BR112014031133B1 - Vacinas reordenadas de btv e ahsv - Google Patents

Abstract

VACINAS REORDENADAS DE BTV E AHSV. A presente invenção abrange vacinas ou composições de TV e ASHV e métodos de produção de vetores recombinantes TV e ASHV reordenados e métodos de vacinação contra o BTV e ASHV.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório US 61/659,198, depositado em 13 de junho de 2012.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a composições para combater infecções pelo vírus da febre catarral (BTV) ou o vírus da peste equina africano (AHSV) em animais. A presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um vetor BTV ou AHSV recombinante, métodos de vacinação contra o BTV ou AHSV, e kits para uso com tais métodos e composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A febre catarral ovina (BT) é uma doença infecciosa viral transmitida por artrópodes dos ruminantes. Bovinos e caprinos podem ser facilmente infectados com o vírus da febre catarral causador, mas sem lesão vascular extensa e, portanto, estas espécies geralmente não apresentam sinais clínicos acentuados. Em contraste, a doença em ovelhas é caracterizada por inflamação catarral das membranas mucosas da boca, nariz e pança, e por inflamação das bandas coronárias e lâminas das unhas. Existe uma escoriação do epitélio, e, finalmente, necrose da mucosa bucal; a língua e boca inchada e inflamada pode assumir uma cor azul a partir do qual a doença é nomeada (Spreull 1905). A taxa de mortalidade em ovinos é estimada em 1 - 30%.

[004] BTV é o vírus protótipo do gênero Orbivirus (família Reoviridae) e é constituído por, pelo menos, 24 serotipos diferentes (Wilson e Mecham 2000). Diferentes cepas de vírus da febre catarral foram identificadas em todo o mundo ao longo de zonas tropicais e temperadas. Infecção por BTV ocorreu tanto quanto a 45° N na Europa, na medida de 50° N na Ásia e na América do Norte, e ao sul até 35°. BTV não é contagiosa entre ruminantes, assim, a distribuição de BTV é dependente da presença de espécies de vetor artrópodes de Culicoides sp. (mosquitos mordentes), com diferentes espécies de vetores que ocorrem em diferentes regiões do mundo. Dados recentes sugerem que a flutuação genética e efeito fundador contribuem para a diversificação de segmentos de genes individuais de cepas de campo de BTV (Bonneau, Mullens et al., 2001). Demonstrou-se que os animais seropositivos BTV são resistentes a re-infecção com o vírus da febre catarral serotipo homóloga.

[005] Infecção de BTV de ruminantes é transitória, enquanto a infecção do inseto vetor Culicoides é persistente. A duração da viremia depende das espécies animais e de uma cepa de vírus da febre catarral. Tem sido relatado que a viremia pode ser muito transiente em ovelhas e pode durar até 41 dias, em indivíduos infectados pelo vírus da febre catarral, até 42 dias em cabras, e até 100 dias em bovinos. Como a infecção pelo vírus da febre catarral de gado muitas vezes resulta em viremia prolongada, mas não são persistentes, o gado serve como um reservatório a partir do qual o vírus pode ser ingerido pelo vetor Culicoides e então transmitido para os outros ruminantes (Anderson, Stott et al, 1985; MacLachlan 1994; MacLachlan e Pearson 2004). A ecologia de diversas espécies de vetores de Culicoides que é mal compreendida e seus locais de reprodução são em grande parte descaracterizado e suas taxas de dispersão desconhecida. Culicoides sonorensis é o principal vetor de BTV na América do Norte. Insetos fêmeas Culicoides tornam-se persistentemente infectados com o vírus da febre catarral e podem transmitir o vírus após um período de incubação extrínseco de até 14 dias (Mullens, Tabachnick et al., 1995). Hibernação de BTV em zonas temperadas pode ocorrer por meio de vetores de inseto infectados verticalmente, embora os dados recentes indicam que há uma redução na expressão dos genes do capsídeo exterior durante a infecção persistente BTV em fases larvares dos insetos vetores (Branco, Wilson et al., 2005).

[006] Os virions de BTV têm um diâmetro de ~ 69 nm com um revestimento de dupla casca (capsídeo) que, por vezes, é rodeado por uma lipoproteína "pseudo-envelope" derivada de membranas celulares de células infectadas. O genoma do vírus da febre catarral inclui 10 segmentos distintos de RNA de cadeia dupla que codificam coletivamente sete estruturas (VP 1) até VP7 e quatro proteínas não estruturais (NS1, NS2, NS3 e NS3a) (Roy, 1996); 9 dos segmentos do genoma são monocistrônico considerando segmento 10 codifica tanto NS3 e NS3A usando uma segunda estrutura de códon de iniciação. RNA genômico é encapsulado na partícula virion icosahedral por um duplo capsídeo protéico em camadas (Verwoerd, Els et al. 1972). O núcleo icosaédrico consiste em duas grandes ptoteínas (VP3 e VP7) e três proteínas menores (VP1, VP4, VP6) e é rodeada pelo capsídeo exterior que consiste de VP2 e VP5, que respectivamente são codificados por segmentos genómicos 2 e 5 (Roy, 1996). VP2 é responsável pela ligação e entrada nas células do vírus da febre catarral, neutralização, serotipo-especificidade e de hemaglutinação. Formas multiméricas de VP2 (dímeros e trímeros) decoram grande parte da superfície de uma estrutura de VP5 na superfície externa das partículas virais (Hassan e Roy, 1999). VP2 varia entre mais de 24 serotipos BTV, e os níveis de anticorpo anti-VP2 correlacionam-se com neutralização do vírus in vitro e in vivo (Huismans e Erasmus 1981). VP5 também varia marcadamente entre os diferentes serotipos e cepas do vírus da febre catarral (de Mattos, de Mattos et al 1994; DeMaula, Bonneau et al 2000) e, embora não específico- VP5 de neutralização mAb foram identificados até o momento, os dados sugerem que esta proteína tem um papel na neutralização e determinação serotipo através da sua influência sobre VP2 conformacional (Huismans e Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al 1990;. DeMaula et al, 2000). VP2 purificada, imunoadsorvida com BTV anti-core de soro, para remover quantidades vestigiais de VP7, foi injetada em ovelhas. Uma dose inicial de 50 microgramas de VP2 foi suficiente para induzir anticorpos precipitantes VP2, bem como anticorpos de neutralização e de inibição da hemaglutinação. Estas ovelhas foram totalmente protegidas contra a provocação com uma cepa virulenta do vírus da febre catarral de mesmo serotipo. Doses mais baixas de VP2 ainda proporcionaram um nível significativo de proteção, embora anticorpos neutralizantes não foram detectados antes do desafio (Huismans, van der Walt et al. 1987). Resultados recentes mostram que a proteína VP2 e NS1 expressam epítopos reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CTL) (Andrew, Whiteley et al., 1995), embora seja improvável que VP7 e VP5 tenha epítopos de CTL. Até agora, VP3, VP4, VP6, NS2 e NS3 não estimularam uma resposta CTL em ovinos (Lobato, Coupar et al., 1997). A tabela 1 (modificado a partir de Wilson e Mecham 2000) abaixo resume os genes do vírus da febre catarral e a sua função da proteína.Tabela 1 – genes do vírus da febre catarral e proteínas codificadas com localização, propriedades, e função de proteínas.

[007] Polipeptídeos antigênicos BTV específicos de interesse incluem VP2 e VP5. O núcleo icosaédrico consiste em duas grandes proteínas (VP3 e VP7) e três proteínas menores (VP1, VP4, VP6) e é rodeado pelo capsídeo exterior que consiste de VP2 e VP5, que respectivamente são codificados por segmentos genômicos 2 e 5 (Roy, 1996). VP2 é responsável pela ligação e entrada nas células do vírus da febre catarral, neutralização, serotipo-especificidade e hemaglutinação. Formas multiméricas de VP2 (dímeros e trímeros) decoram grande parte da superfície de uma estrutura de VP5 na superfície externa das partículas virais (Hassan e Roy, 1999). VP2 varia entre mais de 24 serotipos BTV, e os níveis de anticorpo anti-VP2 correlacionam-se com neutralização do vírus in vitro e in vivo (Huismans e Erasmus 1981). VP5 também varia marcadamente entre as diferentes serotipos e cepas do vírus da febre catarral (de Mattos, de Mattos et al 1994; DeMaula, Bonneau et al 2000) e, embora nenhum VP5-específico neutralizante mAb foram identificados até o momento, os dados sugerem que esta proteína tem um papel na neutralização e determinação serotipo através da sua influência sobre VP2 conformacional (Huismans e Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al 1990; DeMaula et al, 2000). VP2 purificada, imunoadsorvida com BTV anti-core de soro, para remover quantidades vestigiais de VP7, foi injetada em ovelhas. Uma dose inicial de 50 microgramas de VP2 foi suficiente para induzir anticorpos precipitantes VP2, bem como anticorpos de neutralização e de inibição da hemaglutinação. Estas ovelhas foram totalmente protegida contra a provocação com uma cepa virulenta do vírus da febre catarral de mesmo serotipo. Doses mais baixas de VP2 ainda proporcionado um nível significativo de protecção, embora não há anticorpos neutralizantes não foram detectados antes do desafio (Huismans, van der Walt et al. 1987). Resultados recentes mostram que a proteína VP2 e NS1 expressam epítopos reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CTL) (Andrew, Whiteley et al., 1995), embora seja improvável que VP7 e VP5 têm epítopos de CTL. Até agora, VP3, VP4, VP6, NS2 e NS3 não estimularam uma resposta CTL em ovinos (Lobato, Coupar et al., 1997), ver Tabela 1.

[008] Peste equina africana (AHS) é uma doença grave, muitas vezes fatal transmitida por artrópodes virais de cavalos e mulas (peste equina africana, Manual Merck Veterinária). A taxa de mortalidade pode ser tão elevada como 95% em algumas formas de doença. Infecções assintomáticas ou leves podem ocorrer em cavalos, bem como zebras e burros, especialmente, cavalos que foram previamente infectados com um serotipo diferente do vírus. Os animais infectados ou vetores podem transportar o vírus em regiões AHS-livres. Alguns autores especulam que a mudança climática poderia aumentar o risco de propagação de doenças transmitidas por artrópodes, como a peste equina Africano, como recentemente ocorreu relecionado com vírus da febre catarral (Wilson A et al, Parasitol Res 2008; 103: 69-77). Culicoides imicola, o principal vetor para esta doença, tem feito incursões no norte da África e sul da Europa. Potenciais vetores artrópodes também existem em todo, praticamente todas, as regiões do mundo, incluindo grande parte dos Estados Unidos e no resto das Américas.

[009] Peste equina africana resulta de infecção com o vírus da peste equina africana, um membro do gênero Orbivirus na família Reoviridae. Até à data, 9 sorotipos do vírus da peste equina africana são conhecidos. Vírus da Peste equina africana serotipo 9 é difundido em regiões endêmicas, enquanto os serotipos 1 a 8 são encontrados, principalmente, em áreas geográficas limitadas.

[0010] Serotipo 9 tem sido responsável pela maioria dos surtos de peste equina africana fora da África. Sorotipo 4 causou um surto na Espanha e Portugal entre 1987 e 1990 (Lubroth J., Equine Pract 1988; 10:26 - 33).

[0011] A pesquisa inicial do vírus da peste equina africana resultou no desenvolvimento de uma vacina de vírus vivo atenuado modificado do cérebro do rato para o vírus da peste equina africana em 1930. Estas vacinas foram refinadas e resultaram no desenvolvimento de uma cultura de tecidos de vacina de vírus vivo modificado (MLV) atenuado na década de 1960.

[0012] Apesar da eficácia desta vacina, tem algumas limitações inerentes, incluindo reações vacinais (incluindo morte) em animais individuais, resposta imune variada em animais individuais, dificuldade de imunização de animais jovens com imunidade materna passiva, possibilidade de reversão da virulência do vírus da vacina, e recombinação de cepas da vacina após a vacinação com possível reversão da virulência (du Plessis M. et al.1998, Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65: 321-329). Há também implicações socioeconômicas com o uso da vacina de MLV. África do Sul tem um protocolo que lhe permite exportar cavalos para a União Europeia e uma série de outros países. Este protocolo também torna possível para cavalos de outros países para entrar na África do Sul para competir em vários eventos ou ficar no parafuso prisioneiro por um período temporário. O protocolo é baseado na garantia de que os cavalos estão adequadamente vacinados contra o vírus da peste equina Africano. Autoridades veterinárias estão cientes dos possíveis perigos do uso da vacina MLV. A maioria desses problemas poderia ser bastante reduzido, o desenvolvimento de vacinas africanas suplentes do vírus da.

[0013] O genoma do vírus da peste equina Africana é composto muitas vezes por segmentos de cadeia dupla de RNA (Oellermann, RA et al, 1970; Bremer, CW et al, 1976), que codificam pelo menos dez proteínas virais. Os segmentos do genoma são em umerados 1-10 em ordem de migração no PAGE. Sete das proteínas virais são estruturais e formam a partícula de dupla casca do vírus. A capsídeo exterior é composto por duas proteínas virais importantes, VP2 e VP5, que determinam a variabilidade antigênica do vírus da peste equina Africana, enquanto que a capsídeo interno é constituído por duas grandes proteínas virais (VP3 e VP7) e três menores (VP1, VP4 e VP6) (Lewis SA e Grubman MJ, 1991; Martinez-Torrecuadrada JL et al, 1994); Bremer, CW, et al. 1990; Grubman, MJ & Lewis, SA, 1992). PV3 e VP7 são altamente conservadas entre os nove serotipos (Oellermann et al, 1970; Bremer et al, 1990). Pelo menos três proteínas não estruturais, NS1, NS2 e NS3 foram identificadas (Huismans, H. & Els, HJ, 1979; van Staden, V. & Huismans, H., 1991; Mizukoshi, N. et al, 1992).

[0014] Vírus canarypox recombinantes derivados de vírus atenuados têm sido desenvolvidos como vetores para a expressão heteróloga de genes virais. Algumas destas construções canarypox já foram licenciadas como vacinas em muitos países, incluindo a África do Sul, a União Europeia e os Estados Unidos da América para uso em cavalos (Minke JM, et al, 2004a e b; Minke JM, et al, 2007; Siger L, et al.2006) e outras espécies (Poulet H, et al, 2003).

[0015] O fato de que estas vacinas contêm apenas genes do organismo de interesse torna inerentemente segura (Minke JM, et al, 2004b). Além disso, o aparecimento de anticorpo neutralizante detectável é rápido, mesmo após uma única dose de vacina (anã JM et al, 2004b). A segurança inerente de tais vacinas e a natureza do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes fazem tais vacinas particularmente atraente para uso em epizootias (anã JM et al, 2004a).

[0016] Estudos anteriores demonstraram que os cavalos desenvolvem anticorpos neutralizantes para AHS quando eles são inoculados com exogenamente VP2 expresso e um adjuvante apropriado (Scanlen H, et al., 2002). Estudos em ovelhas têm mostrado que a resposta de anticorpos neutralizantes para o vírus sa febre catarral é reforçado por inoculação dos cRNAeiros com partículas semelhantes ao vírus, em que VP2 e VP5 são co-expressos (Pearson LD, Roy P, 1993). Uma vacina de vírus recombinante canarypox que co-expressam os genes que codificam para proteínas da capsídeo VP2 e exterior de VP5

[0017] O vírus da febre catarral foi recentemente mostrado para induzir níveis elevados de proteção em cRNAeiros (Boone JD, et al, 2007).

[0018] Não tem sido demonstrado que os cavalos desenvolvem anticorpos neutralizantes do Vírus da peste equina Africana quando inoculados com um vetor que contém e que co-expressam VP2 e VP5 de AHSV. Pode assim ser apreciado que a presente invenção satisfaz uma necessidade na técnica, proporcionando um poxvírus recombinante incluindo composições e produtos dos mesmos, particularmente, com base em ALVAC recombinantes e composições e produtos dos mesmos, especialmente, tais recombinantes que expressam VP2 e 5 de AHSV, ou qualquer combinação dos mesmos e composições e produtos dos mesmos.

[0019] Estudos relativos a modificação genética do vírus da febre catarral ou AHSV foram descritos por Piet Uma van Rijn et al. (Virology Journal, 2010, 7: 261), Polly Roy et al. (Journal of Viology, 201 1, 85, 19; 10.213-10.221), Polly Roy et al. (Journal of Viology de 2008, p8339-8348), Massimo Palmarini et al. (PLoS Pathogens, 2011, 7 (12): el002477), e no WO 2009/068870.

[0020] Assim, seria vantajoso proporcionar sistemas melhorados de composições imunogênicas e vacinas contra o vírus da febre catarral e AHSV, e métodos para produzir e utilizar tais composições, incluindo composições que fornecem tais diferenciais para métodos de diagnóstico, ensaios e kits.

[0021] Considerando-se a susceptibilidade de animais, incluindo seres humanos, para BTV ou AHSV, um método de prevenção da infecção por BTV ou AHSV e proteger os animais é essencial.

[0022] Por conseguinte, existe uma necessidade de uma vacina eficaz contra o BTV ou AHSV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0023] Composições que compreendem um ou mais vetores recombinantes de BTV ou AHSV recombinados compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um dos antígenos de BTV ou AHSV são fornecidos.

[0024] Os métodos da invenção incluem métodos para a produção de composições ou vetores recombinantes dos BTV e AHSV recombinados. Métodos também incluem métodos de utilização, incluindo a administração a um animal de uma quantidade eficaz das composições ou vetores para produzir uma resposta imunogênica protetora.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A seguinte descrição detalhada, dada por meio de exemplo, mas não se destinam a limitar a invenção apenas às concretizações específicas descritas, pode ser melhor entendido em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:

[0026] A Figura 1 mostra o gráfico esquemático de BTV-1 e BTV-8 combinados e fluxograma de gerar os vetores recombinantes BTV combinados.

[0027] A Figura 2 representa os diâmetros médios dos BTV r combinados.

[0028] A Figura 3 representa as análises da curva de crescimento dos vírus recombinantes. A maioria dos recombinantes crescem de forma semelhante aos vírus parental de tipo selvagem.

[0029] A Figura 4 representa os resultados de neutralização de BTV.

[0030] A Figura 5 ilustra a geração de BTV recombinados.

[0031] A Figura 6 representa o gráfico esquemático de gerar BTV recombinados usando genética reversa.

[0032] A Figura 7 mostra a tabela contendo as SEQ ID NO atribuidas e as sequências de DNA e de proteína.

[0033] A Figura 8 representa a evolução da temperatura retal média após o desafio.

[0034] A Figura 9 descreve dispersões de hipertermias máxima.

[0035] A Figura 10 representa a evolução de escores clínicos médios diários.

[0036] A Figura 11 representa dispersões de escores clínicos globais.

[0037] A Figura 12 representa a evolução de títulos médios de viremia.

[0038] A Figura 13 representa as dispersões de AUC.

[0039] A Figura 14 ilustra a evolução média de títulos de anticorpos neutralizantes BTV-8.

[0040] A Figura 15 ilustra a morfologia das placas de sBTV contendo a proteína VP5 e VP2 de cada serotipo.

[0041] A Figura 16 mostra os títulos virais de vírus sBTV em células BHK-21.

[0042] A Figura 17 ilustra o título infeccioso, ELISA, Dot Blot Vp2 para BTV1 + BTV8 VP2 (RAS 10).

[0043] A Figura 18 mostra o título infeccioso, ELISA, Dot Blot Vp2 para BTV1 + BTV8 VP2 / VP5 (RAS32).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0044] Composições que compreendem um ou mais vetores recombinantes BTV ou AHSV compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um dos antígenos de BTV ou AHSV que provocam uma resposta imunogénica em um animal são fornecidos. Em uma concretização, o polipeptídeo antigênico é um polipeptídeo de BTV VP2 ou VP5, ou um fragmento ativo ou variante deste.

[0045] Reconhece-se que os polipeptídeos antigênicos da presente invenção podem ser polipeptídeos de comprimento total ou fragmentos ativos ou suas variantes. Por "fragmentos ativos" ou "variantes ativas" pretende-se que os fragmentos ou variantes retenham o caráter antigênico do polipeptídeo. Assim, a presente invenção abrange qualquer polipeptídeo, antígeno, imunógeno ou epítopo de BTV ou AHSV que induz uma resposta imunogênica em um animal. O polipeptídeo, antígenio, epítopo ou imunogéniode BTV ou AHSV pode ser qualquer polipeptídeo, antigênico, epítopo ou imunógeno de BTV ou AHSV, tal como, mas não limitado a, uma proteína, um peptídeo ou fragmento ou variante, que provoca, induz ou estimula uma resposta em um animal, tal como um ovino, bovino, caprino ou equino.

[0046] A presente invenção se refere a composições ou vacinas de espécies bovina, ovina, caprina ou equina que podem compreender uma quantidade eficaz de um vetor BTV ou AHSV recombinante e um transportador, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

[0047] Em algumas concretizações, as vacinas ainda compreendem adjuvantes, tais como o óleo-em-água (O / A), emulsões descritas na Patente Norte-Americana US 7,371,395.

[0048] Em ainda outras concretizações, os adjuvantes incluem EMULSIGEN, hidróxido de alumínio e saponina e CpG, ou suas combinações.

[0049] Em algumas concretizações, a resposta no animal é uma resposta imune protetora. Por "animal" pretende- se mamíferos, pássaros, e outros semelhantes. Animal ou hospedeiro inclui mamíferos e humanos. O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em equinos (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes felinos, e outros felinos incluindo guepardos e lynx), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado), suínos (por exemplo, suínos), caprinos (por exemplo, caprinos), aves (por exemplo, galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhões, falcão, corvo, avestruz, ema e casuar), primata (por exemplo, prosimian, tarsier, macaco, gibbon, macaco), e peixes. O termo "animal" inclui também um animal individual, todos os estágios de desenvolvimento, incluindo estágios embrionários e fetais.

[0050] A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um técnico versado no assunto à qual pertence esta divulgação. Os termos singulares "um", "uma", e "o" incluem referente aos plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0051] Note-se que nesta divulgação e, particularmente, nas reivindicações e / ou nos parágrafos, termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes, podem ter o significado que lhe é atribuído na lei de Patentes dos Estados Unidos; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluido", "incluindo", e semelhantes; e que os termos tais como "consistindo essencialmente em" e “consiste essencialmente de” tem o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos Estados Unidos, por exemplo, que permitem a elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que se encontram no estado da técnica ou que afetam uma base ou nova característica da invenção.

[0052] Os termos "vetor(es) BTV ou AHSV recombinante", " vetor(es) BTV ou AHSV recombinante (s) combinado (s)"," BTV ou AHSV combinado", "BTV ou AHSV combinados" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a qualquer modificação, alteração ou construção de um vírus BTV ou AHSV. A modificação, alteração ou construção de um vírus BTV ou AHSV pode incluir, mas não está limitado a, a deleção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, deleção de um gene inteiro, códon de otimização de um gene, substituição conservativa de aminoácidos, inserção de um ou mais polinucleotídeos heterólogos, mistura de genes, transcritos, segmentos de RNA, segmentos de DNA de diferentes serotipos ou espécies em novas combinações.

[0053] Os polipeptídeos antigênicos da presente invenção são capazes de proteger contra BTV e AHSV. Isto é, eles são capazes de estimular uma resposta imune em um animal. Por "antigênico" ou "imunogênico" significa uma substância que induz uma resposta imune específica de um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou in vivo; uma subunidade ou parte de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma parte ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune contra a apresentação a um animal hospedeiro; um polipeptídeo, um epÍtopo, um hapteno, ou qualquer combinação dos mesmos. Alternativamente, o imunogênico ou antigênico pode compreender uma toxina ou antitoxina.

[0054] O termo "imunogênico de proteína, polipeptídeo ou peptídeo", tal como aqui utilizado inclui polipeptídeos que são imunologicamente ativo no sentido de que, uma vez administrado ao hospedeiro, que é capaz de evocar uma resposta imune do tipo humoral e / ou celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é, tal que tem substancialmente a mesma atividade imunológica como a proteína total. Assim, um fragmento de proteína, de acordo com a presente invenção compreende ou consiste essencialmente de, ou consiste de pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. Uma proteína "imunogênica" ou polipeptídeo, tal como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento completo da proteína, seus análogos ou fragmentos imunogénicos destes. Por "fragmento imunogênico" entenda-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e, assim, induz a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Mapeamento de Epítopos Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, sintetizando concorrentemente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondentes a porções da molécula de proteína, e fazendo reagir os peptídeos com anticorpos, enquanto os peptídeos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no estado da técnica e descritas em, por exemplo, Pat. No. 4.708.871; Geysen et al, 1984; Geysen et al, 1986. De modo semelhante, os epítopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação espacial de aminoácidos, tais como, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Mapeamento de Epítopos Protocols, supra.

[0055] Como discutido a invenção abrange os fragmentos e variantes do polipeptídeo antigênico ativo. Assim, o termo "proteína imunogênica, polipeptídeo, ou peptídeo" contempla ainda a deleções, adições e substituições para a sequência, desde que as funções do polipeptídeo para produzir uma resposta imunológica, tal como aqui definido. O termo "variação conservativa" designa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico, de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificado não muda ou se um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa, isto é, as substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) acidic- aspartato e glutamato; (2) básicos lisina, arginina, histidina; (3) não-polares alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são por vezes classificadas como aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ácido, ou glutamina por asparagina, e semelhantes; ou uma substituição conservadora similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado que não terá um efeito importante sobre a actividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo substituições menores de aminoácidos que não afectam substancialmente a imunogenicidade da proteína são, portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência. Todos os polipeptídeos produzidos por estas modificações estão aqui incluídos. O termo "variação conservadora" também inclui a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido progenitor não substituído desde que os anticorpos criados para o polipeptídeo substituído também reajam imunologicamente com o polipeptídeo não substituído.

[0056] O termo "epítopo" refere-se ao local em um antigênico ou hapteno ao qual as células B específicas e / ou células T respondem. O termo é também utilizado alternadamente com "determinante antigênico" ou "local de determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigênico alvo.

[0057] Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e / ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitado a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, e / ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente para um antigênico ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir uma resposta imunológica protetora ou terapêutica, de tal modo que a nova resistência à infecção será aumentada e / ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa proteção pode ser demonstrada por qualquer uma redução ou a falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápida e / ou um título viral reduzido no hospedeiro infectado.

[0058] Antígenos sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, epítopos flanqueadores polyepitopes, e outros antígenos recombinantes ou derivados sinteticamente. Ver, por exemplo, Bergmann et al, 1993; Bergmann et al, 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998

[0059] Fragmentos imunogênicos, para os fins da presente invenção, irá normalmente incluir, pelo menos, cerca de 3 aminoácidos, pelo menos cerca de 5 aminoácidos, pelo menos cerca de 10-15 aminoácidos, ou cerca de 15-25 aminoácidos ou mais aminoácidos, do molécula. Não há limite superior crítico para o comprimento do fragmento, que pode compreender quase o comprimento total da sequência da proteína, ou mesmo uma proteína de fusão que compreende pelo menos um epítopo da proteína.

[0060] Por conseguinte, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epítopo é de que compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de nucleotídeos que codificam um epítopo ou determinante antigênico de um polipeptídeo de vírus da febre catarral ou AHSV. Um polinucleotídeo que codifica um fragmento de um polipeptídeo de BTV ou AHSV pode compreender ou consistir essencialmente em, ou consistir de um mínimo de 15 nucleotídeos, cerca de 30-45 nucleotídeos, cerca de 45-75, ou pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos contíguos ou consecutivos de a sequência que codifica o polipeptídeo. Procedimentos de determinação de epítopo, tais como, a geração de bibliotecas de peptídeos sobrepostos (Hemmer et al, 1998), Pepscan (Geysen et al, 1984; Geysen et al, 1985; Van der Zee R. et al, 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kit de Chiron) e algoritmos (De Groot et al, 1999; PCT / US2004 / 022605) podem ser utilizados na prática da invenção.

[0061] O termo "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" refere-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, cadeia simples ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também engloba híbridos de RNA / DNA. Os seguintes são exemplos de polinucleotídeos não limitativo: um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNAm, RNAt, RNAr, ribozimas, DNAc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo, uracilo, outros açúcares e grupos de ligação, tais como fluororribose e tiolato, e ramos de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser adicionalmente modificada após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações nesta definição são tampas, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, e a introdução de meios para fixar o polinucleotídeo para proteínas, os íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um microrganismo.

[0062] O termo "gene" é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem íntrons e exões como na sequência genómica, ou apenas as sequências de codificação, como no DNAc e / ou as sequências reguladoras necessárias para a sua expressão. Por exemplo, o gene também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou codifica para uma proteína específica, e que inclui sequências reguladoras.

[0063] Os termos "proteína", "peptídeo", "polipeptídeo" e "fragmento de poliptido" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, que pode compreender os aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos, e que pode ser interrompido por outros aminoácidos de porções químicas. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo a formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente bioativo ou marcação.

[0064] Um "isolado" componente biológico (tal como um ácido nucleico ou proteína ou organelo) refere-se a um componente que foi substancialmente separado ou purificado a partir de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outra cromossómico e extra-cromossómica de DNA e de RNA, proteínas e organelas. Os ácidos nucleicos e proteínas que foram "isolado" incluem ácidos nucleicos e de proteínas purificadas por métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparadas por tecnologia recombinante, bem como a síntese química.

[0065] O termo "purificado" como aqui utilizado não requer uma pureza absoluta; pelo contrário, ela é concebida como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo purificado é aquele em que o polipeptídeo é mais enriquecido do que o polipeptídeo está no seu ambiente natural. Isso é, o polipeptídeo é separado dos componentes celulares. Por "substancialmente purificada" pretende-se que, tal modo que o polipeptídeo representa diversas concretizações pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98%, ou mais de os componentes ou materiais celulares foram removidos. Do mesmo modo, o polipeptídeo pode ser parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" pretende-se que menos do que 60% dos componentes ou o material celular seja removido. O mesmo aplica-se a polinucleotídeos. Os polipeptídeos aqui descritos podem ser purificados por qualquer um dos meios conhecidos na arte.

[0066] Como referido acima, os polipeptídeos antigênicos ou seus fragmentos ou variantes são polipeptídeos antigênicos BTV ou AHSV. Os fragmentos e variantes dos polinucleotídeos e polipeptídeos, assim, codificados divulgados são também englobados pela presente invenção. Por "fragmento" entende-se uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos codificada por esta antigênico. Fragmentos de um polinucleotídeo pode codificar fragmentos proteicos que conservam a actividade biológica da proteína nativa e, consequentemente, possuem atividade imunogênica, como notado aqui em outro local. Os fragmentos da sequência de polipeptídeo retêm a capacidade para induzir uma resposta imune protetora em um animal.

[0067] "Variantes" pretende significar sequências substancialmente semelhantes. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e / ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios dentro do polinucleotídeo nativo e / ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Tal como aqui utilizado, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente, respectivamente. As variantes de um polinucleotídeo específico da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) também pode ser avaliado por comparação da percentagem de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Proteína "variante" destina-se a significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa e / ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais em a proteína nativa. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas têm a capacidade para induzir uma resposta imune.

[0068] Em uma concretização, a presente invenção proporciona composição ou vacina compreendendo um ou mais vetores recombinantes BTV ou AHSV compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam polipeptídeos pelo menos um de BTV ou AHSV. Os polipeptídeos podem ser quaisquer polipeptídeos BTV ou AHSV selecionados a partir do grupo que consiste em VP1, VP2, VP3, VP4, VP 6, VP5, VP7, NS1, NS2, NS3 e / 3A. Em um aspecto, os vetores BTV ou AHSV recombinantes compreendem o esqueleto do vetor derivado a partir dos genomas de BTV ou AHSV serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e 26. Em outro aspecto, os polinucleotídeos heterólogos codificam os antígenos de um serotipo BTV ou AHSV que é diferente do serotipo de BTV ou AHSV usado como a espinha dorsal do vetor.

[0069] Em uma outra concretizão, os vetores BTV ou AHSV recombinantes compreendem polinucleotídeos heterólogos que codificam polipeptídeos VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP7, NS1, NS2, VP6, e NS3 / 3A, em que os polipeptídeos podem ser de diferentes serotipos BTV ou AHSV , tais como os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e 26. As diferentes combinações de polipeptídeos a partir de diferentes serotipos BTV ou AHSV pode ser ilustrado nas tabelas seguintes. O nomenclaure utilizado para o recombinado recombinante BTV (ou AHSV) vetores do presente invenção é definida como: a secção de caixa superior do nome refere-se a espinha dorsal do vírus, seguida de um índice, compreendendo a proteína (s) substituo, precedido pela a origem do serotipo do segmento, por exemplo BTV- 1 SVPI refere-se a um vírus com uma espinha dorsal BTV- 1 contendo o gene VP 1 de BTV-8.Tabela 1 mostra alguns exemplos de BTV recombinante compreendendo um ou dois polipeptídeos de um sorotipo BTV e nove ou oito polipeptídeos de outro sorotipo BTV

[0070] A presente invenção abrange vetores recombinantes BTV que compreendem o BTV combinado possuindo a fórmula BTV-ABVPa, BTV-ABVPc,VPd, BTV-ABNSe, BTV-ABVPc,NSe, em que A e B = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 e 26 (para BTV ou AHSV sorotipos); c e d = 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 (para VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP 6 ou VP7); E = 1, 2, e 3/3 A (para NS1, NS2 ou NS3 / 3A).

[0071] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo BTV tendo uma sequência como apresentado na SEQ ID NO: l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190, e um seu fragmento ou variante.

[0072] Além disso, os homólogos de polipeptídeos BTV ou AHSV de ovinos, bovinos, caprinos ou equinos destinam-se a estar dentro do escopo da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "homólogo" inclui ortólogos, parálogos e análogos. O termo "análogos" refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que têm a mesma ou função semelhante, mas que têm evoluído separadamente em organismos não relacionados. O termo " ortólogos" refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos de diferentes espécies, mas que evoluíram a partir de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, ortólogos codificam polipeptídeos tendo as mesmas funções ou funções semelhantes. O termo "parálogos" refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que estão relacionados por duplicação dentro de um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas estas funções podem estar relacionadas. Análogos, ortólogos e parálogos, de um polipeptídeo BTV ou AHSV de tipo selvagem pode diferir do polipeptídeo de BTV do tipo selvagem por modificações pós-traducionais, por diferenças na sequência de aminoácidos, ou por ambos. Em particular, os homólogos da invenção exibem, em geral, pelo menos, 80 - 85%, 85 - 90%, 90 - 95%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência, com a totalidade ou parte de sequências de polinucleotídeos de BTV ou AHSV do tipo selvagem, e exibem uma função semelhante. As variantes incluem variantes alélicas. O termo "variante alélica" refere-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo contendo polimorfismos que levam a alterações nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de vírus). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1 - 5% de variância de um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. As variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em uma série de diferentes espécies, que podem ser facilmente realizadas por utilização de sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético do gene em tais espécies. Qualquer e todas as variações de ácidos nucleicos e de aminoácidos resultantes polimorfismos ou variações que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse, são entendidas como estando dentro do escopo da invenção.

[0073] Tal como aqui utilizado, o termo "derivado" ou "variante" refere-se a um polipeptídeo, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, que tem uma ou mais variações de aminoácidos conservativas ou outras modificações menores, tais que (1) o polipeptídeo correspondente tem substancialmente equivalente função quando em comparação com o polipeptídeo de tipo selvagem ou (2) um anticorpo criado contra o polipeptídeo é imunorreativo com o polipeptídeo do tipo selvagem. Estas variantes ou derivados incluem polipeptídeos com pequenas modificações do polipeptídeo AHSV BTV ou sequências de aminoácidos primárias que podem resultar em peptídeos que possuem atividade substancialmente equivalente em comparação com o polipeptídeo homólogo não modificado. Tais modificações podem ser deliberadas, como por mutagénese dirigida a um local, ou podem ser espontâneas. O termo "variante" contempla ainda a deleções, adições e substituições para a sequência, desde que as funções de polipeptídeo para produzir uma resposta imunológica, tal como aqui definido.

[0074] O termo "variação conservativa" designa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificada não mudar ou se um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa, como descrito acima.

[0075] Os polinucleotídeos da invenção incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, utilização de codons otimizados para um hospedeiro específico. Tal como aqui utilizado, "otimizado" refere-se a um polinucleotídeo que é geneticamente modificado para aumentar a sua expressão em uma dada espécie. Para proporcionar polinucleotídeos que codificam para otimizar polipeptídeos BTV ou AHSV, a sequência de DNA do gene da proteína do BTV ou AHSV pode ser modificada para 1) compreender os codons preferidos por genes altamente expressos de uma espécie em particular; 2) compreender um A + T ou conteúdo na composição de bases de nucleotídeos para que substancialmente encontrados em que as referidas espécies de G + C; 3) formar uma sequência de iniciação da referida espécie; ou 4) eliminar sequências que provocam desestabilização, poliadenilação inadequada, degradação e extinção de RNA, ou aquela forma hairpins estrutura secundária ou locais de splicing de RNA. O aumento da expressão da proteína BTV ou AHSV na referida espécie pode ser alcançada utilizando a frequência de utilização de codons de distribuição em eucariotas e procariotas, ou em uma espécie em particular. O termo "frequência de utilização de códon preferencial" refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira específica em utilização de códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Por isso, todas as sequências nucleotídicas degeneradas estão incluídas na divulgação, contanto que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo BTV ou AHSV codificada pela sequência de nucleotídeos esteja funcionalmente inalterada.

[0076] A identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos pode ser estabelecida pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information) pares blast emparelhados e a matriz blosum62, utilizando os parâmetros padrão (ver, por exemplo, o BLAST ou algoritmo BLASTX disponível no "National Center for Biotechnology Informação "(. NCBI, Bethesda, MD, EUA) servidor, assim como em Altschul et al; e assim, este documento fala do uso do algoritmo BLAST ou BLASTX e matriz BLOSUM62 pelo termo "blasts").

[0077] A "identidade" com respeito a sequências pode referir-se ao número de posições de nucleotídeos idênticos ou aminoácidos divididos pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinada de acordo com o Wilbur e Lipman algoritmo (Wilbur e Lipman), por exemplo, utilizando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de lacuna de 4, e análise assistida por computador e a interpretação dos dados de sequência, incluindo o alinhamento pode ser convenientemente realizada utilizando programas comercialmente disponíveis (por exemplo,

[0078] Intelligenetics™ Suite, o Intelligenetics Inc.CA). Quando as sequências de RNA são referidas como sendo semelhantes, ou possuem um grau de identidade ou homologia da sequência com sequências de DNA, a timidina (T) na sequência de DNA que é considerada igual a uracilo (U) na sequência de RNA. Assim, as sequências de RNA estão dentro do âmbito da invenção e pode ser derivada a partir de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA ser considerada igual ao uracilo (U), em sequências de RNA.

[0079] A identidade de sequência ou semelhança de sequências de duas sequências de aminoácidos, ou a identidade de sequências entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando o software Vetor NTI pacote (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

[0080] Os seguintes documentos fornecem algoritmos para comparar a identidade ou homologia relativa de sequências, e adicionalmente ou em alternativa com respeito ao precedente, os ensinamentos nestas referências podem ser usadas para determinar a percentagem de homologia ou identidade: Needleman SB e Wunsch CD; TF Smith e Waterman MS; Smith TF, MS Waterman e Sadler JR; Feng DF e Dolittle RF; DG Higgins e Sharp PM; Thompson JD, DG Higgins e Gibson TJ; e, Devereux J, P e Smithies Haeberlie O. e, sem experimentação excessiva, um especialista na matéria pode consultar com muitos outros programas ou referência para determinar a percentagem de homologia.

[0081] As reacções de hibridização pode ser realizada sob condições de diferente grau de "rigor".

[0082] Condições que aumentam a severidade de uma reacção de hibridação são bem conhecidas. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al, 1989).

[0083] A invenção abrange ainda os polinucleotídeos BTV contidos em uma molécula de vetor ou em um vetor de expressão e ligados operacionalmente a um elemento promotor e, opcionalmente, de um intensificador.

[0084] Um "vetor" refere-se a um DNA recombinante ou RNA plasmídeo ou vírus que compreende um polinucleotídeo heterólogo para ser entregue a uma célula alvo, quer in vitro ou in vivo. O polinucleotídeo heterólogo pode incluir uma sequência de interesse para fins de prevenção ou terapia, e podem, opcionalmente, estar na forma de um cassete de expressão. Tal como aqui utilizado, um vetor não precisa de ser capaz de replicação na célula alvo final ou objeto. O termo inclui vetores de clonagem e vetores virais.

[0085] O termo "recombinante" significa um polinucleotídeo semi-sintético ou sintético que, ou não ocorre na natureza, ou está ligado a um outro polinucleotídeo em uma disposição não encontrada na natureza.

[0086] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual está a ser comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser colocada por meio de técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.

[0087] A presente invenção refere-se a vacinas ou composições farmacêuticas ou imunológicos de ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos que pode compreender uma quantidade eficaz de antígenos BTV recombinantes e um transportador, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

[0088] A matéria descrita neste documento está dirigida, em parte, para composições e métodos relacionados com o antigênico de BTV preparado de um sistema de expressão de plantas ou algas que foi altamente imunogênico e de animais protegidos contra o desafio de cepas homólogas e heterólogas BTV.

[0089] A presente invenção se refere a uma composição ou vacina compreendendo um ou mais vetores BTV ou AHSV recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam polipeptídeos pelo menos um de BTV ou AHSV e um transportador, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

[0090] Em outra concretização, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pode ser uma emulsão de água-em-óleo. Em ainda uma outra concretização, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão tripla água / óleo / água (A / O / A).

[0091] A invenção abrange ainda os polinucleotídeos BTV contidos em uma molécula de vetor ou em um vetor de expressão e ligados operacionalmente a um elemento promotor e, opcionalmente, de um intensificador.

[0092] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo antigênico da invenção, particularmente, para o polipeptídeos possuindo uma sequência tal como estabelecido nas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 , 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190.

[0093] Em ainda outro aspecto, o presente invenção proporciona fragmentos e variantes dos polipeptídeos BTV acima identificados (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134 , 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190), que podem ser facilmente preparados por um técnico versado no assunto utilizando técnicas de biologia molecular bem conhecidas.

[0094] As variantes são polipeptídeos homólogos possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168 169 , 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190.

[0095] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de vírus da febre catarral, tal como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo uma sequência, tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190. Ainda em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecido nas SEQ ID NO: 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 , 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 , 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, ou 190, ou uma sua variante conservadora, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito, ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos, ou uma combinação destes polipeptídeos.

[0096] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, ou 132, ou uma sua variante. Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um dos um polinucleotídeo tendo uma sequência como apresentado na SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1 10, 1 11, 1 12, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 1 19, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, ou 132, ou uma sua variante.

[0097] Os polinucleotídeos da invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências de codificação adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, elementos de controle, tais como promotores, locais de ligação ao ribossoma, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle do mesmo ou de um promotor diferente, sequências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga, e transformação de uma célula hospedeira, e como tal, constructos pode ser desejável proporcionar concretizações da presente invenção.

[0098] Elementos para a expressão de um polipeptídeo, antigênico, epítopo ou imunogênio BTV ou AHSV estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção. De modo mínimo, este compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um códon de iniciação (ATG), um códon de terminação e um promotor e, opcionalmente, também uma sequência de poliadenilação para determinados vetores, tais como plasmídeos e determinados vetores virais, por exemplo, outros vetores virais de poxvírus. Quando o polinucleotídeo codifica um fragmento da poliproteína, por exemplo, um peptídeo de BTV, vantajosamente, no vetor, um ATG é colocado no 5'do quadro de leitura e um códon de terminação é colocado em 3'. Outros elementos de controle de expressão podem estar presentes, tais como sequências potenciadoras, sequências de estabilização, tais como íntrons e sequências de sinal que permita a secreção da proteína.

[0099] A presente invenção também se refere a preparações que compreendem vetores, tais como vetores de expressão, por exemplo, as composições terapêuticas. As preparações podem compreender um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão in vivo, e compreendendo ou expressando um ou mais polipeptídeos, antígenos, os epítopos ou os imunogénios de BTV ou AHSV. Em uma concretização, o vetor contém e expressa um polinucleotídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um polinucleotídeo que codifica para (e vantajosamente expressar) um antigênico, epítopo ou imunogénio de BTV ou AHSV, em um veículo, portador, excipiente ou transportador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Assim, de acordo com uma concretização da invenção, o outro vetor ou vetores em que a preparação compreende, consiste essencialmente em, consiste de um polinucleotídeo que codifica para, e, em circunstâncias adequadas, o vetor expressa uma ou mais proteínas de um polipeptídeo, antigênico, epítopo ou imunogénio de BTV ou um seu fragmento.

[00100] De acordo com outra concretização, o vetor ou vetores na preparação compreendem, ou consistem essencialmente de, ou consistir de polinucleotídeo (s) que codificam uma ou mais proteínas ou fragmento (s) da mesma de um vírus da febre catarral ou AHSV polipeptídeo, antigênico, epítopo ou imunogénio, o vetor ou vetores que expressam o polinucleotídeo (s). Em uma outra concretização, a preparação compreende um, dois ou mais vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam e que expressam, vantajosamente, in vivo, ou um polipeptídeo, antigênico, proteína de fusão ou um seu epítopo de BTV ou AHSV. A invenção também é dirigida a misturas de vetores que compreendem os polinucleotídeos que codificam e expressam diferentes polipeptídeos, antígenos, os epítopos ou os imunogénios de BTV ou AHSV, por exemplo, um polipeptídeo, antigênico, epítopo ou imunogénio BTV ou AHSV a partir de diferentes espécies animais, tais como, mas não se limitando para, ovino, bovino, caprino ou suíno.

[00101] De acordo com ainda outra concretização da invenção, o vetor de expressão é um vetor plasmídico ou um vetor de plasmídeo de DNA, em particular, um vetor de expressão in vivo. Em um exemplo específico, não limitativo, o plasmídeo pVR1020 ou 1012 (VICAL Inc.; Lucas et al, 1997; Hartikka et al, 1996, ver, por exemplo, Patentes dos EUA Nos 5.846.946 e 6.451.769). Pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo. O plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a sequência de sinal de tPA humano. Em uma concretização o sinal de tPA humano compreende desde o aminoácido H (l) até ao aminoácido S (23) em Genbank sob o número de acesso HUMTPA14. Em um outro exemplo específico, não limitativo, o plasmídeo utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo pode conter a sequência de peptídeo de sinal de IGF equino 1 desde o aminoácido H (24) até ao aminoácido A (48) no Genbank sob o número de acesso U28070. Informação adicional sobre plasmídeos de DNA que podem ser consultadas ou utilizados na prática são encontrados, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 e 6,221,362.

[00102] O termo abrange qualquer unidade de plasmídeo a transcrição do DNA compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, a este respeito, é de notar que um super- enrolado ou não-super-enrolado, o plasmídeo circular, assim como uma forma linear, destina-se a estar dentro do escopo da invenção.

[00103] Cada plasmídeo compreende ou contém ou consiste essencialmente de, em adição ao polinucleotídeo que codifica um antigênico, epítopo ou imunogénio de BTV ou AHSV, opcionalmente, fundido com uma sequência do peptídeo heterólogo, variante, análogo ou fragmento, operativamente ligada a um promotor ou sob o controle de um promotor ou um promotor dependente. Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte funcional em células eucarióticas. O promotor forte pode ser, mas não se limitando a, o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV-IE) humano ou de origem murina, ou possuindo, opcionalmente, um outro origem, tais como o rato ou cobaia, o Super promotor (Ni, M. et al , Plant J. 7, 661-676, 1995.). O promotor CMV IE pode compreender o promotor parte real, que pode ou não estar associada com a parte potenciador. Pode ser feita referência a EP-A-260 148, EP-A-323 597, as Patentes US Nos. 5, 168.062, 5.385.839, e 4.968.615, bem como a Candidatura PCT N° WO87 / 03905. O promotor CMV IE-é, vantajosamente, um CMV-IE humano (Boshart et al, 1985) ou CMV-IE de murino.

[00104] Em termos mais gerais, o promotor tem tanto uma origem viral, uma planta, ou uma origem celular. Um promotor viral forte do que outro de CMV-IE que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor precoce / tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um forte promotor celular que pode ser utilmente empregue na prática da presente invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como por exemplo o promotor da desmina (Kwissa et al., 2000), ou o promotor da actina (Miyazaki et al, 1989).

[00105] Qualquer um dos promotores constitutivos, reguláveis ou dependentes de estímulo pode ser usado. Por exemplo, promotores constitutivos podem incluir o promotor da manopina sintase a partir de Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, pode ser vantajosa a utilização de promotores de genes de choque térmico, promotores de genes seca-induzível, promotores de genes de organismos patogênicos induzíveis, promotores de gene indutível de feridas, e / promotores escuro de genes indutíveis luz. Pode ser útil utilizar promotores que são controlados pelos reguladores do crescimento das plantas, tais como o ácido abscissic, auxinas, citocininas, e ácido giberélico. Os promotores podem também ser escolhido que dão a expressão específica de tecido (por exemplo, da raiz, folha, e promotores específicos floral).

[00106] Os plasmídeos podem compreender outros elementos de controle da expressão. É particularmente vantajoso incorporar estabilização sequência (s), por exemplo, sequência (s) de íntrons, por exemplo, íntron álcool desidrogenase do milho (Callis et al Genes & Dev.1 (10):. 1183-1200, Dec. 1987), o primeiro íntron do hCMV-IE (Pedido de Patente PCT N ° WO 1989/01036), o íntron II do gene da globina do coelho -(van Ooyen et al, 1979). Em outra concretização, os plasmídeos podem compreender UTR 3 '. A UTR 3 'pode ser, mas não se limitando a, Agrobacterium nopalina sintase (NOS) 3' UTR (nopalina sintase: Mapeamento de transcrição e sequência de DNA Depicker, A. et al, J. Mol Appl Genet, 1982; Bevan, NAR, 1984, 12 (22): 8711-8721).

[00107] Tal como para o sinal de poliadenilação (poli A) para os plasmídeos e vetores virais, outros do que os poxvírus, o uso pode mais ser feito do sinal poli (A) da hormona de crescimento bovina (bGH) gene (ver US 5.122.458), ou o poli (A) de sinal do gene da globina coelho ou o sinal poli (A) do vírus SV40.

[00108] Uma "célula hospedeira" ou "célula" designa uma célula procariótica ou eucariótica que tenha sido geneticamente alterada, ou é capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotídeo exógeno, tal como um plasmídeo ou vetor recombinante ou ssRNA ou RNAcd. Quando se refere a células geneticamente alteradas, o termo refere-se tanto para a célula originalmente alterada e para a sua progênie.

[00109] Em uma concretização, a matéria aqui divulgada refere-se a um método de produção de um vetor recombinante de BTV ou AHSV que compreende a transfecção de uma célula com um RNA que codificam) um ou mais polipeptídeos de um serotipo de BTV ou AHSV; e b) RNAs compreendendo os transcritos do genoma de um serotipo diferente do BTV ou AHSV e compreende a deleção dos transcritos que codificam os antígenos na alínea a).

[00110] Em uma outra concretização, a matéria aqui divulgada refere-se a um método de vacinação de um ovino, bovino, caprino, ou de porcino, compreendendo a administração aos ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos uma quantidade eficaz de uma vacina que pode compreender uma quantidade eficaz dos vetores recombinantes de BTV e um veículo, transportador, excipiente, ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

[00111] Em uma concretização, a matéria aqui divulgada refere-se a um método de induzir uma resposta imune que compreende administrar ao ovino, bovino, caprino ou porcino uma vacina compreendendo um vetor recominate de BTV ou AHSV de ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos, em que uma resposta imune é extraída.

[00112] A administração pode ser por via subcutânea ou intramuscular. A administração pode ser livre de agulha (por exemplo Pigjet ou Bioject).

[00113] Em uma concretização da invenção, um regime de prime-boost pode ser empregado, o qual é composto por pelo menos uma administração primária e pelo menos uma administração de reforço com pelo menos um polipeptídeo, antigênico, imunogénio ou epítopo comum. Tipicamente, a composição imunológica ou vacina usada na administração primária tem uma natureza diferente das usadas como uma de reforço. No entanto, é de notar que a mesma composição pode ser utilizada como a administração primária e de reforço. Este protocolo de administração é chamado de "prime-boost".

[00114] Um "prime-boost", de acordo com a presente invenção pode incluir um vetor viral recombinante que é utilizado para expressar uma sequência que codifica BTV ou seus fragmentos que codifica um polipeptídeo antigênico ou seu fragmento ou variante. Especificamente, o vetor viral pode expressar um gene ou fragmento de BTV ou AHSV do mesmo que codifica um polipeptídeo antigênico. Vetor viral aqui contemplado inclui, mas não se limitando a, poxvírus (por exemplo, vírus vacínia ou vírus vaccinia atenuado, vírus avipox ou vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, varíola aviária, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC, TROVAC; ver, por exemplo, US 5.505.941 , US 5,494,8070), vírus raccoonpox, vírus da varíola suína, etc], adenovírus (por exemplo, adenovírus humano, adenovírus canino), herpesvírus (por exemplo, vírus do herpes canino, vírus do herpes do peru, vírus da doença de Marek, vírus da laringotraqueíte infecciosa, herpesvírus felino, laringotraqueíte vírus (ILTV), vírus do herpes bovino, vírus do herpes suíno), baculovírus, retrovírus, etc. Noutra concretização, o vetor de expressão de avipox pode ser um vetor de canarypox, tais como, ALVAC. Em ainda outra concretização, o vetor de expressão de avipox pode ser um vetor da varíola aviária, tais como, TROVAC. O antigênico da invenção BTV ou AHSV pode ser expresso ou é inserido sob o controle de um promotor de poxvírus específico, por exemplo, o promotor entomopoxvirus Amsacta moorei 42K (Barcena, Lorenzo et al., 2000), o promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al, 1985), a vaccinia promotor I3L (Riviere et al, 1992), a vaccinia promotor HA (Shida, 1986), a varíola bovina promotor ATI (Funahashi et al, 1988), o H6 de vaccinia promotor (Taylor et al, 1988b; Guo et al, 1989; Perkus et al, 1989), inter alia.

[00115] Em outra concretização, o vetor de expressão de avipox pode ser um vetor de canarypox, tais como, ALVAC. O polipeptídeo, o antígeno, epítopo ou imunógeno de BTV ou AHSV pode ser um BTV ou AHSV VP2 ou BTV VP5. O vetor viral pode ser vCP2289, que codifica VP2 e VP5 BTV sintético com códons optimizados (ver US 2007/0280960).

[00116] Em um outro aspecto do protocolo prime-boost da invenção, uma composição compreendendo os vetores recombinantes BTV da invenção é administrado seguido pela administração da vacina ou composição que compreende o antigênico do BTV ou AHSV, ou uma vacina viral inativada, ou uma vacina ou composição de plasmídeo de DNA que contém ou expressa o antigênico de BTV ou AHSV. Da mesma forma, um protocolo de indução e reforço pode compreender a administração de vacina ou composição que compreende uma vacina viral inativada, ou composição que compreende um antigênico de BTV ou AHSV, ou uma vacina de plasmídeo de DNA ou uma composição que contenha ou expresse um antigênico do BTV ou AHSV, seguido pela administração de uma composição compreendendo os vetores recombinantes BTV ou AHSV da invenção. Note-se ainda que, tanto as administrações primária e de reforço podem compreender a composição que compreende o antigênico de BTV da invenção.

[00117] Um protocolo prime-boost compreende pelo menos uma primeira-administração e, pelo menos, uma administração de reforço utilizando pelo menos um polipeptídeo comum e / ou variantes ou seus fragmentos. A vacina utilizada na administração primária pode ser de natureza diferente daqueles utilizados como uma vacina de reforço mais tarde. A administração primária pode compreender uma ou mais administrações. Do mesmo modo, as administrações de reforço podem compreender uma ou mais administrações.

[00118] O volume de dose das composições para as espécies que são mamíferos, por exemplo, o volume da dose de composições para ovinos, bovinos, caprinos ou suíno, com base em vetores virais, por exemplo, as composições não poxvírus- viral-based-vetor, é, geralmente, entre cerca de 0,1 até cerca de 5,0 ml, entre cerca de 0,1 a cerca de 3,0 ml, e entre cerca de 0,5 ml a cerca de 2,5 ml.

[00119] A eficácia das vacinas pode ser testada cerca de 2 a 4 semanas após a última imunização de animais difíceis, tais como ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos, com uma cepa virulenta do vírus da febre catarral, tais como as cepas BTV- 1/2/3/4 / 8/9/16 ou 17. Por exemplo, a cepa de BTV pode ser serotipo 17, que foi originalmente isolada a partir do sangue de ovelhas a partir de Tulare, CA (ver Bonneau, DeMaula et al 2002;. DeMaula, Leutenegger et al., 2002). A cepa também pode ser BTV serotipo 8, uma vacina inativada para a qual está atualmente disponível pela Merial Limited.

[00120] Outras cepas podem incluir BTV1 (isolado da Austrália), BTV1 (isolado da África do Sul), BTV2 (isolado da EUA), BTV3 (isolado da África do Sul), BTV4-9, BTV10 (isolado dos EUA), BTV1 1 (isolados dos EUA), BTV12, BTV 13 (isolado dos EUA), BTV14-17, BTV 17 (isolado dos EUA), BTV 18, BTV 19, BTV20 (isolado da Austrália), BTV21-24, ou BTV Corsican.

[00121] Ambas as cepas homólogas e heterólogas são usadas para o desafio para testar a eficácia da vacina. O animal pode ser desafiado por via intradérmica, subcutânea ly, spray, intra-nasal, intra-ocular, intra-traqueal, e / ou por via oral.

[00122] Para BTV, bovinos e caprinos são avaliados por lesão vascular extensa. Também para BTV, ovinos são avaliados para a inflamação catarral das membranas mucosas da boca, nariz e pança, inflamação das bandas coronárias e lâminas dos cascos, escoriação do epitélio, necrose da mucosa bucal, e inchado / inflamado / azul língua e da boca. Cotonetes podem ser coletadas de todos os animais postar desafio para o isolamento do vírus. A presença ou a ausência de antígenos virais nos tecidos acima indicado pode ser avaliada em tempo real por reacção em cadeia de polimerase transcriptase reversa quantitativa (qRRT-PCR). As amostras de sangue podem ser recolhidas antes e após o desafio e pode ser analisada para a presença de anticorpos anti-BTV específico.

[00123] As administrações prime-boost podem ser vantajosamente realizadas de 2 a 6 semanas de intervalo, por exemplo, cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com uma concretização, uma dose de reforço semi-anual ou um reforço anual, vantajosamente, utilizando a vacina baseada em vetor viral, também está prevista. Os animais são, vantajosamente, pelo menos, 6 a 8 semanas de idade no momento da primeira administração.

[00124] As composições que compreendem os polipeptídeos antigênicos recombinantes da invenção utilizado nos protocolos prime-boost estão contidos em um veículo, carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Os protocolos da invenção protegem o animal ovino, bovino, caprino ou porcino do BTV ou AHSV e / ou impedem a progressão da doença em um animal infectado.

[00125] As várias administrações são realizadas, preferencialmente, de 1 a 6 semanas de intervalo, e mais particularmente, cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com um modo preferido, um reforço anual, de preferência usando a composição imunológica à base de vetor viral da vacina, também está prevista. Os animais são, de preferência, pelo menos, um dia de idade no momento da primeira administração.

[00126] Deve ser entendido por um técnico versado no assunto que a descrição aqui fornecida é a título de exemplo e a presente invenção não está limitado a eles. A partir da descrição aqui feita e o conhecimento na técnica, o técnico versado no assunto pode determinar o número de administrações, a via de administração, e as doses a serem utilizadas para cada protocolo de injeção, sem qualquer experimentação indevida.

[00127] A presente invenção contempla, pelo menos, uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita, de acordo com a invenção. O animal pode ser masculino, feminino, fêmea grávida e recém- nascido. Esta administração pode ser feita através de várias vias incluindo, mas não limitado a, injeção intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou (SC) ou por meio de injecção subcutânea, intranasal ou administração por via oral. A composição terapêutica, de acordo com a invenção também pode ser administrada por um dispositivo sem agulha (como, por exemplo, com um Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EUA), Vetjet ou aparelho Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)). Outra abordagem para a administração de composições de plasmídeo é a utilização de eletroporação (ver, por exemplo, Tollefsen et al, 2002; Tollefsen et al, 2003; Babiuk et al, 2002; Pedido PCT No. WO99 / 01158). Em outra concretização, a composição terapêutica é entregada ao animal por pistola de genes ou bombardeamento de partículas de ouro.

[00128] Em uma concretização, a invenção proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para o fornecimento e expressão de um antigênico ou epítopo de BTV ou AHSV em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é a experimentação de rotina para um técnico versado no assunto. Em uma concretização, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expresse um antigênico ou epítopo do BTV ou AHSV e um veículo, portador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma outra concretização, o veículo, portador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente transferência de polinucleotídeos para um animal hospedeiro e / ou melhora a conservação do vetor ou proteína em um hospedeiro.

[00129] Em uma concretização, a matéria aqui divulgada proporciona um método de detecção para a diferenciação entre animais vacinados e infectados (DIVA).

[00130] Atualmente, existem várias vacinas BTV disponíveis. Merial e Intervet ambos oferecem vacinas inativadas BTV8. Um método para distinguir entre BTV- vacinados e BTV-animais infectados foi recentemente descrito (Silvia C. Barros et al, Veterinary Microbiology-2009).

[00131] É aqui revelado que o uso da vacina ou composição da presente invenção permite a detecção da infecção pelo BTV ou AHSV em um animal. É aqui revelado que o uso da vacina ou composição da presente invenção permite a detecção da infecção em animais através da diferenciação entre animais vacinados e infectados (DIVA). Um método é aqui divulgado para o diagnóstico de infecção de BTV em um animal utilizando o método de detecção com base imunogênica-BTV-NS3, tal como, ELISA NS3-específico.

Artigo de Fabricação

[00132] Em uma concretização, a matéria aqui divulgada refere-se a um kit para realização de um método de provocar ou induzir uma resposta imune que pode compreender qualquer uma das composições imunológicos ou vacinas de BTV ou AHSV recombinantes ou composições imunológicas ou vacinas inativadas de BTV ou AHSV, composições ou vacinas virais recombinantes de BTV ou AHSV, e instruções para realizar o método.

[00133] Outra concretização da invenção é um kit para realização de um método de indução de uma resposta imunológica ou de proteção contra o BTV ou AHSV em um animal compreendendo uma composição ou vacina que compreende um antigênico de BTV da invenção e uma composição imunológica viral ou vacina BTV ou AHSV recombinante, e instruções para realizar o método de entrega de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

[00134] Outra concretização da invenção é um kit para realização de um método de indução de uma resposta imunológica ou de proteção contra o BTV ou AHSV em um animal compreendendo uma composição ou vacina compreendendo um antigênico da invenção e uma composição imunológica ou vacina inativada de BTV ou AHSV, e instruções para a execução do método de entrega de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

[00135] Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para vacinação prime-boost, de acordo com a presente invenção tal como descrito acima. O kit pode compreender pelo menos dois tubos de ensaio: um primeiro frasco contendo uma vacina ou composição para a vacinação primária, de acordo com a presente invenção, e um segundo frasco contendo uma vacina ou composição para a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção. O kit pode conter vantajosamente primeiro ou segundo frascos adicionais para- vacinações primárias adicionais ou vacinações de reforçoadicional.

[00136] As seguintes concretizações são abrangidas pela invenção. Em uma concretização, uma composição compreendendo um vetor recombinante BTV ou AHSV e um excipiente, adjuvante, carreador ou veículo farmacêutico ou veterinariamente aceitável é divulgada. Em uma concretização, as composições acima referidas, em que o excipiente, adjuvante, carreador ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável é uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão óleo-em-água são divulgados. Em outra concretização, um método de vacinação de um animal susceptível a ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos BTV ou AHSV compreendendo a administração das composições acima ao animal é divulgado. Em uma concretização, um método de vacinação de um animal susceptível BTV ou AHSV de ovinos, bovinos, caprinos ou porcinos compreendendo um regime de prime-boost é divulgado. Em uma concretização, um método de diagnóstico de infecção por influenza em um animal é divulgado. Em ainda uma outra concretização, um kit para vacinação prime-boost compreendendo, pelo menos, dois tubos de ensaio, em que um primeiro frasco contendo a composição da presente invenção, e um segundo frasco contendo uma composição para a vacinação de reforço compreendendo uma composição que compreende um vetor viral recombinante, ou uma composição compreendendo uma composição de vírus inativados, ou uma composição de plasmídeo de DNA que contém ou expressa o antigênico BTV ou AHSV é divulgado.

[00137] Veículos, transportadores, adjuvantes ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos do técnico versado no assunto. Por exemplo, um transportador ou um veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pode ser uma solução de NaCl a 0,9% (por exemplo, soro fisiológico) ou um tampão de fosfato. Outro transportador ou um veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que podem ser utilizados para os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, poli (L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O transportador, ou um veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou proteína expressa a partir de um vetor da invenção, in vitro); vantajosamente, o transportador, veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e / ou melhorar a conservação do vetor (ou proteína). As doses e os volumes de dose são aqui discutidas na descrição geral e também pode ser determinada por um técnico versado no assunto a partir desta divulgação, em conjugação com o conhecimento na especialidade, sem qualquer experimentação indevida.

[00138] Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, que são, vantajosamente, mas não exclusivamente adequado para plasmídeos, são vantajosamente aqueles possuindo a seguinte fórmula:

em que Rl é um de cadeia linear saturado ou insaturado alifático radical tendo de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é outro alifáticos contendo 2 ou 3 átomos de carbono e radicais X é um grupo amina ou hidroxilo, por exemplo, o DMRIE. Em outra concretização o lipídio catiônico pode ser associado a um lipídeo neutro, por exemplo DOPE.

[00139] Entre estes lipídeos catiónicos, é dada preferência a DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N, N-dimetil-2,3-bis (tetradeciloxi) -l -propano amónio; WO96 / 34109),vantajosamente associado a um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-amina-etanol; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[00140] Vantajosamente, a mistura de plasmídeo com o adjuvante é formada de maneira extemporânea e, vantajosamente, simultaneamente com a administração da preparação ou imediatamente antes da administração da preparação; por exemplo, pouco antes ou logo antes deadministração, a mistura de plasmídeo-adjuvante é formado, vantajosamente, de modo a dar tempo suficiente antes da administração para a mistura de modo a formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como cerca de 30 minutos antes da administração.

[00141] Quando DOPE está presente, o DMRIE: DOPE razão molar é, vantajosamente, cerca de 95: cerca de 5 a cerca de 5: cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1: cerca de 1, por exemplo, 1:1.

[00142] A relação peso adjuvan plasmídeo DMRIE ou DMRIE-DOPE pode estar entre cerca de 50: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 10, tal como cerca de 10: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 5 e cerca de 1: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 2, por exemplo, 1: 1 e 1: 2.

[00143] Em outra concretização, portador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pode ser uma emulsão de água-em-óleo. Exemplos de emulsões adequados de água-em-óleo incluem água-em-óleo de emulsões de vacinas à base de óleo que são estáveis e fluido a 4 ° C contendo: De 6 a 50% v / v de uma fase aquosa contendo o antigênico, de um modo preferido a partir de 12 a 25% v / v, de 50 a 94% v / v de uma fase de óleo contendo no total ou em parte, um óleo não metabolizável (por exemplo, óleo mineral, tal como óleo de parafina) e / ou óleo metabolizável (por exemplo, óleo vegetal , ou ácido gordo, de poliol ou álcool ésteres), de 0,2 a 20 p / v% de surfactantes, de preferência de 3 a 8 p / v%, sendo este último, no total ou em parte, ou em uma mistura de ambos os poliglicerol ésteres, disse ésteres de poliglicerol sendo preferencialmente poliglicerol (poli) ricinoleates, ou óleos de rícino polioxietileno ou então hidrogenada óleos de rícino polioxietileno. Exemplos de surfactantes que podem ser utilizados em uma emulsão de água-em-óleo incluem etoxilados ésteres de sorbitano (por exemplo, monooleato de polioxietileno (20) monooleato de sorbitano (Tween 80), disponível a partir de Applichem, Inc., de Cheshire, CT) e ésteres de sorbitano (por exemplo, mono-oleato de sorbitano (Span 80®), disponível a partir de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Além disso, no que diz respeito a uma emulsão água-em- óleo, ver também Patente US N ° 6.919.084, por exemplo, o Exemplo 8 da mesma, aqui incorporada por referência. Em algumas concretizações, a fase aquosa contendo o antigênico compreende uma solução salina compreendendo um ou mais agentes tamponantes. Um exemplo de uma solução tampão adequada é solução salina tamponada com fosfato. Em uma concretização vantajosa, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão tripla água / óleo / água (P / O / P) (Patente US N ° 6.358.500). Exemplos de outras emulsões adequados são descritos na Patente US No. 7,371,395.

[00144] As composições imunológicas e vacinas de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente em um ou mais veículos farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, excipiente, veículo, ou adjuvantes. Os veículos apropriados ou adjuvantes para utilização na prática da presente invenção são: (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, polímeros de anidrido maleico e de derivados alcenilo, (2) sequências imunoestimulantes (ISS), tal como oligodesoxirribonucleotídeo sequências possuindo um ou mais unidades CpG não metilados (Klinman et al, 1996; W098 / 16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, Subunidade e Adjuvante Abordagem ", publicado pela M. Powell, M. Newman, Pleem um Press 1995, ea emulsão MF59 descritos na página 183 do mesmo trabalho (4), lipídios cação contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citoquinas, (6) de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) ou saponina (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado como referência no presente pedido, ou (9) quaisquer combinações ou misturas destes.

[00145] A emulsão de óleo em água (3), o que é especialmente adequada para os vetores virais, pode ser baseado em: petróleo leve parafina líquida (tipo Farmacopeia europeia), óleo de isoprenóides tais como esqualano, esqualeno, óleo resultante a partir da oligomerização de alcenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou de álcoois possuindo um grupo alquilo de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etilo, propileno-glicol, di (caprilato / caprato), tri glicerol (caprilato / caprato) e propileno glicol dioleato, ou ésteres de ramificado , álcoois ou ácidos graxos, especialmente os ésteres de ácido isoesteárico.

[00146] O óleo é usado em combinação com emulsionantes para formar uma emulsão. Os emulsionantes podem ser não iónicos, agentes tensioativos, tais como: ésteres de sorbitano no um lado, de manida (p.ex. oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propileno glicol e, por outro lado, oleico, ricinoleico, ou ácidos hidroxiesteárico isoesteárico, os referidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, blocos de copolímeros de polioxipropileno ou polioxietileno, tais como Pluronic, por exemplo, L121.

[00147] Entre o tipo (1) polímeros de adjuvante, é dada preferência a polímeros de ácido acrílico reticulado ou ácido metacrílico, especialmente os éteres de polialcenilo reticulado por açúcares ou de poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o nome de carbómero (Pharmeuropa, Vol. 8, n. ° 2, Junho de 1996). Um perito na arte pode também referir-se a Patente US N ° 2.909.462, que proporciona tais polímeros acrílicos reticulados por um composto poli- hidroxilado possuindo pelo menos três grupos hidroxilo, de preferência não mais do que oito destes grupos, os átomos de hidrogénio de pelo menos três grupos hidroxilo sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados, possuindo pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilos, alilos e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tal como metilo. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) são especialmente adequados. Eles são reticulados por meio de alilo de sacarose ou pentaeritritol de alilo. Entre eles, é feita referência ao Carbopol 974P, 934P e 97 IP.

[00148] Tal como para os copolímeros derivados de anidrido maleico-alcenilo, é dada preferência a EMA (Monsanto), que são de cadeia linear ou reticulados copolímeros de anidrido etileno-maleico e eles são, por exemplo, reticuladas por meio de éter divinílico. Também é feita referência a J. Fields et al., 1960

[00149] No que diz respeito à estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e EMA são de preferência formados por unidades básicas com a seguinte fórmula:

no qual: - R1 e R2, que podem ser o mesmo ou diferentes, representam H ou CH3 - X = 0 ou 1, de preferência, x = 1 - Y = 1 ou 2, com x + y = 2.

[00150] Para EMA, x = 0 e y = 2 e para os carbômeros x = y = 1.

[00151] Estes polímeros são solúveis em água ou solução salina fisiológica (20 g / 1 de NaCl) e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo, pela soda (NaOH), para fornecer a solução de adjuvante, em que o vetor (es) de expressão pode ser incorporados. A concentração de polímero na composição imunológica ou de vacina final pode variar entre cerca de 0,01 a cerca de 1,5% p / v, cerca de 0,05 a cerca de 1% p / v, e de cerca de 0,1 a cerca de 0,4% p / v.

[00152] A citocina ou citocinas (5) pode estar na forma de proteína na composição imunológica ou de vacina, ou pode ser co-expressas no hospedeiro com o imunogene ou imunogenes ou epítopo (s) da mesma. É dada preferência a co- expressão da citocina ou citocinas, quer pelo mesmo vetor que expressa o imunogene ou imunogenes ou epítopo (s) do mesmo, ou por um vetor separado dos mesmos.

[00153] A invenção compreende a preparação de tais composições de combinação; por exemplo por mistura dos componentes ativos, e com vantagem em conjunto com um adjuvante, transportador, uma citoquina, e / ou diluente.

[00154] As citoquinas que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fator granulócito estimulante de colónias (G-CSF), fator de granulócito / colónias de macrófagos-estimulante (GM-CSF), interferão a (IFNa), interferão () , interferon, (IFNy), a interleucina-la (IL-la), interleucina (IL- P), a interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina- 4 ( IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), fator-A (TNFa) de necrose do tumor, fator de necrose tumoral (TNFP ), e fator de crescimento transformante (TGFP ). Entende-se que as citocinas podem ser co-administrada e / ou administrada sequencialmente com a composição imunológica ou de vacina da presente invenção. Assim, por exemplo, a vacina da presente invenção pode também conter uma molécula de ácido nucleico exógeno que expressa in vivo, uma citocina apropriada, por exemplo, uma citocina combinado para este hospedeiro a ser vacinado ou em que uma resposta imunológica é para ser atingida (por exemplo, uma citocina bovina para preparações para serem administradas a bovinos).

[00155] Vantajosamente, a composição e / ou vacina imunológica, de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente em, ou consistem em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta terapêutica de um ou mais polipeptídeos como aqui discutido; e, uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir desta divulgação, incluindo os documentos aqui incorporados, e o conhecimento na arte, sem experimentação indevida.

[00156] No caso da composição e / ou vacina imunológica com base nos polipeptídeos expressos, uma dose pode incluir, aproximadamente em 1 μg a cerca de 2000 μg, vantajosamente de cerca de 50 μg a cerca de 1000 μg e mais vantajosamente entre cerca de 100 μg a cerca de 500 μg de BTV ou FMDV antigênico, imunogênio ou epítopo. Os volumes de dose podem estar compreendidos entre cerca de 0,1 e cerca de 10 ml, com vantagem entre cerca de 0,2 e cerca de 5 mL.

[00157] A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos exemplos não limitativos seguintes.

EXEMPLOS

[00158] Construção de inserções de DNA, plasmídeos e vetores virais recombinantes ou plantas foi realizado usando as técnicas padrão de biologia molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989).

Exemplo 1 - Geração de BTV combinado Células e vírus

[00159] Células BSR são um clone de células BHK-21 e foram mantidas em meio de Eagle Dulbecco modificado (DMEM, Gibco) suplementado com soro fetal de bovino a 5% (FBS) e 25 ug / ml de penicilina / estreptomicina (P / S, Gibco). As células Vero foram mantidas em DMEM suplementado com FBS a 5% e P / S. Células CPT-terc são uma linhagem imortalizada de células do plexo coróide de ovelhas (59) e foram mantidas em meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, Gibco) suplementado com FBS a 10% e p / s. Todas as células de mamífero foram incubadas a 37° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.

[00160] BTV-1 é o serotipo 1 cepa de referência da Sul Africana e foi usada como a base para o primeiro sistema de genética inversa BTV. A cepa Europeu BTV-8 (BTV-8NET2008 / 06 (IAH coleção Orbivirus)) foi isolada a partir de uma vaca clinicamente afetado na Holanda, e tem uma história a passagem de apenas uma única passagem em células KC seguido por uma outra passagem em células BHK- 21.

Plasmídeos

[00161] Os plasmídeos utilizados para a recuperação de BTV-1 e BTV-8 foram descritos anteriormente (Ratinier et al, 2011). Cada plasmídeo contém uma única cópia de DNAc de um segmento genômico flanqueado por uma porção 5' do promotor de T7 e um local 3' de restrição. Tanto o promotor T7 e o local de restrição foram dispostos, de tal modo que os plasmídeos linearizados com a enzima de restrição apropriada permitiu a transcrição in vitro de transcritos de RNA tapado com autêntico terminais BTV. Plasmídeos adicionais contendo Seg-2 de campo virulento isolados de BTV-2, BTV-4 e BTV-9 (13), no mesmo contexto que os outros plasmídeos de resgate foram sintetizados comercialmente (GenScript).

Genética reversa

[00162] Os plasmídeos contendo os segmentos do genoma de mutantes resultantes BTV-1 ou BTV-8 ou foram linearizados com as enzimas de restrição apropriadas e, em seguida, purificado por extração com fenol-clorofórmio. Plasmídeos digeridos foram utilizados como molde para a transcrição in vitro utilizando a T7 mMessage mMACHINE Ultra. Kit (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. ssRNAs foram purificados sequencialmente por extração com fenol / clorofórmio e através de colunas Illustra Microspin G25 (GE Healthcare Life Sciences), seguindo o protocolo do fabricante.

[00163] Combinações dos RNA individuais foram montadas de acordo com os recombinantes desejados (ver Tabela 1 e Fig. 1).

[00164] 2 x 105 células BSR foram plaqueadas em placas de 12 poços em meio de crescimento sem antibiótico, 24 h antes da transfecção. As células foram transfectadas com RNA duas vezes utilizando Lipofectamine 2000. Para a primeira transfecção, 1 x 1011 cópias de transcrito in vitro como BTV- capped RNA que codifica VP l, 3, 4, 6, e NSL NS2 foram misturados com OptiMEM (Gibco) contendo RNAsin Plus (0.5 U / l, Promega) em um volume final de 10 l. 2 l de Liptofectamine de 2000, foi misturado com 10 l de OptiMEM (com RNAsin Plus) e incubou-se durante 5 minutos antes de se combinar com o RNA. Complexos de transfecção foram autorizados a formar durante 20 min antes de a mistura de transfecção gota a gota às células. Aproximadamente 18 h após a primeira transfecção, o meio foi substituído e as células transfectadas uma segunda vez de acordo com a primeira transfecção, mas com todos os 10 segmentos e 3 l de Lipofectamina. 4h após a segunda transfecção, o meio foi substituído por uma camada de agar.

[00165] A nomenclatura padrão é adoptada ao longo deste relatório: a seção de caixa superior do nome refere-se a espinha dorsal do vírus, seguida de um índice, compreendendo a proteína substituída, precedida pela origem serotipo do segmento, por exemplo BTV-1 SVPI refere-se a um vírus com um backbone BTV-1 contendo o gene l de BTV-8 VP.

[00166] O gráfico esquemático que representa a geração de recombinado BTV é mostrado na figura 6. Curvas de crescimento

[00167] Para a análise do crescimento do vírus in vitro, 2xl0 5 CPT-terc células / poço ou 3 X 10 6 células KC / poço foram semeadas em placas de 12 poços em 1 ml de meio de crescimento no dia anterior à infecção. As células foram incubadas no meio contendo o vírus em causa, durante 2 h a 37° C. O meio foi então descartado e as células lavadas uma vez com DMEM e em seguida incubadas com 1 ml de meio de crescimento fresco apropriado. 100 l de amostras do sobrenadante foram removidos a 0, 8, 24, 48 e 72 horas após a infecção (pi), e substituído com 100 l do meio de crescimento fresco. 100 l de amostras foram clarificadas por centrifugação durante 5 minutos a 500 xg e, em seguida, armazenada a 4 ° C. As amostras foram então tituladas por limitantes ensaios de diluição (60) em células BSR e títulos de vírus expressas como TCID50 / ml.

Ensaios de placas

[00168] Células CPT-terc foram semeadas a uma densidade de 4 x 105 células / poço em placas de 6 poços 24 h antes da infecção com vírus da febre catarral. As células foram infectadas durante 2 h a 37 contendo o vírus foi rejeitado e as células foram lavadas com DMEM e incubadas durante 72 horas em 3 ml de uma sobreposição semi-sólido (1,2% Avicel em DMEM suplementado com FBS a 4% e p / s). A sobreposição foi então descartada e as células foram lavadas com PBS e, em seguida, coradas para> 1 h com violeta de cristal em formaldeído.

Ensaios de neutralização

[00169] Diluições em série de três vezes de BTV-1 ou BTV-8 anti-soros específicos foram preparados em quadruplicado em placas de 96 poços utilizando 50 de cada soro de teste diluído em DMEM contendo FBS a 3%. 100 TCID 50 recombinantes de vírus da febre catarral-1, vírus da febre catarral-8 e seleccionadas foram então adicionados aos poços correspondentes e as placas e incubou-se a 37 ° C durante 1 h. Finalmente, 2.5xl0 4 células Vero foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada a 37 ° C durante 5 dias em um incubador humidificado com 5% de CO2 no qual CPE virai foi avaliada visualmente. A dose protectora de 50 (PD50) para cada amostra de soro, definido como a diluição de soro que inibe a infecção pelo vírus da febre catarral em 50% de culturas de células Vero, foi determinada utilizando o método de Reed- Muench (60), em seguida. A suspensão células BHK-21 foram ampliados para produção em larga escala de reassortant BTV. O reassortant colhidas BTV foram inativados. Os adjuvantes adequados foram adicionados à BTV combinado para a preparação da vacina.

RESULTADOS

[00170] Genética reversa foi usada para determinar se era possível recombinar qualquer segmento individual de uma das BTV-1 ou BTV-8 em uma espinha dorsal alternativa. Todas as combinações de vírus com um único segmento de BTV-8 na espinha dorsal da BTV-1 foram resgatadas com sucesso, e vice- versa (Figura 1). O genótipo de cada vírus recombinante natural foi verificado por amplificação por RT-PCR e sequenciação de um fragmento de cada segmento (Figura 1). Os resultados mostraram que todo o segmento BTV podem recombinar entre BTV-1 e vírus da febre catarral-8.

[00171] As características de crescimento in vitro de cada vírus recombinante natural foi avaliada usando o ensaio de placa e através da realização de curvas de crescimento de vírus. Diâmetros de placa médio foram determinados a partir de dois ciclos independentes de ensaio de placas. Na maioria dos casos, o diâmetro da placa era em grande parte inalteradas e diferenciaram-se pouco a partir da espinha dorsal parental em que o segmento individual alternativa foi inserido (Fig. 2A-B). No entanto, alguns vírus revelaram consistentemente uma menor ou maior em relação ao fenótipo de placa a espinha dorsal parental. A substituição do BTV-8 Seg- 8 (que codifica NS2) na espinha dorsal do VFC-1 (BTV-1 8N S2) resultou em placas que eram aproximadamente 33% menor do que o de tipo selvagem BTV-1 (Figura 2A). As placas do recombinado oposto, ou seja, BTV-8INS2, também foram reduzidos, embora em menor grau (Figura 2B). Outros monoreassortants que consistentemente produziram placas com um diâmetro menor em comparação com os vírus parentais foram aqueles com segmentos rearranjado que codificam VP 1, VP4, e NS1.

[00172] Análises de curva de crescimento foram realizadas a fim de avaliar a cinética de crescimento de cada recombinante natural. A maioria dos recombinantes demonstraram dinâmica de crescimento semelhantes aos correspondentes vírus do tipo selvagem (Figura 3).

[00173] Vários estudos têm sugerido que VP2 está indissociavelmente ligada à BTV sorotipo. No entanto, também tem sido sugerido que a VP5 contribui para a definição de um serotipo de cepas particulares. Para investigar as contribuições relativas de VP2 e VP5 ao sorotipo determinação, ensaios de neutralização de soro foram realizadas utilizando BTV-1 combinados, BTV-8 e combinados com a espinha dorsal de qualquer BTV-1 ou BTV-8 eo VP2 heteróloga sozinho ou VP2 e VP5 (BTV-, BTV-1 8 VP2, VP5, BTV- 8I VP2 e BTV-8 IVP2, VP 5). BTV-1 e BTV-8 neutralizante antisoros foram derivados de animais vacinados contra BTV-1 ou BTV-8 e desafiado com a cepa homóloga.

[00174] Os resultados mostraram que BTV-8 anti-soros neutralizou completamente do tipo-selvagem BTV-8, enquanto que mostra nenhuma capacidade de neutralização contra BTV-1 (Figura 4A). Da mesma forma BTV-1 foi neutralizada por BTV-1 anti-soros, mas não por anti-soros BTV-8 (Figura 4A).

[00175] Experiências com recombinados contendo VP2 ou VP2 e sozinho VP5 do vírus heterólogo revelou que o vírus só é neutralizada quando o soro corresponde proteína VP2, confirmando estudos ligando serotipo unicamente com VP2.

[00176] Os resultados indicam que VP2 sozinha pode ditar o sorotipo nos levou para gerar mais BTV-1 reassortants incorporando Seg-2 a partir de uma seleção de sorotipos. BTV- 1 vírus recombinantes contendo o VP2 de BTV-2, BTV-4 e BTV-9, resultando em BTV-I2VP2, BTV- I4VP2 e BTV- I 9VP2 respectivamente foram resgatados com sucesso. Em todos os casos os vírus foram resgatados que cresceu igualmente para o vírus de tipo selvagem (Figura 5).Exemplo 2 - Estudo clínico e sorologia de animais vacinados Duas construções usando uma espinha dorsal BTV-1 e substituindo (VP2BTV1) ou (1 VP2BTV VP5BTV + 1) com (VP2BTV8) ou (+ VP2BTV8 VP5BTV8), respectivamente, foram usados no estudo de desafio. Características dos antígenos produzidos para formular as vacinas testadas estão resumidas na Tabela 2 abaixo.Tabela 2 - Características dos antígenos

[00177] Os vírus recombinantes foram crescidos, inativados e processada para produzir duas bateladas de antigênico. Estes antígenos foram formulados em vacinas misturando-os com gel de alumínio (2,7 mg de hidróxido de alumínio) e saponina (30HU dose de vacina de saponina por LML) como adjuvantes. As vacinas testadas estão listadas naTabela 3. Tabela 3 - Características das vacinas

*: teor VP2BTV8 medida pelo quantitativo Dot Blot no AI (Ingrediente Ativo) **: Equivalente mL de AI não-concentrado

[00178] As vacinas foram administradas em 1 ou 2 injecções para ovelhas seronegativas BTV convencional. A proteção foi avaliada através de um virulento BTV-8 desafio realizado 21 dias após a conclusão da vacinação e vigilância clínica e virológica subsequente. Estudo de desafio em ovelhas foi realizado de acordo com a Tabela 4 abaixo.Tabela 4

[00179] Antes das sessões de vacinação, todos os animais foram monitorados por seu estado de saúde e para a temperatura retal. Em DO e / ou de D21, cada animal de grupos Gl a G6 recebeu uma dose de 1 ml da vacina adequada, tal como descrito na Tabela 4. As injecções foram realizadas por via sub-cutânea, à esquerda (OD) ou para a direita (D21) face lateral do tórax, ao lado do cotovelo, após a desinfecção local do sítio da injecção. Os animais do grupo G7 permaneceram não tratado e serviram como controle.

[00180] Para todos os animais, a temperatura retal foi registada em D42 (antes do desafio) e depois diariamente a partir de D47 a D56. A partir de D47 a D56, foram registrados comportamento geral e condição corporal de todos os animais. Para a condição geral: Bom é atribuída uma pontuação de 0; Apathic é atribuída uma pontuação de 1; Deprimido é atribuída uma pontuação de 2; Prostrado é atribuída uma pontuação de 3. Para condição corporal: Normal é atribuída uma pontuação de 0; Fino é atribuída uma pontuação de 1; Caquético é atribuída uma pontuação de 2.

[00181] A partir de D47 a D56, foram registrados sinais clínicos freqüentemente observados durante a infecção febre catarral ovina, incluindo: - O congestionamento e / ou edema, especialmente na cabeça: olhos, narinas, orelhas, lábios, chanfro, espaço intermandibular - Hipersalivação - Secreção nasal / crostas - Balido Plaintive - Petéquias - Problemas locomoção (claudicação) - Problemas respiratórios (tosse / dispneia) - Problemas digestivos (diarréia) - Eritema

[00182] Outro sinal clínico foi registrado quando presente. Nos dias em que não acompanhamento clínico individual foi realizado, estado geral de saúde do rebanho foi verificada diariamente como parte dos cuidados e manutenção diária.

[00183] Em DO (antes da vacinação), D21 (antes da vacinação), D42 (antes do desafio) e D56, todas as ovelhas foram recolhidas amostras de sangue por punção jugular com tubos lisos. Todas as amostras foram tratadas para coletar soro. Os soros foram divididos em alíquotas e inactivado pelo calor (56 ° C, 30 min) antes da sua transferência para o laboratório de análises clínicas. BTV-8 títulos de anticorpos específicos foram determinados em soros individuais em tudo data de amostragem por meio de testes de seroneutralização.

[00184] Testes de sero-neutralização foram realizados de acordo com a técnica (N ° 002.488) atualmente utilizado pelo laboratório de análises clínicas. Resumidamente, os soros foram testados em diluições de três vezes (0,48 loglo), a partir de 1/3, em placas de microtitulação. Cem microlitros de soro diluídas foram incubadas durante 1 hora a 37 ° C com 50 microlitros de uma suspensão virai de um determinado serotipo BTV (serotipo 8). Cinquenta microlitros de uma suspensão de células VERO contendo 500 000 células por ml, em seguida, foram adicionados à mistura e as placas foram incubadas a 37 ° C. A leitura das placas foi baseada no efeito citopático, após uma incubação de 7 dias. Os títulos do soro, expressos em loglo (PD50%) foram calculados por regressão após transformação angular.

[00185] No D42 (antes do desafio), D47, D49, D51, D54 e D56, todas as ovelhas foram recolhidas amostras de sangue por punção jugular com tubos de EDTA.

[00186] A fim de detectar e quantificar a febre catarral RNA do vírus no sangue, teste de análise por qRT-PCR foi executada nestas amostras. Estes ensaios foram feitos de acordo com a técnica No. 200336 actualmente utilizado pelo Laboratório de Análises Clínicas (método automatizado).

[00187] Resumidamente, após extracção utilizando um kit comercial (NucleoSpin múltiplos 96), o RNA foi desnaturado em primeiro lugar por tratamento pelo calor. Uma aliquota foi, em seguida, incubada com a sonda MGB, iniciadores específicos e reagentes do kit Invitrogen Super Script Platina III, para permitir a amplificação no thermocyclor. Esta etapa foi realizada em duplicado. O sinal de fluorescência é proporcional à quantidade de DNA sintetizado. A amplificação por objecto qualquer um dos 24 serotipos BTV. Quantificação de BTV ácidos nucleicos nas amostras foi feita por comparação com amostras de RNA normalizadas. A quantidade de RNA foi expressa em número loglo de RNA cópias por ml de sangue, considerando os resultados obtidos em cada duplicado quando ambos eram positivos, dos quais o positivo quando um dos duplicados foi considerado negativo. O corte positivo fora do ponto 95% da técnica (definida como o número mínimo de sequências alvo por amostra de volume que pode ser detectado em 95% de ensaios) ou o limiar de resposta positiva 95% (PRT95) foi determinada em 3,68 cópias loglo de RNA / mL. Os resultados das amostras a titular abaixo 3.68 cópias loglo de RNA / ml foram expressos como <PRT95 e foram considerados negativos. Os resultados das amostras titulando> P RT95 foram dadas tal e foram considerados positivos.

[00188] Para efeitos de descrição dos resultados (de cálculo da média, o desvio padrão e a área sob a curva) e análise, um título de 3,68 cópias de RNA loglo / mL foi atribuído às amostras negativas.

Resultados de hipertermia

[00189] As evoluções de temperaturas médias após o desafio são apresentadas na Figura 8. Dispersões de hipertermias máxima são mostradas na Figura 9.

[00190] Um aumento da temperatura rectal foi claramente observada no grupo de controle, a partir de

[00191] D48 (ou seja, 6 dias após o desafio) e um pico em D49 (41,3 ° C em média), em seguida progressivamente reduzindo em até D56.

[00192] Em todos os grupos vacinados, a temperatura média era bastante constante durante todo o período de monitorização. Quando comparado com o grupo de controle (G7), significativamente (p <0,01) menor nos grupos vacinados Gl, G3 e G4. As diferenças não foram estatisticamente significantes para G2 e G6.

Sinais clínicos e Pontuações clínicas

[00193] A média da Evolução das pontuações clínicas diárias é mostrado na Figura 10. Dispersão de GCS por grupo é representada na Figura 11.

[00194] Após o desafio, os sinais clínicos mais observados foram congestão e edema na cabeça. Entre outros, eritema, apatia, magreza, corrimento nasal e crostas, problemas respiratórios e de locomoção foram também observados ocasionalmente.

[00195] A frequência ea duração da observação desses sinais eram claramente superiores nos controles do que nos grupos vacinados.

[00196] No grupo controle (G7) significa pontuação clínica diária atingiu o pico em D50 (ou seja, 8 dias após o desafio) em um valor de 8,8 e foi constantemente mais elevada do que em quaisquer grupos vacinados. O GCS média de G7 era 50. Nos grupos vacinados, significa pontuação clínica diária foi muito baixa durante todo o período de monitoramento. Quando comparado com o grupo de controle (G7), GCS foram estatisticamente significativamente (p <0,01) reduzido todos os grupos vacinados com excepção G2. Para G2, a diferença foi próxima da significância estatística.

Resultados da viremia

[00197] Evolução de viremia títulos médios encontram- se resumidos na Figura 12. As frequências de amostras positivas por PCR e as AUCs são mostrados na Tabela 5. A Figura 13 mostra as dispersões de AUC.

[00198] Todas as ovelhas foram confirmadas por RT-PCR negativo antes do desafio. No grupo de controle, todos os cRNAeiros foram positivos em D47 (isto é, 5 dias após o desafio) e todos eles mantiveram-se positivos, em vez títulos elevados, até ao fim do período de monitorização.

[00199] Nos grupos vacinados G3 e G4, um carneiro foi detectado positivo sobre a data de amostragem imediatamente após a inoculação. Ambas as ovelhas foram, então, sempre consideradas negativo. Estes transitórios, inferiores positivos, os resultados foram muito provavelmente devido à detecção de um inoculo remanescente do desafio, e não eram claramente atribuível a uma multiplicação de infecção viral.

[00200] Quando comparado com o grupo de controle (G7), áreas sob as curvas foram estatisticamente significativamente (p <0,01) reduzido em todos os grupos vacinados com excepção G2. Para G2, a diferença foi próxima da significância estatística. Prevenção completa de viremia foi considerado alcançado em Gl, G3, G4 e G5.

[00201] Tabela 5 - Frequências de amostras positivas de PCR e AUC

*: vaciva comercial BR8: vacina Comercial BTV-8 (Merial) **: uma ovelha morta no D53.

Resultados sorológicos

[00202] Evolução dos médios títulos BTV-8 de anticorpos neutralizantes estão resumidos na Figura 14. Todas as ovelhas foram confirmadas seronegativos antes da vacinação e os controles permaneceram soronegativos até desafio.

[00203] Nos 2 tiros grupos vacinados (Gl e G4), algumas sero-conversões foram observadas em D21. No D42, todas as ovelhas tinham sero-convertido em ambos os grupos e os títulos médios foram quase idênticos.

[00204] Nos grupos vacinados um tiro (G2, G3, G5 e G6), algumas sero-conversões foram observadas 21 dias após a vacinação (ie D42). Enquanto se observou uma diferença óbvia nos titulos serológicos (D42) entre uma e duas doses grupos vacinados (Gl vs G2 e G4 vs G5), diferenças nos titulos serológicos de acordo com a carga de antigênico (G2 vs G3) foram menos óbvio.

[00205] Todas as ovelhas fortemente sero-convertidos após o desafio (D56) e houve um claro efeito booster em todos os grupos vacinados.

Conclusão

[00206] Os resultados mostraram que as construções proporcionaram uma redução significativa de hipertermia, a redução significativa dos sinais clínicos, e prevenção completa e significativa da viremia.

Exemplo 3 - Produção de BTV sintético de múltiplos sorotipos

[00207] Usando o sistema de genética inversa como descrito no Exemplo 1, "sintéticos" recombinados BTV (sBTV) foram gerados cobrindo 24 dos 26 serotipos diferentes em que cada um de VP2 foi acoplado com a proteína VP5 homóloga em um BTV-1 espinha dorsal (VP 1, VP3, VP4, NS1, VP7, NS2, NS3 VP6 e proteínas) como mostrado na Tabela 6 abaixo. O termo "sintético" foi utilizado para descrever a plataforma, porque os segmentos do genoma podem ser syntesized in vitro a partir de uma sequência conhecida, em vez de através da amplificação do genoma de um isolado de vírus.

[00208] Curiosamente e surpreendentemente, embora BTV- 25 (Toggenburg Orbivirus) não crescem em cultura de células, através da introdução de regiões não traduzidas de BTV-1 para a sequência de codificação das proteínas VP2 e VP5, fomos capazes de resgatar um sBTV do BTV-25 sorotipo. Assim, a plataforma de vacina pode ser extremamente útil para as cepas de vírus que não podem ser facilmente isolados em cultura de tecidos.Tabela 6 - vírus sBTV Disponível sintetizados pelo sistema de genética inversa

# região de codificação de proteína flanqueada por regiões não traduzidas de BTV-1

Caracterização e replicação in vitro de sBTV

[00209] Estoques virais de cada vírus sBTV foram cultivadas e titulada em células BSR. Fenótipo de placa foi avaliada por ensaio de placas em células de ovino em 72 horas pós-infecção (Figura 15). Como mencionado anteriormente, todos os sorotipos resgatados têm a combinação VP2 / VP5 homóloga.

[00210] A replicação sBTV foi determinada em células BHK-21 (infectadas com uma MOI de 0,001). Os sobrenadantes das células foram colhidos às 72 h pós-infecção (Figura 16). Amostras em triplicado foram posteriormente titulados por TCID 50 em células BHK-21 (usando o método de Reed-Muench) e representados graficamente como LogioTCID 50 / ml.

Exemplo 4 - Produção de vírus inativado combinado

[00211] Duas cepas construto como reassortant BTV, um correspondendo a VP2 de BTV8 em BTV- um backbone eo segundo com VP2 / VP5 de BTV8 em BTV- um backbone foram amplificados em células BHK21.

Produção de células

[00212] Um biorreator foi inoculado 7L (passagem 48) com 5 litros de meio GMEM com 7% de soro de vitelo e 2 x 109 células (passagem 6BHK2M12-47). A cultura foi regulada utilizando como parâmetros: pH: 7,1 ± 0,1, temperatura: 37,0 ± 1,5 ° C, D02: 40 ± 10% e agitação: 300 rpm ± 10%. Após 2 dias de cultura, foi realizada uma em umeração. O volume total da suspensão foi transferida em B4 biorreactor previamente esterilizado e contendo 35 litros de meio GMEM + 7% de CS. A cultura foi regulado utilizando como parâmetros: pH: 7,1 ± 0,1, temperatura: 37,0 ± 1,5 ° C, D02: 40 ± 10% e agitação: 150 rpm ± 10%. Após 3 dias de cultura, a agitação do biorreactor foi parada por decantação das células durante cerca de 24 horas a + 5 ° C. Após decantação, o meio foi eliminado, (restante volume = 5 litros). Médio VMM foi adicionado (30 litros). Depois da mistura, a contagem de células foi efectuada e o inoculo foi adicionado: inoculo BTV1 BTV8 + VP2 (RAS10) para o primeiro ingrediente ativo e inoculo BTV1 BTV8 + VP2 / VP5 (RAS32) para a segunda. O volume final no biorreactor foi de 35 litros, o volume de inoculo foram calculadas para obter um MOI igual a 5 10 "4 CCID 5 O / célula Os parâmetros da cultura foram:. PH: 7,4 ± 0,1, temperatura: 37,0 ± 1,5 ° C, D02: 40 ± 10%, de agitação: 100 rpm ± 10% e a pressão: 0,1 bares ± 10% A cultura foi parado após cerca de 46 horas por arrefecimento sob agitação. Tratamento antes da inativação

[00213] A regulação de oxigênio foi parado e adicionou-se clorofórmio para obter uma concentração final de 0,05%. A mistura foi deixada sob agitação a cerca de 8 ° C durante uma hora com uma regulação do pH a 7,4 ± 0,1. A regulação do pH foi interrompida e o produto armazenado a cerca de + 8 ° C, sem agitação, até que o tratamento. Cerca de 24 litros de cultura foram tratados com ultra-turrax T50: 8 amostras de 3000 ml a 1000 watts durante 3 minutos à temperatura de laboratório. As amostras foram reunidas após o tratamento.

[00214] O produto foi então clarificado por centrifugação (20 minutos a 3500 rpm, 20 ° C). O sobrenadante foi filtrado e armazenado a + 5 ° C antes da inactivação. Inativação

[00215] O sobrenadante filtrado foi aquecido a 37 ° C e o pH foi ajustado para 7,4 ± 0,1.

[00216] A solução de formaldeído foi adicionada para obter uma concentração final de 0,5 mg / ml. Vinte minutos depois, uma dose de EI foi adicionado para obter uma concentração final de 1,5 mM. 18 horas depois, uma segunda dose de EI foi adicionado (mesma concentração). A etapa de inactivação foi efectuada a 37 ° C durante 24 horas (to = tempo da primeira adição de EI). Durante este passo de inactivação, as amostras foram levadas a cabo e tratada por uma solução de L-cisteína.

Filtração e concentração

[00217] O produto inativado foi filtrado (CUNO 30S). O novo volume foi medido. O filtrado foi concentrado à temperatura de laboratório, o fator de concentração foi calculada.

Purificação e Tratamento com formaldeído

[00218] O concentrado foi purificado utilizando uma coluna XK 25/100 com S6FF. Dois ensaios foram realizados. Condições de purificação foram: volume de amostra: 15% da coluna (cerca de 60 ml); tampão para eluição: tampão de fosfato de pH 7,4; Velocidade de eluição: 2,5 ml / min. Exclusão de pico (substância activa), fração de Segurança, e pico de proteína foram recolhidos separadamente.

[00219] A solução de formaldeído foi adicionada ao ingrediente ativo para se obter uma concentração final de 1 mg / ml armazenado a + 5 ° C.

[00220] Os resultados para o título infeccioso, ELISA, dot blot para BTV1 Vp2 + BTV8 VP2 (RAS10) e BTV1 BTV8 + VP2 / VP5 (RAS32) são mostrados nas Figuras 17 e 18. A produção das duas recombinados inactivados BTV purificadas foi realizada com sucesso. Estes dois recombinantes foram usados para formular vacinas.

[00221] Tendo assim descrito em detalhe concretizações preferenciais da presente invenção, é para ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes específicos estabelecidos na descrição acima de como muitas variações evidentes da mesma são possíveis sem se afastarem do espírito ou escopo da presente invenção.

[00222] Todos os documentos citados ou referenciados no pedido os documentos citados, e todos os documentos citados ou mencionados neste documento ("aqui citados documentos"), e todos os documentos citados ou referenciados aqui citados documentos, juntamente com instruções de qualquer fabricante, descrições, especificações de produtos e produto folhas para quaisquer produtos aqui ou em qualquer documento incorporada por referência aqui mencionados, são aqui incorporadas por referência, e pode ser empregue na prática da invenção. REFERÊNCIAS:

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Claims (7)

1. Composição caracterizados pelo fato de que compreende vetores recombinantes de Vírus da Língua Azul (BTV) compreendendo polinucleotídeos heterólogos conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NO: 73 ou 93 que codificam o polipeptídeo VP2 de BTV-8 e o esqueleto do vetor derivado do genoma de BTV-1 compreendendo os polinucleotídeos heterólogos conforme estabelecidos nas SEQ ID NO: 63 ou 75, 65, 66, 67 ou 193 ou 194, 68, 69, 70, 71 e 72.

2. Vetor recombinante de BTV caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NO: 73 ou 93 que codifica o polipeptídeo VP2 de BTV-8, e o esqueleto do vetor derivado do BTV-1 compreendendo os polinucleotídeos heterólogos conforme estabelecidos nas SEQ ID NO: 63 ou 75, 65, 66, 67 ou 193 ou 194, 68, 69, 70, 71 e 72.

3. Método de produção de um vetor recombinante de BTV caracterizado pelo fato de que compreende a transfecção de uma célula com: a) RNAs que codificam VP2 de BTV-8; e b) RNAs que compreendem os transcritos que codificamVP1, VP3, VP4, VP5, VP7, NS1, NS2, VP6NS4, e NS3/3A de BTV-1, e em que em termo de sequência que codificam BTV, estes são as únicas moléculas de RNA com as quais a célula é transfectada.

4. Uso da composição conforme definida na reivindicação 1 ou do vetor conforme definido na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para vacinação de um animal.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende um regime prime-boost.

6. Uso da composição conforme definida na reivindicação 1 ou do vetor conforme definido na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para induzir uma resposta imunogênica ou protetora em um animal contra agentes patogênicos.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o animal é um bovino, ovino, caprino ou equino.

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