BR112014011028B1

BR112014011028B1 - anticorpo biespecífico, composição, e, uso da composição

Info

Publication number: BR112014011028B1
Application number: BR112014011028-0A
Authority: BR
Inventors: Antonio Digiandomenico; Paul Warrener; Charles Stover; Bret Sellman; Ralph Minter; SAndrine Guillard; Steven Rust; Mladen Tomich; Vignesh Venkatraman; Reena Varkey; Li Peng; Melissa Damschroder; Partha Chowdhury; Nazzareno DIMASI; Ryan Fleming; Binyam Bezabeh; Changshou Gao; Cuihua GAO; Godfrey RAINEY
Original assignee: Medimmune, Llc; Medimmune Limited
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2021-03-02
Also published as: RU2014122990A; NZ722379A; CN104136042B; SI2776065T1; WO2013070615A8; EP2776065A4; MX2014005566A; US11203633B2; HUE050985T2; PT2776065T; AU2012336028A1; KR20140091736A; CA2854817A1; BR112014011028A2; AU2017219081B9; US20150023966A1; AU2017219081A1; ES2859323T3; HRP20201370T1; EP2776065A1

Abstract

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ISOLADA OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DA MESMA, ANTICORPO BIESPECÍFICO, MOLÉCULA DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLA-DA, COMPOSIÇÃO, USO DA COMPOSIÇÃO, E, KIT Trata-se de terapias de combinação que compreendem moléculas de ligação de Ps1 e PcrV anti-Pseudomonas e composições relacionadas para o uso na prevenção e no trata-mento de infecção por Pseudomonas.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[0001] O teor da listagem de sequência submetida eletronicamente em arquivo de texto ASCII intitulado sequencelisting_PCTascii.txt criado em 6 de novembro de 2012 e que tem um tamanho de 382 kilobytes depositado com o pedido é incorporado no presente documento na íntegra, a título de referência.

ANTECEDENTES CAMPO DA REVELAÇÃO

[0002] Esta descrição refere-se a terapias de combinação que usam anti-Psl de Pseudomonas e domínio de ligação de PcrVs para uso na presente e tratamento de infecção de Pseudomonas. Ademais, a revelação fornece composições úteis em tais terapias.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[0003] A Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é um patógeno oportunista gram-negativo que causa ambas infecções agudas e crônicas em indivíduos (Ma et al., Journal de Bacteriology 189(22):8353 a 8356 (2007)). Isso se deve parcialmente à alta resistência inata da bactéria aos antiobióticos clinicamente usados e parcialmente devido à formação de biofilmes altamente resistentes a antibiótico (Drenkard E., Microbes Infect 5:1213 a 1219 (2003); Hancokc & Speert, Drug Resist Update 3:247 a 255 (2000)).

[0004]P. aeruginosa é uma causa comum de infecções adquiridas em hospital no Mundo Ocidental. A mesma é um agente causador frequente de bacteremia em vítimas de queimadura e indivíduos imunodeficientes (Lyczak et al., Microbes Infect 2:1051 a 1060 (2000)). Também é a causa mais comum de pneumonia gram-negativa nosocomial (Craven et al., Semin Respir Infect 77:32 a 53 (1996)), especificamente em pacientes ventilados de maneira mecânica e é o patógeno com mais relevância nos pulmões de indivíduos com fibrose cística (Pier et al., ASM News <5:339 a 347 (1998)).

[0005] O exopolisacarídeo de Psi de Pseudomonas é reportado como sendo ancorado à superfície de P. aeruginosa e pensa-se ser importante na facilitação de colonização dos tecidos do hospedeiro e no estabelecimento/manutenção de formação de biofilme (Jackson, K.D., et al., J Bacteriol 186, 4466 a 4475 (2004)). Sua estrutura compreende pentassacarídeo de repetição rico em manose (Byrd, M.S., et al., Mol Microbiol 73, 622 a 638 (2009)).

[0006] PcrV é um componente relativamente conservado do sistema de secreção de tipo III. PcrV parece ser um componente integral do aparelho de translocação do sistema de secreção de tipo III que media a aplicação das toxinas secretórias tipo III no interior das células eucarióticas alvo (Sawa T., et al. Nat. Med. 5, 392 a 398 (1999)). A imunização ativa e passiva contra lesão pulmonar aguda aprimorada com PcrV e a mortalidade de camundongos infectados com P. aeruginosa citotóxica (Sawa et al. 2009). O efeito principal da imunização contra PcrV foi devido ao bloqueio de translocação das toxinas secretórias tipo III no interior das células eucarióticas.

[0007] Devido à crescente resistência a múltiplas drogas, permanece uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de estratégias inovadoras para a identificação de novos profiláticos específicos de Pseudomonas e agentes terapêuticos.

BREVE RESUMO

[0008] A revelação fornece uma molécula de ligação ou um fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas, que compreende: (A) um CDR1 de cadeia pesada que compreende SYAMN (SEQ ID NO:218) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; um CDR2 de cadeia pesada que compreende AITISGITAYYTDSVKG (SEQ ID NO: 219) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; e um CDR3 de cadeia pesada que compreende EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; (b) um CDR1 de cadeia leve que compreende RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; um CDR2 de cadeia leve que compreende SASTLQS (SEQ ID NO: 222) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; e um CDR3 de cadeia leve que compreende LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; ou combinações de (A) e (b). Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento de ligação de antígeno disso se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e compreende: (A) um CDR1 de cadeia pesada que compreende SYAMN (SEQ ID NO: 218), um CDR2 de cadeia pesada que compreende AITISGITAYYTDSVKG (SEQ ID NO: 219) e um CDR3 de cadeia pesada que compreende EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220); e (b) um CDR1 de cadeia leve que compreende RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221), um CDR2 de cadeia leve que compreende SASTLQS (SEQ ID NO: 222) e um CDR3 de cadeia leve que compreende LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223). Em uma modalidade, a molécula de ligação isolada ou o fragmento de ligação de antígeno disso se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e compreende (A) uma região variável de cadeia pesada que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 216; (b) uma região variável de cadeia leve que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 217; ou combinações de (A) e (b). Em uma outra modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso compreende: (A) uma região variável de cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 216; (b) uma região variável de cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 217; ou combinações de (A) e (b). Em uma outra modalidade, a molécula de ligação ou fragmento disso é V2L2 e compreende: (A) uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 216; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 217.

[0009] Em uma modalidade, a revelação fornece uma molécula de ligação isolada ou um fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende a região VH e VL de V2L2. Em uma outra modalidade, a revelação fornece uma molécula de ligação isolada ou um fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e inibe competitivamente PcrV de Pseudomonas que se liga através de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende VH e VL de V2L2. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo recombinante. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo quimérico. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo humano. Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso é um anticorpo biespecífico.

[0010] Em uma modalidade, a molécula de ligação ou o fragmento disso inibe a entrega de toxinas secretórias tipo III no interior das células alvos.

[0011] Em uma modalidade, a revelação fornece um anticorpo biespecífíco que compreende um domínio de ligação que se liga a Psl de Pseudomonas e um domínio de ligação que se liga a PcrV de Pseudomonas. Em uma modalidade, o domínio de ligação de Psl compreende um fragmento de scFv e o domínio de ligação de PcrV compreende uma imunoglobulina intacta. Em uma modalidade, o domínio de ligação de Psl compreende uma imunoglobulina intacta e o dito domínio de ligação de PcrV compreende um fragmento de scFv. Em uma modalidade, se funde scFv ao amino-terminal da região VH da imunoglobulina intacta. Em uma modalidade, se funde scFv ao carbóxi-terminal da região CH3 da imunoglobulina intacta. Em uma modalidade, insere-se scFv na região de dobradiça da imunoglobulina intacta.

[0012] Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-Psl se liga especificamente ao mesmo epítopo de Psl de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) pelo menos 90% idêntica à região correspondente de WapR-004. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-Psl se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e inibe competitivamente a ligação de Psl de Pseudomonas através de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende uma região VH e VL pelo menos 90% idêntica à região correspondente de WapR-004. Em uma modalidade, VH e VL de WapR-004 compreendem SEQ ID NO; 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente. Em uma modalidade, a sequência de WapR-004 é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 e SEQ ID NO:235. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-PcrV se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende a região VH e VL de V2L2. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-PcrV se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e inibe competitivamente PcrV de Pseudomonas que se liga através de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende VH e VL de V2L2. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação de anti-PcrV se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende uma região VH e VL pelo menos 90% idêntica à região correspondente de V2L2. Em uma modalidade, VH e VL de V2L2 compreende SEQ ID NO:216 e SEQ ID NO:217, respectivamente. Em uma modalidade, VH e VL de WapR-004 (SEQ ID NOs:l 1 e 12, respectivamente) e VH e VL de V2L2 (SEQ ID NOs: 216 e 217, respectivamente). Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 e SEQ ID NO:235.

[0013] Em uma modalidade, a revelação fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:216 ou SEQ ID NO:217. Em uma modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[0014] Em uma modalidade, a revelação fornece uma célula que compreende ou produz a molécula de ligação ou o polipeptídeo revelado no presente documento.

[0015] Em uma modalidade, a revelação fornece uma molécula de polinucleotídeo isolada que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ou um polipeptídeo descrito no presente documento. Em uma modalidade, a molécula de polinucleotídeo compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:238 e SEQ ID NO:239. Em uma outra modalidade, a revelação fornece um vetor que compreende um polinucleotídeo descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a revelação fornece uma célula que compreende um polinucleotídeo ou um vetor.

[0016] Em uma modalidade, a revelação fornece uma composição que compreende uma molécula de ligação, um anticorpo biespecífico ou um polipeptídeo descrito no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0017] Em uma modalidade, a revelação fornece uma composição que compreende um domínio de ligação que se liga a Psi de Pseudomonas e um domínio de ligação que se liga a PcrV de Pseudomonas. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-Psl se liga especificamente ao mesmo epítopo de Psi de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) pelo menos 90% idêntica à região correspondente a WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 ou WapR-016. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-Psl se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e inibe competitivamente a ligação de Psi de Pseudomonas através de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende uma região VH e VL pelo menos 90% idêntica à região correspondente a WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 ou WapR- 016. Em uma modalidade, VH e VL de WapR-004 compreendem SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente, VH e VL de Cam-003 compreendem SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente, VH e VL de Cam-004 compreendem SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:2, respectivamente, VH e VL de Cam-005 compreendem SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:2, respectivamente, VH e VL de WapR-001 compreendem SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, respectivamente, VH e VL de WapR-002 compreendem SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respectivamente, VH e VL de WapR-003 compreendem SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente e VH e VL de WapR-016 compreendem SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-PcrV se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende a região VH e VL de V2L2. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti- PcrV se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e inibe competitivamente PcrV de Pseudomonas que se liga através de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende VH e VL de V2L2. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-PcrV se liga especificamente ao mesmo epitopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso que compreende uma região VH e VL pelo menos 90% idêntica à região correspondente de V2L2. Em uma modalidade, VH e VL de V2L2 compreende SEQ ID NO:216 e SEQ ID NO:217, respectivamente. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-Ps 1 compreende a região VH e VL de WapR-004 e dito domínio de ligação de anti-PcrV compreende a região VH e VL de V2L2 ou os fragmentos de ligação de antígeno disso.

[0018] Em uma modalidade, a composição compreende uma primeira molécula de ligação que compreende o dito anti domínio de ligação de Psl e uma segunda molécula de ligação que compreende um domínio de ligação de PcrV. Em uma modalidade, a primeira molécula de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso e a dita segunda molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno disso. Em uma modalidade, os anticorpos ou os fragmentos de ligação de antígeno são independentemente selecionados do grupo que consiste em: monoclonal, humanizado, quimérico, humano, fragmento de Fab, fragmento de Fab', fragmento de F(ab)2 e fragmento de scFv. Em uma modalidade, os domínios de ligação, as moléculas de ligação ou os fragmentos dos mesmos, se ligam a dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais sorotipos de P. aeruginosa diferentes. Em uma modalidade, os domínios de ligação, as moléculas de ligação ou os fragmentos dos mesmos, se ligam a pelo menos 80%, a pelo menos 85%, a pelo menos 90% ou a pelo menos 95% de cepas de P. aeruginosa isoladas de pacientes infectados. Em uma modalidade, as cepas de P. aeruginosa são isoladas de um ou mais de pulmão, expectoração, olho, pus, fezes, urina, cavidades ósseas, um ferimento, pele, sangue, osso ou fluido do joelho. Em uma modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno disso é conjugado para um agente selecionado do grupo que consiste em agente antimicrobiano, um agente terapêutico, um pró-fármaco, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um lipídio, um modificador de resposta biológica, um agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo heterólogo ou um fragmento disso, uma etiqueta detectável, polietileno glicol (PEG) e uma combinação de dois ou mais de qualquer dos ditos agentes. Em uma modalidade, a etiqueta detectável é selecionada do grupo que consiste em uma enzima, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta quimioluminescente, uma etiqueta bioluminescente, uma etiqueta radioativo ou uma combinação de dois ou mais de quaisquer das ditas etiquetas detectáveis.

[0019] Em uma modalidade, a revelação fornece um método de prevenção ou um tratamento de uma infecção de Pseudomonas em um indivíduo em necessidade disso, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição descrita no presente documento, em que a dita administração fornece um efeito terapêutico sinérgico na prevenção ou um tratamento da infecção de Pseudomonasno dito indivíduo e em que o dito efeito sinérgico é maior do que uma soma dos efeitos individuais de administração de quantidades molares iguais aos domínios de ligação individuais. Em uma modalidade, o efeito terapêutico sinérgico resulta na sobrevivência percentual maior que a sobrevivência percentual aditiva dos indivíduos aos quais apenas um dos domínios de ligação foi administrado. Em uma modalidade, a composição é administrada para dois ou mais ciclos de prevenção/tratamento. Em uma modalidade, os domínios de ligação ou as moléculas de ligação são administrados simultaneamente. Em uma modalidade, os domínios de ligação ou as moléculas de ligação são administradas sequencialmente. Em uma modalidade, a infecção de Pseudomonas é uma infecção P. aeruginosa. Em uma modalidade, o indivíduo é um humano. Em uma modalidade, a infecção é uma infecção ocular, uma infecção pulmonar, uma infecção por queimadura, uma infecção por ferimento, uma infecção da pele, uma infecção sanguínea, uma infecção óssea ou uma combinação de duas ou mais das ditas infecções. Em uma modalidade, o indivíduo tem pneumonia aguda, lesão por queimadura, infecção da córnea, fibrose cística ou uma combinação disso.

[0020] Em uma modalidade, a revelação fornece um método de prevenção ou um tratamento de uma infeção de Pseudomonas em um indivíduo em necessidade disso, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ou do fragmento disso, um anticorpo biespecífíco, um polipeptídeo ou uma composição descrito no presente documento.

[0021] Em uma modalidade, a revelação fornece um kit que compreende uma composição descrita no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0022] A Figura 1 (A-F) é uma triagem de célula completa fenotípica com as bibliotecas de fago de anticorpo humano identificadas anticorpos específicos funcionalmente ativos de P. aeruginosa. (A) é um vista geral da estratégia de seleção de anticorpo completa. (B) é um diagrama de fluxo que descreve o processo para isolar os genes variáveis da região de anticorpo dos pacientes recentemente expostos a P. aeruginosa. (C) são as características das bibliotecas de exibição fago de scFv, que indicam o tamanho e a diversidade do repertório de anticorpo clonado. (D) é a comparação da eficiência de seleção de exibição de fago com o uso ou da biblioteca de anticorpo do paciente ou de uma biblioteca de anticorpo virgem, quando selecionada em P. aeruginosa 3064 Δ WapR (') ou em P. aeruginosa PAO1 MexAB OprM Δ WapR ( ) em suspensão. As barras indicam as titulações de saída (em CFU) em cada ciclo de seleção e os círculos indicam a proporção de sequências de CDR3 de VH duplicadas, uma indicação de enriquecimento clonal. (E) é a realização de triagem de ELISA de scFv da exibição de fago para testar a ligação de múltiplas cepas de P. aeruginosa. Os dados de ELISA (absorbância em 450 nm) são mostrados para oito fago-scFvs de individuais a partir de seleções e um fago-scFv irrelevante. (F) é a ligação de FACS de anticorpos específicos de P. aeruginosa com cepas representativas de sorotipos de P. aeruginosa únicos. Para cada anticorpo testado, um anticorpo de controle negativo de IgG humano é mostrado como um pico sombreado.

[0023] A Figura 2 (A-B) é a avaliação de mAbs que promovem OPK do ensaio de opsonofagocitose P. aeruginosa (A) com cepa de sorogrupo de P. aeruginosa luminescente 05 (PAOl.lux), com diluições de anticorpos monoclonais purificados derivados da filtração de fago. (B) é um ensaio de opsonofagocitose com cepa de sorogrupo de P. aeruginosa luminescente OI 1 (9882-80.lux), com diluições de anticorpos monoclonais de WapR-004 e Cam-003 purificados derivados de filtração de fago. Em ambos A e B, R347, um anticorpo humano monoclonal correspondido isotipo que não se ligue aos antígenos de P. aeruginosa, foi usado como um controle negativo.

[0024] A Figura 3 (A-I) é a identificação do exopolisacarídeo alvo de Psi de P. aeruginosa dos anticorpos derivados da triagem fenotípica. A reatividade dos anticorpos foi determinada através de ELISA indireto em placas revestidas com cepas de P. aeruginosa indicadas: (A) trata-se de PAO1 selvagem, PAOlAwópL, PAOlArm/C e PAOlΔgαZt/. (B) trata-se de PAOXΔpslA. O anticorpo Genway é específico para uma proteína de membrana externa de P. aeruginosa e foi usado como um controle positivo. (C) é uma análise de ligação de FACS de Cam-003 até PAO1 e PAOlΔ/asZzi. Indica-se Cam-003 por uma linha preto sólido e pico transparente; um anticorpo IgGl humano não P. aeruginosa específico correspondendo isótopo foi usado como um controle negativo e é indicado por uma linha cinza e pico sombreado. (D) trata-se de LPS purificado de PAO1 e PAOlΔ/zsZ^ foi separado através de SDS-PAGE e imunotransferido com anti-soros derivados de camundongos vacinados com PAO1 ΔwapRAalgD, uma cepa mutante deficiente em transporte de O-antígeno para a membrana externa e na produção de alginato. (E) trata-se de dados de ligação de ELISA em Cam-003 com mutantes isogêncios de PAO1. Cam-003 é apenas capaz de se ligar às cepas que expressem Psl. pPW145 é um vetor de expressão de pUCP que contém ensaios de opsonofagocitose de pslA. (F e G) indicam que Cam-003 apenas medeia a eliminação de cepas capazes de produzir Psl (PAO1 selvagem e PAOlAps/J complementado em trans com o gene pslA ). (H e I) trata-se de dados de ELISA que indicam a reatividade de anticorpos anti-Psl de WapR-001, WapR-004, e WapR-016 com PAO1 ΔwbpLΔalgD e PAO1 ΔwbpLΔalgDΔpslA. Usou-se R347 como um controle negativo em todos os experimentos.

[0025] A Figura 4 são mAbs de anti-Psl que inibem a anexação de célula de cepa de P. aeruginosa luminescente PAOl.lux a células de A549. Adicionou-se PAOl.lux de fase logarítmica a uma camada única confluente de células A549 em um MOI de 10 seguido da análise de RLU após lavagem repetida para remover P. aeruginosa não ligado. Os resultados são representativos de três experimentos independentes realizados em duplicata para cada concentração anticorpo.

[0026] A Figura 5 (A-C) são as cepas de P. aeruginosa subcultivadas in vivo que mantêm/aumentam a expressão de Psl. O anticorpo de Cam-003 anticorpo é mostrado por uma linha preta sólida e um pico transparente; o anticorpo de controle negativo IgG humano é mostrado como uma linha cinza e um pico sombreado. (A) é o controle positivo, foi feito um ensaio com Cam- 003 para se ligar às cepas cultivadas até a fase logarítmica de uma cultura de um dia para o outro (~5 x 10 /ml). (B) trata-se de inocula para cada cepa foi o que preparada para 5x10 de CFU/ml de um TSA cultivado, de um dia para o outro, em placa até relva e testado para reatividade para Cam-003 através de citometria de fluxo. (C) refere-se a quatro horas após o estímulo intraperitoneal, onde a bactéria foi colhida de camundongos através de lavagem peritoneal e ensaiada para a presença de Psl com Cam-003 através de citometria de fluxo.

[0027] A Figura 6 (A-F) são taxas de sobrevivência para animais tratados com anticorpos monoclonais de anti-Psl de Cam-003 ou de WapR- 004 em um modelo de pneumonia aguda P. aeruginosa. (A-D) trata-se de animais que foram tratados com Cam-003 em 45, 15 e 5 mg/kg e R347 em 45 mg/kg ou PBS 24 horas anterior a infecção intranasal com (A) PAO1 (1,6 x 107 de CFU), (B) 33356 (3 x 107 de CFU), (C) 6294 (7 x 106 de CFU), (D) 6077 (1 x 106 de CFU). (E-F) são animais que foram tratados com WapR-004 em 5 e 1 mg/kg conforme indicado seguido de infecção com 6077 em (E) (8 x 10" de CFU) ou (F) (6 x 105 de CFU). Os animais foram cuidadosamente monitorados por sobrevivência até 72 horas (A-D) ou por 120 horas (E-F). Em todos os experimentos, PBS e R347 servidos como controles negativos. Os resultados foram representados como curvas de sobrevivência de Kaplan- Meier; as diferenças na sobrevivência foram calculadas pelo teste de classificação logarítmica para Cam-003 vs. R347. (A) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg - P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0033). (B) Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0012; 15 mg/kg - P=0,0012; 5 mg/kg - P=0,0373). (c) Cam- 003 (45 mg/kg - P=0,0007; 15 mg/kg - P=0,0019; 5 mg/kg - P=0,0212). (D) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0001). Os resultados são representativos de pelo menos dois experimentos independentes. (E) [Cam-003 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P=0,02; Cam-003 (1 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P=0,4848; WapR-004 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P=0,0886; WapR-004 (5 mg/kg) vs. Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0017; WapR-004 (1 mg/kg) vs. Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2468; R347 (5 mg/kg) vs. PBS: P=0,6676] (F) [Cam-003 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P=0,0004; Cam-003 (1 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) vs. R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) vs. Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0002; WapR- 004 (1 mg/kg) vs. Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2628; R347 (5 mg/kg) vs. PBS: P=0,6676]. Os resultados são representativos de cinco experimentos independentes.

[0028] A Figura 7 (A-F) são anticorpos monoclonais de anti-Psl, de Cam-003 e de WapR-004, que reduzem a carga no órgão após a indução de pneumonia aguda. Os camundongos foram tratados com anticorpo de Cam- 003 24 horas anterior a infecção com (A) PAO1 (1,1 x 107 de CFU), (B) 33356 (1 x 107 de CFU), (C) 6294 (6,25 x 106 de CFU) (D) 6077 (1 x 106 de CFU) e anticorpo de WapR-004 24 horas anterior a infecção com (E) 6294 (~1 x 107 de CFU) e (F) 6206 (~1 x 106 de CFU). 24 horas pós-infecção, os animais foram eutanaziados seguido de coleta ou órgãos para identificação de CFU viável. As diferenças no CFU viável foram determinadas através de Teste U de Mann-Whitney para Cam-003 ou WapR-004 vs. R347. (A) Pulmão: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0015; 15 mg/kg - P=0,0021; 5 mg/kg - P=0,0015); Baço: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0120; 15 mg/kg - P=0,0367); Rins: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0092; 15 mg/kg - P=0,0056); (B) Pulmão: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0010; 15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0045); (C) Pulmão: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0003; 15 mg/kg - P=0,0039; 5 mg/kg - P=0,0068); Baço: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0057; 15 mg/kg - P=0,0230; 5 mg/kg - P=0,0012); (D) Pulmão: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0005; 15 mg/kg - P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0007); Baço: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0015; 15 mg/kg - P=0,0089; 5 mg/kg - P=0,0089); Rins: Cam- 003 (45 mg/kg-P=0,0191; 15 mg/kg - P=0,0355; 5 mg/kg - P=0,0021). (E) Pulmão: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0011; 5 mg/kg - P=0,0004; 1 mg/kg - P=0,0002); Baço: WapR-004 (15 mg/kg - P<Q,0001; 5 mg/kg - P=0,0014; 1 mg/kg - P<Q,0001); F) Pulmão: WapR-004 (15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg — P=0,0006; 1 mg/kg - P=0,0079); Baço: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0059; 5 mg/kg - P=0,0261; 1 mg/kg - P=0,0047); Rim: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0208; 5 mg/kg-P=0,0268.

[0029] A Figura 8 (A-G) são anticorpos monoclonais de anti-Psl de Cam-003 e de WapR-004 que são ativos em um modelo de queratite de P. aeruginosa e modelo de lesão térmica. Os camundongos foram tratados com um anticorpo de IgGl de controle ou Cam-003 em 45 mg/kg (A, B) ou 15 mg/kg (C, D) ou PBS ou um anticorpo de IgGl de controle ou Cam-003 em 45 mg/kg ou WapR-004 em 45 mg/kg ou 15 mg/kg ou 5 mg/kg (F, G) 24 horas anterior a infecção com 6077 (011-cytotoxic - 2x106 de CFU). Imediatamente anterior a infecção, foram feitas arranhaduras de 1 mm na córnea esquerda de cada animal seguido de uso tópico de P. aeruginosa em um 5 μl de inóculo. 24 horas após a infecção, os escores de patologia da cómea foram calculados seguido da remoção do olho para determinação de CFU viável. As diferenças nos escores de patologia e em CFU viável foram determinadas através de Teste U de Mann-Whitney. (A) P=0,0001, (B) P<0,0001, (C) P=0,0003, (D) P=0,0015. (F) e (G) Cam-003 (45 mg/kg) vs. WapR-004 (45 mg/kg): P=0,018; Cam-003 (45 mg/kg) vs. WapR-004 (15 mg/kg): P=0,0025; WapR-004 (45 mg/kg) vs. WapR-004 (15 mg/kg): P=0,1331; WapR-004 (5 mg/kg) vs. Ctrl: P<0,0001. Os resultados são representativos de cinco experimentos independentes. (E) é análise de sobrevivência de Cam-003 e camundongos CF-1 tratados com R347 em um modelo de lesão térmica de P. aeruginosa após infeção 6077 (2 x 10? de CFU) (classificação logarítmica: R347 vs. Cam-003 15 mg/kg, P=0,0094; R347 vs. Cam-003 5 mg/kg, P=0,0017). Os resultados são representativos de pelo menos dois três experimentos independentes, (n) se refere ao número de animais em cada grupo. A Figura 8 (H) são anticorpos monoclonais de anti- Psl e de anti-PcrV que são ativos em um modelo de queratite ocular de camundongo de P. aeruginosa. Injetou-se de maneira intraperitoneal (IP) nos camundongos PBS ou um anticorpo de IgGl de controle (R347) em 45 mg/kg ou WapR-004 (α-Psl) em 5 mg/kg ou V2L2 (a-PcrV) em 5 mg/kg, 16 horas anterior a infecção com 6077 (011-citotóxica - IxlO6 de CFU). Imediatamente antes da infecção, os camundongos foram anestesiados seguido de iniciação de três arranhaduras de 1 mm na cómea e no estroma superficial de um olho de cada camundongo com o uso de uma agulha de calibre 27 sob um microscópio de dissecação, seguido de uso tópico de cepa de P. aeruginosa 6077 em um 5 μl de inóculo.

[0030] A Figura 9 (A-C) é um anticorpo mutante de Fc de Cam-003, Cam-003-TM, tem diminuído OPK e a eficácia in vivo, mas mantém a atividade de anexação de anti-célula. (A) é o ensaio de OPK de PAOl.lux com Cam-003 e Cam-003-TM, que abrigam mutações no domínio Fc que impede interações Fc com receptores Fc (Oganesyan, V., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700 a 704 (2008)). R347 foi usado como um controle negativo. (B) é o ensaio de anexação de célula de PAO1 com Cam-003 e Cam-003-TM. (C) é o modelo de pneumonia aguda que compara a eficácia de Cam-003 vs. Cam-003-TM.

[0031] A Figura 10 (A-C) trata-se de: A é o mapeamento e a Identificação de epítopo da afinidade e ligação relativa para anticorpos monoclonais de anti-Psl. O mapeamento epítopo foi desempenhado através de ELISA de competição e confirmado com o uso de um sistema de fluxo de OCTET* com derivado de Psl do sobrenadante de uma cultura de um dia para o outro de cepa PAO1 de P. aeruginosa. As afinidades de ligação relativas foram medidas em um instrumento de FORTEBIO* OCTET® 384. Também são mostrados as concentrações de anticorpo em que a anexação de célula foi inibida de modo máximo e os valores de EC50 de OPK para cada anticorpo. B, C são as afinidades de ligação relativas de vários mutantes de WapR-004 conforme medidos em um instrumento de FORTEBIO* OCTET® 384. Também são mostrados os valores de EC50 de OPK para os vários mutantes.

[0032] A Figura 11 (A-M) trata-se de avaliação dos clones de mutantes de WapR-004 (W4) no ensaio (OPK) eliminação opsonofagocitica de P. aeruginosa (A-M) ensaio de OPK com cepa 05 de sorogrupo de P. aeruginosa luminescente (PAOl.lux), com diluição de clones mutantes de W4 diferentes em formato de scFv-Fc. Em alguns casos, IgGl de W4 foi incluído no ensaio e é indicado como W4-IgGl. W4-RAD-Cam e W4-RAD- GB representam a mesma sequência de WapR-004RAD descrita no presente documento. "W4-RAD" é uma abreviação para as designações WapR- 004RAD e W4-RAD-Cam e W4-RAD-GB, nos painéis D até M representa duas preparações diferentes de WapR-004RAD. (N-Q) é a avaliação de mAbs de anti-Psl otimizados derivados de otimização de orientação (WapR-004) no ensaio de OPK de P. aeruginosa. (N-O) é um ensaio de OPK com PAOl.lux luminescente com o uso de diluições de anticorpos monoclonais otimizado purificados de orientação. (P-Q) repete o ensaio de OPK com PAOl.lux com diluições mAbs purificado para confirmar os resultados. Em (N-Q) usou-se W4-RAD como um controle positivo comparativo. Em todos os experimentos, R347, um anticorpo monoclonal de IgGl humano que não se liga aos antígenos de P. aeruginosa, foi usado como um controle negativo.

[0033] A Figura 12 (A-H) trata-se de (A) é a diversidade de epítopo de PcrV. (B) é a inibição por cento de análise de citotoxicidade para mAb de V2L2 parental, mAb 166 (controle positivo) e R347 (controle negativo). (C) é avaliação da habilidade mAb de V2L2, de mAb 166 (controle positivo) e de R347 (controle negativo) para impedir lise de RBCs. (D) é a avaliação de mAb com linha germinativa V2L2 (V2L2-GL) e de mAbs de V2L2-GL (V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD e V2L2-MR) para impedir lise de RBCs. (E) é a avaliação de mAbs 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 e V2L7 para impedir lise de RBCs (F) é avaliação de V2L2 de mAbs e 29D2 para impedir lise de RBCs. (G-H) são as afinidades de ligação relativas de anticorpos de V2L2-GL e V2L2-MD.

[0034] A Figura 13 (A-I) trata-se de um estudo de sobrevivência in vivo de camundongos tratados com anti-PcrV de anticorpo. (A) são os camundongos que foram tratado 24 horas anterior a infecção com: 1,03 x 106 de CFU 6077 (exoU+) com 45 mg/kg de R347 (controle negativo), 45 mg/kg, 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 1,0 mg/kg de mAbl66 (controle positivo) ou 15 mg/kg, 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg ou 0,2 mg/kg de V2L2. A sobrevivência foi monitorada por 96 horas. (B) são os camundongos que foram tratados 24 horas anterior a infecção com: 2,1 x 107 de CFU 6294 (exoS+) com 15 mg/kg de R347 (controle negativo), 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 1,0 mg/kg de mAbl66 (controle positivo) ou 15 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 1,0 mg/kg de V2L2. A sobrevivência foi monitorada por 168 horas. Os camundongos foram tratados 24 horas anterior a infecção com: (C) 6294 (06) ou (D) PA 103A com R347 (controle negativo), 5 mg/kg de PcrV-02 de anticorpo de PcrV ou 5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,2 mg/kg ou 0,04 mg/kg de V2L2. Os camundongos foram tratado 24 horas anterior a infecção com cepa 6077 com R347 (controle negativo), 5 mg/kg de PcrV-02 de anticorpo de PcrV, V2L7 (5 mg/kg ou 1 mg/kg), 3G5 (5 mg/kg ou 1 mg/kg) ou 11A6 (5 mg/kg ou 1 mg/kg) (E) ou 25 mg/kg de V2L7, 1E6, 1F3, 29D2, R347 ou 1 mg/kg de PcrV-01 de anticorpo PcrV (F) ou 25 mg/kg de 21F1, V2L2, 2H3, 4A8, SH3, LEIO, R347 ou 1 mg/kg de PcrV-02 (G) ou 29D2 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg), V2L2 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg) R347 ou 1 mg/kg de PcrV-02 (H). Os camundongos foram tratados 24 horas anterior a infecção com: 6294 (06) ou PAI03A com V2L2 (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg ou 5 mg/kg), R347 ou 5 mg/kg de PcrV-02. A sobrevivência em por cento foi ensaiada um modelo de pneumonia aguda.

[0035] A Figura 14 trata-se da análise de carga do órgão de camundongos tratados com V2L2. Os camundongos foram tratados 24 horas anterior a infecção com 6206 com (A) R347 (controle negativo), 1 mg/kg, 0,2 mg/kg ou 0,07 mg/kg de V2L2 e (B) 15 mg/kg de R347 (controle negativo); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 1,0 mg/kg de rnAblóó (controle positivo); ou 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg ou 0,2 mg/kg de V2L2. As unidades de formação de colônia foram identificadas por grama de tecido no pulmão, baço e rim.

[0036] Figura 15: Análise de carga de órgão de camundongos tratados com V2L2 e WapR-004 (W4). Os camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 6206 (Oll-ExoU+) com R347 (controle negativo), V2L2 sozinho ou V2L2 (0,1 mg/kg) em combinação com concentrações crescentes de W4 (0,1, 0,5, 1,0 ou 2,0 mg/kg). As unidades formadoras de colônia foram identificadas por grama de tecido no pulmão, baço e rim. .

[0037] Figura 16 (A-G): Taxas de sobrevivência para animais tratados com anticorpo monoclonal anti-PcrV V2L2 em um modelo de pneumonia aguda por P. aeruginosa. As designações V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-PM4, V2L2-A e V2L2-MFS nos painéis A até G representam preparações diferentes de V2L2. (A-C) Os animais foram tratados com V2L2 a 1 mg/kg, 0,5 mg/kg ou R347 a 0,5 mg/kg antes da infecção intranasal com (A) 6077 (9,75 x 105 CFU), (B, C) 6077 (9,5 x 105 CFU). (D-F) Os animais foram tratados com V2L2 a 0,5 mg/kg, 0,1 mg/kg ou R347 a 0,5 mg/kg seguido por infecção com 6077 (D) (1 x 106 CFU), (E) (9,5 x 105 CFU) ou F (1,026 x 106 CFU). (G) Os animais foram tratados com V2L2-MD a (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg ou 5 mg/kg), mAbl66 (controle positivo) a (0,2 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg ou 15 mg/kg) ou R347 a 0,5 mg/kg seguido por infecção com 6206 (2 x 107+CFU).

[0038] Figura 17 (A-B): Representação esquemática de anticorpos biespecíficos (A) Bsl- TNFα/W4, Bs2- TNFα/W4, Bs3- TNFα/W4 e (B) Bs2- V2L2/W4-RAD, Bs3-V2L2/W4-RAD, e Bs4-V2L2-W4-RAD Psl/PcrV. (A) Para Bsl- TNFa/W4, o W4 scFv é fundido ao terminal amino de TNFα VL através de um ligante (G4S)2. Para Bsl- TNFa/W4, o W4 scFv é fundido ao terminal amino de TNFα VH através de um ligante (G4S)2. Para Bsl- TNFa/W4, o W4 scFv é fundido ao terminal carbóxi de CH3 através de um ligante (G4S)2. (B) Para Bs2-V2L2-2C, o W4-RAD scFv é fundido ao terminal amino de V2L2 VH através de um ligante (G4S)2. Para Bs2-W4- RAD-2C, o V2L2 scFv é fundido ao terminal amino de W4-RAD VH através de um ligante (G4S)2. Para Bs3-V2L2-2C, o W4-RAD scFv é fundido ao terminal carbóxi de CH3 através de um ligante (G4S)2. Para Bs4-V2L2-2C, o W4-RAD scFv é inserido na região de dobradiça, ligada pelo ligante (G4S)2 no N-terminal e C-terminal do scFv.

[0039] Figura 18: Avaliação de atividade de WapR-004 (W4) scFv em um construto biespecífico representado na Figura 17A. O W4 scFv foi ligado a dois construtos biespecíficos diferentes (em direções de N ou C- terminal alternadas) que têm um braço de ligação de TNFa. Cada construto biespecífico de W4- TNFα (Bsl-TNFa/W4, Bs2-TNFa/W4 e Bs3- TNFa/W4) manteve a capacidade de inibir a fixação celular similarmente a W4 com o uso de ensaio PAOl.lux (05) indicando que W4 scFv mantém sua atividade em um formato biespecífico. R347 foi usado como um controle negativo.

[0040] Figura 19 (A-C): Domínios de ligação de anti-Psl e anti-PcrV foram combinados no formato biespecífico por substituição do anticorpo TNFa da Figura 17B com V2L2. Esses construtos são idênticos àqueles representados na Figura 17B com exceção do uso do W4-scFv não estabilizado no lugar do W4-RAD scFv estabilizado. Tanto W4 quanto W4- RAD alvejam epítopos idênticos e têm atividades funcionais idênticas. A inibição percentual de citotoxicidade foi analisada tanto para BS2-V2L2 quanto para BS3-V2L2 com o uso de células A549 tratadas tanto com (A) 6206 quanto com (B) 6206ΔpslA. (C) BS2-V2L2, BS3-V2L2 e BS4-V2L2 foram avaliados por sua capacidade de impedir a lise de RBCs em comparação ao controle parental. Todos os construtos biespecíficos mantiveram a atividade anti-citotoxicidade similarmente ao anticorpo V2L2 parental com o uso de células infectadas com 6206 e 6206ΔpslA e impediram a lise de RBCs similarmente ao controle parental (V2L2). R347 foi usado como um controle negativo em todos os experimentos.

[0041] Figura 20 (A-C): Avaliação de construtos biespecíficos anti- Psl/anti-PcrV para promover OPK de P. aeruginosa. O ensaio de opsonofagocitose é mostrado com cepa de sorogrupo 05 de P. aeruginosa luminescente (PAOl.lux), com diluições de anticorpos biespecíficos Psl/ TNFa purificados (Bs2- TNFα e Bs3- TNFa); os anticorpos parentais W4- RAD ou V2L2-IgGl; os anticorpos Psl/PcrV Bs2-V2L2 ou Bs3-V2L2 ou o anticorpo Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C, Bs4-V2L2-2C ou Bs4-V2L2-2C que abriga uma mutação YTE (Bs4-V2L2-2C-YTE). (A) Apesar de o anticorpo Bs2-V2L2 ter mostrado exterminação similar em comparação ao anticorpo W4-RAD parental, a exterminação para o anticorpo Bs3-V2L2 foi diminuída. (B) Apesar de os anticorpos Bs2-V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C terem mostrado exterminação similar em comparação ao anticorpo W4-RAD parental, a exterminação para o anticorpo Bs3-V2L2-2C foi diminuída. (C) As designações W4-RAD e W4-RAD-YTE representam diferentes preparações de W4-RAD. As designações Bs4-V2L2-2C (lote antigo) e Bs4-V2L2-2C (lote novo) representam preparações diferentes de Bs4-V2L2-2C. A modificação YTE em Bs4-V2L2-2C-YTE é uma modificação feita aos anticorpos que aumenta a meia-vida dos anticorpos. As diferentes preparações de anticorpos Bs4 (lote antigo vs. lote novo) mostraram exterminação similar em comparação ao anticorpo W4-RAD parental, no entanto, os anticorpos Bs4-V2L2-2C-YTE tiveram uma queda de 3 vezes na atividade de OPK em comparação a Bs4-V2L2-2C (Consulte a tabela de EC50). R347 foi usado como um controle negativo em todos os experimentos.

[0042] Figura 21 (A-I): Estudo de sobrevivência in vivo de camundongos tratados com anticorpos biespecíficos anti-Psl/anti-PcrV Bs2- V2L2, Bs3-V2L2, Bs4-V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C-YTE em um sistema de modelo de pneumonia aguda por 6206. Os camundongos (n=10) foram tradados com (A): R347 (controle negativo, 0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg), V2L2 (0,2 mg/kg) ou W4-RAD (0,2 mg/kg); (B-C): R347 (controle negativo, 1 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg) ou Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg); (D): R347 (controle negativo, 1 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg), ou Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg); (E): R347 (controle negativo, 2 mg/kg), uma combinação dos anticorpos W4 e V2L2 individuais (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg cada) ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 2 mg/kg); (F): R347 (controle negativo, 1 mg/kg), uma mistura dos anticorpos W4 e V2L2 individuais (0,5 mg/kg ou 1 mg/kg cada) ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 2 mg/kg). Doze horas após o tratamento, todos os camundongos foram infectados com aproximadamente (6.25x105-1x106 CFU/animal) 6206 (Oll-ExoU+). Todos os camundongos foram monitorados por 120 horas. (A): Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção em aproximadamente 30 horas após a infecção. Todos os animais Bs3-V2L2 sobreviveram, juntamente com aqueles que receberam o controle V2L2. Aproximadamente 90% dos animais imunizados com W4- RAD sobreviveram. Em contraste, aproximadamente 50% dos animais Bs2- V2L2 sucumbiram à infecção em 120 horas. (B-F): Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção em aproximadamente 48 horas após a infecção. (B): Bs4-V2L2-2C teve atividade maior em comparação a Bs2- V2L2 tanto em 1,0 quanto 0,5 mg/kg. (C): Bs4-V2L2-2C pareceu ter atividade maior em comparação a Bs2-V2L2 a 1,0 mg/kg (os resultados não são estatisticamente significativos). (D): Bs4-V2L2-2C teve atividade maior em comparação a Bs2-V2L2 a 0,5 mg/kg. (E): Bs4-V2L2-2C tanto em 2 quanto 1 mg/kg teve atividade maior em comparação à mistura de anticorpos tanto a 1,0 quanto 0,5 mg/kg. (F): Bs4-V2L2 (1 mg/kg) teve atividade similar tanto a 1,0 quanto a 0.5 mg/kg. (G-H): Tanto Bs4-V2L2-2C quanto Bs4- V2L2-2C-YTE tiveram atividade similar tanto a 1,0 quanto a 0.5 mg/kg. Os resultados são representados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier; as diferenças na sobrevivência foram calculadas pelo teste de Log-rank para (B) Bs4-V2L2-2C vs. Bs2-V2L2 (1 mg/kg - P=0,034; 0,5 mg/kg - P=0,0002); (D) Bs4-V2L2-2C vs. Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg - P<0,0001); (E): Bs4-V2L2-2C (2 mg/kg) vs. mistura de anticorpos (1 mg/kg cada)-P=0,0012; Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg) vs. mistura de anticorpos (0,5 mg/kg cada)- P=0,0002. (G-H): Os camundongos (n=8) foram tradados com: R347 (controle negativo, 1 mg/kg), Bs4-V2L2-2C (1 e 0,5 mg/kg) e Bs4-V2L2-2C- YTE (1 e 0,5 mg/kg) e 6206 (9e5 CFU). Nenhuma diferença na sobrevivência entre V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C-YTE em qualquer dose foi observada por Log-Rank. (I): Para analisar a eficácia de cada construto de anticorpo, os camundongos foram testados com 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ou 15 mg/kg e analisados pela sobrevivência em um modelo de pneumonia letal por 6206. A sobrevivência percentual é indicada na tabela com o número de animais para cada comparação indicada nos parênteses.

[0043] Figura 22: Análise de carga de órgão de animais tratados com anticorpo biespecífico anti-Psl/PcrV com o uso do modelo de pneumonia aguda por 6206. Os camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 6206 (Oll-ExoU+) com R347 (controle negativo), V2L2 ou W4-RAD sozinho (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), ou BS3-V2L2 (0,28 mg/kg). As unidades formadoras de colônia foram identificadas por grama de tecido no pulmão, baço e rim. Na concentração testada, tanto Bs2-V2L2 quanto Bs3- V2L2 diminuíram significativamente a carga de órgão no pulmão. No entanto, nenhum dos construtos biespecíficos foi capaz de afetar significativamente a carga de órgão no baço ou rim em comparação aos anticorpos parentais.

[0044] Figura 23 (A-B): Análise de carga de órgão de animais tratados com anticorpo biespecífico anti-Psl/PcrV com o uso do sistema de modelo por 6294. Os camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 6294 com R347 (controle negativo), V2L2 ou W4-RAD sozinho (0,5 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,7 mg/kg), ou Bs3-V2L2 (0,7 mg/kg) (A), ou V2L2 ou W4-RAD sozinho (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,2 mg/kg) ou uma combinação dos anticorpos W4-RAD e V2L2 individuais (0,1 mg/kg cada) (B). Doze horas após a administração de anticorpo, todos os camundongos foram infectados com um inoculo contendo 2,5 x 107 CFU de 6294 (A) ou 1.72 x 107 CFU de 6294 (B). As unidades formadoras de colônia foram identificadas por grama de tecido no pulmão, baço e rim. Usando-se o sistema de modelo de 6294, (A) a carga de órgão tanto de BS2-V2L2 quanto de BS3-V2L2 aumentou significativamente em todos os tecidos a um nível comparável àquele do anticorpo parental V2L2. O anticorpo parental W4- RAD não teve efeito sobre a carga de órgão decrescente. (B) a carga de órgão de combinação de Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 e W4-RAD+V2L2 diminuiu significativamente em todos os tecidos a um nível comparável àquele do anticorpo parental V2L2.

[0045] Figura 24: Estudo de sobrevivência in vivo de camundongos tratados com Bs2-W4/V2L2 e Bs3-W4/V2L2 em um sistema de modelo de 6294. Os camundongos foram tratados com R347 (controle negativo, 0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg), V2L2 (0,2 mg/kg) ou W4-RAD (0,2 mg/kg). Doze horas após o tratamento, todos os camundongos foram infectados com 6294. Todos os camundongos foram monitorados por 120 horas. Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção em aproximadamente 75 horas após a infecção. Sessenta por cento Bs3-V2L2 e 50% dos animais Bs2-V2L2 sobreviveram após 120 horas depois da inoculação. Conforme foi visto nos estudos de carga de órgão, a imunização com W4-RAD não afetou a sobrevivência em todos os camundongos que sucumbiram à infecção aproximadamente no mesmo tempo que os controles.

[0046] Figura 25 (A-D): Análise de carga de órgão de anticorpo biespecífico anti-Psl/PcrV ou terapia de combinação de W4 + V2L2 no sistema de modelo de 6206. Concentrações não ideais de anticorpo foram usadas (A-C) para possibilitar a capacidade de decifrar a atividade do anticorpo. (D) Concentrações altas de Bs4 foram usadas. Os camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 6206 com R347 (controle negativo), V2L2 ou W4-RAD sozinho (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs4 (15,0, 5,0 e 1,0 mg/kg) ou uma combinação dos anticorpos W4-RAD e V2L2 individuais (0,1 mg/kg cada). Doze horas após a administração de anticorpo, todos os camundongos foram infectados com um inoculo contendo (A), (B) 4,75 x 105 CFU de 6206 (OI l-ExoU+) ou (C) 7,75 x 105 CFU de 6206 (Oll-ExoU+) ou (D) 9,5 x 105 CFU de 6206 (OI 1- ExoU+). As unidades formadoras de colônia foram identificadas por grama de tecido no pulmão, baço e rim. Usando-se o sistema de modelo de 6206, tanto BS2-V2L2 quanto BS3-V2L2 diminuíram a carga de órgão no pulmão, baço e rins a um nível comparável àquele da combinação de W4 + V2L2. No pulmão, a combinação reduziu significativamente CFUs bacterianos Bs2- e Bs3-V2L2 e V2L2 com o uso do pós-teste de Dunn com Kruskal-Wallis. Diferenças significativas em carga bacteriana no baço e rim não foram observadas, embora uma tendência à redução tenha sido notada. (D) Quando concentrações ideais de Bs4-V2L2-2C foram usadas (15,0, 5,0, e 1,0), uma limpeza bacteriana rápida e eficaz foi observada no pulmão. Adicionalmente, a disseminação bacteriana para o baço e rins foi também extirpada. Asteriscos indicam a signifícância estatística em comparação ao controle de R347 com o uso Fo pós-teste de Kruskal-Wallis com Dunn.

[0047] Figura 26 (A-J): Terapia adjunta terapêutica: Bs4-V2L2-2C + antibiótico. (A)-(B) os camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 1 x 106 CFU de 6206 com 0,5 mg/kg de R347 (controle negativo) ou Bs4-V2L2-2C (0,2 mg/kg ou 0,5 mg/kg) ou Ciprofloxacina (CIP) (20 mg/kg ou 6,7 mg/kg) 1 hora após a infecção ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 24 horas antes da infecção e CIP 1 hora após a infecção (0,5 mg/kg 4- 20 mg/kg ou 0,5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 0,2 mg/kg + 20 mg/kg ou 0,2 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (C) Camundongos foram tratados 1 hora após a infecção com 9,5 x 105 CFU de 6206 com 5 mg/kg de R.347 ou CIP (20 mg/kg ou 6,7 mg/kg) ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg), ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e CIP (5 mg/kg + 20 mg/kg ou 5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 20 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (D) Camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 9,5 x 105 CFU de 6206 com 5 mg/kg R347 ou CIP (20 mg/kg ou 6,7 mg/kg) ou Bs4-V2L2- 2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg), ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Cipro (5 mg/kg + 20 mg/kg ou 5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 20 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (E) Camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 9,75 x 105 CFU de 6206 com 5 mg/kg de R347or Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou CIP (20 mg/kg ou 6,7 mg/kg) 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e CIP 1 hora após a infecção (5 mg/kg + 20 mg/kg ou 5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 20 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (F) Camundongos foram tratados 1 hora após a infecção com 9,5 x 105 CFU de 6206 com 5 mg/kg R347 ou Meropenem (MEM) (0,75 mg/kg ou 2,3 mg/kg) ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg), ou uma combinação do Bs4-V2L2- 2C e MEM (5 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 5 mg/kg + 0,75 mg/kg ou 1 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente). (G) Camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 9,75 x 105 CFU 6206 com 5 mg/kg de R347 ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou MEM (0,75 mg/kg ou 2,3 mg/kg) 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e MEM 1 hora após a infecção (5 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 5 mg/kg + 0,75 mg/kg ou 1 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente). (H) Camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 1 x 106 CFU de 6206 com 5 mg/kg R347 ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou MEM (0,75 mg/kg ou 2,3 mg/kg), ou uma combinação do Bs4- V2L2-2C 2 e MEM (5 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 5 mg/kg + 0,75 mg/kg ou 1 mg/kg + 2,3 mg/kg ou 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente). (I) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 9,25 x 105 CFU de 6206 com 5 mg/kg de R347 ou CIP (6,7 mg/kg) ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente) , (J) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 1,2 x 106 CFU de 6206 com 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg), CIP (6,7 mg/kg), ou Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (A-J) Anticorpo Bs4 combinado ou com CIP ou com MEM aumenta a eficácia da terapia antibiótica, indicando a proteção sinergética quando as moléculas são combinadas. Adicionalmente, embora o antibiótico entregue por si só ou em combinação com um anticorpo não específico de P. aeruginosa possa reduzir ou controlar o CFU bacteriano no pulmão, o antibiótico sozinho não protege os camundongos da letalidade dessa configuração. A proteção ideal dessa configuração exibe a inclusão de Bs4-V2L2-2C em combinação com o antibiótico.

[0048] Figura 27 (A-C): Diferença na atividade funcional de anticorpos biespecíficos BS4-WT, BS4-GL e BS4-GLO: ensaio de exterminação opsonofagocítica (A), ensaio de fixação anti-celular (B) e um ensaio anti-citotoxicidade de lise de RBC (C).

[0049] Figura 28 (A-B): Proteção percentual contra pneumonia letal em camundongos estimulados em configurações profiláticas (A) ou terapêuticas (B) com cepas de P. aeruginosa. A sobrevivência percentual é indicada na tabela com o número de animais para cada comparação indicada nos parênteses. Os traços indicam “não testado”.

[0050] Figura 29 (A-B): As taxas de sobrevivência para animais tratados com anticorpo biespecífico Bs4-GLO em um modelo de bacteremia letal por P. aeruginosa. (A) Os animais foram tratados com Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5 mg/kg, 1 mg/kg ou R347 a 15mg/kg 24 horas antes da infecção intraperitoneal com 6294 (06) (5,58 x 107 CFU). (B) Os animais foram tratados com Bs4-GLO a 5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,2 mg/kg ou R347 a 5 mg/kg 24 horas antes da infecção intraperitoneal com 6206 (Oll-ExoU+) (6,48 x 106 CFU). Os resultados são representados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier; as diferenças na sobrevivência foram calculadas pelo teste de Log-rank para BS4-GLO em cada concentração vs. R347. (A) Bs4-GLO em todas as concentrações vs. R347 P<0,0001. (B) Bs4-GLO em todas as concentrações vs. R347 P=0,0003. Os resultados são representativos de três experimentos independentes.

[0051] Figura 30 (A-C): As taxas de sobrevivência para animais tratados profilaticamente (prevenção) com Bs4-GLO em um modelo de lesão térmica de P. aeruginosa. (A) Os animais foram tratados com Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5 mg/kg ou R347 a 15 mg/kg 24 horas antes da indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6077 de P. aeruginosa (OI l-ExoU+) com 1,4 x 105 CFU diretamente sob a ferida. (B) os animais foram tratados com Bs4-GLO a 15 mg/kg ou R347 a 15 mg/kg 24 horas antes da indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6206 de P. aeruginosa (OI 1- ExoU+) com 4,15 x 104 CFU diretamente sob a ferida. (B) Os animais foram tratados com Bs4-GLO a 15 mg/kg, 5mg/kg ou R347 a 15 mg/kg 24 horas antes da indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6294 de P. aeruginosa (06) com 7,5x 101 CFU diretamente sob a ferida. Os resultados são representados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier; as diferenças na sobrevivência foram calculadas pelo teste de Log-rank para BS4-GLO em cada concentração vs. R347. (A) Bs4-GLO em todas as concentrações vs. R347 - P<0,0001. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes para cada cepa de P. aeruginosa.

[0052] Figura 31 (A-B): Taxas de sobrevivência para animais terapeuticamente tratados (tratamento) com Bs4-GLO em um modelo de lesão térmica de P. aeruginosa. (A) Animais foram tratados com Bs4-GLO em 42,6 mg/kg, 15 mg/kg ou R347 em 45 mg/kg por 4 horas após a indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6077 de P. aeruginosa (O11-ExolT) com 1,6 x 105 de CFU diretamente sob a ferida. (B) Animais foram tratados com Bs4-GLO em 15 mg/kg, 5 mg/kg ou R347 em 15 mg/kg por 12 horas após a indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6077 de P. aeruginosa (011-EXOLT) com 1,0 x 10’ de CFU diretamente sob a ferida. Resultados são representados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier; diferenças na sobrevivência foram calculadas pelo teste de Log-rank para BS4-GLO em cada concentração vs. R347. (A) Bs4-GLO em ambas as concentrações vs. R347 - P=0.0004. (B) Bs4-GLO em 5 mg/kg vs. R347 - P=0,048. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.

[0053] Figura 32 (A-B): Terapia adjuntiva terapêutica: Bs4GLO + ciprofloxacina (CIP): (A) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 9,5 x 105 de CFU 6206 com 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg) ou Bs4-WT (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação de Bs4-WT e CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente). (B) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 9,5 x 10’ CFU 6206 com 5 mg/kg de R347 + CIP (6,7 mg/kg) ou Bs4-GLO (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação de Bs4-GLO e CIP (5 mg/kg + 6,7 mg/kg ou 1 mg/kg + 6,7 mg/kg, respectivamente

[0054] Figura 33 (A-B): Terapia adjuntiva terapêutica: Bs4-GLO + meropenem (MEM): (A) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 9,5 x 10’ de CFU 6206 com 5 mg/kg de R347 + MEM (0,75 mg/kg) ou Bs4-WT (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação de Bs4-WT e MEM (5 mg/kg + 0,75 mg/kg ou 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente). (B) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com 9,5 x 10’ de CFU 6206 com 5 mg/kg de R347 + MEM (0,75 mg/kg) ou Bs4-GLO (1 mg/kg ou 5 mg/kg) ou uma combinação de Bs4-GLO e MEM (5 mg/kg + 0,75 mg/kg ou 1 mg/kg + 0,75 mg/kg, respectivamente).

[0055] Figura 34 (A-C): Terapia adjuntiva terapêutica: Bs4-GLO + antibiótico em um modelo de bacteremia letal. Camundongos foram tratados 24 horas antes para infecção intraperitoneal com cepa 6294 de P. aeruginosa (06) 9,3 x 107 com Bs4-GLO a (0,25 mg/kg ou 0,5 mg/kg) ou R347 (controle negativo). Uma hora após a infecção, camundongos foram tratados subcutaneamente com (A) 1 mg/kg de CIP, (B) 2,5 mg/kg de MEM ou (C) 2,5 mg/kg de TOB. Os resultados são representados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier; as diferenças em sobrevivência foram calculadas pelo teste de Log-rank para Bs4-GLO em cada concentração vs. R347.

[0056] Figura 35 (A-B) Representação esquemática de formatos alternativos para construtos de Bs4 (A) regiões variáveis de anti-PcrV estão presentes separadamente nas cadeias pesadas e leves, enquanto que as regiões variáveis de anti-Psl estão presentes como um scFv dentro da região de dobradiça da cadeia pesada e (B) regiões variáveis de anti-Psl estão presentes separadamente nas cadeias pesadas e leves, enquanto que as regiões variáveis de anti-PcrV estão presentes como um scFv dentro da região de dobradiça da cadeia pesada.

DESCRIÇÃO DETALHADA I.DEFINIÇÕES

[0057] Deve ser notado que o termo "um" ou "uma" entidade se refere a um ou mais daquela entidade; por exemplo, "uma molécula de ligação que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV”, é entendido por representar uma ou mais moléculas de ligação que se ligam especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais”, e "pelo menos um" podem ser usados de modo intercambiável no presente documento.

[0058] Conforme usado no presente documento, o termo “polipeptídeo” se destina a abranger um “polipeptídeo” singular, assim como “polipeptídeos” no plural, e se refere a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácidos”, ou qualquer outro termo usado para se referir como uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos são incluídos dentro da definição de "polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser usado ao invés de, ou de modo intercambiável com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo" também se destina a se referir aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácidos nucleicos designada. O mesmo pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por síntese química.

[0059] Um polipeptídeo, conforme revelado no presente documento, pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora os mesmos não necessariamente tenham tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não têm uma estrutura tridimensional definida, mas, ao invés disso, podem adotar um grande número de conformações diferentes, e são referidos como desdobrado. Conforme usado no presente documento, o termo glicoproteína se refere a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção química de carboidrato que é fixada à proteína por meio de uma cadeia lateral que contém oxigênio ou uma que contém nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.

[0060] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variação ou derivado do mesmo, destina-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é exigido. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas produzidos de modo recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados, conforme revelado no presente documento, como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer conjunto de procedimentos adequado.

[0061] Outros polipeptídeos revelados no presente documento são fragmentos, derivados, análogos ou variações dos polipeptídeos precedentes e uma combinação dos mesmos. Os termos "fragmento”, "variação”, "derivado" e "análogo", quando referindo-se a uma molécula de ligação tal como um anticorpo que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, conforme revelado no presente documento, incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do anticorpo ou polipeptídeo nativo correspondente. Fragmentos de polipeptídeos incluem, por exemplo, fragmentos proteolíticos, assim como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpo específicos discutidos em outro ponto no presente documento. Variações de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, conforme revelado no presente documento, incluem fragmentos conforme descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácido. As variações podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. Variações de ocorrência não natural podem ser produzidas com o uso de conjuntos de procedimentos de mutagênese conhecidos na técnica. Polipeptídeos variados podem compreender substituições, deleções ou adições conservativas ou não conservativas de aminoácido. Derivados de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e/ou PcrV, conforme revelado no presente documento, são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir recursos adicionais não encontrados no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variados também podem ser referidos no presente documento como "polipeptídeos análogos”. Conforme usado no presente documento, um "derivado" de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e/ou PcrV, se refere a um polipeptídeo de indivíduo que tem um ou mais resíduos quimicamente derivados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluído como "derivados" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituído por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituído por lisina; 3-metilhistidina pode ser substituído por histidina; homosserina pode ser substituído por serina; e omitina pode ser substituído por lisina.

[0062] O termo "polinucleotídeo" se destina a abranger um ácido nucleico singular, assim como ácidos nucleicos plurais, e se refere a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação de amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucleico" se refere a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolado" quer-se dizer uma molécula, DNA ou RNA de ácido nucleico, que foi removido de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e/ou PcrV contido em um vetor é considerado isolado, conforme revelado no presente documento. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isolado incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, polinucleotídeo ou a ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, local de ligação de ribossomo ou um terminador de transcrição.

[0063] Conforme usado no presente documento, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não é traduzido em um aminoácido, o mesmo pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, locais de ligação de ribossomo, terminadores transcricionais, introns e similares, não fazem parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construtos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Adicionalmente, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um único vetor pode separadamente codificar uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas dou PcrV, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variação, ou derivado do mesmo. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tal como um peptídeo sinal de secretor ou um domínio funcional heterólogo.

[0064] Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução associados de modo operacional a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operacional é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, é associada a uma ou mais sequências regulatórias de tal modo a posicionar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado à mesma) são "associados de modo operacional" se a indução de função de promotor resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto de gene desejado, e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a capacidade das sequências regulatórias de expressão de direcionar a expressão do produto de gene ou interferir com a capacidade do molde de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora seria associada de modo operacional a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor tiver a capacidade de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de célula que direciona transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, acentuadores, operadores, repressores e sinais de término de transcrição podem ser associados de modo operacional ao polinucleotídeo para direcionar transcrição específica de célula. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são revelados no presente documento.

[0065] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida por aqueles versados na técnica. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tal como, mas sem se limitar a, segmentos de promotor e acentuador de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovirus (tal como vírus Rous sarcoma). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tal como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, assim como outras sequências com capacidade para controlar expressão de gene em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e acentuadores específicos de tecido, assim como promotores induzíveis de linfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

[0066] Similarmente, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles de habilidade comum na técnica. Esses incluem, mas não se limitam a, locais de ligação de ribossomo, códons de início e término de tradução, e elementos derivados de picomavírus (particularmente um local de entrada de ribossomo interno, ou IRES, também referido como uma sequência de CITE).

[0067] Em outras modalidades, um polinucleotídeo pode ser RNA, por exemplo, na forma de mensageiro de RNA (mRNA).

[0068] Regiões de codificação de polinucleotídeo e ácido nucleico podem ser associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos sinal ou secretório, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo, conforme revelado no presente documento, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e/ou PcrV, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variação, ou derivado do mesmo. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretória que é clivada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente por todo o retículo endoplasmático rugoso tenha sido iniciada. Aqueles de habilidade comum na técnica estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido à terminação N do polipeptídeo, que é clivada do polipeptídeo completo ou de "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é usado, ou um derivado funcional daquela sequência que b '^m a capacidade para direcionar a secreção do polipeptídeo que é associado de nu io operacional à mesma. Altemativamente, um peptídeo sinal de mamífero Werólogo, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder de tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder de ativador de plasminogênio de tecido (TPA) humano ou β- glucuronidase de camundongo.

[0069] São reveladas no presente documento certas moléculas de ligação, ou fragmentos de ligação de antígeno, variações, ou derivados do mesmo. Exceto se referir-se especificamente a anticorpos de tamanho total, tal como anticorpos de ocorrência natural, o termo "molécula de ligação" abrange anticorpos de tamanho total, assim como fragmentos de ligação de antígeno, variações, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, moléculas de imunoglobulina ou anticorpo de ocorrência natural ou moléculas ou fragmentos de anticorpo projetado que ligam antígeno de maneira similar às moléculas de anticorpo.

[0070] Conforme usado no presente documento, o termo “molécula de ligação” se refere em seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Conforme descrito mais à frente no presente documento, uma molécula de ligação pode compreender um ou mais dos domínios de ligação descritos no presente documento. Conforme usado no presente documento, um "domínio de ligação" inclui um local que se liga especificamente ao determinante antigênico. Um exemplo não limitante de uma molécula de ligação de antígeno é um anticorpo ou fragmento disso que retém ligação específica de antígeno.

[0071] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" podem ser usados de modo intercambiável no presente documento. Um anticorpo (ou um fragmento, variação ou derivado do mesmo, conforme revelado no presente documento, compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada e pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados são relativamente bem entendidas. Consulte, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A ∑ aboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988).

[0072] Conforme será discutido em mais detalhes abaixo, o termo “imunoglobulina” compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser bioquimicamente distinguidas. Aqueles versados na técnica observarão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre as mesmas (por exemplo, yl-y4). É a natureza dessa cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG], IgGz, IgGs, IgG4, IgAb etc. são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são prontamente discemíveis ao versado na técnica em vista da presente revelação e, consequentemente, estão dentro do escopo desta revelação.

[0073] Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são ligadas de modo covalente entre si, e as porções de “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente projetadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos percorrem de uma terminação N nas extremidades bifurcadas da configuração Y até a terminação C no fundo de cada cadeia.

[0074] Ambas as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. Nesse aspecto, será observado que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade de antígeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CHI, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, tal como secreção, mobilidade transplacental, ligação de receptor de Fc, ligação de complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumenta conforme se tornam mais distais do local de ligação de antígeno ou amino-terminal do anticorpo. A porção de N-terminal é uma região variável e na porção de C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CL realmente compreendem o carbóxi-terminal da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[0075] Conforme indicado acima, a região variável permite que a molécula de ligação seletivamente reconheça e ligue especificamente epítopos a antígenos. Isto é, o domínio VL e domínio VH, ou subconjunto das regiões de determinação de complementaridade (CDRs), de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo combina para formar a região variável que define um local de ligação de antígeno tridimensional. Essa estrutura de molécula de ligação quaternária forma o local de ligação de antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o local de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL.

[0076] Em anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões de determinação de complementaridade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação de antígeno são sequências curtas e não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O remanescente dos aminoácidos nos domínios de ligação de antígeno, referidos como regiões de "armação", mostram menos variabilidade intermolecular. As regiões de armação adotam amplamente uma conformação de β-ldmina e as CDRs formam laços que conectam e, em alguns casos fazem parte de, a estrutura de β-ldmina. Assim, regiões de armação agem para formar um arcabouço que fornece para posicionar as CDRs na orientação correta por interações não covalentes de intercadeia. O domínio de ligação de antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Essa superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo a seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de armação, respectivamente, podem ser prontamente identificados para qualquer dada região variável de cadeia pesada ou leve por uma pessoa de habilidade comum na técnica, visto que os mesmos foram precisamente definidos {consulte, "Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E., et al., Departamento dos Estados Unidos de Saúde e Serviços Humanos (U.S. Department of Health e Human Services), (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 796:901 a 917 (1987), que são incorporados no presente documento a título de referência integralmente).

[0077] No caso em que há duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo conforme usado no presente documento se destina a incluir todos tais significados, exceto se explicitamente afirmado o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região de determinação de complementaridade" ("CDR") para descrever os locais de combinação de antígeno não contíguo encontrados dentro da região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Essa região particular foi descrita por Kabat et al., Departamento dos Estados Unidos de Saúde e Serviços Humanos, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J Mal. Biol. 196:901 a 917 (1987), que são incorporados no presente documento a título de referência, em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados um ao outro. Independentemente, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variações do mesmo se destina a estar dentro do escopo do termo, conforme definido e usado no presente documento. Os resíduos de aminoácido adequados que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela I como uma comparação. Os números exatos de resíduo que abrangem uma CDR particular irão variar dependendo da sequência e tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR particular, dada a sequência de aminoácidos de região variável do anticorpo. TABELA 1: Definições de CDR 1

I A numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 é de acordo com as convenções denumeração apresentados por Kabat et al. ( consulte abaixo).

[0078] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para sequências de domínio variável que seja aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode atribuir de modo inequívoco esse sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais para além da própria sequência. Conforme usado no presente documento, "numeração de Kabat" se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., Departamento dos Estados Unidos de Saúde e Serviços Humanos, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Exceto se especificado o contrário, referências à numeração de posições de resíduo de aminoácido específicas em uma molécula de ligação que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variação, ou derivado do mesmo, conforme revelado no presente documento, são de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[0079] Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variações, ou derivados do mesmo incluem, mas não se limitam a, anticorpos policlonal, monoclonal, humano, humanizado ou quimérico, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação de epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), fragmentos que compreendem um domínio de VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab. Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na Patente n° U.S. 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou anticorpo abrangidas por esta revelação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[0080] Por "se liga especificamente a”, geralmente se quer dizer que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivado do mesmo liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação de antígeno, e que a ligação implica alguma complementaridade entre o domínio de ligação de antígeno e o epítopo. De acordo com essa definição, uma molécula de ligação é dita por "se ligar especificamente" a um epítopo quando se liga àquele epítopo, por meio de seu domínio de ligação de antígeno mais prontamente do que ligaria a um epítopo aleatório não relacionado. O termo "especificidade" é usado no presente documento para qualificar a afinidade relativa através da qual certa molécula de ligação liga a certo epítopo. Por exemplo, molécula de ligação "A" pode ser considerada por ter uma especificidade maior para um dado epítopo do que molécula de ligação "B”, ou molécula de ligação "A" pode ser dita por ligar a epítopo "C" com uma especificidade maior do que para um epítopo relacionado "D”.

[0081] Por "preferencialmente liga”, quer-se dizer que o anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais prontamente do que ligaria a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que "preferencialmente liga" a um dado epítopo mais provavelmente se ligaria àquele epítopo do que a um epítopo relacionado, muito embora tal anticorpo possa ter reação cruzada com o epítopo relacionado.

[0082] Para fins de exemplo não limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o dito primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD) que é menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação, tal como um anticorpo pode ser considerado por ligar um primeiro antígeno, preferencialmente se o mesmo liga o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação pode ser considerada por ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo.

[0083] Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivado do mesmo pode ser considerado por ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o primeiro epítopo com uma taxa de constante para dissociação (k(off)) que é menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação pode ser considerada por ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, uma molécula de ligação pode ser considerada por ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo.

[0084] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivados da mesma revelados no presente documento pode ser dita por ligar um antígeno alvo, por exemplo, um polissacarídeo revelado no presente documento ou um fragmento ou variação do mesmo com uma taxa de constante para dissociação (k(off)) de menor do que ou igual a 5 X 10’2 s’1, 10'2 s'1, 5 X 10'3 s’1 ou 10 3 s'1. Uma molécula de ligação conforme revelado no presente documento pode ser dita por ligar um antígeno alvo, por exemplo, um polissacarídeo com uma taxa de constante para dissociação (k(off)) menor do que ou igual a 5 X 10'4 s"1, 10'4 s"1, 5X10' 5 s'1, ou IO’5 s'1 5 X IO’6 s’1, 10'6 s'1, 5 X 10'7 s’1 ou 10'7 s’1.

[0085] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variação, ou derivados revelados no presente documento podem ser ditos por ligar um antígeno alvo, por exemplo, um polissacarídeo com uma taxa de constante para associação (k(on)) maior do que ou igual a 103 M'1 s’1, 5 X 103 M'1 s’1, 104 M'1 s’1 ou 5 X 104 M’1 s"1. Uma molécula de ligação conforme revelado no presente documento pode ser dita por ligar um antígeno alvo, por exemplo, um polissacarídeo com uma taxa de constante para associação (k(on)) maior do que ou igual a 103 M’1 s'1, 5 X 105 M’1 s’1, 106 M’1 s’1, ou 5 X 106 M'1 s’1 ou 107 M'1 s’1.

[0086] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivado da mesma é dito por inibir de modo competitivo a ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de referência a um dado epítopo se a mesma preferencialmente liga àquele epítopo até o ponto em que bloqueia, até certo grau, a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de referência ao epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios ELISA de competição. Uma molécula de ligação pode ser dita por inibir de modo competitivo a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de referência a um dado epítopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

[0087] Conforme usado no presente documento, o termo "afinidade" se refere a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molécula de imunoglobulina. Consulte, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988) nas páginas 27 a 28. Conforme usado no presente documento, o termo "avidez" se refere à estabilidade geral do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, isto é, a força de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno. Consulte, por exemplo, Harlow, nas páginas 29 a 34. A avidez é relacionada à afinidade de moléculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos, e também as valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente repetitiva, tal como um polímero, seria uma de alta avidez.

[0088] Moléculas de ligação ou fragmentos de ligação de antígeno, variações ou derivados dos mesmos, conforme revelado no presente documento, também podem ser descritos ou especificados em termos de sua reação cruzada. Conforme usado no presente documento, o termo "reação cruzada" se refere à capacidade de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivados dos mesmos, específica para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida de parentesco entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, uma molécula de ligação tem reatividade cruzada se liga a um epítopo além daquele que induziu sua formação. O epítopo de reação cruzada geralmente contém muitos dos mesmos recursos estruturais complementares que o epítopo de indução e, em alguns casos, pode realmente se encaixar melhor do que o original.

[0089] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivados dos mesmos também pode ser descrita ou especificada em termos de sua afinidade de ligação a um antígeno. Por exemplo, uma molécula de ligação pode ligar a um antígeno com uma constante de dissociação ou KD não maior do que 5 x 10’" M, 10'- M, 5 x 10' M, 10'3M, 5 x 10'4M, 1O'4M, 5 x 10'5M, 10'5M, 5 x 10'6M, 10'6M, 5 x 10'7 M, 10'7M, 5 x 10'8M, 1O’8M, 5 x 10’9M, 10'9M, 5 x 10'10M, 10'10M, 5 x 10' 11 M, 10'HM, 5 x 10'12M, 1O'12M, 5 x 10'13M, 10'l3M, 5 x 10'14M, 10'14M, 5 x 10'15M, OU 1O'I5M.

[0090] Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(s) sozinha ou em combinação com o todo ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CHI, CH2, e CH3. Também são incluídos fragmentos de ligação de antígeno que também compreendem qualquer combinação de região(ões) variável(s) com uma região de dobradiça, domínios CHI, CH2, e CH3. Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos revelados no presente documento podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Os anticorpos podem ser anticorpos de humano, murino, asno, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser relacionada a condrictes em sua origem (por exemplo, de tubarões). Conforme usado no presente documento, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que tem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito infra e, por exemplo, na Patente N° U.S. 5.939.598 por Kucherlapati et al.

[0091] Conforme usado no presente documento, o termo “porção de cadeia pesada” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que compreende uma porção de cadeia pesada, compreende pelo menos um de: um domínio de CHI, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, mediana e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variação ou fragmento disso. Por exemplo, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivados dos mesmos pode compreender uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CHI; uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio de CH2; uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CHI e um domínio de CH3; uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio de CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio de CH2 e um domínio de CH3. Em outra modalidade, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variação, ou derivados dos mesmos compreende uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio de CH3. Além disso, uma molécula de ligação para uso na revelação pode carecer de pelo menos uma porção de um domínio de CH2 (por exemplo, o todo ou parte de um domínio de CH2). Conforme apresentado acima, será entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que esses domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de modo que variam em sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[0092] As porções de cadeia pesada de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo conforme revelado no presente documento, podem ser derivadas de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio de CHI derivado de uma molécula IgGl e uma região de dobradiça derivada de uma molécula IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula IgGl e, em parte, de uma molécula IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula IgGl e, em parte, de uma molécula IgG4.

[0093] Conforme usado no presente documento, o termo “cadeia leve porção” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. A porção de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio de VL ou CL.

[0094] Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variações, ou derivados dos mesmos revelados no presente documento podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de um antígeno, por exemplo, um polissacarídeo alvo que os mesmos reconhecem ou se ligam especifícamente. A porção de um polissacarídeo alvo que especifícamente interage com o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epítopo”, ou um "determinante antigênico”. Um antígeno alvo, por exemplo, um polissacarídeo, pode compreender um único epítopo, mas tipicamente compreende pelo menos dois epítopos, e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, conformação e tipo de antígeno.

[0095] Conforme previamente indicado, as estruturas de subunidade e configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Conforme usado no presente documento, o termo “domínio de VH” inclui o domínio variável de terminal de amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo “domínio de CHI” inclui o primeiro domínio de região constante (amino mais terminal) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio de CHI é adjacente ao domínio de VH e é amino terminal em relação à região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0096] Conforme usado no presente documento, o termo “domínio de CH2” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de resíduo 244 até resíduo 360 de um anticorpo com o uso de esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração Kabat; e resíduos 231 a 340, sistema de numeração EU; consulte Kabat EA et al. op. cit. O domínio de CH2 é exclusivo em que não é proximamente pareado com outro domínio. Ao invés disso, duas cadeias de carboidrato ramificadas ligadas por N são interpostas entre os dois domínios de CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. E também bem documentado que o domínio de CH3 se estende do domínio de CH2 até o C-terminal da molécula IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0097] Conforme usado no presente documento, o termo “região de dobradiça” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio de CHI ao domínio de CH2. Essa região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo, assim, que as duas regiões de ligação de antígeno de N-terminal se movam independentemente. Regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, mediano, e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161AW3 (1998)).

[0098] Conforme usado no presente documento, o termo “ligação de dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. A cisteína de aminoácido compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas IgG de ocorrência natural, as regiões de CH 1 e CL são ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas por duas ligações de dissulfeto em posições que correspondem a 239 e 242 com o uso do sistema de numeração Rabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU).

[0099] Conforme usado no presente documento, o termo “anticorpo quimérico” será usado para significar qualquer anticorpo em que a região ou local imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada) é obtida de uma segunda espécie. Em algumas modalidades, a região ou local de ligação alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[0100] O termo "anticorpo biespecífico", conforme usado no presente documento, se refere a um anticorpo que tem locais de ligação para dois antígenos diferentes dentro de uma única molécula de anticorpo. Será observado que outras moléculas, além da estrutura de anticorpo canônica, podem ser construídas com duas especificidades de ligação. Será adicionalmente observado que a ligação de antígeno por anticorpos biespecíficos pode ser simultânea ou sequencial. Triomas e hibridomas híbridos são dois exemplos de linhagens celulares que podem secretar anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos também podem ser construídos por meios recombinantes. (Strõhlein e Heiss, Future Oncol. 6:1.387 a 1.394 (2010); Mabry e Snavely, IDrugs. 73:543 a 549 (2010)).

[0101] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo projetado" se refere a um anticorpo no qual o domínio variável em um da cadeia pesada e leve ou ambas é alterado por substituição pelo menos parcial de uma ou mais CDRs de um anticorpo de especificidade conhecida e, caso seja necessário, por substituição de região de armação parcial e mudança de sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou até subclasse que o anticorpo a partir do qual as regiões de armação são derivadas, é concebido que as CDRs serão derivadas de um anticorpo de classe diferente e preferencialmente de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo projetado no qual um ou mais CDRs "doadoras" de um anticorpo não humano de especificidade conhecida é enxertada em uma região de armação de cadeia pesada ou leve humana é referido no presente documento como um "anticorpo humanizado”. Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas da região variável doadora para transferir a capacidade de ligação de antígeno de um domínio variável para outro. Ao invés disso, pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do local de ligação alvo. Dadas as explicações apresentadas em, por exemplo, Patentes N° U.S. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370, estará bem dentro da competência daqueles versados na técnica, seja ao realizar a experimentação de rotina ou por teste de tentativa e erro para obter um anticorpo projetado ou humanizado funcional.

[0102] Conforme usado no presente documento o termo “polipeptídeo adequadamente dobrado” inclui polipeptídeos (por exemplo, anticorpos PcrV e Psl de anti-Pseudomonas) nos quais todos os domínios funcionais que compreendem o polipeptídeo são distintamente ativos. Conforme usado no presente documento, o termo “polipeptídeo não adequadamente dobrado” inclui polipeptídeos nos quais pelo menos um dos domínios funcionais do polipeptídeo não é ativo. Em uma modalidade, um polipeptídeo adequadamente dobrado compreende cadeias de polipeptídeo ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfeto e, inversamente, um polipeptídeo não adequadamente dobrado compreende cadeias de polipeptídeo não ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfeto.

[0103] Conforme usado no presente documento, o termo “projetado” inclui manipulação de moléculas de polipeptídeo ou ácido nucleico por meios sintéticos (por exemplo, por conjuntos de procedimentos recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação desses conjuntos de procedimentos).

[0104] Conforme usado no presente documento, os termos "ligado”, "fundido" ou "fusão" são usados de modo intercambiável. Esses termos se referem à união de mais dois elementos ou componentes, por quaisquer meios, incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão em quadro" se refere à união de dois ou mais quadros de leitura abertos (ORFs) de polinucleotídeo para formar um ORF contínuo mais longo, de maneira que mantenha o quadro de leitura traducional correto dos ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente assim unidos na natureza). Embora o quadro de leitura seja assim tomado contínuo por todos os segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados por, por exemplo, sequência de ligante em quadro. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em quadro, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de armação de imunoglobulina ou regiões de CDR adicionais, desde que as CDRs "fundidas" sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.

[0105] No contexto de polipeptídeos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma direção de terminal amino para carboxila na qual resíduos vizinhos entre si na sequência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.

[0106] O termo “expressão”, conforme usado no presente documento se refere a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, redução de expressão de gene, assim como ambas a expressão transiente e expressão estável. O mesmo inclui, sem limitação, transcrição do gene em mensageiro de RNA (mRNA), e a tradução de tal mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto final desejado for um bioquímico, a expressão inclui a criação daquele bioquímico e quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um "produto de gene”. Conforme usado no presente documento, um produto de gene pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um mensageiro de RNA produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido de um transcrito. Produtos de gene descritos no presente documento incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós transcricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica e similares.

[0107] Conforme usado no presente documento, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas preventivas ou profiláticas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir a velocidade (atenuar) um distúrbio, infecção ou alteração fisiológica indesejada. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitação, o alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não piorando) da doença, depuração ou redução de um agente infeccioso tal como P.aeruginosa em um sujeito, um atraso ou retardamento da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão (ou parcial ou total), ou detectável ou indetectável. “Tratamento” pode também significar prolongar a sobrevida em comparação à sobrevida esperada se não for recebido o tratamento. Aqueles em necessidade do tratamento incluem aqueles já com a infecção, afecção ou distúrbio assim como aqueles propensos a ter a afecção ou distúrbio ou aqueles nos quais afecção ou distúrbio deve ser prevenida, por exemplo, em pacientes com queimaduras ou pacientes imunossuprimidos suscetíveis à infecção por P.aeruginosa.

[0108] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou “mamífero” entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejada(o). Os sujeitos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda e animais de zoológico, esportes ou estimação tais como cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas, ursos e assim por diante.

[0109] Conforme usado no presente documento, as frases tais como “um sujeito que se beneficiaria da administração de moléculas de ligação ou domínios de ligação de PcrV e Psi de anti-Pseudomonas” e “um animal em necessidade do tratamento” incluem sujeitos, tais como sujeitos mamíferos, que se beneficiariam da administração de domínios de ligação de PcrV e Psl de an\À-Pseudomonas ou uma molécula de ligação, tal como um anticorpo, que compreende um ou mais dos domínios de ligação. Tais domínios de ligação ou moléculas de ligação podem ser usados, por exemplo, para a detecção de Psl ou PcrV de Pseudomonas (por exemplo, para um procedimento de diagnóstico) e/ou para o tratamento, isto é, paliação ou prevenção de uma doença, com moléculas de ligação de Psl e PcrV antiPseudomonas. Conforme descrito em mais detalhes no presente documento, as moléculas de ligação de Psi e PcrV anti-Pseudomonas podem ser usadas de forma não conjugada ou podem ser conjugadas, por exemplo, a um fármaco, pró-fármaco ou um isótopo.

[0110] O termo "efeito sinérgico", conforme usado no presente documento, refere-se a um efeito terapêutico maior que o aditivo produzido por uma combinação de compostos em que o efeito terapêutico obtido com a combinação excede os efeitos aditivos que resultariam de outra maneira da administração individual dos compostos sozinhos. Determinadas modalidades incluem métodos para produzir um efeito sinérgico no tratamento de infecções por Pseudomonas, em que o dito efeito é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500% ou pelo menos 1.000% maior do que o efeito aditivo correspondente.

[0111] A "coadministração" refere-se à administração de diferentes compostos, tal como um anti-Psl e um domínio de ligação de anti-PcrV ou molécula de ligação que compreende um ou ambos dentre um anti-Psl e o domínio de ligação de anti-PcrV, de modo que os compostos obtenham um efeito sinérgico na imunidade anti-Pseudomonas. Os compostos podem ser administrados nas composições iguais ou diferentes que, se separadas, são administradas próximas uma à outra, em geral dentro de 24 horas entre si e mais tipicamente dentro de cerca de 1 a 8 horas entre si e ainda mais tipicamente dentro de 1 a 4 horas entre si ou próximas à administração simultânea. As quantidades relativas são dosagens que alcançam o sinergismo desejado.

II.DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO E MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO

[0112] Os anticorpos que ligam Psl e formatos para usar esses anticorpos foram descritos na técnica. Consulte, por exemplo, o Pedido Internacional n° PCT/US2012/041538, depositado em 8 de junho de 2012 e PCT/US2012/63639, depositado em 6 de novembro de 2012 (número de registro do procurador AEMS-115WO1, intitulado “MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF”), que estão incorporados no presente documento em suas totalidades a título de referência.

[0113] Uma modalidade é direcionada aos domínios de ligação que se ligam especificamente ao PcrV de Pseudomonas, em que a ligação pode interromper a atividade do sistema de secreção de toxina do tipo III. Em determinadas modalidades, os domínios de ligação têm a mesma especificidade de ligação de Pseudomonas como o anticorpo V2L2.

[0114] Outra modalidade é direcionada aos domínios de ligação que se ligam especificamente ao PcrV ou Psi de Pseudomonas, em que a administração de ambos os domínios de ligação resulta em efeitos sinérgicos contra as infecções por Pseudomonas pela (a) inibição da ligação de Pseudomonas aeruginosa às células epiteliais, (b) promoção, mediação ou aumento assassinato opsonofagocítico (OPK) de P. aeruginosa, (c) inibição da ligação de P. aeruginosa às células epiteliais ou (d) interrupção da atividade do sistema de secreção de toxina do tipo III. Em determinadas modalidades, os domínios de ligação têm a mesma especificidade de ligação de Pseudomonas que os anticorpos Cam-003, WapR-004, V2L2 ou 29D.

[0115] Outras modalidades são direcionadas a uma molécula(s) de ligação isolada que compreende um ou ambos os domínios de ligação que se ligam especificamente ao Psi e/ou PcrV de Pseudomonas, em que a administração da molécula de ligação resulta em efeitos sinérgicos contra infecções por Pseudomonas. Em determinadas modalidades, a molécula de ligação pode compreender um domínio de ligação dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos que incluem, porém sem limitação, Cam-003, WapR- 004, V2L2 ou 29D22.

[0116] Conforme usado no presente documento, os termos "domínio de ligação" ou "domínio de ligação de antígeno" incluem um sítio que se liga especificamente a um epítopo em um antígeno (por exemplo, um epítopo de Psl ou PcrV de Pseudomonas'). O domínio de ligação de antígeno de um anticorpo inclui tipicamente pelo menos uma porção de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e pelo menos uma porção de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. O sítio de ligação formado por essas regiões variáveis determina a especificidade do anticorpo.

[0117] A revelação é mais especificamente direcionada a uma composição que compreende pelo menos dois domínios de ligação antiPseudomonas, em que um domínio de ligação se liga especificamente a Psl e o outro domínio de ligação se liga especificamente a PcrV. Em uma modalidade, a composição compreende um domínio de ligação que se liga especificamente ao mesmo epítopo de Psl de Pseudomonas como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) de WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 ou WapR-016. Em determinadas modalidades, o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) de V2L2 ou 29D2.

[0118] Em uma modalidade, a composição compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou inibe competitivamente a ligação de Psl de Pseudomonas por um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a VH e VL de WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR- 003 ou WapR-016. Em determinadas modalidades, o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas e/ou inibe competitivamente a ligação de PcrV de Pseudomonas por um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) de V2L2 ou 29D2.

[0119] Outra modalidade é direcionada a uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV de Pseudomonas como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a região VH e VL de V2L2 ou 29D2.

[0120] E também incluída uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas e inibe competitivamente a ligação de PcrV de Pseudomonas por um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a VH e VL de V2L2 ou 29D2.

[0121] Uma modalidade é direcionada a uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao mesmo epítopo de Psl de Pseudomonas como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a região VH e VL de WapR-001, WapR-002 ou WapR-003.

[0122] E também incluída uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e inibe competitivamente a ligação de Psl de Pseudomonas por um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a VH e VL de WapR-001, WapR-002 ou WapR-003.

[0123] É adicionalmente incluída uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente ao mesmo epítopo de Psl de Pseudomonas como um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a VHe VL de WapR-016.

[0124] É também incluída uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a Psi de Pseudomonas e inibe competitivamente a ligação de Psl de Pseudomonas por um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende a VH e VL de WapR-016.

[0125] Os métodos para fazer os anticorpos são bem conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Uma vez que os anticorpos para vários fragmentos ou para o Psl ou PcrV de Pseudomonas de comprimento completo sem a sequência de sinal foram produzidos, a determinação de quais aminoácidos ou epítopo do Psl ou PcrV de Pseudomonas aos quais o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno se liga pode ser determinada por protocolos de mapeamento de epítopo conforme descrito no presente documento assim como os métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA de sanduíche de anticorpo duplo conforme descrito em "Chapter 11 - Immunology," Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., volume 2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Protocolos de mapeamento de epítopo adicionais podem ser encontrados em Morris, G. Epitope Mapping Protocols, Nova Jersey: Humana Press (1996), que são ambos incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades. O mapeamento de epítopo pode também ser realizado por meios comercialmente disponíveis (isto é, ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)).

[0126] Em determinados aspectos, a revelação é direcionada a uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo que se liga especificamente a Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) que é menor do que a KD para o dito anticorpo monoclonal de referência.

[0127] Em determinadas modalidades, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudo monas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo conforme revelado no presente documento se liga especificamente a pelo menos um epítopo de Psl ou PcrV, isto é, se liga a tal epítopo mais prontamente que se ligaria a um epítopo não relacionado ou aleatório; se liga preferencialmente a pelo menos um epítopo de Psl ou PcrV, isto é, se liga a tal epítopo mais prontamente do que se ligaria a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo; inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de referência que por sua vez se liga específica ou preferencialmente a um determinado epítopo de Psl ou PcrV; ou se liga a pelo menos um epítopo de Psl ou PcrV com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação KD de menos do que cerca de 5 x 10'2 M, cerca de 10'2 M, cerca de 5 x 10” M, cerca de 10” M, cerca de 5 x 10'4M, cerca de 10'4 M, cerca de 5 x IO’5 M, cerca de IO’5 M, cerca de 5 x 10'6 M, cercade 10'6 M, cerca de 5x 10’7 M, cerca de 10'7 M, cerca de 5 x 10'8 M, cerca de10’8 M, cerca de 5x10'9 M, cerca de10'9 M, cerca de 5 x 10"10 M, cerca de1O’I()M, cerca de 5x10'" M, cerca de10'" M, cerca de 5 x 10'12M, cerca de10’12 M, cerca de 5x10'13 M, cerca de10'13 M, cerca de 5 x 10'14 M, cerca de 1O'I4M, cerca de 5 x 1O'I5M ou cerca de 1O'|3M.

[0128] Conforme usado no contexto de constantes de dissociação de ligação, termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nos métodos utilizados para medir a afinidade de anticorpo. Por exemplo, dependendo do nível de precisão da instrumentação usada, do erro padrão com base no número de amostras medidas e do erro de arredondamento, o termo “cerca de 10'2 M” pode incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.

[0129] Em modalidades específicas, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo liga Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma taxa de constante para dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10' s' , 10’ s’ , 5 X 10’ s' ou 10' s' . Altemativamente, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo liga o Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma taxa de constante para dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10’4 s'1, 10’4 s1, 5 X IO'5 s'1 ou 10’5 s'1 5 X 10'6 s'1, IO'6 s'1, 5 X 10’7 s’1 ou 10’7 s’1.

[0130] Em outras modalidades, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo conforme revelado no presente documento liga o Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma taxa de constante para associação (k(on)) maior ou igual a 103 M’1 s’1, 5 X 10J M'1 s’1, 104 M'1 s’1 ou 5 X 104 M’1 s*1. Altemativamente, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo conforme revelado no presente documento liga o Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma taxa de constante para associação (k(on)) maior ou igual a 10? M'1 s'1, 5 X 105 M'1 s*1, 106 M’1 s'1 ou 5 X 106 M’1 s’1 ou 107 M’1 s’1.

[0131] Em várias modalidades, uma molécula de ligação de Psl e/ou PcrV de anXÃ-Pseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo conforme descrito no presente documento promove a exterminação opsonofagocítica de Pseudomonas ou inibe a ligação de Pseudomonas a células epiteliais. Em determinadas modalidades descritas no presente documento, o alvo de Psl ou PcrV de Pseudomonas é Psl ou PcrV de Pseudomonas aeruginosa. Em outras modalidades, determinadas moléculas de ligação descritas no presente documento podem se ligar a moléculas de polissacarídeo relacionadas estruturalmente independente de sua fonte. Tais moléculas do tipo Psl seriam esperadas a ser idênticas ou ter relatividade estrutural suficiente ao Psl de P. aeruginosa para permitir o reconhecimento específico por uma ou mais das moléculas de ligação reveladas. Em outras modalidades, determinadas moléculas de ligação descritas no presente documento podem se ligar a moléculas de polipeptídeo relacionadas estruturalmente independente de sua fonte. Tais moléculas do tipo PcrV seriam esperadas a ser idênticas ou ter relatividade estrutural suficiente ao PcrV de P. aeruginosa para permitir o reconhecimento específico por uma ou mais das moléculas de ligação reveladas. Portanto, por exemplo, determinadas moléculas de ligação descritas no presente documento podem se ligar a moléculas do tipo Psl e/ou do tipo PcrV produzidas por outras espécies bacterianas, por exemplo, as moléculas do tipo Psl ou do tipo PcrV produzidas por outras espécies de Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, ou Pseudomonas alcaligenes. Altemativamente, determinadas moléculas de ligação conforme descritas no presente documento podem se ligar às moléculas do tipo Psl e/ou do tipo PcrV produzidas sinteticamente ou por células hospedeiras geneticamente modificadas para produzir moléculas do tipo Psl ou do tipo PcrV.

[0132] A não ser que seja especificamente notado, conforme usado no presente documento, um "fragmento do mesmo" em referência a uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo refere-se a um fragmento de ligação de antígeno, isto é, uma porção do anticorpo que se liga especificamente ao antígeno.

[0133] As moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de hx\t\-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem compreender uma região constante que media uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente Cl do complemento a uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema de complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise dos patógenos. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também ser envolvida na hipersensibilidade autoimune. Ademais, os anticorpos se ligam a receptores em várias células por meio da região Fc, com um sítio de ligação de receptor Fc na região de anticorpo Fc que se liga a um receptor Fc (FcR) em uma célula. Há vários receptores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo aos receptores Fc nas superfícies celulares aciona várias respostas biológicas importantes e diversas incluindo o engolfamento e a destruição de partículas revestidas por anticorpo, eliminação dos complexos imunológicos, lise de células alvo revestidas por anticorpo por células exterminadoras (chamada de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina.

[0134] Consequentemente, determinadas modalidades reveladas no presente documento incluem uma molécula de ligação de Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo, na qual pelo menos uma fração de um ou mais domínios de região constante foi deletada ou alterada de outra maneira de modo a fornecer as características bioquímicas desejadas tais como funções efetoras reduzidas, a capacidade de dimerizar de modo não covalente, capacidade aumentada de localizar o sítio de um tumor, meia vida de soro reduzida ou meia vida de soro aumentada em comparação a um todo, anticorpo inalterado com imunogenicidade aproximadamente igual. Por exemplo, determinadas moléculas de ligação descritas no presente documento são anticorpos deletados do domínio que compreende uma cadeia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que não têm pelo menos uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em determinados anticorpos, um domínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será deletado, por exemplo, todo ou parte do domínio CH2 será deletada.

[0135] As formas modificadas de moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem ser feitos a partir de anticorpos progenitores ou precursores inteiros com o uso de conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica. Os conjuntos de procedimentos exemplificativos são discutidos em outro lugar no presente documento.

[0136] Em determinadas modalidades, ambas as regiões variável e constante de moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno são completamente humanas. Os anticorpos completamente humanos podem ser feitos com o uso de conjuntos de procedimentos que são conhecidas na técnica e conforme descrito no presente documento. Por exemplo, os anticorpos completamente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um estímulo antigênico, mas cujos locais endógenos foram desabilitados. Os conjuntos de procedimentos exemplificativos que podem ser usados para fazer tais anticorpos são descritos nas patentes n° US: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Outros conjuntos de procedimentos são conhecidos na técnica. Os anticorpos completamente humanos podem ser igualmente produzidos por várias tecnologias de exibição, por exemplo, exibição de fago ou outros sistemas de exibição virai, conforme descrito em mais detalhes em outro lugar no presente documento.

[0137] As moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de antiPseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos conforme revelado no presente documento podem ser feitas ou fabricadas com o uso de conjuntos de procedimentos que são conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, as moléculas de ligação ou fragmentos das mesmas são “produzidos de modo recombinante”, isto é, são produzidos com o uso da tecnologia de DNA recombinante. Os conjuntos de procedimentos exemplificativos para fazer as moléculas de anticorpo ou fragmentos das mesmas são discutidos em mais detalhes em outro lugar no presente documento.

[0138] Em determinadas moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos descritos no presente documento, a porção Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora com o uso de conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, a deleção ou a inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação de receptor Fc do anticorpo modificado circulante aumentando através disso a localização do tumor. Em outros casos, é possível que as modificações de região constante moderem a ligação de complemento e reduzam assim a meia vida de soro e a associação não específica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar as ligações de dissulfeto ou porções químicas de oligossacarídeo que permitem a localização aprimorada devido à flexibilidade de anticorpo ou especificidade de antígeno aumentada. O perfil fisiológico resultante, a biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tal como a localização, biodistribuição e meia vida de soro, podem ser facilmente medidos e quantificados com o uso de conjuntos de procedimentos imunológicos bem conhecidos sem a experimentação indevida.

[0139] Em determinadas modalidades, as moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos não obterão uma resposta imunológica deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em uma modalidade, as moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos são modificados para reduzir sua imunogenicidade com o uso de conjuntos de procedimentos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser humanizados, desimunizados ou anticorpos quiméricos podem ser feitos. Esses tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo murino ou primata, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo progenitor, mas que é menos imunogênico em humanos. Isso pode ser alcançado por vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não humanos inteiros em regiões constantes humanos para gerar anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais regiões não humanas de determinação de complementaridade (CDRs) em um arcabouço humano e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos de arcabouço críticos; ou (c) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas "ocultar" os mesmos com uma secreção do tipo humana pela substituição de resíduos de superfície. Tais métodos são revelados em Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei.81:6.851 a 6.855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol.44:65 A 92 (1988); Verhoeyen etal., Science239:\.534 a 1.536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 a 498 (1991); Padlan, Molec. Immun.31:\69 a 217 (1994) e nas Patentes n° U.S. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.190.370, todas as quais são incorporadas por meio deste a título de referência em sua totalidade.

[0140] A desimunização pode também ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Conforme usado no presente documento, o termo “desimunização” inclui a alteração de um anticorpo para modificar os epítopos de célula T (consulte, por exemplo, WO9852976A1, W00034317A2). Por exemplo, as sequências de VH e VL do anticorpo inicial são analisadas e um “mapa” de epítopo de célula T humana de cada região V que mostra a localização dos epítopos em relação às regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chave dentro da sequência. Os epítopos de célula T individuais do mapa de epítopo de célula T são analisados a fim de identificar substituições de aminoácido alternativas com um risco baixo de alterar a atividade do anticorpo final. Uma faixa de sequências de VH e VL alternativas é projetada compreendendo combinações de substituições de aminoácido e essas sequências são incorporadas subsequentemente em uma faixa de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para Psl e/ou PcrV de Pseudomonas ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos revelados no presente documento, que são então testados para função. Os genes de cadeia leve e pesada completos que compreendem regiões C humanas e V modificadas são, então, clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subseqüentes introduzidos nas linhagens celulares para a produção do anticorpo inteiro. Os anticorpos são, então, comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados e a variante ótima é identificada.

[0141] As moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de antiPseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem ser geradas por qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos policlonais para um antígeno de interesse podem ser produzidos por vários procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo de Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser administrado a vários animais hospedeiros incluindo, porém sem limitação, coelhos, camundongos, ratos, galinhas, hamsters, cabras, burros, etc. para induzir a produção de soros que contêm anticorpos policlonais específicos para o antígeno. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras e incluem, porém sem limitação, Freund (completo e incompleto), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tal como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de lapa califomiana, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tal como BCG (bacilo Calmette- Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bem conhecidos na técnica.

[0142] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados com o uso de uma variedade ampla de conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica incluindo o uso de conjuntos de procedimentos de exibição de hibridoma, recombinante e fago ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos com o uso de conjuntos de procedimentos de hibridoma incluindo aqueles conhecidos na técnica e ensinados, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição (1988).

[0143] Os anticorpos de codificação de DNA ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sitos de ligação de antígeno) podem também ser derivados de bibliotecas de anticorpo, tais como bibliotecas de exibição de fago. Particularmente, tal fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno expressos a partir de uma biblioteca de anticorpo de repertório ou combinatória (por exemplo, humano ou murino). O fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, com o uso do antígeno identificado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície ou microesfera sólida. O fago usado nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos que incluem domínios de ligação fd e M13 expressos a partir do fago com scFv, Fab, Fv OE DAB (região Fv individual de cadeias pesadas ou leves) ou domínios de anticorpo Fv estabilizado por dissulfeto fundidos de modo recombinante ou ao gene de fago III ou à proteína de gene VIII. Os métodos exemplificativos são estabelecidos, por exemplo, no documento n° EP 368 684 Bl; patente n° U.S. 5.969.108, Hoogenboom, H.R. e Chames, Immunol. Today 21:311 (2000); Nagy et al.Nat. Med. 5:801 (2002); Huie et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95:2682 (2001); Lui et al., J. Mol. Biol.375:1063 (2002), cada um dos quais é incorporado no presente documento a título de referência. As diversas publicações (por exemplo, Marks et al., Bio/Technology 10U19 a 783 (1992)) descreveram a produção de anticorpos humanos de alta afinidade pelo embaralhamento de cadeia, assim como a infecção combinatória e a recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago grandes. Em outra modalidade, a exibição ribossômica pode ser usada para substituir o bacteriófago como a plataforma de exibição (consulte, por exemplo, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 75:1287 (2000); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95:3.750 (2001); ou Irving et al., J. Immunol. Methods 248\3\ (2001)). Em ainda outra modalidade, as bibliotecas de superfície celular podem ser triadas para anticorpos (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 97:10.701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:2\\ (2000)). Tais procedimentos fornecem alternativas para conjuntos de procedimentos de hibridoma tradicionais para o isolamento e clonagem subsequente dos anticorpos monoclonais.

[0144] Nos métodos de exibição de fago, os domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que codificam os mesmos. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam as regiões VH e VL são amplificadas a partir das bibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA humano ou murino de tecidos linfoides) ou bibliotecas de cDNA sintético. Em determinadas modalidades, os DNAs que codificam as regiões VH e VL são unidos em conjunto por um ligante scFv por PCR e clonados em um vetor de fagemídeo (por exemplo, p CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado na E. coli e a £. coli é infectada com o fago ajudante. O fago usado nesses métodos são um fago tipicamente filamentoso incluindo fd e Ml3 e as regiões VH ou VL são usualmente fundidas de modo recombinante ou ao gene de fago III ou gene VIII. O fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno de interesse (isto é, Psl ou PcrV de Pseudomonas) pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, com o uso do antígeno identificado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície ou microesfera sólida.

[0145] Os exemplos adicionais dos métodos de exibição de fago que podem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles revelados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182A\ a 50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177 a 186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952 a 958 (1994); Persic et al., Gene 187:9 a 18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191 a 280 (1994); Pedido PCT n° PCT/GB91/01134; Publicações PCT n° WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes n° U.S. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0146] Conforme descrito nas referências acima e nos exemplos abaixo, após a seleção de fago, as regiões de codificação de anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, levedura e bactérias. Por exemplo, os conjuntos de procedimentos para produzir de modo recombinante os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregados com o uso de métodos conhecidos na técnica tais como aqueles revelados na publicação PCT n° WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864 a 869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26 a 34 (1995); e Better et al., Science 240:\.64\ a 1.043 (1988) (as ditas referências incorporadas a título de referência sem suas totalidades).

[0147] Os exemplos de conjuntos de procedimentos que podem ser usados para produzir Fvs de cadeia única e anticorpos incluem aqueles descritos nas Patentes n° U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46 a 88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7.995 a 7.999 (1993); e Skerra et al., Science 249:1.038 a 1.040 (1988). Em determinadas modalidades, tal como a administração terapêutica, anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos podem ser usados. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como anticorpos que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir os anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Morrison, Science 229:1.202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 725:191 a 202 (1989); Patentes n° U.S. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, que são incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo a partir de um anticorpo de espécie não humana que se liga ao antígeno desejado que tem uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e regiões de arcabouço de uma molécula de imunoglobulina humana. Frequentemente, os resíduos de arcabouço nas regiões de arcabouço humanas serão substituídas pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferencialmente melhorar, a ligação de antígeno. Essas substituições de arcabouço são identificados pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pela modelagem das interações dos resíduos de arcabouço e CDR para identificar os resíduos de arcabouço importantes para a ligação de antígeno e comparação de sequência para identificar os resíduos de arcabouço não usuais nas posições particulares. (Consulte, por exemplo, Queen et al., Patente n° U.S. 55.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que são incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades). Os anticorpos podem ser humanizados com o uso de uma variedade de conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, enxerto por CDR (EP 239.400; publicação PCT n° WO 91/09967; Patentes n° U.S. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585,089), recobrimento e recapeamento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489 a 498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):8Q5 a 814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969 a 973 (1994)) e embaralhamento de cadeia (Patente n° U.S.5.565.332).

[0148] Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo os métodos de exibição de fago descritos acima com o uso de bibliotecas de anticorpos derivadas das sequências de imunoglobulina humana. Consulte também as Patentes n° U.S. 4.444.887 e 4.716.111; e as publicações PCT n° WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada uma das quais é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0149] Os anticorpos humanos podem também ser produzidos com o uso de camundongos transgênicos que não tem a capacidade de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células tronco embrionárias de camundongo. Adicionalmente, várias companhias podem estar empenhas em fornecer anticorpos humanos produzidos em camundongos transgênicos direcionados contra um antígeno selecionado com o uso do conjunto de procedimentos similar a este descrito acima.

[0150] Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados com o uso de um conjunto de procedimentos referido como "seleção guiada". Nessa abordagem, um anticorpo não humano monoclonal selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12:899 a 903 (1988). Consulte também a Patente n° U.S.5.565.332.)

[0151] Em outra modalidade, o DNA que codifica os anticorpos monoclonais desejados pode ser prontamente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que podem se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeia leves e pesadas de anticorpos murinos). As células de hibridoma isoladas e subclonadas ou fago isolado, por exemplo, podem servir como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outra maneira imunoglobulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético conforme descrito no presente documento) pode ser usado para clonar as sequências de região variável e constante para a fabricação de anticorpos conforme descrito em Newman et al., Patente n° U.S. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que é incorporada a título de referência no presente documento. As células transformadas que expressam o anticorpo desejado podem ser cultivadas em quantidade relativamente grandes para fornecer suprimentos clínicos e comerciais da imunoglobulina.

[0152] Em uma modalidade, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve ou pesada de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada da descrição compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo.

[0153] Em uma modalidade específica, a sequência de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as sequências das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) pelos métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela comparação a sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões da hipervariabilidade de sequência. Com o uso de técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs podem ser inseridas dentro das regiões de arcabouço, por exemplo, em regiões de arcabouço humanas para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de arcabouço podem ser de ocorrência natural ou regiões de arcabouço de consenso e preferencialmente regiões de arcabouço humanas (consulte, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278A51 a 479 (1998) para uma listagem de regiões de arcabouço humanas). O polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de arcabouço e CDRs codifica um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de um antígeno desejado, por exemplo, Psl ou PcrV. Uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas dentro das regiões de arcabouço e as substituições de aminoácido melhoram a ligação do anticorpo a seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer as substituições de aminoácido ou deleções de um ou mais resíduos de cisteína de região variável que participam em uma ligação de dissulfeto entre cadeias para gerar moléculas de anticorpo que não tem uma ou mais ligações de dissulfeto entre cadeias. Outras alterações ao polinucleotídeo são abrangidas pela presente revelação e estão dentro das capacidades de um versado na técnica.

[0154] São também fornecidas moléculas de ligação que compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) descritas no presente documento, tais moléculas de ligação ou fragmentos das mesmas se ligam especificamente ao Psl ou PcrV de Pseudomonas. Os conjuntos de procedimentos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para introduzir mutações na sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ou fragmento da mesma que se liga especificamente a Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, incluindo, porém sem limitação, mutagênese direcionada a sitio e mutagênese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácido. As variantes (incluindo derivados) codificam polipeptídeos que compreendem menos do que 50 substituições de aminoácido, menos do que 40 substituições de aminoácido, menos do que 30 substituições de aminoácido, menos do que 25 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituições de aminoácido, menos do que 5 substituições de aminoácido, menos do que 4 substituições de aminoácido, menos do que 3 substituições de aminoácido ou menos do que 2 substituições de aminoácido em relação à região de referência VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, região VL, VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral com uma carga similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Altemativamente, mutações podem ser introduzidas de modo aleatório ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser triados pela atividade biológica para identificar os mutantes que retêm a atividade (por exemplo, a capacidade de ligar um Psl ou PcrV de Pseudomonas}.

[0155] Por exemplo, é possível introduzir mutações somente em regiões de arcabouço ou somente em regiões CDR de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser mutações missense silenciosas ou neutras, isto é, tem nenhum ou pouco efeito em uma capacidade do anticorpo de ligar o antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códon ou melhorar uma produção de anticorpo do hibridoma. Altemativamente, as mutações missense não neutras podem alterar uma capacidade do anticorpo de ligar o antígeno. E provável que a localização das mutações missense mais silenciosas e neutras esteja nas regiões de arcabouço, enquanto que é provável que a localização das mutações missense mais não neutras esteja na CDR, embora isso não seja uma exigência absoluta. Um versado na técnica poderia projetar e testar as moléculas mutantes com as propriedades desejadas tal como nenhuma alteração na atividade de ligação de antígeno ou alteração na atividade de ligação (por exemplo, melhoras na atividade de ligação de antígeno ou mudança na especificidade de anticorpo). Seguindo a mutagênese, a proteína codificada pode ser rotineiramente expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, capacidade de ligar pelo menos um epítopo de Psl ou PcrV de Pseudomonas} pode ser determinada com o uso de conjuntos de procedimentos descritos no presente documento ou modificando-se rotineiramente os conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica.

[0156] Uma modalidade fornece um anticorpo biespecífico que compreende um domínio de ligação de PcrV e Psl de anü-Pseudomonas revelado no presente documento. Em determinadas modalidades, o anticorpo biespecífico contém um primeiro domínio de ligação de Psl e o segundo domínio de ligação de PcrV. Os anticorpos biespecíficos com mais do que duas valências são contemplados. Por exemplo, os anticorpos triespecífícos podem também ser preparados com o uso dos métodos descritos no presente documento. (Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)).

[0157] Uma modalidade fornece um método para produzir um anticorpo biespecífico que utiliza uma única cadeia leve que pode parear com ambos os domínios variáveis de cadeia pesada presentes na molécula biespecífica. Para identificar essa cadeia leve, várias estratégias podem ser empregadas. Em uma modalidade, uma série de anticorpos monoclonais são identificadas para cada antígeno que pode ser alvejado com o anticorpo biespecífico, seguido pela determinação de qual dentre as cadeia leves utilizadas nesses anticorpos pode funcionar quando pareada com a cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos identificados ao segundo alvo. Dessa maneira, uma cadeia leve que pode funcionar com duas cadeias pesadas para permitir a ligação a ambos os antígenos pode ser identificada. Em outra modalidade, as técnicas de exibição, tal como exibição de fago, podem permitir a identificação de uma cadeia leve que pode funcionar com duas ou mais cadeias pesadas. Em uma modalidade, uma biblioteca de fago é construída que compreende um repertório diverso de domínios variáveis de cadeia pesada e um único domínio variável de cadeia leve. Essa biblioteca pode ser adicionalmente utilizada para identificar os anticorpos que se ligam a vários antígenos de interesse. Assim, em determinadas modalidades, os anticorpos identificados compartilharão uma cadeia leve comum.

[0158] Em determinadas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende pelo menos um Fv de cadeia única (scFv). Em determinadas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende dois scFvs. Por exemplo, um scFv pode ser fundido a um ou ambos dentre um polipeptídeo que contém o domínio CH3 contido dentro de um anticorpo. Alguns métodos compreendem produzir uma molécula biespecífica em que uma ou ambas as regiões constantes de cadeia pesada que compreendem pelo menos um domínio CH3 são utilizadas em conjunto com um único domínio Fv de cadeia única para fornecer a ligação de antígeno.

III.POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO

[0159] A revelação é adicionalmente direcionada a polipeptídeos isolados que formam as moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente a Psl e/ou PcrV de Pseudomonas e polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos. As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos conforme revelados no presente documento, compreendem polipeptídeos, por exemplo, sequências de aminoácidos que codificam, por exemplo, regiões de ligação de antígeno específico para Psl e/ou específico para PcrV derivadas das moléculas de imunoglobulina. Um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos "derivada de" uma proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo. Em determinados casos, o polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que é derivada de um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos inicial particular tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica a esta da sequência inicial ou uma porção da mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10 a 20 aminoácidos, pelo menos 20 a 30 aminoácidos, pelo menos 30 a 50 aminoácidos ou que é de outra maneira identificável a um versado na técnica como tendo sua origem na sequência inicial.

[0160] E também revelada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais dentre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 74 conforme mostrado na Tabela 2.

[0161] E adicionalmente revelada uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de VH idêntica ou idêntica exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido a uma ou mais dentre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 74 conforme mostrado na Tabela 2.

[0162] Algumas modalidades incluem uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma VH, em que uma ou mais das regiões VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas a uma ou mais sequências de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 74 conforme mostrado na Tabela 2.

[0163] Adicionalmente revelada é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma VH, em que uma mais das regiões VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 da VH são idênticas a, ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido, a uma ou mais sequências de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 e/ou VHCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 74 conforme mostrado na Tabela 2. Assim, de acordo com essa modalidade a VH compreende um ou mais de uma VHCDR1, VHCDR2, ou VHCDR3 idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais da sequências de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 mostradas na Tabela 3..

[0164] Revelada também é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 conforme mostrado na Tabela 2.

[0165] Algumas modalidades revelam uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de VL idêntica a ou idêntica com exceção de uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido a uma ou mais de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 16 conforme mostrado na Tabela 2.

[0166] Fornecida também é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma VL, em que uma ou mais das regiões de VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas a um ou mais sequências de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 de cadeia leve de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 16 conforme mostrado na Tabela 2.

[0167] Fornecida adicionalmente é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende uma VL, em que uma ou mais das regiões de VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 da VL são idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais sequências de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 e/ou VLCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 16 conforme mostrado na Tabela 2. Assim, de acordo com essa modalidade a VL compreende um ou mais de uma VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3 idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais das sequências de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3 mostradas na Tabela 3.

[0168] Em outras modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas, compreende, consiste essencialmente em ou consiste em sequências de aminoácidos de VH e VL pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idênticas a: (a)SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente,(b) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:2, respectivamente,(c) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 2 , respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente,(e) SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente,(f) SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente,(g) SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente,(h) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; (i) SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou (j) SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 12, respectivamente. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso descrito acima compreende uma VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 e uma VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso descrito acima compreende uma VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e uma VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso descrito acima compreende uma VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: He uma VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0169] Certas modalidades fornecem uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas, que compreende uma VH de imunoglobulina e uma VL de imunoglobulina, em que cada uma compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (CDR1), CDR2 e CDR3, em que a CDR1 DE VH é PYYWT (SEQ ID NO:47), a CDR2 DE VH é YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), a CDR3 DE VH é selecionada a partir do grupo que consiste em ADWDRLRALDI (Psl0096, SEQIDNO:258), AMDIEPHALDI (Psl0225,SEQIDNO:267), ADDPFPGYLDI (Psl0588, SEQ ID NO:268), ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQIDNO:269), ADWDHKHALDI (Psl0337,SEQIDNO:270), ATDEADHALDI (Psl0170, SEQ ID NO:271), ADWSGTRALDI (PsI0304, SEQID NO:272),GLPEKPHALDI(Psl0348,SEQIDNO:273), SLFTDDHALDI (Psl0573, SEQ ID NO:274), ASPGVVHALDI (Psl0574, SEQID NO:275),AHIESHHALDI(Psl0582,SEQIDNO:276), ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277), SQHDLEHALDI (Psl0585, SEQ ID NO:278) e AMPDMPHALDI (Psl0589, SEQ ID NO:279), a CDR1 DE VL é RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), a CDR2 DE VL é GASNLQS (SEQ ID NO:51) e a CDR3 DE VL é selecionada a partir do grupo que consiste em QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280), QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281), QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282), QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52), QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283), SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284), GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285), LQGDLWPLT (Psl0348, SEQ ID NO:286), e QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO:287), em que as CDRs de VH e VL estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0170] Certas modalidades fornecem uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especifícamente a Psl de Pseudomonas, que compreende uma VH de imunoglobulina e uma VL de imunoglobulina, em que cada uma compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (CDR1), CDR2 e CDR3, em que a CDR1 DE VH é PYYWT (SEQ ID NO:47), a CDR2 DE VH é YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), a CDR1 DE VL é RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), a CDR2 DE VL é GASNLQS (SEQ ID NO:51) e a CDR3 DE VH e a CDR3 DE VL compreendem, respectivamente, ADWDRLRALDI (Psl0096, SEQ ID NO:258) e QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280); AMDIEPHALDI (Psl0225, SEQ ID NO:267) e QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281); ADDPFPGYLDI (Psl0588, SEQ ID NO:268) e QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282); ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQ ID NO:269) e a CDR3 DE VL é QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52); ADWDHKHALDI (Psl0337, SEQ ID NO:270) e QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283); ATDEADHALDI (Psl0170, SEQ ID NO:271) e SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284); ADWSGTRALDI (Psl0304, SEQ ID NO:272) e GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285); GLPEKPHALDI (Psl0348, SEQ ID NO:273) e (Psl0348, SEQ ID NO:286); SLFTDDHALDI (PslO573, SEQ ID NO:274) e SEQ ID NO:52; ASPGVVHALDI (Psl0574, SEQ ID NO:275) e SEQ ID NO:52; AHIESHHALD1 (Psl0582, SEQ ID NO:276) e SEQ ID NO:52; ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277) e SEQ ID NO:52; SQHDLEHALDI (PslO585, SEQ ID NO:278) e SEQ ID NO:52; ou AMPDMPHALDI (Psl0589, SEQ ID NO:279) e QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO:287).

[0171] Certas modalidades fornecem uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas, que compreende uma VH de imunoglobulina e uma VL de imunoglobulina, em que a VH compreende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKX1LELI GYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCA RADWDRLRALDIWGQGTMVTVSS, em que XI é G ou C (Psl0096, SEQ ID NO:288) e a VL compreende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQSTGAWNWFGX2GTKVEIK, em que X2 é G ou C (Psl0096, SEQ ID NO:289); em que a VH compreende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR AMDIEPHALDIWGQGTMVTVSS (Psl0225, SEQ ID NO:290) e a VL compreende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKP GKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSDDGFPNFGGGTKVEIK (Psl0225, SEQ ID NO:291); em que a VH compreende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQ PPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARADDPFPGYLDIWGQGTMVTVSS (Psl0588, SEQ ID NO:292) e a VL compreende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI RSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQSDTFPLKFGGGTKVEIK (PslO588, SEQ ID NO:293); em que a VH compreende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSK KQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWNEGRKLDIWGQGTMVTVSS (Psl0567, SEQ ID NO:294) e a VL compreende SEQ ID NO:11; no presente documento a VH compreende QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCT VSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGD TSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDHKHALDIWGQGTMVTV SS (Psl0337, SEQ ID NO:295) e a VL compreende DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIY GASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQDSSSWPLTF GGGTKVEIK (Psl0337, SEQ ID NO:296); em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR ATDEADHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0170, SEQ ID NO:297) e a VL compreende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQK PGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SQSDTFPLTFGGGTKLEIK (Psl0170, SEQ ID NO:298); em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQ PPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAA DTAVYFCARADWSGTRALDIWGQGTLVTVSS (Psl0304, SEQ ID NO:299) e a VL compreende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCWASQS IRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCGQSDAFPLTFGGGTKLEIK (Psl0304, SEQ ID NO:300); em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVA GGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTS KKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARGLPEKPHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0348, SEQ ID NO:301) e a VL compreende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIY GASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGDLWPLTF GGGTKLEIK (Psl0348, SEQ ID NO:302); em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR SLFTDDHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0573, SEQ ID NO:303) e a VL compreende SEQ ID NO:11; em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR ASPGVVHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0574, SEQ ID NO:304) e a VL compreende SEQ ID NO:11; em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR AHIESHHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0582, SEQ ID NO:305) e a VL compreende SEQ ID NO: 11; em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR ATQAPAHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0584, SEQ ID NO:306) e a VL compreende SEQ ID NO: 11; em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR SQHDLEHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0585, SEQ ID NO:307) e a VL compreende SEQ ID NO:11; ou em que a VH compreende EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR AMPDMPHALDIWGQGTLVTVSS (Psl0589, SEQ ID NO:308) e a VL compreende EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKP GKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSLEFPLTFGGGTKLEIK (Psl0589, SEQ ID NO:325).

[0172] Revelado também é um fragmento de Fv de cadeia única de anticorpo isolado (ScFv) que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas (um "ScFv de anti-Psl"), que compreende a fórmula VH-L-VL ou altemativamente VL-L-VH, em que L é uma sequência de ligantes. Em certos aspectos o ligante pode compreender (a) [GGGGS]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, (b) [GGGG]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, ou uma combinação de (a) e (b). Por exemplo, um ligante exemplificative compreende: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:326). Em certas modalidades, o ligante compreende adicionalmente os aminoácidos ala-leu no C-terminal do ligante. Em certas modalidades o ScFv de anti-Psl compreende a sequência deaminoácidosde SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241,SEQID NO:242, SEQIDNO:243,SEQIDNO:244,SEQIDNO:245,SEQID NO:246, SEQIDNO:247,SEQIDNO:248,SEQIDNO:249,SEQID NO:250, SEQIDNO:251,SEQIDNO:252,SEQIDNO:253,SEQID NO:254 ou SEQ ID NO:262.

[0173] Revelado também é um fragmento de Fv de cadeia única de anticorpo isolado (ScFv) que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas (um "ScFv de anti-PcrV"), que compreende a fórmula VH-L-VL ou altemativamente VL-L-VH, em que L é uma sequência de ligantes. Em certos aspectos o ligante pode compreender (a) [GGGGS]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, (b) [GGGG]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, ou uma combinação de (a) e (b). Por exemplo, um ligante exemplificative compreende: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:326). Em certas modalidades o ligante compreende adicionalmente os aminoácidos ala-leu no C-terminal do ligante.

[0174] Revelada também é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada (VH) e/ou região variável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a SEQ ID NO: 216 ou SEQ ID NO: 217.

[0175] Adicionalmente revelada é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas que compreende uma VH, em que uma mais das regiões VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 da VH são idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido, a uma ou mais sequências de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 e/ou VHCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NOs: 218-220 conforme mostrado na Tabela 3. Assim, de acordo com essa modalidade, a VH compreende um ou mais de uma VHCDR1, VHCDR2, ou VHCDR3 idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais da sequências de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 mostradas na Tabela 3.

[0176] Fornecida adicionalmente é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas que compreende uma VL, em que uma ou mais das regiões de VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 da VL são idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais sequências de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 e/ou VLCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NOs: 221-223 conforme mostrado na Tabela 3. Assim, de acordo com essa modalidade a VL compreende um ou mais de uma VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 idênticas a ou idênticas com exceção de quatro, três, duas ou uma substituição de aminoácido a um ou mais das sequências de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 mostradas na Tabela 3.

[0177] Fornecida também é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas que compreende uma VH e uma VL, em que a VH compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:255 e SEQ ID NO:257, e em que a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:256.

[0178] Fornecida adicionalmente é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a PcrV de Pseudomonas que compreende uma VH e uma VL, em que cada uma compreende uma CDR.1, CDR2, e CDR3, em que a CDR1 DE VH é (a) SYAMS (SEQ ID NO:311) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido, a CDR2 DE VH é AISGSGYSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 312) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido, e a VHCDR3 é EYSISSNYYYGMDV (SEQ ID NO: 313) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; ou (b) em que a CDR1 DE VL é WASQGISSYLA (SEQ ID NO:314) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido, a CDR2 DE VL é AASTLQS (SEQ ID NO:315) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido, e a CDR3 DE VL é QQLNSSPLT (SEQ ID NO:316) ou uma variante disso que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácido; ou (c) uma combinação de (a) e (b); em que as CDRs de VH e VL estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Em certos aspectos dessa modalidade, (a) a VH compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ou 100% idênticas a SEQ ID NO:317, (b) a VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ou 100% idênticas a SEQ ID NO:318; ou (c) uma combinação de (a) e (b).

[0179] Revelada também é uma molécula de ligação biespecífica isolada, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente tanto a Psl de Pseudomonas quanto a PcrV de Pseudomonas que compreende uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada (VH) e/ou região variável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO:229, ou SEQ ID NO: 235.

[0180] Em certas modalidades, um anticorpo biespecífico conforme revelado no presente documento tem a estrutura de BS1, BS2, BS3, ou BS4, tudo conforme mostrado na Figura 17. Em certos anticorpos biespecíficos revelados no presente documento, o domínio de ligação que se liga especifícamente a Psl de Pseudomonas compreende uma molécula de ScFv de anti-Psl. Em outros aspectos o domínio de ligação que se liga especifícamente a Psl de Pseudomonas compreende uma cadeia pesada e cadeia leve convencionais. De modo similar em certos anticorpos biespecíficos revelados no presente documento o domínio de ligação que se liga especifícamente a PcrV de Pseudomonas compreende uma molécula de ScFv de anti-PcrV. Em outros aspectos o domínio de ligação que se liga especifícamente a PcrV de Pseudomonas compreende uma cadeia pesada e cadeia leve convencionais.

[0181] Em certos aspectos um anticorpo biespecífico conforme revelado no presente documento tinha a estrutura de BS4, revelada em detalhes no Pedido Provisório n2 US 61/624.651, depositado em 16 de abril de 2012 e no Pedido Internacional n2 PCT/US2012/ 63639, depositado 6 de novembro de 2012 (número de registro legal AEMS-115WO1, intitulado “MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF”), que são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Por exemplo, esta revelação fornece um anticorpo biespecífico em que uma molécula de ScFv de anti-Psl é inserida na região de dobradiça de cada cadeia pesada de um anticorpo anti-PcrV ou fragmento disso.

[0182] Esta revelação fornece uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada de anticorpo e uma cadeia leve de anticorpo, em que a cadeia pesada de anticorpo compreende a fórmula VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3, em que CHI é um domínio de região constante de cadeia pesada 1, Hl é um primeiro fragmento de região de dobradiça de cadeia pesada, LI é um primeiro ligante, S é uma molécula de ScFv de anti-PcrV, L2 é um segundo ligante, H2 é um segundo fragmento de região de dobradiça de cadeia pesada, CH2 é um domínio de região constante de cadeia pesada 2 e CH3 é um domínio de região constante de cadeia pesada 3. Em certos aspectos, a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:257 ou SEQ ID NO:317. Em certos aspectos LI e L2 são iguais ou diferentes e independentemente compreendem (a) [GGGGS]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, (b) [GGGG]n, em que n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 ou uma combinação de (a) e (b). Em certas modalidades, o Hl compreende EPKSC (SEQ ID NO:320), e H2 compreende DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:321).

[0183] Em certos aspectos, S compreende uma molécula de ScFv de anti-Psl que tem asequência de aminoácidos de SEQ ID NO:240,SEQID NO:241,SEQIDNO:242,SEQIDNO:243,SEQIDNO:244,SEQID NO:245,SEQIDNO:246,SEQIDNO:247,SEQIDNO:248,SEQID NO:249,SEQIDNO:250,SEQIDNO:251,SEQIDNO:252,SEQID NO:253, SEQ ID NO:254 ou SEQ ID NO:262, ou qualquer combinação de duas ou mais dessas sequências de aminoácidos.

[0184] Em aspectos adicionais, CH2-CH3 compreende (SEQ ID NO:322), em que XI é M ou Y, X2 é S ou T, e X3 é T ou E. Em aspectos adicionais a cadeia leve de anticorpo compreende VL-CL, em que CL é uma região constante de kappa de cadeia leve de anticorpo ou uma região constante de lambda de cadeia leve de anticorpo. Em aspectos adicionais, VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:256 ou SEQ ID NO:318. CL pode compreender, por exemplo, a sequência de aminoácidos deSEQ IDNO:323.

[0185] Fornecida adicionalmente é uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo biespecífico que se liga especificamente tanto a Psl de Pseudomonas quanto a PcrV de Pseudomonas que compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:264, e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:263.

[0186] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser um fragmento de Fv de cadeia única em tandem, que contém dois fragmentos de scFv diferentes (isto é, V2L2 e W4) covalentemente ligado juntos por um ligante (por exemplo, um polipeptídeo ligante). (Ren-Heidenreich et al. Cancer 700:1095 a 1.103 (2004); Kom et al. J Gene Med 6:642 a 651 (2004)). Em algumas modalidades, o ligante pode conter, ou ser, toda ou parte de uma região constante de polipeptídeo de cadeia pesada tal como um domínio de CHI. Em algumas modalidades, os dois fragmentos de anticorpo podem ser covalentemente ligados juntos por meio de um ligante de poliglicina-serina ou poliserina-glicina conforme descrito, por exemplo, nas Patentes n~ 7.112.324 e 5.525.491, respectivamente, os métodos para gerar anticorpos de scFv em tandem biespecíficos são descritos em, por exemplo, Maletz et al. Int J Cancer 93:409 a 416 (2001); e Honemann et al. Leukemia 18:636 a 644 (2004). Altemativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares" conforme descrito em, por exemplo, Zapata et al. Protein Eng. 8:1.057 a 1.062 (1995). Brevemente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno.

[0187] A revelação também engloba formas variantes de anticorpos biespecíficos tais como as moléculas de imunoglobulina variáveis duplas tetravalentes (DVD-Ig) descritas em Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1.290 a 1.297. As moléculas DVD-Ig são projetadas de modo que dois domínios variáveis de cadeia leve (VL) de dois anticorpos parentes diferentes sejam ligados em tandem diretamente ou por meio de ligante curto por conjuntos de procedimentos de DNA recombinante, seguidos pelo domínio constante de cadeia leve. Por exemplo, o polipeptídeo de cadeia leve DVD-Ig pode conter em tandem: (a) a VL de V2L2; e (b) a VL de WapR-004. De modo similar, a cadeia pesada compreende os dois domínios variáveis de cadeia pesada (VH) diferentes ligados em tandem, seguidos pelo domínio constante CHI e pela região Fc. Por exemplo, o polipeptídeo de cadeia pesada DVD-Ig pode conter em tandem: (a) a VH de V2L2; e (b) a VH de WapR- 004. Nesse caso, a expressão das duas cadeias em uma célula resulta em um heterotetrâmero que contém quatro sítios de combinação de antígeno, dois que se ligam especificamente a V2L2 e dois que se ligam especificamente a Psl. Os métodos para gerar moléculas DVD-Ig a partir de dois anticorpos parentes são adicionalmente descritos em, por exemplo, Publicações PCT n~ WO 2008/024188 e WO 2007/024715.

[0188] Em certas modalidades, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso conforme descrito no presente documento se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) no maior do que 5 x 10'2 M, 10’2 M, 5 x 10'3 M, 10'3 M, 5 x 10’4 M, 10’4 M, 5 x 10’5 M, 10’5 M, 5 x IO'6 M, IO’6 M, 5 x 10'7 M, 10’7 M, 5 x 10'8 M, IO’8 M, 5 x 10'9 M, 10’9 M, 5 x IO'10 M, IO'10 M, 5 x 10’11 M, 10'11 M, 5 x 10'12 M, 10'12 M, 5 x 10‘13 M, 10’13 M, 5 x IO'14 M, IO'14 M, 5 x 10'15 M ou 1O',5M.

[0189] Em modalidades específicas, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso conforme descrito no presente documento se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) em uma faixa de cerca de 1 x 10'10 a cerca de 1 x 10’6 M. Em uma modalidade, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso conforme descrito no presente documento se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, com uma afinidade caracterizada por um KD de cerca de 1,18 x 10' M, conforme determinado pelo ensaio de ligação OCTET1" descrito no presente documento. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso conforme descrito no presente documento se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, com uma afinidade caracterizada por um KD de cerca de 1,44 x 10'7 M, conforme determinado pelo ensaio de ligação OCTET® descrito no presente documento.

[0190] Algumas modalidades incluem a molécula de ligação isoladas por exemplo, um anticorpo ou fragmento disso conforme descrito acima, que (a) pode inibir anexação de Pseudomonas aeruginosa a células epiteliais, (b) pode promover OPK de P. aeruginosa ou (c) pode inibir anexação de P. aeruginosa a células epiteliais e pode promover OPK de P. aeruginosa.

[0191] Em algumas modalidades, a molécula de ligação isolada por exemplo, um anticorpo ou fragmento disso conforme descrito acima, em que a inibição máxima de anexação de P. aeruginosa a células epiteliais é alcançada em uma concentração de anticorpo de cerca de 50 μg/ml ou menos, 5,0 μg/ml ou menos, ou cerca de 0,5 μg/ml ou menos, ou em uma concentração de anticorpo na faixa de cerca de 30 μg/ml a cerca de 0,3 μg/ml ou em uma concentração de anticorpo de cerca de 1 μg/ml, ou em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,3 μg/ml.

[0192] Certas modalidades incluem a molécula de ligação isolada por exemplo, um anticorpo ou fragmento disso conforme descrito acima, em que o EC50 de OPK é menor que cerca de 0,5 μg/ml, menor que cerca de 0,05 μg/ml ou menor que cerca de 0,005 μg/ml ou em que o EC50 de OPK se encontra na faixa de cerca de 0,001 μg/ml a cerca de 0,5 μg/ml ou em que o EC50 de OPK se encontra na faixa de cerca de 0,02 μg/ml a cerca de 0,08 μg/ml ou em que o EC50 de OPK se encontra na faixa de cerca de 0,002 μg/ml a cerca de 0,01 μg/ml ou em que o EC50 de OPK é menor que cerca de 0,2 μg/ml ou em que o EC50 de OPK é menor que cerca de 0,02 μg/ml. Em certas modalidades, uma molécula de ligação de anti-Psl de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado disso descrito no presente documento se liga especifícamente ao mesmo epítopo de Psl que o anticorpo monoclonal WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 ou Cam-005, ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar a Psl de Pseudomonas. O WapR-004RAD é idêntico a WapR-004 com a exceção de uma substituição de aminoácido G98A da VH sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0193] Algumas modalidades incluem mutantes de WapR-004 (W4) que compreendem uma sequência de aminoácidos de molécula de scFv-Fc idêntica a ou idêntica com exceção de uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido a uma ou mais de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102,SEQID NO:103, SEQID NO:104,SEQID NO:105, SEQ ID NO: 106,SEQID NO:107, SEQID NO:108,SEQID NO:109, SEQ ID NO: 110,SEQID NO:111, SEQID NO:112,SEQID NO:113, SEQ ID NO: 114,SEQID NO:115, SEQID NO:116,SEQID NO:117, SEQ ID NO: 118,SEQID NO:119, SEQID NO:120,SEQID NO:121, SEQ ID NO: 122,SEQID NO:123, SEQID NO:124,SEQID NO:125, SEQ ID NO: 126,SEQID NO:127, SEQID NO:128,SEQID NO:129, SEQ ID NO: 130,SEQID NO:131, SEQID NO:132,SEQID NO:133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ou SEQ ID NO: 146.

[0194] Outras modalidades incluem mutantes de WapR-004 (W4) que compreendem uma sequência de aminoácidos de molécula de scFv-Fc pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idênticas a uma ou mais de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ IDNO:101, SEQID NO:102,SEQID NO:103,SEQIDNO: 104,SEQ IDNO:105, SEQID NO:106,SEQID NO:107,SEQIDNO: 108,SEQ IDNO:109, SEQID NO:110,SEQID NO:111,SEQIDNO: 112,SEQ IDNO:113, SEQID NO:114,SEQID NO:115,SEQIDNO: 116,SEQ IDNO:117, SEQID NO:118,SEQID NO:119,SEQIDNO: 120,SEQ IDNO:121, SEQID NO:122,SEQID NO:123,SEQIDNO: 124,SEQ IDNO:125, SEQID NO:126,SEQID NO:127,SEQIDNO: 128,SEQ IDNO:129, SEQID NO:130,SEQID NO:131,SEQIDNO: 132,SEQ IDNO:133, SEQID NO:134,SEQID NO:135,SEQIDNO: 136,SEQ IDNO:137, SEQID NO:138,SEQID NO:139,SEQIDNO: 140,SEQ IDNO:141, SEQID NO:142,SEQID NO:143,SEQIDNO: 144, SEQ ID NO: 145; ou SEQ ID NO: 146.

[0195] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de anti-Psl de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado disso descrito no presente documento se liga especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal WapR-001, WapR-002, ou WapR-003 ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar a Psl dePseudomonas.

[0196] Em certas modalidades, uma molécula de ligação de anti-Psl de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado disso descrito no presente documento se liga especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal WapR-016 ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar a Psl de Pseudomonas. TABELA 2: Sequências de aminoácidos de VH e VL de referência*

*As sequências ce aminoácidos de VH e CDR1 DE VL, CDR2 e CDR3 são subinhadasTABELA 3: Sequências de aminoácidos de VH e CDR1 DE VL, CDR2 e CDR3 de referencia

[0197] Em certas modalidades, um anti-PcrV de Pseudomonas molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado disso descrito no presente documento se liga especificamente ao mesmo epítopo de PcrV que o anticorpo monoclonal V2L2 e/ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar a PcrV de Pseudomonas.

[0198] Por exemplo, em certos aspectos, a molécula de ligação de anti-PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma compreende V2L2-GL e/ou V2L2-MD.

[0199] Em certas modalidades, uma molécula de ligação de anti-PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivada da mesma descrita no presente documento se liga especifícamente ao mesmo epitopo PcrV como anticorpo monoclonal 29D2 e/ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar ao PcrV de Pseudomonas.

[0200] Qualquer molécula de ligação PcrV e/ou Psl de Pseudomonas e/ou, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados da mesma descrita no presente documento podem incluir adicionalmente polipeptídeos adicionais, por exemplo, um peptídeo sinal para direcionar a secreção do polipeptídeo codificado, regiões constantes de anticorpo conforme descrito no presente documento, ou outros polipeptídeos heterólogos conforme descrito no presente documento. Adicionalmente, as moléculas de ligação ou fragmentos das mesmas da descrição incluem fragmentos de polipeptídeo conforme descrito alhures. Adicionalmente, moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas descritas no presente documento podem ser polipeptídeos de fusão, fragmentos Fab, scFvs ou outra derivados, conforme descrito no presente documento.

[0201] Além disso, conforme descrito com mais detalhe em outras partes no presente documento, a revelação inclui composições que compreendem moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas descritas no presente documento.

[0202] Deve-se entender também por um versado na técnica que as moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas descritas no presente documento podem ser modificadas de modo que as mesmas variem em sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de ocorrência natural a partir do qual os mesmos foram derivados. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos ou polipeptídeo derivados de uma proteína designada pode ser similar, por exemplo, ter uma identidade de certa porcentagem à sequência inicial, por exemplo, o mesmo pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico à sequência inicial.

[0203] Conforme conhecido na técnica, a "identidade de sequência" entre dois polipeptídeos é determinada comparando a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. Quando discutido no presente documento, se qualquer polipeptídeo particular é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo pode ser determinado com o uso de métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica tal como, mas sem limitação, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 5371 1). BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482 a 489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento sequencial para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência, os parâmetros são estabelecidos, evidentemente, de modo que a porcentagem de identidade seja calculada sobre o comprimento inteiro da sequência de polipeptídeo de referência e que lacunas em homologia de até 5 % do número total de aminoácidos na sequência de referência são permitidos.

[0204] A porcentagem de “identidade de sequência” também pode ser determinada comparando duas sequências favoravelmente alinhadas sobre uma janela de comparação. A fim de alinhar favoravelmente as sequências para comparação, a porção de uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções denominadas lacunas enquanto a sequência de referência é mantida constante. Um alinhamento favorável é aquele alinhamento que, mesmo com lacunas, produz o maior número possível de posições “idênticas” entre as sequências de referência e de comparação. A porcentagem de “identidade de sequência” entre duas sequências pode ser determinada com o uso da versão do programa “BLAST 2 Sequences” que estava disponível junto a National Center for Biotechnology Information em 1 de setembro de 2004, cujo programa incorpora os programas BLASTN (para comparação de sequência nucleotídica) e BLASTP (para comparação de sequência polipeptídica), cujos programas são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(12):5873 a 5877, 1993). Ao utilizar “BLAST 2 Sequences,” parâmetros que eram parâmetros padrão em 1 de setembro de 2004, podem ser usados para tamanho de palavra (3), penalidade de lacuna aberta (11), penalidade de lacuna de extensão (1), desaparecimento de lacuna (50), valor esperado (10) e qualquer outro parâmetro exigido incluindo mas sem limitação, opção de matriz.

[0205] Além disso, substituições, deleções ou inserções de nucleotídeo ou aminoácido que resultam em substituições conservadoras ou mudanças em regiões de aminoácido "não essenciais" podem ser feitas. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou aminoácido derivada de uma proteína designada pode ser idêntica à sequência inicial exceto por uma ou mais substituições, inserções ou deleções individuais de aminoácido, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinte ou mais substituições, inserções ou deleções individuais de aminoácido. Em certas modalidades, uma sequência de polipeptídeo ou aminoácido derivada a partir de uma proteína designada tem um a cinco, um a dez, um a quinze ou um a vinte substituições, inserções ou deleções individuais de aminoácido relativas à sequência inicial.

[0206] Uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma descrita no presente documento pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma proteína de fusão. As proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno de imunoglobulina com pelo menos um local de ligação alvo e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção com a qual o mesmo não é naturalmente ligado por natureza. As sequências de aminoácido podem normalmente existir em proteínas separadas que são trazidas juntas no polipeptídeo de fusão ou as mesmas podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, através de síntese química ou criando e traduzindo um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeo são codificadas na relação desejada.

[0207] O termo "heterólogo", conforme aplicado a um polinucleotídeo, polipeptídeo ou outra porção química significa que o polinucleotídeo, polipeptídeo ou outra porção química é derivada a partir de uma entidade distinta daquela do resto da entidade a qual a mesma está sendo comparada. Em um exemplo não limitante, um "polipeptídeo heterólogo" a ser fundido a uma molécula de ligação, por exemplo, um derivado, variante ou fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo da mesma é derivado a partir de um polipeptídeo de não imunoglobulina da mesma espécie ou um polipeptídeo de imunoglobulina ou não imunoglobulina de uma espécie diferente.

IV. CONJUGADOS DE ANTICORPO E PROTEÍNAS DE FUSÃO

[0208] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas podem ser administradas múltiplas vezes na forma conjugada. Em ainda outra modalidade, as moléculas de ligação de Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas podem ser administradas na forma não conjugada, depois na forma conjugada ou vice versa.

[0209] Em modalidades específicas, as moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas podem ser conjugadas a um ou mais agentes antimicrobianos, por exemplo, Polimixina B (PMB). A PMB é um pequeno antibiótico de lipopeptídeo aprovado para tratamento de infecções gram- negativas resistentes a múltiplas drogas. Além da atividade bactericida da mesma, a PMB liga lipopolissacarídeo (LPS) e neutraliza os efeitos pró- inflamatórios do mesmo. (Dixon, R.UM. & Chopra, I. J Antimicrob Chemother 18, 557 a 563 (1986)). Acredita-se que o LPS contribua significativamente para inflamação e o início de sepse gram-negativa. (Guidet, B., et al., Chest 106, 1194-1201 (1994)). Os conjugados de PMB para moléculas portadoras foram mostrados neutralizar LPS e mediar proteção em modelos animais de endotoxemia e infecção. (Drabick, J.J., et al. Antimicrob Agents Chemother 42, 583 a 588 (1998)). E também revelado um método para prender uma ou mais moléculas PMB a resíduos de cisteína introduzidos na região Fc de anticorpos monoclonais (mAb) da revelação. Por exemplo, os conjugados de Cam-003-PMB retiveram ligação específica mediada por mAb para P. aeruginosa e também retiveram atividade OPK. Além disso, os conjugados mAb-PMB ligaram e neutralizaram LPS in vitro. Em modalidades específicas, as moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas podem ser combinadas com antibióticos (por exemplo, Ciprofloxacina, Meropeném, Tobramicina, Aztreonam).

[0210] Em certas modalidades, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma descrita no presente documento pode compreender uma sequência de aminoácido heterológo ou uma ou mais outras porções químicas não comumente associadas a um anticorpo (por exemplo, um agente antimicrobiano, um agente terapêutico, um pró-fármaco, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um lipídeo, um modificador de resposta biológica, agente farmacêutico, uma linfocina, um anticorpo ou fragmento heterólogo disso, uma etiqueta detectável, polietileno glicol (PEG) e uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos ditos agentes). Em modalidades adicionais, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de antiPseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma pode compreender uma etiqueta detectável selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta quimioluminescente, uma etiqueta bioluminescente, uma etiqueta radioativa ou uma combinação de duas ou mais de qualquer uma das ditas etiquetas detectáveis.

V. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE CODIFICAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEOS

[0211] São também fornecidos, no presente documento, moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas descritas no presente documento. .

[0212] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74 ou SEQ ID NO:216 conforme mostrado na Tabela 2.

[0213] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) de SEQ ID NO:257 ou SEQ ID NO:259. Por exemplo as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:261 e SEQ ID NO:: 259, respectivamente.

[0214] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos VH idêntica a, ou idêntica exceto por um, dois, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido para um ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74 ou SEQ ID NO:216 conforme mostrado na Tabela 2.

[0215] A modalidade adicional fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica um VH, em que uma ou mais das regiões VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 do VH são idênticas a, ou idênticas exceto por quatro, três, dois ou uma substituição de aminoácido, para uma ou mais sequências de aminoácidos VHCDR1, VHCDR2 e/ou VHCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74, ou SEQ ID NO:216 conforme mostrado na Tabela 2.

[0216] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas que compreende um VH, em que um ou mais das regiões VHCDR1, VHCDR2 ou VHCDR3 do VH são idênticas a, ou idênticas exceto por quatro, três, dois ou uma substituição de aminoácido, para uma ou mais sequências de aminoácidos de cadeia pesada de referência VHCDR1, VHCDR2 e/ou VHCDR3 de uma ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 74 conforme mostrado na Tabela 2.

[0217] Uma modalidade adicional fornece uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que compreende o VH codificado pelo polinucleotídeo que se liga específica ou preferencialmente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas.

[0218] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:217 conforme mostrado na Tabela 2.

[0219] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina de SEQ ID NO:256, por exemplo, a sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:260.

[0220] Uma modalidade adicional fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos VL idêntica a, ou idêntica exceto por um, dois, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido para uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO:217 conforme mostrado na Tabela 2.

[0221] Outra modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica um VL, em que uma ou mais das regiões VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 do VL são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas a uma ou mais sequências de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 de cadeia leve de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO:217 conforme mostrado na Tabela 2.

[0222] Uma modalidade adicional fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso que se liga especificamente ao Psl de Pseudomonas que compreende um VL, em que uma ou mais das regiões VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3 do VL são idênticas a ou idênticas exceto por quatro, três, dois, ou uma substituição de aminoácido, para uma ou mais sequências de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 e/ou VLCDR3 de cadeia pesada de referência de uma ou mais de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:217 conforme mostrado na Tabela 2.

[0223] Em outra modalidade, moléculas de ligação isoladas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que compreende o VL codificado pelo polinucleotídeo ligam específica ou preferencialmente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas.

[0224] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma molécula scFv incluindo um VH e um VL, em que a scFv é pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais de SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70 conforme mostrado na Tabela 4.TABELA 4: Sequências de ácido nucleico de scFv de referência

[0225] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno disso codificado por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, que se liga especificamente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, compreende, consiste essencialmente em ou consiste em sequências de aminoácidos VH e VL pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas a: (a) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, (c) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 2 , respectivamente, (d) SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 , respectivamente, (e) SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, (f) SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, (g) SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 , respectivamente, (h) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; (i) SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou (j) SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 12 , respectivamente.

[0226] Em certas modalidades, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso codificada por um ou mais do polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não maior do que 5 x 10’2 M, 10’2 M, 5 x 10’’ M, 10'3 M, 5 x 10'4 M, 10'4 M, 5 x 10'5 M, 10'5 M, 5 x IO’6 M, 10’6 M, 5 x IO’7 M, 10'7 M, 5 x 10'8 M, 10'8 M, 5 x IO’9 M, 10'9 M, 5 x IO'10 M, IO'10 M, 5 x 10’11 M, IO’11 M, 5 x IO'12 M, 10'12 M, 5 x 10'13 M, 10'13 M, 5 x 10'14 M, IO'14 M, 5x 1(T15M, OU 1O'15M.

[0227] Em modalidades específicas, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) em uma faixa de cerca de 1 x 10'l(l a cerca de 1 x 10'6 M. Em uma modalidade, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, com uma afinidade caracterizada por uma KD de cerca de 1,18 x 10' M, conforme determinado pelo ensaio de ligação OCTET® descrito no presente documento. Em outra modalidade, uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno disso codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, com uma afinidade caracterizada por uma KD de cerca de 1,44 x 10' M, conforme determinado pelo ensaio de ligação OCTET descrito no presente documento.

[0228] Em certas modalidades, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao mesmo epitopo Psl como anticorpo monoclonal WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 ou Cam-005 ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar ao Psl de Pseudomonas', e/ou se liga especificamente ao mesmo epitopo PcrV como anticorpo monoclonal V2L2, ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar ao PcrV de Pseudomonas. WapR-004RAD é idêntico ao WapR-004 exceto por uma substituição de ácido nucleico G293C da sequência de ácido nucleico VH que codifica a sequência de aminoácidos VH de SEQ ID NO:11 (uma substituição do nucleotídeo na porção de codificação de VH de SEQ ID NO:71 na posição 317). A sequência de ácido nucleico que codifica o WapR-004RAD VH é apresentada como SEQ ID NO 76.

[0229] Algumas modalidades fornecem um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de molécula scFv- Fc mutante W4 idêntica a, ou idêntica exceto por um, dois, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido para uma ou mais de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ IDNO:102,SEQIDNO:103,SEQID NO:104,SEQID NO: 105, SEQ IDNO:106,SEQIDNO:107,SEQID NO:108,SEQID NO: 109, SEQ IDNO:110,SEQIDNO:111,SEQID NO:112,SEQID NO: 113, SEQ IDNO:114,SEQIDNO:115,SEQID NO:116,SEQID NO: 117, SEQ IDNO:118,SEQIDNO:119,SEQID NO:120,SEQID NO: 121,SEQIDNO:122, SEQ ID NO:123,SEQID NO:124,SEQ ID NO: 125,SEQIDNO:126, SEQ ID NO:127,SEQID NO:128,SEQ ID NO: 129,SEQIDNO:130, SEQ ID NO:131,SEQID NO:132,SEQ ID NO: 133,SEQIDNO:134, SEQ ID NO:135,SEQID NO:136,SEQ ID NO: 137,SEQIDNO:138, SEQ ID NO:139,SEQID NO:140,SEQ ID NO: 141,SEQIDNO:142, SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO: 145; ou SEQ ID NO: 146.

[0230] Outras modalidades fornecem um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de molécula scFv-Fc mutante W4 pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais de: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ IDNO:100, SEQ ID NO:101,SEQID NO:102,SEQID NO:103, SEQ IDNO:104, SEQ ID NO:105,SEQID NO:106,SEQID NO:107, SEQ IDNO:108, SEQ ID NO:109,SEQID NO:110,SEQID NO:111, SEQ IDNO:112, SEQ ID NO:113,SEQID NO:114,SEQID NO:115, SEQ IDNO:116, SEQ ID NO:117,SEQID NO:118,SEQID NO:119, SEQ IDNO:120, SEQ ID NO:121,SEQID NO:122,SEQID NO:123, SEQ IDNO:124, SEQ ID NO:125,SEQID NO:126,SEQID NO:127, SEQ IDNO:128, SEQ ID NO:129,SEQID NO:130,SEQID NO:131, SEQ IDNO:132, SEQ ID NO:133,SEQID NO:134,SEQID NO:135, SEQ IDNO:136, SEQ ID NO:137,SEQID NO:138,SEQID NO:139, SEQ IDNO:140, SEQ ID NO:141,SEQID NO:142,SEQID NO:143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ou SEQ ID NO: 146.

[0231] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica uma molécula scFv-Fc mutante W4, em que o ácido nucleico é pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntico a uma ou mais de SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, ou SEQ ID NO: 152, SEQ É NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO:155,SEQIDNO:156,SEQ IDNO:157,SEQ IDNO:158, SEQ ID NO:159,SEQIDNO:160,SEQ IDNO:161,SEQ IDNO:162, SEQ ID NO:163,SEQIDNO:164,SEQ IDNO:165,SEQ IDNO:166, SEQ ID NO:167,SEQIDNO:168,SEQ IDNO:169,SEQ IDNO:170, SEQ ID NO:171,SEQIDNO:172,SEQ IDNO:173,SEQ IDNO:174, SEQ ID NO:175,SEQIDNO:176,SEQ IDNO:177,SEQ IDNO:178, SEQ ID NO:179,SEQIDNO:180,SEQ IDNO:181,SEQ IDNO:182, SEQ ID NO:183,SEQIDNO:184,SEQ IDNO:185,SEQ IDNO:186, SEQ ID NO:187,SEQIDNO:188,SEQ IDNO:189,SEQ IDNO:190, SEQ ID NO:191,SEQIDNO:192,SEQ IDNO:193,SEQ IDNO:194, SEQ ID NO:195,SEQIDNO:196,SEQ IDNO:197,SEQ IDNO:198, SEQ ID NO:199,SEQIDNO:200,SEQ IDNO:201,SEQ IDNO:202, SEQ ID NO:203,SEQIDNO:204,SEQ IDNO:205,SEQ IDNO:206, SEQ ID NO:207,SEQIDNO:208,SEQ IDNO:209,SEQ IDNO:210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214; ou SEQ ID NO: 215.

[0232] Uma modalidade fornece um polinucleotídeo isolado que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo V2L2, em que o ácido nucleico é pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntico a uma ou mais de SEQ ID NO: 238 ou SEQ ID NO: 239.

[0233] Em outras modalidades, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao mesmo epitopo como anticorpo monoclonal WapR-001, WapR-002 ou WapR-003, ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar ao Psl de Pseudomonas.

[0234] Em certas modalidades, uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anú-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma codificada por um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, se liga especificamente ao mesmo epitopo como anticorpo monoclonal WapR-016, ou irá inibir competitivamente tal anticorpo monoclonal de se ligar ao Psl de Pseudomonas.

[0235] A revelação também inclui fragmentos dos polinucleotídeos conforme descrito alhures no presente documento. Adicionalmente, polinucleotídeos que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos Fab e outros derivados, conforme descrito no presente documento, também são fornecidos.

[0236] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência nucleotídica do anticorpo é conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 77:242 (1994)), que, de modo conciso, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição que contêm porções da sequência que codifica o anticorpo, abrandamento e aglutinação desses oligonucleotídeos e, então, amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[0237] Altemativamente, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma pode ser gerada a partir de ácido nucleico a partir de uma fonte adequada. Se um clone que contém um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser sintetizado quimicamente ou obtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, preferencialmente poli A+RNA, isolada de qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo ou tal como células hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) através de amplificação PCR com o uso de iniciadores sintéticos hibridizáveis às terminações 3' e 5' da sequência ou clonando com o uso de uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone cDNA de uma biblioteca cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem, então, ser clonados em vetores de clonagem replicáveis com o uso de qualquer método bem conhecido na técnica.

[0238] Uma vez que a sequência nucleotídica e sequência de aminoácidos correspondente de uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma é determinada, a sequência nucleotídica da mesma pode ser manipulada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências nucleotídicas, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese direcionada ao local, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), que são, ambas, incorporadas a título de referência no presente documento na totalidade das mesmas), para gerar anticorpos que têm uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido.

[0239] Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de artà-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma pode ser composta de qualquer poliribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma pode ser composta de DNA de filamento único e duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento único e filamento duplo, RNA de filamento único e duplo, e RNA que é mistura de regiões de filamento único e duplo, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de filamento único ou, mais tipicamente, de filamento duplo ou uma mistura de regiões de filamento único e duplo. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma pode ser composto de regiões de filamento triplo que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma também pode conter uma ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou para outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, tritiladas e bases incomuns tal como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA; desse modo, "polinucleotídeo" abarca formas modificadas química, enzimática ou metabolicamente.

[0240] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção de cadeia pesada de imunoglobulina ou porção de cadeia leve) pode ser criado introduzindo uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo para a sequência nucleotídica da imunoglobulina de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas através de técnicas padrão, tal como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácido conservador são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais.

VI.EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO

[0241] Conforme é bem conhecido, RNA pode ser isolado das células hibridomas originais ou de outras células transformadas através de técnicas padrão, tal como extração e precipitação de guanidinio isotiocianato seguido de centrifugação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA pode ser isolado do RNA total através de técnicas padrão tal como cromatografia em oligo dT celulose. Técnicas adequadas são familiares na técnica.

[0242] Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas da molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma podem ser feitos, tanto simultâneo quanto separadamente, com o uso de transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo com métodos bem conhecidos. PCR pode ser iniciado através de iniciadores de região constante de consenso ou por iniciadores mais específicos com base no DNA de cadeia leve e pesada publicado e sequências de aminoácidos. Conforme discutido acima, PCR também pode ser usado para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpo. Nesse caso, as bibliotecas podem ser protegidas por iniciadores de consenso ou sondas homólogas maiores, tal como sondas de região constante de camundongo.

[0243] DNA, tipicamente DNA plasmídeo, pode ser isolado das células com o uso de técnicas conhecidas na técnica, com restrição mapeada e sequenciado de acordo com técnicas padrão bem conhecidas estabelecidas em detalhes, por exemplo, nas referências antecedentes relacionadas às técnicas de DNA recombinante. Evidentemente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente revelação em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise subsequente.

[0244] Seguindo a manipulação do material genético isolado para fornecer uma molécula de ligação Psl e/ou PcrV de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma da revelação, os polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudo mo nas, são tipicamente inseridos em um vetor de expressão para a introdução em células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de anü-Pseudomonas.

[0245] A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula-alvo descrita no presente documento, por exemplo, Psl e/ou PcrV, requer a construção de um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um anticorpo molécula ou uma cadeia pesada ou leve de uma anticorpo, ou porção do mesmo (que contém o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da revelação tenha sido obtido, o vetor para a produção do anticorpo molécula pode ser produzido através de tecnologia de DNA recombinante com o uso de conjuntos de procedimentos bem conhecidos na técnica. Assim, métodos para o preparo de uma proteína através da expressão de um polinucleotídeo que contém um anticorpo que codifica sequência de nucleotídeos são descritos no presente documento. Métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contém sequências de codificação de anticorpo e sinais de controle traducional e transcricional apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, in vitro conjunto de procedimentos de DNA recombinante, conjuntos de procedimentos sintéticos e recombinação genética in vivo. A revelação fornece, assim, vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo da revelação, ou uma cadeia pesada ou leve dos mesmos, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligados operacionalmente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (consulte, por exemplo, o Pedido PCT n2 WO 86/05807; o Pedido PCT n2 WO 89/01036; e a Patente n2 U.S. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor for expressão de toda a cadeia pesada ou leve.

[0246] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado no presente documento para significar vetores usados em conformidade com a presente revelação como um veículo para introduzir em e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Conforme conhecido por aqueles versados na técnica, tais vetores podem ser facilmente selecionados a partir do grupo que consiste em plasmídeos, fagos, vírus e retrovirus. Em geral, vetores compatíveis com a presente revelação compreenderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a habilidade de entrar e/ou se replicar em células eucarióticas ou procarióticas.

[0247] Para os fins desta revelação, vários sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animal tal como vírus do papiloma bovino, vírus do polioma, adenovirus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovirus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com locais internos de ligação de ribossomo. Além disso, células que integraram o DNA nos cromossomos das mesmas podem ser selecionadas introduzindo-se um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transferidas. O marcador pode proporcionar a prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como cobre. O gene de marcador selecionável pode ser diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula através de cotransformação. Elementos adicionais também podem ser necessários para a síntese óptima de mRNA. Esses elementos podem incluir sequências de sinal, sinais de união, bem como promotores transcricionais, acentuadores e sinais de terminação.

[0248] Em algumas modalidades os genes de região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão juntamente com os genes de região constante de cadeia pesada e leve (por exemplo, humanos) sintéticos conforme discutido acima. Evidentemente, qualquer vetor de expressão que tem a capacidade de suscitar a expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente revelação. Exemplos de vetores adequados incluem, mas sem se limitar, os plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl e pZeoSV2 (disponíveis pela Invitrogen, San Diego, CA), e o plasmídeo pCI (disponível pela Promega, Madison, WI). Em geral, a triagem de grandes números de células transformadas para aquelas que expressam níveis adequadamente altos de cadeias pesadas e leves imunoglobulina é uma experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos.

[0249] De modo mais geral, uma vez que o vetor ou Sequência de DNA que codifica uma subunidade monoméria do anti-Psl de Pseudomonas dou. PcrV molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma da revelação foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser alcançada através de vários conjuntos de procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses incluem, mas sem se limitar, transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fusão de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envelopado, microinjeção e infecção com vírus intacto. Consulte Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez e Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Capítulo 24.2, páginas 470 a 472 (1988). Tipicamente, a introdução de plasmideo no hospedeiro é através de eletroporação. As células hospedeiras que alojam o construto de expressão são cultivadas sob condições apropriada para a produção das cadeia leves e cadeias pesadas, e avaliadas para a síntese de proteína de cadeia pesada e/ou leve. Conjuntos de procedimentos de ensaio exemplificativos incluem ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), rádio imuno ensaio (RIA) ou análise classificadora de célula ativada por fluorescência (FACS), imunohistoquímica e similares.

[0250] O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira através de conjuntos de procedimentos tradicionais e as células transfectadas são, então, cultivadas através de conjuntos de procedimentos convencionais para produzir um anticorpo para uso nos métodos descritos no presente documento. Assim, a revelação inclui células hospedeiras que contém um polinucleotídeo que codifica uma anti-Psl de Pseudomonas e/ou PcrV molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado da mesma, ou uma cadeia pesada ou leve da mesma, de modo operacional ligada a um promotor heterólogo. Em algumas modalidades, para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores que codificam tantas as cadeias pesadas quantas as leves podem ser coexpressos na célula hospedeira for expressão para toda a molécula de imunoglobulina, conforme detalhado abaixo.

[0251] Determinadas modalidades incluem um polinucleotídeo isolado que compreende um ácido nucleico que codifica o VH e VL descritos acima, em que uma molécula de ligação ou fragmento de ligação de antígeno disso expresso pelo polinucleotídeo se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV. Em algumas modalidades, os polinucleotídeo conforme descrito codifica uma molécula de scFv que inclui VH e VL, pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntica a uma ou mais dentre SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 70 conforme mostrado na Tabela 4.

[0252] Algumas modalidades incluem vetores que compreendem os polinucleotídeos descritos acima. Em modalidades adicionais, os polinucleotídeos são associados de modo operacional a um promotor. Em modalidades adicionais, a revelação fornece células hospedeiras que compreendes tais vetores. Em modalidades adicionais, a revelação fornece vetores em que o polinucleotídeo é associado de modo operacional a um promotor, em que os vetores podem expressar uma molécula de ligação que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV em uma célula hospedeira adequada.

[0253] E fornecido, ainda, um método para produzir uma molécula de ligação ou fragmento da mesma que se liga especificamente a Psl de Pseudomonas e/ou PcrV, que compreende cultivar uma célula hospedeira que contém um vetor que compreende os polinucleotídeos descritos acima, e que recupera o dito anticorpo, ou fragmento do mesmo. Em modalidades adicionais, a revelação fornece uma molécula de ligação isolada ou fragmento da mesma produzida através do método descrito acima.

[0254] Conforme usado no presente documento, "células hospedeiras" se refere a células que alojam vetores construídos com o uso de conjuntos de procedimentos de DNA recombinante e que codificam pelo menos um gene heterólogo. Em descrições de processos para o isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinante, os termos "célula" e "cultura de célula" são usados de modo intercambiável para representar a fonte de anticorpo a menos quando claramente especificado de outra maneira. Em outras palavras, a recuperação de polipeptídeo a partir das "células" pode significar a partir de células inteiras centrifugadas, ou a partir da cultura de célula que contém tanto o meio quanto as células suspensas.

[0255] Uma variedade de sistemas de expressão de hospedeiro-vetor pode ser utilizada para expressa moléculas de anticorpo para uso nos métodos descritos no presente documento. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas representam, ainda, células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da revelação in situ. Essas incluem, mas sem se limitar, microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformados com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo que contém sequências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante que contém sequências de codificação de anticorpo; sistemas celulares de inseto com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) que contêm sequências de codificação de anticorpo; sistemas celulares de planta infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo de Ti) que contêm sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas celulares de mamífero (por exemplo, células de COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que alojam construtos de expressão recombinantes que contêm promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou a partir de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; o promotor 7.5K de vírus vaccinia). Células bacterianas tais como Escherichia coli, ou células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula anticorpo recombinante total, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamíferos tais como células ovarianas de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento de promotor de gene precoce intermediário principal a partir de citomegalovirus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

[0256] A linhagem de célula hospedeira usada para a expressão de proteína é frequentemente de origem mamífera; aqueles versados na técnica são creditados com a habilidade de determinar as linhagens celulares de particulares que são mais bem adequadas para o produto de gene desejado a ser expresso na mesma. Linhagens celulares de hospedeiro exemplificativas incluem, mas sem se limitar, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, DHFR minus), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de hamsters filhote), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-lclBPT (células endotelial bovina), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Linhagens celulares de hospedeiro são tipicamente disponíveis a partir de serviços comerciais, da Coleção de Cultura de Tecido Americana ou a partir da literatura publicada.

[0257] Além disso, é possível escolher uma cepa de célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto de gene na maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e o processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós- traducional e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens celulares ou sistemas de hospedeiro apropriados podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para esse fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas.

[0258] Para uma produção de alto rendimento e a longo prazo de proteínas recombinantes, uma expressão estável é preferencial. Por exemplo, linhagens celulares que expressam de modo estável a molécula de anticorpo podem ser projetadas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado através de elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, realçador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estrangeiro, as células projetadas podem ser permitidas a crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido e, então, são deslocadas para uma mídia seletiva. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem de modo estável ao plasmídeo no interior se seus cromossomos e cresçam para formar o focos que por sua vez pode ser clonado e expandido em linhagens celulares. Esse método pode vantajosamente ser usado para manipular linhagens celulares que expressam de maneira estável o anticorpo molécula.

[0259] Diversos sistemas de seleção podem ser usados, que inclui, mas não se limita a quinase de timidina de vírus simplex de herpes (Wigler et al., Cell 77:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)) e os genes de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:%V1 1980) podem ser empregados tk-, hgprt- ou aprt-células, respectivamente. Também, a resistência de antimetabólito pode ser usada como base da seleção para os genes a seguir: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência a aminoglicosideo G-418 Clinical Pharmacy 12'A%& a 505; Wu e Wu, Biotherapy 3:87 a 95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573 a 596 (1993); Mulligan, Science 260:926 a 932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191 a 217 (1993); TIB TECH 11(5):155 a 215 (May, 1993); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Os métodos comumente conhecidos na técnica da tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer e Expressão, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e in Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados a título de referência no presente documento em sua plenitude.

[0260] Os níveis de expressão da molécula de anticorpo podem ser aumentados através da amplificação de vetor (para uma revisão, consulte Bebbington e Hentschel, The use of vector based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammal cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Célula. Biol. 3:257 (1983)).

[0261] A produção in vitro permite aumento em escala para proporcionar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Os conjuntos de procedimentos para cultivo de célula de mamífero sob as condições de cultura de tecido são conhecidos na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de elevação pneumática ou em um reator de agitação contínua, ou cultura de célula imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos cerâmicos. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas através dos métodos de cromatografia costumeiros, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca de íon, cromatografia sobre celulose DEAE ou (imuno-)cromatografia de afinidade, por exemplo, após biossíntese preferência de um polipeptídeo de região de dobradiça sintética ou anterior a ou subsequente a etapa de cromatografia HIC descrita no presente documento.

[0262] Os constructos que codifica anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos, conforme revelados no presente documento também podem ser expressos em células de não mamíferos como bactéria ou levedura ou células de planta. A Bactéria que prontamente adquirem os ácidos nucleicos incluem membros de enterobacteriaceae, como cepas de Escherichia coli ou Salmonella', Bacillaceae, como Bacillus subtilis', Pneumococcus', Streptococcus, e Haemophilus influenzae. Será adicionalmente observado que, quando expresso em bactéria, os polipeptídeos heterólogos tipicamente se tomam parte dos corpos de inclusão. O polipeptídeos heterólogos precisam ser isolado, purificados e, então, montado em moléculas funcionais. Em que formas tetravalentes dos anticorpos são desejas, as subunidades, então, se automontarão em anticorpos tetravalentes (WO02/096948A2).

[0263] Em sistemas bacterianos, inúmeros vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados, dependendo do uso destinado à molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não se limitam, ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), no qual a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em quadro com a região de codificação lacZ, de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3.101 a 3.109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5.503 a 5.509 (1989)); e similares. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas por adsorção e ligação a microesferas de glutationa-agarose de matriz seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou locais de clivagem de protease de fator Xa de modo que o produto de gene alvo clonado possa ser liberado da porção química de GST.

[0264] Além dos procariotas, micróbios eucariotas também podem ser usados. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de panificação comum, é a mais comumente usada dentre micro-organismos eucariotas, embora inúmeras outras cepas sejam comumente disponíveis, por exemplo, Pichiapastoris.

[0265] Para expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) é comumente usado. Esse plasmídeo já contém o gene TRP1 que fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura que carece da capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics <55:12 (1977)). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma de célula hospedeira da levedura então fornece um ambiente eficaz para detectar a transformação por crescimento na ausência de triptofano.

[0266] Em um sistema de inseto, vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).

[0267] Uma vez que a molécula de ligação de PcrV e/ou Psl de anti-Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variação ou derivado da mesma, conforme revelado no presente documento, foi expressa de modo recombinante, a mesma pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após a Proteína A, e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outro conjunto de procedimentos padrão para a purificação de proteínas. Outro método para aumentar a afinidade de anticorpos da revelação é revelado em US 2002 0123057 Al.

VII.IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO INDIFERENTES A SEROTIPO

[0268] A revelação abrange uma abordagem de célula inteira indiferente alvo para identificar moléculas de ligação terapêuticas independentes de sorotipo, por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos com atividades terapêuticas desejadas ou superiores. O método pode ser utilizado para identificar moléculas de ligação que podem antagonizar, neutralizar, limpar ou bloquear uma atividade indesejada de um agente infeccioso, por exemplo, um patógeno bacteriano. Conforme é conhecido na técnica, muitos agentes infecciosos exibem significativa variação em seus antígenos de superfície dominantes, o que permite que os mesmos evadam a vigilância imune. O método de identificação descrito no presente documento pode identificar moléculas de ligação que alvejam antígenos que são compartilhados dentre muitas espécies de Pseudomonas diferentes ou outros patógenos gram-negativos, fornecendo, assim, um agente terapêutico que pode alvejar múltiplos patógenos de múltiplas espécies. Por exemplo, o método foi utilizado para identificar uma série de moléculas de ligação que ligam à superfície de P. aeruginosa de maneira independente de sorotipo, e quando ligadas a patógenos bacterianos, mediam, promovem ou acentuam a atividade opsonofagócita (OPK) contra células bacterianas, tal como patógenos bacterianos, por exemplo, espécies Pseudomonas oportunistas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, e Pseudomonas alcali genes) e/ou inibem a anexação de tais células bacterianas a células epiteliais.

[0269] Determinadas modalidades revelam um método para identificar moléculas de ligação independentes de sorotipo que compreende: (a) preparar bibliotecas de anticorpo virgem e/ou convalescente no fago, (b) remover os anticorpos específicos para sorotipo da biblioteca por panorama de esgotamento, (c) triar a biblioteca para anticorpos que se ligam especificamente às células inteiras independentes de sorotipo e (d) triar os anticorpos resultantes para as propriedades funcionais.

[0270] Determinadas modalidades fornecem uma abordagem de triagem fenotípica de célula inteira conforme revelado no presente documento com bibliotecas de fago de anticorpo derivadas de pacientes convalescentes infectados por P. aeruginosa ou virgens. Com o uso de uma estratégia panorâmica que selecionou inicialmente contra a reatividade específica para sorotipo, diferentes clones que ligam células inteiras de P. aeruginosa foram isolados. Os clones selecionados foram convertidos em anticorpos de IgGl humana e foi confirmado que reagem com isolados clínicos de P. aeruginosa independente da classificação de sorotipo ou local do isolamento de tecido (Consulte os Exemplos). As telas de atividade funcional descritas no presente documento indicaram que os anticorpos foram eficazes na prevenção da ligação de P. aeruginosa às células de mamíferos e da exterminação opsonofagocítica mediada (OPK) de uma maneira dependente de concentração e independente de sorotipo.

[0271] Nas modalidades adicionais, as moléculas de ligação descritas acima ou fragmentos das mesmas, anticorpos ou fragmentos dos mesmos ou composições ligam-se a dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais sorotipos de P. aeruginosa diferentes ou a pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das cepas de P. aeruginosa isoladas dos pacientes infectados. Nas modalidades adicionais, as cepas de P. aeruginosa são isoladas de um ou mais dentre fluido de joelho, osso, sangue, pele, um ferimento, cavidade óssea, urina, fezes, pus, olho, cuspe ou pulmão.

VIII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE COMPREENDEM AS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE PSL E/OU PCRV DE ANTI-PSEUDOMONAS

[0272] As composições farmacêuticas usadas nesta revelação compreendem carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àqueles versados na técnica. As preparações líquidas para a administração parenteral incluem emulsões, suspensões e soluções aquosas ou não aquosas estéreis. Determinadas composições farmacêuticas conforme reveladas no presente documento podem ser administradas oralmente em uma forma dosagem aceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. Determinadas composições farmacêuticas também podem ser administradas por inalação ou aerossol nasal. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e similares. As formulações adequadas para o uso nos métodos terapêuticos revelados no presente documento são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16a edição (1980).

[0273] A quantidade de molécula de ligação de anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, que pode ser combinada com os materiais carreadores para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. Os regimes de dosagem podem também ser ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). As composições podem também compreende as moléculas de ligação anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos dispersos em um material carreador biocompatível que funciona como uma entrega adequada ou sistema de suporte para os compostos.

IX.MÉTODOS DE TRATAMENTO QUE USAM MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO TERAPÊUTICAS

[0274] Os métodos para preparar e administrar as moléculas de ligação de anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, conforme revelado no presente documento a um indivíduo em necessidade das mesmas são bem conhecidos ou são prontamente determinados por aqueles versados na técnica. A rota de administração das moléculas de ligação anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou tópica. O termo parenteral conforme usado no presente documento inclui, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea. Uma forma adequada para a administração seria uma solução para a injeção, particularmente para injeção ou gotejamento intravenoso ou intra-arterial. Entretanto, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos no presente documento, uma molécula de ligação anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, conforme revelado no presente documento pode ser entregue diretamente ao local da população celular adversa, por exemplo, a infecção aumentando através disso a exposição do tecido doente ao agente terapêutico. Por exemplo, uma molécula de ligação de anti-Psl e/ou PcrV de Pseudomonas pode ser administrada diretamente ao tecido ocular, lesão por queimadura ou tecido pulmonar.

[0275] Anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados disso, conforme revelado no presente documento podem ser administrados em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento in vivo de infecção de Pseudomonas. A esse respeito, deve-se observar que as moléculas de ligação reveladas serão formuladas de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo. Para os propósitos do pedido atual, uma quantidade farmaceuticamente eficaz deverá ser mantida em uma quantidade suficiente para alcançar a ligação eficaz a um alvo ou para alcançar um benefício, por exemplo, tratar, melhorar, diminuir, eliminar ou impedir infecção de Pseudomonas.

[0276] Algumas modalidades são direcionadas a um método de prevenção ou tratamento de uma infecção de Pseudomonas em um indivíduo em necessidade disso, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ou fragmento disso, do anticorpo ou fragmento disso, da composição, do polinucleotídeo, do vetor ou da célula hospedeira descrita no presente documento. Em modalidades adicionais, a infecção de Pseudomonas é uma infecção por P. aeruginosa. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em certos modalidades, a infecção é uma infecção ocular, uma infecção pulmonar, uma infecção por queimadura, uma infecção por ferimento, uma infecção da pele, uma infecção sanguínea, uma infecção óssea ou uma combinação de duas ou mais das ditas infecções. Em modalidades adicionais, o indivíduo sofre de pneumonia aguda, lesão por queimadura, infecção da córnea, fibrose cística ou uma combinação disso.

[0277] Certas modalidades são direcionadas a um método para bloquear ou impedir a anexação de P. aeruginosa à células epiteliais que compreende colocar uma mistura de células epiteliais e P. aeruginosa em contato com a molécula de ligação ou fragmento disso, o anticorpo ou fragmento disso, a composição, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula hospedeira descrita no presente documento.

[0278] Também revelado é um método de melhoramento de OPK de P. aeruginosa que compreende colocar uma mistura de células fagocíticas e P. aeruginosa em contato com a molécula de ligação ou fragmento disso, o anticorpo ou fragmento disso, a composição, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula hospedeira descrita no presente documento. Em modalidades adicionais, as células fagocíticas são células HL-60 diferenciadas ou leucócitos polimorfonucleares humanos (PMNs).

[0279] Mantendo-se no escopo da revelação, anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados disso, podem ser administrados a um humano ou outro animal em conformidade com os métodos de tratamento mencionados anteriormente em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados disso, revelados no presente documento podem ser administrados a tal humano ou outro animal em uma forma de dosagem convencional preparada combinando-se o anticorpo da revelação como um carreador ou diluente convencional farmaceuticamente aceitável de acordo com conjuntos de procedimentos conhecidos.

[0280] As doses eficazes das composições da presente revelação, para tratamento de infecção de Pseudomonas variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, seja o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas, e seja o tratamento profilático ou terapêutico. Geralmente, o paciente é um humano, porém mamíferos não humanos incluindo mamíferos transgênicos podem ser tratados também. As dosagens de tratamento podem ser tituladas com uso de métodos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica para otimizar a segurança e eficácia.

[0281] Anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados disso podem ser administrados em múltiplas ocasiões em várias frequências dependendo de vários fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. Altemativamente, anti-Psl de Pseudomonas e/ou moléculas de ligação de PcrV, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados disso podem ser administrados como uma formulação de liberação continua, em cujo caso menos administração frequente é necessária. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia vida do anticorpo no paciente.

[0282] As composições da revelação podem ser administradas por qualquer método adequado, por exemplo, de modo parenteral, intraventricular, oral, por pulverização de inalação, de modo tópico, retal, nasal, bucal, vaginal ou por meio de um reservatório implantado. O termo “parenteral” conforme usado no presente documento inclui conjuntos de procedimentos de infusão ou de injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraestemal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraniana.

X.SINERGIA

[0283] Chou e Talalay (Adv. Enzyme Regul., 22:27-55 (1984)) desenvolveram um método matemático para descrever as constatações experimentais de efeitos de fármaco combinada de um modo qualitativo e quantitativo. Para fármacos mutuamente exclusivas, as mesmas mostraram que a equação de isobol generalizada se aplica para qualquer grau de efeito (ver pág 52 em Chou e Talalay). Um isobol ou isobolograma é a representação gráfica de todas essas combinações de dois fármacos que têm o mesmo grau de efeito. Em isobologramas, uma linhagem reta indica efeitos aditivos, uma curva côncava (curva abaixo da linha reta) representa efeitos sinérgicos, e a curva convexa (curva acima da linha reta) representa efeitos antagonísticos. Essas curvas também mostram que uma combinação de dois fármacos mutuamente exclusivos irá mostrar o mesmo tipo de efeito sobre a totalidade da faixa de concentração, a combinação é aditiva, sinergística ou antagonística. A maioria das combinações de fármaco mostra um efeito aditivo. Em alguns casos, entretanto, as combinações mostram menos ou mais do que um efeito aditivo. Essas combinações são denominadas antagonística ou sinergística, respectivamente. A combinação manifesta sinergia terapêutica se a mesma for terapeuticamente superior uma à outra dos constituintes usados na dose favorável da mesma. Ver, T. H. Corbett et al., Cancer Treatment Reports, 66, 1187 (1982). Tallarida RJ (J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep; 298 (3):865-72) também observa que "Dois fármacos que produzem afeitos abertamente similares irão, por vezes, produzir efeitos exagerados ou reduzidos quando usados simultaneamente. Uma avaliação quantitativa é necessária para distinguir esses casos de simples ação aditiva."

[0284] Um efeito sinérgico pode ser medido com o uso do método de Chou e Talalay de índice de combinação (CI) (ver Chang et al., Cancer Res. 45: 2434-2439, (1985)) que é baseado no princípio de efeito mediano. Esse método calcula o grau de sinergia, aditividade ou antagonismo entre dois fármacos em vários níveis de citotoxicidade. Onde o valor Cl é menos do que 1, há sinergia entre os dois fármacos. Onde o valor de Cl é 1, há um efeito aditivo, mas não efeito sinérgico. Os valores de Cl maiores do que 1 indicam antagonismo. Quanto menor for o valor Cl, maior o efeito sinérgico. Em outra modalidade, um efeito sinérgico é determinado usando a concentração inibitória fracionária (FIC). Esse valor fracionário é determinado expressando o IC50 de um fármaco atuando em combinação, como uma função do IC50 do fármaco agindo sozinho. Para dois fármacos interagindo, a soma do valor FIC para cada fármaco representa a medida da interação sinergística. Onde o FIC é menos do que 1, há sinergia entre os dois fármacos. Um valor FIC de 1 indica um efeito aditivo. Quando menor o valor FIC, maior a interação sinergística.

[0285] Em algumas modalidades, um efeito sinérgico é obtido no tratamento de Pseudomonas em que um ou mais dos agentes de ligação são administrados em uma "dose baixa" (isto é, com o uso de uma dose ou doses que seriam consideradas não terapêuticas se administradas sozinhas), em que a administração do agente de ligação de dose baixa em combinação com outros agentes de ligação (administrados em uma dose tanto baixa quanto terapêutica) resulta em um efeito sinérgico que excede os efeitos aditivos que resultariam, de outra maneira, a partir de administração individual do agente de ligação sozinho. Em algumas modalidades, o efeito sinérgico é alcançado através de administração de um ou mais dos agentes de ligação administrados em uma "dose baixa" em que a dose baixa é fornecida para reduzir ou evitar toxicidade ou outros efeitos colaterais indesejáveis.

XI.IMUNOENSAIOS

[0286] As moléculas de ligação Psl e/ou PcrV de Kxdx-Pseudomonas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas podem ser ensaiadas para ligação imunoespecífica através de qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, mas sem se limitar, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos com o uso de conjuntos de procedimentos tais como western blots, radioimunensaios, ELISA (ensaio imunosorbente ligado a enzima), imunoensaios tipo "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão de gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para citar alguns. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994), que é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade). Os imunoensaios exemplificativos são descritos brevemente abaixo (mas não são destinados por meio de limitação).

[0287] Há uma variedade de métodos disponíveis para medir a afinidade de uma interação de anticorpo-antígeno, mas relativamente alguns para determinar as constantes de taxa. A maioria dos métodos consiste em rotular tanto o anticorpo como antígeno, o que inevitavelmente complica as medições de rotina e apresenta incertezas nas quantidades medidas. A afinidade de anticorpo pode ser medida por uma série de métodos, incluindo OCTET®, BIACORE®, ELISA, e FACS.

[0288] O sistema OCTET* usa biossensores em um formato de placa de 96 cavidades para relatar análise cinética. Os eventos de ligação e dissociação de proteína podem ser monitorados medindo-se a ligação de uma proteína em solução a uma segunda proteína imobilizada no biossensor de FortéBio. No caso de ligação de medição de anti-Psl ou PcrV anticorpos a Psl ou PcrV, o Psl ou PcrV é imobilizado em partes de OCTET* seguidas pela análise de ligação do anticorpo, que está em solução. A associação e dissociação de anticorpo ao Psl ou PcrV imobilizado é então detectada pelo sensor de instrumento. Os dados são então coletados e exportados ao GraphPad Prism para ajuste de curva de afinidade.

[0289] A Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) conforme executada em BIACORE* oferece uma série de vantagens em métodos convencionais de medição da afinidade de interação de anticorpo-antígenos: (i) nenhuma exigência em rotular tanto o anticorpo como antígeno; (ii) anticorpos não precisam ser purificados antecipadamente, O sobrenadante de cultura de célula pode ser usado diretamente; (iii) medições em tempo real, que permitem comparação rápida semiquantitativa de diferentes interações monoclonais de anticorpo, são permitidas e são suficientes para muitos propósitos de avaliação; (iv) a superfície bioespecífica pode ser regenerada de modo que uma série de diferentes anticorpos monoclonais possa ser facilmente comparada sob condições idênticas; (v) procedimentos analíticos são completamente automatizados, e extensas séries de medições podem ser executadas sem a intervenção do usuário. BIAapplications Handbook, versão AB (reimpresso em 1998), BIACOREk número de código BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versão AB (reimpresso em 1998), BIACOREk número de código BR-1001-84.

[0290] Os estudos de ligação baseados em SPR exigem que um membro de um par de ligações seja imobilizado em uma superfície do sensor. O parceiro de ligação imobilizado é denominado como o ligante. O parceiro de ligação em solução é denominado como o analito. Em alguns casos, o ligante é anexado indiretamente à superfície através da ligação a outra molécula imobilizada, que é denominada como a molécula de captura. A resposta de SPR reflete uma mudança na concentração de massa na superfície do detector à medida que os analitos se ligam ou dissociam.

[0291] Com base em SPR, interações de monitoramento de medições de BIACORE® em tempo real diretamente conforme as mesmas acontecem. O conjunto de procedimentos é adequado para a determinação de parâmetros cinéticos. A classificação de afinidade comparativa é extremamente simples de executar, e tanto a constante cinética quanto a constante de afinidade podem ser derivada dos dados de sensorgrama.

[0292] Quando o analito é injetado em um pulso discreto ao longo de uma superfície ligante, o sensorgrama resultante pode ser dividido em três fases essenciais: (i) associação do analito com o ligante durante uma injeção de amostra; (ii) equilíbrio ou estado estacionário durante a injeção de amostra, onde a taxa de ligação do analito é equilibrada através da dissociação do complexo; (iii) dissociação do analito de superfície durante o fluxo de tampão.

[0293] As fases de associação e dissociação fornecem informações na cinética de interação de analito-ligante (ka e kd, as taxas de formação complexa e dissociação, kd/ka = KD). A fase de equilíbrio fornece informações na afinidade da interação de analito-ligante (KD).

[0294] O software BIAevaluation fornece facilidades compreensivas para ajuste de curva com uso tanto de integração numérica quanto de algoritmos de ajuste global. Com análise adequada dos dados, a taxa separada e constantes de afinidade para interação pode ser obtida a partir de investigações de BIACOREk simples. A taxa de afinidades mensuráveis por esse conjunto de procedimentos é muito ampla, variando de mM a pM.

[0295] A especificidade de Epítopo é uma importante característica de um anticorpo monoclonal. O mapeamento de Epítopo com BIACORE*, em contraste aos conjuntos de procedimentos convencionais que usam radioimmunoensaio, ELISA ou outros métodos de absorção de superfície, não exige anticorpos de rotulação ou purificados, e permite testes de especificidade de múltiplos locais com uso de uma sequência de diversos anticorpos monoclonais. Adicionalmente, grandes números de análises podem ser processados automaticamente.

[0296] Os experimentos de ligação em pares testam a capacidade dos dois MAbs de se ligarem simultaneamente ao mesmo antígeno. Os MAbs direcionados contra epítopos separados se ligarão independentemente, enquanto que os MAbs direcionados contra epítopos idênticos proximamente relacionados irão interferir com a ligação do outro. Esses experimentos de ligação com BIACORE* são fáceis de realizar.

[0297] Por exemplo, uma pessoa pode usar uma molécula de captura para ligar o primeiro Mab, seguido pela adição de antígeno e o segundo MAb sequencialmente. Os sensorgramas revelarão: 1. Quanto do antígeno se liga ao primeiro Mab, 2. Até onde o segundo MAb se liga ao antígeno fixado em superfície, 3. Se o segundo MAb não se liga, se reverter a ordem do teste em pares altera os resultados.

[0298] A inibição de peptídeo é outra técnica usada par mapeamento de epítopo. Esse método pode complementar os estudos de ligação de anticorpo em pares, e pode relacionar epítopos funcionais a recursos estruturais quando a sequência primária do antígeno for conhecida. Os peptídeos ou fragmentos de antígeno são testados para a inibição de MAbs diferentes ao antígeno imobilizado. Presume-se que os peptídeos que interferem com a ligação de um dado MAb são estruturalmente relacionados ao epítopo definido por aquele MAb.

XII.ADMINISTRAÇÃO

[0299] Uma composição que compreende ou um domínio de ligação de anti-Psl ou domínio de ligação de anti-PcrV, ou uma composição que compreende tanto um domínio de ligação de anti-Psl quanto de anti-PcrV são administradas de tal modo que eles forneçam um efeito sinérgico no tratamento de Pseudomonas em um paciente. A administração pode ser por qualquer meio adequado desde que a administração forneça o efeito terapêutico desejado, isto é, sinergismo. Em determinadas modalidades, os anticorpos são administrados durante o mesmo ciclo de terapia, por exemplo, durante um ciclo de terapia durante um período de tempo prescrito, ambos os anticorpos são administrados ao indivíduo. Em algumas modalidades, a administração dos anticorpos pode ser durante a administração sequencial em ciclos de terapia separados, por exemplo, o primeiro ciclo de terapia que envolve a administração de um anticorpo anti-Psl e o segundo ciclo de terapia que envolve a administração de um anticorpo anti-PcrV. A dosagem dos domínios de ligação administrados a um paciente também dependerá da frequência de administração e pode ser prontamente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0300] Em outras modalidades, os domínios de ligação são administrados mais do que uma vez durante um ciclo de tratamento. Por exemplo, em algumas modalidades, os domínios de ligação são administrados semanalmente por três semanas consecutivas em um ciclo de tratamento de três ou quatro semanas.

[0301] A administração da composição que compreende um ou mais dos domínios de ligação pode ser no meio dia ou em dias diferentes desde que a administração forneça o efeito terapêutico desejado.

[0302] Será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que outras doses ou frequências de administração que fornecem o efeito terapêutico desejado são adequadas para uso na presente invenção.

XII. KITS

[0303] Em ainda outras modalidades, a presente invenção fornece kits que podem ser usados para realizar os métodos descritos no presente documento. Em determinadas modalidades, um kit compreende uma molécula de ligação revelada no presente documento em um ou mais recipientes. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá prontamente que os domínios de ligação revelados, polipeptídeos e anticorpos da presente invenção podem ser prontamente incorporados em um dos formatos de kit estabelecidos que são bem conhecidos na técnica.

[0304] A prática da revelação empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são explicadas completamente na literatura. Consulte, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edição, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I e II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. Patente sob No U.S.: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller e M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer e Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); e in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

[0305] Os princípios gerais da modificação de anticorpo são apresentados em Antibody Engineering, 2~ Edição, C.A.K.. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995). Os princípios gerais da modificação de proteína são apresentados em Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press em Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). Os princípios gerais da ligação de anticorpos e anticorpo-hapteno são apresentados em: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2~ Edição, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); e Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman e Hall, New York, NY (1984). Adicionalmente, os métodos padrão em imunologia conhecidos na técnica e não descritos especificamente são geralmente seguidos como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (eds), Basic e Clinical -Immunology (8~ Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) e Mishell e Shiigi (eds), Selected Métodos in Cellular Immunology, W.H. Freeman e Co., New York (1980).

[0306] Os trabalhos de referência padrão que apresentam os princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of SelfNonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., “Monoclonal Antibody Technology” in Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4~ Edição Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt e Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. e Male D., Immunology 6~ Edição London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. e Lichtman, A., Cellular e Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann e Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach e Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção e triagem de bibliotecas de exibição de fago de anticorpo humano

[0307] Esse exemplo descreve uma abordagem panorâmica de célula completa indiferente alvo com bibliotecas de fago de anticorpo humano derivadas em ambos os pacientes recuperação infectados por P. aeruginosa e virgens para identificar antígenos de proteção inovadores contra a infecção de Pseudomonas (Figura IA). Os ensaios incluídos nas telas funcionais in vitro incluíam ensaios de eliminação de opsonofagocitose (OPK) e ensaios de anexação de célula com o uso da linhagem celular epitelial A549. Os candidatos líder, com base em atividade in vitro superior, foram testados em modelos de pneumonia aguda de P. aeruginosa, queratite e infecção por queimadura.

[0308] A Figura 1B mostra a construção da biblioteca de exibição de fato de anticorpo de paciente. O sangue complete foi agrupado de 6 pacientes em recuperação 7 a 10 dias após o diagnóstico seguido por extração de RNA e construção de biblioteca de fago conforme descrito anteriormente (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309 a 314 (1996); Wrammert, J., et al., Nature 453, 667 a 671 (2008)). A Figura 1C mostra que a biblioteca de scFv clonado final continha 5,4 x 10 transformantes e o sequenciamento revelou que 79% dos genes scFv eram de comprimento completo e em quadro. Os laços de CDR3 de VH, frequentemente importantes para determinar a especificidade de epítopo, eram 84% diversos no nível de aminoácido antes da seleção de biblioteca.

[0309] Além da biblioteca de paciente, uma biblioteca de exibição de fago de scFv humano virgem que contém até IxlO11 membros de ligação (Lloyd, C., et al., Protein Eng Des Sei 22, 159 a 168 (2009)) foi usado para o isolamento de anticorpo (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309 a 314 (1996)). A P. aeruginosa eliminada por calor (1x109) foi imobilizada em tubos IMMUNO™ (Nunc; MAXISORP™) seguido pelas seleções de exibição de fago conforme descrito (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309 a 314 (1996)) com a exceção da trietanolamina (lOOnM) sendo usada como o tampão de eluição. Para a seleção em P. aeruginosa em suspensão, células eliminadas por calor foram bloqueadas seguidas pela adição de fago bloqueado às células. Após a lavagem, o fago eluído foi usado para infectar células de E. coli conforme descrito (Vaughan, 1996). O resgate de fago de E. coli e ligação à P. aeruginosa eliminada por calor por ELISA foi realizado conforme descrito (Vaughan, 1996).

[0310] Após o desenvolvimento e validação da metodologia de seleção de afinidade de célula completa, tanto a nova biblioteca de paciente em recuperação e uma biblioteca virgem construída anteriormente (Vaughan, T.J., et al., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) passaram foi seleção de afinidade em suspensões de cepa de P. aeruginosa 3064 que possui um O- antígeno completo bem como uma cepa mutante de wapR isogênica que carecia de expressão de superfície do O-antígeno. A Figura 1D mostra que os titulantes de saída de seleções de biblioteca de paciente consecutivas aumentam em uma taxa maior para a biblioteca de paciente do que para a biblioteca virgem (1x10 vs 3x10 no ciclo 3, respectivamente). Além disso, observou-se também que a duplicação de sequências de laço de CDR3 de VH nas bibliotecas (uma medida de enriquecimento clonal durante a seleção), é superior na biblioteca de paciente, atingindo 88 a 92%, em comparação a 15 a 25% na biblioteca virgem no ciclo 3 (Figura 1D). O fago de scFv individual de seleções de afinidade foram a seguir triados por ELISA quanto à reatividade das cepas de sorotipo heterólogo de P. aeruginosa (Figura IE). As placas de ELISA (Nunc; MAXISORP™) foram revestidas com cepas de P. aeruginosa a partir de culturas de um dia para o outro conforme descrito (DiGiandomenico, A., et al., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)). Os anticorpos diluídos foram adicionados a placas bloqueadas por 1 hora, lavados, e tratados com anticorpos secundários anti-humanos conjugados com HRP por 1 hora seguido pelo desenvolvimento e análise conforme descrito (Ulbrandt, N.D., et al., J Virol 80, 7.799 a 7.806 (2006)). A espécie dominante de fago obtida a partir das seleções de célula completa com ambas as bibliotecas renderam reatividade específica por sorotipo (dados não mostrados). Os clones que exibem ligação independente de sorotipo na ausência de ligação não específica a E. coli ou albumina de soro bovino foram selecionados para avaliação adicional.

[0311] Para a expressão de IgG, as cadeias VH e VL de anticorpos selecionados foram clonadas em vetores de expressão de IgGl humano, coexpressas em células de HEK293, e purificadas cromatografia de afinidade de proteína A conforme descrito (Persic, L., et al., Gene 187, 9 a 18 (1997)). Os anticorpos de IgGl humana feitos com os variáveis de região desses fagos independente de sorotipo selecionados foram confirmados para especificidade por P. aeruginosa e priorizados para análise subsequente por ligação de célula completa a sorotipos clinicamente relevantes dominantes por análise de FACS (Figura 1F), visto que esse método é mais rigoroso do que ELISA. Para os ensaios de ligação à base de citometria de fluxo as cepas de P. aeruginosa de fase log intermediária foram concentradas em PBS para um OD650 de 2,0. Após a incubação do anticorpo (10 μg/ml) e bactérias (~1 x 10 células) por 1 hora a 4°C com agitação, as células lavadas foram incubadas com um anticorpo de IgG anti-humana de cabra ALEXA FLUOR 647® (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 0,5 hora a 4°C. As células lavadas foram manchadas com mancha bacteriana verde BACLIGHT™ como recomendando (Invitrogen, Carlsbad, CA). As amostras foram colocadas em um citômetro de fluxo LSR II (BD Biosciences) e analisadas com o uso de BD FacsDiva (v. 6.1.3) e FlowJo (v. 9.2; TreeStar). Os anticorpos que exibem a ligação por FACS foram priorizados adicionalmente por teste de atividade funcional em um ensaio de eliminação de opsonofagocitose (OPK).

Exemplo 2: Avaliação de mAbs que promove OPK de P. aeruginosa

[0312] Esse exemplo descreve a avaliação de anticorpos de IgGl humana priorizados para promover o OPK de P. aeruginosa. A Figura 2A mostra que com a exceção d e WapR-007 e do anticorpo de controle negativo R347, todos os anticorpos mediaram a eliminação dependente de concentração da cepa de sorogrupo 05 de P. aeruginosa luminescente (PAOl.lux). WapR-004 e Cam-003 exibiram atividade de OPK superior. Os ensaios de OPK foram realizados conforme descrito em (DiGiandomenico, A., et al., Infect Immun 72, 7.012 a 7.021 (2004)), com modificações. Brevemente, os ensaios forma realizados em placas com 96 cavidades com o uso de 0,025 ml de cada componente de OPK; cepas de P. aeruginosa-, soro de filhote de coelho diluído; células HL-60 diferenciadas; e anticorpo monoclonal. Em alguns ensaios de OPK, as cepas de P. aeruginosa luminescentes, que foram construídas conforme descrito (Choi, K.H., et al., Nat Methods 2, 443 a 448 (2005))., foram usadas. Os ensaios de OPK luminescentes foram realizados conforme descrito acima, mas com a determinação de unidades de luciferase relativas (RLUs) com o uso de um leitor de placa de múltiplas etiquetas ENVISION da Perkin Elmer (Perkin Elmer).

[0313] A capacidade dos anticorpos WapR-004 e Cam-003 de mediar a atividade de OPK contra outra cepa de sorotipo de O-antigeno clinicamente relevante, 9882-80.lux, foi avaliada. A Figura 2B mostra que a atividade de OPK de WapR-004 e Cam-003 acentuada se estende até a cepa 9882-80 (OH).

[0314] Além disso, esse exemplo descreve a avaliação de mutantes de WapR-004 (W4) no formato de scFv-Fc para promover o OPK de P. aeruginosa. Um mutante, Wap-004RAD (W4-RAD), foi especificamente criado através de mutagênese direcionada ao local para remover um motivo de RGD em VH. Outros mutantes de W4 foram preparados conforme a seguir. A PCR aninhada foi realizada conforme descrito (Roux, K.H., PCR Métodos Appl 4, SI85 a 194 (1995)), para amplificar os variantes de W4 (derivados de hipermutação somática) da biblioteca de scFv derivada dos pacientes infectados P. aeruginosa em recuperação, para análise. Esta é a biblioteca da qual WapR-004 foi derivado. Os fragmentos de variante de W4 foram subclonados e sequenciados com o uso de procedimentos padrão conhecidos na técnica. As cadeias leves de mutante de W4 (LC) foram recombinadas com a cadeia pesada de WapR-004 (HC) para produzir mutantes de W4 no formato de scFv-Fc. Além disso, os mutantes de cadeia pesada de WapR-004 RAD (HC) foram recombinados com LCs parentais de M7 e M8 no formato de scFv-Fc. Os construtos forma preparados com o uso de procedimentos padrão conhecidos na técnica. As Figuras 11 (A-M) mostram que com a exceção do anticorpo de controle negativo R347, todos mutantes de WapR-004 (W4) mediaram a eliminação dependente de concentração de cepa de sorogrupo 05 de P. aeruginosa luminescente (PAOl.lux).

[0315] A região variável de WapR-004-RAD região foi organizada em linhagem germinativa para reduzir a imunogenicidade potencial, produzindo a linhagem germinativa WapR-004 ("WapR-004-GL"), e foi otimizada por líder por mutagênese direcionada ao local. Os clones com afinidade aprimorada para Psl foram selecionados em triagens à base de competição. Os clones superiores foram classificados por aprimoramento de afinidade e analisados em ensaio funcional in vitro. Os 14 clones otimizados por líder são: Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, Psl0337, Psl348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, PslO588 e Psl0589.

Exemplo 3: Anticorpos artíi-P. aeruginosa independentes de sorotipo alvejam o exopolissacarídeo Psl

[0316] Esse exemplo descreve a identificação do alvo de anticorpos anti-P. aeruginosa derivados de triagem fenotípica. A análise alvo foi realizada para tratar se os anticorpos independentes de sorotipo alvejaram antígenos de carboidrato ou proteína. Nenhuma perda de ligação foi observada em extratos de célula completa de ELISA toPAOl digeridas exaustivamente com proteinase K, sugerindo aqueles resíduos de carboidrato alvejados por reatividade (dados não mostrados). Os mutantes isogênicos foram construídos em genes responsáveis por O-antígeno, alginato, e biossíntese de núcleo de LPS; yvbpL (deficiente em O-antígeno); wbpL/algD (deficiente em O-antígeno e alginato); rmlC (deficiente em O-antígeno e núcleo externo truncado); e galU (deficiente em O-antígeno e núcleo interno truncado). Os mutantes de P. aeruginosa foram construídos com base na estratégia de substituição de alelo descrita por Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1.195 a 1.204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831 a 834 (1993)). Os vetores foram mobilizados da cepa de E. coli SI7.1 para a cepa de P. aeruginosa PAO1; recombinantes foram isolados conforme descrito em (Hoang, T.T., et al., Gene 212, 77 a 86 (1998)). A deleção de gene foi confirmada por PCR. Os mutantes de P. aeruginosa foram complementados com construtos à base de pUCP30T nutrindo genes do tipo selvagem. A reatividade dos anticorpos foi determinada por ELISA indireta em placas revestidas com as cepas de P. aeruginosa indicadas acima: A Figura 3A mostra que a ligação de Cam-003 ao wbpL ou ao mutante duplo de wbpL/algD não foi afetada, entretanto a ligação aos mutantes de rmlC e galU foi abolida. Embora esses resultados tenham sido consistentes com a ligação ao núcleo de LPS, a reatividade ao LPS purificado de PAO1 não foi observada. Mostrou-se recentemente que os genes rmlC e galU foram exigidos para a biossíntese do Psl exopolissacarídeo, um polímero de pentassacarídeo de repetição que consiste em D-manose, L-rhamnose, e D- glicose. A ligação de Cam-003 a um PA01Aps/zt de inativação de pslA, foi testada, já que pslA é requerido para a biossíntese de Psl (Byrd, M.S., et al., Mol Microbiol 73, 622 a 638 (2009)). A ligação de Cam-003 a PAOlA/zsZ/l foi abolida quando testada por ELISA (Figura 3B) e FACS (Figura 3C), embora a molécula de LPS nesse mutante estivesse inafetada (Figura 3D). A ligação de Cam-003 foi restaurada em um mutante triplo de PAOWwbpLIalgDIpslA complementado com pslA (Figura 3E) como a capacidade do Cam-003 de mediar a eliminação opsônica ao PAOlΔpsM complementado em contraste ao mutante (Figura 3F e 3G). A ligação de anticorpo Cam-003 a um mutante de exopolissacarídeo Pel também foi inafetada, confirmando adicionalmente Psl como o anticorpo alvo (Figura 3E). Os ensaios de ligação confirmara que os anticorpos remanescentes também são ligados a Psl (Figura 3H e 31).

Exemplo 4: Anexação de bloco de mAbs anti-Psl de P. aeruginosa a células epiteliais cultivadas.

[0317] Esse exemplo mostra que os anticorpos anti-Psl bloquearam a associação de P. aeruginosa com as células epiteliais. Os anticorpos anti-Psl foram adicionados a uma monocamada confluente de células A549 (uma linhagem celular epitelial basal alveolar de adenocarcinoma humana) cultivadas em placas com 96 cavidades opacas (Nunc Nunclon Delta). A cepa de P. aeruginosa PAO1 luminescente de fase log (PAOl.lux) foi adicionada a um MOI dentre 10. Após incubação de PAOl.lux com células A549 a 37°C por 1 hora, as células A549 foram lavadas, seguido pela adição de LB+0,5% de glicose. As bactérias foram quantificadas após uma breve incubação a 37°C conforme realizado no ensaio de OPK descrito no Exemplo 2. As medições das cavidades em células A549 foram usadas para corrigir ligação não específica. A Figura 4 mostra que com a exceção de Cam-005 e WapR- 007, todos os anticorpos reduziram a associação de PAOl.lux a células A549 de uma forma dependente de dose. Os mAbs que tiveram o melhor desempenho nos ensaios de OPK, WapR-004 e Cam-003 (consulte as Figuras 2A-B, e Exemplo 2), também eram os mais ativos na inibição da anexação de célula de P. aeruginosa às células epiteliais de pulmão A549, fornecendo até -80% de redução em comparação com o controle negativo. WapR-016 era o terceiro anticorpo mais ativo, mostrando atividade inibitória semelhante a WapR-004 e Cam-003 mas uma concentração de anticorpo 10 vezes maior.

Exemplo 5: Cepas de P. aeruginosa passadas vivo mantêm/aumentam a expressão d e Psl

[0318] Para testar se a expressão de Psl in vivo foi mantida, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com isolados de P. aeruginosa seguido pela coleta de bactérias por lavagem peritoneal quatro horas após infecção. A presença de Psl foi analisada com um anticorpo de controle e Cam-003 por citometria de fluxo já que as condições para ligação de são mais rigorosas e permitem a quantificação de células que são positivas ou negativas para a expressão de Psl. Para a ligação ex vivo, inóculos bacterianos (0,1 ml) foram preparados de uma placa de TSA de um dia para o outro e entregue intraperitoneal mente aos camundongos BALB/c. Em 4 horas. Após o estímulo, as bactérias foram colhidas, RBCs lisadas, sonicadas e resuspensas em PBS complementado com 0,1% de Tween-20 e 1% de BS A. As amostras foram manchadas e analisadas conforme descrito anteriormente no Exemplo 1. A Figura 5 mostra que as bactérias colhidas após a lavagem peritoneal com três cepas de P. aeruginosa do tipo selvagem mostraram manchamento de Cam-003 forte, que era comparável as bactérias cultivadas em fase log (comparar as Figuras 5A e 5C). As bactérias do tipo selvagem passadas in vivo exibiram manchamento acentuado em comparação ao inoculo (comparar as Figuras 5B e 5C). Dentro dos inóculos, Psl não foi detectado pra a cepa 6077 e foi minimamente detectado para as cepas PAO1 (05) e 6206 (OI 1-citotóxica). A ligação de Cam-003 às bactérias aumentou em relação aos indicando que a expressão de Psl é mantida ou aumentada in vivo. As cepas de tipo selvagem 6077, PAO1, e 6206 expressam Psl após passagem in vivo, entretanto a cepa de PAO1 que nutre uma deleção de pslA (PΔOXΔpslA) não tem a capacidade de reagir com Cam-003. Esses resultados enfatizam adicionalmente Psl como o alvo dos anticorpos monoclonais.

Exemplo 6: Taxas de Sobrevivência para animais tratados com anticorpos monoclonais anti-Psl de Cam-003 e WapR-004 em um modelo de pneumonia aguda por P. aeruginosa

[0319] Os anticorpos ou PBS foram administrados 24 horas antes da infecção em cada modelo. Os modelos de pneumonia aguda por P. aeruginosa, queratita, e infecção por ferimento térmico foram realizados conforme descrito (DiGiandomenico, A., et al., Proc Natl Acad Sei USA 104, 4.624 a 4.629 (2007)), com modificações. No modelo de pneumonia aguda, os camundongos BALB/c (The Jackson Laboratory) foram infectados com cepas de P. aeruginosa suspensas em um inoculo de 0,05 ml. No modelo de ferimento térmico, os camundongos CF-1 (Charles River) receberam uma queimadura de área de superfície de corpo total de 10% com um marca de metal aquecido para 92 °C por 10 segundos. Os animais foram infectados subcutaneamente com cepa de P. aeruginosa 6077 na dose indicada. Para experimentos de carga de órgão, a pneumonia aguda foi induzida em camundongos seguido pela coleta de pulmões, baços e rins 24 horas pós- infecção para a determinação de CFU.

[0320] Os anticorpos monoclonais Cam-003 e WapR-004 foram avaliados em um modelo de pneumonia letal aguda contra cepas de P. aeruginosa que representam os sorotipos mais frequentes associados a doença clínica. As Figuras 6A e 6C mostram uma sobrevivência dependente de concentração em camundongos tratados por Cam-003 com as cepas PAO1 e 6294 quando comparado aos controles. As Figuras 6B e 6D mostram que proteção completa do estímulo com 33356 e cepa citotóxica 6077 foi proporcionado por Cam-003 em 45 e 15 mg/kg enquanto uma sobrevivência de 80 e 90% foi observada em 5mg/kg para 33356 e 6077, respectivamente. As Figuras 6E e 6F mostra uma sobrevivência dependente de concentração significativa em camundongos tratados com WapR-004 no modelo de pneumonia aguda com cepa 6077 (011) (8 x 105 CFU) (Figura 6E), ou 6077 (011) (6 x 105 CFU) (Figura 6F).

[0321]Cam-003 e WapR-004 foram examinados a seguir por sua capacidade de reduzir a carga de órgão de P. aeruginosa no pulmão e espalhamento para órgãos distais, e posteriormente os animais foram tratados com concentrações variadas de WapR-004, Cam-003, ou anticorpos de controle em diversas concentrações diferentes. Cam-003 foi eficaz na redução da carga no pulmão de P. aeruginosa contra todos as quatro cepas testadas. Cam-003 foi o mais eficaz contra a cepa citotóxica altamente patogênica, 6077, em que a dose baixa foi tão eficaz quanto a dose superior (Figuras 7D). Cam-003 também teve um efeito significativo na redução de disseminação para o baço e rins em camundongos infectados com PAO1 (Figura 7A), 6294 (Figura 7C), e 6077 (Figura 7D), embora a disseminação para esses órgãos não tenha sido observada em camundongos infectados 33356 (Figura 7B). A Figuras 7E e 7F mostram que de forma semelhante, WapR-004 reduziu a carga de órgão após a indução de pneumonia aguda com 6294 (06) e 6206 (011). Especificamente, WapR-004 foi eficaz na redução de disseminação de P. aeruginosa para o baço e rins e camundongos infectados.

Exemplo 7: Construção de anticorpo monoclonal anti-PcrV V2L2

[0322] Os camundongos Veloclmmune® (Regeneron Pharmaceuticals) foram imunizados pelo método de imunização ultracurto com r-PcrV e títulos séricos foram seguidos pela ligação a PcrV e neutralização da atividade hemolítica de P.aeruginosa viva. Os camundongos que mostram atividade anti-hemolítica no soro foram sacrificados e os gânglios linfáticos e baço (axial, inguinal e popliteal) foram colhidos. As populações de célula para esses órgãos foram aderidas ao r-Pcrv biotinilado para selecionar células B específicas anti-PcrV. As células selecionadas foram então fundidas com parceiro de mieloma de camundongo P3X63-Ag8 e semeados em 25K células/cavidade no meio de seleção de hibridoma. Após 10 dias o meio das cavidades de hibridoma foi alterado completamente com meio recente e após outros 3 a 4 dias os sobrenadantes de hibridoma foram ensaiados para atividade anti-hemolítica. As colônias que mostram atividade anti-hemolítica foram clonadas com diluição limitada em 0,2 célula/cavidade de placas com 96 cavidades e o ensaio de atividade anti-hemolítica foi repetido. Os clones que mostram atividade anti-hemolítica foram adaptados para IgG ultra baixo que contém meio de cultura de hibridoma. O IgG dos meios condicionados foram purificados e ensaiados quanto à atividade anti- hemolítica in vitro e in vivo para proteção contra infecção por P.aeruginosa. Os anticorpos também foram categorizados pelo ensaio de competição em grupos diferentes. Os domínios variáveis (V) dos anticorpos de interesse foram subclonados do cDNA derivado de seus respectivos clones diferentes. Os segmentos V subclonados foram fundidos em quadro com o cDNA para o domínio constante correspondente em um plasmídeo de expressão de mamífero. Os IgGs recombinantes foram expressos e purificados das células HEK293. Nos casos em que mais do que uma sequência V de cDNA foi obtida a partir de um clone particular, todas as combinações de cadeias leve a pesada foram expressas e caracterizadas para identificar o IgG funcional.

Exemplo 8: Taxas de sobrevivência para animais tratados com anticorpos monoclonais anti-Psl Cam-003, WapR-004 e anticorpo monoclonal anti-PcrV V2L2 em um modelo de infecção de córnea por P. aeruginosa

[0323] A eficácia de Cam-003 e WapR-004 foi avaliada a seguir em um modelo de infecção de cómea por P. aeruginosa que enfatiza a capacidade de patogênicos de anexar a colonizar tecido danificado. As Figuras 8 A-D e 8 F-G mostram que os camundongos que recebem Cam-003 e WapR-004 tinham significativamente menos patologia e contagens bacterianas reduzidas em homogenatos oculares totais do que foi observado em animais tratados por controle negativo. A Figura 8E mostra que Cam-003 também foi eficaz quando testado em um modelo de ferimento térmico, fornecendo proteção significativa em 15 e 5 mg/kg em comparação ao controle tratado com anticorpo. Figura 8 (H): A atividade de anticorpos monoclonais anti-Psl e anti-PcrV V2L2 foi testada em um modelo de queratita ocular de camundongo de P. aeruginosa. Os camundongos de C3H/HeN foram injetados intraperitonealmente (IP) com PBS ou um anticorpo de IgGl de controle (R347) em 45 mg/kg ou WapR-004 (a-Psl) em 5mg/kg ou V2L2 (a-PcrV) em 5mg/kg, 16 hours horas antes da infecção com (Ml (011-citotóxico - IxlO6 CFU). Imediatamente antes da infecção, os camundongos foram anestesiados seguidos pela iniciação de três arranhões de 1 mm na cómea e estroma superficial de um olho de cada camundongo com o uso de uma agulha de calibre 27 sob um microscópio de dissecação, seguido pela aplicação tópica de cepa de P. aeruginosa 6077 em um inoculo de 5 μl. Os olhos foram fotografados em 48 horas após infecção seguida pela classificação de cómea através da visualização de olhos sob um microscópio de dissecação. A classificação de infecção da cómea foi realizada conforme descrito anteriormente por Preston et al. (Preston, MJ., 1995, Infect. Immun. 63:3.497). Brevemente, os olhos infectados foram classificados 48 horas após a infecção com cepa 6077 por um investigador que desconhecida dos tratamentos com animal. O próximo esquema de classificação foi usado: grau 0, olho macroscopicamente idêntico a um olho não infectado; grau 1, leve opacidade que cobre parcialmente a pupila; grau 2, opacidade densa que cobre a pupila; grau 3, opacidade densa que cobre a pupila inteira; grade 4, perfuração da córnea (encolhimento do globo ocular). Os camundongos que recebem Cam-003 ou WapR-004RAD sistematicamente dosados (IP) mostraram significativamente menos patologia e unidades formadoras de colônia bacteriana reduzidas (CFU) em homogenatos oculares totais do que foi observado nos animais tratados por mAb de controle R347. Resultados semelhantes foram observados em animais tratados com V2L2 em comparação a controles tratados com R347.

Exemplo 9: Um anticorpo mutante de Cam-003 Fc, Cam-003-TM, diminuiu a eficácia de OPK e in vivo mas mantém a atividade de anexação anti-célula.

[0324] Dado o potencial para mecanismos duplos de ação, um mutante de Cam-003 Fc, Cam-003-TM, foi criado que nutre mutações no domínio Fc que reduz sua interação com receptores de Fey (Oganesyan, V., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700 a 704 (2008)), para identificar se a proteção era mais correlacionada à anexação anti-célula ou atividade de OPK. Os mutantes de P. aeruginosa foram construídos com base na estratégia de substituição de alelo descrita por Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1.195 a 1.204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831 a 834 (1993)). Os vetores foram mobilizados de cepa de E. coli SI7.1 na cepa de P. aeruginosa PAO1; os recombinantes de foram isolados conforme descrito (Hoang, T.T., et al., Gene 212, 77 a 86 (1998)). A deleção de gene foi confirmada por PCR. Os mutantes de P. aeruginosa foram complementados com construtos à base de pUCP30T que nutrem genes do tipo selvagem. As Figuras 9A mostram que Cam-003-TM exibiu uma queda de 4 vezes em atividade de OPK em comparação a Cam-003 (EC50 de 0,24 e 0,06, respectivamente) mas foi tão eficaz no ensaio de anexação de célula (Figura 9B). A Figura 9C mostra que Cam-003-TM também foi menos eficaz contra a pneumonia sugerindo que atividade de OPK ótima é necessária para a proteção ótima. Os ensaios de anexação de célula e OPK foram realizados conforme descrito anteriormente in Exemplos 2 e 4, respectivamente.

Exemplo 10: Mapeamento de Epítopo e afinidade relativa para anticorpos anti-Psl

[0325] O mapeamento de epítopo foi realizado através de ELISA por competição e confirmado com o uso de um sistema de fluxo OCTET* com Psl derivado do sobrenadante de uma cultura de um dia para o outro de cepa de P. aeruginosa PAO1. Para a ELISA por competição, os anticorpos foram biotinilados com o uso de Sulfo-NHS-Biotina e Kit de Biotinilação EZ-Link (Thermo Scientific). As placas revestidas com antígeno foram tratadas com o EC50 de anticorpos biotinilados coincubados com anticorpos não etiquetados. Após a incubação com estreptavidina conjugada com HRP (Thermo Scientific), as placas foram desenvolvidas conforme descrito acima. Os experimentos de competição entre mAbs anti-Psl determinaram que os anticorpos alvejaram pelo menos três epítopos únicos, denominados anticorpos de classe 1, 2, e 3 (Figura 10A). Os anticorpos de classe 1 e 2 não competem por ligação, entretanto o anticorpo de classe 3, WapR-016, inibe parcialmente a ligação dos anticorpos de classe 1 e 2.

[0326] A afinidade de anticorpo foi determinada pelos ensaios de ligação OCTET* com o uso de Psl derivado do sobrenadante de culturas de PAO1 de um dia para o outro. O KD de anticorpo foi determinado ponderando-se as cinéticas de ligação de sete concentrações para cada anticorpo. As medições de afinidade foram tomadas com um instrumento FORTEBIO" OCTET® 384 com o uso de placas com 384 cavidades inclinadas. O sobrenadante das culturas de PAO1 de um dia para o outro ± o gene pslA foram usados como a fonte de Psl. As amostras foram carregadas em sensores de aminopropilsilano OCTET* (hidratado em PBS) e bloqueadas, seguido pela medição de ligação de mAb anti-Psl em diversas concentrações, e dissociação em PBS + 1% de BS A. Todos os procedimentos foram realizados conforme descrito (Wang, X., et al., J Immunol Methods 362, 151 a 160). Os dados de AnM brutos de associação e dissociação foram ajustados em curva com GraphPad Prism. A Figura 10A mostra as afinidades de ligação relativas de anticorpos anti-Psl caracterizados acima. Os anticorpos de classe 2 tiveram as maiores afinidades de todos os anticorpos anti-Psl. A Figura 10A também mostra um resumo de anexação de célula e experimentos de dados de OPK. A Figura 10B mostra as afinidades de ligação relativas e valores de EC50 de OPK do mutante Wap-004RAD (W4RAD) bem como outros mutantes de W4 otimizados por líder por meio de mutagênese direcionada ao local conforme descrito no Exemplo 2. A Figura 10C mostra as afinidades de ligação relativas do Wap-004RAD (W4RAD), linhagem germinativa Wap-004RAD (W4RAD-GL) bem como anticorpos monoclonais anti-Psl otimizados por líder (Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, Psl0337, Psl348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, Psl0588 e Psl0589). Os clones destacados Psl0096, Psl0225, Psl0337, Psl0567 e Psl0588 foram selecionados com base em sua atividade de OPK acentuada, conforme mostrado no Exemplo 10 abaixo.

Exemplo 11: Avaliação de clones de mutante WapR-004 (W4) otimizados por líder e anticorpos monoclonais anti-Psl otimizados por líder no ensaio de eliminação opsonofagocítica de P. aeruginosa (OPK)

[0327] Esse exemplo descreve a avaliação de clones de mutante WapR-004 (W4) otimizados por líder e anticorpos monoclonais anti-Psl otimizados por líder para promover a OPK de P. aeruginosa com o uso do método descrito no Exemplo 2. As Figuras 11A-Q mostram que com a exceção do anticorpo de controle negativo R347, todos os anticorpos mediaram a eliminação dependente de concentração de cepa de sorogrupo 05 de P. aeruginosa luminescente (PAOl.lux).

Exemplo 12: V2L2 de anticorpo monoclonal Anti-PcrV reduz a letalidade da pneumonia aguda de múltiplas cepas

[0328] A diversidade de epítopo de PcrV foi analisada com o uso de três abordagens: método de citometria de fluxo baseada em microesfera, ELISA por competição e western blotting de rPcrV fragmentado. Os experimentos por competição entre mAbs anti-PcrV determinaram que os anticorpos alvejaram pelo menos seis epítopos únicas, denominadas anticorpos de classe 1, 2, 3, 4, 5 e 6 (Figura 12A). Os anticorpos de classe 2 e 3 competem parcialmente para ligação. Os mAbs que representam classes de epítopo adicionais: classe 1 (V2L7, 3G5, 4C3 e 11A6), classe 2 (1E6 e 1F3), classe 3 (29D2, 4A8 e 2H3), classe 4 (V2L2) e classe 5 (21F1, LEIO e SH3) foram esteados quanto à proteção in vivo conforme descrito abaixo.

[0329] Os mAbs anti-PcrV inovadores foram isolados com o uso de tecnologia de hibridoma e os inibidores de T3SS mais potentes foram selecionados com o uso de um ensaio de inibição de lise de célula sanguínea vermelha de coelho. A porcentagem de inibição da análise de citotoxicidade foi analisada para o V2L2 mAb parental, mAbl66 (controle positivo) e R347 (controle negativo), em que os anticorpos foram administrados à linhagem celular broncoepitelial A549 cultivada combinada com cepa de P. aeruginosa 6077 de fase log (exoU+) em um MOI de aproximadamente 10. A lise de A549 foi testada medindo-se a atividade de lactato desidrogenase liberada (LDH) e a lise na presença de mAbs foi comparada a cavidades sem mAb para determinar a porcentagem de inibição. O V2L2 mAb, mAb 166 (controle positivo) e R347 (controle negativo) foram avaliados por sua capacidade de evitar a lise de RBCs, em que os anticorpos foram misturados com P. aeruginosa 6077 de fase log (exoU ) e lavaram as células sanguíneas vermelhas de coelho (RBCs) e incubaram por 2 horas a 37°. As RBCs intactas foram peletizadas e a extensão da lise determinada medindo-se o OD405 do sobrenadante libre de célula. A lise na presente de mAbs anti-PcrV foi comparada a cavidades sem mAb para determinar a porcentagem de inibição. O anticorpo de controle positivo, mAb 166, é um anticorpo anti-PcrV caracterizado anteriormente (JInfect Dis. 186: 64 a 73 (2002), Crit Care Med. 40: 2.320 a 2.326 (2012)).(B) O mAb com V2L2 parental demonstrou inibição de citotoxicidade com um IC50 de 0,10 μg/ml e exibiu uma concentração de IC50 28 vezes menor do que mAb 166 (IC50 de 2,8 μg/ml). (C) V2L2 também demonstrou prevenção de lise de RBC com um IC50 de 0,37 μg/ml e exibiu uma concentração de IC50 10 vezes menor do que mAb 166 (IC50 de 3,7 μg/ml).

[0330] A região variável de V2L2 foi completamente germinada para reduzir a imunogenicidade potencial. V2L2 foi maturado por afinidade com o uso da abordagem de mutagênese com parcimônia para randomizar cada posição com 20 aminoácidos para todos os seis CDRs, identificando mutações únicas aprimoradas por afinidade. Uma biblioteca combinatorial foi então usada, encodificando todas as combinações possíveis de mutações únicas aprimoradas por afinidade. Os clones com afinidade aprimorada a PcrV foram selecionados com ouso de ligação ELISA no formato de IgG. Os clones superiores foram classificados por aprimoramento de afinidade e analisados em um ensaio funcional in vitro. V2L2 CDRs foram mutagenizados sistematicamente e os clones com afinidade aprimorada a PcrV foram selecionados em triagens à base de competição. Os clones foram classificados por aumentos em afinidade e analisados em um ensaio funcional. Conforme mostrado na Figura 12D, a lise de RBC foi analisada para MAb com linhagem germinativa V2L2 (V2L2-GL), mAbs otimizados por V2L2-GL (V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD e V2L2-MR), e um anticorpo de controle negativo R347 com o uso de células A549 infectadas por cepa de Pseudomonas 6077. V2L2-GL, V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD e V2L2-MR demonstraram prevenção de lise de RBC. Conforme mostrado na Figura 12E, mAbs 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 e V2L7 demonstraram prevenção de lise de RBC. Conforme mostrado na Figura 12F, V2L2 era mais potente na prevenção de lise de RBC do que o 29D2.

[0331] As cinéticas de ligação de V2L2-GL e V2L2-MD foram medidas com o uso de um instrumento Bio-Rad ProteOn™ XPR36. Os anticorpos foram capturados em um chip biosensor GLC com o uso de reagentes de IgG anti-humana. A proteína rPcrV foi injetada em múltiplas concentrações e a fase de dissociação seguir por 600 segundos. Os dados foram capturados e analisados com o uso de software ProteOn Manager. A Figura 12 (G-H) mostra as afinidades de ligação relativas dos anticorpos (G) V2L2-GL e (H) V2L2-MD. O V2L2-MD de clone aumentou Kd por 2 a 3 vezes sobre V2L2-GL.

[0332] O efeito in vivo da administração de um anticorpo anti-PcrV foi estudado em camundongos com o uso de um modelo de pneumonia aguda. Os grupos de camundongos foram tratados com quaisquer concentrações crescentes do anticorpo V2L2, um anticorpo de controle positivo anti-PcrV (mAb 166), ou um controle negativo (R347), conforme mostrado na Figura 13 (A-B). Os grupos de camundongos também foram tratados com quaisquer concentrações crescentes do anticorpo V2L2, o anticorpo de PcrV PcrV-02, ou um controle negativo (R347), conforme mostrado na Figura 13 (C-D). Vinte de quatro horas após o tratamento, todos os camundongos foram infectados com 5x10 CFU (C) Pseudomonas aeruginosa 6294 (06) ou (D) PA103A (011). Conforme mostrado na Figura 13, quase todos os animais tratados por controle sucumbiram à infecção em 48 horas pós infecção. Entretanto, V2L2 mostrou um efeito dependente de dose sobre sobrevivência aprimorada até mesmo em 168 horas pós infecção. Adicionalmente, V2L2 forneceu uma proteção significativamente mais potente do que mAbl66 em doses semelhantes (P=0,025, 5 mg/kg para cepa 6077; P < 0.0001, 1 mg/kg para cepa 6294).

[0333] Os grupos de camundongos foram tratados com concentrações crescentes do 11A6, 3G5 ou V2L7, as mesmas concentrações de 29D2, 1F3, 1E6, V2L2, LEIO, SH3, 4A8, 2H3, ou 21F1, concentrações crescentes do 29D2, concentrações crescentes do V2L2, o anticorpo de PcrV PcrV-02, ou um controle negativo (R347), conforme mostrado na Figura 13 (E-H). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente (IP) com mAbs 24 horas antes da infecção intranasal com cepa de Pseudomonas 6077 (1 x 106 CFU/animal). Conforme mostrado na Figura 13E mAbs 11A6, 3G5 e V2L7 não forneceram proteção in vivo. Conforme mostrado na Figura 13F, mAb 29D2 fornece proteção in vivo. Conforme mostrado na Figura 13G, mAb V2L2 também fornece proteção in vivo. A Figura 13H mostra a comparação in vivo de 29D2 e V2L2. A Figura 131 mostra que mAb V2L2 protege contra cepas de Pseudomonas adicionais (isto é,6294 e PA 103A).

[0334] A carga do pulmão dos camundongos infectados por Pseudomonas também foi estudada em resposta à administração de V2L2. Os camundongos da Figura 14 (A) forma tratados com 1 mg/kg de R347 (controle), ou 1 mg/kg, 0,2 mg/kg, ou 0,07 mg/kg de V2L2 e então foram infectados intranasalmente com 1,2 x 106 cfu de Pseudomonas 6206. Os camundongos da Figura 14 (B) também foram tratados com 15 mg/kg de R347 (controle negativo); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, ou 1,0 mg/kg de mAb 166 (controle positivo); ou 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, ou 0,2 mg/kg de V2L2 e então forma infectados intranasalmente com 5,5 x 106 cfu de Pseudomonas 6206. Conforme mostrado na Figura 14 (A-B), embora V2L2 tenha pouco efeito sobre limpeza no rim, o mesmo reduziu bastante a disseminação tanto no pulmão quanto no baço de uma forma dependente da dose. Além disso, o V2L2 forneceu uma redução significativamente maior em CFU de órgão do que mAb 166 em doses semelhantes (P < 0,0001, 1 mg/kg, pulmão).

Exemplo 13: Atividade in vivo de terapia de combinação com o uso de anticorpos WapR-004 (anti-Psl) e V2L2 (anti-PcrV)

[0335] O efeito in vivo de administração de combinação de anti-Psl e domínio de ligação de anti-PcrVs foi adicionalmente estudado em camundongos com o uso dos anticorpos V2L2 e WapR-004 (RAD). Grupos de camundongos foram tratados com R347 (2,1 mg/kg - controle negativo), V2L2 (0,1 mg/kg), W4-RAD (0,5 mg/kg), ou combinação de V2L2/W4 (tanto 0,1, 0,5, 1,0 ou 2,0 mg/kg cada). Vinte e quatro horas após a administração de anticorpo, todos os camundongos foram infectados com um inoculo que contém 5,25 x IO3 cfu 6206 (Oll-ExoU+). Vinte e quatro horas após a infecção, pulmões, baços, e rins foram coletados, homogeneizados, e laminados para unidade de formação de colônia (CFU) identificação por grama de tecido. Conforme mostrado na Figura 15, nas concentrações testadas, tanto V2L2 quanto W4 foram eficazes em diminuir a carga de órgão, a combinação de V2L2/W4 mostrou um efeito aditivo na clareza do tecido. A examinação histológica do tecido de pulmão revelou menos hemorragia, menos edema, e menos infiltrado inflamatório comparado a camundongos que recebem V2L2 ou WapR-004 sozinho (Tabela 5).

[0336] Animais imunizados de forma similar também foram analisados quanto à sobrevivência de infecções de pneumonia aguda. Tabela 5

[0337] Exemplo 14: Taxa de sobrevivência para animais tratados com anticorpo anti-PcrV monoclonal V2L2 em um modelo de pneumonia aguda P. aeruginosa

[0338] Anticorpos monoclonais V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-A, V2L2-C, V2L2-PM4 e V2L2-MFS foram avaliados em um modelo de pneumonia letal aguda em cepa 6077 de P. aeruginosa conforme previamente descrito no Exemplo 11. As Figuras 16 (A até F) mostram sobrevivência em todos os camundongos tratados com V2L2 infectados com a cepa 6077 quando comparados ao controle. No entanto, nenhuma diferença significativa na sobrevivência é observada entre os anticorpos V2L2 tanto na dose: 0,5mg/kg quanto na dose de 1 mg/kg (A até C) ou 0,5mg/kg e 0,1 mg/kg (D-F). As Figuras 16 (G a I) mostram a sobrevivência em todos os camundongos tratados com V2L2 infectados com cepa 6077 quando comparados ao controle, nenhuma diferença significativa na sobrevivência é observada entre anticorpos V2L2 tanto na dose: 0,5mg/kg quanto na dose 1 mg/kg (G-I). (A até H)

[0339] Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção por aproximadamente 48 horas após a infecção.

Exemplo 15: Construção de anticorpos biespecíficos de WapR-004/V2L2

[0340] A Figura 17A mostra TNFo. construtos de modelo biespecíficos. Para Bsl-TNFot/W4, o W4 scFv é fundido ao amino-terminal de TNFot VL através de um ligante (G4S)2. Para Bs2-TNFot/W4, o W4 scFv é fundido ao amino-terminal de TNFoc VH através de um ligante (G4S)2. Para Bs3-TNFot/W4, o W4 scFv é fundido ao carbóxi-terminal de CH3 através de um ligante (G4S)2.

[0341] Visto que a combinação de WapR-004 + V2L2 fornece proteção contra desafio de Pseudomonas, foram gerados construtos biespecíficos que compreendem um WapR-004 scFv (W4-RAD) e V2L2 IgG (Figura 17B). Para gerar Bs2-V2L2-2C, o W4-RAD scFv é fundido ao N- terminal de VH V2L2 através de ligante (G4S)2. Para gerar Bs3-V2L2-2C, W4-RAD scFv foi fundido ao C-terminal de CH3 através de ligante (G4S)2. Para gerar Bs4-V2L2-2C, o W4-RAD scFv foi inserido na região de dobradiça, ligada pelo ligante (G4S)2 em N-terminal e C-terminal de scFv. Para gerar Bs2-W4-RAD-2C, o V2L2 scFv foi fundido ao amino-terminal de VH W4-RAD através de um ligante (G4S)2.

[0342] Para gerar o W4-RAD scFv para o construto de Bs3, o W4- RAD VH e VL foram amplificados por PCR. Os iniciadores usados para amplificar o W4-RAD VH foram: iniciador avançado de VH W4-RAD: inclui ligante (G4S)2 e 22bp de sequência de N-terminal de VH (GTAAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGGTGCAG CTGTTGGAGTCGG (SEQ ID NO:224)); e iniciador reverso de W4-RAD VH: inclui parte de ligante (G4S)4 e 22 bp de sequência de C-terminal de VH (GATCCTCCGCCGCCGCTGCCCCCTCCCCCAGAGCCCCCTCCGCCA CTCGAGACGGTGACCAGGGTC (SEQ ID NO:225). De forma similar, o W4-RAD VL foi amplificado por PCR com o uso dos iniciadores: iniciador avançado de VL W4-RAD: inclui parte de ligante (G4S)2 e 22 bp de sequência de N-terminal VL (AGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATC TGGGGGAGGGGGCAGCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC (SEQ ID NO:226)); e iniciador reverso de VL W4-RAD: inclui parte de sequência de vetor e 22 bp de sequência de C-terminal de VL (CAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAC SEQ ID NO:227)). Os fragmentos de sobreposição foram então fundidos entre si para formar o W4-RAD scFv. sequência de W4-RAD scFv no vetor Bs3: sequências sublinhadas são ligantes G4S GGGGSGGGGSEVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIR QPPGKCLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTA ADTAVYFCARADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGK APKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQS YSFPLTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO:228)

[0343] Depois que o fragmento de W4-RAD de scFv foi amplificado, o mesmo foi então purificado com gel e ligado ao vector Bs3 que fora digerido com BamHI/NotI. A ligação foi feita com o uso do sistema InFusion, seguido pela transformação em células competentes Stellar. As colônias foram sequenciadas para confirmar a inserção correta de W4-RAD scFv.

[0344] Para gerar o Bs3-V2L2-2C, a porção de IgG no vetor Bs3 foi substituída por V2L2 IgG. Brevemente, o vetor Bs3 que contém W4-RAD scFv foi digerida com BssHII/SalI e a banda de vetor resultante foi purificada com gel. De forma similar, o vetor que contém V2L2 vector foi digerido com BssHII / Sall e a inserção de V2L2 foi purificada com gel. A inserção de V2L2 foi então ligada com o vetor Bs3-W4-RAD scFv e colônias foram sequenciadas para confirmar a inserção correta de V2L2 IgG.

[0345] Uma abordagem similar foi usada para gerar Bs2-V2L2-2C. Sequências de VH W4-RAD scFv-V2L2 no vetor Bs2: sequências sublinhadas são ligante G4S EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCAR ADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVL TQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASN LQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGT KLEIKGGGGSGGGGSEMQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSY AMNWVRQAPGEGLEWVSAITISGITAYYTDSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAGDTAVYYCAKEEFLPGTHYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:229)

[0346] Os iniciadores a seguir foram usadas para amplificar W4-RAD scFv. (iniciador avançado de) VH e (iniciador reverso de) VL: iniciador avançado de VH W4-RAD para o vetor Bs2 que inclui alguns introns, peptídeo sinal 3 e 22bp de sequência de N-terminal de VH W4-R.AD (TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG (SEQ ID NO:230)) e o iniciador reverso de VL W4-RAD para vetor Bs2: incluem ligante (G4S)2 e 32 bp de sequência de C-terminal de VL (CCCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCC CACAGCCGAAAG (SEQ ID NO:231))

[0347] Para amplificar a região de VH V2L2, os iniciadores a seguir foram usados: iniciador avançado de VH V2L2: inclui ligante (G4S)2 e 22 bp de V2L2 sequência de N-terminal de VH (GGCGGAGGGGGATC CGGCGGAGGGGGCTCTGAGATGCAGCTGTTGGAGTCTGG (SEQ ID NO:232)), e iniciador reverso de VH V2L2: inclui alguns de sequência de N- terminal CH 1 e 22 bp de sequência de C-terminal de VH V2L2 (ATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO: 233)).

[0348] Esses iniciadores foram então usados para amplificar VH V2L2, que foi então unido por sobreposição com W4-RAD scFv e VH V2L2 para obter W4-RAD scFv-V2L2-VH. O W4-RAD scFv-VH V2L2 foi então ligado ao vetor Bs2 por purificação com gel W4-RAD scFv -VH V2L2 (a partir do PCR sobreposto); a digestão do vetor Bs2 com BsrGI/SalI, e banda de vetor de purificação com gel. O W4-RAD scFv-V2L2-VH foi então ligada ao vetor Bs2 pelo sistema In-Fusion e transformada em células competentes Stellar e as colônias foram confirmadas para a inserção correta de W4-RAD scFv-VH V2L2. Para substituir VL no vetor Bs2 por VL V2L2, o vetor Bs2 que contém W4-RAD scFv-V2L2-VH foi digerido com BssHII/BsiWI e a banda de vetor foi purificada com gel. O vector de pOE-V2L2 foi então digerido com BssHII / BsiWI e a inserção de VL V2L2 foi purificada com gel. A inserção de VL V2L2 foi então ligada com os vetores Bs2-W4-RAD scFv-V2L2-VH e as colônias foram sequenciadas para a inserção correta de V2L2 IgG.

[0349] Finalmente, uma abordagem similar baseada em PCR foi usada para gerar o construto Bs4-V2L2-2C. A região de dobradiça com sequência de ligante é mostrada abaixo: Região de dobradiça com sequência de ligante: KVDKRVEPKSCGGGGSGGGGS - terminação N de scFv (SEQ ID NO:329) CHI dobradiça ligante C-terminal de scFv - GGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO:330) ligante dobradiça CH2 Sequências de W4-RAD scFvs no vetor BS4: W4-RAD scFv está em itálico e em negrito com os ligantes G4S sublinhados em itálicos em negrito', regiões de dobradiça são duplamente sublinhadas KVDKRV1EPKSCGGGGSGGGGSE VQLLESGPGL VKPSE TLSL TCNVA GGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSGYTD YNPSLKSR VTISGD TSK KQFSLHVSSVTAADTA VYFCARADWDLLHALDIWGQGTL VTVSSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEIVL TQSPSSLSTSVGDR VTITCRASQSIRSH LNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DF A TYYCQQSYSFPL TFGCGTKLEIKGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPkYYYUSYÁ) ID NO:324) W4-RAD scFv é apresentado em itálico e em negrito com os ligantes G4S sublinhados em itálicos em negrito E VQLLESGPGL VKPSETLSL TCNVA GGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIG YIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARA D WDLLHALDIWGQGTL VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEI VL T QSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGTK

LEIK

[0350] W4-RAD scFv foi gerado com o uso de PCR e os iniciadores a seguir: iniciador avançado de VH W4-RAD para vector Bs4: inclui algumas das sequências de ligante e 24 bp de sequência de N-terminal de VH W4- RAD (GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGC (SEQ ID NO:236)); e iniciador reverso de VL W4-RAD for vector Bs4: inclui alguma sequência de dobradiça, ligante e 21 bp de W4-RAD sequência de C-terminal de VL (GTGTGAGTTTTGTCggatccCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTTTG ATCTCCAGCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 237)).

[0351]W4-RAD scFv foi então ligada ao vector Bs4 para obter Bs4- V2L2-2C por purificação com gel W4-RAD scFv (de PCR); o Bs4-V2L2 vector foi digerido com BamHI e a banda de vetor foi purificada com gel. O W4-RAD scFv foi ligado com vector Bs4 pelo sistema In-Fusion e o vetor transforma células competentes Stellar. As colônias foram sequenciadas para a inserção correta de W4-RAD scFv.

[0352] As sequências para a cadeia leve e cadeia pesada do construto Bs4-V2L2-2C são fornecidas em SEQ ID NOS: 327 e 328, respectivamente.

Exemplo 16: Um anticorpo biespecífico Psl/PcrV promove a sobrevivência em modelos de pneumonia

[0353] Como uma questão inicial, os anticorpos biespecíficos Bs2 e Bs3 foram testados para examinar se os mesmos retiveram sua atividade de W4 ou V2L2 em um formato biespecífico. Para o W4 scFv parental, foi gerado um anticorpo biespecífico que tem W4 e um braço de ligação de TNF- alfa. Um análise de anexação de célula foi desempenharam conforme descrito acima com o uso da cepa luminescente P. aeruginosa PAOl.lux. Conforme mostrado na Figura 18, todos os construtos biespecíficos desempenharam similaridade ao construto W4-IgGl parente.

[0354] Conforme mostrado na Figura 19 (A até C), a inibição de porcentagem de citotoxicidade foi analisada tanto para Bs2-V2L2 quanto para Bs3-V2L2 com o uso tanto de (A) 6206 quanto de (B) 6206 células infectadas com ΔpslA, e (C) inibição de porcentagem de lise de RBC foi analisada para Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C com o uso de 6206 células infectadas. Conforme mostrado na Figura 19 (A até C), todos os anticorpos biespecíficos retiveram atividade de anticitotoxicidade e lise de RBC inibida em níveis similar ao anticorpo V2L2 parental com o uso de células infectadas com ΔpslA 6206 e 6206.

[0355] A capacidade dos anticorpos biespecíficos Bs2 e Bs3 para mediar OPK de P. aeruginosa foi analisada com o uso do método descrito no Exemplo 2. Embora o anticorpo de Bs2-V2L2 tenha mostrado eliminação similar comparada ao anticorpo W4-RAD parental, a eliminação do anticorpo Bs3-V2L2 foi diminuída (Figura 20A). Embora os anticorpos Bs2-V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C tenham mostrado a eliminação similar comparada ao anticorpo W4-RAD parental, a eliminação do anticorpo Bs3-V2L2-2C foi diminuída (Figura 20B). A Figura 20C mostra que diferentes preparações de Bs4 anticorpos (velha porção vs. nova porção) mostraram eliminação similar comparada ao anticorpo W4-RAD parental, no entanto, os anticorpos Bs4- V2L2-2C-YTE tiveram um queda de 3 vezes na atividade de OPK quando comparado ao Bs4-V2L2-2C. Um mutante de YTE compreende uma combinação de três "mutações de YTE": M252Y, S254T, e T256E, em que a numeração está de acordo com o índice de EU conforme apresentado em Kabat, introduzido na cadeia pesada de um IgG. Consulte o documento de patente de n° U.S. 7.658.921, que é incorporado ao presente documento a título de referência. O mutante de YTE foi mostrado para aumentar a meia vida de soro de anticorpos em aproximadamente quatro vezes conforme comparado às versões de tipo selvagem do mesmo anticorpo. Consulte, por exemplo, DalfAcqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006) e documento de patente de n° U.S. 7,083,784, que são incorporados ao presente documento a título de referência em suas integridades.

[0356] Seguindo a confirmação de que tanto W4 quanto V2L2 retiveram atividade em um formato biespecífico, os construtos Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 e Bs4-V2L2 foram analisados para sobrevivência de infecções de pneumonia aguda. Conforme mostrado na Figura 21 A, todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção por aproximadamente 30 horas após a infecção. Todos os animais de Bs3-V2L2 sobreviveram, junto a aqueles que receberam o controle de V2L2. Aproximadamente 90% dos Animais imunizados com W4-RAD sobreviveram. Em contraste, As Figuras B a F mostram que aproximadamente 50% dos animais de Bs2-V2L2 sucumbiram à infecção por 120 horas. Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção por aproximadamente 48 horas após a infecção. As Figuras G-H do não se diferenciam na sobrevivência entre camundongos tratados com Bs4- V2L2-2C e Bs4-V2L2-2C-YTE tanto na dose. Esses resultados sugerem que ambos os anticorpos funcionam de forma equivalente nos modelo de pneumonia aguda 6206. A Figura 21 I mostra que a mistura de anticorpo Bs2- V2L2, Bs4-V2L2-2C, e W4-RAD + V2L2 é a mais eficaz na proteção contra pneumonia letal em camundongos estimulados com cepa 6206 de P. aeruginosa (ExoU+).

[0357] A carga no órgão também foi analisada em relação a camundongos similares imunizados conforme descrito acima. Seguindo a imunização conforme acima, os camundongos foram estimulados com 2.75 x 103 CFU 6206. Conforme mostrado na Figura 22, na concentração testada, tanto Bs2-V2L2 quanto Bs3-V2L2 diminuíram significativamente a carga de órgão no pulmão. No entanto, nenhum dos construtos biespecíficos teve capacidade de afetar de forma significativa a carga humano no baço ou rim comparado aos anticorpos parentais devido ao uso de concentrações sub- ideais dos construtos biespecíficos. As concentrações sub-ideais foram usadas para permitir a capacidade de decifrar a atividade de anticorpo.

[0358] Os efeitos de sobrevivência e carga de órgão dos anticorpos biespecíficos também foram direcionados ao uso da cepa 6294. Com o uso do sistema de modelo 6294, tanto BS2-V2L2 quanto BS3-V2L2 diminuíram significativamente a carga de órgão em todos os tecidos a um nível comparável ao do Anticorpo V2L2 parental. O anticorpo W4-RAD parental não teve efeito na diminuição da carga de órgão (Figura 23A). Conforme mostrado na Figura 23B, Bs2-V2L2, Bs3-V2L2, e a combinação W4- RAD+V2L2 diminuiu significativamente a carga de órgão em todos os tecidos a um nível comparável ao do anticorpo V2L2 parental.

[0359] Os dados de sobrevivência para camundongos imunizados foi similar aos camundongos estimulados com 6294 como antes. Conforme mostrado na Figura 24, BS3-V2L2 mostrou atividade similar de sobrevivência a Camundongos tratados sozinhos com V2L2, enquanto BS2-camundongos tratados com V2L2 mostraram um nível ligeiramente inferior de proteção de estímulo.

[0360] A carga de órgão também foi analisada em anticorpos biespecíficos tratados na comparação com animais tratados com combinação conforme descrito acima. Conforme mostrado nas Figuras 25 (A até C), tanto BS2-V2L2 quanto BS3-V2L2 diminuíram a carga de órgão no pulmão, baço e rins a um nível comparável ao da combinação W4 + V2L2. No pulmão, a combinação reduziu significativamente os CFUs bacterianos Bs2- e Bs3- V2L2 e V2L2 com o uso do Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn. Diferenças significativas de carga bacteriana no baço e rim não foram observadas, embora uma tendência para redução fosse notada. Um estudo da carga de órgão também foi desempenhado com Bs4-GLO com o uso de 6206 no modelo de pneumonia. Conforme mostrado na Figura 25 (D), quando maiores concentrações de anticorpo são usadas na profilaxia de camundongos, um nível significativo (Kruskal-Wallis com Pós teste de Dunn) de redução na carga bacteriana do pulmão foi observada. Reduções Significativas de disseminação bacteriana ao baço e rins também foram observadas quando com o uso de maiores concentrações de Bs4-GLO nesse modelo.

[0361] Esses resultados foram confirmados pela examinação histológica de tecido de pulmão de camundongos imunizados com BALB/c estimulados com l.33x10 CFU com o uso de Cepa 6294 de P. aeruginosa (Tabela 6A), 1.7x10 CFU com o uso de Cepa 6294 de P. aeruginosa (Tabela 6B) e 9,25 x 10? CFU com o uso de cepa de P. aeruginosa 6206 (Tabela 7).

Exemplo 17: Terapia adjuntiva terapêutica: Bs4-V2L2-2C + antibiótico

[0362] Efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4 e terapia adjuntiva de antibiótico foi avaliada em um modelo de pneumonia letal aguda contra cepa 6206 de P. aeruginosa conforme previamente descrito no Exemplo 6 (Figura 26 (A até J)). (A até B) Os Camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção com 6206 com R347 (controle negativo) ou Bs4- V2L2-2C ou Ciprofloxacin (CIP) 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 24 horas antes da infecção e Cipro 1 hora após a infecção. (C) Os camundongos foram tratados 1 hora após a infecção com 6206 com R347 ou CIP ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e CIP. (D) Os Camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou CIP ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e CIP. (E) Os camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Bs4-V2L2-2C ou CIP 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e CIP 1 hora após a infecção. (F) Os camundongos foram tratados 1 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Meropenem (MEM) ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e MEM. (G) Os camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Bs4-V2L2-2C ou MEM 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e MEM 1 hora após a infecção. (H) Os camundongos foram tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Bs4-V2L2-2C ou MEM, ou uma combinação do Bs4- V2L2-2C 2 e MEM. (I) Os camundongos foram tratados 4 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Cipro ou Bs4-V2L2-2C ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Cipro. Todos os camundongos de controle sucumbiram à infecção por aproximadamente 24 horas após a infecção. Conforme mostrado nas Figuras 26 (A até I) o anticorpo Bs4 combinado tanto com CIP como com MEM aumenta a eficácia de terapia antibiótica, indicando proteção sinérgica quando as moléculas são combinadas. Estudos adicionais se focaram no nível de carga bacteriana em camundongos tratados com Bs4 ou CIP sozinho ou em combinação (Bs4+CIP). Conforme mostrado na Figura 26 (J), o nível de carga bacteriana em todos os órgãos (pulmão, baço e rins) foi similar em R347+CIP e Bs4+CIP, no entanto, somente os camundongos em que Bs4 foi incluído na combinação com CIP sobrevivem à infecção (Figuras 26 (A até E, I)). Em geral, esses dados indicam que os antibióticos são importantes para reduzir a carga bacteriana nesse ajuste de modelo de animal, no entanto, exige-se que o anticorpo específico reduza a patogenicidade bacteriana, protegendo desse modo a imunidade do hospedeiro normal.

[0363] O efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4 e terapia adjuntiva de antibiótico Tobramicina será avaliado em um modelo de pneumonia letal aguda contra a cepa 6206 de P. aeruginosa conforme previamente descrito no Exemplo 6. Os camundongos serão tratados 24 horas antes da infecção com 6206 com R347 (controle negativo) ou Bs4-V2L2-2C ou Tobramicina 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 24 horas antes da infecção e Tobramicina 1 hora após a infecção. Os camundongos também serão tratados 1 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Tobramicina ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2- 2C e Tobramicina. Adicionalmente, os camundongos serão tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Tobramicina ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Tobramicina. Ademais, os camundongos serão tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Bs4-V2L2-2C ou Tobramicina 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e Tobramicina 1 hora após a infecção. Os camundongos serão tratados 4 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Tobramicina ou Bs4-V2L2-2C ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Tobramicina.

[0364] O efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4 e terapia adjuntiva de antibiótico Aztreonam será avaliado em um modelo de pneumonia letal aguda contra a cepa 6206 de P. aeruginosa conforme previamente descrito no Exemplo 6. Os camundongos serão tratados 24 horas antes da infecção com 6206 com R347 (controle negativo) ou Bs4-V2L2-2C ou Aztreonam 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 24 horas antes da infecção e Aztreonam 1 hora após a infecção. Os camundongos também serão tratados 1 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Aztreonam ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Aztreonam. Adicionalmente, os camundongos serão tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Aztreonam ou Bs4-V2L2-2C, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Aztreonam. Ademais, os camundongos serão tratados 2 horas após a infecção com 6206 com R347 ou Bs4-V2L2-2C ou Aztreonam 1 hora após a infecção, ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C 2 horas após a infecção e Aztreonam 1 hora após a infecção. Os camundongos serão tratados 4 hora após a infecção com 6206 com R347 ou Aztreonam ou Bs4-V2L2-2C ou uma combinação do Bs4-V2L2-2C e Aztreonam.

Exemplo 18: Construção do anticorpo biespecífico BS4-GLO

[0365] Foi gerado o construto biespecífico de BS4-GLO (Orientação Germinativa Otimizada) que compreende anti-Psl scFv (Psl0096 scfv) e V2L2-MD (VH+VL) conforme mostrado na Figura 35A. A cadeia leve de BS4-GLO compreende região variável de cadeia leve (isto é, V2L2-MD) de anticorpo anti-PcrV otimizado de orientação germinativa. A cadeia pesada de BS4-GLO compreende a fórmula VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3, em que CHI é um domínio-1 de região constante de cadeia pesada, Hl é um primeiro fragmento de região de dobradiça de cadeia pesada, LI é um primeiro ligante, S é um molécula anti-PcrV ScFv, L2 é um segundo ligante, H2 é um segundo fragmento de região de dobradiça de cadeia pesada, CH2 é um domínio-2 de região constante de cadeia pesada, e CH3 é um domínio-3 de região constante de cadeia pesada. Cadeia leve de Bs4-GLO: AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLI YSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPW TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:...) Região variável de cadeia leve V2L2 (isto é, V2L2-MD) de GLO (orientação germinativa otimizada) é sublinhada Cadeia pesada de Bs4-GLO: EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGEGLE WVSAITISGITAYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVY YCAKEEFLPGTHYYYGMDVWGQGTTVTVSS1ASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKRVIEPKSÇGGGG.SGG' GGSEVQLLESGPGL VKPSETLSL TCNVA GGSISPYYWTWIRQPPGKCL ELIGYIHSSGYTDYNPSLKSR VTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTA VYF CARAD WDLLHALDIWGQGTL VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE IVL TQSPSSLSTSVGDR VTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLFYG ASNLQSG VPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFA TYYCQQSYSFPL TFG CGr#£E//fGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK região variável de cadeia pesada de V2L2 (isto é, V2L2- MD) de GLO (orientação germinativa otimizada) é sublinhada; CHI está entre colchetes [];W4-RAD (isto é, Psl0096) de GLO (orientação germinativa otimizada)scFv está em itálico e em negrito com os ligantes G4S sublinhados em itálico em negrito, regiões de dobradiça são duplamente sublinhadas,

[0366] Um construto de Bs4-GLO alternativo biespecífico que compreende um anti-PcrV ScFv e um anti-Psl (VH+VL) é mostrado na Figura 35B, e é gerada similaridade.

Exemplo 19: Avaliação da atividade funcional e eficácia do anticorpo biespecífico de Bs4-GLO

[0367] Anticorpos biespecíficos Bs4-WT (também denominados no presente documento como Bs4-V2L2-2C), Bs4-GL (que compreende regiões variáveis anti-PcrV e anti-Psl) e Bs4-GLO produzidos conforme descrito no Exemplo 18 foram testados para diferenças na atividade funcional em um ensaio de eliminação opsonofagocítica (Figura 27A), conforme previamente descrito no Exemplo 2, análise de anexação anti-celular (Figura 27B), conforme previamente descrito no Exemplo 4 e uma ensaio de anti- citotoxicidade de lise de RBC (Figura 27C), conforme previamente descrito no Exemplo 12. Nenhuma diferença in vitro em atividades funcionais entre os anticorpos foi observada.

[0368] A eficácia In vivo de Bs4-GLO foi examinada da seguinte forma. Para avaliação profilática, os camundongos foram profilaticamente tratados com diversas concentrações do Bs4-GLO (isto é, 0,007mg/kg, 0,02mg/kg, 0,07mg/kg, 0,2mg/kg, 0,5mg/kg, 1 mg/kg, 3mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg ou 15mg/kg) (Figura 28A), 24 horas antes da infecção com as cepas de P. aeruginosa a seguir(6206 (1,0 x 106), 6077 (1,0 x 106), 6294 (2,0 x 107) ou PA 103 (1,0 x 106)). Para avaliação terapêutica, os camundongos foram terapeuticamente tratados com diversas concentrações do Bs4-GLO (isto é, 0,03mg/kg, 0.3mg/kg, 0,5mg/kg, 1 mg/kg, 2mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg, 15mg/kg, ou 45mg/kg) (Figura 28B), em uma hora após a infecção com as cepas de P. aeruginosa a seguir (6206 (1,0 x 106), 6077 (1,0 x 106), 6294 (2,0 x 107) ou PA103 (1,0 x 106)).

[0369] O efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4-GLO foi avaliado em um modelo de pneumonia letal aguda contra diferentes cepas de P. aeruginosa conforme previamente descrito no Exemplo 6. A Figura 29 mostra taxa de sobrevivência para animais tratados com o Bs4-GLO em um modelo de bacteremia letal de P. aeruginosa. Os aspectos do modelo de bacteremia são revelados em detalhes no pedido provisório de n° U.S. 61/723,128, depositado em 6 de novembro de 2012 (Número do Dossiê do Advogado ATOX-500P1, intitulado “METHODS OF TREATING S. AUREUS ASSOCIATED DISEASES”), que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0370] Os animais foram tratados com Bs4-GLO ou R347, 24 horas antes da infecção intraperitoneal com (A) 6294 (06) ou (B) 6206. O BS4- GLO é eficaz em todas as concentrações testadas na proteção contra pneumonia letal em camundongos estimulados com cepas de P. aeruginosa (A) 6294 e (B) 6206.

[0371] O efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4-GLO foi avaliado em um modelo de lesão térmica por P. aeruginosa contra diferentes cepas de P. aeruginosa. A Figura 30 mostra a taxa de sobrevivência para animais profilaticamente tratados com o Bs4-GLO em um modelo de lesão térmica por P. aeruginosa. Os animais foram tratados com Bs4-GLO ou R347 horas antes da indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa de P. aeruginosa (A) 6077 (OH-EXOLT) OU (B) 6206 (OII-EXOLT) OU (C) 6294 (06) diretamente sob a ferida. O BS4-GLO é eficaz em todas as concentrações testadas na prevenção em um modelo de lesão térmica por P. aeruginosa em camundongos estimulados com cepas de P. aeruginosa (A) 6077, (B) 6206 e (C) 6294.

[0372] A Figura 31 mostra a taxa de sobrevivência para animais tratados terapeuticamente com anticorpo biespecífico Bs4-GLO em um modelo de lesão térmica por P. aeruginosa. (A) Os animais foram tratados com Bs4-GLO ou R347 (A) 4h horas ou (B) 12 horas após a indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6077 de P. aeruginosa (OI 1-EXOLC) diretamente sob a ferida. O Bs4-GLO é eficaz em todas as concentrações testadas em tratamento em um modelo de lesão térmica por P. aeruginosa em camundongos tratados com Bs4-GLO (B) 4 horas ou (B) 12 horas após a indução de lesão térmica e infecção subcutânea com cepa 6077de P. aeruginosa.

Exemplo 20: Terapia adjuntiva terapêutica: Bs4-GLO + antibiotic

[0373] O efeito de sobrevivência do anticorpo biespecífico Bs4-GLO e a terapia adjuntiva antibiótica foram avaliados em um modelo de pneumonia letal aguda contra cepa de P. aeruginosa 6206 conforme previamente descrito no Exemplo 6.

[0374] A Figura 32 mostra terapia adjuntiva terapêutica com ciprofloxacina (CIP). (A) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com cepa 6206 de P. aeruginosa com R347 + CIP ou Bs4-WT ou uma combinação do Bs4-WT e CIP. (B) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com cepa 6206 de P. aeruginosa com R347 + CIP ou Bs4- GLO ou uma combinação do Bs4-GLO e CIP. (A-B) O anticorpo Bs4-WT ou BS4-GLO combinado com CIP aumentou a eficácia da terapia antibiótica.

[0375] A Figura 33 mostra terapia adjuntiva terapêutica com meropenem (MEM): (A) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com cepa 6206 de P. aeruginosa com R347 + MEM ou Bs4-WT ou uma combinação do BS4-WT e MEM. (B) Camundongos foram tratados 4 horas após a infecção com cepa 6206 de P. aeruginosa com R347 + MEM ou BS4 ou uma combinação do Bs4-GLO e MEM. (A-B) O anticorpo Bs4-WT ou Bs4-GLO combinado com MEM aumenta a eficácia da terapia antibiótica.

[0376] A Figura 34 mostra terapia adjuntiva terapêutica: Bs4-GLO mais antibiótico em um modelo de bacteremia letal. Camundongos foram tratados 24 horas antes da infecção intraperitoneal com cepa 6294 de P. aeruginosa com Bs4-GLO nas concentrações indicadas, que foram previamente determinadas como em doses protetoras sub-terapêuticas nesse modelo e R347 (controle negativo). Uma hora após a infecção, os camundongos foram tratados por via subcutânea com antibióticos nas concentrações indicadas, que foram previamente determinadas como doses protetoras sub-terapêuticas, (A) Ciprofloxacina (CIP), (B) Meropenem (MEM) ou (C) Tobramicina (TOB). Os animais foram monitorados com cuidado para sobrevivência até 72 horas após a infecção. O anticorpo Bs4- GLO combinado com tanto CIP, MEM ou TOB, em doses sub-protetoras, aumenta a eficácia da terapia antibiótica.

[0377] A revelação não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas, as quais se destinam a ilustrações únicas de aspectos individuais da revelação e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta revelação. De fato, várias modificações da revelação adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e desenhos anexos. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

[0378] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados ao presente documento a título de referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicada como incorporada a título de referência. Adicionalmente, os Pedidos Provisórios n° US 61/556.645 depositado em 7 de novembro de 2011; 61/624.651 depositado em 16 de abril de 2012; 61/625.299 depositado em 17 de abril de 2012; 61/697depositado em 585 depositado em 6 de setembro de 2012 e Pedido Internacional n° PCT/US2012/63639, depositado em 6 de novembro de 2012 (número do dossiê AEMS-115WO1, nomeado “MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF”) são incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. Tabela 6A

Tabela 6B

Tabela 7

Claims

1.Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação que se liga a Ps1 de PSEUDOMONAS e um domínio de ligação que se liga a PcrV de PSEUDOMONAS, em que o domínio ligante de Ps1 compreende: (a)uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo PYYWT (SEQ ID NO: 47); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ADWDRLRALDI (SEQ ID NO: 258); (b)um CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQSIRSHLN (SEQ ID NO: 50); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GASNLQS (SEQ ID NO: 51); e um CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSTGAWNW (SEQ ID NO: 280); e em que o domínio de ligação PcrV compreende (c)uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SYAMN (SEQ ID NO: 218); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AITMSGITAYYTDDVKG (aminoácidos 50-66 de SEQ ID NO: 264); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220); (d)uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SASTLQS (SEQ ID NO: 222); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223)..

2.Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de Ps1 compreende um fragmento de scFv e o domínio de ligação de PcrV compreende uma imunoglobulina intacta.

3.Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de Ps1 compreende uma imunoglobulina intacta e o domínio de ligação de PcrV compreende um fragmento scFv.

4.Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que (a)o scFv se funde ao amino-terminal da região VH da imunoglobulina intacta; ou (b)o scFv se funde ao carbóxi-terminal da região CH3 da imunoglobulina intacta.

5.Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o scFv é inserido na região de dobradiça da imunoglobulina intacta.

6.Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de anti-PcrV compreende um VH compreendendo os aminoácidos 1-124 da SEQ ID NO: 264 e uma VL compreendendo os aminoácidos 1-107 da SEQ ID NO: 263.

7.Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de anti-Psl compreende um fragmento scFv compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 262.

8.Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de anti-Ps1 compreende um fragmento scFv compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:262 e em que o domínio de ligação de anti-PcrV compreende uma VH compreendendo os aminoácidos 1-124 da SEQ ID NO: 264, e uma VL compreendendo os aminoácidos 1-107 da SEQ ID NO: 263.

9.Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 264 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 263.

10.Composição, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico ou fragmento do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

11.Uso da composição conforme definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para a prevenção de uma infecção por PSEUDOMONAS em um indivíduo.

12.Uso da composição conforme definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para o tratamento de uma infecção por PSEUDOMONAS em um indivíduo.