CN114250190A - 封装细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种封装细胞及其制备方法，封装细胞包括：细胞；保护膜，所述保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面。在本发明实施例的封装细胞中，保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面，可以在单个已经去除细胞壁的植物细胞的细胞膜外表面包覆一层保护膜，由于细胞不具有细胞壁，细胞膜容易损伤，通过保护膜可以保护所述细胞的细胞膜，使得细胞膜不容易被损伤，通过微流控通道使每个微滴中包含细胞的过程中，使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂，避免在单细胞分析前导致细胞死亡和内容物泄露，保证细胞分析结果的准确性和可靠性。

Description

封装细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种封装细胞及其制备方法。

背景技术

细胞是生物体基本的结构和功能单位，由于各细胞群体之间存在异质性，通过对细胞群体分析获得的均值掩盖了单个细胞之间的差异，不能表征基因表达的随机性本质，无法反映真实情况。随着微流控液滴技术的发展，可以在油相中形成水微滴，通过微流控通道使每个微滴中包含一个细胞，再利用荧光信号、显微成像等技术，对含有细胞的液滴进行分选，并进行液滴内的PCR反应、测序、细胞表达抗体分析等单细胞分析。植物细胞研究过程中会先去除细胞壁，而质膜在微流控液滴生成试剂中受到表面活性剂的影响破裂，在单细胞分析前就导致细胞死亡和内容物泄露。此外，由高压液体射流或电场进行细胞分选过程中，同样对细胞有极大伤害。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种封装细胞及其制备方法，用以解决在细胞研究过程中，质膜在微流控液滴生成试剂中容易破裂，在细胞分析前就导致细胞死亡和内容物泄露的问题。

第一方面，本发明实施例提供了一种封装细胞，包括：

细胞；

保护膜，所述保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面。

其中，封装细胞还包括：

液膜，所述液膜包覆在所述保护膜的外表面。

其中，所述保护膜中包括：

第一化合物，所述第一化合物具有第一基团和第二基团；

第二化合物，所述第二化合物具有第三基团，所述第一基团与所述细胞的细胞膜连接，所述第二基团与所述第三基团连接。

其中，所述第二基团与所述第三基团通过第三化合物连接，所述第三化合物具有第四基团与第五基团，所述第二基团与所述第四基团连接，所述第三基团与所述第五基团连接。

其中，所述保护膜中包括聚合物层。

其中，所述聚合物层中具有亲水基团和/或疏水基团。

其中，所述聚合物层由同一单体聚合形成，所述单体中具有连接基团，所述连接基团与所述细胞的细胞膜连接。

其中，在所述保护膜的厚度方向上依次具有亲水性结构、疏水性结构和亲水性结构；和/或

所述保护膜为网状的交联结构。

其中，所述保护膜为磷脂分子层、磷脂交联分子层、细胞膜碎片层或脂质层。

其中，所述细胞为去除细胞壁的植物细胞；和/或

所述细胞为单细胞。

其中，所述保护膜的外表面具有亲水基团和/或疏水基团。

第二方面，本发明实施例提供了一种封装细胞的制备方法，包括：

提供细胞；

在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜。

其中，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤之后，还包括：

在所述保护膜的外表面包覆液膜。

其中，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤包括：

在所述细胞的细胞膜的外表面形成第一化合物层，第一化合物具有第一基团和第二基团，所述第一基团与所述细胞的细胞膜连接；

将具有第三基团的第二化合物与所述第一化合物连接，其中，所述第二基团与所述第三基团连接。

其中，将具有第三基团的第二化合物与所述第一化合物连接的步骤包括：

将第二化合物与第一化合物通过具有第四基团与第五基团的第三化合物连接；其中，所述第二基团与所述第四基团连接，所述第三基团与所述第五基团连接。

其中，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤包括：

获取细胞膜碎片或脂质；

在所述细胞的细胞膜的外表面包覆细胞膜碎片层或脂质层。

本发明实施例的封装细胞包括：细胞；保护膜，所述保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面。在本发明实施例的封装细胞中，保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面，可以在单个已经去除细胞壁的植物细胞的细胞膜外表面包覆一层保护膜，由于细胞不具有细胞壁，细胞膜容易损伤，通过保护膜可以保护所述细胞的细胞膜，使得细胞膜不容易被损伤，通过微流控通道使每个微滴中包含细胞的过程中，使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂，避免在单细胞分析前导致细胞死亡和内容物泄露，保证细胞分析结果的准确性和可靠性。

附图说明

图1为本发明实施例中封装细胞的一个结构示意图；

图2为本发明实施例中封装细胞的一个制备流程示意图；

图3为在细胞表面形成磷脂交联分子层的一个流程示意图；

图4为在细胞表面形成聚合物层的一个流程示意图；

图5为在细胞表面形成细胞膜碎片层或脂质层的一个流程示意图；

图6为用十字形微流控通道将包裹保护膜的细胞形成液膜的示意图。

附图标记

细胞10；

保护膜20；

液膜30；

微孔筛板40。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一，字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

如图1至图6所示，本发明实施例的封装细胞，包括：细胞10和保护膜20，保护膜20可以包覆在细胞10的细胞膜的外表面。在本发明实施例的封装细胞中，保护膜20包覆在细胞10的细胞膜的外表面，可以在单个已经去除细胞壁的植物细胞的细胞膜外表面包覆一层保护膜20，由于细胞不具有细胞壁，细胞膜容易损伤，通过保护膜20可以保护细胞10的细胞膜，使得细胞膜不容易被损伤，通过微流控通道使每个微滴中包含细胞的过程中，使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂，避免在单细胞分析前导致细胞死亡和内容物泄露，保证细胞分析结果的准确性和可靠性。

在一些实施例中，如图1、图2和图6所示，封装细胞还可以包括：液膜30，液膜30包覆在保护膜20的外表面。液膜30可以为油相膜或水相膜，保护膜20的外表面可以具有疏水基团，便于在保护膜20的外表面形成油相的液膜30，保护膜20的外表面可以具有亲水基团，便于在保护膜20的外表面形成水相的液膜30，可以通过微流控通道使每个细胞表面包覆液膜30，由于保护膜20的存在，可以使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂。

在应用过程中，细胞10可以为去除细胞壁的植物细胞，由于植物细胞通过保护膜20进行了质膜保护，液滴油中的表面活性剂无法直接渗透质膜，减少了对植物细胞的伤害。此外，分选操作中的高压液体或高压电场直接施加于液滴界面以及保护膜20，对植物细胞的直接伤害减小，整个制备及分选过程温和，有效提高了细胞的存活率，可以有效降低植物单细胞技术的使用成本，减少对操作人员技能的依赖。

在本发明的实施例中，保护膜20中可以包括：第一化合物和第二化合物，第一化合物可以具有第一基团和第二基团，第二化合物可以具有第三基团，第一基团与细胞10的细胞膜连接。第一化合物的第一基团可以先吸附在细胞10的细胞膜的表面，可以通过点击化学反应让第一化合物和第二化合物交联反应以交联成膜层。第一基团可以包括正电型基团，例如氨基，便于第一基团与细胞10的细胞膜的连接，细胞10的细胞膜的外表面具有电负性，通过正电型基团便于吸附在细胞10的细胞膜的外表面上，第一基团与细胞10的细胞膜之间还可以通过范德华力进行吸附连接。第二基团与第三基团连接，第二基团与第三基团可以通过化学键连接，比如，第二基团可以包括C＝C双键，第三基团可以包括巯基或羟基，第二基团与第三基团之间可以通过加成或缩合连接，不同的羟基之间也可以进行缩合，第三基团可以具有一个或多个羟基，同一第二化合物分子中的羟基之间可以缩合，不同第二化合物分子中的羟基之间也可以缩合，通过第二基团与第三基团的加成或缩合连接可以使得第一化合物和第二化合物交联形成膜层作为保护膜20，对细胞10的细胞膜具有保护作用。

在一些实施例中，第二基团与第三基团可以通过第三化合物连接，第三化合物具有第四基团与第五基团，第二基团与第四基团连接，第三基团与第五基团连接。比如，第二基团可以包括C＝C双键，第三基团可以包括C＝C双键，第四基团与第五基团可以包括巯基或羟基，第二基团与第四基团可以通过加成连接，第三基团与第五基团可以通过加成连接，第二基团与第三基团可以通过第三化合物连接，通过第二基团与第四基团的连接以及第三基团与第五基团的连接可以使得第一化合物和第二化合物形成膜层，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜20，通过保护膜20可以对细胞10的细胞膜具有保护作用，防止细胞膜损坏。在一些实施例中，第二基团与第三基团可以包括羧基，第四基团与第五基团可以包括羟基；或者第二基团与第三基团可以包括羟基，第四基团与第五基团可以包括羧基。第一化合物与第二化合物可以为相同的化合物，比如，第一化合物与第三化合物可以为磷脂分子，通过第三化合物使得磷脂分子进行交联，可以形成磷脂交联分子层。

在另一些实施例中，保护膜20中可以包括聚合物层，可以通过可以自交联的化合物在细胞膜的表面形成聚合物层，通过聚合物层来保护细胞膜，防止细胞膜损坏。如图4所示，可以用两亲性分子吸附在细胞10(去除细胞壁的植物细胞)的表面，分子的疏水端可以具有胆固醇、胆红素等大环脂溶性分子结构，可以插入细胞膜结构，对细胞膜影响小，有利于和细胞膜的连接；亲水端可以具有聚乙二醇、聚乙烯醇、聚酯等亲水性结构，可以带有硫醇SH基团，有利于交联聚合；待两亲性分子吸附稳定后，可以利用点击化学反应，将两亲性分子交联稳定，形成核为去除细胞壁的植物细胞，壳为交联聚合物结构，用交联聚合物结构作为聚合物层来保护细胞膜，交联聚合物可以作为保护膜20。

在一些实施例中，聚合物层中可以具有亲水基团和/或疏水基团，以便于在保护膜20的外表面包覆液膜。保护膜20可以为聚合物层，液膜30可以为油相膜或水相膜，聚合物层的外表面可以具有疏水基团，便于在聚合物层的外表面形成油相的液膜30；聚合物层的外表面可以具有亲水基团，便于在聚合物层的外表面形成水相的液膜30，可以通过微流控通道使每个细胞表面包覆液膜30，由于聚合物层的存在，可以使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中破裂。

在一些实施例中，聚合物层可以由同一单体聚合形成，单体中具有连接基团，连接基团与细胞10的细胞膜连接。连接基团可以包括正电型基团，例如氨基，有利于连接基团与细胞10的细胞膜的稳定连接，连接基团与细胞10的细胞膜之间还可以通过范德华力进行吸附连接。

在本发明的实施例中，在保护膜20的厚度方向上依次具有亲水性结构、疏水性结构和亲水性结构。也即是，保护膜20的中间结构为疏水性结构，保护膜20两侧具有亲水性结构，在保护膜20的内侧表面与外侧表面具有亲水性结构，便于保护膜20的内侧表面与细胞膜的连接，保护膜20的外侧表面的亲水性结构有利于水性液膜的包裹。

所述保护膜为网状的交联结构，可以具有孔隙，有利于细胞膜内部与外部之间的物质的传输交换。

可选地，保护膜20可以为磷脂分子层、磷脂交联分子层、细胞膜碎片层或脂质层。由于细胞膜具有磷脂分子结构，在细胞10的细胞膜表面包覆磷脂分子层，磷脂分子层可以为磷脂双分子层，有利于保护膜20与细胞膜的结合；磷脂交联分子层可以为通过化合物将两层磷脂分子层交联形成的分子层；可以利用同种细胞或其他细胞的细胞膜的碎片来包覆细胞10的细胞膜的表面，比如，可以利用同种的植物细胞的细胞膜的碎片来包覆细胞10的细胞膜表面，增强保护膜20与细胞膜的相容性；在细胞10的细胞膜表面可以包覆脂质层，脂质层易于与细胞膜结合。

可选地，细胞10为去除细胞壁的植物细胞。植物细胞形态不规则，尺寸分布宽，且细胞壁刚性强，影响检测，植物细胞研究过程中会先去除细胞壁，而质膜在微流控液滴生成试剂中受到表面活性剂的影响破裂，在单细胞分析前就导致细胞死亡和内容物泄露。通过在去除细胞壁的植物细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜20可以有效保护细胞膜，防止质膜在微流控液滴生成过程中破裂。

可选地，细胞10可以为单细胞。由于各细胞群体之间存在异质性，通过对细胞群体分析获得的均值掩盖了单个细胞之间的差异，不能表征基因表达的随机性本质，通过一个细胞的检测分析可以获取单个细胞之间的差异。

可选地，保护膜20的外表面具有亲水基团和/或疏水基团。比如，保护膜20的外表面可以具有疏水基团，便于在保护膜20的外表面形成油相的液膜30；保护膜20的外表面可以具有亲水基团，便于在保护膜20的外表面形成水相的液膜30。

本发明实施例提供一种封装细胞的制备方法，包括：

提供细胞10；细胞10可以为去除细胞壁的植物细胞，细胞10可以为一个细胞；

在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜20。

通过上述方法可以制备细胞膜的外表面包覆保护膜20的细胞，保护膜20包覆在细胞10的细胞膜的外表面，比如，可以在单个已经去除细胞壁的植物细胞的细胞膜外表面包覆保护膜20，通过保护膜20可以保护细胞10的细胞膜，使得细胞膜不容易被损伤，通过微流控通道使每个微滴中包含细胞的过程中，使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂，避免在单细胞分析前导致细胞死亡和内容物泄露，保证细胞分析结果的准确性和可靠性。

在一些实施例中，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤之后，还可以包括：

在保护膜20的外表面包覆液膜30。

可以通过微流控通道使细胞表面包覆液膜30，液膜30可以为油相膜或水相膜，保护膜20的外表面可以具有疏水基团，便于在保护膜20的外表面形成油相的液膜30；保护膜20的外表面可以具有亲水基团，便于在保护膜20的外表面形成水相的液膜30，由于保护膜20的存在，可以使得细胞保持完好，防止质膜在微流控液滴生成过程中受到试剂的影响破裂。在应用过程中，通过保护膜20可以对植物细胞质膜进行保护加固，再通过使用微流控芯片和液滴生成技术，将单个细胞及后续反应试剂包封在“油包水”的液滴中，其中，连续相可以为油，分散相可以为水，并通过表面活性剂稳定，构成细胞分选的液滴载体，同时也构成了对单个植物细胞生化反应的微反应器。

如图2所示，提供细胞10，细胞10可以为去除细胞壁的植物细胞，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜20，在保护膜20的外表面包覆液膜30，对形成液膜的细胞进行分选，然后对分选出的单细胞进行分析。

如图6所示，可以利用十字形微流控通道，将包裹保护膜20后的植物细胞10注入，形成油包水液滴，在保护膜20的外表面包覆液膜30。

在另一些实施例中，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤可以包括：

在细胞10的细胞膜的外表面形成第一化合物层，第一化合物具有第一基团和第二基团，所述第一基团与细胞10的细胞膜连接；

将具有第三基团的第二化合物与第一化合物连接，其中，第二基团与第三基团连接。

其中，第一基团可以包括正电型基团，例如氨基，便于第一基团与细胞10的细胞膜的吸附连接，第二基团与第三基团连接，第二基团与第三基团可以通过化学键连接，比如，第二基团可以包括C＝C双键，第三基团可以包括巯基或羟基，通过第二基团与第三基团的连接可以使得第一化合物和第二化合物形成膜层，对细胞10的细胞膜具有保护作用。

在一些实施例中，将具有第三基团的第二化合物与所述第一化合物连接的步骤包括：

将第二化合物与第一化合物通过具有第四基团与第五基团的第三化合物连接；其中，所述第二基团与所述第四基团连接，所述第三基团与所述第五基团。第二基团与第三基团可以通过第三化合物连接，第三化合物具有第四基团与第五基团，第二基团与第四基团连接，第三基团与第五基团连接。比如，第二基团可以包括C＝C双键，第三基团可以包括C＝C双键，第四基团与第五基团可以包括巯基或羟基，第二基团与第三基团可以通过第三化合物连接，通过第二基团与第四基团的连接以及第三基团与第五基团的连接可以使得第一化合物和第二化合物形成膜层，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜20，通过保护膜20可以对细胞10的细胞膜具有保护作用，防止细胞膜损坏。

在本发明的实施例中，如图3所示，保护膜20可以为磷脂交联分子层，比如磷脂交联双分子层。首先，可以用磷脂吸附在细胞10(去除细胞壁的植物细胞)的细胞膜表面，磷脂满足以下条件：头基可以为正电型基团，例如氨基，双尾链可以为不饱和尾链，例如C＝C双键；待头基在细胞膜的表面吸附稳定后，再加入大量同类磷脂水化，在细胞10的细胞膜的表面形成双层磷脂结构；利用点击化学反应，利用双硫醇SH-----SH试剂，例如，可以选择双巯基乙酸乙二醇酯，使得巯基与磷脂上的C＝C双键反应，将磷脂交联稳定，形成核为去除细胞壁的植物细胞，壳为磷脂交联双分子层结构，磷脂交联双分子层可以作为保护膜20，对细胞膜具有保护作用，防止细胞膜损坏。

在本发明的实施例中，在细胞10的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤可以包括：

获取细胞膜碎片或脂质；

在细胞10的细胞膜的外表面包覆细胞膜碎片层或脂质层。

可以利用同种细胞或其他细胞的细胞膜的碎片来包覆细胞10的细胞膜的表面，比如，细胞10可以为去除细胞壁的植物细胞，可以利用同种的植物细胞的细胞膜的碎片来包覆细胞10的细胞膜表面，增强保护膜20与细胞膜的相容性；在细胞10的细胞膜表面可以包覆脂质层，脂质层易于与细胞膜结合。

如图5所示，可以利用同种细胞或其他细胞的细胞膜的碎片、脂质体沉积在微孔筛板40上，微孔筛板40表面具有亲水性，筛孔尺寸可以略大于待包封的细胞10(去除细胞壁的植物细胞)；利用压力将植物细胞慢慢挤压过微孔筛板40，令细胞膜碎片或脂质体碎片包裹在植物细胞表面，反复多次可以使包裹较完整，进而在细胞10的细胞膜的外表面包覆细胞膜碎片层或脂质层，细胞膜碎片层或脂质层作为保护膜20。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本发明的保护之内。

Claims (16)

1.一种封装细胞，其特征在于，包括：

细胞；

保护膜，所述保护膜包覆在所述细胞的细胞膜的外表面。

2.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，还包括：

液膜，所述液膜包覆在所述保护膜的外表面。

3.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，所述保护膜中包括：

第一化合物，所述第一化合物具有第一基团和第二基团；

第二化合物，所述第二化合物具有第三基团，所述第一基团与所述细胞的细胞膜连接，所述第二基团与所述第三基团连接。

4.根据权利要求3所述的封装细胞，其特征在于，所述第二基团与所述第三基团通过第三化合物连接，所述第三化合物具有第四基团与第五基团，所述第二基团与所述第四基团连接，所述第三基团与所述第五基团连接。

5.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，所述保护膜中包括聚合物层。

6.根据权利要求5所述的封装细胞，其特征在于，所述聚合物层中具有亲水基团和/或疏水基团。

7.根据权利要求5所述的封装细胞，其特征在于，所述聚合物层由同一单体聚合形成，所述单体中具有连接基团，所述连接基团与所述细胞的细胞膜连接。

8.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，在所述保护膜的厚度方向上依次具有亲水性结构、疏水性结构和亲水性结构；和/或

所述保护膜为网状的交联结构。

9.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，所述保护膜为磷脂分子层、磷脂交联分子层、细胞膜碎片层或脂质层。

10.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，所述细胞为去除细胞壁的植物细胞；和/或

所述细胞为单细胞。

11.根据权利要求1所述的封装细胞，其特征在于，所述保护膜的外表面具有亲水基团和/或疏水基团。

12.一种封装细胞的制备方法，其特征在于，包括：

提供细胞；

在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤之后，还包括：

在所述保护膜的外表面包覆液膜。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤包括：

在所述细胞的细胞膜的外表面形成第一化合物层，第一化合物具有第一基团和第二基团，所述第一基团与所述细胞的细胞膜连接；

将具有第三基团的第二化合物与所述第一化合物连接，其中，所述第二基团与所述第三基团连接。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，将具有第三基团的第二化合物与所述第一化合物连接的步骤包括：

将第二化合物与第一化合物通过具有第四基团与第五基团的第三化合物连接；其中，所述第二基团与所述第四基团连接，所述第三基团与所述第五基团连接。

16.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在所述细胞的细胞膜的外表面包覆保护膜的步骤包括：

获取细胞膜碎片或脂质；

在所述细胞的细胞膜的外表面包覆细胞膜碎片层或脂质层。

Images