CN111647594B - 一种用于水环境dna富集的滤膜组件、收集器及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于水环境DNA富集的滤膜组件、收集器及应用方法，属于环境DNA检测技术领域。所述滤膜组件包括：至少两层由上到下依次层叠设置的滤膜，按照由上到下的次序，各层滤膜的滤孔孔径任意选择性的呈线性减小或阶梯式减小；上下相邻的两层滤膜之间保持一定空隙，上下相邻的两层滤膜之间的滤孔呈交错状设置。利用本发明提供的滤膜组件进行水环境DNA富集，可以实现水样中生物样品的梯度过滤，避免滤膜的堵塞，进而增大滤膜的过滤量，提高水样的过滤通量和过滤效率，还能提高后续DNA的提取效率。

Description

一种用于水环境DNA富集的滤膜组件、收集器及应用方法

技术领域

本发明属于环境DNA检测技术领域，更具体地说，涉及一种用于水环境DNA富集的滤膜组件、收集器及应用方法。

背景技术

物种分布，物种丰富度情况是淡水生态系统物种多样性研究的主要问题，对于实施生物多样性保护措施起到至关重要的作用。从物种生存环境中获取DNA来反映物种分布，丰度等信息，是一种非侵入、快速的物种检测手段。随着高通量测序技术的快速发展，基于环境DNA和分子生物学技术(eDNA宏条形码技术)的物种多样性研究方法开始越来越多的应用到水生态健康评价中，由此显著提高了我们对生态系统物种多样性的认识水平。比如Ficetda等研究者(Species detection using environmental DNA from water samples[J]Biol Lett,2008,4(4):432-435)利用环境DNA检测方法，检测了天然池塘中入侵物种美国牛蛙的存在情况。

物种丰富度的考察基于环境DNA浓度，环境DNA浓度不仅受DNA的释放和降解过程的影响，同时还受环境DNA提取方法和水样本体积的影响。eDNA宏条形码技术主要是以获取受纳水体中的浮游生物(包括植物体、动物体、微生物体以及不同尺寸的生物体)、水样中的悬浮颗粒物等为基础，来检测环境DNA，因此，环境DNA富集是开展环境基因组学研究的基础，水环境中各类DNA的富集效率直接影响后续环境基因组学研究效率及结果的可靠性。

目前，对水环境DNA的富集主要采用微孔滤膜过滤的方式。比如，申请号201610577046.9，申请日2016.07.20的中国发明专利申请文件中公开了一种滤膜组件及具有其的过滤装置，滤膜组件包括：至少两个滤膜，至少两个滤膜上、下依次层叠设置，位于上层的滤膜的滤孔的孔径大于位于其下层的滤膜的滤孔的孔径；其中，位于最下层的滤膜的滤孔孔径为0.45μm。该申请案的滤膜组件虽然一定程度上解决了现有技术中的滤膜不能准确检测水中的悬浮固体含量的问题。但对于浊度大、藻类密度大、污染严重的水体，上述装置在样品的过滤富集过程中存在以下问题：1)过滤速度慢、通量低；2)易发生滤膜堵塞；3)影响受纳水体中的浮游生物的采集准确性，进而影响检测结果的可靠性。

因此，开发一种新型的水环境DNA富集滤膜组件、收集器，改进采样技术，对于提高分析监测质量是极其重要的。反之，如果采样失误，后续的分析过程将丧失意义，甚至造成巨大浪费。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有水环境DNA富集滤膜，在过滤富集过程中易发生滤膜易堵塞，过滤速度慢、通量低的问题，本发明通过使上下相邻的两层滤膜之间保持一定空隙，可以避免由于滤膜之间的层叠导致的有效过滤面积的损失及滤孔的堵塞；从而有效解决过滤通量低及堵塞的问题。

进一步的，本发明通过在相邻两层滤膜之间的空隙内填充若干数量的微球，微球在空隙内自由移动，既可以通过微球使堵塞在滤孔中的物质被挤出，防止堵塞，又可以使微球对滤膜起到支撑和导流的作用，保证过滤通量同时防止堵塞，在后续的DNA提取过程中还可以使DNA有效释放，提高DNA提取效率。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于水环境DNA富集的滤膜组件，所述滤膜组件包括：

至少两层由上到下依次层叠设置的滤膜，按照由上到下的次序，各层滤膜的滤孔孔径呈线性减小或阶梯式减小；上下相邻的两层滤膜之间保持一定空隙；

优选的，所述上下相邻的两层滤膜之间的空隙内填充有若干数量的微球，所述微球可在空隙内自由移动。

优选的，所述相邻两层滤膜之间的滤孔呈交错状设置。

优选的，所述相邻两层滤膜之间的边缘通过黏胶剂进行黏合，形成滤膜黏合边缘，从而防止微球掉落，实现微球的固定。

优选的，所述黏胶剂为压力敏感型胶粘剂。

优选的，所述上下相邻的两层滤膜之间的空隙内至少填充有两种不同粒径的微球。

优选的，所述相邻的两层滤膜之间的微球的填充体积为15～30％。

优选的，所述微球为二氧化硅或者氧化锆微珠，所述微球的粒径为2～5mm。

优选的，每上、下相邻的两层滤膜中，位于上层滤膜的滤孔孔径大于位于下层滤膜的滤孔孔径；

优选的，所述滤膜组件包括上、中、下三层，上层滤膜的滤孔孔径为20～100μm；中层滤膜的滤孔孔径为5～20μm；下层滤膜的滤孔孔径为0.2～1μm。

优选的，本发明提供了一种用于水环境DNA富集的收集器，所述的收集器包括上座体、中座体以及下座体；所述的上座体与中座体卡合连接形成上腔室，所述的中座体与下座体卡合连接形成下腔室，上下腔室之间安装有所述的滤膜组件。

优选的，利用上述滤膜组件进行水环境DNA富集及提取的方法，具体步骤如下：

1)将滤膜组件安装于收集器或独立的使用；

2)在负压条件下进行水样的收集，收集的水样由滤膜组件的上层进入，下层流出进行过滤，过程中微球支撑上、下相邻的两层滤膜，同时对流经的水体形成导流，且微球可在滤膜之间的空隙内自由移动，使微球与微球之间、微球与滤膜之间产生相互碰撞、摩擦；过滤过程中所述水环境中的DNA富集至滤膜组件；水样过滤完成后，将滤膜组件取出，进行水环境DNA的提取；

2)将滤膜组件置于装有裂解液的无菌管中，在振荡均质仪中进行振荡、破碎，过程中滤膜空隙中的微球之间、微球与滤膜之间相互碰撞、摩擦，使生物DNA充分释放。

优选的，本发明中提供了一种水环境DNA富集采集装置，所述采集装置包括负压隔膜泵、安装有滤膜组件的收集器，所述负压隔膜泵通过管道与收集器的出水口相连通，同时所述收集器的进水口处连接有进水管。

按照本发明的工作原理，上述滤膜组件、富集器以及DNA富集采集装置同样可以用于其他生物样品(如RNA等)的采集和提取。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件，由上到下依次层叠有若干层滤膜，且滤孔孔径逐渐变小，使用时水样通过的滤膜孔径也逐渐变小，一方面，可以实现水样中生物样品的梯度过滤，另一方面，尺寸相对较大的生物及颗粒物被上层的大孔滤膜拦截，可在一定程度上避免下层滤膜的堵塞，进而增大下层滤膜的过滤量，提高水样的过滤通量和过滤效率；同时，上下相邻的两层滤膜之间保持一定空隙，可以避免由于滤膜之间的层叠导致的有效过滤面积的损失及滤孔的堵塞；从而有效解决过滤通量低及堵塞的问题。

(2)本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件，上下相邻的两层滤膜之间保持一定空隙且滤孔呈交错状设置，可以保证即使上层滤膜的滤孔发生堵塞现象，也不会累计下层滤膜地滤孔，本发明在上下相邻的两层滤膜保持一定空隙的基础上通过滤孔的设置进一步地避免下层滤膜的堵塞，保证下层滤膜的过滤量，进一步保证水样的过滤通量和过滤效率。

(3)本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件，在上下相邻的两层滤膜空隙之间填充有若干数量的微球，且微球可在空隙之间自由移动，其作用如下：

其一，微球可在空隙之间自由移动，过滤过程中微球之间、微球与滤膜之间会产生碰撞、摩擦等相对运动，使原本堵塞在滤孔中的物质被挤出，大大降低各层滤膜的堵塞机率；

其二，微球可以在过滤时对滤膜起到支撑和导流的作用，避免相邻滤膜之间发生部分/全部贴合现象的产生，最大限度的避免下层滤膜堵塞的发生(或因上层滤膜的堵塞导致、或因滤膜间的贴合导致)；即使上层滤膜有部分滤孔被堵塞，在微球的支撑作用下水样仍可以通过其他未堵塞滤孔进入微球撑起的空隙内，在微球的导流作用下，水样仍可以在整个下层滤膜进行过滤，最大限度的保证了下层滤膜的有效过滤面积及利用率，是水样的过滤通量和过滤效率的有力保证；

其三，提高滤膜裂解效率，在后续的DNA提取过程中，需要使用振荡均质仪器对滤膜进行振荡破碎，在整个振荡的过程中，滤膜空隙中的微珠之间、微球与滤膜之间均会不断碰撞和摩擦，致使滤膜滤孔中的物质被挤出，或者被碰碎，使得DNA更充分的释放出来，提高裂解的效果，提升DNA的提取率。

(4)本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件，在上下相邻的两层滤膜之间填充有至少两种不同粒径(粒径不一致)的微球，可以有效避免微球之间产生规矩的排列现象，增强使用时微球之间的相对运动，进一步提升使用效果。

(5)本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件，所用微球材质包括二氧化硅或氧化锆，一方面，使用上述材质不会对DNA产生吸附，避免影响检测结果的准确性；另一方面材质坚固不易破碎，且成本低。

(6)本发明提供的用于水环境DNA富集的收集器，安装有上述滤膜组件，相当于同时设有多层级过滤膜，过滤膜按照从进水到出水的方向，孔径从大到小依次递减，可以实现不同规格粒度等级的过滤，并能使水样最大限度地通过收集器，提高DNA富集的工作效率、避免收集器的堵塞。本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件、收集器，结构简单，设计合理，易于制造。

附图说明

图1为本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件的结构示意图；

图2为本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件的局部放大结构示意图；

图3为单层滤膜、普通三层叠加滤膜以及“3D”层叠滤膜在进行水体过滤时最大水体过滤体积图；

图4为本发明提供的用于水环境DNA富集的收集器的结构示意图；

图5为本发明提供的用于水环境DNA富集的收集器的中座体结构示意图；

图6为实验室进行水环境DNA富集的装置结构示意图。

图中：100、滤膜；110、上层滤膜；120、中层滤膜；130、下层滤膜；200、微球；300、滤膜黏合边缘；400收集器；410、上座体；420、中座体；421、第二凸台；422、过水孔；423、第一凹槽；430、下座体；440、滤膜组件；450、进水口；460、出水口；500、蓝口瓶；600、过滤底座；700、过滤量杯；800、洛克负压隔膜泵；900、镊子。

具体实施方式

需要说明的是，当元件被称为“安装”于另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以两元件直接为一体；当一个元件被称为“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能两元件直接为一体。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用的，“呈线性减小”是指各所述“目标”的尺寸均不相同，按文中所述顺序依次减小；“阶梯式减小”是指按文中所述顺序，所述位于前面的若干个“目标”具有相同的尺寸，位于后面的若干个“目标”具有另一相同的尺寸，且所述前面的若干个“目标”的尺寸大于后面若干个“目标”。

如本文所使用的，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用的，“相邻”是指两个结构或元件接近。具体地说，被标识为“相邻”的元件可以邻接或连接。此类元件也可以彼此靠近或接近而不必彼此接触。在一些情况下，接近的精确程度可取决于特定的上下文。

长度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

如图1、图2所示，本发明提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件440包括至少两层由上到下依次层叠设置的滤膜100；且按照由上到下的次序，各层滤膜100的滤孔孔径任意选择性的呈线性减小或阶梯式减小；上下相邻的两层滤膜100之间通过填充一定数量可自由移动的微球200来保持二者之间的空隙，上下相邻的两层滤膜之间的滤孔呈交错状设置。各层滤膜100之间的边缘通过黏胶剂进行黏合，以防治微球洒落。

图4展示了本发明提供的用于水样生物样品富集的收集器400，收集器设有进水口450和出水口460，所述的收集器400包括上座体410、中座体420和下座体430；进水口450设置在上座体410顶端，出水口460设置在下座体430底部。

所述上座体410的下部为腔体，该腔体外侧壁设有第一凸台，所述的中座体420分为上腔体与下腔体，所述上腔体内壁设有第一凹槽423，所述上座体410通过其第一凸台与中座体420的第一凹槽423卡合连接形成上腔室。所述中座体420的下腔体外侧壁设有第二凸台421，所述下座体430腔体内壁设有第二凹槽，所述中座体420通过其第二凸台421与第二凹槽卡合连接形成下腔室。

所述中座体420结构如图5所示，中座体420的上下腔体中间设有过水孔422。所述的上腔室和下腔室之间安装有密封圈以及滤膜组件440。

水体流经收集器400后，水体中的生物样品富集在滤膜组件440上，富集完成后，打开收集器400，用无菌镊子夹出滤膜组件440，装入事先准备好的无菌离心管中(离心管体积2-10毫升均可)。

本发明中提供了一种水环境DNA富集采集装置，所述采集装置包括负压隔膜泵、安装有滤膜组件440的收集器400，所述负压隔膜泵通过管道与收集器400的出水口460相连通，同时所述收集器400的进水口450处也连接有进水管。

实施例1

如图1、2所示，本实施例中提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件440为“3D”层叠滤膜，所述滤膜组件440包括三层由上到下依次层叠设置的滤膜100，各层滤膜之间的边缘(约3mm)通过压力敏感型胶粘剂粘合，形成滤膜黏合边缘300；且按照由上到下的次序，位于上层的滤膜100的滤孔孔径大于位于下层的滤膜100的滤孔孔径，本实施例中所述上层滤膜110的滤孔孔径为20μm；所述中层滤膜120的滤孔孔径为5μm；所述下层滤膜130的滤孔孔径为0.2μm。

上层滤膜110与中层滤膜120之间、中层滤膜120与下层滤膜130之间均填充有粒径为2mm的二氧化硅材质的微球200，上层滤膜110与中层滤膜120之间微球200的填充率为15％，中层滤膜120与下层滤膜130之间微球200的填充率(体积)为30％；

本实施例中的收集器400安装有本实施例中提供的滤膜组件440。

本实施例中，进行水环境DNA富集时，利用现有的水体环境DNA智能采集装置(具体结构及运行原理同专利号CN 209400274U中公开的水体环境DNA智能采集装置及其运行原理)进行，该水体环境DNA智能采集装置中安装有本实施例中提供的收集器400。

本实施例中进行水环境DNA富集方法，具体步骤如下：

1)将滤膜组件440安装于收集器400内；

2)收集器400安装于上述的水体环境DNA智能采集装置中进行水样的收集，收集的水样经由进水管、进水口450进入收集器400，随后流经滤膜组件440，再经由出水口460排出；流经收集器400的水体中的生物样品富集在滤膜组件440上；水样过滤完成后，将收集器400中的滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

在滤膜组件440过滤的过程中，收集的水样由滤膜组件440的上层滤膜110进入，下层滤膜130流出；期间微球200支撑上、下相邻的两层滤膜100，同时对流经的水体形成导流，且微球200可在空隙之间自由移动，使微球200与微球200之间、微球200与滤膜100之间产生相互碰撞、摩擦；水样过滤完成后，将滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

3)富集完成后，打开收集器400，用无菌镊子夹出滤膜组件440，装入事先准备好的、装有裂解液的无菌离心管中(离心管体积2-10毫升均可)，随后将无菌离心管置于振荡均质仪中进行振荡、破碎，过程中滤膜100空隙中的微球200之间、微球200与滤膜100之间相互碰撞、摩擦，使生物DNA充分释放。

实施例2

如图1、2所示，本实施例中提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件440为“3D”层叠滤膜，所述滤膜组件440包括三层由上到下依次层叠设置的滤膜100，各层滤膜之间的边缘(约3mm)通过压力敏感型胶粘剂粘合形成滤膜黏合边缘300；且按照由上到下的次序，位于上层的滤膜100的滤孔孔径大于位于下层的滤膜100的滤孔的孔径，本实施例中所述上层滤膜110的滤孔孔径为100μm；所述中层滤膜120的滤孔孔径为20μm；所述下层滤膜130的滤孔孔径为1μm。

上层滤膜110与中层滤膜120之间、中层滤膜120与下层滤膜130之间均填充有粒径为2mm的氧化锆材质的微球200，上层滤膜110与中层滤膜120之间微球200的填充率为15％，中层滤膜120与下层滤膜130之间微球200的填充率为18％。

本实施例中的收集器400安装有本实施例中提供的滤膜组件440。

本实施例中提供的水环境DNA富集采集装置，包括负压隔膜泵、安装有滤膜组件440的收集器400，所述负压隔膜泵通过管道与收集器400的出水口460相连通，同时所述收集器400的进水口450处也连接有进水管。

本实施例中进行水环境DNA富集方法，具体步骤如下：

1)将滤膜组件440安装于收集器400内；

2)富集采集装置置于采样现场，并将进水管置于需采样的水体中，开启负压隔膜泵，形成负压吸附的条件，水体经由进水管、进水口450进入收集器400，随后流经滤膜组件440，再经由出水口460排出；流经收集器400的水体中的生物样品富集在滤膜组件440上；水样过滤完成后，将收集器400中的滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

在滤膜组件440过滤的过程中，收集的水样由滤膜组件440的上层滤膜110进入，下层滤膜130流出；期间微球200支撑上、下相邻的两层滤膜100，同时对流经的水体形成导流，且微球200可在空隙之间自由移动，使微球200与微球200之间、微球200与滤膜100之间产生相互碰撞、摩擦；水样过滤完成后，将滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

3)富集完成后，打开收集器400，用无菌镊子夹出滤膜组件440，装入事先准备好的、装有裂解液的无菌离心管中(离心管体积2-10毫升均可)，随后将无菌离心管置于振荡均质仪中进行振荡、破碎，过程中滤膜100空隙中的微球200之间、微球200与滤膜100之间相互碰撞、摩擦，使生物DNA充分释放。

实施例3

如图1、2所示，本实施例中提供的用于水环境DNA富集的滤膜组件440为“3D”层叠滤膜，包括三层由上到下依次层叠设置的滤膜100，各层滤膜100之间的边缘(约3mm)通过压力敏感型胶粘剂粘合形成滤膜黏合边缘300；且按照由上到下的次序，位于上层的滤膜100的滤孔孔径大于位于下层的滤膜100的滤孔的孔径。

本实施例中所述上层滤膜110为滤孔孔径100μm的尼龙滤膜；所述中层滤膜120为滤孔孔径为20μm的尼龙滤膜；所述下层滤膜130为滤孔孔径为0.45μm的混合纤维素滤膜。

上层滤膜110与中层滤膜120之间、中层滤膜120与下层滤膜130之间均填充有二氧化硅材质的微球200。其中，上层滤膜110与中层滤膜120之间填充粒径为5mm和3mm的微球200，填充率为15％，其中粒径为5mm的微球与粒径为3mm的微球的数量比例为1：8；中层滤膜120与下层滤膜130之间填充粒径为3mm和1mm的微球200，填充率为18％，其中粒径为3mm的微球与粒径为1mm的微球的数量比例为1：10。

本实施例中的收集器400安装有本实施例中提供的滤膜组件440。

本实施例中提供的水环境DNA富集采集装置，包括负压隔膜泵、安装有滤膜组件440的收集器400，所述负压隔膜泵通过管道与收集器400的出水口460相连通，同时所述收集器400的进水口450处也连接有进水管。

本实施例中进行水环境DNA富集方法，具体步骤如下：

1)将滤膜组件440安装于收集器400内；

2)富集采集装置置于采样现场，并将进水管置于需采样的水体中，开启负压隔膜泵，形成负压吸附的条件，水体经由进水管、进水口450进入收集器400，随后流经滤膜组件440，再经由出水口460排出；流经收集器400的水体中的生物样品富集在滤膜组件440上；水样过滤完成后，将收集器400中的滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

在滤膜组件440过滤的过程中，收集的水样由滤膜组件440的上层滤膜110进入，下层滤膜130流出；期间微球200支撑上、下相邻的两层滤膜100，同时对流经的水体形成导流，且微球200可在空隙之间自由移动，使微球200与微球200之间、微球200与滤膜100之间产生相互碰撞、摩擦；水样过滤完成后，将滤膜组件440取出，进行水环境DNA的提取；

3)富集完成后，打开收集器400，用无菌镊子夹出滤膜组件440，装入事先准备好的、装有裂解液的无菌离心管中(离心管体积2-10毫升均可)，随后将无菌离心管置于振荡均质仪中进行振荡、破碎，过程中滤膜100空隙中的微球200之间、微球200与滤膜100之间相互碰撞、摩擦，使生物DNA充分释放。

对比例1

本对比例中对以下三种滤膜组件的采样能力进行了测试：

一、所述滤膜组件分别为：

1、单层滤膜：滤孔孔径为0.45μm的混合纤维素滤膜；

2、普通三层叠加滤膜：上层为滤孔孔径100μm的尼龙滤膜，中层为滤孔孔径为20μm的尼龙滤膜，下层为滤孔孔径为0.45μm的混合纤维素滤膜；

3、实施例3中的“3D”层叠滤膜。

二、所述测试条件如下：过滤用水采集于九乡河(北纬32.113681，东经118.945127)，采用洛克负压隔膜泵，理论负压为-0.098兆帕。

三、所述测试方法如下：

如图6所示，将过滤底座600旋在1L的蓝口瓶500上，利用镊子900放入滤膜组件并旋紧过滤量杯700固定滤膜组件，加入待采集水样，开启洛克负压隔膜泵800开始过滤直到滤膜组件堵塞为止，堵塞的判断依据是连续5秒没有水滴滴下；最后统计不同滤膜组件的过滤体积。每种滤膜设置5个实验重复，实验结束后去除最大值和最小值，取平均值。

测试结果对比如图3所示，结果表明单层滤膜与普通三层叠加滤膜的过滤体积无明显差别，平均过滤400毫升水样就会堵塞，实施例3中的“3D”层叠滤膜的过滤体积明显高于单层滤膜和普通三层叠加滤膜，平均过滤600毫升水样，过滤体积增加了50％。

对比例2

将对比例1采样后的三种滤膜分别在相同的条件下进行DNA提取。采用OMEGA水样DNA提取试剂盒进行，按照试剂盒操作说明进行操作。简单来说，将滤膜放入5毫升无菌样品管中，加入玻璃珠和裂解液(玻璃珠和裂解液均由OMEGA水样DNA提取试剂盒附带)，用SI公司的斡旋仪在最大转速下震荡5分钟，然后在4000r/min的转速下离心3分钟，利用吸取裂解液进行DNA的提取。

DNA提取后用Qubit 2.0进行定量，并用百泰克的多功能酶标仪测定260/280nm吸光度的比值，以此衡量DNA的纯度。实验结果如下表所示，“3D”层叠滤膜过滤体积更大，提取的DNA浓度要高于单层滤膜和普通三层叠加滤膜。具体的，三种滤膜所提取的DNA浓度及纯度如表1所示。

结果表明，在洗脱体积为100微升的情况下，单层滤膜提取DNA浓度为5.4ng/μL，普通三层叠加滤膜提取DNA浓度为6.3ng/μL，“3D”层叠滤膜提取浓度为9.3ng/μL。且其提取的DNA纯度超过1.7，纯度较高，满足后续实验分析的要求。由此可见，本发明的滤膜组件应用于DNA的富集提取，不仅能够有效防止滤膜堵塞，而且能够提取到质量更高的生物样品。

表1三种滤膜所提取的DNA浓度及纯度

以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种用于水环境DNA富集的滤膜组件，其特征在于：所述滤膜组件包括：

至少三层由上到下依次层叠设置的上层、中层、下层滤膜（100），按照由上到下的次序，各层滤膜（100）的滤孔孔径呈线性减小或阶梯式减小，所述上层滤膜（100）的滤孔孔径为20~100 μm；中层滤膜（100）的滤孔孔径为5~20 μm；下层滤膜（100）的滤孔孔径为0.2~1 μm；上下相邻的两层滤膜（100）之间保持一定空隙；

所述上下相邻的两层滤膜（100）之间的空隙内填充有若干数量的微球（200），所述微球（200）的填充体积为15~30%，所述微球（200）包括二氧化硅或氧化锆微珠，所述微球（200）的粒径为2~5mm，所述微球（200）可在空隙内自由移动。

2.根据权利要求1所述的用于水环境DNA富集的滤膜组件，其特征在于：所述上下相邻的两层滤膜（100）之间的滤孔呈交错状设置。

3.根据权利要求2所述的用于水环境DNA富集的滤膜组件，其特征在于：所述上下相邻两层滤膜（100）之间的边缘通过黏胶剂进行黏合，形成滤膜黏合边缘（300）。

4.根据权利要求3所述的用于水环境DNA富集的滤膜组件，其特征在于：所述上下相邻的两层滤膜（100）之间的空隙内至少填充有两种不同粒径的微球（200）。

5.根据权利要求4所述的用于水环境DNA富集的滤膜组件，其特征在于：所述上下相邻的两层滤膜（100），位于上层滤膜（100）的滤孔孔径大于位于下层滤膜（100）的滤孔孔径；和/或所述黏胶剂为压力敏感型胶粘剂。

6.一种用于水环境DNA富集的收集器，其特征在于：所述收集器包括上座体（410）、中座体（420）以及下座体（430）；所述的上座体（410）与中座体（420）卡合连接形成上腔室，所述的中座体（420）与下座体（430）卡合连接形成下腔室，所述的上下腔室之间安装有权利要求1~5中任意一项所述的用于水环境DNA富集的滤膜组件。

7.一种利用权利要求1~5任意一项所述的滤膜组件进行水环境DNA富集和提取方法，具体步骤如下：

1）在负压条件下，进行水样的收集，收集的水样由滤膜组件（440）的上层进入，下层流出进行过滤，所述微球（200）支撑上、下相邻的两层滤膜（100），同时对流经的水体形成导流，过滤过程中所述水环境中的DNA富集至滤膜组件（440）上；

2）过滤完成后，将滤膜组件（440）取出，进行水环境DNA的提取：将滤膜组件（440）置于装有裂解液的无菌管中，进行振荡、破碎，过程中滤膜空隙中的微球（200）之间、微球（200）与滤膜（100）之间相互碰撞、摩擦，使生物DNA充分释放，进行DNA提取。

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