BR112014025651B1 - Anticorpo anti-blys, seu método de preparação, composição farmacêutica, vetor de dna recombinante e molécula de dna - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-BLyS. A presente invenção refere-se ao campo de biofarmacêutica. É descrito um anticorpo anti-BLyS. O anticorpo anti-BLyS tem como alvo especificamente o BLyS, que pode se combinar com um fator estimulante de linfócito B, e pode inbir a combinação de fator estimulante de linfócito B com o receptor BR3-Fc do mesmo. *Também são providos os usos de anticorpo anti-BLyS na fabricação de um medicamento para prevenir e/ou tratar doenças causadas por proliferação excessiva de células B tais como lúpus eritematoso sistêmico.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo de biofarmacêuti- ca, e refere-se a um anticorpo anti-BLyS e ao uso do mesmo. O anticorpo anti-BLyS pode se combinar com um fator estimulante do linfóci- to B, e pode inibir a combinação do fator estimulante do linfócito B com o receptor BR3-Fc do mesmo. Ela ainda se refere a um anticorpo antiBLyS humanizado que tem baixa afinidade com fator MHC II e o uso do mesmo.

Histórico da Invenção

[002] Lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é um tipo de doença autoimune, que envolve vários sistemas de órgãos do corpo tais como pele, articulações, coração, pulmão, rins, sangue e cérebro, e é progressiva de forma difundida, com remissão e retorno ocorrendo alternadamente. Lúpus eritematoso sistêmico afeta principalmente Caribe- nhos de origem Africana, Asiáticos e Hispânicos, enquanto tem menor incidência nos Caucasianos (a raça branca). De acordo com a Lupus Foundation of America, é previsto de forma conservadora que o Lúpus eritematoso sistêmico afete 300.000 pessoas na América. Sob a estimativa da Datamonitor Company, existem 2.2 milhões de pacientes que sofriam de Lúpus eritematoso somente na China, Índia e México, sendo que na China são mais de 1 milhão de pacientes que sofrem de Lúpus eritematoso sistêmico, a qual é a mais alta do mundo. Uma vez que os sintomas iniciais de Lúpus eritematoso sistêmico são muito dissimulados, a quantidade real de pacientes pode ser bem maior do que a estimativa atual. Desse modo, existe uma grande demanda no diagnóstico e tratamento de SLE em consultório.

[003] A causa de SLE é complicada e incerta. Não é causado por um único fator, e pode estar relacionada a vários fatores tais como he-reditariedade, ambiente, hormônio sexual e imunidade, etc. Neste momento, é amplamente reconhecido pela comunidade científica que a patogênese de SLE é aquela que, no nível celular, a autorreação da célula B permanece por muito tempo nos tecidos periféricos, e produz antígeno autólogo humano, que causa autoimunidade. Então, se for possível inibir o crescimento e a proliferação da célula B inicial, o SLE pode ser tratado.

[004] O estimulante do linfócito B (BLyS), também conhecido como Tall-1(TNF e ligante expressado por leucócito relacionado a Apol 1), BAFF (fator de ativação da célula B que pertence à família TNF), THANK (homólogo TNF que ativa a apopotose, NF-KB e JNK), pertence à família de fator de necrose tumoral (TNF), e é uma nova citocina primeiramente descoberta e clonada por Hongbing Shu e outros em 1999. Como um co-estimulante da célula de linfócito B, BLyS pode, na presença de anti-IgM e IL-4, exclusivamente estimular a proliferação e diferenciação da célula B, e ter uma função muito importante em imunidade humoral. E sua expressão em excesso no corpo está quase relacionada à doença autoimune.

[005] Experimento in vitro mostra que, após as células B serem pré-ativadas por IgM, BLyS pode induzir as células B a proliferar mas- sivamente e secretar grande quantidade de IgM e IgA. No entanto, para as células B no período de descanso, esta estimulação não tem efeito óbvio. Um outro estudo mostra que, BLyS age principalmente em células pré-linfóides B, células B linfoides imaturas e células linfoi- des ativadas, apesar de ter nenhum efeito em plasmócito, e células tronco linfáticas pluripotentes. Assim como a maioria das citocinas, BLyS estimula transmissão de sinal a jusante pelo receptor de superfície de células B. Muitos grupos de estudo confirmaram que os recepto- res combinados com BLyS são: receptor de fator de ativação de célula B (BR3, receptor BLyS 3 ou BAFF-R), ativador de transmembrana (ati- vador de transmembrana-1 e modulador de cálcio e ligante-interagente de ciclofilina, TACI) e antígeno para maturação de célula B (BCMA). Esta especificidade determina que BLyS é um alvo muito bom para doenças de autoimunidade mediadas por anticorpo da célula B e câncer do tipo linfoma.

[006] Foi demonstrado in vivo e in vitro que o anticorpo terapêuti co de anti-BLyS pode efetivamente inibir o crescimento de células B, e a separação de IgA e IgM, desse modo alcançando o efeito para tratar SLE (Edwards BM et al, The remarkable flexibility of the human antibody repertoire; isolation of over one thousand different antibodies to a single protein, BLyS. J Mol Biol. 2003 Nov 14; 334(1):103-18; Baker KP et al, Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator. Arthritis Rheum. 2003 Nov; 48(11): 3253-65). Benlysta, um anticorpo anti-BLyS desenvolvido pelo US Human Genome Sciences Inc, se torna o primeiro novo medicamento para tratamento de SLE nos últimos 60 anos. Benlysta somente tem objetivo em célula B estimulada por BLyS, e amplamente reduz o efeito colateral durante a terapia em comparação com medicamentos de quimioterapia, desse modo provendo uma terapia segura e eficaz para pacientes com SLE. Estudo e aplicação clínica de terapia tida como alvo contra BLyS são desenvolvidos rapidamente em anos recentes, e a maior parte das empresas exceto Human Genome Sciences Inc usa proteínas de fusão modificadas na base de BLyS ou receptor do mesmo. A empresa norte-americana Genentech desenvolveu o medicamento BR3-FC, a Zymogenetics desenvolveu o medicamento TACI-FC, e a AMGEN desenvolveu polipeptídeo-FC. Em comparação com Benlysta, estes medicamentos têm baixa especificidade, fraca força de ligação, relativa- mente pobre efeito curativo e toxicidade mais forte. Os três medicamentos são todos parados ou terminados no teste clínico II. Consequentemente, o medicamento do anticorpo de anti-BLyS é exatamente o tratamento farmacêutico eficaz para esse alvo.

[007] Benlysta é produzido por meio de biblioteca de exibição de fago. E as desvantagens da biblioteca de exibição de fago são que: acreditou-se que o pareamento de cadeias pesadas e cadeias leves é artificial sem a seleção in vivo (Greg Winter, e outros, Making Antibodies by Phage Display Technology. Annual Review of Immunology Vol. 12: 433-455); a biblioteca é construída a partir de PBMC imaturo humano, desse modo que os anticorpos do candidato tenham baixa afinidade (Edwards BM, e outros, The remarkable flexibility of the human antibody repertoire; isolation of over one thousand different antibodies to a single protein, BLyS. J Mol Biol. 2003 Nov 14; 334(1):103-18); na maior parte dos casos, os medicamentos pretendentes da biblioteca de exibição de fago têm desvantagens de baixo rendimento, baixa estabilidade e pobre natureza farmacocinética in vivo (Ponsel D, e outros, High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 2011 May 3;16(5):3675-700).

[008] Anticorpos anti-BLyS com as seguintes propriedades são ainda necessários na técnica: eles são produzidos, por exemplo, ao se usar tecnologia de anticorpo de camundongo humanizado, etc, sem usar biblioteca de exibição de fago; eles são capazes de se ligar ao estimulante de linfócito B com alta afinidade e inibir o estimulante de linfócito B da ligação a seu receptor BR3-Fc, com alta especificidade; eles têm baixa imunogenicidade; e/ou têm baixa afinidade com fator MHC II, através disso minimizando a resposta imune enquanto asseguram afinidade.

Sumário da Invenção

[009] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo anti-BLyS, em que as sequências de aminoácido das cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 assim como a cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-BLyS são selecionadas a partir de um dos grupos a seguir ou das variantes funcionais dos mesmos.

[010] Em uma modalidade, a sequência de aminoácido de cadeia leve da região variável e a sequência de aminoácido de cadeia pesada da região variável do anticorpo anti-BLyS antibody são selecionadas a partir de um dos seguintes grupos: a: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 31 e SEQ ID NO. 32 ou as variantes funcionais das mesmas; b: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 33 e SEQ ID NO. 34 ou as variantes funcionais das mesmas; c: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 35 e SEQ ID NO. 36 ou as variantes funcionais das mesmas; d: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 37 e SEQ ID NO. 38 ou as variantes funcionais das mesmas; e e: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 39 e SEQ ID NO. 40 ou as variantes funcionais das mesmas.

[011] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-BLyS da invenção é humanizado.

[012] Em uma modalidade, a sequência de aminoácido de cadeia leve da região variável e a sequência de aminoácido de cadeia pesada da região variável do anticorpo anti-BLyS são selecionadas a partir dos seguintes grupos:

[013] I: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 41 e SEQ ID NO. 42 ou as variantes funcionais das mesmas;

[014] II: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 43 e SEQ ID NO. 44 ou as variantes funcionais das mesmas;

[015] III: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 45 e SEQ ID NO. 46 ou as variantes funcionais das mesmas; e

[016] IV: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 47 e SEQ ID NO. 48 ou as variantes funcionais das mesmas.

[017] Em algumas modalidades preferidas, o anticorpo anti-BLyS ainda compreende cadeia leve humana da região constante e cadeia pesada humana da região constante, e a cadeia leve da região variável e cadeia pesada da região variável se conecta à cadeia leve humana da região constante e cadeia pesada humana da região constante respectivamente. Em uma modalidade, a cadeia leve humana da região constante é cadeia leve humana da região constante k. Em uma modalidade, a cadeia pesada humana da região constante é cadeia pesada do fragmento Fc.

[018] Esta invenção ainda provê molécula de DNA para codificar o anticorpo anti-BLyS da invenção. Preferivelmente, a molécula de DNA tem a sequência de nucleotídeo selecionada a partir da SEQ ID NO. 49-58.

[019] A invenção provê um vetor de DNA recombinante, que compreende a molécula de DNA de anticorpo anti-BLyS da invenção.

[020] A invenção ainda provê uma célula hospedeira, que compreende o vetor de DNA recombinante da invenção.

[021] Em outro aspecto, a invenção provê um método para prevenir e/ou tratar doenças causadas por proliferação extra de célula B, que compreende aplicar uma dosagem eficaz de anticorpo anti-BLyS de qualquer uma das reivindicações 1 a 7. Em algumas modalidades, as doenças causadas pela proliferação extra de célula B são selecionadas a partir de SLE, artrite reumatoide, artrite anquilosante, ou câncer do tipo linfoma da célula B.

[022] A invenção também provê uma composição farmacêutica,que compreende uma dosagem eficaz do anticorpo de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[023] A invenção também provê um método para preparar anticorpo anti-BLyS, que compreende incubar as células hospedeiras da invenção, e obter o anticorpo.

Descrição Detalhada da Invenção

[024] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos utilizados aqui têm o mesmo significado do que aqueles entendidos por aqueles versados na técnica. Com relação às definições e termos da técnica, os profissionais podem fazer referência aos Protocolos Atuais em Biologia Molecular (Ausubel) especificamente. A abreviação de resíduo de aminoácido é um código padrão de 3 letras e/ou 1 letra que designam um dos 20 comumente utilizados L- aminoácidos na técnica.

[025] Um objetivo da invenção é prover um anticorpo anti-BLyS,que pode se ligar ao estimulante do linfócito B e inibir sua ligação ao receptor BR3-Fc do mesmo.

[026] De modo a alcançar o objetivo da invenção, a presente invenção adota as seguintes soluções técnicas.

[027] Em tecnologia de engenharia genética, o RNA do sangue periférico humano é extraído, e o cDNA de BLyS humano é obtido ao reversamente se fazer a transcrição com o RNA do sangue periférico humano que está sendo utilizado como um padrão. Depois o segmento do gene de BlyS humano é obtido pela amplificação com o cDNA de BLyS humano sendo utilizado como um padrão respectivamente. E a proteína purificada de BLyS humano é obtida ao se colonizar o segmento do gene de BlyS humano em sistema de expressão eucariótica para transfectar as células hospedeiras, e depois expressá-las e purificá-las.

[028] A proteína purificada de BLyS humano é utilizada como an-tígeno para imunizar camundongos de modo a se obter 2000 linhas de diferentes células de hibridoma monoclonais, das quais um total de 211 linhas de clones que secretam anticorpos capazes de se ligar à proteína de BLyS é selecionado pela reação de marcação de enzima. Destas 211 linhas de células de hibridoma monoclonais, 5 linhas de células de hibridoma monoclonais que secretam anticorpos capazes de inibir o BLyS marcado por biotina da ligação ao receptor de BLyS em BJAB com habilidades diferentes são obtidas ao se testar a capacidade de ligação ao receptor de BLyS em células BJAB, que são nomeadas como 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8, respectivamente.

[029] ELISA é utilizado para identificar os sinais imunológicos dos anticorpos secretados pelas 5 linhas de célula de hibridoma monoclonais obtidas. Os resultados mostram que os anticorpos secretados pelas linhas de célula de hibridoma selecionadas pela presente invenção são todas contra BLyS especificamente, sem correspondência com outros antígenos da família TNF tais como TNF-α, TNF-β.

[030] Além disso, RNA da célula de hibridoma monoclonal individual é extraído, e reversamente transcrito para obter cDNA, que é então, utilizado como um padrão, para amplificar a sequência de DNA na região variável que corresponde a cada célula de hibridoma monoclonal. Após o sequenciamento, análise em série é conduzida nas sequências obtidas de acordo com www.expasy.ch, e análise por classificação Kabat é conduzida com base nas sequências de aminoácido derivadas, de modo a determinar as regiões FR e regiões CDR de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos secretados por cada célula de hibridoma monoclonal.

[031] Já que BLyS tem o efeito de estimular o crescimento de célula B e mantê-la viva, os anticorpos que inibem, especialmente neutralizam o efeito de BLyS, inibirão o crescimento de célula B. E a célula B é um tipo especial de célula para organismos produzirem anticorpos, de modo a ser difícil que a célula B produza anticorpo contra o seu crescimento (Thomas Schirrmann, e outros, Phage display for the generation of antibodies for proteome research, diagnostics and therapy, Molecules, 2011, 16, 412-426). Consequentemente, é relativamente difícil produzir anticorpo anti-BLyS por meio de imunização de camundongos. No entanto, a invenção obtem um anticorpo anti-BLyS por meio de imunização de camundongo, e mantém as vantagens de anticorpo de camundongo.

[032] Em um aspecto, a invenção se refere a um anticorpo anti-BLyS, onde as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 assim como a cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas a partir de um dos seguintes grupos ou das variantes funcionais dos mesmos.

[033] Em uma modalidade, o anticorpo anti-BLyS secretado por dita célula de hibridoma monoclonal 1D12, compreende cadeia leve de região variável de sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO. 31 e cadeia pesada de região variável de sequência de aminoáci- do mostrada pela SEQ ID NO. 32, e é nomeado como anticorpo monoclonal 1D12.

[034] Em uma modalidade, o anticorpo anti-BLyS secretado por dita célula de hibridoma monoclonal 2B10, compreende cadeia leve de região variável de sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO. 33 e cadeia pesada de região variável de sequência de aminoáci- do mostrada pela SEQ ID NO. 34, e é nomeado como anticorpo monoclonal 2B10.

[035] Em uma modalidade, o anticorpo anti-BLyS secretado por dita célula de hibridoma monoclonal 2G3, compreende cadeia leve de região variável de sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO. 35 e cadeia pesada de região variável de sequência de aminoáci- do mostrada pela SEQ ID NO. 36, e é nomeado como anticorpo monoclonal 2G3.

[036] Em uma modalidade, o anticorpo anti-BLyS secretado por dita célula de hibridoma monoclonal 5A5, compreende cadeia leve de região variável de sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO. 37 e cadeia pesada de região variável mostrada pela SEQ ID NO. 38, e é nomeado como anticorpo monoclonal 5A5.

[037] Em outra modalidade, o anticorpo anti-BLyS secretado por dita célula de hibridoma monoclonal 13G8, compreende cadeia leve de região variável de sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO. 39 e cadeia pesada de região variável de sequência de aminoáci- do mostrada pela SEQ ID NO. 40, é nomeado como anticorpo monoclonal 13G8.

[038] Obviamente, sem essencialmente afetar a atividade do anticorpo, o indivíduo versado na técnica pode substituir, adicionar e/ou de- letar um ou mais (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais) aminoácidos nas sequências de aminoácido da invenção, de modo a obter sequência de aminoácido com função equivalente, isto é, a variante funcional de dita sequência de aminoácido. Todas essas estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, os aminoácidos na região veriável podem ser substituídos com aqueles tendo naturezas similares.

[039] A variante funcional da sequência de aminoácido da invenção pode fazer parte de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do consenso com a sequência fonte da mesma. O consenso da sequência da invenção pode ser medido por software de análise de sequência. Por exemplo, programas de computador BLAST com parâmetros padrão, especialmente BLASTP ou TBLASTN, podem ser utilizados.

[040] Para reduzir mais a imunogenicidade, o anticorpo preparado de camundongo pode ser humanizado para se obter anticorpo antiBLyS humanizado. O método para preparação de anticorpo humanizado é bem conhecido àquele versado na técnica. Por exemplo, o anticorpo anti-BLyS humanizado da invenção pode ser preparado pela transferência de sequência CDR da invenção para região variável de anticorpo humano. O anticorpo humanizado não resultará em resposta de anti-anticorpo (AAR) e resposta de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA), e não será neutralizado pelo anti-anticorpo e rapidamente removido, desse modo tendo função imune, tal como ação ADCC e CDC.

[041] Em uma modalidade, a sequência de aminoácido de cadeia leve da região variável e sequência de aminoácido de cadeia pesada da região variável de anticorpo anti-BLyS humanizado da invenção são selecionadas a partir de um dos seguintes grupos: I: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 41 e SEQ ID NO. 42 ou as variantes funcionais das mesmas; II: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 43 e SEQ ID NO. 44 ou as variantes funcionais das mesmas; III: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 45 e SEQ ID NO. 46 ou as variantes funcionais das mesmas; e IV: sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 47 e SEQ ID NO. 48 ou as variantes funcionais das mesmas.

[042] O anticorpo anti-BLyS humanizado da invenção não é so mente capaz de se ligar ao estimulante do linfócito B de modo a inibir sua ligação ao receptor BR3-Fc do mesmo, mas também tem baixa afinidade ao fator MHC II, assim minimizando a resposta imune enquanto se mantém a afinidade.

[043] Em outras modalidades preferidas, o anticorpo anti-BLyS da invenção também compreende cadeia leve humana da região cons- tante e cadeia pesada da região constante, e a cadeia leve da região variável e cadeia pesada da região variável respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BLyS humanizado compreende cadeia leve completa e cadeia pesada completa, onde a cadeia leve completa é formada ao se conectar a cadeia leve de região variável contida no anticorpo anti-BLyS à cadeia leve de região constante humana, e a cadeia pesada completa é formada ao se conectar a cadeia pesada de região variável contida no anticorpo anti-BLyS à cadeia leve humana da região constante.

[044] Preferivelmente, a cadeia leve humana da região constant é a cadeia leve humana da região constante k.

[045] Preferivelmente, a cadeia pesada da região constante é o fragmento Fc da cadeia pesada humana.

[046] Em uma modalidade, ambas cadeia leve da região constan te k e cadeia pesada do fragmento Fc são derivados de linfócito B humano saudável. Em tecnologia da engenharia genética, a região variável e a região constante são conectadas pelo PCR de extensão sobreposta para obter cadeia leve completa e cadeia pesada de anticorpo anti-BLyS humanizado.

[047] A invenção também provê moléculas de DNA para codificar o anticorpo anti-BLyS ou anticorpo anti-BLyS humanizado da invenção. Devido à degeneração do códon, podem haver muitas moléculas de DNA que podem codificar o anticorpo da invenção.

[048] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia leve da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 31, a sequência de nu- cleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 49.

[049] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia pesada da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 32, a sequência de nucleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 50.

[050] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia leve da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 33, a sequência de nu- cleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 51.

[051] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia pesada da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 34, a sequência de nucleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 52.

[052] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia leve da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 35, a sequência de nu- cleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 53.

[053] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia pesada da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 36, a sequência de nucleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 54.

[054] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia leve da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 37, a sequência de nu- cleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 55.

[055] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia pesada da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 38, a sequência de nucleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 56.

[056] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia leve da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 39, a sequência de nu- cleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 57.

[057] Em uma modalidade, a invenção provê molécula de DNA para codificar a cadeia pesada da região variável que tem sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO. 40, a sequência de nucleotídeo da qual é mostrada como SEQ ID NO. 58.

[058] O termo "anticorpo anti-BLyS" utilizado aqui compreende qualquer anticorpo ou imunoglobulina de fenógeno, ou fragmento de ligação ao antígeno que retém a capacidade de ligação específica ao antígeno, incluindo mas não limitado a Fv, scFv (sc significa cadeia única), Fab, F(ab')2, Fab', fragmento scFv-Fc, diacorpo, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia única, e proteína de fusão que compreende parte de ligação ao antígeno do anticorpo e da proteína não- anticorpo. O anticorpo pode ser marcado e detectado, por exemplo, pelo isótopo radioativo, enzima a qual pode produzir substância detec- tável, proteína fluorescente, biotina, etc. O anticorpo também pode se ligar ao veículo de fase sólida, incluindo mas não limitado à placa ou esfera de poliestireno, etc.

[059] Além disso, a molécula de DNA para codificar o anticorpo anti-BLyS da invenção pode ser clonada no vetor pelo indivíduo versado na técnica, de modo a transformar as células hospedeiras. Consequentemente, a invenção também provê um vetor de DNA recombi- nante, que compreende molécula de DNA para codificar o anticorpo anti-BLyS da invenção.

[060] Preferivelmente, o vetor de DNA recombinante é um vetor de expressão, no qual a molécula de DNA de dito anticorpo é clonada pelo indivíduo versado na técnica, de modo a transformar a célula hospedeira e obter anticorpo de cadeia única ao induzir a expressão.

[061] Em uma modalidade, o vetor de DNA recombinante da in venção compreende molécula de DNA para codificar o anticorpo antiBLyS humanizado da invenção. A molécula de DNA do anticorpo antiBLyS humanizado codificado pode ser recombinada para construir vetor para transcrição mamífera e expressão. O vetor de expressão da invenção compreende a sequência de DNA da região variável e região constante da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-BlyS monoclonal humano codificado. No entanto, dois vetores de expressão podem ser construídos respectivamente, um compreendendo cadeia pesada de região variável e região constante, e o outro compreendendo cadeia leve de região variável e região constante, para transfectar os mamíferos juntos.

[062] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão tam bém compreende um promotor e uma sequência de DNA para codificar peptídeos sinal secretores, e pelo menos um gene resistente ao medicamento para rastreamento. O método utilizado compreende tecnologia de síntese de DNA e tecnologia recombinante in vitro.

[063] A invenção também provê uma célula hospedeira, compre endendo o vetor de DNA recombinante da invenção. A célula hospedeira da invenção pode ser célula hospedeira procariótica, célula hospedeira eucariótica ou bacteriófago.

[064] En particular, a célula hospedeira procariótica pode ser Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces ou Proteus mirabilis. A célula hospedeira eucariótica pode ser fungo tal como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, Trichoderma, etc.; célula de insetos tal como lagarta militar; célula de plantas tal como tabaco, etc.; e célula de mamífero tal como célula BHK, célula CHO, célula COS, célula de mieloma, etc.

[065] Em alguma modalidade, a célula hospedeira da invenção é preferivelmente célula de mamífero, mais preferivelmente célula BHK, célula CHO, célula NSO ou célula COS.

[066] A atividade neutralizadora imune de dito anticorpo anti BLyS humanizado da invenção é testada por experimentos citológicos in vitro. O resultado mostra que o anticorpo anti-BLyS humanizado da invenção pode inibir a proliferação de célula B em graus diferentes.Consequentemente, a invenção provê um método para prevenir e/ou tratar doenças causadas pela proliferação extra de célula B, que compreende a aplicação de uma dosagem eficaz de anticorpo anti-BLyS de qualquer uma das reivindicações 1 a 7. A invenção também provê o uso de dito anticorpo anti-BLyS ou anticorpo anti-BLyS humanizado na preparação de medicamentos para prevenir e/ou tratar doenças causadas pela proliferação extra de célula B. As doenças causadas pela proliferação extra de célula B incluem, mas não estão limitadas a, SLE, artrite reumatoide, artrite anquilosante ou câncer do tipo linfoma da célula B.

[067] A invenção também provê uma composição farmacêutica,que compreende uma dosagem eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-BLyS ou anticorpos anti-BLyS humanizados da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser preparada ao se misturar qualquer um dos anticorpos anti-BLyS ou anticorpos anti-BLyS humanizados da invenção e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis pelo método convencional, e pode ser preparada como preparação farmacêutica. O "veículo farmaceutica- mente aceitável” significa um ou mais veículos orgânicos ou inorgânicos, naturais ou sintéticos que são bem conhecidos ao indivíduo versado na técnica, o qual pode promover a estabilidade e aplicação clínica de um anticorpo pela combinação com o anticorpo. Veículos apropriados compreendem solução fisiológica estéril e solução e suspensão estéreis iso-osmóticas anidra ou aquosa conhecida do versado na técnica. A dosagem eficaz e método de administração da invenção dependem de muitos fatores, incluindo idade, peso, sexo, condição de saúde natural e situação nutricional do paciente, intensidade de atividade do composto, tempo de administração, taxa metabólica, gravidade da doença e julgamento subjetivo dos médicos. De acordo com os fatores acima, a dosagem eficaz e método de administração podem ser facilmente decididos por aqueles versados na técnica.

[068] A composição farmacêutica da invenção pode ser prepara da usando veículos apropriados, excipientes e outros reagentes, que podem melhorar a transferência, liberação, tolerância, etc. A formulação utilizada pode compreender, por exemplo, comprimido, pó, pasta, unguento, gel, cera, óleo, lipídeo, vesícula contendo lipídeo, conjugado de DNA, etc. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada por qualquer forma apropriada, por exemplo, oral, nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Breve Descrição dos Desenhos

[069] Figura 1 mostra a detecção da imagem de SDS-PAGE do exemplo 1, em que o filamento A é a proteína expressa pelo plasmí- deo recombinante da invenção, o filamento B é o plasmídeo recombi- nante com vetor vazio, filamento C é um marcador de peso molecular da proteína;

[070] Figura 2 mostra o gráfico de citometria de fluxo sobre a combinação de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina em diferentes concentrações e células BJAB do exemplo 2, em que a linha escura é o grupo de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina em 200ng/mL, a linha vermelha é o grupo de proteína re- combinante his-hBLyS marcada com biotina em 100ng/mL, a linha azul é o grupo da proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina em 50ng/mL, a linha roxa é o grupo de proteína recombinante his- hBLyS marcada com biotina em 25ng/mL, a linha verde é o grupo sem proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina e e que somente contém SA-APC;

[071] Figura 3 mostra o gráfico de citometria de fluxo sobre a combinação de soro de camundongos imunizados e células BJAB do exemplo 3;

[072] Figura 4 mostra o gráfico de citometria de fluxo sobre a combinação de anticorpo secretado por célula de hibridoma monoclonal e receptor BLyS em célula BJAB do exemplo 4, onde a linha escura é o grupo de controle de IgG negativo, a linha vermelha é o grupo sem proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina e que somente contém SA-APC, a linha roxa é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 3H9, a linha azul é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 13G8;

[073] Figura 5 mostra o gráfico de citometria de fluxo sobre a combinação de anticorpo secretado pela célula de hibridoma e receptor BLyS em célula BJAB do exemplo 4, onde a linha escura é o grupo de controle de IgG negativo, a linha vermelha é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 1D12, a linha roxa é a célula de hibridoma monoclonal 2B10, a linha azul é a célula de hibridoma monoclonal 2G3;

[074] Figura 6 mostra o gráfico de citometria de fluxo sobre a combinação de anticorpo secretado pela célula de hibridoma monoclonal e receptor BLyS em célula BJAB do exemplo 4, onde a linha escura é o grupo de controle de IgG negativo, a linha vermelha é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 5A5, a linha roxa é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 1D7, a linha azul é o grupo de célula de hibridoma monoclonal 4D3;

[075] Figura 7 mostra o resultado do ensaio imunoabsorvente ligado à enzima de anticorpos secretados pela célula de hibridoma monoclonal 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8 do exemplo 4, e proteína recombinante his-hBLyS e proteína da família do fator de necrose tumoral (TNF);

[076] Figura 8 mostra o resultado da inibição da proliferação in vitro de célula B pelo anticorpo anti-BLyS humanizado do exemplo 9, onde o eixo horizontal representa a concentração de anticorpo antiBLyS humanizado, e o eixo vertical representa o valor da fluorescência.

[077] Figura 9 mostra o efeito de inibição da molécula de anticorpo candidata em hiperplasia do linfonodo induzida por BLyS.

[078] Figura 10 mostra o efeito de inibição da molécula de anti corpo candidata no crescimento de soro IgA induzido por BLyS.

Modalidades Específicas

[079] As modalidades da invenção revelam o anticorpo anti-BLyS e o uso do mesmo. O indivíduo versado na técnica pode executá-lo fazendo referência a este conteúdo e melhorando o parâmetro do processo de forma apropriada. Especificamente, toda a substituição similar e a modificação são óbvias ao versado na técnica, e estão dentro do escopo da invenção. O produto da invenção é descrito por exemplos preferidos, e aqueles versados na técnica podem modificar e combinar de forma apropriada de acordo com o método descrito aqui sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção, de modo a executar e aplicar a tecnologia da invenção.

[080] Para favorecer o entendimento da invenção, descrições detalhadas da invenção são providas abaixo em combinação com exemplos.

Exemplo 1: Clonagem e expressão do gene BLyS humano

[081] O sangue periférico humano saudável foi isolado, e o RNA total foi extraído e purificado com estojo comercial para RNA (Qiagen Company). A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada pela transcrição reversa com RNA total purificado sendo utilizado como padrão. O sistema de reação de cDNA ocorreu como abaixo:

[082] Água destilada esterilizada foi adicionada ao sistema até um volume total de 20 μL.

[083] Condições de reação eram: 30°C em 10 min, 42°C em 30 min, 99°C em 5 min, 4°C em 5 min. O sistema foi colocado em um banho de gelo por 5 minutos após a reação ter completado.

[084] Sobre o fundamento de sequência de DNA de comprimento total de BLyS humano, os primers P1 e P2 de BLyS clonados e secretados foram projetados e sintetizados. A amplificação por PCR foi realizada usando primer a montante P1 e primer a jusante P2 com o cDNA sintetizado por transcrição reversa sendo utilizado como padrão. As sequências de nucleotídeo de P1 e P2 são como abaixo: P1: 5’tacgaagctt gcatcatcat catcatcatg gcggcggctc cggcggcggc tccccgttca gggtccagaa gaa; P2: 5’cgacgtcgac tcacagcagt ttcaatgcac caaaaaatgt gacatc.

[085] O sistema de reação de amplificação por PCR foi:

[086] Água destilada esterilizada foi adicionada ao sistema em um volume total de 50 μL.

[087] Procedimento de reação por PCR ocorreu como a seguir:

[088] O produto da amplificação por PCR foi recuperado por eletro forese em gel, enzima dupla digerida com Sal I e Hind III, e clonada no sistema de plasmídeo de expressão eucariótica pCDNA3.1 Ao usar o plasmídeo transformado com vetor vazio como controle, 3 dias após transfectar células 293T (Centro Chinês para Coleção de tipo de Cultura), o sobrenadante do meio de cultura foi coletado, e purificado por croma- togtrafia de afinidade His para obter proteína purificada his-hBLyS. Foi testado por SDS-PAGE. O resultado foi mostrado na figura 1.

[089] Pode ser visto a partir do resultado na figura 1 que, proteínas foram expressas pelo plasmídeo recombinante da invenção, enquanto nenhuma faixa clara de expressão de proteína era encontrada para o plasmídeo recombinante do vetor vazio. A proteína do plasmí- deo recombinante da invenção era de cerca de 23Kb, próximo ao peso molecular de 23Kb deduzido de acordo com a sequência de aminoáci- do de BLyS humano.

Exemplo 2: Testar a capacidade de ligação ao receptor em célula BJAB.

[090] Marcar a proteína recombinante His-hBLyS com biotina.

[091] Proteína recombinante purificada His-hBLyS obtida a partir do exemplo 1 foi misturada com biotina-xx-NHS dissolvida em DMSO, em uma razão de peso-a-volume de 1:4 in ng/mL, e colocada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi cromatografada através de uma coluna de gel para isolar o his-hBLyS marcado com biotina e o livre de biotina.

[092] Ligar a proteína recombinante his-hBLyS marcada com bio tina à célula BJAB.

[093] As proteínas recombinantes isoladas his-hBLyS marcadas com biotina foram divididas em quatro grupos que têm concentrações diferentes de 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL e 200 ng/mL, misturadas com 1x106 de células humanas de linforma de Burkitt (BJAB) respecti- vamente, incubadas a 4°C por 15 minutos, lavadas com PBS por 3 vezes, juntadas com estreptavidina-aloficocianina (SA-APC) para alcançar uma concentração final de 0.2 μg/mL, e incubadas a 4°C por 20 minutos. Após a lavagem com PBS por 3 vezes, foi testada pelo citô- metro de fluxo. O resultado foi mostrado na figura 2.

[094] Pode ser visto a partir do resultado da figura 2 que, a prote ína recombinante humana BLyS marcada com biotina pode se ligar a célula BJAB em diferentes concentrações.

Exemplo 3: Camundongo de imunização.

[095] A proteína recombinante his-hBLyS obtida a partir do exemplo 1 foi utilizada como antígeno para se misturar com a mesma quantidade de adjuvante imunológico (adjuvante de Freund). 4 camundongos fêmea FVB de 6 semanas foram testados, 3 dos quais foram imunizados, e o outro foi utilizado para experimento de controle. Após a primeira imunização, uma imunização de reforço foi dada uma vez por semana. Antes da última imunização de reforço, sangue foi retirado da veia da cauda do camundongo imunizado. O soro foi misturado com proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina (com uma concentração de 50 ng/mL) e incubado em temperatura ambiente por 20 minutos. Depois, a mistura foi incubada com célula BJAB a 4°C por 15 minutos, lavada com solução fisiológica normal por 3 vezes, juntada com 0.2 μg/mL de estreptavidina-aloficocianina e incubada a 4°C por 15 minutos. Após a lavagem com solução fisiológica normal por 3 vezes, a amostra foi testada no citômetro de fluxo para testar se o soro do camundongo imunizado pode inibir BLyS de se ligar ao seu receptor BR3-Fc. O resultado foi mostrado na figura 3.

[096] Pode ser visto a partir do resultado da figura 3 que, o soro obtido do camundongo 1 dos três camundongos imunizados pode efetivamente inibir a ligação de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina à célula BJAB. Então, camundongo 1 foi selecionado como um acompanhamento experimental individual para conduzir os outros experimentos de fusão.

Exemplo 4: Fusão de célula e rastreamento de célula de hibrido- ma monoclonal.

[097] Após a última imunização, o linfonodo na base da coxa do camundongo foi colhido, e colocado em solução fisiológica normal. A suspensão rica em célula B foi tomada e fundida com célula de mielo- ma SP2/0 por eletroporação com método de rotina. As células fundidas foram distribuídas em placa de 96 poços, e incubadas em meio completo RPMI-1640 que contém HAT sob a condição de CO2 a 5% a 37°C. No método de enzima marcada, 211 clones que secretaram os anticorpos capazes de se ligar à proteína BLyS foram rastreados em diferentes células de hibridoma monoclonais.

[098] Os anticorpos produzidos pelos 211 clones os quais podem se ligar à proteína BLyS foram misturados com proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina respectivamente e incubados em temperatura ambiente por 20 minutos. Depois, a mistura foi incubada com células BJAB a 4°C por 15 minutos, lavada com solução fisiológica normal por 3 vezes, juntada com 0.2 μg/mL de estreptavidina-alofico- cianina e incubada a 4°C por 15 minutos. Após a lavagem com solução fisiológica normal por 3 vezes, a amostra foi testada em um citômetro de fluxo para rastrear as células de hibridoma monoclonais que podem inibir a ligação de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina às células BJAB. Como resultado, os anticorpos secretados pelas 11 células de hibridoma monoclonais podem inibir a ligação de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina ao receptor BLyS em BJAB em graus diferentes, como mostrado na tabela 1. A capacidade de inibição de anticorpos secretados por células de hibridoma monoclo- nais nomeadas como 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8 era mais forte do que a de anticorpos secretados por células de hibridoma monoclonais nomeadas como 3H9, 1D7 e 4D3. Os resultados do teste de 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8 foram mostrados nas figuras 4 a 6.Tabela 1. Subtipos de anticorpos secretados por células que inibem a ligação de proteína recombinante his-hBLyS marcada com biotina ao receptor BLyS em BJAB.

Exemplo 5: Teste da ligação à outra proteína de família de necrose tumoral (TNF).

[099] Para testar mais a especificidade da ligação dos anticorpos candidatos, 1 μg/mL de proteína recombinante his-hBLyS, factor-α de necrose tumoral (TNF-α), factor-β de necrose tumoral (TNF-β), e BSA foram introduzidos à placa ELISA de 96 poços, e mantidos durante a noite a 4°C em um tampão de revestimento de carbonato de 0.05 M com Ph 9.0. No dia seguinte, a solução nos poços foi abandonada, e os poços foram lavados com solução tampão para lavagem por 3 vezes. Depois, a solução de PBS contendo BSA a 3% BSA foi adicionada e vedada por 20 minutos. Após a lavagem com solução tampão para lavagem por 3 vezes, 100 μL de anticorpos diluídos secretados por células de hibridoma monoclonais 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8 foram adicionados, incubados por 1 hora em temperatura ambiente e lavados com solução tampão para lavagem por 3 vezes. Anticorpo an- ti-camundongo de cabra foi reticulado com Peroxidase de rábano silvestre (HRP) diluído com solução tampão para lavagem 1:10000 vezes, e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem com solução tampão para lavagem por 3 vezes, 50 μL de solução de substrato de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados para desenvolvimento da cor, e reagiram em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois, a reação foi finalizada com solução de 25 μL de ácido sulfúrico. Absorvência a 450 nm foi medida. O resultado estatístico foi mostrado na figura 7.

[0100] Pode ser visto da figura 7 que, anticorpos secretados por células de hibridoma monoclonais 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8 todos se reconhecem e se ligam a BLyS, mas nenhum deles reconhece TNF-α ou TNF-β.

Exemplo 6: Determinação da sequência da região variável de anticorpo secretado pela célula de hibridoma monoclonal

[0101] As células de hibridoma monoclonais 1D12, 2B10, 2G3,5A5 e 13G8 obtidas pelo rastreamento foram incubadas. Células foram coletadas por centrifugação a 1000 rpm. A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada pela transcrição inversa do RNA da célula de hibridoma individual extraída de acordo com o método do exemplo 1. A sequência de DNA da região variável que corresponde às células de hibrido- ma com a primeira cadeia sintetizada de cDNA sendo utilizada como um padrão. As sequências de primer usadas na reação de amplificação eram como a seguir:

[0102] Os primers necessários para amplificação de cadeia pesa da eram como a seguir: primer 1: 5’atg g(ag)a tg(cg) agctg(tg) gt(ca) at(cg) ctc tt; primer 2: 5’ggg gatatc cacc atg (ag)ac ttc ggg (tc) tg agc t(tg ) g gtt tt; and primer 3: 5’ggg tatatc cacc atg gct gtc ttg gggctg ctcttct.

[0103] Os primers necessários para amplificação de cadeia leve eram como a seguir:primer 1: 5’ atg gag aca gac aca ctcctgctat; primer 2: 5’atg gattttcaa gtg cag a tt tic ag; primer 3: 5’atg gag (ta)ca ca(gt)(ta)ct cag gtc ttt (ga)t a; and primer 4: 5’atg (gt)cc coat) (ga) ct cag (ct)t(ct) ct(tg)gt.

[0104] O sistema de reação de amplificação era:

[0105] Água esterilizada destilada foi adicionada ao sistema para alcançar um volume total de 50 μL.

[0106] Procedimento de reação em PCR ocorreu:

[0107] O produto de amplificação por PCR foi recuperado por ele- troforese em gel e enviado a uma empresa biológica para sequenci- amento. Análise serial foi conduzida nas sequêncuias obtidas de acordo com www.expasy.ch. As sequências de aminoácido de cadeia leve de região variável e cadeia pesada de região variável foram mostradas na tabela 2. A análise de classificação Kabat foi conduzida com base nas sequências de aminoácido derivadas para determinar a região FR e a região CDR de cadeia leve e cadeia pesada de célu- las de hibridoma individuais 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 e 13G8. As sequências de aminoácido da cadeia leve de região variável e as sequências de aminoácido de cadeia pesada de região variável de células de hibridoma individuais 1D12, 2B10, 2G3, 5A5 and 13G8 foram mostradas na tabela 2:Tabela 2. Sequências de aminoácido de cadeia leve de região variável e cadeia pesada de região variável de anticorpo anti-BLyS.

Exemplo 7: A humanização do anticorpo anti-BLyS

[0108] A transformação humanizada foi realizada nas sequências de região variável de anticorpos secretados pelas células de hibridoma individuais.

[0109] O procedimento da transformação humanizada envolvido principalmento nas etapas-chave a seguir.

[0110] As sequências de gene dos anticorpos secretados pelas células de hibridoma individuais foram comparadas com as sequências de gene de anticorpo do sistema embrionário humano para encontrar as sequências que tem maior homologia.

[0111] A afinidade com HLA-DR foi testada pela análise com silício para selecionar a sequência estrutural do sistema embrionário humano que tem a menor afinidade.

[0112] As sequências de aminoácido estruturais de região variável e periferia da mesma foram analisadas pela aplicação de acoplamento molecular utilizando uma tecnologia de computador para investigar a forma de combinação esteroscópica. Ao se calcular a força eletrostá- tica, força van der waals, propriedades hidrofóbicas e hidrofílicas e o valor de entropia, os aminoácidos individuais principais na sequência do gene do anticorpo secretado pelas células de hibridoma individuais que podem interagir com BLyS e manter a estrutura espacial foram analisados e enxertados de volta à estrutura do gene selecionado do sistema embrionário humano. Com base nisso, 4 diferentes anticorpos anti-BLyS humanizados foram obtidos. As sequências de cadeia leve de cadeia variável e cadeia pesada de região variável destas foram mostradas na tabela 3.Tabela 3. Sequências de cadeia leve de região variável e cadeia pesada de região variável de anticorpo anti-BLyS humanizado.

Exemplo 8: A construção do vetor de expressão de anticorpo antiBLyS humanizado.

[0113] O fragmento Fc de cadeia pesada da região variável foi amplificado a partir de células de sangue humano ao usar primer a montante VH5 e primer a jusante VH3. A região constante k de cadeia leve foi amplificada a partir de células de sangue humano ao usar primer a montante VL5 e primer a jusante VL3. Sítios de endonuclease Xho I e Age I foram introduzidos em cadeia pesada. Sítios de endonuclease Sma I e Dra III foram introduzidos em fragmento de cadeia leve. O plasmídeo pCDNA 3.1 foi incorporado, e o clone correto foi confirmado por sequenciamento. Materiais experimentais sequenciais foram todos obtidos por extração a partir das células que foram transfectadas por esta série de plasmídeo. As sequências de nucleotídeo de VH5, VH3, VL5 e VL3 eram como a seguir: VH5: 5’gcggaattc(c/g)aggtg(a/c)agct(g/t)ca(c/g)(c/g) a(a/g)tc (a/t)gg; VH3: 5’accgccggat ccaccaccgc ccg agccacc gccacctgcg gagacgatga cc(a/g)tgg tccc; VL5: 5’ggtggtggatccggcggtgg cggttccgacattgtgatgacccagt ctcca; VL3: 5’ggatacagttggtgcagcctcgagctacc gttt.

[0114] Quatro anticorpos humanizados foram obtidos, os quais foram nomeados como BLyS-I, BLyS-II, BLyS-III e BLyS-IV respectivamente.

Exemplo 9: Anticorpos anti-BLyS humanizados inibem a proliferação de célula B in vitro.

[0115] Células B foram extraídas pelas esferas magnéticas CD19 marcadas MACS do sangue humano periférico, e foram subcultivadas em placa de 96 poços em 100.000 por placa e incubadas. BLyS re- combinante (10 ng/mL) e fragmento Fab de IgM de cabra anti-humano (4 μg/mL) foram introduzidos em meio completo para estimular o crescimento de célula B. Os anticorpos anti-BLyS humanizados diferentes que tem concentrações diferentes obtidas a partir do exemplo 8 foram introduzidos ao meio e incubados por 6 dias. Desde então, a célula B foi contada por Celltiter Glo da Promega Company. O valor (RLU) foi contado por fluorescência. O resultado foi mostrado na figura 13.

[0116] Pode ser visto da figura 8 que, quatro anticorpos anti-BLyS humanizados BLyS-I, BLyS-II, BLyS-III e BLyS-IV preparados no exemplo 8 podem inibir o crescimento de célula B em graus diferentes.

[0117] Os exemplos acima são utilizados somente para ajudar a entender o método da invenção e o conceito da mesma. Para o indivíduo normal versado na técnica, muitas revisões e modificações podem ser feitas na invenção, as quais ainda caem dentro do escopo da invenção, sem se afastar do princípio da invenção.

Exemplo 10: Estudo da farmacodinâmica de anticorpo anti-BLyS humanizado in vivo. 1) Determinar a dosagem de BLyS para estimular a proliferação de célula B.

[0118] BLyS recombinante com concentrações diferentes foi inje tado na veia da cauda de camundongos. O peso corporal (em gramas), peso do baço (mg), e peso do linfonodo (mg) do camundongo foram medidos após uma semana. Os resultados foram mostrados na tabela 4.Tabela 4

[0119] Os resultados mostraram que BLyS auto-produzido de 0.3 mg/Kg pode efetivamente estimular o crescimento de célula B in vivo. O peso de linfonodo pode ser utilizado como o principal indicador de avaliação farmacodinâmica para avaliar a proliferação de célula estimulada por BLyS. Isto se deu principalmente devido ao fato de que 50% dos linfonodos eram células B, e a proporção de célula B se tornou maior após ser estimulada por BLyS.

2) Estudo In vivo do efeito de inibição do anticorpo antiBLyS em BlyS

[0120] Com base nisso, o BLyS de 0.3 mg/kg foi misturado com camundongos 1D12, 2B10, 2G3 e 5A5 e BLyS-I humano (13G8) de 0.05 mg/kg. Depois, seu peso de linfonodo e conteúdo de IgA no soro foram medidos (veja figura 9 e figura 10).

[0121] O resultado mostrou: camundongos 1D12, 2B10, 2G3 e 5A5 e BlyS-I humano (13G8) podem efetivamente inibir o efeito de BLyS.

Claims (11)

1. Anticorpo anti-BLyS, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido das cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3, e as sequências de aminoácido das cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 são SEQ ID Nos: 25, 26, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

2. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido da cadeia leve de região variável e as sequências de aminoácido da cadeia pesada de região variável do anticorpo anti-BLyS são sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40.

3. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser humanizado.

4. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido da cadeia leve de região variável e as sequências de ami- noácido da cadeia pesada de região variável do anticorpo anti-BLyS são sequências de aminoácido como mostradas pela SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48.

5. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma cadeia leve humana de região constante e uma cadeia pesada humana de região constante, e a cadeia leve de região variável e a cadeia pesada de região variável se conectam à cadeia leve humana de região constante e a cadeia pesada humana de região constante, respectivamente.

6. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve humana de região constante é uma cadeia leve humana de região constante k.

7. Anticorpo anti-BLyS, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada humana de região constante é uma cadeia pesada humana de fragmento Fc.

8. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo anti-BLyS como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a molécula de DNA apresenta uma sequência de nucleotídeo selecionada de SEQ ID NO: 57 e 58.

9. Vetor de DNA recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de DNA, como definida na reivindicação 8.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma dose eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Método para preparar um anticorpo anti-BLyS, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula hospedeira com o vetor, como definido na rei-vindicação 9, para obtenção do anticorpo.

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