CN111718836A - 一种用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，自上而下依次堆叠设置上流道层、滤膜层、下流道层，采用微孔滤膜技术对样本液中的稀有细胞进行富集，采用液滴技术对富集细胞进行封装，采用介电泳技术对液滴提纯分选，本发明集成有细胞滤选、反向冲洗、单细胞液滴封装和介电泳分选功能，实现了样本中稀有细胞的高纯度单细胞自动封装一体化，可以直接用于后续单细胞操控与分析。

Description

一种用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片
技术领域
本发明涉及生物样本处理技术，具体涉及一种用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片。
背景技术
近十年来，面向生物样本处理应用的微流控技术迅速发展。微流控芯片也称“芯片实验室”，能够有效克服传统医疗器械设备体积大、反应时间长、样本消耗多等弊端，将生物样本的制备、处理、传输等功能集成到一个微小的芯片上，在基础研究、病理诊断、辅助治疗等领域得到广泛的应用。在微流控芯片中，生物亲和技术、微孔滤膜过滤、液滴技术、流体惯性操控、介电泳操控、磁操控、声波操控等多种技术被应用于稀有细胞获取与封装中。其中，微孔滤膜过滤技术基于稀有细胞与背景细胞尺寸及变形性差异，实现稀有细胞的富集与获取，具备非标记、通量大、结构简单、易于集成的优势。液滴技术是一种微小体积液体操控技术，每个液滴可以作为一个微反应器，实现生物样本的反应与检测，具备操作灵活、特异性强、灵敏性高的优势。
目前面向稀有细胞处理的微流控芯片大多局限在细胞分选层面，还不能够在一块微流控芯片上集成实现稀有细胞的分选及单细胞封装功能集成。导致稀有细胞的应用局限在计数层面，难以实现后续的单细胞操控与分析。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种集成有细胞滤选、反向冲洗、单细胞液滴封装和介电泳分选功能的，能够实现样本中稀有细胞的高纯度单细胞自动封装一体化，可以直接用于后续单细胞操控与分析的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片。
技术方案：本发明的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，自上而下依次堆叠设置上流道层、滤膜层、下流道层，所述上流道层设置有连续相液入口、样品液入口、染色液入口、反向冲洗液入口，所述样品液入口、染色液入口分别连通滤选匀流流道，滤选匀流流道连通液滴生成十字通道，所述滤膜层设置有微孔滤膜微孔滤膜对样品液中的稀有细胞进行富集；所述下流道层设置有反向冲洗液流道和冲洗匀流流道，所述反向冲洗液入口连通反向冲洗液流道，反向冲洗液流道连通冲洗匀流流道，滤选匀流流道、微孔滤膜、冲洗匀流流道的中心处于同一直线上；反向冲洗液经冲洗匀流流道对微孔滤膜进行反向冲洗，将微孔滤膜上富集的稀有细胞冲洗至液滴生成十字通道；所述连续相液入口连通连续相液流道，所述连续相液流道分成两路从液滴生成十字通道的两侧接入，液滴生成十字通道将稀有细胞封装成液滴；液滴生成十字通道连通介电泳分选Y形流道，介电泳分选Y形流道对液滴进行提纯分选。
所述上流道层还设置有第一导电液入口和第二导电液入口，所述第一导电液入口连通第一电极流道，第一电极流道接入第一导电液出口；所述第二导电液入口连通第二电极流道，第二电极流道接入第二导电液出口。
所述介电泳分选Y形流道的入口处设置光学传感器对准标，通过光学传感器对准标对液滴内稀有细胞的颜色进行识别并触发第一电极流道或第二电极流道信号通断；实现液滴的分选。
所述上流道层还设置有有效液滴出口和无效液滴出口，所述有效液滴出口通过第一分选支流道连通介电泳分选Y形流道；所述无效液滴出口通过第二分选支流道连通介电泳分选Y形流道。
所述滤选匀流流道、冲洗匀流流道均由外圈环形与多个环形阵列的支流道构成；这样设置能够使样品液或者反向冲洗液能够与微孔滤膜充分接触，还能避免局部冲击损坏微孔滤膜的结构。
所述上流道层还设置有滤选废液出口，所述下流道层设置有滤选废液流道，滤选废液出口与滤选废液流道连通，滤选废液流道与冲洗匀流流道连通；能够将废液排出。
所述述上流道层与滤膜层之间通过上流道底板层连接；所述滤膜层与下流道层之间通过下流道盖板层连接。
所述微孔滤膜外同心设置滤膜外圈，将微孔滤膜设置在其中，保护微孔滤膜因挤压发生损坏。
所述上流道层和下流道层为聚二甲基硅氧烷PDMS、硅胶、塑料、玻璃材料中一种或几种。
所述微孔滤膜为硅、聚二甲基硅氧烷PDMS、SU-8光刻胶、聚碳酸酯材料中的一种。
有益效果：本发明与现有技术相比，其有益效果在于：(1)集成有细胞滤选、反向冲洗、单细胞液滴封装和介电泳分选功能，能够一体化实现样本中稀有细胞获取与单细胞封装，从而获得高纯度的单细胞液滴；(2)可以直接用于后续单细胞操控与分析。
附图说明
图1为本发明所述微流控芯片的爆炸示意图；
图2为本发明中上流道层的结构示意图；
图3为本发明中上流道底板层结构示意图；
图4为本发明中滤膜层的结构示意图；
图5为本发明中下流道盖板层的结构示意图；
图6为本发明中下流道层结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步详细介绍。
如图1所示，本发明包括自上而下依次堆叠设置的上流道层1、上流道底板层2、滤膜层3、下流道盖板层4、下流道层5，本实施例中，上流道层1和下流道层5为聚二甲基硅氧烷PDMS、硅胶、塑料、玻璃材料中一种或几种。上流道底板层2和下流道盖板层4为双面胶。如图3所示，上流道层1设置有连续相液入口101、样品液入口102、染色液入口103、有效液滴出口104、无效液滴出口105、反向冲洗液入口106、滤选废液出口107、第一导电液入口108、第二导电液入口109、第一导电液出口110、第二导电液出口111、连续相液流道112、滤选匀流流道113、液滴生成十字通道114、介电泳分选Y形流道115、第一分选支流道116、第二分选支流道117、第一电极流道118、第二电极流道119、光学传感器120；连续相液入口101连通连续相液流道112，连续相液流道112分两路从液滴生成十字通道114的两侧接入。两路连续相液流道112形成一个闭环流道，样品液入口102、染色液入口103、滤选匀流流道113均位于闭环流道内圈，样品液入口102、染色液入口103分别连通滤选匀流流道113，滤选匀流流道113连通液滴生成十字通道114的左通道，液滴生成十字通道114的右通道连通介电泳分选Y形流道115，液滴生成十字通道114将稀有细胞封装成液滴后，再经过介电泳分选Y形流道115对液滴进行提纯分选。在本实施例中，滤选匀流流道113的结构是由外圈环形与多个环形阵列的支流道构成。
如图2所示，有效液滴出口104通过第一分选支流道116连通介电泳分选Y形流道115；无效液滴出口105通过第二分选支流道117连通介电泳分选Y形流道115。第一导电液入口108连通第一电极流道118，第一电极流道118接入第一导电液出口110；第二导电液入口109连通第二电极流道119，第二电极流道119接入第二导电液出口111，第一电极流道118、第二电极流道119与液体流道不相连，相距10-50微米。
光学传感器120设置在介电泳分选Y形流道115的入口处，用于对液滴内稀有细胞的颜色进行识别并触发第一电极流道118或第二电极流道119信号通断。当无效液滴通过时，光学传感器120触发第一导电液中的第一级电极工作，无效液滴流入第二分选支流道117并由无效液滴出口105流出。当有效液滴通过时，光学传感器120触发第二导电液中的第二级电极工作，有效液滴流入第一分选支流道116并由有效液滴出口104，直至完成液滴的分选。
如图3所示，上流道底板层2设置有反相冲洗液上通孔201、滤液上通孔202、滤选废液上通孔203。反相冲洗液上通孔201与上流道层1中的反向冲洗液入口106连通，用于流通反向冲洗液。滤液上通孔202与上流道层1中的滤选匀流流道113连通，用于向下流通过滤后的样品液以及反向冲洗时反向冲洗液向上层流动。滤选废液上通孔203与上流道层1中的滤选废液出口107连通，用于向外排放废液。
如图4所示，滤膜层3设置有滤膜外圈301、微孔滤膜302。滤膜外圈301与微孔滤膜302同心设置，且将滤膜外圈301设置在外围，滤膜外圈301用于保护微孔滤膜302不受破坏。微孔滤膜302位于滤选匀流流道113的正下方，且与滤液上通孔202连通，样本液从样品液入口102进入滤选匀流流道113，样本液经微孔滤膜302过滤后，样品液中的稀有细胞富集于微孔滤膜302上表面。在本实施例中，微孔滤膜302为硅、聚二甲基硅氧烷PDMS、SU-8光刻胶、聚碳酸酯材料中的一种。
如图5所示，下流道盖板层4设置有反相冲洗液下通孔401、滤液下通孔402、滤选废液下通孔403。反相冲洗液下通孔401与上流道底板层2中的反相冲洗液上通孔201连通，用于通过反向冲洗液。滤液下通孔402与上流道底板层2中的滤液上通孔202连通，用于通过滤液。此外，滤膜外圈301的直径要大于滤液上通孔202、滤液下通孔402的直径，防止过滤时样品液外漏，影响实验结果。滤选废液下通孔403与上流道底板层2中的滤选废液上通孔203连通。
如图6所示，下流道层5设置有反向冲洗液流道501、冲洗匀流流道502、滤选废液流道503，反向冲洗液入口106连通反向冲洗液流道501，反向冲洗液流道501连通冲洗匀流流道502，滤选匀流流道113、微孔滤膜302、冲洗匀流流道502的中心处于同一直线上。滤选废液流道503连通滤选废液下通孔403。反向冲洗液经冲洗匀流流道502对微孔滤膜302进行反向冲洗，将微孔滤膜302上富集的稀有细胞冲洗至液滴生成十字通道114。
制备上述芯片时，反向冲洗液入口106分别与反相冲洗液上通孔201、反相冲洗液下通孔401、反向冲洗液流道501的入口处对准，确保反向冲洗液能够全部流入反向冲洗液流道501。滤选匀流流道113分别与滤液上通孔202、微孔滤膜302、滤液下通孔402、冲洗匀流流道502对准，确保反向冲洗液能够流入滤选匀流流道113。滤选废液出口107分别与滤选废液上通孔203、滤选废液下通孔403、滤选废液流道503的出口对准，确保废弃的滤液能够被排出去。
使用时，首先样本液由样品液入口102流入，经滤选匀流流道113匀流后样本液中的稀有细胞随样本液均匀流入微孔滤膜302，经微孔滤膜302过滤，富集在稀有细胞微孔滤膜302上表面；其次，缓冲液经样品液入口102流入，对微孔滤膜302的表面进行冲洗，提高稀有细胞纯度；然后，染色液从染色液入口103流入，经过滤选匀流流道113后到达微孔滤膜302，染色液对微孔滤膜302上表面的稀有细胞进行特异性染色；接着，反向冲洗液从反向冲洗液入口106依次流入反相冲洗液上通孔201、反相冲洗液下通孔401、反向冲洗液流道501、冲洗匀流流道502、滤液下通孔402、微孔滤膜302，反向冲洗液对微孔滤膜302进行反向冲洗，将微孔滤膜302上表面的稀有细胞冲洗至液滴生成十字通道114，连续相液体从连续相液入口101经连续相液流道112到达液滴生成十字通道114，稀有细胞在连续相液体的夹流作用下形成单细胞液滴；最后，介电泳分选Y形流道115对液滴进行提纯分选，通过介电泳分选Y形流道115入口处的光学传感器120对液滴内细胞的颜色进行识别并触发电极流道通断，当无效液滴通过时，光学传感器120触发第一导电液中的第一级电极工作，无效液滴流入第二分选支流道117并由无效液滴出口105流出；当有效液滴通过时，光学传感器120触发第二导电液中的第二级电极工作，有效液滴流入第一分选支流道116并由有效液滴出口104，直至完成液滴的分选。

Claims (10)

1.一种用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：自上而下依次堆叠设置上流道层(1)、滤膜层(3)、下流道层(5)，所述上流道层(1)设置有连续相液入口(101)、样品液入口(102)、染色液入口(103)、反向冲洗液入口(106)，所述样品液入口(102)、染色液入口(103)分别连通滤选匀流流道(113)，滤选匀流流道(113)连通液滴生成十字通道(114)，所述滤膜层(3)设置有微孔滤膜(302)，微孔滤膜(302)对样品液中的稀有细胞进行富集；
所述下流道层(5)设置有反向冲洗液流道(501)和冲洗匀流流道(502)，所述反向冲洗液入口(106)连通反向冲洗液流道(501)，反向冲洗液流道(501)连通冲洗匀流流道(502)，滤选匀流流道(113)、微孔滤膜(302)、冲洗匀流流道(502)的中心处于同一直线上；反向冲洗液经冲洗匀流流道(502)对微孔滤膜(302)进行反向冲洗，将微孔滤膜(302)上富集的稀有细胞冲洗至液滴生成十字通道(114)；
所述连续相液入口(101)连通连续相液流道(112)，所述连续相液流道(112)分成两路从液滴生成十字通道(114)的两侧接入，液滴生成十字通道(114)将稀有细胞封装成液滴；液滴生成十字通道(114)连通介电泳分选Y形流道(115)，介电泳分选Y形流道(115)对液滴进行提纯分选。
2.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述上流道层(1)还设置有第一导电液入口(108)和第二导电液入口(109)，所述第一导电液入口(108)连通第一电极流道(118)，第一电极流道(118)接入第一导电液出口(110)；所述第二导电液入口(109)连通第二电极流道(119)，第二电极流道(119)接入第二导电液出口(111)。
3.根据权利要求2所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述介电泳分选Y形流道(115)的入口处设置光学传感器对准标(120)，通过光学传感器对准标(120)对液滴内稀有细胞的颜色进行识别并触发第一电极流道(118)或第二电极流道(119)信号通断。
4.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述上流道层(1)还设置有有效液滴出口(104)和无效液滴出口(105)，所述有效液滴出口(104)通过第一分选支流道(116)连通介电泳分选Y形流道(115)；所述无效液滴出口(105)通过第二分选支流道(117)连通介电泳分选Y形流道(115)。
5.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述滤选匀流流道(113)、冲洗匀流流道(502)均由外圈环形与多个环形阵列的支流道构成。
6.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述上流道层(1)还设置有滤选废液出口(107)，所述下流道层(5)设置有滤选废液流道(503)，滤选废液出口(107)与滤选废液流道(503)连通，滤选废液流道(503)与冲洗匀流流道(502)连通。
7.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述述上流道层(1)与滤膜层(3)之间通过上流道底板层(2)连接；所述滤膜层(3)与下流道层(5)之间通过下流道盖板层(4)连接。
8.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述微孔滤膜(302)外同心设置滤膜外圈(301)。
9.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述上流道层(1)和下流道层(5)为聚二甲基硅氧烷PDMS、硅胶、塑料、玻璃材料中一种或几种。
10.根据权利要求1所述的用于稀有细胞获取与单细胞封装的微流控芯片，其特征在于：所述微孔滤膜(302)为硅、聚二甲基硅氧烷PDMS、SU-8光刻胶、聚碳酸酯材料中的一种。
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