fenil}carbonil)amino]etil}benzoico) sirve como control

positivo. Para medir los niveles de AMPc, se incuban conjugado de cAMP-d2 y conjugado anti-AMP-criptato en tampon de lisis con las celulas tratadas a temperatura ambiente durante 1 hora. Se detecta la senal de HTRF usando un lector de placas EnVision® (Perkin-Elmer) para calcular la relacion de fluorescencia a 665 nm a 620 nm. Se convierten los datos brutos en cantidad de AMPc (pmol/pocillo) usando una curva patron de AMPc generada para 40 cada experimento. Se analizan los resultados usando una ecuacion logfstica no lineal de 4 parametros (ABase Equation 205) como se muestra: y= (A+((B-A)/(1+((C/x)AD)))) donde y= % de inhibicion espedfica, A= valle de la curva, B= pico de la curva, C= CI50 relativa= concentracion que causa un 50 % de inhibicion basada en el intervalo de los datos de pico a valle, D= Hill, pendiente= pendiente de la curva.

Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, se ensayan los compuestos de los 45 Ejemplos 1-9 de la presente memoria esencialmente como se describe anteriormente, y exhiben una CI50 menor de aproximadamente 1 jM. Mas espedficamente, siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, el Ejemplo 1 tiene una CI50 de 6,9 ± 2,5 nM (n= 5) medida en EP4 humanos. Esto demuestra que los compuestos de los Ejemplos 1-9 son antagonistas potentes de EP4 humano in vitro.

Actividad antagonista funcional de EP4 de rata in vitro

50 Se clona ADNc de EP4 de rata (n° de acceso a Genebank NM_03276) en el vector pcDNA 3.1 y posteriormente se transfecta en celulas HEK293 para expresion de receptor. Se aumenta de escala el clon estable de EP4 de rata y se congela entonces como un banco de celulas para futuro cribado de compuestos. Para ensayar los compuestos antagonistas de EP4 en celulas rEP4, se descongelan las celulas congeladas y se resuspenden entonces en tampon de ensayo de AMPc. El tampon de AMPc esta compuesto por HBSS sin rojo fenol (Hyclone, SH30268)

5

10

15

20

25

30

35

40

suplementado con HEPES 20 mM (Hyclone, SH30237), 0,1 % de BSA (Gibco, 15260) e IBMX 125 pM (Sigma, 15879). Se siembran las celulas en placas negras de poliestireno de fondo redondo de media area de 96 pocillos (Costar 3694). Se diluyen los compuestos en serie con DMSO, dando curvas de concentracion-respuesta de 10 puntos. Se anaden entonces los compuestos diluidos a tampon de ensayo de AMPc que contiene PGE2 (Cayman 14010, a una concentracion predeterminada para producir una EC80) a una relacion de DMSO/tampon de 1/100. Se tratan las celulas con compuestos en presencia de PGE2 (concentracion de CE80) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los niveles de AMPc generados a partir de las celulas se cuantifican mediante un kit de ensayo HTRF de de AMPc (Cisbio 62AM4PEC). Se leen las placas en un lector de placas EnVision usando el protocolo optimizado de HTRF (PerkinElmer). Se calculan las CI50 usando el ajuste de curva de dosis y respuesta sigmoidea de regresion no lineal Graphpad Prism (v. 4).

Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, se ensayan los compuestos de los Ejemplos 1-9 de la presente memoria esencialmente como se describe anteriormente y exhiben una CI50 menor de aproximadamente 1 pM. Mas espedficamente, siguiendo los procedimientos esencialmente como se describen anteriormente, el compuesto del Ejemplo 1 tiene una CI50 de 15 nM medida en EP4 de rata. Esto demuestra que los compuestos de los Ejemplos 1-9 son potentes antagonistas de EP4 de rata in vitro.

Actividad antagonista in vitro en sangre humana completa

Se cree que los efectos inhibidores de PGE2 sobre la produccion de TNFa inducida por LPS en macrofagos/monocitos esta mediada por receptores EP4 (vease Murase, A., et al., Life Sciences, 82: 226-232 (2008)). La capacidad del compuesto del Ejemplo 1 de revertir el efecto inhibidor de PGF2 sobre la produccion de TNFa inducida por LPS en sangre humana completa es un indicio de actividad funcional.

Se recoge sangre de donantes voluntarios normales en tubos Vacutainer con heparina de sodio. Los donantes no han tomado AINE ni celecoxib en 48 horas o glucocorticoides en 2 semanas antes de la donacion. Todos los tubos/donaciones se agrupan en tubos de centnfuga conicos Falcon de 50 ml y se distribuyen 98 pl/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Falcon 3072). Se diluyen los compuestos en DMSO a 100 x final y se anade 1 pl/pocillo por triplicado a la sangre, dando curvas de concentracion y respuesta de 7 puntos. Se pretrata la sangre con los compuestos a 37 °C en atmosfera humidificada de 5 % de CO2 durante 30 minutos, despues de lo cual se anaden 1 pl/pocillo de solucion de lipopolisacarido (LPS) 1 mg/ml (Sigma 0111:B4) en suero fetal bovino (BSA)/PBS 0,2 mg/ml tanto con PGE2 1 mM (Cayman 14010) como sin ella, dando una concentracion final de LPS de 10 pg/ml tanto con PGE2 10 nM con sin ella. Se incuban las placas durante 20-24 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada de 5 % de CO2. Se centrifugan las placas a 1800 x g durante 10 minutos a 22 °C en una centnfuga Eppendorf 5810R. Se retira el plasma de la capa celular y se transfiere a placas de polipropileno de fondo en v. Se cuantifican los niveles de TNFa en 2 pl de plasma por un inmunoensayo enzimatico comerciamente disponible (R&D Systems DY210), usando placas Immulon 4 HBX (Thermo 3855) y sustrato 3,3',5,5' tetrametilbifenil-4,4'-diamina (KPL 50-76-03). Se leen las placas a A450-A650 en un lector de placas (Molecular Devices Versamax) usando el software SOFTmaxPRO (v. 4.3.1). Se calculan las CI50 usando el ajuste de curva de dosis y respuesta sigmoidea de regresion no lineal Graphpad Prism (v. 4). Se expresan los resultados como la media geometrica ± desviacion estandar; n= numero de determinaciones independientes.

Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describen anteriormente, se ensayaron los compuestos de los Ejemplos 1-9 de la presente memoria esencialmente como se describe anteriormente y exhibfan una CI50 menor de aproximadamente 1 pM. Mas espedficamente, siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, el compuesto del Ejemplo 1 tiene una CI50 de 123 ± 88 nM (n= 12). Esto demuestra que los compuestos de los Ejemplos 1-9 son antagonistas de EP4 potentes en el ensayo de induccion de TNFa en sangre humana.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de formula:

10

15

imagen1

en la que X es:

imagen2

R1 es H, -CN o F;

R2 es H o metilo R3 es H; y

R4 es H, metilo o etilo; o

R3 y R4 unidos forman conjuntamente un anillo ciclopropilo; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
2. - Un compuesto segun la reivindicacion 1, en el que R2 es H.
3. - Un compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que R3 es H y R4 es metilo.
4. - Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X es:

imagen3
5.- El compuesto segun la reivindicacion 1, que es:

imagen4

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
6.- El compuesto segun la reivindicacion 5, que es:

5

5

10

15

imagen5

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
7. - Una sal clorhidrato del compuesto segun la reivindicacion 6, que es:

imagen6
8. - Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en

terapia.
9. - Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en

el tratamiento de artrosis.
10. - Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en

el tratamiento de artritis reumatoide.
11. - Un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo segun las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en

el tratamiento del dolor asociado a artrosis o artritis reumatoide.
12. - Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo

segun las reivindicaciones 1 a 7 en combinacion con uno o mas vetuculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
13. - La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 12, que comprende ademas uno o mas de otros agentes

terapeuticos.