BR112014010811B1

BR112014010811B1 - Multissomas: redes de gotículas encapsuladas

Info

Publication number: BR112014010811B1
Application number: BR112014010811-0A
Authority: BR
Inventors: John Hagan Pryce Bayley; Andrew Heron; Gabriel Villar
Original assignee: Oxford University Innovation Limited
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2022-07-12
Also published as: US20140356289A1; EP2773451A1; CN104053497A; US10548852B2; IN2014CN03680A; CA2853966C; GB201119032D0; JP2015501328A; KR102038450B1; BR112014010811A8; BR112014010811A2; US11998642B2; CA2853966A1; AU2012330894A1; AU2012330894B2; US11406603B2; CN104053497B; US20230048266A1; US20200214988A1; WO2013064837A1

Abstract

REDES DE GOTÍCULAS ENCAPSULADAS MULTISOMAS. A invenção proporciona uma gotícula encapsulada compreendendo: uma gota de um meio hidrofóbico; uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota; e uma gotícula de solução aquosa no interior da camada periférica, a gotícula solução aquosa compreendendo: (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso. A invenção também proporciona processos para preparar as gotículas encapsuladas. Várias utilizações da gotícula encapsulada são também descritas, incluindo a sua utilização como veículos de entrega de drogas, em biologia sintética, e no estudo de proteínas de membrana.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se gotas encapsuladas, que são também referidos aqui como "multisomas", e as composições que compreendem a gota encapsulada. A invenção também proporciona processos para preparar as gotas encapsuladas. Várias utilizações da gota encapsulada são também descritas, incluindo a sua utilização como veículos de entrega de fárma- cos, em biologia sintética, e no estudo de proteínas de membrana.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Uma gota aquosa feita em uma solução de lipídios em óleo adquire um revestimento monocamada de lipídios, e duas gotas de tais postos em contato formar uma camada dupla lipídica na sua interface, chamada uma camada dupla interface de gotícula (DIB) (Funakoshi,. Et al. Anal. Chem. 78, 8169-8174 (2006); Holden, MA et al. J. Am.Chem. Chem. Soe. 129, 8650-8655 (2007)). Da mesma forma, um suporte de hidrogel plana pode ser usado em lugar de uma das gotas de modo a formar uma bicamada gota sobre hidrogel (DHB) (Heron, AJ et al. J. Am. Chem. Chem. Soe. 129, 16.042-16.047 (2007)). DIBs e DHBs provaram notavelmente plataformas estáveis para medições elétricas ou ópticos em proteínas de membrana única (Holden, MA et al., J. Am. Chem. Chem. Soc. 129, de 8650-8655 (2007); Heron, AJ et al. J. Am. Chem. Chem. Soe. 129, 16042-16047 (2007); Syeda, R. et al, J. Am. Chem. Chem. Soc.130, 15543-15548 (2008); Heron, AJ et al. J. Am. Chem. Chem. Soe. 131, 1652-1653 (2009)). Além da utilidade de camadas duplas de interface individuais em medições biofísicas, redes funcionais de gota unidas por DIBs podem ser construídos para explorar uma variedade de bombas de membrana, os canais e poros para agir como sensores de luz, as baterias, e dispositivos elétricos (Holden, MA et al, J. Am. Chem Soc. 129, 8650-8655 (2007); Maglia, G. et al Nat Nanotechnol 4, 437-440 (2009)). Enquanto as redes de gota fornecer um meio para construir dispositivos funcionais, eles foram vítimas de uma restrição importante: as gotas devem ser rode- adas por uma fase de óleo a granel, o que impossibilitou a sua utilização em ambientes aquosos fisiológicos e outros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] Os inventores proporcionaram agora redes de gotí- culas de solução aquosa encapsuladas que não necessitam de uma fase de óleo a granel e são estáveis em ambientes aquosos e outros hidrofíli- cos. Gotículas de solução aquosa e redes de gota, que são delimitadas por moléculas anfifílicas, foram estabilizados encapsulando-os dentro de pequenas gotas de um meio hidrofóbico. A gotícula resultante encapsula, que também são aqui referidos como "multisomas", pode comunicar com o ambiente externo através de proteínas de membrana. Além disso, as proteínas da membrana permitem múltiplas gota no mesmo multisoma para comunicar uns com os outros. Isso, em princípio, permite multisomas de sentir seu ambiente, informações do processo, e de forma contingente entregar materiais para os arredores. Múltiplas gotas no mesmo encapsulamento de gota também podem libertar o seu conteúdo para o ambiente ao mesmo tempo, por exemplo, depois de um decréscimo no pH ou um aumento da temperatura, o que proporciona um método útil para a entrega de fármacos combinatória. Outras aplicações de multisomas variam de proporcionar uma nova plataforma para o estudo fundamental de proteínas de membrana, de atuar como chassis protocelular multicom- partimentos para a biologia sintética "de baixo para cima".

[0004] Deste modo, num primeiro aspecto, a invenção- proporciona uma gotícula encapsulada compreendendo: - Uma gota de um meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po- liméricas em torno da superfície da gota; e uma das gotas no interior da camada periférica, compre-endendo a gota solução aquosa: (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso.

[0005] As camadas periféricas e externas podem em conjunto formar uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica.

[0006] Num segundo aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de uma gotícula encapsulada, que gotícula encapsulada compreende: uma gota de um meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po-liméricas em torno da superfície da gota; e uma das gotas no interior da camada periférica, compre-endendo a gota solução aquosa: (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; processo esse que compreende: a transferência de uma gotícula de solução aquosa, que compreende gotículas de solução aquosa (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso, numa gota de um meio hidrofóbico, que tem suspensa uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da sua superfície.

[0007] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada que é obtida por um processo do segundo aspecto da invenção, tal como definido acima.

[0008] Num terceiro aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de uma gotícula encapsulada, que gotícula encapsulada compreende: - Uma gota de um meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po-liméricas em torno da superfície da gota; e - Uma das gotas no interior da camada periférica, com-preendendo a gota aquosa (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; processo esse que compreende: (i) a introdução de uma gota de um meio hidrofóbico num veículo hidrofílico, na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas, pro-duzindo, assim, uma gota de um meio hidrofóbico e uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota; (ii) introdução de uma gotícula de um meio aquoso para um meio hidrofóbico, na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo, assim, uma das gotas dentro do meio hidrofóbico, compreendendo a referida gotícula de solução aquosa: (a) o referido meio aquoso, e (b) uma camada externa das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; em que os passos (i) e (ii) podem ser realizados em qualquer ordem ou simultaneamente; e (iii) transferir a gota aquosa produzida no passo (ii) para a gota do meio hidrofóbico produzido no passo (i), produzindo assim a referida gotícula encapsulada.

[0009] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada que é obtida por um processo do terceiro aspecto da invenção, tal como definido acima.

[0010] As gotas encapsuladas da invenção também podem ser produzidas usando técnicas de microfluidos, que podem, por exemplo empregam dispositivos microfluídicos de cisalhamento ou foco de fluxo consecutivos.

[0011] Assim, num outro aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de uma gotícula encapsulada, cujo processo compreende: (i) introdução de uma gota de meio aquoso a partir de um primeiro canal de um dispositivo de microfluidos, que o primeiro canal contém o referido meio aquoso, num segundo canal do dispositivo de microfluidos, que segundo canal contém um meio hidrofóbico, em que o meio aquoso, no primeiro canal, ou o meio hi-drofóbico no segundo canal, ou ambos, compreender adicionalmente moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo, assim, no segundo canal de uma gotícula de solução aquosa no meio hidrofóbico, compreendendo a referida gotícula de solução aquosa: (a) o referido meio aquoso e (b) uma camada externa das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; e (ii) introdução de uma gota do referido meio hidrofóbico a partir do segundo canal, o qual gota de meio hidrofóbico compreende a gota de solução aquosa, em um terceiro canal do dispositivo microfluídico, em que o terceiro canal contém um veículo hidrofílico, em que o meio hidrofóbico no segundo canal, ou o veículo hidrofílico no terceiro canal, ou ambos, compreender adicionalmente moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo-se assim no terceiro canal gotícula en-capsulada no interior do veículo hidrofílico, a gotícula encapsulada compreendendo: - A gota do referido meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po-liméricas em torno da superfície da gota; e - A referida gotícula de solução aquosa no interior da referida camada periférica.

[0012] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada que é obtido por um processo do aspecto adicional da invenção, tal como definido acima.

[0013] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo: uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, e um veículo hidrofílico. A composição pode compreender uma pluralidade de gota de encapsula a invenção e o referido veículo hidrofílico.

[0014] A gotícula encapsulada da invenção pode compreender um ou mais agentes bioativos, por exemplo, terapêutico e / ou agentes de diagnóstico, e, como mencionado acima, são úteis como veículos de entrega de fármacos.

[0015] Por conseguinte, num outro aspecto, a invenção proporciona uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, que compreende ainda um agente terapêutico, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, que compreende ainda um agente de diagnóstico, para utilização num método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal.

[0016] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma composição da presente invenção, tal como definido acima, em que a gotícula encapsulada compreende ainda um agente terapêutico, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

[0017] Também é proporcionada uma composição da invenção, tal como definido acima, em que a gotícula encapsulada compreende ainda um agente de diagnóstico, para utilização num método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal.

[0018] Outras aplicações incluem o fornecimento de multisomas uma plataforma para o estudo fundamental de proteínas de membrana. Como será explicado mais adiante, a gotícula encapsulada da invenção pode compreender uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas. Em particular, uma parte da camada externa da gotícula de solução aquosa na encapsulada pode contatar a camada periférica de modo a formar uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas numa interface entre a das gotas e a camada periférica. Adicionalmente ou em alternativa, mais do que uma gota de solução aquosa pode estar presente no encapsulamento, e uma parte da camada externa de uma gotícula de solução aquosa pode contatar parte da camada externa da outra gota para formar uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas a uma interface entre as duas gotas. Além disso, mais do que uma gotícula de solução aquosa, podem formar uma camada dupla com a camada periférica. Desta forma, o encapsulamento de gota da invenção pode compreender uma ou mais camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas. Em algumas formas de realização, o encapsulamento de gota é composto por múltiplas camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas. O ou cada camada dupla no encapsulado da gotícula da invenção é capaz de acomodar uma ou mais proteínas de membrana, portanto a gotícula encapsulada da invenção pode fornecer uma plataforma útil para o estudo fundamental de proteínas de membrana, incluindo, por exemplo, poros, canais de proteínas de proteínas ou bombas de proteínas, receptores e proteínas que efeito o reconhecimento de células ou de uma célula-célula à interação. O ou cada camada dupla no encapsulado pode compreender uma pluralidade de proteínas de membrana, por exemplo de múltiplas cópias da mesma membrana de proteína ou de dois ou mais classes diferentes de membrana de proteína.

[0019] Por conseguinte, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima como uma ferramenta de pesquisa para o estudo de proteínas de membrana.

[0020] A invenção proporciona ainda a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido num método para investigar e / ou rastreio de uma membrana de proteína. Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido num método para investigar e / ou rastreio de uma substância a analisar que interage com uma membrana de proteína.

[0021] Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui defini- do num método para investigar e / ou rastreio de uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas.

[0022] Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma primeira gotícula encapsulada da invenção como acima definida e uma segunda gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, para investigar e / ou rastreio de um complexo de membrana de proteína, que se estende por duas camadas duplas das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas, em que em cada um dos referidos primeiro e segundo gotículas encapsulada, uma gotícula de solução aquosa referida situa-se na borda da gota, na qual parte da camada externa dos contactos de gotículas de solução aquosa referida camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas numa interface entre a das gota e a camada periférica, e em que o referido primeiro e segundo encapsula gota são posicionados de tal modo que a camada dupla da primeira gotícula encapsulada e a camada dupla da segunda gotícula encapsulada são aposto, em que uma membrana de proteína vãos complexos referidas duas camadas duplas apostos.

[0023] Usando membrana de proteínas e várias gotas, multisomas pode sentir o seu ambiente, a informação de processo e de forma contingente entregar materiais para o ambiente, tal como ilustrado na figura 1a a seguir.

[0024] Assim, num outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma gota encapsulada da invenção, como acima definido para o tráfico de uma molécula entre gota no encapsulado.

[0025] A invenção também proporciona a utilização de uma gotícula encapsulada da invenção, como acima definido para a entrega de uma molécula de uma gotícula no encapsulado para o meio ambiente externo.

[0026] A invenção também proporciona a utilização de uma gotícula encapsulada da invenção, como acima definido para a troca de materiais entre as gotas encapsuladas e ambiente.

[0027] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima como um sensor. Por exemplo, a gotícula encapsulada pode ser usada como um sensor de luz ou um sensor para detectar a presença de um analito alvo. Redes de gota pode ser construído dentro de multisomas para explorar uma variedade de bombas de membrana, os canais e poros para agir como sensores de luz, as baterias, e dispositivos elétricos.

[0028] Por conseguinte, a invenção também proporciona a utilização de gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima como um sensor, bateria, ou dispositivo elétrico.

[0029] Ainda proporcionado um sensor, de uma bateria, ou um dispositivo elétrico, que compreende uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima.

[0030] A gotícula encapsulada da invenção também pode atuar como um chassi protetor multi-compartimento para "inferior de baixo para cima" biologia sintética.

[0031] Deste modo, noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima em biologia sintética.

[0032] A invenção também proporciona a utilização de uma composição da invenção, tal como definido acima em biologia sintética.

[0033] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima para preparar uma protocélula.

[0034] A invenção também proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima, para se preparar um total de protocéculas. Um agregado de protocélulas também pode ser referido como prototecido.

[0035] Ainda proporcionado o uso de uma composição da invenção, tal como definido acima para preparar uma protocélula.

[0036] Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma composição da invenção, tal como definido acima, para se preparar um total de protocéculas.

[0037] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de uma protocélula, compreendendo o método: proporcionando uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima; e permitindo que a camada externa da gotícula de solução aquosa a entrar em contato com a referida camada periférica de moléculas an-fipáticas não poliméricas, ou levando a camada externa da gotícula de solução aquosa em contato com a referida camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, e formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos uma parte da superfície da gotícula de solução aquosa.

[0038] Formação em camada dupla pode opcionalmente ser auxiliada por eliminação de alguns ou de todo o meio hidrofóbico da gotícula encapsulada da invenção. Assim, numa forma de realização, o método de preparação de um protocélula compreende: remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico a partir de uma gotícula de encapsular da invenção, tal como definido acima, de modo que a referida camada periférica de não- poliméricas moléculas anfipáticas varas para a camada externa de a referida gotícula de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície da gotícula de solução aquosa.

[0039] Em outro aspecto, a invenção proporciona um pro-tocélula que é obtenível pelo método da invenção, como acima definido para a preparação de um protocélula.

[0040] Em outro aspecto, a invenção proporciona um pro-tocélula compreendendo uma gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, em que a referida camada periférica de não-poliméricas moléculas anfipáticas contata a camada externa do referido das gotas e, assim, forma uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno parte da gotícula de solução aquosa.

[0041] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de um prototecido, que prototecido compreende um agregado de protocéculas, método esse que compreende: proporcionando uma gotícula encapsulada da invenção como acima definido, que compreende uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa; e permitindo que as camadas externas das gotas aquosas para entrar em contato com a referida camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, ou trazendo as camadas externas das gotículas de solução aquosa em contato com a camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, e formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície de uma pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0042] Formação em camada dupla pode opcionalmente ser auxiliada por eliminação de alguns ou de afligir o meio hidrofóbico da gotícula encapsulada da invenção. Assim, numa forma de realização, o método de preparação de um prototecido compreende: remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico a partir de uma gotícula de encapsular a invenção como acima definido, que compreende uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa, de modo a que a camada periférica de não polimérico moléculas anfipáticas varas para as camadas externas das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície de uma pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0043] Em outro aspecto, a invenção proporciona um pro-totecido que é obtenível pelo método da invenção, como acima definido para a preparação de um prototecido.

[0044] Em outro aspecto, a invenção proporciona um pro-totecido compreendendo um gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, que encapsulam gotícula compreende uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa, em que a camada periférica de não poliméricas moléculas anfipáticas contata as camadas externas do referido gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de uma das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície de uma pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0045] Em outro aspecto, a invenção proporciona um pro-totecido compreendendo uma pluralidade de protocelis da invenção, tal como definido acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0046] A figura 1a-e contêm ilustrações e fotografias de multisomas da invenção esquemáticos. Assim, a figura 1a é uma ilustração es-quemática que mostra as gotas aquosas encapsuladas numa gotícula de óleo; as gotículas de solução aquosa são separadas umas das outras por camadas duplas de lipídio, o que permite a comunicação dentro da rede por meio de proteínas de membrana, por exemplo poros de proteína, canais ou bombas; camadas duplas também estão presentes nas superfícies das gotículas de solução aquosa que se projectam a partir da gotícula de óleo permitindo que a rede para se comunicar com a solução a granel. O multisoma mostrado é capaz de detectar o seu ambiente, o processamento das informações, e, em seguida, de forma contingente entregar materiais para o meio ambiente. As capacidades de detecção e de entrega são demonstradas nos exemplos aqui.

[0047] A figura 1b é uma ilustração esquemática de uma rede de duas gotículas encapsuladas, ilustrando as monocamadas de lipídios e nas camadas duplas multisomas da invenção.

[0048] As figuras, 1c, 1d e 1e são fotografias de multisomas contendo um, dois e três gotas de interiores, respectivamente. As gotas de óleo foram suspensas em aros de arame para permitir o estudo prolongado. As gotas aquosas foram tingidas com 25 μM sulforrodamina 101 (vermelho) ou fluoresceína (verde). Barras de escala representam 400 μm.

[0049] A figura 2a mostra uma definição dos ângulos de contato θ1, θ2 e θβ, de uma gotícula encapsulada, em relação à horizontal, cuja geometria foi calculado computacionalmente como descrito no Exemplo 1.

[0050] A figura 2b mostra a energia livre de formação de camada dupla calculada como uma função dos ângulos de contato θ2 e θβ, para os valores de parâmetros descritos no Exemplo 1. As setas indicam a direcção de descida mais acentuada. A geometria da gotícula encapsulada nos nove pontos sobre a paisagem marcada por círculos vermelhos está ilustrada adjacente a cada ponto. O estado mais estável, como determinado pelo cálculo, marcado sobre a paisagem por uma estrela, está representado na figura 2a.

[0051] A figura 3 refere-se à medição de correntes iônicas através de um estafilococos-hemolisina (αHL) poros. Assim, a figura 3a é uma ilustração esquemática de medição de corrente iônica que flui entre uma gota encapsulada e a solução aquosa de grandes quantidades, por meio de um poro de αHL inserido na camada dupla.

[0052] A figura 3b mostra aumentos graduais na corrente indicam inserções consecutivas de tipo selvagem (WT) αHL poros na camada dupla que separa a gotícula encapsulada a partir da solução aquosa a granel. Os níveis de corrente (que corresponde aos picos no histograma de corrente) foram separados por 18,6 ± 0,8 pA (média ± DP, n = 16), que é a corrente esperada para um único poro AHL. Apenas um exemplo dos dados é mostrado. As medidas foram realizadas em +50 mV em 500 mM KC1.

[0053] A figura 3c mostra bloqueios corrente de um único poro αHL WT após a adição de ~ 10 μM Y-ciclodextrina (yCD) para uma solução a granel. Indicado são os atuais níveis de poro desocupado, o poro com yCD ligado, e o nível atual zero. Os atuais YCD bloqueios tinha uma amplitude de 63,7 ± 2,0% (média ± DP, n = 673), e uma taxa de dissociação de 4,0 ± 0,6 s "1 (média ± dp) consistente com estudos anteriores. Apenas um exemplo dos dados é mostrado. As medidas foram feitas a -50 mV em 1 M KC1.

[0054] A figura 4 refere-se a comunicação por difusão através dos poros αHL. Assim, a figura 4a mostra os resultados das medições de fluorescência de duas multisomas, cada um com uma única gota de interior, na mesma solução a granel. Ambas as gotas internas contidas dextrano conjugado fluo-4, e um contido αHL. As gotas de óleo e interiores são descritas onde eles são invisíveis nas fotografias, e são respectivamente rotuladas "óleo" e "Dye”. Após a adição de Ca 2 + para a solução externa, foi observado um aumento na fluorescência na gotícula contendo αHL, enquanto se manteve a fluorescência negligenciável para a gotícula sem proteína. A barra de escala representa 300 μm.

[0055] A figura 4b mostra os resultados de medições de fluorescência de uma rede de duas gotículas encapsuladas, no qual uma gota continha Ca 2 + e o outro continha dextrano conjugado com fluo-4 e αHL; essas gotas são, respectivamente, rotuladas 'Ca 2 + 'e' Dye. Foi observado um aumento na fluorescência apenas na gotícula que contém o corante. A barra de escala representa 300 μm.

[0056] A figura 5 refere-se a entrega dependente do pH. Assim, a figura 5a é uma ilustração esquemática de uma experiência que demonstra a sensibilidade de uma rede de duas gotículas encapsuladas feita com uma mistura de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) e ácido oleico (OA) de pH. Uma gotícula continha Ca 2 + e o outro continha dextrano conjugado com fluo-4. Após a diminuição do pH do tampão aquoso externo 8,05,5, ambas as gotas estouram, libertando o seu conteúdo para dentro da solução aquosa a granel, onde eles misturados para produzir um sinal fluorescente.

[0057] A figura 5b mostra os resultados das medições de fluorescência a partir da experiência ilustrada na figura 5a. O óleo e as gotas de interiores, contendo Ca+ ou fluo-4 são descritos, respectivamente, e rotulada "Óleo", "Ca 'e' Corante”. Após a redução do pH da solução externa, tanto gota rebentar simultaneamente. Esta primeira causou uma ligeira diminuição na in-tensidade de fluorescência como o conteúdo da gota de corante foram diluídos, em seguida, um aumento acentuado na intensidade como a solução de fluo-4 misturado com o Ca 2 + solução. Finalmente, a intensidade diminuiu à medida que a mistura se tornou diluída para a fase aquosa de massa. Barra de escala representa 500 μm.

[0058] A figura 6 refere-se a entrega dependente da tem-peratura. Assim, a figura 6a mostra as temperaturas de ruptura de multisomas com uma única gota interna submetida a uma rampa de temperatura (superior: a temperatura foi aumentada desde a temperatura ambiente a uma taxa de ~1°C min -1; inferior: histograma de estourar temperaturas). A temperatura estouro foi de 43,6 ± 3,5 ° C (média ± DP, n = 93), excluindo as três multisomas que estouraram abaixo de 35 ° C.

[0059] A figura 6b mostra os tempos de ruptura de multisomas com uma única gota interna mantida a uma temperatura constante de 37,2 ± 0,4 ° C. O topo esquemático fornece o perfil de temperatura. O gráfico de baixo mostra a proporção de multisomas que estourou dentro de 30 min de atingir 37° C, mostrando que a 93% de multisomas sobreviveram durante pelo menos 30 minutos a esta temperatura (n = 46).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0060] O encapsulamento das gotículas da invenção também é aqui referido como um "multisoma", independentemente do facto de apenas um ou uma pluralidade de gotículas de solução aquosa são encapsulados no interior da camada periférica. Assim, os termos "gotícula encapsulada" e "multisoma", tal como aqui utilizado, referem-se ambos a estruturas sintéticas que contêm um ou mais gotas encapsuladas. Na presente invenção, uma ou mais gotículas de solução aquosa são encapsulados dentro de uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, que a camada é. situada em torno da superfície de uma gota hidrofóbico. O ou cada um deles compreende gotículas de solução aquosa (a) um meio aquoso, e (b) uma camada ex terna de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso. As uma ou mais gotículas de solução aquosa também são totalmente ou parcialmente dentro da própria gota hidrofóbico. Assim, uma das gotas pode ser totalmente dentro da gota hidrofóbica, completamente rodeada pelo meio hidrofóbico. Alternativamente, pode ser em ou perto da borda da gota, em contato com a camada periférica, de modo que as camadas mais externas e periféricas aderir para formar uma camada dupla, como se mostra na figura, lb a le. Este último arranjo, em que a gotícula de solução aquosa é em ou perto da borda da gota de modo a que a camada externa constitui uma camada dupla com a camada periférica, é pensado para ser termodinamicamente mais estável. O encapsulamento das gotículas da invenção é sintético. Assim, a gotícula encapsulada da invenção pode ser referida como uma gotícula encapsulada sintético.

[0061] O encapsulamento das gotículas da invenção compreende uma gota de um meio hidrofóbico; uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota; e uma gota de solução aquosa no interior da camada periférica. A gotícula de solução aquosa compreende um meio aquoso e uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso.

[0062] As moléculas anfipáticas não poliméricas são ge-ralmente dispostas em torno da superfície da gota hidrofóbico em uma mono- camada, e a camada externa da ou das gotas de cada no multisoma compreende tipicamente uma monocamada das moléculas anfipáticas não poliméricas. No entanto, as camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas podem ser formadas nas interfaces quando o ou cada gotícula de solução aquosa adere à superfície da gota hidrófobo, e, de fato, quando as gotas aquosas aderirem uns aos outros (ver as figuras).

[0063] Assim, a camada periférica compreende, tipicamente, uma monocamada de moléculas anfipáticas não poliméricas.

[0064] Normalmente, a camada externa de moléculas an-fipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso compreende uma monocamada das moléculas anfipáticas não poliméricas.

[0065] Tipicamente, a camada periférica inclui uma mono-camada das moléculas anfipáticas não poliméricas e a referida camada externa compreende uma monocamada das moléculas anfipáticas não poliméricas.

[0066] Em algumas formas de realização da gotícula en-capsulada da invenção, particularmente quando a encapsular é sintetizado em primeiro lugar e a gotícula de solução aquosa ainda não teve tempo para aderir à camada periférica para formar uma estrutura termodinamicamente mais estável, o da gota serão totalmente situada no interior da gota hidrofóbico; a camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas não será em tais casos, estar em contato com a camada periférica, mas, geralmente, só estar em contato com o meio hidrofóbico.

[0067] Numa forma de realização, portanto, a gotícula de solução aquosa situa-se no interior da gota e a referida camada externa de mo-léculas anfipáticas, não poliméricas não está em contato com a camada periférica. Geralmente, nesta forma de realização, a camada externa de não poliméricas moléculas anfipáticas contactos a meio hidrofóbico.

[0068] Tipicamente, no entanto, a gotícula encapsulada da invenção compreende, pelo menos, uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas. Normalmente, por exemplo, a camada periférica da gotícula encapsulada e a camada externa da gotícula de solução aquosa são capazes de formar em conjunto uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica. Adicionalmente ou em alternativa, a camada externa da gotícula de solução aquosa, podem formar uma camada dupla, com a camada externa de uma outra gotícula de solução aquosa na gotícula encapsulada.

[0069] Assim, em algumas formas de realização, a gota de solução aquosa situa-se na borda da gota, na qual parte da camada externa dos contactos de gotículas de solução aquosa referida camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas numa interface entre a gota aquosa e a camada periférica. Tipicamente, em tais formas de realização, uma parte diferente da dos contactos externas da camada do meio hidrofóbico. Uma fotografia de um exemplo de uma tal disposição é mostrada na figura 1c. Tal arranjo está também ilustrado esquematicamente na figura 1b, no caso de duas gotas aquosas estão presentes. Tais acordos são encontrados para ser cineticamente estável.

[0070] A camada dupla na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica pode ainda compreender uma membrana de proteína. A membrana de proteína pode ser de qualquer tipo. Foi demonstrada a utilização de proteínas de membrana integrais, mas espera-se igualmente que as proteínas da membrana periféricas podem ser usadas. A membrana de proteína pode ser por exemplo uma bomba de membrana, o canal e / ou poro, para permitir o controlo preciso sobre a troca de material, e a comunicação elétrica, entre a gota e a solução externa. A membrana de proteína pode ser por exemplo um poro OHL. No entanto, qualquer membrana de proteína adequado pode ser utilizado, incluindo as duas classes principais que se β-barris ou feixes de ct helicoidal. Uma aplicação importante é uma membrana de proteína que é um poro ou canal. Além de um poro ou canal de proteína, outras proteínas de membrana possíveis incluem, mas não exclusivamente, um receptor, um transportador ou uma proteína que efetua o reconhecimento de células ou de uma interação célula-a-célula. A camada dupla na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica, e, na verdade qualquer outra camada dupla na gotícula encapsulada, pode compreender mais do que uma membrana de proteína. Por exemplo, uma camada dupla particular pode conter múltiplas cópias da mesma membrana de proteína, ou de dois ou mais classes diferentes de proteínas de membrana. Onde mais de uma classe está presente, a camada dupla pode conter várias cópias de cada classe diferente.

[0071] Proteínas de membrana adequadas que permitem a troca de materiais e comunicação elétrica são conhecidos e prontamente disponíveis para o perito na arte; muitas dessas proteínas ou estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados por métodos conhecidos. Por exemplo, monómeros WT AHL pode ser preparado pelo método in vitro de transcrição-tradução (IVTT), e heptamerisado por incubação com as membranas de glóbulos vermelhos de coelho. Os heptameros são tipicamente purificados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) (Maglia, G. et al. Método. Enz mol. 475, 591-623, 2010). Além disso, Bayley, H. et al. Gota bilayers interface. Mol BioSyst. 4, 1191-1208 (2008) enumera várias proteínas que foram testadas para a inserção em camadas duplas de interface de gotas feitos no óleo a granel.

[0072] O encapsulamento das gotículas da invenção pode compreender uma pluralidade de gotículas de solução aquosa dentro da camada periférica. Cada gotícula de solução aquosa compreende: (a) um meio aquoso dito, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas dito não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso. A camada externa de cada gotícula de solução aquosa compreende normalmente uma monocamada da molécula anfipática não polimérica. No entanto, as camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas podem ser formadas nas interfaces quando o ou cada gotícula de solução aquosa adere ao interior da camada periférica ao redor da gota hidrofóbico, ou ainda quando as gotas aquosas aderirem uns aos outros.

[0073] O número das referidas gotículas de solução aquosa na gotícula encapsulada que compreende uma pluralidade de gota pode ser denotado n, em que n é igual ou superior a 2. Uma forma de realização em que n é 2 está ilustrado esquematicamente na figura 1b e uma fotografia de uma tal concretização é mostrado na figura Id. Em algumas formas de realização, n é um número inteiro igual ou superior a 3. Uma fotografia de uma forma de reali- zação na qual n representa 3 é mostrada na figura le, e uma forma de realização em que n é 6 é ilustrada esquematicamente na figura 1a.

[0074] O número inteiro n pode, em princípio, ser muito elevada, por exemplo, na ordem dos milhões.

[0075] Isto é porque as gotas aquosas podem serem muito pequena e não existem limite superior para o tamanho da gota hidrofóbico. Além disso, como explicado mais abaixo, as gotas de encapsula a invenção podem incluir as grandes redes de gotículas de solução aquosa. Estas redes, que podem, em princípio compreendem milhões de gotas, são úteis para a preparação de prototecido (ou seja, um agregado de protocelis). Em algumas formas de realização, por conseguinte, o número inteiro n pode ser tão elevada como vários milhões, por exemplo, até cerca de 10 milhões, ou por exemplo até cerca de 5.000.000.

[0076] Em outras formas de realização, n pode ser de várias centenas, por exemplo até cerca de 500, ou por exemplo até cerca de 400. Efetivamente, multisomas feitas pelo método de pipetagem manual usado nos presentes exemplos têm tipicamente um diâmetro externa de cerca de ~ 1 mm, e gotículas de solução aquosa podem ser facilmente feitos manualmente até ~ 100-μm diâmetro. Assim, cerca de 500 dessas gotículas de solução aquosa poderia caber em uma esfera um milímetro, ou talvez até 25% menos do que isso devido a restrições de embalagem (embora isto dependa composições das gotas). Assim, em algumas formas de realização o número inteiro n pode ser de até cerca de 500, ou por exemplo até cerca de 400. Maio inteiro n, por exemplo, ser um número inteiro de 2 a 500, ou um número inteiro de 3 a 500. N pode ser um número inteiro de 2 a 400. Em outras formas de realização, n pode ser um número inteiro de 2 a 300, ou um número inteiro de 3 a 200. mais tipicamente n é de 2 a 200. Em outras formas de realização, no entanto, n representa um número inteiro de 2 a 50, ou um número inteiro de 3 a 50. n pode ser por exemplo de 2 a 20, ou de 2 a 10.

[0077] Tipicamente, quando o encapsulamento gotícula compreende uma pluralidade de gotículas de solução aquosa, uma parte da camada externa de uma primeira das ditas aquosa gotas contactos parte da camada externa de uma segunda das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla do anfipático não poliméricos moléculas em uma interface entre os referidos primeiro e segunda gota.

[0078] Assim, mais geralmente, a gotícula encapsulada da invenção compreende, tipicamente, uma camada dupla de uma das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas, que camada dupla é formado numa interface entre a da gota e a camada periférica ou entre a das gotas e uma segunda das gotas.

[0079] A camada dupla na interface entre os referidos primeiro e segundo gotas pode ainda compreender uma ou mais proteínas de membrana. As gotículas encapsuladas podem trocar espécies químicas uns com os outros através de proteínas de membrana incorporados na camada dupla entre as gotas. Proteínas de membrana adequados incluem, mas não estão limitados a bombas, canais e / ou poros, por exemplo, um poro HL.

[0080] Normalmente, pelo menos uma das referidos primeira e segunda gotas situa-se na borda da gota, na qual parte da camada externa dos contactos de gotículas de solução aquosa a camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas numa interface entre a gota de solução aquosa e a camada periférica.

[0081] A camada dupla na interface entre a referida gotícula de solução aquosa e a camada periférica pode ainda compreender uma ou mais proteínas de membrana. A membrana de proteína pode ser de qualquer tipo, incluindo, por exemplo, uma bomba, o canal e / ou poro, por exemplo, um poro de αHL. Gotas encapsuladas podem trocar material entre a gota e uma solução externa via essas proteínas. Além disso, como explicado acima, gotas encapsuladas dentro da multisoma pode também troca de material entre si, através de proteínas de membrana em camadas duplas entre as gotas. Assim, gota encapsula com uma cadeia ou uma rede de gota são capazes de materiais tais como o tráfico de compostos químicos por meio da cadeia ou de rede, a partir de gotas de gota, bem como de e para o ambiente externo. Sistemas de transporte complexos pode ser construído desta forma e um exemplo de um sistema deste tipo é mostrado esquematicamente na figura 1a. Os primeiro e segundo gota no gotícula encapsulada acima definido, que compreende uma pluralidade de gota pode tanto estar situado na extremidade da gota, na qual parte da camada externa dos primeiros contactos de gotículas de solução aquosa a camada periférica, formando assim uma primeira camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre a primeira das gota e a camada periférica, e uma parte da camada externa do segundo contactos de gotículas de solução aquosa a camada periférica, formando assim uma segunda camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas numa interface entre a segunda das gota e a camada periférica. Uma tal concretização é ilustrada esquematicamente na figura 1b e uma fotografia de uma tal concretização é mostrado na figura 1d. A primeira ou segunda camada dupla pode ainda compreender uma membrana de proteína, ou ambas as primeiras e segunda camadas duplas pode compreender uma membrana de proteína. Qualquer proteína ou proteínas de membrana adequado pode ser empregue. A membrana de proteína ou de proteínas pode por exemplo ser selecionado a partir de bombas, os canais e / ou poros, e pode ser por exemplo um a-hemolisina (HL) poros. Outras possíveis proteínas de membrana incluem, mas não estão limitados a um receptor, um transportador ou uma proteína que efetua o reconhecimento de células ou de uma interação célula-a- célula. Assim, através de proteínas de membrana, ambos os primeiros e segundo gota podem ser capazes de comunicação elétrica ou de troca de materiais com o ambiente externo, bem como entre si.

[0082] Como mencionado acima, a gotícula encapsulada da invenção compreende preferencialmente uma camada dupla de moléculas anfipáticas referidas não poliméricas.

[0083] Deste modo, numa forma de realização preferida, a gotícula encapsulada da invenção como aqui definido compreende uma gotícula de solução aquosa, ou uma pluralidade de gotículas de solução aquosa, no interior da camada periférica, caracterizado por o ou cada gotícula de solução aquosa compreende: (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso, e o encapsulamento gotícula compreende ainda uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas, em que (i) uma gotícula de solução aquosa referida situa-se na borda da gota, na qual parte da camada externa dos contactos de gotículas de solução aquosa referida camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica; ou (ii) uma parte da camada externa de uma primeira das referidas gotículas de solução aquosa contactos parte da camada externa de uma segunda das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre as referidas primeira e segunda gotas. Em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, n é igual a ou maior do que 3, e uma parte da camada externa de uma primeira das ditas aquosa gotas contactos parte da camada externa de uma segunda das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim um camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre os referidos primeiro e segundo gotas, e em que a parte da camada externa do segundo contactos de gota parte da camada externa de um terço das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla do não moléculas anfipáticas poliméricas em uma interface entre as ditas segunda e terceira gota.

[0084] A camada dupla na interface entre as primeiras e segunda gotas pode ainda compreender uma membrana de proteína.

[0085] A camada dupla na interface entre a segunda e terceira gotas pode ainda compreender uma membrana de proteína.

[0086] Numa forma de realização, a camada dupla na interface entre as primeiras e segunda gotas compreende ainda uma membrana de proteína, e a camada dupla na interface entre a segunda e terceira gotas compreende ainda uma membrana de proteína. As três gotas formam então uma cadeia de gota em comunicação uns com os outros.

[0087] Tipicamente, pelo menos um dos referidos primeiro, segundo e terceiro gota também está situado na borda da gota, na qual parte da camada externa de pelo menos um dos contatos de gotículas de solução aquosa a camada periférica, formando assim uma camada dupla de o referido membro não polimérico moléculas anfipáticas na uma interface entre a referida gotícula de solução aquosa e a camada periférica.

[0088] A camada dupla na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica pode ainda compreender uma membrana de proteína, tal como uma bomba, de canais ou poros. A gota pode então estar em comunicação com o ambiente externo também.

[0089] Tipicamente, todos os três dos referidos primeira, segunda e terceira gotas estão situados no bordo de gota, em que uma parte da camada externa de cada um dos referidos primeiro, segundo e terceiro gotículas de solução aquosa contata a camada periférica, formando assim camadas duplas dos referidos não moléculas anfipáticas poliméricas nas interfaces entre os referidos primeiro, segundo e terceiro gotículas de solução aquosa e a camada periférica. Uma fotografia de um exemplo de uma tal concretização é mostrada na figura 1e.

[0090] Pelo menos uma das camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas nas interfaces entre os referidos primeiro, segundo e terceiro gotículas de solução aquosa e da camada periférica pode ainda compreender uma membrana de proteína. Qualquer proteína ou proteínas de membrana adequado pode ser empregue. A membrana de proteína ou de proteínas pode por exemplo ser selecionado a partir de bombas, os canais e / ou poros, e pode por exemplo ser um poro HL. Outras proteínas de membrana possíveis incluem, mas não estão limitados a receptores, transportadores ou proteínas que o reconhecimento de células ou de um efeito de interação célula- a-célula.

[0091] As gotas encapsuladas da invenção podem incluir cadeias ou redes de gotículas de solução aquosa dentro da gota hidrofóbico. As gotas aquosas de uma cadeia ou uma rede são separadas umas das outras por camadas duplas de moléculas anfipáticas não-poliméricas, geralmente camadas duplas lipídicas, opcionalmente, permitindo a comunicação dentro da cadeia ou da rede através de poros de proteína, quando os poros são de proteína presente nas camadas duplas.Se uma "cadeia" de gota é considerada como uma estrutura de "unidimensional", em que cada gotícula contato um máximo de duas outras gotas para formar uma linha de gota, em seguida, uma rede pode ser considerada como uma estrutura de duas ou três dimensões em que, pelo menos, uma gota está em contato com mais do que duas outras gotas. Normalmente, em uma rede, mais do que uma gota na rede está em contato com mais do que duas outras gotas. Em algumas redes, cada gotícula na rede está em contato com mais do que duas outras gotas. A rede pode, por exemplo, ser uma monocamada "bidimensional" de gota ou de uma massa de gota "tridimensional". Camadas duplas podem também estar presentes nas superfícies das gotículas de solução aquosa, que contatam com a ca-mada periférica da gota hidrofóbica, permitindo que a corrente ou a rede comunicar com a solução a granel por meio de proteínas de membrana em que os atuais. Assim, multisomas pode ser preparado que são capazes de sentir seu ambiente, processamento da informação, e, em seguida, de forma contingente entregando materiais, ou recebimento de materiais de o meio ambiente. As capacidades de detecção e de entrega são demonstradas nos presentes exemplos.

[0092] Deste modo, numa forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção pode compreender uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa dentro da camada periférica, caracterizado por a referida pluralidade de gotículas de solução aquosa compreende mais do que duas gotas aquosas, as quais estão em contato um com o outro numa cadeia ou rede, em que uma parte da camada externa de cada gotícula na cadeia ou rede de contactos, uma parte da camada externa da outra gotícula na corrente ou de rede, formando assim camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas nas interfaces entre a gota da cadeia ou rede.

[0093] Em algumas formas de realização, cada uma das referidas camadas duplas nas interfaces entre a gota da cadeia ou de rede compreende ainda uma membrana de proteína. A membrana de proteína ou de proteínas pode ser selecionado a partir de bombas, canais e poros, por exemplo AHL. Em princípio, no entanto, qualquer membrana de proteína pode ser utilizada. Como explicado acima, outras proteínas de membrana possíveis incluem, mas não estão limitados a um receptor, um transportador ou uma proteína que efetua o reconhecimento de células ou de uma interação célula-a- célula. O número de gotículas de solução aquosa em que a referida cadeia ou de rede pode ser denotado m, em que m é um número inteiro igual ou superior a 3. Em algumas formas de realização que m é igual ou superior a 4. O inteiro m pode, por exemplo, ser de, pelo menos, 5, ou, pelo menos, 6. Em algumas formas de realização, m é igual ou superior a 6.

[0094] O inteiro m pode, em princípio, ser muito elevada, por exemplo, na ordem dos milhões.

[0095] Como explicado acima, as gotas aquosas podem ser muito pequenas e toda a das gotículas de solução aquosa podem estar presentes na mesma rede. Por conseguinte, o inteiro m pode tão alta quanto vários milhões. Essas grandes redes de gota são úteis para preparar prototecido. Assim, em algumas formas de realização, m é um número inteiro de até cerca de 10 milhões, ou por exemplo até cerca de 5.000.000.

[0096] Em outras formas de realização, m pode ser tão elevado como 400 ou 500. Assim, numa forma de realização, m é um número inteiro de até 500, ou por exemplo até 400. Por exemplo, m pode ser um número inteiro de 3 a 500, ou um número inteiro de 3 a 400. Em outras formas de realização, m pode ser um número inteiro de 4 a 500, ou um número inteiro de 4 a 400. Assim, por exemplo, m pode ser um número inteiro de 6 a 500, ou um número inteiro de 10 a 400. Mais tipicamente m varia de 3 a 300, ou um número inteiro de 3 a 200. Assim, m pode ser de 5 a 200. Em algumas formas de realização, n pode ser um número inteiro de 3 a 50, ou um número inteiro de 4 a 50. n pode, por exemplo, ser de 3 a 20, ou de 3 a 10. Em algumas formas de realização, m é de 4 a 10.

[0097] Tipicamente, pelo menos uma das gotículas de solução aquosa na cadeia ou rede está situado na borda da gota, na qual parte da camada externa da gotícula de solução aquosa situado na extremidade dos contactos gota a camada periférica, formando assim uma camada dupla de as referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre a referida gotícula de solução aquosa e a camada periférica. Esta camada dupla pode ainda compreender uma ou mais proteínas da membrana, para permitir a comunicação entre a corrente ou rede de gota e o ambiente externo. A membrana de proteína ou de proteínas pode ser qualquer membrana de proteína adequada, por exemplo uma bomba, ou poro do canal. A membrana de proteína pode ser por exemplo a αHL. A camada dupla pode conter múltiplas cópias da mesma membrana de proteína, ou de dois ou mais classes diferentes de proteínas de membrana. Onde mais de uma classe está presente, a camada dupla pode conter várias cópias de cada classe diferente. A maio camada dupla por exemplo compreender diferentes tipos de proteínas de canais iônicos de membrana, por exemplo, pelo menos uma proteína do canal de sódio e pelo menos uma proteína de canal de potássio. Outras proteínas de membrana possíveis incluem, mas não estão limitados a receptores, transportadores ou proteínas que o reconhecimento de células ou de um efeito de interação célula- a-célula. Tipicamente, pelo menos uma das gotículas de solução aquosa na cadeia ou uma rede não está em contato com a camada periférica. Assim, pelo menos uma das gotículas de solução aquosa na cadeia ou de rede pode estar no meio da cadeia ou de rede, e pode, portanto, ser mantido numa posição que está longe da borda do multisoma. Em algumas formas de realização, pelo menos, duas das gotículas de solução aquosa na cadeia ou uma rede não estão em contato com a camada periférica. Uma forma de realização em que duas das gotículas de solução aquosa na cadeia ou uma rede não estão em contato com a camada periférica está ilustrado esquematicamente na figura 1a, em que as duas gotas aquosas que actuam como módulos de processamento estão presentes no meio da rede, para longe da camada periférica.

[0098] Em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção que compreende uma referida cadeia ou uma rede, uma primeira gota de solução aquosa, em uma extremidade da cadeia ou de rede, está situado na extremidade da gota, na qual parte da camada externa do referido primeiro contactos de gotículas de solução aquosa de uma primeira parte da camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas em uma interface entre a referida primeira das gota e a referida primeira parte da camada periférica; e uma segunda das gota, no outro extremo da cadeia, ou rede, também está situado na borda da gota (tipicamente, na extremidade oposta da gota), em que parte da camada externa do referido segundo contactos de gotículas de solução aquosa de uma segunda parte de a camada periférica, formando assim uma camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas numa interface entre a referida segunda das gota e a referida segunda parte da camada periférica; e a cadeia ou rede compreende ainda pelo menos uma outra das gota, situado entre o primeiro e segundo gotículas de solução aquosa. Este outro, pelo menos, uma gota de solução aquosa não é geralmente em contato com a camada periférica.

[0099] Geralmente, nesta forma de realização, a cadeia ou rede compreende ainda, pelo menos, duas outras gotas aquosas, situados entre as referidas primeira e segunda gotículas de solução aquosa. Tipicamente, o dito pelo menos duas outras gotas aquosas não estão em contato com a camada periférica.

[0100] Uma tal concretização é ilustrada esquematicamente na figura 1a. Na forma de realização da figura 1a, duas primeiras gotas aquosas, situado em uma das extremidades, agir como um módulo de detecção, e dois segundo gotículas de solução aquosa, situado na outra extremidade da rede, atuam como um módulo de entrega, e mais duas gotas aquosas, que funcionam como módulos de processamento, está situado entre a primeiro (detecção) e uma segunda (entrega) gota.

[0101] Tipicamente, a camada dupla na interface entre a primeira das gotas e a primeira parte da camada periférica compreende ainda uma membrana de proteína, tal como uma bomba, de canal ou poro (como descrito anteriormente). A cadeia ou uma rede de gota no multisoma irá então ser capaz de comunicar com o externa através de evironment a primeira gota de solução aquosa e a referida membrana de proteína. A referida primeira gota no maio de rede, por exemplo, funciona como um módulo sensor, capaz de detectar a presença de um produto químico particular no ambiente externo, por exemplo, ou é capaz de detecção de luz. Assim, a primeira gota pode, em algumas formas de realização compreendem uma molécula do sensor. A molécula de sensor pode estar presente no meio aquoso da gotícula ou na camada dupla. A molécula de sensor pode ser uma molécula que é sensível à presença de um produto químico em particular (por exemplo, um anaiyte alvo), ou pode ser uma molécula fotossensível.

[0102] Normalmente, a camada dupla na interface entre a segunda das gotas e a segunda parte da camada periférica compreende ainda uma membrana de proteína. A cadeia ou uma rede de gota no multisoma irá então também ser capaz de comunicar com o ambiente externo através da segunda das gotas e a referida membrana de proteína. A referida segunda gota no maio rede por exemplo atuar como um módulo de entrega, capaz de entre- gar um produto químico particular para o ambiente externo. Tal administração pode ser, por exemplo, depende da primeira gota de detectar a presença ou ausência de um produto químico ou, por exemplo, a presença ou ausência de luz.

[0103] As gotas aquosas encapsuladas da invenção podem, portanto, ser utilizados como módulos de sensores e, consequentemente, num modo de realização, a gota de solução aquosa, ou, pelo menos, uma das gotículas de solução aquosa na gotícula encapsula da invenção como aqui definidos, podem ainda compreender um molécula de sensor.A molécula de sensor pode estar presente no meio aquoso da gotícula ou numa camada dupla formado numa interface entre a das gota e a camada periférica ou entre a das gota e uma outra gotícula de solução aquosa. Qualquer molécula de sensor adequado pode ser empregue. A molécula de sensor pode por exemplo ser uma molécula que é sensível à presença de um produto químico particular, por exemplo, um anaiyte alvo, ou, por exemplo, uma molécula fotossensível. Um exemplo de uma molécula de sensor sensível à luz adequado é bacteriorodop- sina. Bacteriorodopsina é uma membrana de proteína que capta a energia da luz e usa-o para mover protões através da membrana. Outros exemplos adequados de moléculas de sensores incluem canais iônicos fechados e proteínas receptoras.

[0104] A gota de solução aquosa, ou, pelo menos, uma das gotículas de solução aquosa na gotícula encapsulada da invenção pode compreender ainda uma molécula de entrega. A entrega da molécula a partir da gota para encapsular o ambiente externo pode, por exemplo ser contingente na ativação de uma molécula de sensor na ou em outra gotícula no encapsulado. O meio hidrofóbico nas gotas encapsuladasda invenção podem ser selecionados de entre uma vasta gama de materiais. O meio hidrofóbico pode compreender um único composto hidrofóbico. Em alternativa, pode compreender uma mistura de dois ou mais compostos hidrofóbicos diferentes. O meio é hidrofóbico, de modo que a gotícula de solução aquosa ou gota no multisoma permanecer encapsulados na forma de gotas, em vez de se misturar com o meio hidrofóbico, mas caso contrário, o meio hidrofóbico pode ser escolhido livremente. O meio hidrofóbico pode ser selecionado para afetar a flutuação da gotícula de solução aquosa ou gota no multisoma e a velocidade de formação da camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da gotícula de solução aquosa ou gota quando se prepara o multisoma.

[0105] Um meio hidrofóbico nas gotas encapsuladasda in-venção é tipicamente um óleo. Um óleo pode ser um composto único, puro, ou o óleo pode compreender uma mistura de dois ou mais compostos. Qualquer tipo de óleo é adequado, desde que a sua tensão interfacial com o meio hidrofí- lico das gotas aquosas e a fase de massa externa é suficientemente elevada para prevenir a desintegração espontânea da gota de óleo e aquosas, e desde que ele não desestabilizar as camadas duplas formadas.

[0106] O óleo pode, por exemplo, compreende óleo de silicone (por exemplo, polifenil metil siloxano). O óleo pode ser constituído por um óleo de silicone simples, por exemplo, polifenil metil siloxano. Alternativamente, o óleo pode compreender uma mistura de dois ou mais óleos de silicone diferentes.

[0107] Adicionalmente ou em alternativa, o óleo pode compreender um hidrocarboneto. Quando o óleo é composto por um hidrocar- boneto que pode compreender um único composto de hidrocarboneto, ou uma mistura de dois ou mais hidrocarbonetos.

[0108] Em algumas formas de realização, o óleo é uma mistura que compreende: (a) um ou mais hidrocarbonetos, e (b) um ou mais óleos de silicone.

[0109] Quando o óleo é composto por um hidrocarboneto, o hidrocarboneto pode ser ramificado ou não ramificado, por exemplo, um hi-drocarboneto possuindo de 5 a 30 átomos de carbono, ou de 5 a 20 átomos de carbono (embora os hidrocarbonetos de baixo peso molecular que requerem um controlo de evaporação). Preferencialmente, o hidrocarboneto é um líquido à temperatura de funcionamento do encapsulado gotícula da invenção. Os exemplos adequados incluem alcanos ou alcenos, tais como hexadecano, o decano, o pentano ou o esqualeno. Normalmente, o óleo compreende um hi- drocarboneto.

[0110] Tipicamente, o hidrocarboneto é um alcano não substituído C10-C20, por exemplo o hexadecano. Embora se tenha descoberto que a baixa densidade de hexadecano pura feita a montagem de multisomas pelo método descrito nos presentes Exemplos difícil, hexadecano e alcanos mais curtas, no entanto, devem ser adequados para outras multisomas para os quais os efeitos de flutuação são menos importantes e cujo monocamadas podem formar mais rapidamente, incluindo, por exemplo "miniaturizada" multisomas que são menores do que aqueles preparados nos presentes exemplos.

[0111] Em algumas formas de realização, o hidrocarboneto é um hidrocarboneto de cadeia mais longa, Alcanotal como Alcano C17-C20 não substituído.

[0112] São possíveis outros tipos de óleo. Por exemplo, o óleo pode ser um fluorocarboneto. Isto pode ser útil para o estudo de alguns sistemas, por exemplo, para minimizar a perda de uma membrana de proteína particular ou analito da gotícula ou para controlar o conteúdo de gás, tal como oxigénio. Porque fluorocarbonetos podem ser tanto hidrófobos e lipófobo, uma fase de óleo que compreende fluorocarbonetos podem utilmente impedir a adesão da multisomas às superfícies. Em outra forma de realização, o hidrocarboneto é um C10-C30 Alcano substituído-bromo, ou por exemplo um Alcano C10-C20 substituído-bromo, por exemplo bromododecano. Embora bromododecano foi verificado a necessidade de longos tempos de incubação para a formação de monocamada, este óleo deve ser mais apropriado para outras multisomas cuja monocamadas podem incubar mais rapidamente, por exemplo, multisomas “miniaturizado”, que são menores do que aqueles preparados nos presentes Exemplos.

[0113] Normalmente, o óleo compreende um óleo de silicone ou hidrocarbonetos. Qualquer óleo de silicone adequado pode ser empregue.

[0114] Óleo de silicone é vantajoso devido à sua densidade ser próximo ao da água, o que garante que gotas encapsuladas são aproximadamente flutuabilidade neutra na água. O óleo de silicone pode ser por exemplo de polifenilmetilsiloxano, que tem uma densidade de cerca de 1 g.cm "3.

[0115] O hidrocarboneto tipicamente possui de 5 a 20 átomos de carbono (um C 5 -C 2) o hidrocarboneto, mais tipicamente de 10 a 20 átomos de carbono (um hidrocarboneto C10-C20). Tipicamente, ele é um Alca- no ou um alceno. Assim, o hidrocarboneto pode ser um Alcano C5-C20, ou um Alcano C10-C20. Numa outra forma de realização, o hidrocarboneto pode ser um Cs ~ C 2 o alceno, ou um alceno C50-C20. O hidrocarboneto é normalmente não substituído. Numa forma de realização preferida, o hidrocarboneto é um não substituído alcano C5-C20, de preferência um não substituído Ci 0 -C 2 o Alcano. O hidrocarboneto pode ser, por exemplo, esqualeno, hexadecano ou decano. Numa forma de realização é o esqualeno. No entanto, em algumas formas de realização, o hidrocarboneto pode ser substituído com um átomo de halogéneo, por exemplo bromo.

[0116] Em algumas formas de realização, o meio hidrofóbico que compreende uma mistura de óleo de silicone e um hidrocarboneto. Tais misturas foram encontrados para fornecer vezes vantajosamente baixas para incubação multisomas estáveis para serem formadas. O óleo de silicone e de hidrocarbonetos na mistura pode ser conforme definido mais acima. Tipicamente, o hidrocarboneto é um não substituído alcano C10-C20, de preferência o hexadecano. O óleo de silicone tem, tipicamente, uma densidade próxima da da água, para garantir a flutuabilidade multisoma tem aproximadamente neutro em meio aquoso; ele pode ser por exemplo poli siloxana fenil- metil. Normalmente, a relação do volume do óleo de silicone para o hidrocar- boneto é igual ou maior do que 5: 1. A proporção em volume do óleo de silicone para o maio de hidrocarboneto, por exemplo, ser de 5: 1 a 15: 1, por exemplo cerca de 9: 1 ou cerca de 10: 1.

[0117] Tipicamente, o meio hidrofóbico utilizado nas gotas encapsuladas da invenção tem uma densidade próxima da água, por exemplo, uma densidade de cerca de 1 g.cm "3, de tal modo que os encapsulados de gota da invenção são aproximadamente de flutuação neutra na água.

[0118] Numa forma de realização, o meio hidrofóbico que compreende tanto o óleo de silicone e hexadecano. Tipicamente, o óleo de silicone é o poli siloxano fenil-metil. A proporção em volume do óleo de silicone para o hexadecano é tipicamente igual ou maior do que 5: 1, por exemplo, a partir de 5: 1 a 15: 1. Pode por exemplo ser de cerca de 9: 1, ou de cerca de 10: 1.

[0119] O meio aquoso no interior da gotícula de solução aquosa ou gota nas gotas encapsuladasda invenção pode ser água pura. Em alternativa, o meio aquoso pode ser uma solução aquosa, por exemplo uma solução tampão aquosa. A solução aquosa pode ser escolhida livremente com a finalidade ou o uso do multisoma, ou para o experimento a ser realizado usando o multisoma. A solução aquosa de cada gotícula na encapsula gota podem ser iguais ou diferentes. Uma propriedade importante é o pH, e isto pode ser variado ao longo de uma vasta gama. Em algumas formas de realização, por exemplo, o pH do meio aquoso no interior da gotícula de solução aquosa ou gota pode estar na gama de 5 a 9 (ou, por exemplo, no intervalo compreendido entre 6 e 8), embora pHs mais elevados e mais baixos são também possíveis. O meio aquoso pode, portanto, ser uma solução tampão aquosa. Qualquer tampão adequado pode ser empregue, dependendo do pH desejado. A solução tampão pode ser, por exemplo, compreender de Tris HC1, com KCl, e EDTA, em algumas formas de realização, o pH da solução aquosa de tampão é de 5 a 9, ou, por exemplo, de 6 a 8. A natureza e concentração dos solutos pode ser variada para variar as propriedades da solução.

[0120] O encapsulamento das gotículas da invenção compreende moléculas anfipáticas que não são polímeros e que não compreendem polímeros. Tais moléculas anfipáticas, que estão presentes em ambas a camada periférica da gotícula encapsulada, e na camada externa do ou de cada uma das gotas, são aqui referidas como "moléculas anfipáticas não poliméricas". Em geral, as moléculas anfipáticas não poliméricas podem ser de qualquer tipo que é capaz de formar uma camada dupla dentro do meio hidrofóbico na multisoma. Isto depende da natureza do meio hidrofóbico e o meio aquoso das gotas, mas uma grande variedade de moléculas anfipáticas não- poliméricas são possíveis.

[0121] Moléculas anfipáticas são moléculas que têm ambos os grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. Como mencionado acima, a camada externa formada em torno da gotícula de solução aquosa compreende normalmente uma monocamada de moléculas anfipáticas não poliméricas, que é formado e mantido naturalmente pela interação dos grupos hidrofóbicos e hidrofílicos com o meio aquoso de modo a que as moléculas de alinhamento sobre a superfície a gota com os grupos hidrofílicos voltadas para dentro em direcção ao meio aquoso e os grupos hidrofóbicos viradas para o externa em direcção ao meio hidrofóbico. Da mesma forma, a camada periférica formada ao redor da gota hidrofóbico compreende normalmente uma monocamada de moléculas anfipáticas não poliméricas, que é formado e mantido naturalmente pela interação dos grupos hidrofóbicos e hidrofílicos com: (a) o meio hidrofóbico da gota e, quando a gotícula encapsular é suspensa dentro de um veículo hidrofílico, tal como um meio aquoso ou um líquido iônico, (b) o veículo hidrofílico.

[0122] Uma importante classe de moléculas anfipáticas não poliméricas, que podem ser usados nas gotas encapsuladas da invenção são as moléculas lipídicas. As moléculas de lipídios pode ser qualquer uma das principais classes de lipídios, incluindo fosfolipídios, ácidos graxos, acy graxo! S, Glycerolipids, glycerophosphoiipids, esfingolipídios, lipídios, esteróis lipídios prenol, saccharolipids e policetídeos. Alguns exemplos importantes incluem fosfolipídios e ácidos graxos. As moléculas de lipídios pode ser ocorrência natural ou sintética. Embora a formação de uma camada dupla de moléculas lipí- dicas foi demonstrada é esperado que o método é adequado para todas as moléculas anfipáticas não poliméricas capazes de formar uma camada dupla.

[0123] Uma classe comum de grupo hidrófobo, que pode estar presente em uma molécula anfipática não-polimérico é um grupo hidrocarboneto, como por exemplo, na maioria dos lipídios. No entanto, outro tipo adequado de grupo hidrofóbico que pode ser empregue é um grupo de fluorocarbono. Assim, uma outra classe importante de molécula anfipática não- polimérico é uma molécula anfipática não polimérico que compreende pelo menos um grupo de fluorocarbono. Um exemplo de uma tal molécula seria uma molécula IPID semelhante. Que compreende uma cauda hidrófoba de fluorocarbono e um grupo de cabeça hidrofílico. Fluoroanfifílicos pode ser usado para impedir que a inserção de proteínas de membrana para camadas duplas de lipídios, possivelmente por sequestrar as proteínas em agregados da fluoroamphiphile (Bioquímica Raychaudhuri et al. 50, 1599-1606 (201 1)). As moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada não precisam de ser todos do mesmo tipo. Em vez disso, as moléculas anfipáticas não poliméricas podem, em algumas formas de realização ser uma mistura de dois ou mais tipos diferentes de molécula anfipática não polimérica. Outro exemplo importante é que as moléculas anfipáticas não poliméricas nas respectivas camadas externas de diferentes gotículas de solução aquosa na multisoma podem ser de tipos diferentes, de modo que a camada dupla (s) formado entre as diferentes gotículas de solução aquosa pode ser assimétrica.

[0124] Tipicamente, por conseguinte, as moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada da invenção compreendem moléculas lipídicas. As moléculas de lipídios não necessitam de ser todas do mesmo tipo. Assim, as moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada da invenção podem compreender um único tipo de lipídio ou uma mistura de duas ou mais moléculas de lipídios diferentes. Além disso, a com posição de lipídio da camada periférica da gotícula encapsulada podem ser o mesmo ou diferente do que a da camada externa da gotícula de solução aquosa. Quando mais do que uma gota de solução aquosa está presente no encapsulado, as composições de lipídios das camadas externas das gotículas de solução aquosa podem ser o mesmo ou diferentes um do outro, e o mesmo que ou diferente a partir da composição de lipídio da camada periférica. Moléculas lipídicas são particularmente vantajosos porque camadas duplas lipídicas, ou mais genericamente as camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas, são os modelos de membranas celulares e as gota encapsulados da invenção, portanto, servir como excelentes plataformas para uma série de estudos experimentais, incluindo, por exemplo, como novos plataformas para o estudo fundamental de proteínas de membrana, ou como chassis protocellular multi-compartimento para "de baixo para cima" biologia sintética.

[0125] Os fosfolipídios são particularmente preferidos, por razões descritas acima e também porque são um componente importante de todas as membranas celulares, tornando gota encapsula compreendendo fosfolipídios particularmente adequado para aplicações de biologia sintética, bem como para a entrega do fármaco.

[0126] Deste modo, as moléculas anfipáticas não poliméricas nas gotas encapsuladas da presente invenção compreendem tipicamente as moléculas de fosfolipídios. As moléculas de fosfolipídios podem ser iguais ou diferentes, ou seja, as moléculas anfipáticas não poliméricas na encapsulado gotícula pode compreender um único tipo de fosfolipídio, ou uma mistura de dois ou mais diferentes fosfolipídios. Os fosfolipídios são bem conhecidos para um técnico no assunto e muitos estão comercialmente disponíveis, a partir de fornecedores, tais como Avanti Polar Lipids. As moléculas de fosfolipídios podem ser glicerofosfolipídios ou fosfoesfingolipídios ou uma mistura dos dois. As moléculas de fosfolipídios podem compreender fosfolipídios, fosfolipídios aniô- nicos que compreendem aminas primárias, fosfolipídios contendo colina e / ou glicoesfingolipídios. Normalmente, as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem um ou mais lipídios glycerophospho. Como o técnico no assunto apreciar, glicerofosfolipídios incluem, mas não estão limitados a glicerofosfoli- pídios contendo uma estrutura, tal como definido na fórmula (I):

em que: R 1 e R 2, os quais são iguais ou diferentes, são selecio nados a partir de C 1 0-C 25 alquilo e os grupos C 10 -C 2Sgrupos alquileno; ou R 3 está ausente de tal modo que OU 3 é S " , ou R 3 está presente e é H, CH 2 CH 2 N (R 4 ) 3 + , um grupo açúcar, ou um grupo de aminoácidos, e cada R 4, que é o mesmo ou diferente, é selecionado in-dependentemente a partir de H e alquilo em Q-C4.

[0127] Tipicamente, quando R 3 representa CH 2 CH 2 N (R 4) 3 +, cada um de R 4, que é o mesmo ou diferente, é selecionado de H e metilo. Como o técnico no assunto irá apreciar, quando cada R 4 representa um grupo metilo, R 3grupo é um grupo colina, e quando cada R 4 seja H, R 3 grupos é um grupo de etanolamina.

[0128] Quando R3 representa um grupo de aminoácidos que pode ser por exemplo um grupo serina, ou seja,-CH2CH (NH2) (COOH). Quando R3 representa um grupo de açúcar, que pode ser por exemplo glicerol, ou seja, -CH 2 CHOHCH 2 OH, ou, por exemplo, inositol, ou seja, -CH (CHOH)5.

[0129] São exemplos típicos de R1 e R2 grupos são de C10-C25, os grupos alquilo, incluindo, mas não limitado a linear C10-C25 grupos alquilo, tais como, por exemplo, CH3(CH2)IO, CH3(CH2)i2-, CH3(CH2)i4-, CH3(CH2)i6-, CH3(CH2)i8-, CH3(CH2)22— e grupos alquilo ramificados C10-C25, tais como, por exemplo -CH2-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3- CH(CH3)2.

[0130] Mais exemplos típicos de R1 e R2 são grupos não substituído C10-C25 grupos alquileno, incluindo, mas não limitados a CH3(CH2)5CH = CH(CH2)7-,CH3(CH2)7CH-CH(CH2)7-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4(CH-CHCH2)3CH==CH(CH2)3-5 e CH3CH2CH-CHCH2CH=CHCH2CH-CH(CH2)7".

[0131] Como o técnico no assunto irá apreciar, o O- grupo fosfato no grupo adjacente OR3 a grupo pode, em algumas formas de realização ser protonado, ou associado com um cátion adequado, por exemplo um cátion de um metal, tal como Na +.

[0132] Assim, as moléculas anfipáticas não poliméricas podem compreender um ou mais glicerofosfolipídios têm a estrutura de fórmula (1) tal como definido acima.

[0133] Por exemplo, as moléculas anfipáticas não poliméricas podem compreender qualquer um ou mais dos seguintes glicerofosfolipídios: 1,2-diftanoil-OT-glicero-3-fosfocolina (DPhPC), 1,2-diestearoil-OT-glicero- 3-fosfocolina (DSPC) Z-dipalmitoil-sra-glicero-3-fosfocolina (DPPC), ou 1-, 2- dipalmitoil-OT-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DPPG) pode ser empregue como as moléculas anfofílicas nas gotas encapsuladas da invenção, ou uma mistura de um ou mais dos mesmos. O glicerofosfolipídios 1,2-dioleoil-sfi-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE) pode também ser usado, e é tipicamente utilizado em combinação com um lipídio sensível ao pH, por exemplo, um ácido graxo (ver mais abaixo).

[0134] As moléculas anfipáticas não-poliméricas nas gotas encapsuladasda invenção pode compreender um ou mais ácidos graxos, por exemplo ácido oleico. Os ácidos graxos são, naturalmente, bem conhecidos do perito e uma vasta gama de estes estão disponíveis comercialmente.

[0135] As moléculas anfipáticas não-poliméricas, por exemplo, podem compreender uma mistura que compreende: (a) um ou mais fosfolipídios, e (B) um ou mais ácidos graxos.

[0136] Para além das moléculas anfipáticas não poliméricas, a camada periférica da gotícula encapsulada da invenção pode ainda compreender um lipídio PEGuilado. O termo "lipídio peguilados", tal como aqui utilizado, refere-se a um lipídio que tenha sido derivatizado com poli(etileno glicol).

[0137] A inclusão de um ou mais lipídios Peguilados na camada periférica do multisome tem o efeito útil de estabilizar o multisoma in vivo, e, em particular, prolonga a meia-vida de plasma da multisoma. Isto significa que, quando o multisoma contém um ou mais agentes terapêuticos ou de diagnóstico, a inclusão de um ou mais lipídios Peguilados na camada periférica também tem o efeito útil de prolongar a meia-vida no plasma do agente dentro do multisoma. Tais efeitos foram previamente observadas quando lipídios Peguilados são usados em formulações de fármacos lipossomais. Lipídios Peguilados são conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis a partir de fornecedores tais como NOF Corporation, Japão (ver http://www.phospholipid.jp/phospholipid_2-3.html). Qualquer lipídio PEGuilado adequado pode ser empregue na presente invenção, incluindo, mas não limitado a PEG-fosfolipídios, de diacilglicerol-PEG, derivados de colesterol, PEG, e suas misturas. Assim, numa forma de realização, a camada periférica da gotícula encapsulada da invenção compreende ainda um lipídio PEGuilado. A camada periférica pode incluir um ou mais lipídios Peguilados em adição às moléculas anfipáticas não-poliméricas, por exemplo, múltiplas cópias do mesmo lipídio PEGilada, ou uma mistura de dois ou mais classes diferentes de lipídios Peguilados. Lipídios Peguilados adequados incluem, mas não estão limitados a PEG-fosfolipídios, de diacilglicerol-PEG, derivados de colesterol, PEG e as suas misturas. O componente de poli (etileno glicol) (PEG) do lipídio PEGilada pode ter qualquer uma de várias geometrias diferentes. Assim, ela pode ser substancialmente linear de PEG ou PEG ramificado. O PEG ramificado pode, por exemplo, têm de três a dez cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Alternativamente, o PEG ramificado pode ser uma estrela de PEG, tendo de 10 a 100 cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Alternativamente, o PEG pode ser PEG de um pente, tendo múltiplas cadeias de PEG enxertadas a uma espinha dorsal de polímero.

[0138] Os um ou mais lipídios Peguilados empregues no maio camada periférica, por exemplo, compreender um PEG-fosfolipídio com a seguinte fórmula (II)

em que R 1 e R 2 são tal como acima definido para os gli- cerofosfolipídios de fórmula (I), e R 5 seja um grupo que compreende poli (eti- leno-glicol).

[0139] O grupo que compreende poli (ethy! eno glicol) pode por exemplo ter a fórmula-CH 2 CH 2 NHC (0)-X, ou, por exemplo,- CH 2 CH 2 NHC (0) (CH 2 ) 3 C (0) -X, em que X compreende a referida poli (eti- leno-glicol). A maio grupo X, por exemplo, compreendem PEG substancialmente linear, ou, por exemplo, um PEG ramificado, possuindo, por exemplo, de três a dez cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Alternativamente, ele pode ser uma estrela de PEG, tendo, por exemplo, de 10 a 100 cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Ou, por exemplo, pode ser um PEG pente, tendo múltiplas cadeias de PEG enxertadas a uma espinha dorsal de polímero.

[0140] Assim, R 5 pode ser, por exemplo, ser- CH 2 CH 2 NHC (0) - (OCH 2 CH 2) q OCH 3, -CH 2 CH 2 NHC (0) (CH 2) 3 C (0) - (OCH 2 CH 2) q OCH 3 ,-CH 2 CH 2 NHC (0) - (OCH 2 CH 2 ) q OH, ou - CH 2 CH 2NHC (0) (CH 2 ) 3 C (0) - (OCH 2 CH 2 ) q OH ) em que q é um número inteiro positivo. O inteiro q pode por exemplo ser de 5 a 10 mil, ou por exemplo de 10 a 1000. Alternativamente, R 5 pode ser - (CH 2 CH 2 0) q CH 3, ou - (CH 2 CH 2 0)q H, em que q é um número inteiro positivo. O inteiro q pode por exemplo ser de 5 a 10 mil, ou por exemplo de 10 a 1.000.

[0141] Adicionalmente ou em alternativa, um ou mais lipídios Peguilados podem compreender um diacilglicerol-PEG de fórmula (III)

em que R 1 e R são como definidos acima para os glicero- fosfolipídios de fórmula (I), e R é um grupo que compreende poli (etileno-glicol).

[0142] O poli (etileno glicol) pode ser, por exemplo, compreender PEG substancialmente linear, ou, por exemplo, um PEG ramificado, possuindo, por exemplo, de três a dez cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Alternativamente, ele pode ser uma estrela de PEG, tendo, por exemplo, de 10 a 100 cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Ou, por exemplo, pode ser um pente PEG, tendo múltiplas cadeias de PEG enxertadas a uma espinha dorsal de polímero.

[0143] R6 pode por exemplo ser -(CH2CH2O)qCH3, - (CH2CH2O)qH, -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH, -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3 ou -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH, em que q é um número inteiro positivo. O inteiro q pode por exemplo ser de 5 a 10 mil, ou por exemplo de 10 a 1000.

[0144] Adicionalmente ou em alternativa, um ou mais lipídios Peguilados podem compreender um derivado de colesterol PEG-de fórmula (IV)

em que R 7 representa um grupo que compreende poli (etileno-glicol).

[0145] Mais uma vez, o poli (etileno glicol) pode compreender PEG substancialmente linear, ou, por exemplo, um PEG ramificado, possuindo, por exemplo, de três a dez cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Alternativamente, ele pode ser uma estrela de PEG, tendo, por exemplo, de 10 a 100 cadeias de PEG que emanam a partir de um núcleo central. Ou, por exemplo, pode ser um PEG pente, tendo múltiplas cadeias de PEG enxertadas a uma espinha dorsal de polímero.

[0146] R 7 pode ser, por exemplo, ser - (OCH 2 CH 2) q OH ou - (OCH 2 CH 2 ) <) OCH3 em que q é um número inteiro positivo. O inteiro q pode por exemplo ser de 5 a 10 mil, ou por exemplo de 10 a 1000.

[0147] Poliglicerina pode ser usado em vez de poli (etileno-glicol), pelo que numa forma de realização a camada periférica da gotícula encapsulada da invenção pode ainda compreender um lipídio que compreende uma porção de poliglicerina.

[0148] Gotas encapsuladas da invenção possuindo diâmetros na gama de 500μm a 2000 μm, tipicamente cerca de 800μm têm sido produzidos experimentalmente. É, no entanto, esperado que encapsula gotas maiores e encapsulados de gota de menor diâmetro pode ser produzidos. Deste modo, numa forma de realização, os encapsulados de gota da invenção têm um diâmetro que é igual ou inferior a 2 mm, de preferência igual ou inferior a 1 mm.

[0149] Os volumes das gotas encapsuladas da invenção, que têm sido produzidos experimentalmente, variam tipicamente de 0,2 μL a 2 μL, mas mais uma vez, espera-se que a maior dimensão das gotas e se encapsula gotas de menor volume poderia ser produzido. Assim, numa forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção tem um volume o qual é igual a ou menor que 4 μL de preferência igual ou inferior a 2 μL. A gotícula de maio encapsulado por exemplo tem um volume na gama de 0,2 μL a 2 μL.

[0150] Tipicamente, ou cada gotícula de solução aquosa dentro da encapsulada gotícula da invenção tem um diâmetro que é igual ou inferior a 500 μm, de preferência igual ou inferior a 300 μm.

[0151] O volume da ou de cada uma das gotas na gotícula encapsulada da invenção é geralmente igual ou inferior a 80 nL, por exemplo igual ou inferior a 20 nL. Numa forma de realização, o ou cada gotícula de solução aquosa tem um volume de entre 0,5 nL e 70 nL.

[0152] Como mencionado acima, espera-se que os en-capsulados de gota de menor volume e de diâmetro podem ser produzidos. Encapsula gota menores são particularmente desejáveis para a administração in vivo, por exemplo, em aplicações de entrega de fármacos. Na verdade, seria preferível em aplicações que requerem multisomas para interagir com as células vivas que encapsula as gotas não eram maiores do que alguns mi- crómetros, e, de preferência <200 nm.

[0153] Assim, a gotícula encapsulada da invenção pode em algumas formas de realização têm um diâmetro que é igual ou inferior a 10 μm, ou, por exemplo, igual ou inferior a 200 nm. O encapsulamento das gotícu- las da invenção pode, em algumas concretizações tem um volume que é igual ou inferior a 0,5 picolitros, ou, por exemplo, igual ou inferior a 5 attolitros.

[0154] O efeito do aumento da curvatura nas monocama- das e camadas duplas é susceptível de ser significativa em encapsula destes tamanhos. Portanto, pode ser preferível utilizar lipídios com altas curvaturas intrínsecas em tais gotas encapsuladas, a fim de adaptar as propriedades dependentes da curvatura das monocamadas e camadas duplas, tais como as transições de fase. Os lipídios com altas curvaturas intrínsecas são bem conhecidas para o perito na arte. Zimmerberg, J. & Kozlov, MM Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 7, 9-1 (2006) apresenta várias estratégias para a produção de camada dupla curvatura, e Tabie 1 em que o papel apresenta alguns lipídios com curvaturas elevadas intrínsecas, tais como DOPE (com curvatura negativa) e vários lisolipídios (com curvatura positiva). Assim, exemplos de lipídios com altas curvaturas intrínsecas incluem os seguintes lisofosfolipídios, todos os quais têm curvaturas positivos: fosfatidilcolina L-liso (L-liso PC), fosfatidilcolina ó-liso (liso-PC O), P-liso fosfatidilcolina (P- liso PC), ácido lisofosfatídico (LPA), fosfatidiletanolamina L-liso (L-liso PE), fosfatidiletanolamina ó-liso (O-liso PE) e fosfatidiletanolamina S-liso (S-liso PE). Dioleoylphosphatidylserine (DOPS) também tem curvatura positiva. Outros exemplos de lipídios com altas curvaturas intrínsecas incluem as seguintes, que têm curvaturas negativas: dioleoilfos- fatidilcolina (DOPC), ácido fosfatídico (PA), 1,2-dioleoil-OT-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol, dicaprylglycerol (DCG) e diacil lycerol (DAG) (Zimmerberg, J. & Kozlov, MM Nat Rev. Mol celular Bio 7, 9 - (2006)).

[0155] Assim, as moléculas anfipáticas não-poliméricas nas gotas encapsuladas da invenção podem em algumas formas de realização ser selecionado a partir de L-liso PC, ó-liso PC, P-liso PC, LPA, L-liso PE, O- liso PE, S -liso PE, DOPS, DOPC, PA, DOPE, colesterol, DCG e DAG.

[0156] Seria preferível em encapsula gotícula de menos do que 10 μin de diâmetro para revestir as gotículas de solução aquosa encapsuladas, e a gota de meio hidrofóbico, com lipídios de curvatura oposta, res pectivamente. Isto pode ser conseguido através da incubação das gotículas de solução aquosa em óleo contendo lipídios com curvatura negativa, em seguida, transferir as gotas numa gotícula de óleo revestidas com uma monocamada de lipídio com curvatura positiva.

[0157] Deste modo, tipicamente as moléculas anfipáticas não poliméricas na camada periférica compreendem lipídios tendo uma primeira curvatura e as moléculas anfipáticas não poliméricas na camada externa do ou de cada gotícula de solução aquosa compreendem os lipídios que têm uma segunda curvatura, na qual tanto a primeira curvatura é positiva e a segunda curvatura é negativa, ou a segunda curvatura é positivo e a primeira curvatura é negativa. Exemplos de lipídeos com curvatura negativa incluem DOPC, PA, DOPE, colesterol, DCG e DAG. Exemplos de lipídeos com curvatura positiva incluem lysophospholipids (por exemplo L-liso PC, O-liso PC, P-liso PC, LPA, L-PE liso, liso O-PE e S-liso PE) e do Dops.

[0158] Como mencionado acima, a camada periférica pode ainda compreender um ou mais Lipídios Peguilados (que pode ser o mesmo ou diferentes quando mais do que uma está presente), a fim de aumentar o tempo de vida do multisoma na corrente sanguínea.

[0159] Encapsula gota da invenção podem ser utilizados como veículos de distribuição de fármacos, por exemplo, como veículos para a entrega de agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico, ou agentes de contraste in vivo, ou para a entrega de qualquer outro tipo de composto ou composição in vivo, como desejado.

[0160] Deste modo, numa forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção compreende ainda um agente terapêutico.

[0161] O agente terapêutico pode estar na forma de pró- fármaco. Deste modo, numa forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção compreende adicionalmente um pró-fármaco.

[0162] O encapsulamento das gotículas da invenção pode compreender, alternativamente, um agente de diagnóstico, ou, por exemplo, um agente de contraste.

[0163] O agente terapêutico, pró-fármaco, um agente de diagnóstico, ou agente de contraste pode estar presente no meio hidrofílico de uma gotícula de solução aquosa na gotícula encapsulada da invenção. Como alternativa, ele pode estar presente no meio hidrofóbico da gota.

[0164] Tipicamente, ele está presente no meio hidrofílico do ou uma gotícula de solução aquosa na encapsulado.

[0165] Múltiplas gotas no mesmo encapsulamento gotícula pode libertar o seu conteúdo para o meio ambiente, simultaneamente ou em momentos diferentes, por exemplo, após a exposição a um estímulo externo, tal como uma alteração no pH ou na temperatura; isto proporciona um método útil para a entrega de fármacos combinatória. Com efeito, proporcionando múltiplas espécies farmacológicas para uma célula por encapsulação em liposso- mas convencionais requer que essas espécies ser encapsulada ou em conjunto, permitindo que as reacções potencialmente indesejáveis entre eles; ou separadamente, em cujo caso cada célula receberá uma proporção mal controlada de cada espécie. Por outro lado, o fornecimento de vários fármacos encapsulados em diferentes compartimentos de uma única multisoma (incluindo na fase hidrófoba) permitirá um controlo preciso sobre as proporções de dosagem. Isto pode ser vantajoso para a administração de fármacos com mecanismos de acção independentes; a sua absorção pelas células, em proporções fixas poderá ser esperado para aumentar a sua eficácia global, e diminuir a probabilidade de desenvolvimento de resistência a qualquer um dos fármacos. Deste modo, numa forma de realização, a gotícula encapsulada da inven-ção compreende ainda um primeiro agente e um segundo agente. Normalmente, estes estão presentes em partes separadas do encapsular. As partes do encapsulado aqui referido incluem o meio hidrofóbico da gota, e o meio aquoso de qualquer das gotículas de solução aquosa.

[0166] Assim, numa forma de realização do primeiro agente está dentro da, ou, pelo menos, uma das gotículas de solução aquosa, no encapsulado, e o segundo agente está dentro do meio hidrofóbico.

[0167] Numa outra forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção é uma gotícula encapsulada, que compreende uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa, e o primeiro agente e o segundo agente são de diferentes gotículas de solução aquosa de o encapsular.

[0168] Tipicamente, os primeiro e segundo agentes são selecionados de entre agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico, fármacos para utilização em terapias de combinação em conjunto, pró-fármacos e os seus ativadores, correspondentes fármacos e seus compostos desativador cor-respondentes, bem como agentes de contraste para a monitorização da biodis- tribuição do fármaco.

[0169] Em alternativa, os primeiro e segundo agentes podem ser compostos de reagentes por reagir em conjunto numa reacção química.

[0170] Tipicamente, os primeiro e segundo agentes estão presentes na gotícula encapsulada numa proporção pré-determinada, por exemplo, em uma proporção de dosagem pré-determinada, ou por exemplo, numa proporção estequiométrica apropriada para uma reacção química particular, para ter lugar entre os agentes.

[0171] A entrega de múltiplos fármacos com mecanismos independentes da ação podem ser mais eficaz do que a soma dos efeitos de cada fármaco separadamente. A utilização conjunta de combinações de fármacos é o de impedir o aparecimento de resistência aos fármacos em uma ampla gama de doenças. Se os vários fármacos são entregues em solução, a proporção de cada fármaco tomado por uma célula em particular é mal controlada. Por outro lado, a encapsulação destes fármacos numa única portadora, tal como uma gotícula encapsulada a invenção, proporciona um controlo preciso sobre as proporções de dosagem. Encapsular múltiplas fármacos em compar- timentos separados de cada multisoma impede que qualquer das interações indesejáveis entre os fármacos, e permite que as condições em cada compartimento aquoso a ser otimizado para a fármaco naquele compartimento.

[0172] Assim, numa forma de realização, os primeiro e segundo agentes referidos acima são dois fármacos diferentes. Tipicamente, os primeiro e segundo agentes são medicamentos que são adequados para utilização em conjunto numa terapia de combinação. Os fármacos podem estar presentes na gotícula encapsulada de uma proporção de dosagem pré- determinada. Muitas combinações de medicamentos, que são adequados para utilização em conjunto numa terapia de combinação, e que são, portanto, adequados para o uso em conjunto de uma gotícula de encapsular da invenção, são conhecidos na arte. Por exemplo, o uso de combinações de antimaláricos que não compartilham o mesmo mecanismo de resistência pode reduzir as chances de resistência aos fármacos (White, N. "resistência à fármacos antima- láricas e combinação de quimioterapia." Phil Trans. R. Soc.. Lond. B 354, 739749 (1999)). Assim, os primeiro e segundo agentes podem ser duas fármacos antimaláricas diferentes que têm diferentes mecanismos de resistência a fármacos. Em particular, o primeira e segunda fármacos anti-maláricos pode ser pirimetamina em combinação com sulfadoxina ou sulfaleno cuja combinação é utilizada para o tratamento de malária causada por cloroquina-resistentes de P. falciparum. Os dois compostos inibem etapas sequenciais na biossíntese de folato. O mesmo mecanismo é utilizado pela combinação de clorproguanil e dapsona. Outras combinações de fármacos antimaláricas com diferentes mecanismos de ação incluem: atovaquona e proguanil, artemisina e mefloquina, artemeter e lumefantrina, artesunato com atovaquone e proguanil, quinina e tetraciclina, e quinina e clindamicina. Assim, os primeiro e segundo agentes podem ser de qualquer das combinações acima mencionadas.

[0173] Um outro exemplo é o câncer, para a qual um grande número de combinação existe regimes de quimioterapia (ver, por exemplo, http://www.macmillan.org.uk). Alguns exemplos são ABVD (doxorru- bicina, bleomicina, vimblastina e dacarbazina) para linfoma, CHOP (ciclofosfa- mida, doxorrubicina, vincristina e prednisona) de Hodgkin para o linfoma não- Hodgkin, e CMF (ciclofosfamida, metotrexato e 5-fluorouracil) para câncer de mama. Assim, a gotícula encapsulada da invenção pode compreender qualquer das combinações acima mencionadas e os diferentes fármacos podem estar contidos dentro dos mesmos ou diferentes compartimentos do encapsulamento.

[0174] Ainda outros exemplos de medicamentos que podem ser incluídos dentro do encapsulado gotícula da invenção são combinações de fármacos utilizados para tratar a infecção viral (ver Clavel, F. & Hance, resistência a fármacos AJ HIV. N. Engl. J. Med. 350, 1023 A 1035 (2004)). Combinações típicas incluem inibidores nucleósidos da transcriptase reversa (que inibem a transcrição inversa do genoma viral) e um inibidor da transcriptase reversa não-nucleósido (o qual inibe a transcrição reversa do genoma viral por um mecanismo diferente) ou um inibidor de protease (que inibe a partícula viral montagem). Alguns regimes atuais recomendados são (ver http://aidsinfo.nih.gov): emtricitabina, tenofovir e efavirenz; emtricitabina, te- nofovir, tazanavir e ritonavir; emtricitabina, tenofovir, darunavir e ritonavir; e emtricitabina, tenofovir e raltegravir. O encapsulamento das gotículas da invenção pode, portanto, compreender qualquer das combinações acima mencionadas e os diferentes fármacos podem ser contidas dentro de compartimentos diferentes do encapsulamento. As gotas encapsuladas da invenção também permitem a administração de compostos que têm, independentemente, pouco ou nenhum efeito, e só são eficazes em combinação com outros compostos. Estas combinações sinérgicas são utilizadas em alguns tratamentos para a infecção bacteriana, e na entrega de pró-fármacos (precursores inativos de fármacos activas). Em alguns casos, como no tratamento de infecções bacteri- anas discutidas a seguir, os vários compostos podem ser encapsulados em conjunto, caso em que as vantagens de multisomass são como discutidos acima. Em outros casos, tais como a entrega e ativação de pró-fármacos, como discutido abaixo, os componentes reagem quando unidas. Assim, quando um multisoma é disparado para libertar o seu conteúdo, uma espécie activa pode ser criado in situ com propriedades diferentes para os seus compostos de origem. Alguns exemplos são os seguintes:

[0175] Mecanismos de infecção bacteriana [Walsh, C. mo-leculares que conferem resistência a fármacos antibacterianas. Nature 406, 775-781 (2000)]: A amoxicilina é usada em combinação com o ácido clavulâni- co, que inativa uma enzima que, em determinadas estirpes de outra forma desativar amoxicilina. A combinação de ampicilina e sulbactam emprega um princípio semelhante, em que o sulbactam é o desativador enzimático. Outra combinação sinérgica é a de quinupristina e dalfopristina.

[0176] Deste modo, o primeiras e segundo fármacos na- gotícula encapsulada da invenção pode ser por exemplo amoxicilina e clavula- nato, respectivamente, de ampicilina e sulbactam, respectivamente, ou de quinupristina e dalfopristina, respectivamente.

[0177] Outra possibilidade é a terapia enzima-profármaco [Xu, G. & McLeod, HL Clin. Câncer Res. 7, 3314-3324 (2001)]: HM 1826, um derivado inativo da doxorrubicina fármaco anti-câncer, é convertido por humano beta-g ucuronidase a doxorubicina. Num estudo que empregou esta combinação, o gene da beta-glucuromdase humana foi transfectada em primeiro lugar para as células tumorais, que, em seguida, a enzima produzida e secretada ele. O pró-fármaco HMR 1826 foi adicionado ao espaço extracelular, onde foi convertido para o doxorrubicina fármaco activa. Considerando que o HMR 1826 não é permeável à membrana da célula, a doxorrubicina é capaz de aceder ao citosol. Por conseguinte, os primeiro e segundo agentes da gotícula encapsulada da invenção pode ser HMR 1826 e humano de beta-glucuronidase.

[0178] Numa outra forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção é utilizada como um veículo para a entrega simultânea de um pró-fármaco e do seu ativador. Neste pedido, uma gotícula de um multisoma interior contém um pró-fármaco, e outra gota interior do mesmo multisoma contém o seu ativador correspondente. Conjuntamente liberar o conteúdo em cima de algum estímulo externo permitiria que a pró-fármaco e ativador de combinar, produzindo as espécies ativas in situ. Isto iria permitir a administração de fármacos que são, por exemplo, demasiado instáveis ou insolúveis para ser entregue no estado ativo. Esta abordagem também pode ser utilizada para encapsular uma pró-fármaco permeia para a camada dupla multisomal, que é convertida num fármaco activa que é permeante para as membranas celulares.

[0179] Assim, numa forma de realização, o primeiro agente é uma forma inactiva de um fármaco que é capaz de ser activada por um ativador, e o segundo agente é referido ativador. O ativador pode ser por exemplo uma enzima. A forma inactiva do referido fármaco pode ser referido como um pró-fármaco.

[0180] Tipicamente, a pró-fármaco é um fármaco de que é muito instável ou insolúvel para ser entregue no estado ativo. Assim, numa forma de realização é a pró-fármaco fosfato de miproxifene e o ativador é uma fosfatase alcalina. Fosfato Miproxifene é o éster de fosfato de inactiva do miproxifene agente anticancerígeno, e ~ 1000 vezes maior do que a solubilidade aquosa miproxifene. É convertida para a espécie activa por fosfatases alcalinas.

[0181] Profármacos particularmente adequados à sua entrega em multisomas são aqueles cuja ativadores não são encontrados endo- genamente. Algumas estratégias pró-fármaco dependem da entrega de um ativador exógeno após a entrega sistêmica, alvo de um pró-fármaco. Xu, G. & McLeod, HL "Estratégias para a terapia do câncer enzima / pró-fármaco" Clin. Câncer Res. 7, 3314-3324 (2001) apresenta exemplos de combinações profármaco / ativadores utilizados nestas estratégias, que podem ser utilizados como primeiro e segundo agentes de encapsula as gotas da invenção. O pró- fármaco pode ser, por exemplo, HMR 1826, caso em que o ativador é humano de beta-glucuronidase.

[0182] Por outro lado, a gotícula encapsulada da intervenção no poderiam ser utilizados para entregar fármacos ativos que são desativados por uma outra espécie, proporcionando um controlo preciso sobre o tempo de vida da fármaco ativa.Bodor, N. & Buchwald, P. "design fármaco Soft: princípios gerais e aplicações recentes" med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000) apresenta vários exemplos de fármacos leves, que são normalmente desativados pela espécies endógenas.Multisomas pode permitir o uso de desativadores de exógenos, ou concentrações mais elevadas de desativadores endógenos do que seria encontrado no corpo.

[0183] Assim, numa outra forma de realização, o primeiro agente é um fármaco que é capaz de ser desativado por um composto desati- vador, e o segundo agente é referido composto desativador. Por exemplo, o primeiro agente pode ser o cloreto de mivacúrio fármaco e o segundo agente podem ser a enzima correspondente desativador colinesterase do plasma humano.

[0184] Além dos fármacos, multisomas também pode ser utilizado para transportar um agente de contraste para uma modalidade de imagiologia médica. Isso irá permitir a determinação exacta da distribuição dos medicamentos contidos no multisoma, mantendo o marcador separadas dos fármacos até o momento da entrega. Deve ser possível para encapsular agentes de contraste para as várias modalidades de imagem médica, que permitiriam a visualização de como multisomas de transporte de fármaco são distribuídos no interior do corpo. A utilização de compartimentos separados para o fármaco e o traçador de impedir qualquer reacção química entre os dois. Os agentes de contraste podem ser incluídos para a radiografia (por exemplo dia- trizoato, iopamidol, iodixanol), ressonância magnética (por exemplo gadodiami- de, ácido gadopentético), ultra-som (por exemplo, bolhas de ar), ou radionuclí- deos podem ser encapsulados para tomografia por emissão de pósitrons (eg fiudeoxyglucose (18F)), tomografia cintilografia (por exemplo iobenguano) ou emissão de fóton único computadorizada (por exemplo Na123I).

[0185] Por conseguinte, em uma outra forma de realização, o primeiro agente é um fármaco e o segundo agente é um agente de contraste adequado para a monitorização da biodistribuição do fármaco. O agente de contraste pode, por exemplo, ser um agente de contraste para radiografia (por exemplo diatrizoato, iopamidol, iodixanol), ressonância magnética (MRI) (por exemplo, gadodiamide, ácido gadopentético), ou ultra-som (por exemplo, bolhas de ar), ou radionuclídeos podem ser encapsulados para pósitrons tomo- grafia por emissão (por exemplo fiudeoxyglucose (18F)), a cintilografia (por exemplo iobenguano) ou emissão de fóton único tomografia computadorizada (por exemplo Na 123I).

[0186] Um multisoma pode ser feita para conter compostos não-fármacos e medicamentos, em compartimentos separados (incluindo a fase de óleo). Uma possibilidade para o composto não-fármaco é um agente de contraste adequado para a monitorização da biodistribuição do fármaco, tal como discutido acima. Outras possibilidades são tão fo comos:Agentes [Pouponneau, P., Leroux, JC, Soulez, G., Ga- boury, L. & Martel, S. Co-encapsulação de nanopartículas magnéticas e doxorrubicina em microcarriers biodegradáveis para tecidos profundos a segmentação por navegação MRI vascular Segmentação. Biomateriais 32, 3481-3486 (2011)]: Um estudo recente encapsulado doxorrubicina e magnéticas de nanopartículas (FECO) em poli (ácido láctico-co-glicólico) microesferas, e usaram um scanner de ressonância magnética modificado para simultaneamente imagem e orientar as micropartículas através do sangue vasos in vivo. Um princípio similar pode ser aplicado as gotas encapsuladas da invenção, caso em que as partículas magnéticas e os fármacos poderia ser encapsuladas em compartimentos separados.

[0187] Dispara: Além de encapsular um fármaco, um multisoma poderia conter uma substância que responde a um estímulo externo, de tal modo que induza a libertação da fármaco. Esta substância pode ser, por exemplo, as partículas ferromagnéticas, as quais poderiam ser aquecidas por aplicado externamente campos magnéticos alternados, usado para MRI. Células: Pode ser possível encapsular células vivas em multisomas, e libertá-los para o meio ambiente, em conjunto com os compostos encapsulados separadamente nas mesmas multisomas, para desencadear um comportamento particular.

[0188] Por conseguinte, em uma outra forma de realização, o primeiro agente é um fármaco e o segundo agente é um agente de di- reccionamento, um gatilho ou uma célula viva. O agente de direccionamento ou gatilho pode ser selecionado de entre qualquer um dos listados acima.

[0189] As gotas encapsuladas da invenção podem conter três ou mais agentes diferentes, em diferentes partes do encapsulamento.

[0190] Por conseguinte, em uma outra forma de realização, o encapsulamento de gota é uma gotícula encapsulada como acima definido, que compreende uma pluralidade de referidas gotículas de solução aquosa dentro da camada periférica, e que compreende ainda um primeiro agente, de um segundo agente, e um terceiro agente em partes separadas do encapsular. As partes do encapsulado aqui referido incluem o meio hidrofóbico da gota, e as diferentes gotículas de solução aquosa.

[0191] Por exemplo, numa forma de realização do primeiro agente está presente numa das gotículas de solução aquosa no encapsulado, o segundo agente está presente no meio hidrofóbico, e o terceiro agente que está presente noutro das gotículas de solução aquosa. Numa outra forma de realização, a gotícula encapsulada da invenção é uma gotícula encapsulada que compreende mais do que duas das referidas gotículas de solução aquosa, e os primeiro, segundo e terceiro agentes estão em diferentes gotículas de solução aquosa de o encapsular.

[0192] O terceiro agente pode, por exemplo, ser um agente terapêutico, um agente de diagnóstico, um fármaco para uso em conjunto numa terapia de combinação com o primeiro ou o segundo agente, de um pró- fármaco, um composto ativador para uma pró-fármaco, um composto desativa- dor para um fármaco activa, ou um agente de contraste para a monitorização da biodistribuição do primeiro ou do segundo agente. Em alternativa, os primeiro, segundo e terceiro agentes podem ser compostos de reagentes por reagir em conjunto numa reacção química.

[0193] Tipicamente, os primeiro, segundo e terceiro agentes estão presentes na gotícula encapsulada numa proporção pré- determinada. Como mencionado acima, o fornecimento de vários fármacos encapsulados em diferentes compartimentos de uma única multisoma (incluindo na fase hidrófoba) permitirá um controlo preciso sobre as proporções de dosagem. Isto pode ser vantajoso para a administração de fármacos com mecanismos de acção independentes. Além disso, a sua absorção pelas células, em proporções fixas poderá ser esperado para aumentar a sua eficácia global, e diminuir a probabilidade de desenvolvimento de resistência a qualquer um dos fármacos.

[0194] Alguns exemplos não limitativos de combinações de três ou mais fármacos que podem ser empregues na gotícula encapsulada da invenção (por exemplo, cada um dos fármacos em um compartimento separado) incluem os seguintes: as terapias do câncer ABVD (doxorrubicina, bleo- micina, vinblastina e dacarbazina) para Hodgkin, CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona) para o linfoma não-Hodgkin, e CMF (Ciclofosfamida, metotrexato e 5-fluorouraciI) para câncer de mama.

[0195] Também é razoável esperar que multisomas pode ser utilizado para encapsular substâncias que não são atualmente fornecidos em combinação. A combinação ideal de compostos que consistem em compostos originais que são estáveis em separado, e após libertação desencadeada a partir da multisoma, reagem para formar um composto ativo, instável. A instabilidade do composto ativo iria garantir que áreas distantes da região desencadeada não são afetadas.

[0196] As estabilidades de uma ou mais das camadas duplas na gotícula encapsulada da invenção podem em algumas formas de reali zação ser sensível a um estímulo, por exemplo, um estímulo externo, de tal modo que quando a camada dupla em questão é exposta a estímulos que pode libertar o seu conteúdo dentro o ambiente circundante. A camada dupla que é sensível ao estímulo pode ser formada uma camada dupla de uma interface entre uma gota de solução aquosa e a camada periférica, ou seja, uma "camada dupla externa". Nesse caso, a exposição a gotícula encapsulada para o estímulo em questão pode causar a camada dupla externo para vazar ou romper e os conteúdos da gotícula de solução aquosa pode ser libertado a partir da gotícula encapsulada. Alternativamente, a camada dupla que é sensível ao estímulo pode ser uma camada dupla, que é formado na interface entre duas gotas aquosas no encapsulado, ou seja, uma "camada dupla interna". Nesse caso, a exposição da camada dupla ao estímulo pode causar a camada dupla interna para vazar ou romper, permitindo que os conteúdos das duas gotas aquosas para combinar.

[0197] As duplas camadas externas de duas ou mais gota dentro da mesma gotícula encapsulada podem, por exemplo, ser sensível ao mesmo estímulo e as gotas podem, portanto, ser capazes de libertar os seus conteúdos em simultâneo após a exposição a esse estímulo. Em outras formas de realização, as camadas duplas externas de duas ou mais gota dentro da mesma gotícula encapsulada podem ter diferentes estabilidades, e as gotas podem, portanto, ser capaz de libertar o seu conteúdo para o meio ambiente em momentos diferentes, em resposta a estímulos differen, ou, por exemplo, em resposta aos diferentes níveis ou grandezas de mesmo estímulo. Por exemplo, uma primeira gota de gotícula encapsulada pode ser capaz de libertar os seus conteúdos em reponse para uma alteração no pH, ao passo que um segundo gota no encapsulado pode ser capaz de libertar os seus conteúdos em reponse a uma mudança na temperatura. Alternativamente, duas ou mais gota dentro da mesma gotícula encapsulada podem libertar os seus conteúdos em resposta a diferentes níveis de um mesmo estímulo. Assim, por exemplo, uma primeira gota pode ser capaz de libertar os seus conteúdos em reponse a uma variação relativamente pequena do pH ou da temperatura, enquanto um segundo gota apenas pode libertar o seu conteúdo em reponse a uma alteração no pH ou na maior temperatura. Adicionalmente ou alternativamente, uma ou mais das camadas duplas internas no encapsulado pode ser sensível a um estímulo de tal modo que o conteúdo de duas ou mais gotículas de solução aquosa dentro do encapsulado podem ser combinados.

[0198] Assim, em algumas formas de realização, múltiplas gotas na mesma gotícula encapsulada são capazes de libertar o seu conteúdo para o ambiente ao mesmo tempo, por exemplo, após a exposição a um estímulo externo, tal como uma alteração no pH ou na temperatura. Os conteúdos aqui referidos podem ser primeiros, segundo e / ou terceiros agentes como definidos acima, ou qualquer outro composto ou composição para entrega a partir de dentro da gotícula encapsulada.

[0199] Por conseguinte, em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção aqui descrito, no qual o encapsulamento gotícula compreende uma camada dupla de uma das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas, a estabilidade da referida camada dupla pode ser sensível a um estímulo. O estímulo é tipicamente um estímulo externo.

[0200] Além disso, em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção que são aqui descritos, em que o encapsulamento de gota é composto por uma pluralidade de camadas duplas de moléculas anfipáticas referidas não poliméricas, as estabilidades de uma ou mais das referidas camadas duplas podem ser sensíveis a um estímulo, em algumas formas de realização, a estabilidade de pelo menos uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. O estímulo é tipicamente um estímulo externo. Em outras concretizações, a estabilidade de mais do que uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. Em outras formas de realização, as estabilidades de todas e cada uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. Os estímulos a que são sensíveis as camadas duplas podem ser iguais ou diferentes.

[0201] Em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção aqui descrita, em que parte da camada externa de uma solução aquosa de gotas de contactos da camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas na interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica (ou seja, uma "camada dupla externo"), a estabilidade do referido camada dupla pode ser sensível a um estímulo. O estímulo é tipicamente um estímulo externo.

[0202] Além disso, em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção aqui descrito, no qual o encapsulamento gotícula compreende uma pluralidade de gotículas de solução aquosa no interior da camada periférica, caracterizado por a camada externa de mais do que uma das referidas gotículas de solução aquosa contata a camada periférica de modo a formar uma pluralidade de camadas duplas externos, a estabilidade de uma ou mais das referidas camadas duplas podem ser sensíveis a um estímulo. O estímulo é tipicamente um estímulo externo. Em algumas concretizações, a estabilidade de pelo menos uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. Em outras concretizações, a estabilidade de mais do que uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. Em outras formas de realização, as estabilidades de todas e cada uma das referidas camadas duplas é sensível a um estímulo. Os estímulos a que as camadas duplas externas são sensíveis podem ser iguais ou diferentes.

[0203] Em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção aqui descrito, no qual o encapsulamento gotícula compreende uma pluralidade de gotículas de solução aquosa dentro da camada periférica, caracterizado por parte da camada externa de uma primeira das ditas aquosa gotas contactos parte da camada externa de uma segunda as referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas numa interface entre entre os referidos primeiro e segundo gotículas de solução aquosa (um "camada dupla interna"), a estabilidade do referido camada dupla pode ou não ser sensível a um estímulo. Em algu- mas concretizações, a estabilidade da referida camada dupla interna é sensível a um estímulo externo.

[0204] Além disso, em formas de realização da gotícula encapsulada da invenção aqui descrito, no qual o encapsulamento gotícula compreende uma pluralidade das referidas camadas duplas de moléculas anfi-páticas internas não poliméricas, a estabilidade de uma ou mais das referidas camadas duplas podem ser sensíveis a um estímulo. O estímulo pode ser um estímulo externo. Em algumas concretizações, a estabilidade de pelo menos uma das referidas camadas duplas internas é sensível a um estímulo. Em outras formas de realização, as estabilidades de todas e cada uma das referidas camadas duplas internas é sensível a um estímulo. Os estímulos a que as camadas duplas internas são sensíveis podem ser iguais ou diferentes.

[0205] Tipicamente, nestas formas de realização, a gotícula encapsulada da invenção é um que compreende adicionalmente um agente de entrega, tal como um agente terapêutico, pró-fármaco, um agente de diagnóstico, ou agente de contraste, tal como descrito acima. Alternativamente, ele pode ser um que compreende dois ou mais de tais agentes para a entrega. Os dois ou mais agentes podem ser em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima, ou na mesma peça. Por exemplo, a gotícula encapsulada da invenção pode ser um que compreende um primeiro agente e um segundo agente, em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima, ou um que compreende primeiro, segundo e terceiro agentes em partes separadas do encapsulado, como definido acima.

[0206] Como mencionado acima, o estímulo pode ser uma alteração de pH (tal como um aumento ou diminuição do pH), uma mudança na temperatura (por exemplo, o aquecimento ou arrefecimento), mas qualquer outro estímulo adequado pode ser utilizado. Outros estímulos adequados que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados aos ultra-sons; um stiumu- lus mecânica; fluxo de cisalhamento; uma concentração crítica de uma espécie (por exemplo, de uma concentração crítica de catiões bivalentes); um campo magnético; um campo elétrico; e radiação electromagnética (luz), incluindo mas não se limitando a, UV, raios-X e raios gama de infravermelhos.Adicionalmente ou alternativamente, as estabilidades das camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas podem ser controladas através da inclusão de uma molécula em uma ou mais das camadas duplas, tal como um lipídio ou proteína, que reconhece uma espécie de superfície sobre uma célula-alvo. As espécies de superfície podem por si só ser uma proteína. A resposta a este reconhecimento pode ser a desestabilização imediata da camada dupla, ou pode ser indireta. Deste modo, numa forma de realização, as moléculas anfipáticas não poliméricas da referida camada dupla ou camadas duplas compreendem uma molécula que reconhece uma espécie de superfície numa célula alvo, em que a resposta para o reconhecimento compreende desestabilização da camada dupla ou camadas duplas. A resposta pode incluir a desestabilização imediata da camada dupla, ou pode compreender indireta desestabilização da camada dupla. A molécula pode ser, por exemplo, um lipídio ou uma proteína.

[0207] Normalmente, no entanto, o estímulo externo é uma alteração do pH ou uma mudança na temperatura.

[0208] Numa forma de realização, o estímulo externo é uma mudança no pH. A alteração no pH a que a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não-poliméricas são sensíveis pode haver uma diminuição no pH acima de 7,5 e inferior a 7,5, ou, por exemplo, uma diminuição do pH de acima de 7,0 para abaixo de 7,0, ou, por exemplo, uma diminuição no pH acima de 7,0 e inferior a 6,5. Mais tipicamente, a referida alteração de pH é uma diminuição no pH acima de 7,0 e inferior a 6,0, ou, por exemplo, uma diminuição do pH de acima de 7,0 para abaixo de 5,5. Numa outra forma de realização, a referida alteração de pH é uma diminuição no pH acima de 7,5 até abaixo de 7,0, ou, por exemplo, uma diminuição do pH de acima de 7,5 e inferior a 6,5, ou, por exemplo, uma diminuição do pH de acima de 7,5 para abaixo de 6,0, ou para exemplo, uma diminuição do pH de acima de 7,5 para abaixo de 5,5. Assim, em algumas concretizações, as moléculas anfipáticas não poliméricas da referida camada dupla ou camadas duplas são selecionadas de modo a que a camada dupla ou camadas duplas romper ou vazar, sobre a dita mudança de pH. Por "ruptura" aqui significa ruptura irreversível, de modo que todo o conteúdo da gotícula encapsulada é liberado no meio ambiente. O termo "fuga" no presente contexto significa que alguns dos conteúdos são libertados a partir da gotícula encapsulada, por exemplo, quando a estrutura de camada dupla ou camadas duplas de a gotícula encapsulada tornam-se menos estável e, por conseguinte, a perda do seu conteúdo, mas a estrutura geral da gotícula encapsular permanece mais ou menos intacta.

[0209] Em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, a referida camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas são capazes de ruptura ou vazamento após a exposição a um pH inferior a 7,5. Numa outra forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, a referida camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas são capazes de ruptura ou vazamento após a exposição a um pH ácido, isto é, um pH inferior a 7,0. Tipicamente, neste modo de realização, o referido pH ácida é um pH de 6,5 ou abaixo. Mais tipicamente, o referido pH ácida é um pH de 6,0 ou inferior, ou, por exemplo, um pH de 5,5 ou abaixo. Isto pode ser conseguido através do emprego de um lipídio sensível ao pH em camada dupla ou camadas duplas em questão. O lipídio sensível ao pH pode ser por exemplo um ácido graxo tendo um pK alfa, quando incorporado na camada dupla no ou em torno do pH no qual é desejado que a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas devem tornar- se instável. A valores de pH que são maiores do que o pK alfa do ácido graxo, o ácido graxo será desprotonado e, portanto, fortemente anfipática, e, portanto, será apropriado para a estabilização de uma camada dupla interna ou externa de um muMsome. A valores de pH que são mais baixos do que o pJ5T como, por outro lado, o ácido graxo será protonado e menos anfipática, desestabilizando assim qualquer camada dupla em que está presente. Como o técnico no assunto irá apreciar, o k alfa de um ácido graxo em uma camada dupla é desloca- do em relação ao pK a de que o ácido graxo livre em solução aquosa. Assim, cada um pK um aqui referido é o k alfa do ácido graxo, quando presente numa camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada. O perito na arte pode facilmente avaliar o pK a de um ácido graxo em uma camada dupla utilizando métodos que são conhecidos na arte, por exemplo utilizando métodos espectroscópicos conhecidos, em particular, os métodos conhecidos que utilizam a espectroscopia de RMN.

[0210] Assim, em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, as moléculas anfipáticas não-poliméricas de camada dupla ou camadas duplas compreendem um lipídio sensível ao pH.

[0211] Tipicamente, o lipídio sensível ao pH é um ácido fatly. Numa concretização, o lipídio sensível ao pH é um ácido graxo tendo um pKa igual ou menor do que cerca de 8,5.

[0212] Numa outra forma de realização, o lipídio sensível ao pH é um ácido graxo tendo um pK alfa igual a ou inferior a cerca de 8,0. Em ainda outra forma de realização, o lipídio sensível ao pH é um ácido graxo tendo um k alfa igual a ou inferior a cerca de 7,5.

[0213] O lipídio sensível ao pH pode ser por exemplo um ácido graxo tendo um pK & compreendido entre 6 e 8, por exemplo um ácido graxo tendo um kafa de cerca de 7,5. Os ácidos graxos apropriados incluem o ácido oleico, que se tem uma pK alfa de cerca de 7,5, quando está presente em uma camada dupla.

[0214] Em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, as moléculas anfipáticas não-poliméricas de camada dupla ou camadas duplas compreendem um lipídio sensível ao pH, tal como definido acima, e um lipídio adicional, que não é sensível ao pH. Tipicamente, o lipídio adicional que não é sensível ao pH é um lipídio que favorece um estado de não-bi camada, mas que forma uma camada dupla estável em combinação com o lipídio sensível ao pH, a um pH neutro. Tipicamente, o lipídio adicional que não é sensível ao pH é um fosfolipídio. Mais tipicamente, é um glicerofos- folipídios. Um glicerofosfolipídios adequado para utilização neste contexto seria 1,2-dioleoil ~ 5 sn-gIicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). Assim, em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, as moléculas anfipáticas não-poliméricas de camada dupla ou camadas duplas compreendem um lipídio sensível ao pH, tal como definido acima, e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE). Assim, por exemplo, as moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada da invenção podem compreender uma mistura de DOPE e ácido oleico. Em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, as moléculas anfipáticas não-poliméricas de camada dupla ou camadas duplas compreendem DOPE e ácido oleico em uma relação molar de 1: 1 a 3: 1, de preferência numa relação molar de cerca de 2: 1.

[0215] Numa outra forma de realização, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada da invenção são sensíveis à temperatura. Assim, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas podem, em algumas formas de realização ser capaz de romper ou vazamento após exposição a uma temperatura elevada ou por exposição a uma temperatura reduzida. Numa forma de realização, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas são capazes de ruptura ou vazamento após exposição a uma temperatura elevada. De modo a ser útil para a entrega in vivo de fármacos a temperatura elevada é tipicamente à volta ou acima da temperatura do corpo, ou seja, em torno de ou acima de 37 ° C. Assim, em uma forma de realização da gotícula encapsulada da invenção, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas são capazes de ruptura ou vazamento após exposição a uma temperatura igual ou superior a cerca de 37 ° C. Numa outra forma de realização, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas são capazes de ruptura ou vazamento após exposição a uma temperatura igual ou superior a cerca de 40 ° C, ou, por exemplo, igual ou superior a cerca de 42 ° C. Tais concretizações são úteis em conjunção com hipertermia ligeira local de até 42 ° C, produzindo uma melhoria correspondente local de libertação da fármaco a partir de multisomas in vivo.

[0216] Tipicamente, nestas formas de realização, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem um lipídio sensível à temperatura. Alternativamente, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas podem compreender um lipídio sensível à temperatura, e um lipídio adicional. Tipicamente, o lipídio sensível à temperatura é um fosfolipídio, mais tipicamente um glicerofos- folipídios. Quanto mais lipídios é geralmente um fosfolipídio.

[0217] Tipicamente, o lipídio sensível à temperatura é um lipídio que possui uma temperatura de transição de fusão Tm ou em torno da temperatura de interesse em que é desi ed que as camadas de moléculas anfipáticas não poliméricas devem tornar-se instável. Lipossomas feitos com tais lipídios são conhecidas por terem um máximo local em torno de permeabilidade Tm, atribuível aos limites entre as fases sólidas e fluidas de camada dupla li- possomal. Dito isto, a temperatura de ruptura do encapsulamento gotícula pode ser consideravelmente diferente, geralmente inferior, à temperatura de transição do lipídio sensível à temperatura. Este é geralmente o caso, se um outro lipídio está presente, como a presença de mais um lipídio pode ter o efeito de alargar a transição de fusão do lipídio sensível à temperatura, e / ou para diminuir a temperatura de transição de pico do lipídio sensível à temperatura.

[0218] Em segundo lugar, a extensão da libertação do conteúdo de lipossomas sensíveis à temperatura tem sido demonstrada que o aumento com o seu tamanho, assim, para uma dada de lipídio sensível à temperatura, a temperatura de ruptura do encapsulamento gotícula da invenção pode diminuir à medida que o tamanho da gotícula encapsulada aumenta.

[0219] Assim, tipicamente, o lipídio sensível à temperatura empregue na camada dupla ou camadas duplas gotas encapsuladas da invenção é um lipídio que possui uma temperatura de transição de fusão, Tm, o que é igual a ou maior do que a temperatura de interesse em que é desejado que as camadas de moléculas anfipáticas não poliméricas devem tornar-se instável.

[0220] Por conseguinte, o lipídio sensível à temperatura pode ser um lipídio possuindo uma temperatura de transição de fusão, Tm, que é igual ou superior a cerca de 37 ° C. Mais tipicamente, é um lipídio possuindo uma temperatura de transição de fusão, Tm, que é igual ou superior a cerca de 40 ° C. Assim, ele pode ser um lipídio possuindo uma temperatura de transição de fusão, Tm, a partir de 37 ° C a 90 ° C, ou, por exemplo, a partir de 40 ° C a 70 ° C. Numa concretização, o lipídio sensível à temperatura é um lipídio que possui uma temperatura de transição de fusão, Tm, compreendida entre 40 ° C a 60 ° C.

[0221] Tipicamente, o lipídio sensível à temperatura é um glicerofosfolipídios, ele pode ser por exemplo 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC) ou 1,2-dipaImitoyl-OT-glicero-3-fosfocolina (DPPC). Se um outro lipídio está presente em combinação com o lipídio sensível à temperatura, que é tipicamente um glicerofosfolipídios, por exemplo, um glicerofosfolipídios de fórmula (I) aqui definidos. Quanto mais lipídios podem ser por exemplo 1,2-diphytanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC).

[0222] Assim, numa forma de realização, a camada dupla ou camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas na gotícula encapsulada da invenção compreendem 1,2-diestearoil-. S?-Glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-diphytanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC). Tipicamente, neste modo de realização, as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem 1,2 - distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-diphytanoyl-> src-glicero- 3-fosfocolina (DPhPC) numa proporção molar de 1: 1 a 5: 1, de preferência numa relação molar de cerca de 3: 1 Em uma outra forma de realização, as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem 1,2 - dipalmitoil-sw- glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-diphytanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC).

[0223] As gotas encapsuladas da invenção são estáveis em ambientes aquosos e outros hidrofílicos.

[0224] Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição que compreende: (a) uma gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido, e (b) um veículo hidrofílico.

[0225] Tipicamente, a composição inclui uma pluralidade de gota encapsulados da invenção, tal como aqui definido e o veículo hidrofílico.

[0226] O veículo hidrofílico pode ser qualquer meio hidrofílico adequado. Tipicamente, é aquoso. Assim, o veículo hidrofílico tipicamente compreende água. O veículo hidrofílico pode ser por exemplo água pura ou uma solução aquosa. Tipicamente, é uma solução aquosa de tampão. Outros materiais hidrofílicos que a água pode, contudo, ser empregue, por exemplo, líquidos iônicos hidrofílicos. Deste modo, numa forma de realização do transportador hidrofílico compreende um líquido iônico. Para certas aplicações, o veículo hidrofílico é desejavelmente farmaceuticamente aceitável.

[0227] Assim, a invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende: (a) uma gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido, e (b) um veículo hidrofílico farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, neste aspecto da invenção, a gotícula encapsulada da invenção é um que compreende adicionalmente um agente para entrega in vivo, tais como um agente terapêutico, pró-fármaco, um agente de diagnóstico, ou agente de contraste, tal como descrito acima. Alternativamente, ele pode ser um que compreende dois ou mais agentes em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima. Por exemplo, a gotícula encapsulada da invenção pode ser um que compreende um primeiro agente e um segundo agente, em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima, ou um que compreende primeiro, segundo e terceiro agentes em partes separadas do encapsulado, como definido acima.

[0228] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido, ou uma composição da invenção tal como aqui definida, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Tipicamente, neste aspecto, a gotícula encapsulada da invenção, ou o ou cada gotícula encapsulada na composição, é uma gotícula encapsulada da invenção, como acima definido, que compreende ainda um agente terapêutico ou de pró-fármaco. Ele pode por exemplo ser um que compreende dois ou mais agentes em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima. Por exemplo, a gotícula encapsulada da invenção pode ser um que compreende um primeiro agente e um segundo agente, em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima, ou um que compreende primeiro, segundo e terceiro agentes em partes separadas do encapsulado, como definido acima.

[0229] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido, ou uma composição da invenção tal como aqui definido, para uso no método de anúncio iagnostic praticado no corpo humano ou animal. Tipicamente, neste aspecto, a gotícula encapsulada da invenção, ou o ou cada gotícula encapsulada na composição, é uma gotícula encapsulada da invenção, como acima definido, que compreende ainda um agente de diagnóstico ou um agente de contraste. Ele pode por exemplo ser um que compreende dois ou mais agentes em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima. Por exemplo, a gotícula encapsulada da invenção pode ser um que compreende um primeiro agente e um segundo agente, em partes separadas do encapsulado, tal como definido acima, ou um que compreende primeiro, segundo e terceiro agentes em partes separadas do encapsulado, como definido acima.

[0230] Outras aplicações de multisomas variam de proporcionar uma nova plataforma para o estudo fundamental de proteínas de membrana, de atuar como chassis protocellular multicompartimentos para a biologia sintética "de baixo para cima". Em particular, a gota de encapsula da invenção pode ser utilizado para preparar protocéculas ou agregados de proto- céculas (prototecido).

[0231] Assim, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido, ou uma composição da invenção tal como aqui definido, em biologia sintética.

[0232] Ainda proporcionado o uso de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido, ou uma composição da invenção, como aqui definida, num método de preparação de um protocélula.

[0233] Ainda proporcionado o uso de um encapsulamento das gotas da invenção, tal como aqui definido, ou uma composição da invenção, como aqui definida, num método de preparação de prototecido.

[0234] Um protocélula pode ser preparado por remoção ou redução da quantidade do meio hidrofóbico de uma gotícula encapsulada da invenção, por exemplo, uma gotícula encapsulada contendo apenas uma das gotas no interior da camada periférica. O meio hidrofóbico pode ser removido a partir de em torno da gotícula de solução aquosa, permitindo que ela se evapore e / ou através da remoção mecanicamente, por exemplo com uma micropi- peta. À medida que mais e mais do meio hidrofóbico é removida, a camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas se move para mais perto e mais perto da camada externa da gotícula de solução aquosa, e, eventualmente, forma uma camada de bi com as moléculas anfipáticas não poliméricas da externa camada de gotícula de solução aquosa. Remoção de óleo não é necessária por duas monocamadas a aderir para formar uma camada dupla. No entanto, a remoção do óleo resultará em ainda mais a adesão de monocamadas em uma camada dupla. Assim, a remoção ou a redução da quantidade de meio hidrofóbico pode causar uma camada dupla de ser formada em torno da superfície da gotícula de solução aquosa, para produzir uma estrutura celular do tipo que se pode ser utilizado como um protocélula ou pode ser usado para produzir uma protocélula. A remoção de todo o óleo causará uma camada dupla de ser completamente formado em torno da superfície da gotícula de solu- ção aquosa. As formas de camada dupla rapidamente após a remoção ou a redução da quantidade de meio hidrofóbico, porque, na ausência de uma determinada quantidade de intervir meio hidrófobo da camada dupla tem uma energia livre mais baixa do que duas monocamadas e, portanto, tem uma energia livre negativa de formação; por conseguinte, é um evento espontâneo. A camada dupla pode também ser formado sem necessidade de remover ou reduzir a quantidade do meio hidrofóbico; como se referiu antes, a formação de camada dupla simplesmente requer que as duas superfícies revestidas com monocamada aproximam um do outro, o que pode ocorrer espontaneamente, se a gotícula de solução aquosa não é de flutuação neutra na gota de óleo; a remoção de óleo no entanto causará monocamadas de aderir a uma bicamada adicional.

[0235] Prototecido pode ser produzido por um método análogo começando com um encapsulamento de gota da invenção, que compreende uma cadeia ou uma rede de gotículas de solução aquosa. Nesse caso, as gotas aquosas já camadas duplas formado entre eles; No entanto, as partes das camadas externas da cadeia ou rede ainda estará na forma de monocamada, exposta ao meio hidrofóbico na multisoma. A redução ou a remoção do meio hidrofóbico de cerca de cadeia ou uma rede irá causar a monocamada periférica para se aproximar e mais perto das superfícies externas em monocamada de gotículas de solução aquosa na cadeia ou rede, e, eventualmente, a monocamada periférica irá combinar-se com as monocamadas externas do gotículas de solução aquosa para formar uma camada dupla. Assim, eliminando ou reduzindo a quantidade de meio hidrofóbico pode causar uma camada dupla de ser formada em torno da superfície da cadeia ou rede, para produzir uma rede de estruturas semelhantes a células que podem ser usadas como base para a produção de prototecido. Remover todo o óleo causará uma ca-mada dupla de ser completamente formado em torno da superfície da cadeia ou de rede. Como observado acima, a camada dupla pode também ser formado sem necessidade de remover ou reduzir a quantidade de meio hidrofóbico, mas a remoção de óleo pode induzir monocamadas de aderir a uma bicamada adicional.

[0236] Por conseguinte, a invenção proporciona ainda um método de preparação de uma protocélula, compreendendo o método: o forne-cimento de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como definido acima, e permitindo que a camada externa da gotícula de solução aquosa a entrar em contato com a referida camada periférica de anfipático não poliméri- co moléculas, ou levando a camada externa da gotícula de solução aquosa em contato com a referida camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, e desse modo formando uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície da gotícula de solução aquosa.

[0237] Como mencionado acima, a formação de camada dupla pode ser auxiliada por remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico da gotícula encapsulada da invenção. Assim, em algumas formas de realização, o método de preparação de um protocélula compreende: remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico a partir de uma gotícula de encapsular da invenção, tal como definido acima, de modo que a referida camada periférica de não-poliméricas moléculas anfipáticas varas para a camada externa de a referida gotícula de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície da gotícula de solução aquosa.

[0238] Tipicamente, no método da invenção para a preparação de um protocélula, a gotícula encapsulada da invenção é aquela que contém uma única gota de solução aquosa.

[0239] A invenção proporciona ainda um protocélula que é obtenível pelo método da invenção, como acima definido para a preparação de um protocélula.

[0240] Ainda se proporciona uma protocélula compreendendo uma encapsulada gotícula da invenção, tal como aqui definido, em que a referida camada periférica de não-poliméricas moléculas anfipáticas contata a camada externa das referidas gotas e, assim, forma uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de parte da aquoso Gota. Tipicamente, a gotícula encapsulada da invenção é aquela que contém uma única gota de solução aquosa.

[0241] A gota de solução aquosa a encapsular nas gotas da invenção pode separar da gota de óleo, quando o fluxo de cisalhamento é aplicado externamente (por exemplo, para a fase aquosa externa), para produzir uma gota de óleo e uma vesícula unilamelar gigante separado. O maio vesícula por exemplo, ser usado como um protocélulas.

[0242] Assim, a invenção proporciona ainda um método de preparação de uma vesícula, o método compreende a aplicação do fluxo de cisalhamento para uma gotícula encapsulada da invenção.

[0243] Ainda se proporciona um método de preparação de uma protocélula, método esse que compreende a aplicação de um fluxo de cisalhamento para gotícula encapsulada da invenção.

[0244] A invenção proporciona ainda um protocélula que é obtenível pelo método da invenção, como acima definido para a preparação de um protocélula.

[0245] A invenção proporciona ainda um método de preparação de um prototecido, método esse que compreende: proporcionar um gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido, que compreende uma pluralidade de referidas gotículas de solução aquosa, e permitindo que as camadas externas das gotas aquosas para entrar em contato com o periférico camada de moléculas anfipáticas não-poliméricas ou trazendo as camadas externas das gotículas de solução aquosa em contato com a camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas, e desse modo formando uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos uma parte da superfície da pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0246] Como mencionado acima, a formação de camada dupla pode ser auxiliada por remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico da gotícula encapsulada da invenção. Assim, numa forma de realização, o método de preparação de um prototecido compreende: remoção de parte ou da totalidade do meio hidrofóbico a partir de uma gotícula de encapsular a invenção como acima definido, que compreende uma pluralidade das referidas gotículas de solução aquosa, de modo a que a camada periférica de não poli- mérico moléculas anfipáticas varas para as camadas externas das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície de uma pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0247] Tipicamente, no método da invenção para a preparação de um prototecido, a gotícula encapsulada da invenção é uma que compreende duas ou mais gotículas de solução aquosa, ou, por exemplo, mais do que duas gotas aquosas, as quais estão em contato um com o outro numa cadeia ou rede, em que uma parte da camada externa de cada gotícula na corrente ou contactos de rede uma parte da camada externa de uma outra gotícula na corrente ou de rede, formando assim camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas nas interfaces entre as gota da cadeia ou rede.

[0248] Ainda se proporciona um prototecido que é obtenível pelo método da invenção acima definido para a preparação de um prototecido.

[0249] A invenção também fornece um prototecido com-preendendo um gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, que encapsulam gotícula compreende uma pluralidade de referidas gotículas de solução aquosa, em que a camada periférica de não-poliméricas moléculas anfipáticas contata as camadas externas das referidas gotículas de solução aquosa, formando assim um camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno de pelo menos parte da superfície de uma pluralidade de gotículas de solução aquosa.

[0250] A invenção também fornece um prototecido com-preendendo uma pluralidade de protocéculas da invenção, tal como definido acima.

[0251] Usando as proteínas da membrana e várias gotas de ligados por camadas duplas, multisomas pode sentir o seu ambiente, a informação de processo e de forma contingente entregar materiais para o ambiente, tal como ilustrado na figura 1a a seguir. Por conseguinte, a invenção proporciona ainda a utilização de um encapsulamento das gotas da invenção, tal como aqui definido para o tráfico de uma molécula entre gota no encapsulado e / ou para o fornecimento de uma molécula de uma gotícula no encapsulado para o meio ambiente externo. De modo mais geral, a invenção proporciona ainda o uso de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido para a troca de materiais entre as gotas encapsuladas e o meio ambiente.

[0252] Multisomas também pode ser utilizado como plataforma para o estudo fundamental de proteínas de membrana: os encapsulados de gota da invenção representam uma forma simples de fazer uma camada dupla lipídica curvo, com várias formas de controlar a curvatura da camada dupla. Além disso, eles permitem que duas camadas duplas lipídicas para ser colocado em aposição próxima, através de praticamente todos os meios de micro-e nano-manipulação, facilitar uma ampla gama de experiências. Estas experiências incluem investigação e / ou rastreio de proteínas da membrana, de investigação e / ou rastreio de analitos que interagem com as proteínas da membrana, e de investigação e / ou rastreio de camadas duplas curvadas na gotícula encapsulada. Encapsula fato de gota da invenção podem ser usadas para estudar quaisquer fenômenos de camada dupla, em geral, envolve tipicamente um processo que ocorre na ou através da camada dupla.

[0253] Por conseguinte, a invenção proporciona ainda a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido num método para investigar e / ou rastreio de uma membrana de proteí- na. A gota de encapsula da invenção é especialmente útil para o estudo de pro-teínas de membrana que se estendem duas camadas duplas estreitamente apostos, como é explicado mais abaixo. Assim, numa forma de realização da membrana de proteína é um que se estende por duas camadas duplas.

[0254] Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido num método para investigar e / ou rastreio de uma substância a analisar que interage com uma membrana de proteína.

[0255] Em outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um encapsulamento das gotículas da invenção, tal como aqui definido num método para investigar e / ou rastreio de uma camada de moléculas anfipáticas bi não poliméricas.

[0256] A gota de encapsula da invenção também pode ser usada para estudar as propriedades da membrana de proteína inserido numa camada dupla aí. Por exemplo, a dependência da voltagem das propriedades da membrana de proteína pode ser determinada. As técnicas para estudar as proteínas de membrana em camadas duplas lipídicas são bem conhecidos na arte. A função de um canal ou de poro pode ser determinado por medição, por exemplo, uma corrente iônica que flui através da camada dupla lipídica, por meio de uma membrana de proteína. A função de um transportador pode ser determinada através da medição da quantidade de uma molécula translocado através da camada dupla lipídica, por exemplo por espectrometria de massa ou ELISA, ou através da utilização de um substrato que é marcado por fluorescência ou radioatividade.

[0257] Como mencionado acima, as gotas de encapsula da invenção são especialmente úteis para o estudo de proteínas de membrana que se estendem duas camadas duplas. Por exemplo, encapsulados gota da invenção podem ser usadas para estudar os complexos de proteínas formadoras de poros que se estendem duas camadas duplas lipídicas, tais como as junções de hiato e poros nucleares, o nível de molécula única posicionando dois multisomas com gota individuais internas de tal modo que as suas camadas duplas são opostas.

[0258] Deste modo, noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um primeiro gotícula encapsulada da invenção como acima definido e um segundo gotícula encapsulada da invenção, tal como definido acima, para investigar e / ou rastreio de um complexo de membrana de proteína, que se estende por duas das referidas camadas duplas moléculas anfipáticas não poliméricas, em que em cada um dos referidos primeiro e segundo encapsula gota, uma gotícula de solução aquosa referida situa-se na borda da gota, na qual parte da camada externa dos contactos de gotículas de solução aquosa referida camada periférica, formando assim uma camada dupla de moléculas anfipáticas dito não poliméricas numa interface entre a das gota e a camada periférica, em que o referido primeiro e segundo encapsula gota são posicionados de tal modo que a camada dupla da primeira gotícula encapsulada e a camada dupla da segunda gotícula encapsulada são aposto, e em que a membrana de proteína vãos referidas duas camadas duplas apostos.

[0259] Redes de gotículas de solução aquosa unidas por camadas duplas de interface de gota podem ser construídos para explorar uma variedade de bombas de membrana, os canais e poros para agir como sensores de luz, as baterias, e dispositivos elétricos. Isto está descrito em Holden, MA et al., J. Am. Chem. Chem. Soe. 129, 8650-8655 (2007), e Maglia, G. et al Nat. Nanotechnol. 4, 437-440 (2009), que se referem à construção de tais redes de gota de uma fase de óleo a granel. Tais redes de gota também pode ser construído dentro de multisomas, utilizando os métodos aqui descritos, para proporcionar gota encapsulados da invenção, que funcionam como sensores, baterias ou dispositivos elétricos.

[0260] Por conseguinte, a invenção proporciona ainda o uso de gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido como um sensor, bateria, ou dispositivo elétrico. Além disso é proporcionado um sensor, um batteiy, ou um dispositivo elétrico, que compreende uma gotícula encapsulada da invenção, tal como aqui definido.

[0261] Multisomas que comunicam uns com os outros através de uma fase de massa hidrofílico (tipicamente aquosa) contendo os multisomas também estão previstas, em que uma primeira multisoma "transmite" um sinal através da libertação de espécies na solução a granel, quer por difusão através de poros nas camadas duplas externas, ou por pH ou rotura induzida pela temperatura, e, em seguida, uma segunda multisoma "recebe" o sinal. A segunda multisoma pode receber o sinal, quer por difusão das espécies para as gotículas de solução aquosa da segunda multisoma através de poros nas camadas duplas externas, ou pela utilização de mais espécies na monocamada lipídica externa do segundo multisomas que é sensível à sinal.

[0262] Multisomas que comunicam com os materiais biológicos químico externo e estão também previstas, incluindo, por exemplo multisomas que comunicam com as células biológicas, tecidos ou organismos. Numa forma de realização, por exemplo, a gotícula encapsulada da invenção é capaz de se comunicar com uma terminação nervosa, soltando um neurotransmissor que a terminação nervosa é capaz de detectar. O neuro- transmissor pode ser libertado, quer por difusão através de poros nas camadas duplas externas da multisomas, ou por pH ou rotura induzida pela temperatura. Uma vez libertado pelo multisomas. O neurotransmissor é então detectado pela terminação nervosa, e um sinal é assim transmitida a partir da multisomas para o nervo.

[0263] A gota encapsulada da invençãopode ser produzida pelo processo da invenção para a produção de uma gotícula encapsulada, que gotícula encapsulada compreende: - Uma gota de um meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po-liméricas em torno da superfície da gota; e - Uma das gotas no interior da camada periférica, com-preendendo a gotícula de solução aquosa (A) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; processo esse que compreende: a transferência de uma gotícula de solução aquosa, que compreende gotículas de solução aquosa (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas, não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso, numa gota de um meio hidrofóbico, em que a dita uma gota de um meio hidrofóbico tem uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da sua superfície.

[0264] Normalmente, o processo da invenção compreende os passos seguintes: (i) introdução de uma gota de um meio hidrofóbico num veículo hidrofílico, na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo, assim, uma gota de um meio hidrofóbico e uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota; (ii) introdução de uma gotícula de um meio aquoso para um meio hidrofóbico, na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo, assim, uma das gotas dentro do meio hidrofóbico, compreendendo a referida gotícula de solução aquosa: (a) o referido meio aquoso, e (b) uma camada externa das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; em que os passos (i) e (ii) podem ser realizados em qualquer ordem ou simultaneamente; e (iii) transferir a gotícula de solução aquosa produzido no passo (ii) para a gota do meio hidrofóbico produzido no passo (i), produzindo assim a referida gotícula encapsulada.

[0265] O veículo hidrofílico utilizado no passo (i) pode ser qualquer meio hidrofílico adequado. Tipicamente, é aquoso. Assim, o veículo hidrofílico tipicamente compreende água. O veículo hidrofílico pode ser por exemplo água pura ou uma solução aquosa. Tipicamente, é uma solução aquosa de tampão. Outros materiais hidrofílicos que a água pode, contudo, ser empregue, por exemplo, líquidos iônicos hidrofílicos. Deste modo, numa forma de realização do transportador hidrofílico compreende um líquido iônico. Em concretizações preferidas, o veículo hidrofílico é um meio aquoso, por exemplo água ou uma solução tampão aquosa.

[0266] O meio hidrófobo utilizado na etapa (i) pode ser como acima definido para os encapsulados de gota da invenção. A gota de meio hidrofóbico é introduzido no veículo hidrofílico na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas. A gota de meio hidrofóbico é tipicamente introduzida no veículo hidrofílico, utilizando uma pipeta. Normalmente, as moléculas anfipáticas não poliméricas estão presentes no próprio meio hidrofóbico, isto é, elas estão presentes na gota hidrofóbica. Alternativamente, eles podem ser fornecidos no veículo hidrofílico, por exemplo, eles podem ser dissolvidos ou suspensos em vesículas de lipídios, no veículo hidrofílico. As moléculas anfipáticas não poliméricas podem ser como acima definidas para os encapsulados de gota da invenção. De preferência, se as moléculas anfipáticas não poliméricas não estão presentes no meio hidrofóbico, em seguida, eles estão presentes em ambos o meio aquoso da gotícula e no veículo hidrofílico usado no passo (i). Isso melhora a estabilidade do multisoma.

[0267] O diâmetro da gota hidrofóbico pode ser controlado através da formação a gota em um circuito que tem um diâmetro semelhante. Tipicamente, a gota hidrofóbica é formada no lacete dentro do veículo hidrofílico. Assim, o circuito vazio é submerso no primeiro veículo hidrofílico, e a gota de meio hidrofóbico é introduzido no veículo hidrofílico e depois para o circuito. Normalmente, a gota do meio hidrofóbico é pipetada para o veículo hidrofílico e para o circuito.

[0268] Alternativamente, se uma gota hidrofóbico menor for desejada, o diâmetro da gota hidrofóbico pode ser controlada pela utilização de uma micropipeta, ou seja, através da introdução da gota do meio hidrofóbico na portadora hidrofílica a partir de uma micropipeta. O diâmetro da gota hidrofóbico é tipicamente de 500 a 2000 μm μm, mais tipicamente de 500 a 1500 μπi μm, por exemplo cerca de 800 μq. Gotas e gotas de menor diâmetro maiores podem, contudo, ser utilizado. Por conseguinte, o diâmetro da gota hidrofóbico pode ser igual ou inferior a cerca de 2 mm, ou, por exemplo, igual ou inferior a 1 mm.

[0269] A formação da camada periférica de moléculas an-fipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota é simples. Isso é conseguido simplesmente por proporcionar as moléculas anfipáticas não poliméricas no meio hidrofóbico de gota ou no veículo hidrofílico, como descrito acima, após o que a camada pode formar-se naturalmente quando a gota é deixada no veículo hidrofílico durante um período de tempo suficiente. As moléculas anfipáticas não poliméricas formam-se espontaneamente uma camada, tipicamente monomolecular, na interface entre o veículo hidrofílico e hidrófobo a gota, o que torna a camada periférica da gotícula encapsulada da invenção.

[0270] O meio hidrófobo utilizado na etapa (i) pode também compreender qualquer outro agente, tal como qualquer agente, fármaco, pró-fármaco, um agente terapêutico ou de diagnóstico de outros que se deseja incluir no meio hidrofóbico da gotícula encapsulada resultante.

[0271] Passo (ii) refere-se à produção de uma gotícula de solução aquosa, para ser incluído na multisoma, e no passo (ii) uma gotícula de um meio aquoso é introduzido num meio hidrofóbico na presença de moléculas anfipáticas não poliméricas. Claro que, se mais do que uma gota de solução aquosa a ser incluído no multisoma, então mais do que uma gotícula pode ser preparados nesta fase de acordo com o passo (ii), e, em seguida, cada uma das gotas resultantes para o multisoma pode ser transferido para o gota hidrófobo de acordo com o passo (iii).

[0272] O meio hidrófobo utilizado na etapa (ii) é tipicamente o mesmo meio hidrofóbico que é usado para produzir a gota hidrófoba do passo (i), e pode ser de qualquer meio hidrofóbico, como acima definido para os encapsulados de gota da invenção. As moléculas anfipáticas não- poliméricas são geralmente presente no meio hidrofóbico. Em alternativa, no entanto, eles podem estar presentes no meio aquoso da gotícula, por exemplo dissolvido no meio aquoso ou em suspensão como vesículas lipídicas. De preferência, se as moléculas anfipáticas não poliméricas não estão presentes no meio hidrofóbico, em seguida, eles estão presentes em ambos o meio aquoso da gotícula e no veículo hidrofílico usado no passo (i). Isso melhora a estabilidade do multisoma. As moléculas anfipáticas não poliméricas utilizados no passo (ii) pode ser qualquer dos discutidos acima para os encapsulados de gota da invenção. O meio aquoso utilizado no passo (ii) pode ser água pura. Alternativamente, pode ser uma solução aquosa. A solução aquosa pode ser escolhida para o objectivo ou a utilização da gotícula em questão dentro da multisoma. Uma propriedade importante é o pH, e isto pode ser variado ao longo de uma vasta gama. O meio aquoso pode, portanto, ser uma solução tampão aquosa. Qualquer tampão adequado pode ser empregue, dependendo do pH desejado. A solução tampão pode ser, por exemplo, compreender Tris-HCl, com KCl, e EDTA. Se a gota de solução aquosa é para conter um agente, tal como um agente, fármaco, pró-fármaco, o agente de diagnóstico, ativador, de- sativador ou sensor de molécula terapêutica, o agente é tipicamente presente no meio aquoso que é utilizado para formar a gota nesta fase. Da mesma forma, se a gotícula de solução aquosa é comunicar com outros gota no multisoma, ou com o ambiente externo, em seguida, uma membrana de proteína adequado estará tipicamente presente no meio aquoso, nesta fase. A proteína pode ser qualquer uma das proteínas de membrana discutidos anteriormente para as gotas de encapsula da invenção.

[0273] A gota de meio aquoso pode ser introduzida no meio hidrofóbico no passo (ii) utilizando uma micropipeta, por exemplo uma pipeta com uma electroforese em gel de carregamento de ponta. A ponta da micropipeta é normalmente preenchida com o meio aquoso, e, em seguida, imerso no meio hidrofóbico. Apenas o suficiente do meio aquoso pode então ser expelido para expor uma pequena gota pendente, e, em seguida, a gotícula pode ser separada a partir da ponta através de qualquer método conveniente, por exemplo, pressionando a ponta contra a parede de um vaso que contém o meio hidrofóbico. O volume da gotícula de solução aquosa é geralmente igual ou inferior a 80 nl, mas pode por exemplo ser igual ou inferior a 20 nL.

[0274] A formação da camada externa das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso, é muito simples. Isso é conseguido simplesmente por proporcionar as moléculas anfipáticas não poliméricas no meio hidrofóbico, ou em meio aquoso da gotícula, como descrito acima, após o que a camada externa pode formar-se naturalmente quando a gotícula é deixada no um meio hidrófobo por um período suficiente de tempo. As moléculas anfipáticas não poliméricas formam-se espontaneamente uma camada, tipicamente monomolecular, na interface entre as gota e o meio hidrofóbico.

[0275] O passo de transferir a gotícula de solução aquosa na gota de meio hidrofóbico, para produzir a referida gotícula encapsulada da invenção, pode ser realizado por qualquer método adequado; as gotas são robustas e facilmente manipuladas. O passo é normalmente realizado usando uma pipeta. No entanto, um tal passo pode também ser realizado num dispositivo de microfluidos, como parte de um procedimento automatizado (ver abaixo). Se a gotícula é encapsulada para conter mais do que uma gota de solução aquosa, em seguida, mais do que uma gotícula pode ser transferida para a gota hidrófoba desta maneira, quer através da transferência de uma rede de DIB intacta, corrente ou uma pluralidade de gotículas de solução aquosa na gota hidrofóbico, ou pela transferir gotas desconexas que pode, em seguida, formam camadas duplas in situ. Como mencionado acima, as gotas são robustas e facilmente manipuladas.

[0276] Tipicamente o passo (iii) não é realizada até que um período de tempo tenha decorrido suficiente para permitir (a) a formação da camada externa das moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da super fície da gotícula ou gotas de meio aquoso e (b) a formação de a camada periférica das moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota de meio hidrofóbico. Este período de tempo necessário para formar monoca- madas estáveis pode ser referido como o tempo de incubação. O tempo de incubação varia dependendo do meio hidrofóbico utilizado e da concentração das moléculas anfipáticas não poliméricas.

[0277] Numa forma de realização, o passo (iii) não é realizada até que pelo menos 5 minutos, após a conclusão das etapas (i) e (ii). Em outras formas de realização, o passo (iii) não é realizada até que pelo menos 10 minutos após a conclusão das etapas (i) e (ii), ou, por exemplo, até pelo menos, 25 minutos após a conclusão das etapas (i) e (ii). Em experimentos utilizando apenas DPhPC, o tempo de espera foi -10 min; usando a mistura de DOPE / OA, -25 min; usando a mistura de DSPC / DPhPC, -10 min.

[0278] O processo da invenção para a produção de um encapsulamento das gotículas da invenção pode compreender ainda a recuperação da referida gotícula encapsulada do veículo hidrofílico. O encapsulamento de gota pode ser recuperado utilizando qualquer técnica adequada, por exemplo, utilizando uma pipeta para retirar a gotícula encapsulada do veículo hidrofílico.

[0279] O processo pode ainda compreender, em seguida, reintroduzindo a gota recuperado encapsular em um outro veículo hidrofílico. O outro veículo hidrofílico pode por exemplo ser uma composição farmaceutica- mente aceitável, água ou uma solução aquosa, um líquido iônico, ou por exemplo, um material de suporte hidrofílico viscoso ou rígida.

[0280] Alternativamente, o processo da invenção para a produção de um encapsulamento das gotículas da invenção pode ainda com-preender a troca veículo hidrofílico com um outro veículo hidrofílico. Assim, por exemplo, quando o veículo hidrofílico é uma solução aquosa, o processo pode compreender ainda a troca de a referida solução aquosa por diluição em série com uma nova fase aquosa.

[0281] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada que é obtido por um processo da invenção, tal como definido acima para a produção de uma gotícula encapsulada. As gotas encapsuladas da invenção também podem ser produzidas usando técnicas de microfluidos, que podem, por exemplo empregam corte consecutivo ou dispositivos de microfluidos de fluxo de focagem. Tais técnicas são particularmente adequados para a produção de gotas encapsula com pequenos volumes e diâmetros (por exemplo diâmetros de cerca de 100 μin). Microfluidic técnicas são, por conseguinte, desejável para a produção de gotas encapsula para administração in vivo, por exemplo, em aplicações de entrega de fármacos.

[0282] Assim, num outro aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de uma gotícula encapsulada, cujo processo compreende: (i) a introdução de uma gota de meio aquoso a partir de um primeiro canal de um dispositivo de microfluidos, que o primeiro canal contém o referido meio aquoso, em um segundo canal do dispositivo de microfluidos, que segundo canal contém um meio hidrofóbico, em que o meio aquoso, no primeiro canal, ou o meio hi-drofóbico no segundo canal, ou ambos, compreender adicionalmente moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo, assim, no segundo canal de uma gotícula de solução aquosa no meio hidrofóbico, compreendendo a referida gotícula de solução aquosa: (a) o referido meio aquoso e (b) uma camada externa das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso; e (ii) introdução de uma gota do referido meio hidrofóbico a partir do segundo canal, o qual gota de meio hidrofóbico compreende a gota de solução aquosa, em um terceiro canal do dispositivo microfluídico, em que o terceiro canal contém um veículo hidrofílico, em que o meio hidrofóbico no segundo canal, ou o veículo hidrofílico no terceiro canal, ou ambos, compreender adicionalmente moléculas anfipáticas não poliméricas, produzindo-se assim no terceiro canal gotícula en-capsulada no interior do veículo hidrofílico, a gotícula encapsulada compreendendo: - A gota do referido meio hidrofóbico; - Uma camada periférica de moléculas anfipáticas não po-liméricas em torno da superfície da gota; e - A referida gotícula de solução aquosa no interior da referida camada periférica.

[0283] O processo pode, por exemplo, ser um processo de corte consecutivos (Okushima, S. et ai "Langmuir 20, 9905-9908 (2004)) ou de um processo de fluxo de focagem (Chu, LY et al. Angew. Chem. Int. Editar. 46, 8970-8974 (2007);. Seo, M. et al, Soft Matter 3, 986-992 (2007)).

[0284] Numa concretização, o processo é um processo de corte consecutivos. Tipicamente, neste modo de realização, o primeiro canal constitui uma junção substancialmente em forma de T, com o segundo canal e o segundo canal forma uma junção em forma de T, substancialmente com o terceiro canal. Este arranjo estimula a produção de gotículas de solução aquosa na junção entre os primeiro e segundo canais, bem como a produção de gotas de o referido meio hidrofóbico, no final do segundo canal. Tipicamente, os primeiro e segundo canais são feitas de um material hidrofóbico. Isto encoraja o meio aquoso destes canais para formar gotas e permanecer em forma de gota. Tipicamente, o terceiro canal é feita de um material hidrofílico. Isto encoraja a gota do referido meio hidrofóbico (que por sua vez contém a gota de solução aquosa ou gotas) a permanecer na forma de uma gota de água no terceiro canal.

[0285] Numa outra forma de realização, o processo é um processo flowfocusing. Tipicamente, neste modo de realização, a extremidade do primeiro canal a partir do qual a gota de meio aquoso é produzido se projec- ta para o segundo canal, e a extremidade do segundo canal a partir do qual a gota de o referido meio hidrofóbico é produzido fica saliente para o terceiro ca nal. Normalmente, o meio aquoso flui através do referido primeiro canal, o referido meio hidrofóbico flui através do referido segundo canal, e o referido meio de suporte flui através do referido terceiro canal, num processo contínuo.

[0286] O processo pode compreender ainda a recuperação da referida gotícula encapsulada no interior do referido veículo hidrofílico do dispositivo microflmdic.

[0287] O processo pode compreender ainda a recuperação da gotícula encapsulada do veículo hidrofílico. O encapsulamento de gota pode ser recuperado utilizando qualquer técnica adequada, por exemplo, utilizando uma pipeta para retirar a gotícula encapsulada do veículo hidrofílico ou por meio de um procedimento automatizado em um dispositivo de microflui- dos. Um dispositivo de microfluidos pode por exemplo ser equipada com um ou mais armadilhas para multisomas, permitindo que a fase aquosa externa ser trocadas, mantendo multisomas no lugar. Alternativamente, um dispositivo de microfluidos pode utilizar uma fase aquosa externa para a produção dos multisomas, e, em seguida, a saída dos vários somes numa fase aquosa externa diferente.

[0288] O processo pode ainda compreender, em seguida, reintroduzindo a gota recuperado encapsular em um outro veículo hidrofílico. O outro veículo hidrofílico pode por exemplo ser uma composição farmaceutica- mente aceitável, água ou uma solução aquosa, um líquido iônico, ou por exemplo, um material de suporte hidrofílico viscoso ou rígida.

[0289] Alternativamente, o processo da invenção para a produção de um encapsulamento das gotículas da invenção pode ainda com-preender a troca veículo hidrofílico com um outro veículo hidrofílico. Assim, por exemplo, quando o veículo hidrofílico é uma solução aquosa, o processo pode compreender ainda a troca de a referida solução aquosa por diluição em série com uma nova fase aquosa, ou através da utilização de um processo automatizado em um dispositivo de microfluidos.

[0290] A invenção proporciona ainda uma gotícula encapsulada que é obtido por um processo da invenção, tal como definido acima para a produção de uma gotícula encapsulada.

[0291] A presente invenção é ainda ilustrada nos exemplos que se seguem:

EXEMPLOS Vulgarmente Lipídios e óleos

[0292] Todos os lipídios foram adquiridos na forma de pó a partir de Avanti Polar Lipids e dissolvido em pentano (DPhPC, DOPE) ou clorofórmio (DSPC) a 10 mg ml-1. Porções destas soluções stock foram evaporados utilizando um fluxo de azoto, seguido por, pelo menos, 30 min sob vácuo Os resíduos foram re-solubilisado em várias concentrações em várias misturas de óleo para experimentos usando apenas DPhPC, a concentração de lipídios foi de 0,1-0,2 mg ml-1, o óleo era um 9: 1 (v / v) mistura de óleo de silicone (Silicone Oil AR 20) e hexadecano (ambos da Sigma-Aldrich) As experiências de sensibilidade do pH utilizado uma mistura a 2: 1 (mol / mol) de DOPE e OA (Sigma-Aldrich) a 10 mg ml-4 totais concentração, em 19: mistura de 1 (v / v) de óleo de silicone e hexadecano. Os ensaios de sensibilidade temperatura utilizada uma mistura a 3: 1 (mol / mol) de DSPC e DPhPC a 1 mg mL-1 de concentração total, de um 9:1 (v / v) mistura de óleo de silicone e hexadecano.

Poros αHL

[0293] De tipo selvagem (WT) estafilocócica a-hemolisina (AHL) monómeros foram preparadas por transcrição in vitro de translação (IVTT), e heptamerised por incubação com as membranas de glóbulos vermelhos de coelho. Os heptamers foram, em seguida, purificados por electroforese em gel de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) para uma concentração final de ~1 ng μl-1 (475 Maglia, G. et al. Método. Enzymol., 591-623, 2010). A proteína foi diluída 10 - 100 vezes para os experimentos de gravação elétricos. O procedimento usado para preparar a αHL usada nas experiências de fluorescência tem sido descrita (Maglia, G. et al. Nano Lett. 9, 3831-3836, 2009). Resumidamente, uma cultura foi cultivada a partir de uma única colónia da estirpe de madeira 46 de Staphylococcus aureus. Heptamers espontaneamente oligomerizadas de αHL foram purificados por cromatografia de troca ca- tiônica e de electroforese em gel, e armazenada a ~2 mg ml-1 em tampão de fosfato de sódio 20 mM com NaCl 150 mM e 0,3% (w / v) de SDS, pH 8,0. Esta solução de proteína foi adicionada às gotas aquosas, a uma diluição de 50 vezes.

Tampões

[0294] O tampão utilizado foi de 25 mM Tris HCl, pH 8,0, KCl, EDTA e concentrações de lipídios, como dado no texto, excepto para as experiências de sensibilidade, em que o pH do tampão foi de Tris.HCl 30 mM, 10 mM de ácido succínico, 50 mM de KCl, 50 μM EDTA, a pH 8,0 ou pH 3,0.

Exemplo 1: A encapsulação

[0295] Multisomass foram feitos em três passos. Em primeiro lugar, as gotas de tampão de diâmetro ~300 μm foram pipetados óleo contendo lipídios dissolvidos; tipicamente o óleo era uma mistura de 9:1 (vol / vol) de óleo de silicone e hexadecano, e o lipídio foi 1,2-dipitanoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DPhPC). Em segundo lugar, uma gotícula da mesma solução de óleo de diâmetro ~800 μm foi colocado num tampão de grandes quantidades. Finalmente, depois de ~5 min um número de gotículas de solução aquosa foi transferido com uma pipeta na gotícula de óleo. Dentro de ~1 min de encapsulação, as gotas interiores coladas um ao outro, e à superfície da gotícula de óleo (figura 1c-e). Estas estruturas eram estáveis durante pelo menos 24h. Para simplicidade, o termo "multisoma" é aqui utilizado, independentemente do número de gotas encapsuladas.

[0296] Era desejável que esperar vários minutos (o tempo de incubação) antes de encapsulamento. Se transferido muito rapidamente, as gotas aquosas tendem a fundir-se uns com os outros e com a fase aquosa externa. O tempo de incubação pode ser necessária para monocamadas lipídicas bem embalados para formar em torno das gotas de óleo e aquosas. Estas mo- nocamadas podem então aderir para formar camadas duplas lipídicas, ou entre duas gotas encapsuladas (uma camada dupla interna), ou entre uma gota interior e a solução aquosa externa (uma camada dupla externo).

[0297] Na maioria das aplicações previstas, multisomass deve ser aproximadamente de flutuação neutra na água, e óleo de silicone utilizado foi escolhido em conformidade para a sua densidade de 1,01 g.cm-3 Igualmente importante, no entanto, era o tempo mínimo de incubação necessário para formar multisomass estáveis com um determinado óleo: enquanto esta era <5 min para o óleo de silicone e mistura hexadecano contendo 0,2 mg ml-1 DPhPC, multisomass feitas com 1 - bromododecano (densidade de 1,04 g cm3) não eram estáveis, mesmo após períodos de incubação mais longos e em concentrações de lipídios mais elevados.

Encapsulamento - Métodos

[0298] Estudar multisomass para períodos prolongados, foi necessário para corrigir as suas posições, evitando qualquer interação com as paredes do recipiente que pode afetar a estrutura. Por exemplo, se a gota de um óleo de contactos multisoma a interface de ar-aquoso a granel antes de ser totalmente revestida com uma monocamada de lipídio, a gota estende-se pelo que a interface. Do mesmo modo, se os contactos do multisoma uma parede do recipiente antes de a formação de monocamada, a gota de óleo pode aderir a essa superfície, o que pode obstruir a formação de uma camada dupla externo. Isto foi conseguido por suspensão de cada multisoma de um pequeno laço do fio de prata ou de plástico, de diâmetro -0.8-1.5 mm, submerso no tampão aquoso a granel. Loops de prata foram feitas envolvendo 100 fio de prata μπi diâmetro em torno de um modelo cilíndrico. Loops de plástico consistiu em seções transversais cortadas de pontas de pipeta. Cada ciclo foi então ligado a um fio de prata fixado à parede do recipiente. Multisomas poderia ser desalojado laços de prata por perturbação mecânica, enquanto os lacetes de plástico realizada multisomas muito confiável por causa de sua forte aderência à gota de óleo.

[0299] Uma solução de lipídios em óleo foi dispensada para um circuito para efetuar uma gotícula de óleo de volume de -0.5-2 μL suspenso em tampão. Poços acrílico Micromachined foram cheias com a mesma solução de óleo, e as gotas aquosas de volume de -0.5-70 nl foram realizados nestes poços com uma pipeta de 2 μL com uma electroforese em gel de carregamento de ponta. A ponta foi preenchida com aproximadamente 200 nl da solução aquosa, em seguida, imersas em solução de óleo. Apenas o suficiente da solução foi expulso para expor uma pequena gota pendente, e esta gota foi separada a partir da ponta ao pressionar a ponta da pipeta contra o fundo do poço. Após o tempo de espera, uma pipeta foi usada para transferir uma ou mais das gotas aquosas para a gotícula de óleo em solução aquosa a granel. Em experiências utilizando apenas DPhPC, o tempo de espera foi ~ 10 min; usando a mistura de DOPE / OA, -25 min; usando a mistura de DSPC / DPhPC, ~ 10 min. Multisomas com várias gotas de interiores pode ser formado tanto pela transferência de uma rede de DIB intactos, ou por transferência de gota não ligados, que, em seguida, formados in situ, camadas duplas.

Panorama energético

[0300] Após a encapsulação, mas antes a formação de camada dupla, as gotas de óleo e internas num multisoma minimizar as suas energias de superfície, através da adopção de geometrias esféricas. Após a formação de camada dupla, multisomas têm geometrias mostradas nas figuras. 2b-d. Essas geometrias representam um compromisso metaestável entre a adesão favorável de apposing monocamadas para formar camadas duplas e distorções desfavoráveis que expõem uma maior área de superfície monoca- mada ou camada dupla. Estes estados são só cineticamente estáveis, como a fusão das gotas interiores com a fase aquosa de massa iria diminuir ainda mais a energia livre do sistema. As tensões superficiais de uma monocamada e camada dupla, ym e respectivamente, são medidas do custo energético de criação de uma unidade de área de cada tipo de interface. Ao considerar o leque de possíveis geometrias de um multisoma e cálculo do custo energético ou benefício de cada geometria em relação ao estado antes da formação de camada dupla, podemos prever a geometria mais favorável. Aqui destacamos este cálculo para um multisoma com uma única gota de interior. Primeiro, para explorar todas as geometrias possíveis, é necessário para parametrizar a estrutura de um multisoma. Assumindo que cada uma das duas monocamadas e a camada dupla minimizar as suas próprias zonas de superfície, segue-se que a geometria do multisoma é composto de tampas esféricas. A geometria do multisoma pode então ser definido pelos três ângulos de contato ilustrado na Figura, 2a. A imposição de conservação do volume para as gotas de óleo e interiores, um desses ângulos é restringido e as outras duas variáveis permanecem livres. A escolha de qual o ângulo que a constranger é arbitrária.

[0301] A energia livre da formação de uma multisoma com uma certa geometria é simplesmente dado que as alterações em monocamada e superfície camada dupla áreas relativas aos estados esféricas, ponderada pela tensão superficial de cada interface. A energia livre da formação de uma multisoma com ângulos de contato (01, θ2, θβ) e:

onde Ri e R2 são os raios das gotas de óleo e interiores, respectivamente, antes da formação em camada dupla; ri é o raio de curvatura das três tampas esféricas correspondentes aos θ ângulos de contato, e pode ser avaliada a partir da θi, Ri e R2.

[0302] Escolhendo θ2, e θβ como as variáveis livres, podemos avaliar ΔF em cada possível combinação de θ2, e θβ para produzir uma paisagem de energia livre (figura 2b), usando os seguintes valores de parâmetros: Ri = 400 μm, R2 = 200 μm, ym = 5 mN m-1 (Yue, DE et al, J. Chem Soe Farad T. 1 72, 2685-2693 (1976); Morisaku, T., et al Anal. Sei. 20, 1605-1608 (2004)) e yb/ym = 0,68. O valor de yb/ym foi obtido a partir de medição de ângulos de contato DIB. O mínimo da paisagem representa a geometria de equilíbrio local, o que é ilustrado na figura 2a. Para as condições usadas para calcular a paisagem, os ângulos de contato de equilíbrio são: (θ1, θ2, θβ) = (33°, 173°, 77°).

[0303] O valor absoluto de qualquer ym ou yb é exigido apenas para calcular a energia livre absoluta de formação. A geometria de equilíbrio do multisoma pode ser calculado dado apenas a relação dos volumes de gotas e da razão yb/ym. Por outro lado, dada a geometria especial de equilíbrio desejado para um multisoma, uma análise semelhante à apresentada aqui pode impor restrições de projeto sobre os volumes de gota relativos e tensões superficiais.

Exemplo 2: Medições elétricas

[0304] Por analogia com os sistemas de DlBs em óleo a granel (Holden, MA et al. J. Am. Chem. Chem. Soe. 129, 8650-8655 (2007)), a incorporação de bombas de membrana, os canais e poros nas camadas duplas de um multisoma faria permitir o controle preciso sobre a troca de material, ea comunicação elétrica, entre as várias gotas internas ea solução externa. Para determinar se as camadas duplas externas de multisomas pode suportar a inserção de proteínas de membrana, foram realizadas medições elétricas através da camada dupla externa de um multisoma com uma única gota de interior. Para conseguir isso, um eletrodo de Ag / AgCl com isolamento de vidro que foi feito se eletricamente exposto apenas em sua ponta (ver Métodos, abaixo). Imediatamente após uma gotícula de solução aquosa foi transferida para a gotícula de óleo, a ponta do eléctrodo foi inserida no dropiet interior. Através de micromanipulação da eléctrodo, a gotícula interior foi então levada até à superfície da gotícula de óleo para permitir a formação de camada dupla (figura 3a).

[0305] Quando do tipo selvagem (WT) estafilocócica- hemolisina (αHL) foi incluído no interior das gotas, os aumentos progressivos na corrente iônica foram observados no espaço de 1 minuto da formação de camada dupla, como registrado com o eléctrodo inserido e um eléctrodo de Ag / AgCl liso na externa solução aquosa. Um exemplo de um rastreio de tal corrente é mostrado na figura 3b. A amplitude dos passos foi de 18,6 ± 0,8 pA (média ± DP, n = 16), de acordo com a corrente esperada de -18,6 pA para o poro AHL nas condições dadas (+50 mV, 500 mM C1) (Stoddart, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 106, 7702-7707 (2009)). As medidas atuais, portanto, correspondiam às inserções consecutivas de αHL poros na camada dupla externa.

[0306] Para confirmar que a inserção de poro era de αHL, a experiência foi repetida com uma menor concentração de proteína para reduzir a probabilidade de inserções múltiplas. Depois de alguns minutos, a corrente de degraus de zero a um nível constante, que corresponde à inserção de um único poro αHL na camada dupla externa. Imediatamente a seguir, Y- ciclodextrina (yCD, ~10 μM) foi adicionado para a solução aquosa externa, o que causou bloqueios reversíveis da corrente através do poro (figura 3c), com uma amplitude de bloqueio de 63,7 ± 2,0% (média ± DP, n = 673) a - 50 mV em 1 M KCL1. A mínimos quadrados linear para ajuste 10 histograma logarítmica dos tempos de permanência dá uma taxa de dissociação de 4,0 ± 0,6s-1 (média ± dp). Um estudo anterior empregando DIBs encontrada uma amplitude de bloqueio de -60 % e uma taxa de dissociação de 2,0 s "1 em tampão de pH 7,0 (Holden, MA et al., J. Am. Chem. Chem, Soe. 129, 8.650-8.655 (2007).). A taxa de dissociação maior visto aqui no tampão de pH 8,0 é consistente com a conclusão de que a taxa de dissociação de β-ciclodextrina de AHL aumenta com o pH (Gu, LQ et al., Biophys. J. 79, 1967-1975 (2000)).

[0307] A plataforma de gravação elétrico desenvolvido aqui pode ser utilizado para estudar os complexos de proteínas formadoras de poros que se estendem duas camadas duplas lipídicas, tais como as junções de hiato (Nakagawa, S. et al, Curr. Opin. Struc. Biol. 20, 423-430 (2010. )) e poros nucleares (Strambio-De-Castillia, C. et al., Nat. Rev. Mol.. Cell Bio. 1 1, 490-501 (2010)), ao nível de molécula única posicionando dois multisomas com única gota internas de tal forma que suas camadas duplas são opostas.

Medidas elétricas - Métodos

[0308] Correntes medidas através DIBs e multisomas feitas com óleo de silicone puro mostrou explosões ocasionais de corrente de fuga, que foram suprimidos por mistura do óleo com uma pequena proporção de hexadecano. Correntes foram medidos por meio de eletrodos de Ag / AgCl com um amplificador de patch-clamp (Axopatch 200B, Axon Instruments) e 16-bit digitalizador (1322A, Molecular Devices). Os dados foram adquiridos em 10 kHz com um 2 kHz low-pass filtro de Bessel, e para a análise foram ainda filtrada com um 400 Hz passa-baixa filtro de Bessel. Eléctrodos de Ag / AgCl, foram preparados por tratamento de 25 ou 100 fios de prata diâmetro μin (Scientific Wire Company e Sigma Aldrich, respectivamente), com 25% de sódio uma solução de hipoclorito de, pelo menos, 30 min.

[0309] Eléctrodos de vidro-revestidos foram feitos por en- roscamento 25 do fio de prata μin de diâmetro por meio de um capilar de vidro com diâmetros internos e externos de 142 e 559 μin μm, respectivamente (Drummond). O tubo capilar foi depois puxado (PC-10, Narishige) com o fio no seu interior, de tal modo que se separou em duas partes. O fio dentro de uma destas peças foi soldado a um pino de eléctrodo para a abertura maior do capilar. Pinças foram usadas para cortar ~ 50 μin de vidro a partir da extremidade puxada do capilar, a exposição da ponta do fio. Este final foi então tratado com uma solução de hipoclorito de sódio, como acima. A região próxima da extremidade puxada do capilar foi revestida com borracha de silicone (3140 Revestimento de TV, Dow Corning) para impedir a fuga de corrente entre o interior das gota e a solução aquosa externa (figura 3a).

Exemplo 3: Comunicação por Difusão

[0310] Tendo estabelecido que os poros αHL podem inserir em camadas duplas externas multisomal, exploramos se as gotas de interiores de um multisoma poderia usar esses poros para se comunicar de forma passiva com os outros e com a solução aquosa externa; isto é, sem a condução do fluxo de iões com uma tensão aplicada externamente.

[0311] Primeiro foi testado se uma gotícula encapsulada pode comunicar-se com a solução aquosa externa. Um multisoma foi feito com uma única gota interior contendo poros AHL e fluo-4 (Ca 2 + corante sensível) conjugado com 10.000 MW de dextrano, e monitorizada por meio de microsco- pia de fluorescência. A adição de Ca 2 + para a solução externa causou a gota inicialmente interior escura se tornar fluorescente durante -1,5 h (figura 4A), ao passo que um multisoma sem AHL não mostrou nenhum aumento de fluorescência (n = 6). Concluiu-se que o aumento da fluorescência na multisoma contendo AHL foi provocada pela difusão de Ca 2 + iões a partir da solução aquosa externa no interior da gotícula, por meio de AHL poros na camada dupla externa. De medições elétricas através de um DIB com a mesma concentração de AHL que o utilizado no multisoma, é esperado que o número de poros AHL inseridos na camada dupla multisomal ser vários milhares. Em seguida testaram se duas gotas de interiores, um multisoma poderia comunicar uns com os outros de uma maneira semelhante, através da inclusão de dextrano conjugado com fluo-4 e AHL em uma gotícula e de Ca + no outro. A gotícula contendo Fluo-4 aumentada da fluorescência ao longo -1 h (figura 4B), indicando a difusão do Ca 2 + iões entre as gotas internos através AHL poros na camada dupla interior. Juntos, estes resultados demonstram a comunicação por difusão passiva entre um multisoma e a solução externa, e dentro das gotas de interiores de um multisoma.

[0312] As medições de fluorescência mostraram um intervalo de tempo entre o início de Ca 2 + e um aumento de fluxo de fluorescência. Isto é devido à ligação competitiva de Ca 2 + por EDTA, incluídos nas gotas interiores para quelar a pequena quantidade de contaminantes Ca presente no sal de tampão, o que de outro modo teria produzido a fluorescência de fundo. Ca2 + liga-se fluo-4 e EDTA a taxas semelhantes (kon ~ 107 -10s M-1 s-1), mas dissocia-se fluo-4 muito mais rapidamente do que o de EDTA, com k 0 f f ~ 400 s "1 e <1 s "1, respectivamente (Naraghi, M., Cell Calcium 22, 255-268 (1997); Johnson, JD et al., Biophys J. 76, 1514-1522 (1999)). Numa escala de tempo de minutos, portanto, o EDTA atua como um dissipador para quase todo o Ca2+ na gota, e apenas uma vez o EDTA foi saturada pode uma proporção significativa dos fluo-4 moléculas se ligam Ca 2 + íons.

Métodos - Fluorescência medições

[0313] O sal de potássio de fluo-4 conjugado com um dex- trano 10.000 MW (Invitrogen) foi dissolvido em água pura, e adicionados às gotas a concentração de corante final de 25 μM. Gota contendo corante também continha 50 μM EDTA sal dissódico. Ca 2 + gota contendo continha 100 mM de CaCl 2.

[0314] A microscopia de fluorescência foi realizada com um microscópio Nikon Eclipse TE2000-S invertido com uma objectiva Nikon TPI DL 10X, usando uma lâmpada de arco de mercúrio de iluminação e o cubo de filtro adequado. As fotografias foram tiradas com uma Hamamatsu C9100 câmera EMCCD, com uma exposição de 400 ms e ganho de 179. Intensidades de fluorescência foram medidos usando software ImageJ (Abramoff, MD, Magelhaes, PJ & Ram, SJ de processamento de imagem com a imagem 11, 36-42 (2004)).

Exemplo 4: Multisomas para entrega do fármaco

[0315] A capacidade de um único multisoma para manter muitas espécies químicas em separados compartimentos, e permitir que eles se combinam de uma forma controlada, permite que novos meios de distribuição de fármacos. A entrega de mais de uma espécie farmacológicas para uma célula usando lipossomas convencionais requer que essas espécies de ser encapsulada, quer em conjunto, permitindo que as reacções potencialmente indesejáveis entre eles; ou separadamente, em cada caso em que ceil receberá uma proporção mal controlada de cada espécie. Por outro lado, o fornecimento de vários fármacos encapsulados em diferentes compartimentos de uma única multisoma (incluindo na fase de óleo) que permitem um controlo preciso sobre as proporções de dosagem. Isto pode ser vantajoso para a administração de fármacos com mecanismos de acção independentes; a sua absorção pelas células, em proporções fixas poderá ser esperado para aumentar a sua eficácia global, e diminuir a probabilidade de desenvolvimento de resistência a qualquer um dos fármacos.

[0316] Além da entrega simultânea de fármacos independentes, entrega multisomal seria particularmente adequado para pró-fármacos, as formas inactivas de medicamentos que podem ser activados por outras espécies (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Fármaco Discov. 7, 255-270 (2008)). Neste caso, cada multisoma conteria o pró-fármaco em uma gotícula interior, e o ati- vador de outra gotícula interior. Conjuntamente libertando os conteúdos das gotas mediante alguns estímulos externos (tal como uma alteração no pH ou na temperatura) permitirá que o pró-fármaco e do ativador de combinar, produzindo a espécie activa in situ. Isto iria permitir a administração de fármacos que são, por exemplo, demasiado instáveis ou insolúveis para ser entregue no estado ativo. Por exemplo fosfato miproxifene, o éster de fosfato de inactiva do miproxifene agente anticancerígeno, tem ~1000-vezes maior do que a solubilidade aquosa miproxifene, e é convertido para a espécie activa por fosfatases alcalinas (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Fármacos Discov. 7, 255-270 (2008)). Inversamente, multisomas poderia ser utilizado para entregar "fármacos suaves" (fármacos ativos que são desativados por uma outra espécie; Bo- dor, N. et al, Med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000).). A inclusão do fármaco ativo e sua desativador em gota separadas do mesmo multisoma daria um controle preciso sobre a vida útil da fármaco ativa.

[0317] Existem atualmente duas grandes abordagens para a entrega de pró-fármacos. Um faz uso de ativadores que já estão presentes in vivo (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Discov Fármacos. 7, 255-270 (2008)), e, portanto, tem uma escolha limitada de ativadores. Em outra abordagem, como no anticorpo, e do gene da enzima dirigida por vírus profármaco terapias (ADEPT, GDEPT e VDEPT, respectivamente), um ativador exógeno é fornecido às células alvo antes da administração sistémica do pró-fármaco (Niculescu-Duvaz, 1. 1, et al., Entregar Adv. Fármacos. Rev. 26, 151-172 (1997)). Embora essas abordagens podem fazer uso de uma ampla gama de ativadores, enfrentam obstáculos consideráveis. Na ADEPT, o ativador é acoplado a um anticorpo direccionada para a superfície de um tipo particular de células. Este acoplamento do anticorpo pode ser oneroso para desenvolver e introduz complicações imunogénicas (Xu, J. e outros, Clin Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001).). Além disso, o fármaco ativo deve ser capaz de penetrar no cytosoi a partir do espaço extracelular. Embora GDEPT VDEPT e evitar estes problemas, fornecendo material genético para uma enzima ativadora de pró-fármaco nas células-alvo, estas abordagens estão limitadas a ativadores da proteína que pode ser expresso em níveis elevados (Xu, G. et al. Clin. Câncer Res. 7, 3314-3324 (2001)). As restrições que se aplicam a sistemas de distribuição existentes pró-fármaco pode ser contornada pela entrega com multisomas, tendo um pró-fármaco e ativador em compartimentos separados. Um problema central para todos os veículos de entrega de fármacos está provocando a liberação de fármacos aprisionadas nos locais apropriados. Aqui demonstramos que o aplicativo multisomas de dois mecanismos estabelecidos de libertação desencadeada, a primeira base de um decréscimo no pH e o segundo em um aumento na temperatura.

Sensibilidade ao pH

[0318] Os lipossomas podem ser sujeitos a endocitose pelas células com e sem a utilização de moléculas alvo específicas (Torchilin, VP Nat. Rev. Drug Discov. 4, 145-160 (2005)). A descarga dos conteúdos lipossó- micos para o citosol pode ser alcançada por engenharia dos lipossomas para desestabilizar a pH ácido, de modo a que se fundem com a membrana do en- dossoma antes do endosomai progride para um lisossoma, em que os conteúdos possam ser sequestrados ou discriminado (Chu, CJ et al. Pharm. Res. 7, 824-834 (1990)). Multisomas miniaturizados que sofrem endocitose e feitas para desestabilizar a pH ácido pode também conseguir a entrega de fármaco intracelular, simultaneamente liberando o pró-fármaco e o ativador dentro do endossoma. Para a fármaco activa para ganhar acesso ao citosol, ele deve ser feito de permeante à membrana endosomai; inversamente, o pró-fármaco e o ativador deve ser impermeabilizante para a membrana multisomal, a fim de evitar fugas prematuras pró-fármaco. Exemplos específicos incluem: HMR separadamente encapsulado 1826 e humano beta-glucuronidase. O último converte o ex a doxorrubicina. Enquanto HMR 1826 não é permeante à membrana celular, doxorrubicina é separadamente encapsulado fosfato miproxifene e um ativador da fosfatase alcalina. O último converte a primeira para miproxifene. Miproxifene é ~ 1000 vezes menos do que o fosfato miproxifene solúvel em água e, portanto, tende a ser mais membrana permeante.

[0319] Alternativamente, a fármaco ativa podem ter acesso ao citoplasma do endosome ou lisossomo através de efluxo, por exemplo através de vias de reciclagem.

[0320] Uma estratégia para preparar os lipossomas sensíveis ao pH utiliza uma mistura de dois lipídios (Drummond, DC et al., Prog. Lipid Res. 39, 409-460 (2000)). Um deles, tais como 1,2-dioleoíl-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), favorece um estado não-camada dupla; outro, tal como o ácido oleico (OA), estabiliza o estado de camada dupla a valores de pH acima do seu pKa (~7,5 quando incorporado na camada dupla (Hamilton, JA & Cistola, DP Proc. Natl Acad. Sei. EUA 83, 82-86 (1986)), (Small, DM, Cabral, DJ, Cistola, DP, Parques, JS & Hamilton, JA Hepatology 4, 77S-79S (1984))), mas não em valores de pH mais baixos, quando uma proporção significativa da OA é protonado. Aqui vamos aplicar esta estratégia para dar sensibilidade pH para multisomas.

[0321] Multisomas feitas com uma mistura de DOPE e OA foram encontrados para ser estável durante pelo menos um dia, em uma solução aquosa externa a pH 8,0 (n = 7). Ao diminuir o pH desta solução entre 8,0 e -5,5, substituindo aproximadamente metade do que com um tampão de pH 3,0, idêntica, o bi externo! Ayers subitamente rompida, permitindo que o conteúdo das gotas de interiores para misturar um com o outro e com o externo solução (figura 5a). As gotas sempre rebentar dentro <2 min de cada um dos ou- tros, e geralmente dentro de <1 min (n - 8). Multisomas não rebentar se o tampão de pH 8,0 foi trocado por tampão do mesmo pH, mostra que o estouronão foi devido a perturbações mecânicas. Para testar se os conteúdos das gotas misturados uns com os outros antes de difundir para dentro da solução externa, com duas gotas de multisomas internas foram feitas no qual uma gota interior continha dextrano conjugado com fluo-4, e o outro continha Ca 2+. Estes multisomas foram monitorados com microscopia de fluorescência. Logo após a redução do pH da solução externa, tanto interiores gota rebentar simultaneamente, liberando o Ca + e fluo-4 em solução externa; a intensidade de fluorescência correspondente diminuiu com o fluo-4 tornou-se diluído (figura 5b). Em poucos segundos, as nuvens do fluo-4 e Ca 2 * agora na solução externa começaram a se misturar, e seu volume de intersecção mostrou um aumento acentuado na intensidade de fluorescência. Finalmente, tornou-se esta mistura brilhante diluída, mais uma vez, diminuir a intensidade de fluorescência.

Sensibilidade pH - métodos

[0322] Gota contendo corantes continha 25 μM dextrano conjugado com fluo-4 e 50 μM EDTA. Ca 2 + gota contendo continha 10 mM de CaCl 2 . As goticulas encapsuladas foram deixados a equilibrar durante -15 min após a formação, em seguida, cerca de metade do volume da solução aquosa externo foi substituído com o mesmo volume da mesma solução tampão de pH 8,0. Este foi então repetido, mas com o mesmo volume de tampão de pH 3,0.

Sensibilidade à temperatura

[0323] Também implementamos um mecanismo para a li-beração desencadeada com temperatura de multisomas. Lipossomas feitos com um lipídio com uma temperatura de transição de fusão Tm tem um máximo local em torno de permeabilidade Tm atribuível aos limites entre as fases sólidas e fluidas de camada dupla lipossomal (Mills, J.. et al., BBA-Biomembranes 1716, 77-96 (2005)). Mecanismos de distribuição usando este fenômeno estão sendo desenvolvidos para uso em conjunto com hipertermia leve local de até 42 ° C, produzindo um aumento correspondente no local, a liberação do fármaco (Needham, D. et al Adv Entregar Fármacos Rev. 53, 285- 305 (2001)).

[0324] As tentativas para formar multisomas com 1,2- dipalmitoil-. W-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (Tm = 41 ° C), popularmente utilizados para os lipossomas sensíveis à temperatura, não deu camadas duplas estáveis quando realizado sobre uma gama de lipídio concentrações e tempos de incubação. A instabilidade dos lipossomas de DPPC gigantes foi notado noutro local (Akashi, K. et al, Biophys J. 71, 3242-3250 (1996); Korlach, J. et al, Proc Natl Acad Sci EUA 96, 8461-8466 (1999)). No entanto, multisomas feitas com uma mistura a 1: 1 (mol / mol) de DPPC e DPhPC eram estáveis, com - 90% de sobrevivência, pelo menos, 12 h (n = 8). Quando submetido a um gradiente de temperatura, as camadas duplas externas de multisomas feitos com esta mistura de lipídios com uma única gota interior rompido subitamente em 32,6 ± 1,6 ° C (n = 1 1), libertando os conteúdos das gotas interiores na solução aquosa externa. A temperatura de ruptura não mostra uma tendência significativa em termos da proporção molar de DPhPC variou de -15-75%, e proporções significativamente mais baixos de DPhPC não conseguiu estabilizar as camadas duplas.

[0325] Que a temperatura de ruptura é consideravelmente mais baixa do que a temperatura de transição do DPPC é provavelmente devido a dois factores. Em primeiro lugar, a adição de DPhPC para DPPC é conhecido para alargar significativamente a transição em fusão, e para diminuir a temperatura de transição de pico (Lmdsey, H. et al. Biochim. Biophys. Acta 555, 147-167 (1979)). Em segundo lugar, a extensão da libertação do conteúdo de lipossomas sensíveis à temperatura tem sido demonstrada que o aumento com o seu tamanho (Ueno, M. et al., B. Chem. Soe. Jpn 64, 1588-1593 (1991)). A grande área de camadas duplas em nossas multisomas modelo em comparação com lipossomas poderiam, portanto, gerar sensibilidade à temperatura elevada. Juntamente com o aparecimento precoce da transição de fusão causada pela adição de DPhPC, este aumento da sensibilidade pode explicar a ruptura dramática da camada dupla observado bem abaixo da Tm de DPPC pura. Seguindo a hipótese de que os lipídios semelhantes ao DPPC sofrer um alargamento semelhante da transição de fusão sobre a mistura de DPhPC, DPPC foi substituído por 1,2-diestearoil-5 -? Glicero-3-fosfocolina (DSPC) (Tm ~ 55° C) a fim de elevar a temperatura de ruptura do multisomes para dentro de uma gama apropriada para a hipertermia ligeira clínica. Multisomas feitas com uma mistura a 3: 1 (mol / mol) de DSPC e DPhPC com uma única gota interior foram encontrados para ser estável à temperatura ambiente durante pelo menos um dia (n = 11).

[0326] Multisomas feitos com esta mistura de lipídios foram submetidos a uma rampa de temperatura de ~1° C, min-1, e a temperatura a que cada rajada multisoma foi observado (Figura 6a). Sem -3% de multisomas que surgiu a -30 ° C, a temperatura de ruptura foi de 43,6 ± 3,5 ° C (média ± DP, n = 93). Quando multisomas com duas gotas de interiores foram aquecidos do mesmo modo, em 70% dos casos, as duas gotas de interiores de cada multisoma rebentar dentro de 0,1° C uns dos outros, em 42,9 ± 3,5 ° C (média ± DP, n = 10).

[0327] As multisomas eram capazes de manter o seu conteúdo à temperatura do corpo, antes de ser submetido a hipertermia; quando multisomas com uma única gota interna foram mantidos a 37,2 ± 0,4 ° C, 93% sobreviveram durante pelo menos 30 min (n = 46) (figura 6b).

Sensibilidade à temperatura - Métodos

[0328] Um recipiente feito de segurar 12 sobre multisomas laços de plástico foi colocado sobre um bloco de aquecimento, e a temperatura da solução aquosa de massa foi medida com um termómetro de termopar. A solução em bruto foi continuamente agitada com um motor para assegurar a homogeneidade da temperatura. O termostato bloco de aquecimento foi controlada usando feedback em tempo real a partir de medições de temperatura para alcançar os regimes de temperatura em rampa e constantes descritas no texto.

Conclusões

[0329] Demonstrou-se no presente contexto que multisomas são estáveis em solução aquosa. As goticulas encapsuladas podem trocar espécies químicas uns com os outros e com o meio ambiente através de proteínas de membrana incorporados em camadas duplas. Além disso, multisomas podem responder aos estímulos externos, tais como o pH e temperatura por co-libertando os conteúdos das gotas encapsuladas. Estas funcionalidades expandam significativamente a aplicabilidade dos dispositivos de rede de gotas, por exemplo, como veículos para a entrega de fármacos combinatória. Os multisomas aqui estudadas foram ~800 μm de diâmetro (figura 1c-e). Esta escala foi conveniente para a manipulação inicial e estudo de multisomas individuais. No entanto, algumas aplicações que requerem multisomas para interagir com as células vivas podem obrigá-los a ser maior do que alguns mícrons e, idealmente, <200 nm, para a sua utilização na entrega do fármaco (Devine, DV, Biochim. Biophys. Acta 1191, 43-51 (1994)). O efeito do aumento da curvatura nas monocamadas e camadas duplas multisomal é provável que se torne importante para multisomas menores do que ~1 μm de diâmetro (Lichtenberg, D. et al. Bioquímica (Mosc.) 20, 3462-3467 (1981)).

[0330] O fabrico de elevado rendimento de multisomas miniaturizados poderia ser conseguido através da utilização de técnicas de mi-crofluidos existentes, que empregam corte consecutivo (Okushima, S. et al, Langmuir, 20, 9905-9908 (2004)) ou o fluxo de focagem (Chu, LY et al., Angew Chem Int Edição 46, 8970-8974 (2007); Seo, M. et al, Soft Matter 3, 986-992 (2007)) para encapsular gotículas de solução aquosa em ~100 μm gota de óleo de diâmetro, em grandes quantidades solução aquosa. Estas estruturas foram estabilizadas tipicamente por surfactantes ou copolímeros em bloco. Um estudo recente (Shum, HC et al, Angew. Chem. Int. Editar. 50, 1648-1651 (2011) usado microfluídica fluxo de focagem para criar grupos de gotículas de solução aquosa unidos por camadas duplas de copolímeros em bloco.

Claims

1. Multissoma caracterizado por compreender: - uma gota de um meio hidrofóbico; - uma camada periférica de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície da gota em que as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem moléculas lipídicas; e - uma gotícula de solução aquosa, ou uma pluralidade de gotículas de solução aquosa, no interior da camada periférica, em que cada gotícula de solução aquosa compreende: (a) um meio aquoso, e (b) uma camada externa de moléculas anfipáticas não poliméricas em torno da superfície do meio aquoso em que as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem moléculas lipídicas, em que o multissoma compreende uma camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em que a referida camada dupla compreende ainda uma proteína de membrana e em que: - i) uma gotícula de solução aquosa está situada na borda da gota, em que a parte externa da gotícula de solução aquosa contata com a referida camada periférica, formando deste modo a referida camada dupla das referidas moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre a gotícula de solução aquosa e a camada periférica; ou - ii) parte da camada exterior de uma primeira gotícula de solução aquosa contata parte da camada externa de uma segunda referida gotícula de solução aquosa, formando deste modo a referida camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas em uma interface entre a referida primeira e segunda gotículas.

2. Multissoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína de membrana ser um poro, canal ou bomba.

3. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por: referida gotícula de solução aquosa, ou, pelo menos, um dito gotículas de solução aquosa, compreender ainda uma molécula sensor.

4. Multissoma, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o sensor de molécula ser uma molécula que é sensível à presença de um analito alvo ou uma molécula fotossensível;

5. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda um agente terapêutico, um pró-fármaco ou um agente de diagnóstico, em que o agente terapêutico, um agente de diagnóstico ou pró-fármaco estar presente no meio hidrofílico de uma gotícula de solução aquosa, ou no meio hidrofóbico.

6. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender ainda um primeiro agente e um segundo agente, em partes separadas do encapsulado, em que o primeiro agente está na gotícula de solução aquosa ou pelo menos em uma das gotículas de solução aquosa, e o segundo agente está dentro do meio hidrofóbico, ou em que o primeiro agente e o segundo agente estão em diferentes gotículas de solução aquosa do encapsulado.

7. Multissoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os primeiro e segundo agentes serem selecionados entre agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico, fármacos para utilização em terapias combinadas, pró-fármacos e os seus respectivos ativadores, fármacos ativos e seus compostos desativadores correspondentes, e agentes de contraste para monitorar a biodistribuição de um fármaco.

8. Multissoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os primeiro e segundo agentes serem fármacos adequados para utilização em conjunto numa terapia combinada; ou o primeiro agente é uma forma inativa de um fármaco que é capaz de ser ativada por um ativador, e o segundo agente é referido ativador; ou o primeiro agente é um fármaco que é capaz de ser desativado por um composto desativador, e o segundo agente é dito desativador de composto; ou o primeiro agente é um fármaco e o segundo agente é um agente de contraste adequado para a monitorização da biodistribuição do fármaco.

9. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por o multissoma compreender ainda um terceiro agente, em que terceiro agente está em uma parte ou em partes do encapsulado diferentes do primeiro e segundo agentes, seja em uma gotícula ou em gotículas aquosas diferentes ou no meio hidrofóbico.

10. Multissoma, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o terceiro agente ser um agente terapêutico, um agente de diagnóstico, um fármaco para uso em conjunto numa terapia combinada com o primeiro ou o segundo agente, de um pró-fármaco, um ativador para um pró- fármaco, um composto desativador de um fármaco ativo ou um agente de contraste para a monitorização da biodistribuição do fármaco.

11. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado por os referidos agentes ativos estarem presentes na gotícula encapsulada em uma proporção de dosagem pré- determinada.

12. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por os primeiro e segundo agentes e, quando presente, o terceiro agente, serem compostos de reagente para reagir em conjunto numa reação química.

13. Multissoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a estabilidade da referida camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas, ou de uma ou mais das referidas camadas duplas de moléculas anfipáticas não poliméricas, ser sensível a um estímulo em que as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem moléculas lipídicas.

14. Multissoma, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por as moléculas anfipáticas não poliméricas da referida camada dupla ou camadas duplas compreenderem uma molécula que reconhece uma espécie de superfície sobre uma célula alvo, em que a resposta para o reconhecimento compreende desestabilização da camada dupla ou camadas duplas.

15. Uso de multissoma que compreende uma proteína de membrana, em que o multissoma é conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, caracterizado por: ser para o tráfico de uma molécula entre gotículas no encapsulado e/ou para a entrega de uma molécula de uma gotícula no encapsulado para o meio ambiente externo; investigar e/ou rastreio de uma proteína de membrana ou que interage com uma proteína de membrana; ou investigar e/ou o rastreio de uma camada dupla de moléculas anfipáticas não poliméricas, em que as moléculas anfipáticas não poliméricas compreendem moléculas lipídicas.

16. Sensor, bateria ou dispositivo elétrico, caracterizado por compreender um multissoma conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores de 1 a 14.