BR112013016196B1

BR112013016196B1 - Sistema de processo integrado

Info

Publication number: BR112013016196B1
Application number: BR112013016196-5A
Authority: BR
Inventors: Perttu Koskinen; Reijo Tanner
Original assignee: Neste Oil Oyj
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2020-03-03
Also published as: ES2525793T3; AU2011347063A1; EP2468857A1; CA2822330A1; PL2468857T3; MY164576A; CA2822330C; JP5936206B2; WO2012085346A1; CN103348013B; UY33837A; AU2011347063B2; EP2468857B1; JP2014502500A; BR112013016196A2; US8936655B2; PT2468857E; US20120159840A1; CN103348013A

Abstract

sistema de processo integrado a presente invenção se refere a urn processo integrado, o qual compreende urn processo de produção de óleo de única 5 célula, e urn processo industrial de papel e i ou polpa. o processo consiste em que, no processo de produção de óleo de célula única é utilizado urn microrganismo capaz de produção de lípidos ou lípidos e enzimas quando cultivadas num meio compreendendo urn material orgânico a partir do processo industrial de papel e i ou polpa. lipídios ou lípidos e enzimas são produzidos por microrganismos no referido processo de produção de óleo de célula único, e i ou num processo conectado e este. a presente invenção também se relaciona corn o uso de lípidos produzidos no processo corno biocombustível ou corno urn componente de biocombustível ou corno urn material de partida para a produção de biocombustíveis e uso de enzimas produzidas no processo de produção de lípido no processo industrial de papel e i ou polpa ou em outras aplicações corno urna preparação de enzima ou corno urna fonte de enzimas.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: “SISTEMA DE PROCESSO INTEGRADO”.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um sistema de processo integrado, no qual um destes processos é um processo industrial de papel ou celulose, e outro processo é um processo de produção de óleo de célula única (processo de produção de lipídio microbiano). A invenção se refere também a um processo para produzir lipídios de celulose e/ou resíduos da indústria de papel no sistema integrado e de utilização dos lipídios.

Antecedentes da Invenção

Hemicelulose representa uma grande fração relativa em materiais de madeira, sendo tipicamente de 20 a 40% do peso do material de madeira dependendo das espécies de madeira. Em processos de polpação química, tais como celulose Kraft e processos de pasta de dissolução, a madeira é deslenhificada. Além de lignina, hemicelulose é separada em grande parte a partir de celulose no processo de produção de pasta química, e o produto final de celulose contém apenas pequenas quantidades ou nenhuma de hemicelulose, dependendo do processo. Portanto, aproximadamente, metade da madeira é dissolvida em um processo de polpação química. Nos processos de polpação, tais como polpação-Kraft ou polpação por sulfito (dissolução da pasta), a fração de hemicelulose que é separada a partir da pasta é, essencialmente, queimada e não valorizada.

No principal processo de polpação, polpação Kraft (polpação por sulfato ou cozimento), a lignina da madeira e, em parte, hemicelulose são dissolvidas em condições severas em um digestor (cozimento). Os produtos de degradação de hemicelulose no licor resultante (licor negro) são bastante complexos e sua separação e purificação a partir do licor são difíceis e sua adequação para processos microbianos é deficiente. Por essa razão, o licor negro é queimado na caldeira de recuperação para produzir eletricidade e energia térmica. No entanto, hemicelulose tem valor de aquecimento significativamente menor do que a lignina, a combustão de hemiceluloses dissolvidas não constitui uma utilização econômica ideal deste recurso. Portanto, a hemicelulose deve, preferencialmente, ser extraída antes do cozimento para produzir produtos de valor mais elevado. Uma opção para valorizar a hemicelulose é convertê-la em produtos químicos e/ou biocombustíveis (por exemplo, etanol, butanol) por processos microbiológicos. No entanto, esta pré-extração de hemicelulose antes de polpação, não deve diminuir o rendimento ou qualidade da pasta.

Dissolução da pasta (também chamado de dissolução da celulose) é uma pasta de madeira branqueada, que tem um conteúdo de celulose elevado (> 90%). Dissolução da pasta é um grau de pasta química usado como matéria-prima para uma ampla variedade de derivados de celulose, por exemplo, viscose (têxteis), celofane, acetato de celulose e metilcelulose. Dissolução da pasta é feita pelo processo de sulfito ou pelo processo Kraft, com uma fase para extrair as hemiceluloses antes do processo de polpação. A hemicelulose é um subproduto que é largamente desperdiçado nas fábricas atuais, como muitas vezes é queimada nas caldeiras e a maior parte da energia é perdida na forma de calor.

Vários métodos diferentes de pré-extração de hemicelulose antes da produção-Kraft de pasta podem ser aplicados, tal como a extração com água quente pressurizada (tratamento hidrotérmico) e vários métodos organosolv utilizando álcoois (por exemplo, etanol, metanol) e/ou ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido málico, ácido láctico ou ácido peracético), possivelmente suplementados com catalisador ácido, tal como S02. Os métodos podem facilitar a remoção, sobretudo de hemicelulose ou lignina e da fracção de hemicelulose de pasta. Na maioria dos métodos de pré-extração, hemicelulose é obtida pelo menos em parte, na forma oligomérica. Os oligômeros têm de ser hidrolisados a monômeros antes que possam ser convertidos em produtos finais por microrganismos. A conversão dos oligômeros de açúcar na hemicelulose a monômeros de açúcar pode ser realizada por enzimas específicas, tais como as xilanases, arabinases, galactosidases e/ou mannananes dependendo do tipo de hemicelulose (dependendo da espécie de madeira). Estas enzimas são produzidas por certos microrganismos, normalmente, bactérias ou fungos.

Um conceito de biorrefinaria que inclui uma préextração de hemicelulose antes do processo de formação de pasta e a utilização da fração de hemicelulose de etanol ou de produção de produtos químicos tem sido sugerido no estado da técnica. Uma revisão de métodos de pré-extração de hemicelulose é apresentado em Huang e colaboradores (2008) e uma visão geral de biorrefinaria- Kraft-pasta, incluindo pré-extração de hemicelulose por Marinova e colaboradores (2009). A publicação de patente US 20090165968 descreve um método para pré-extrato de hemicelulose antes do processo de Kraft-pasta, o qual aumenta a susceptibilidade de hemicelulose para fermentações biológicas para o etanol e produtos químicos. A produção de etanol a partir de pré-extrato de hemicelulose a partir do processo Kraft-pasta de eucalipto é descrito em Mendes e colaboradores (2010) .

Embora no estado da técnica, tem sido descrito vários métodos através dos quais o material de madeira e, em particular, a hemicelulose pode ser extraída por processos da indústria de celulose, há ainda uma necessidade de novos processos que facilitem o fraccionamento e posterior valorização do material de madeira, em particular, a hemicelulose, para os processos da indústria de celulose.

A degradação e a utilização de material lignocelulósico são importantes também em outras áreas industriais do que nos processos da indústria de celulose. Óleos de célula única têm sido tradicionalmente usados como produtos especiais, por exemplo, em alimentos saudáveis. Tipo semelhante de processo de produção foi também descrito para a produção de lipídios para a produção de biodiesel. No entanto, como o produto é um produto químico de baixo custo, os custos do processo não devem estar ao nível dos custos de processos de produtos especiais. Além disso, o rendimento de lipídios por microrganismos heterotróficos é tipicamente muito baixo, por cento em peso, menos do que 20% do açúcar alimentado, na melhor das hipóteses 22 - 24% a partir de açúcares disponíveis podem ser transformados a óleo. Devido a estas razões, a utilização de matérias primas de baixo custo, como a matéria-prima lignocelulósica, para a produção de óleo é necessário.

Um processo de produção de óleo de célula única usando microrganismos, tipicamente, compreende o cultivo de microrganismos em biorreatores gaseificados permitindo que as células acumulem lipídios, colhendo células ricas em lipídios e óleo de recuperação das células.

A utilização de matéria-prima de celulose para a produção de óleo tem sido sugerida em algumas publicações de patentes recentes. US 2009/0064567 A1 revela a produção de óleos biológicos por fermentação heterotrófica pelo crescimento de microrganismos do reino Stramenopile usando matéria-prima contendo celulose, como fonte principal de carbono. A celulose é hidrolisada por enzimas ou por outros microrganismos capazes de sacarificação de celulose. WO2009/001 1480 A1 revela a produção de óleos biológicos a partir de material celulósico despolimerizado por microalgas e fungos.

A publicação da patente US2009/217569 revela a produção de óleo de célula única a partir de vários lignocelulósicos e de outros materiais hidrolisados, incluindo madeira e pasta e resíduos da indústria de papel para a fabricação de biocombustíveis. O método compreende o tratamento do material de origem, com água, ácido ou álcali e contatar o filtrado ou precipitado com microrganismo produtor de lipídios. O estado da técnica descreve também a produção de lipídios diretamente a partir de açúcares poliméricos em lignocelulose, como xilana por Fall e colaboradores (1984), ou a celulose por Lin Hui e colaboradores (2010) por organismos capazes de produzir celulases ou hemiceluloses.

A hidrólise enzimática é tipicamente realizada em uma etapa separada do processo de produção de biocombustíveis por enzimas comerciais. Tipicamente, as enzimas comerciais são compradas e produzidas fora do processo atual de produção de biocombustíveis. O preço das enzimas é o principal fator de custo na conversão de materiais celulósicos de biocombustíveis por processos microbiológicos.

Sumário da Invenção

É um objetivo da presente invenção proporcionar uma solução para os problemas encontrados no estado da técnica. Especificamente, a presente invenção visa proporcionar uma solução tecnicamente vantajosa para os problemas encontrados na pasta e/ou no processo industrial de papel.

É outro objetivo proporcionar uma solução tecnicamente vantajosa para os problemas encontrados na produção de óleo de célula única em larga escala.

É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar uma solução, a qual permita melhorar a economia de produção de óleo de célula única em larga escala.

É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar uma solução, a qual permita reduzir o impacto ambiental.

A presente invenção visa, especialmente, resolver os problemas relacionados com a fabricação de transporte biocombustível.

Para alcançar esses objetivos, a invenção é caracterizada pelas características que são alcançadas nas reivindicações independentes. Outras reivindicações representam concretizações preferidas da invenção.

O método, de acordo com a invenção, é baseado na constatação de que as correntes laterais de processos de pasta e indústria de papel contém uma quantidade significativa de nutrientes, o que pode servir como fonte de carbono para os microrganismos, em particular, para microrganismos produtores de lipídios.

Tem sido descoberto, surpreendentemente, que o processo de produção de lipídios produz uma quantidade significativa de proteínas, em particular, enzimas. Mais especificamente, em relação com um processo de produção de óleo de célula única, pode ser produzido uma quantidade significativa de enzimas capazes de degradar o material de madeira ou de material orgânico a partir de pasta e/ou da indústria de papel. Na presente invenção verificaram-se que as enzimas produzidas no processo de produção de lipídios podem ser reutilizadas na pasta e/ou processos industrial de papel, tal como nos processos da indústria de pasta, por exemplo, em operações de branqueamento de pasta, pasta de destintagem, o tratamento de material lignocelulósico antes da polpação química, fabricação da pasta de dissolução, descascamento ou processos de modificação de fibras.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um sistema integrado, que compreende um primeiro processo, que é um processo de produção de óleo de célula única, e um segundo processo, o qual é uma pasta / ou processo industrial de papel. No material orgânico do sistema de pasta e/ou da indústria de papel é introduzido no processo de produção de lipídios e, no processo de produção de lipídios é usado um microrganismo capaz de produzir os lipídios ou lipídios e enzimas quando cultivadas em um meio compreendendo um material orgânico a partir de pasta e/ou na indústria de papel. Em uma concretização, lipídios ou lipídios e enzimas são produzidos por microrganismos referidos no processo de produção de óleo de célula única.

Em outra concretização, enzimas sao produzidas em um

processo conectado	ao	processo de	produção de óleo	de
célula única.
A enzima pode	ser	recuperada a	partir da cultura	de
microrganismos, meio	de	cultura gasto	ou sobrenadante.
Tipicamente,	o	sobrenadante	e as células	do

microrganismos são separadas a partir da cultura de microrganismos e os lipídios são recuperados a partir das células do microrganismo. Em várias concretizações da invenção, o sobrenadante ou uma fração enriquecida em proteínas do sobrenadante ou uma diluição do sobrenadante contendo enzimas cataliticamente ativas são recuperadas a partir do processo de produção de lipídios ou a partir de um processo a ele ligado. Em uma concretização, o sobrenadante ou uma fração enriquecida em proteínas do sobrenadante compreendendo enzimas é introduzida a partir do processo de produção de lipídios na pasta e/ou processo industrial de papel.

Em uma concretização da invenção, as enzimas são produzidas em um processo separado do processo de produção de lipídios ou por outro microrganismo diferente do microrganismo produtor de lipídio.

Em uma concretização preferida da invenção, as enzimas e os lipídios são produzidos pelo mesmo microrganismo.

Em uma concretização preferida da invenção, o processo microbiológico de produção de lipídios, utiliza frações ou resíduos de pasta e/ou da indústria de papel, tais como a hemicelulose ou mistura primária, tal como a partir de processos de remoção de tinta ou de pasta, e que produz substâncias úteis, tais como enzimas, para usar na pasta e/ou processos industrial de papel. Simultaneamente, o processo microbiológico produz quantidades substanciais de lipídios que podem ser utilizados para diversos fins, por exemplo, produção de biocombustíveis. O sistema de processo integrado fornece uma maneira, a mais completa utilização e valorização da biomassa lignocelulósica em pasta e/ou processos industriais de papel.

Pasta e/ou indústria de papel pode, potencialmente, produzir maior variedade de produtos secundários valiosos por valorização de correntes laterais do que os processos do estado da técnica e permite vantagens competitivas.

Em resumo, pode concluir-se que a presente invenção oferece vantagens na medida em que:

- A invenção	aqui	descrita	pode	melhorar o	custo-
eficiência de pasta	e/ou	os processos indústrias de	papel.
- Valorização	de	corrente	de	hemicelulos	e pela

produção de resultados de transporte de biocombustíveis em benefícios econômicos. No estado da técnica, polpação-Kraft mói a hemicelulose terminando em licor negro e é queimado.

- A conversão de resíduos que contêm celulose de pasta e/ou da indústria de papel, tais como as misturas primárias provenientes de destintagem, do descasque, do processo de polpação químico, do processo de polpação mecânico ou de um processo de fabricação de papel. A produção de produtos valiosos, tais como lipídios por microrganismos acrescenta valor ao atual processo de tratamento aeróbio e/ou anaeróbio de águas residuais.

- A produção de enzimas necessárias em pasta e/ou processo industrial de papel no local resulta em economia de custos. Ele também reduz a necessidade de estabilização de enzimas, antes da utilização.

- Bioprocessos consolidados para a produção de lipídios (digestão enzimática e fermentação na mesma etapa do processo) diminui o custo e melhora a eficiência em comparação com os processos que caracterizam a hemicelulose dedicada e/ou produção de lipídios e a fase de produção. Reduz os custos, eliminando ou diminuindo a necessidade de comprar enzimas externa.

- Processo de polpação química produz grandes quantidades de energia excedente, principalmente calor. Utilização de excesso de calor do processo de polpação resulta em melhoria da eficiência energética. Por exemplo, o calor do processo de produção de pasta (de combustão de lignina) para concentrar os açúcares na hidrólise de hemicelulose (xarope), para purificar o hidrolisado, ou na recuperação de solventes na recuperação de óleo no processo de produção de lipídios.

- O custo de energia de tratamento de materiais ou materiais compreendendo outra biomassa de carboidrato polimérico lignocelulósico é reduzido pelo uso de enzimas a partir do processo de óleo de célula única em lugar de ou em adição às enzimas comerciais e tratamentos termomecânicos e químico.

- A remoção das proteínas da enzima, a partir do remanescente dos licores provenientes da fermentação da produção de óleo de célula única reduz a carga do consumo de oxigénio biológico do licor de fermentação liberado da produção de óleo de célula única.

- O balanço de carbono de um processo de óleo de célula única é melhorado quando as proteínas enzimáticas, em vez de causar a carga biológica em correntes de processo, são reduzidas ou removidas das águas residuais de fermentação, reutilizada para fins catalíticos ou utilizada como um nutriente no processo de produção de óleo célula de única ou de outros processos biotecnológicos.

Breve Descrição das Figuras

As fig. 1 e 2 mostram esquemas de processo.

A fig. 3 mostra a Xilose liberada no teste de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 200 mg de Xilano de madeira de bétula.

A fig. 4 mostra a Xilose liberada no teste de hidrólise por proteína. Como substrato foi utilizado 200 mg de Xilano de madeira de bétula.

A	fig. 5	mostra a	Xilose	e Xilobiose	liberadas	no
teste	de hidrólise por	volume	de caldo de	cultura. Como
substrato foi	utilizado	200 mg	de Xilano	de madeira	de
bétula	.
A	fig. 6	mostra a	Xilose	e Xilobiose	libertadas	no

teste por hidrólise por proteínas. Como substrato foi utilizado 200 mg de Xilano de madeira de bétula.

A fig. 7 mostra o açúcar liberado (Xilose e Glicose) como % de substrato (500 mg de celulose nativa ou biomassa residual da cultura) durante o teste de hidrólise com 1 ml de solução de Xilanase comercial.

A fig. 8 mostra a Xilose liberada no teste de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 200 mg de Xilano de madeira de bétula.

A fig. 9 mostra a Xilose liberada no teste por hidrólise por proteínas. Como substrato foi utilizado 200 mg de Xilano de madeira de bétula.

A fig. 10 mostra a Glicose liberada no teste de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 1 g de celulose. Algumas Xiloses foram liberadas da hemicelulose proveniente do caldo de cultura utilizado.

A fig. 11 mostra a Glicose liberada no teste de hidrólise por proteína. Como substrato foi utilizado 1 g de celulose. Algumas xiloses foram libertadas da hemicelulose proveniente do caldo de cultura utilizado.

Descrição Detalhada da Invenção

Um processo de produção de óleo de célula única se refere aqui a um processo, que compreende as etapas de formar ou permitir a formação de um microrganismo sintetizador de lipídios e permitindo que a massa de organismo, assim, obtida para produção e/ou armazenamento (acúmulo) de lipídios, recuperando as células a partir da fase líquida, e extraindo ou recuperando os lipídios das células. Conforme descrito aqui mais tarde em diversos grupos de microrganismos, tais como entre as bactérias, arqueobactérias, fungos (fungos filamentosos), leveduras e algas são microrganismos produtores de óleo de célula única, tal como aqui descrito, a presente invenção utiliza, preferencialmente, microrganismos capazes de produzir tanto lipídios quanto enzimas. Um microrganismo se refere, em algumas concretizações da invenção a dois ou mais microrganismos. Em algumas concretizações, as enzimas são produzidas por um microrganismo e o óleo de célula única (lipídios) por outro microrganismo.

O termo óleo de célula única se refere a uma substância gordurosa, cuja molécula contém, tipicamente, como uma parte, uma cadeia de hidrocarboneto alifático, o qual se dissolve em solventes orgânicos não polares, mas é fracamente solúvel em água. Óleos de únicas células é um grupo essencial de moléculas grandes em células vivas. Óleos de únicas células são, por exemplo, os lipídios, as gorduras, ceras, ésteres de cera, esteróis, terpenos, isoprenóides, carotenóides, polihidroxil conoatos, ácidos nucleicos, ácidos graxos, álcoois graxos, aldeídos graxos, ésteres de ácidos graxos, fosfolipídios, glicolipídios, esfingolipídios e glicerídeos, tais como triacil-gliceróis, diacilgliceróis ou monoacilgliceróis.

Óleos de células únicas preferidas na presente invenção são lipídios, gorduras, ceras, glicerídeos e ácidos graxos e seus derivados, em particular, triglicerídeos e ésteres de cera.

No escopo da presente invenção lipídio é utilizado como sinônimo de óleo de célula única.

Processo da indústria de pasta se refere aqui, a um processo destinado à produção de pasta de papel a partir de materiais lignocelulósicos, ou fibras recicladas bem como materiais fibrosos necessários à produção de pasta.

Pasta e/ou a indústria de papel se refere aqui, para o ramo da indústria que produz vários tipos de papel, cartão, papel, papel de jornal, papel higiênico e artigos de cartão, pasta e placas de isolamento e prensada. Pasta e/ou indústria de papel utiliza materiais lignocelulósicos ou fibras recicladas como matéria-prima. A indústria de celulose e/ou papel inclui processos, como a produção de polpação química, polpação mecânico, polpação semi-química, polpação química termomecânica, os processos de reciclagem de fibra e de fabricação de papel.

Polpação química se refere a um processo, em que o material lignocelulósico, tal como madeira ou lascas de madeira são tratadas com os produtos químicos e o calor, o que resulta na remoção da maior parte da lignina e, assim, a liberação de fibras, sem danificar seriamente as fibras de celulose. Tipicamente, a maioria da lignina e de hemicelulose se tornam solúveis em água da polpação química e é, assim, removida das fibras de pasta. Aproximadamente, metade do material de madeira é dissolvida em polpação química. Os principais métodos para a produção de pasta química são polpação Kraft e processo de pasta dissolvida (processo de sulfito). Soda cozimento é uma modificação ao processo Kraft cozimento, no qual o sulfito de sódio não é utilizado.

Processo de polpa Kraft ou polpação Kraft ou cozimento Kraft se referem a um processo de polpação química, no qual o material lignocelulósico é tratado com mistura de hidróxido de sódio e sulfeto de sódio, que quebram as ligações que ligam a lignina a celulose. Cozimento sódico é uma modificação ao processo de cozimento Kraft, no qual o sulfito de sódio não é utilizado. Solventes orgânicos, tais como etanol, metanol e ácido peracético podem ser usados como um reforço químico no processo de pasta Kraft.

Processo de pasta de dissolução ou processo de sulfito, se refere a um processo de produção de polpação química, em que o ácido sulfuroso (H2SO3) e íons de bissulfito atuam na degradação e dissolução da lignina. Polpação de sulfito ácido é realizada a um PH baixo, 1 a 2, enquanto que polpação de sulfito neutro é realizada a valores de PH de 7 a 9. Solventes orgânicos, tais como etanol, metanol e ácido peracético podem ser usados como um reforço químico no processo de dissolução de celulose.

Processo Organosolv se refere a um processo de polpação química com produtos químicos orgânicos usados para conseguir a remoção de lignina e liberação de fibras. Produtos químicos orgânicos tipicamente usados no processo de Organosolv incluem, mas não se limitando a metanol, etanol, ácido fórmico, ácido acético, ácido peracético, acetato de etilo e acetona. A remoção de lignina no processo de Organosolv pode ser reforçada por adição de ácido com um catalisador, tal como o ácido sulfúrico ou dióxido de enxofre (SO₂) .

Polpação mecânica se refere a um processo, no qual as fibras em material lignocelulósico, tal como madeira ou lascas de madeira são liberadas mecanicamente, tal como por moagem. Os principais tipos de polpação mecânica incluem a pasta de madeira triturada em pedra e pasta de refinador. Pasta de madeira triturada em pedra seja feita por trituração de troncos de madeira e, se cozinhado, antes da moagem, é conhecida como pasta de madeira triturada a pressão. Pasta refinada é feita por alimentação de lascas de madeira para o centro de discos rotativos (refinação), se a pasta de papel é tratada com vapor de água antes da refinação, a pasta é denominada pasta termomecânica. Na fabricação de pasta química termomecânica, a madeira é prétratada com produtos químicos, tais como sulfito de sódio e vapor de refinação feito pela refinação de lascas. Em todos os casos, o rendimento da pasta é elevado, tipicamente de a 98%, o que significa que todos os componentes da madeira são retidos na fibra com apenas pequenas perdas de substâncias facilmente solúveis em água, o que difere dos processos de polpação química, em que o rendimento da polpa é significativamente inferior.

Processo de fibra de reciclagem ou processo de reciclagem de fibra se refere ao processo que utiliza produtos de pasta usados, tais como papel, e os refaz em novos produtos de pasta ou de papel. O processo permite a reciclagem e reutilização de produtos de papel e pasta. O processo de fibra de reciclagem consiste em geral em três etapas, a formação de pasta de papel, a remoção de contaminantes, tais como tinta (destintagem), e branqueamento das fibras.

De acordo com uma concretização preferida da invenção, a hidrólise e a produção de biocombustível são realizadas utilizando microrganismos, que são capazes da produção de ambas as enzimas capazes de hidrolisar açúcares oligoméricos e de produção de biocombustíveis. Tipicamente, isto é realizado em uma única etapa.

De acordo com uma concretização preferida da invenção, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, preferencialmente, pelo menos 50%, mais preferencialmente, pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90% de determinadas enzimas, que são utilizadas na pasta / ou processo da indústria de papel, são produzidas por um microrganismo que produz também lipídios. Na pasta e/ou na indústria de papel, o processo pode ser usado de várias enzimas que normalmente algumas enzimas ou grupos de enzimas são produzidos no processo integrado único de produção de óleo de células ou em um processo relacionado a ele e, algumas enzimas ou grupo de enzimas são obtidos a partir de outras fontes, por exemplo, enzimas comerciais.

Um microrganismo que produz lipídios significa neste caso um ou mais microrganismos produtores de lipídios, preferencialmente, um microrganismo produtor de lipídios.

De acordo com outra concretização da invenção, as enzimas são produzidas por um ou mais microrganismos, diferente do microrganismo que produz os lipídios no mesmo processo de produção de lipídios ou em um processo relacionado ao processo. O microrganismo (s) pode ser (um) microrganismo (s) eficiente à produção específica de enzimas, tais como as enzimas hidrolisantes, por exemplo, Trichoderma ou Bacillus. Um processo relacionado com o processo de produção de lipídios significa, por exemplo, um processo, em que a matéria-prima para o processo de produção de lipídios é tratada, por exemplo, com enzimas.

De acordo com outra concretização da

invenção, as

enzimas são produzidas em um processo separado do processo de produção de lipídios. As enzimas são produzidas, por

exemplo, em um processo separado por um

microrganismo

eficiente na produção de enzimas específicas, tais como

enzimas hidrolíticas. Alternativamente, as

enzimas são

enzimas comerciais.

De acordo com outra concretização da	invenção, a
hidrólise e a produção de biocombustíveis são	realizadas de

uma maneira semelhante, utilizando os microrganismos que

são capazes de produzir enzimas, capazes

de hidrolisar

açúcares oligoméricos e produção de biocombustíveis, porém, as enzimas produzidas são usadas separadamente para

hidrolisar a matéria-prima, tal como a	celulose (ou
hemicelulose) de hidrólise. Os produtos de	hidrólise são

então utilizados na fermentação.

De acordo ainda com outra concretização da invenção, processo de produção de lipídios à base de microrganismos heterotróficos é integrado em uma pasta e/ou processo da indústria de papel. Os microrganismos heterotróficos

utilizam resíduos ou frações de pasta e/ou

indústria de

papel como matéria-prima para a produção de lipídios.

Em uma concretização da invenção, o material orgânico utilizado para a produção de lipídios compreende pelo menos 30%, preferencialmente, pelo menos 50%, preferencialmente, 60% de lignoceluloses, preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 90% de lignoceluloses ou lignocelulose derivada de materiais de pasta e/ou indústria de papel.

Em uma concretização da invenção, o material orgânico a partir de pasta e/ou na indústria de papel usado em um processo de produção de lipídios compreende pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 90% de uma fração de lignocelulose, ou materiais derivados da lignocelulose, tais como hemiceluloses ou celulose.

Em uma concretização da invenção, o material orgânico a partir de pasta e/ou na indústria de papel usado em um processo de produção de lipídios compreende pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, preferencialmente, pelo menos 30%, preferencialmente, pelo menos 40%, de preferência pelo menos 50%, preferencialmente, pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 90% dos açúcares poliméricos.

grau de polimerização quantidade de

4 monossacáridos no hidrolisado de deslignificação dependem em grande parte, do cozimento de lignocelulose ou do método de pré-tratamento. Tipicamente, a extração de água quente pressurizada de resultados materiais de lignocelulósicos, em fração de hemicelulose, é constituída principalmente por hemicelulose oligomérica. Processo de dissolução de pasta, por outro lado, produz tipicamente hidrólise, isto é, licor de sulfito gasto, onde os açúcares de hemicelulose estão principalmente na forma monomérica.

Em uma concretização da invenção, o material orgânico a partir de pasta e/ou na indústria de papel, pelo menos, a remoção parcial da lignina utilizada em um processo de produção de lipídios compreende pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90% de hemicelulose ou materiais derivados de hemicelulose.

Em uma concretização da invenção, o material orgânico a partir de pasta e/ou na indústria de papel, pelo menos, a remoção parcial da lignina, utilizado em processo de produção de lipídios compreende, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 90% de celulose.

Mais especificamente, as frações adequadas para a produção de lipídios microbianos incluem materiais de hemicelulose, que são separados antes do processo atual de polpação. Esta integração pode ser utilizada em diferentes

tipos de	processos de polpação	incluindo	pasta Kraft	e
processos	de dissolução de pasta.
Em	uma concretização da	invenção,	a produção	de
celulase	e/ou hemicelulase, a hidrólise e	fermentação	da

celulose e/ou da hemicelulose são realizadas em uma única etapa. Isso oferece o potencial para menor custo e maior eficiência do que os processos apresentandos de celulase dedicada e/ou produção de hemicelulase. Isso resulta em custos evitados de capitais, substrato e outras matériasprimas e utilitários associados com a produção de celulase e/ou hemicelulase. Além disso, oferece a possibilidade de obtenção de taxas de hidrólise mais elevadas e, por conseguinte, reduzir o volume do reator e o investimento de capital. O processo de uma etapa reduz significativamente os custos com a eliminação, ou pelo menos diminui a necessidade de uma enzima produzida em um bioprocesso separado.

Ainda outra concretização da invenção, os microrganismos heterotróficos utilizam misturas primária (s) a partir de pasta e/ou na indústria de papel, tais como destintagem, o descasque, pasta química, pasta mecânica ou fabricação de papel de misturas primária (s) . As misturas primárias podem ser combinadas com outras frações, ou a partir de resíduos de pasta e/ou na indústria de papel, tais como a celulose ou a hemicelulose.

Os microrganismos utilizados na produção de lipídios são, preferencialmente, capazes de utilizar a hemicelulose polimérica possuindo exoenzimas, como hemicellulases capazes de degradação de hemicelulose. As hemicelulases, tais como as xilanases, arabinases, mananases, galactosidases podem ser recuperadas a partir do meio de cultura gasto (utilizado) a partir de processo de produção de lipídios e reutilizadas no processo de formação de pasta, por exemplo, para o branqueamento de pasta, destintagem da pasta, dissolução e fabricação de pasta ou modificação de fibras. Tais enzimas podem ser produzidas, por exemplo, por fungos ou bactérias, preferencialmente, o fungo pertencente ao gênero Aspergillus, A. oryzae, Humicola, Rhizopus, ou Trichoderma, ou bactérias, de preferência, Streptomyces.

Em outra concretização da invenção, microrganismos produtores de lipídios saõ usados para serem capazes de utilizar açúcares poliméricos em celulose e hemicelulose. As hemicelulases e/ou celulases podem ser recuperadas a partir do meio de cultura do processo de produção de lipídios e reutilizadas no processo de formação de pasta, por exemplo, na modificação de fibras, processamento de fibras recicladas ou de destintagem. Tais enzimas podem ser produzidas, por exemplo, por bactérias ou fungos, preferencialmente, pertencentes ao gênero Aspergillus, tais como A. terreus, ou bactérias pertencentes ao Streptomyces.

De acordo com uma concretização preferida da invenção, as enzimas produzidas a partir de lipídios na produção de pasta e/ou na indústria de papel, tais como, a partir de pasta e/ou de correntes laterais da indústria de papel ou resíduos, tais como corrente de hemicelulose ou mistura primária, são recobertos de processo microbiológico e utilizado na pasta de papel e/ou na indústria de papel, tal como na pasta e/ou fábrica de papel. De preferência, as enzimas de hemicelulase para uma (pré) aplicação de branqueamento de pasta ou para a remoção de resíduos de xilano do processo de dissolução de pasta possuem baixa atividade ou nenhuma degradação de celulose, a fim de não afetar ou degradar as fibras de celulose na pasta. Tais enzimas podem ser produzidas, por exemplo, por fungos, preferencialmente, pertencentes ao gênero Aspergillus, tal como A. oryzae, também são oleaginosas e capazes de acumular lipídios de hemicelulose. Aplicação de

reaproveitamento	alternativo	de	enzimas de hemicelulase	é
reciclá-las de	volta	para	o	processo de produção	de
lipídios.
As enzimas	podem	ser	utilizadas em pasta e/ou	na

indústria de papel, também para reduzir os custos de fabricação de papel ou para melhorar o produto. Principais aplicações de enzimas incluem o branqueamento de pasta, onde as enzimas (por exemplo, xilanases de hemicelulose e mananases) e, possivelmente, as lacases são utilizadas a fim de facilitar a hemicelulose e/ou a remoção de lignina. A utilização de enzimas no branqueamento de pasta reduz o consumo de produtos químicos branqueadores e, resulta, em ambos os benefícios econômicos e ambientais. As enzimas utilizadas no processo de formação de pasta são enzimas comerciais produzidas em fábricas separadas enzima. A produção de enzimas no local pode resultar em redução de custos devido à diminuição da necessidade de processamento de enzimas, como a estabilização antes de usar.

Além disso, muitas outras aplicações para as enzimas existem em pasta e/ou na indústria de papel, ajudando na destintagem, aumentando a polpação Kraft, diminuindo o recipiente de coleta, facilitando a maceração, removendo seletivamente os componentes de fibra, modificando as propriedades das fibras, aumentando a flexibilidade da fibra e covalentemente ligando as cadeias laterais ou grupos funcionais, descascamento, limpeza de máquinas de papel e campo e remoção de lodo.

Branqueamento da celulose, ou seja, remoção de lignina de pastas químicas é necessária por razões estéticas e para melhorar as propriedades do papel, porque as sobras de resíduos de lignina depois de polpação de sulfito confere uma cor marrom indesejável para o papel. Os objetivos do tratamento enzimático dependem das condições atuais de fabricação e podem estar relacionadas às exigências ambientais, redução dos custos de produtos químicos ou manutenção ou melhoria da qualidade do produto.

A aplicação mais importante de enzimas xilanase está no pré-branqueamento da pasta Kraft e, xilanases tem ganho importância como alternativas aos produtos químicos que contêm cloros tóxicos. O tratamento de pastas químicas com xilanases permite economizar o consumo de produtos químicos branqueadores, reduz os impactos ambientais e/ou aumenta o brilho final da pasta. A principal força impulsionadora tem sido as vantagens econômicas e ambientais da enzima para a planta de branqueamento. Xilanases podem também ser usadas na remoção de cana, fibras que não foram separadas em fibras individuais na polpação.

Xilanases podem ser utilizadas no processamento de pastas de celulose para remover os resíduos de xilano no processo de dissolução de celulose. As enzimas são capazes de degradar seletivamente a fração de hemicelulose, sem afetar a celulose. Uma vez que a hemicelulose seja removida por hemicelulases, a lignina é mais facilmente removível e degradável por enzimas, tais como a lacase. A principal enzima necessária para aumentar a deslignificação de pasta Kraft é endo-p-xilanase, mas o enriquecimento de outras enzimas, tais como mananase, lipase, e «-galactosidase têm sido mostradas a melhorar o efeito do tratamento enzimático da pastae Kraft. Enzima xilanase pode reduzir o requisito para oxidação de substâncias químicas em até 20% - 40%. (Beg e colaboradores, 2001). A preparação de enzima resultante deverá estar completamente livre de qualquer atividade de celulase. Além disso, as xilanases que são ativas e estáveis a alta temperatura e de pH alcalino são desejáveis (Beg e colaboradores, 2001). Enzimas tolerantes a álcali são preferidas, desde que elas possam funcionar sem ajuste de pH no branqueamento da celulose (Bajpai, 2004).

Os microrganismos preferidos para a produção de xilanases, em particular, para o branqueamento da celulose, são as xilanases fúngicas das espécies bacterianas, Aspergillus e Trichoderma e xilanases das espécies de

Bacillus, espécies do Streptomyces e espécies de Clostridium. Desses gêneros, especialmente, os Aspergillus e Streptomyces contêm espécies oleaginosas, ou seja, capazes de acumular quantidades significativas de lipídios (> 15% do seu peso seco da célula), quando cultivada em condições adequadas ou ideais.

De acordo com a invenção, os microrganismos quando cultivados em matérias-primas de celulose e/ou na indústria de papel, são capazes de produzir e acumular pelo menos 3% (p/p) de lipídios do seu peso seco de células, preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%

As enzimas podem também ser usadas na modificação das fibras de celuloses, especialmente, no refino da pasta do processo de polpação mecânica. Modificação enzimática de fibras tem como objetivo a redução do consumo de energia na produção de celuloses termomecânicas e aumento da capacidade de batimento de celuloses químicas ou a melhoria das propriedades das fibras.

Enzimas pectinase e xilanase podem ser usadas para auxiliar o descasque, podendo resultar em consumo de energia significativo no processo de descasque.

Mistura de xilanase e enzimas de celulase em baixas concentrações foram encontradas para aumentar significativamente a desobstrução de fibras recicladas, sem reduzir substancialmente a produtividade.

Pastas de dissolução podem ser usadas para a produção de materiais celulósicos, tais como acetatos, celofanes e sedas artificiais. Sua fabricação é caracterizada pela derivatização e, assim, a solubilização de celulose altamente purificada. A remoção de hemicelulose a partir de pastas requer o uso de elevadas cargas cáusticas e condições de produção de pasta adequadas, tais como a produção de pasta de sulfito e pré-tratamento com ácido Kraft. Tratamento de xilanase no processo de dissolução de pasta pode reduzir a carga química necessária durante a extração cáustica ou facilitar a extração de hemicelulose de celulose Kraft.

As enzimas podem ser utilizadas na destintagem de celulose de fibras secundárias para converter em produtos de alta qualidade. As enzimas utilizadas na destintagem podem ser, por exemplo, celulases, hemicelulases, lacases, esterases, s lipases e as pectinases.

As lipases podem ser usadas na remoção de pez na polpação, os quais causam problemas de funcionamento nas máquinas de papel. Enzimas específicas, tais como hidrolases de Levan, amilases e proteases também podem ser usadas para limpar e reduzir limos nas máquinas de papel.

A hemicelulose representa uma grande fração relativa em materiais de madeira, sendo tipicamente de 20 a 40% em peso do material de madeira de acordo com as espécies de madeira. A hemicelulose é separada a partir da celulose no processo de formação de pasta, e o produto final de celulose contém apenas pequenas quantidades ou nenhuma hemicelulose, dependendo do processo. De modo a integrar o processo de produção de lipídios com um processo de pasta Kraft tradicional, processo adicional à unidade de separação de hemiceluloses é necessário antes do processo efetivo de polpação. Tal processo pode ser de qualquer unidade de processo que separa hemicelulose a partir de material lignocelulósico, tal como, mas não se limitando, a

extração de	água	quente	pressurizada	(tratamento
hidrotérmico),	tratamentos	ácidos ou	tratamentos
Organosolv.
No caso	do pr	ocesso de	dissolução de	pasta,	os
processos do	estado	da técnica	, tais como o	processo	de
dissolução de	pasta	ou proces	so Kraft com	extração	de

hemiceluloses (por exemplo, tratamento ácido), os processos produzem corrente de hemicelulose e lignina, os quais contêm açúcares fermentáveis, e os processos de produção de lipídios podem ser mais rapidamente integrados ao processo de produção de pasta.

O método de separação ou extração da hemicelulose a partir de lignocelulose antes da produção de pasta pode ser feito por qualquer método conhecido. De preferência, a separação de hemiceluloses é realizada com um método que produz, eventualmente, após a purificação e concentração, hidrolisados que não inibem o crescimento de microrganismos produtores de lipídios. De preferência, o método proporciona fração de hemicelulose, que contém, pelo menos, parte dos açúcares na forma oligomérica. Uma concretização da invenção é usar a extração de água quente sob pressão para extrair a hemicelulose. Além disso, para a hemicelulose, a extração de água quente pressurizada remove mineral partir de materiais lignocelulósicos que podem ser preferíveis em fermentação e reduzem a necessidade de adições minerais em meio de cultura.

Em certas aplicações de pré-tratamento, tais como em certos tratamentos Organosolv ou no licor de sulfito gasto, quantidades significativas de hemicelulose e lignina podem ser solubilizadas a partir da fração de celulose que permanece sólida. Nestes casos, a separação de açúcares da hemicelulose e lignina é preferível antes do processo de produção microbiológica aeróbia de lipídios. A separação da fração de lignina a partir de açúcares de hemicelulose pode ser realizado com qualquer método conhecido. Em tratamentos

Organosolv, a remoção de lignina é promovida pela ação direta de um solvente orgânico (etanol, metanol, acetona, ácido acético, ácido fórmico, acetato de etilo, etc.) para solubilizar a lignina e hidrolisar a fração hemicelulósica. Um método geral para separar a lignina a partir de hidrolisado de hemicelulose é adicionar a água, o que resulta da precipitação de lignina.

O hidrolisado de hemicelulose pode precisar ser tratado com diferentes operações unitárias antes da alimentação para os microrganismos. A separação da lignina de resíduos de lignina pode ser necessária. Os açúcares no hidrolisado de hemicelulose pode precisar ser concentrada, por exemplo, por meio de evaporação de água. Além disso, pode ser necessário para se livrar dos compostos orgânicos, tais como ácidos (ácidos orgânicos) liberados no prétratamento, ou solventes, tais como álcoois ou ácidos, ou outros compostos, tais como S02, utilizados na hidrólise. Métodos tais como, mas não limitados extração, evaporação ou destilação da corrente podem ser utilizados. Estes processos de evaporação, destilação ou descascamento podem utilizar o calor de processo e corrente de processo de polpação (combustão de lignina). A utilização de calor de processo é vantajosa, uma vez que, tipicamente, as fábricas de celulose produzem excesso de calor, que não pode ser utilizado. Além disso, os açúcares podem precisar ser concentrados por filtração ou membrana ou por aplicação de tecnologias. Por exemplo, os açúcares de oligoméricos em hemicelulose podem ser concentrados por filtração por membrana. O hidrolisado de hemicelulose pode precisa ser ainda purificado antes da alimentação para os microrganismos. Os métodos hidrolisados condicionados para remover compostos inibidores podem incluir, mas não são limitadas, a precipitação, a filtração, a extração ou adsorção, ou tratamento enzimático.

A invenção descrita pode ser aplicada ao processo de polpação utilizando quaisquer materiais ou misturas incluindo, mas não se limitando a madeira macia (como o pinheiro, abeto), madeira dura (tais como, eucalipto, bétula, faia, choupo, carvalho), bambu, palha de arroz, palha de cevada, palha de trigo, haste do milho, óleo de palma, cachos de frutos e bagaço. De preferência, a fração de hemicelulose a partir de material lignocelulósico é utilizada como matéria-prima para a produção de lipídios. A invenção não está limitada à utilização de corrente de hemicelulose, ou quaisquer frações, como matéria-prima para a produção de lipídios, também correntes contendo celulose, de quaisquer frações das mesmas e/ou outros compostos adequados para a produção de lipídios podem ser usados. O processo de produção de lipídios também pode utilizar outras fontes de celulose e/ou da indústria de papel, como a fibra de resíduos ou msitura primária de celulose e/ou da indústria de papel. Por exemplo, a alimentação de hemicelulose pode ser complementada com outros fluxos de celulose e/ou da indústria de papel. Além disso, o processo de produção de lipídios pode ser complementado com outras matérias-primas do que aquelas de celulose e/ou da indústria de papel, tais como materiais lignocelulósicos, como resíduos agrícolas, culturas energéticas, resíduos de papel, biomassa de algas, resíduos da indústria de alimentos, resíduos orgânicos sólidos urbanos, resíduos biológicos de cozinhas institucionais, amido (tal como amido de milho, amido de trigo, amido de batata, amido de mandioca, etc.) ou de açúcares, tais como os melaços de cana-de-açúcar ou de açúcar de beterraba. A matéria-prima para a produção de lipídios pode incluir também as matérias-primas de aditivos, tais como amido ou dos seus resíduos, os quais são usados no processo de fabricação de papel.

De acordo com uma concretização preferida da invenção, a corrente de hemiceluloses a partir de processo de produção de pasta, ou separadas antes do processo de formação de pasta é utilizada para a produção de lipídios por microrganismos. Além disso, a fração de hemicelulose fermentável produzidas no processo de produção de pasta está dentro do escopo da invenção. Para a produção de lipídios, são utilizados microrganismos capazes de utilizar açúcares derivados de hemicelulose. Os microrganismos podem ser quaisquer organismos capazes de acumular e/ou produzir lipídios (microrganismos oleaginosos). Tais microrganismos são bactérias, leveduras, fungos filamentosos (bolores) ou as algas, que podem crescer heterotroficamente ou mixotroficamente

O microrganismo pode ser capaz de utilizar o que outros compostos incluídos os açúcares no hidrolisado da hemicelulose, tal como ácidos orgânicos derivados a partir de biomassa lignocelulósica para o crescimento e produção de lipídios. Os microrganismos podem também utilizar os compostos, tais como ácidos orgânicos ou álcoois, adicionados como reagentes na extração de hemicelulose de crescimento e de produção de lipídios. Pequenas quantidades destes compostos, tipicamente, 0,01 a 10% podem permanecer no hidrolisado após a remoção da maioria destes reagentes. A presença destes compostos pode ser vantajoso para o processo microbiológico de produção de lipídios.

Os açúcares em hemicelulose podem estar na forma monomérica e/ou na forma oligomérica para a produção de lipídios. Em uma concretização mais preferida da invenção, açúcares estão, principalmente, na forma oligomérica. Tipicamente, pelo menos 5, pelo menos 10%, pelo menos 20%, preferencialmente, pelo menos 30%, preferencialmente, pelo menos 40%, preferencialmente, pelo menos 50%, preferencialmente, pelo menos 60%, preferencialmente, pelo menos 70%, preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 90% da quantidade de açúcares está na forma oligomérica e/ou na forma polimérica.

Em uma concretização mais preferida da invenção, o processo de produção de lipídios utiliza microrganismos que são capazes de utilizar açúcares poliméricos por exoenzimas, como por exemplo, as hemicelulases, xilanases, mananases, arabinases ou galactosidases. Os microrganismos utilizados na presente invenção possuem enzimas ou são capazes de produzir, que são capazes de degradar hemicelulose e utilizar açúcares oligoméricos a partir de diferentes materiais, tais como materiais de madeira, incluindo galactoglucomananas em madeira dura e de madeira macia em xilana, e (arabino) xilanas em materiais herbáceos, tais como palha. As exoenzimas degradantes de açúcar poliméricos produzidos por microrganismos podem ser concentradas ou recuperadas do meio de cultura gasto e reutilizadas no processo de polpação como diluição ou como água de processamento. As hemicelulases são amplamente utilizadas nos processos de produção de pasta, por exemplo, no branqueamento de celulose e de modificação de fibra. Para efeitos de branqueamento da celulose, é preferível que as hemicelulases sejam termoestáveis e tolerem um pH alcalino. Isto irá reduzir a necessidade de resfriamento e ajuste do pH da corrente de celulose antes do tratamento enzimático, o que pode simplificar o processo e resultar em economia de custos de capital e operacionais.

Celulose e/ou a indústria de papel produzem uma variedade de resíduos ou de correntes de resíduos que contêm açúcares poliméricos, tais como celulose e/ou hemicelulose, em função do processo. O principal processo de tratamento de águas residuais usados em fábricas de celulose e papel é a sedimentação primária (esclarecimento, resolução), onde a matéria sólida é removida. Isto é considerado como um tratamento primário de águas residuais e os sólidos produzidos são conhecidos como mistura primária.

As misturas primárias normalmente contêm celulose oligomérica, hemicelulose e lignina e/ou compostos inorgânicos. A mistura primária é uma matéria-prima adequada para a produção de lipídios por microrganismos. De acordo com a presente invenção, a(s) mistura(s) primária(s) a partir de celulose e/ou da indústria de papel são usadas para a produção de lipídios por microrganismos. As misturas primárias podem ser pré-tratadas para melhorar a biodegradabilidade de açúcares, ou tratadas para reduzir a quantidade de lignina ou de resíduos de lignina, compostos inorgânicos, ou compostos inibidores antes da alimentação para o bioprocesso.

Na concretização preferida da invenção, tais microrganismos usados, os quais são capazes de produzir lipídios e enzimas capazes de hidrolisar os açúcares poliméricos. Tais enzimas enriquecidas e/ou recuperadas a partir do meio de cultura utilizado, e serem reutilizados no processo de celulose e da indústria papel.

As misturas primárias da celulose e/ou da indústria de papel incluem, tais como destintagem, descascamento, polpação química, mecânica ou polpação semi-química fabricação de papel de misturas primárias. Polpação química de mistura primária inclui o principal processo de mistura de celulose Kraft e dissolução do processo de celulose de misturas primárias. A celulose mecânica primária e a polpação semi-química de misturas primárias incluem madeira triturada em pedra (SGW), pressão de madeira triturada (PGW), pasta de refinador mecânica (RMP), e processo de polpação termomecânica (TMP). O processo de destintagem de mistura primária provém de fábrica de papel reciclado com fibra, a mistura pode conter tintura, corante, cola, agente de coesão, bem como enchimentos de papel e outros aditivos inorgânicos, além de fibra de celulose. A mistura requer tipicamente separação, pelo menos parcial, de constituintes inorgânicos de fibras antes da alimentação microbiana do processo de produção de lipídios. A mistura primária de fábricas de papel contém enchimentos de fabricação de papel como argila, carbonato de cálcio, talco e dióxido de titânio na adição às fibras de celulose. Tipicamente, pelo menos a separação parcial destes componentes inorgânicos é necessária à alimentação microbiana do processo de produção de lipídios.

Em uma concretização da invenção, processo de produção de lipídios microbianos é integrado a um processo de reciclagem de fibras (processo de reciclagem de celulose). A mistura primária a partir de celulose e do processo da indústria de papel, tais como a mistura de destintagem, é utilizada como matéria-prima para a produção de lipídios por microrganismos. A mistura de destintagem pode ser tratada para reduzir os conteúdos dos compostos inorgânicos ou compostos inibidores orgânicos ou inorgânicos antes da alimentação para o bioprocesso. A mistura de destintagem pode ser complementada com outras matérias-primas a partir de celulose e/ou processos da indústria de papel ou de outros locais, como resíduos agrícolas lignocelulósicos, culturas energéticas, microalgas, plantações de açúcar, amido, sacarose ou melaço. O processo microbiológico usando, pelo menos, algumas misturas primárias ou outros resíduos orgânicos a partir de processo de reciclagem de fibras, tais como de destintagem, produzem os lipídios que podem ser recuperados e convertidos em biocombustíveis, e enzimas que são, por exemplo, capazes de hidrolisar os açúcares poliméricos. As enzimas podem ser recuperadas e/ou enriquecidas a partir do meio de cultura gasto e reutilizadas em uma celulose/ou um processo da indústria de papel, tal como no processo de reciclagem da fibra, na destintagem de papel. As enzimas recuperadas podem também ser usadas em outros lugares na celulose e no processo da indústria de papel ou vendido e utilizado em qualquer outro processo.

As enzimas no meio de cultura gasto, capazes de hidrolisar os açúcares poliméricos incluem, por exemplo, celulases e/ou hemicelulases, dependendo do microrganismo utilizado. De preferência, ambas as celulases e hemicelulases estão incluídas no meio de cultura gasto.

Processo de produção de lipídios a partir de mistura primária pode ser suplementado com outros resíduos a partir de celulose e/ou processos da indústria de papel, ou a partir de matérias-primas de outros locais, tais como resíduos de aricultural, resíduos da indústria alimentar ou biomassa lignocelulósica ou amido ou melaço.

As exoenzimas produzidas no local pela alimentação de microrganismos de hemicelulose que tenha sido extraído a partir do mesmo material que é usado para a produção de celulose. Portanto, as exoenzimas produzidas no local são muito apropriadas para o branqueamento de celulose no local. Em uma concretização da invenção, um sobrenadante resultante do tratamento da celulose ou pasta / ou corrente da indústria de papel, com as enzimas de celulose e/ou do processo da indústria de papel é reciclado de volta para o processo de produção de lipídios microbianos. O sobrenadante pode conter compostos, que são vantajosos para o crescimento e produção e lipídios dos microrganismos produtores de lipídios. Por exemplo, o sobrenadante pode conter açúcares adequados para o crescimento microbiano e produção de lipídios, minerais para o crescimento e/ou de enzimas que hidrolisam os açúcares poliméricos microbianos. Em uma concretização da invenção, o sobrenadante resultante da enzimática pré-branqueamento de celulose, tais como o tratamento com hemicelulases, é reciclado de volta para o processo de produção de lipídios microbianos. Em outra concretização, o sobrenadante do tratamento enzimático de pasta de dissolução para a remoção de hemicelulose na celulose é reciclado para o processo de produção de lipídios. O sobrenadante pode ser concentrado e/ou fração de proteína coletada, antes da alimentação para o processo de produção de lipídios microbianos.

De acordo com uma concretização da invenção, também os microrganismos que não são capazes de utilizar oligômeros ou polímeros de açúcar para a produção de lipídios podem ser usados e estão dentro do escopo da invenção. Neste caso, as matérias-primas de celulose e/ou da indústria de papel, tais como de hemicelulose, a mistura primária ou fibra de resíduos são alimentadas como monômeros de açúcar ao processo de produção de lipídios. A hidrólise de polímeros de hemicelulose a monômeros pode ocorrer devido ao procedimento de extração de hemicelulose ou devido à adição de enzimas capazes de hidrólise de polímeros de açúcar. A hidrólise enzimática de hemicelulose e/ou celulose em matérias-primas pode ser realizada em um passo de processo separado a partir de acumulação de óleo ou simultaneamente durante a acumulação de óleo, de acordo com o chamado, sacarificações simultâneas e abordagem de fermentação.

Além disso, dentro do escopo da invenção, está uma concretização, onde os organismos diferentes (duas ou mais) são utilizados para a hidrólise de açúcares poliméricos e de produção de lipídios a partir de monômeros de açúcar. Esse processo se caracteriza pelo fato de o processo compreender um primeiro microrganismo, por exemplo, fungos filamentosos, levedura ou cepa de bactéria, que seja capaz de hidrolisar (despolimerização) compostos orgânicos poliméricos, tais como hemicelulose ou celulose e um segundo microrganismo, tal como uma levedura, cepa de bactéria, algas ou fungos filamentosos, que seja capaz de utilizar os produtos resultantes da hidrólise para o seu crescimento e a produção de gordura de uma célula única. Tais etapas dos processos podem ser implementados como processos sequenciais ou simultaneamente. Uma cepa de um microrganismo capaz de hidrolisar compostos orgânicos poliméricos pode ser substituída pelo uso de enzimas com uma capacidade de hidrolisar tais compostos. O tratamento com enzimas pode ser realizado antes ou concomitantemente com a produção microbiana de gordura de uma célula única. A operação de bioprocesso com duas ou mais espécies pode ser realizada por quaisquer métodos, incluindo, mas não se limitando a operação em biorreator ao mesmo tempo como coculturas, ou separando as fases do processo de hidrólise de hemicelulose e de produção de lipídios no tempo ou espaço.

Em qualquer dos casos, de acordo com a invenção, as enzimas envolvidas na hidrólise de polímeros de açúcar podem ser recuperadas a partir do meio de cultura e reutilizadas no processo de polpação.

O processo de produção de lipídios pode também ser integrado com o processo de polpação mecânica. A produção de lipídios pode utilizar resíduos, tais como as substâncias solúveis em água, criada na polpação, a partir de matérias-primas. Os resíduos solúveis em água, em geral, contêm componentes de hemicelulose, como galactoglucomanana acetilada. O processo de produção de lipídios pode ser suplementado com outros resíduos de celulose e/ou processos da indústria de papel, ou de outros locais, tais como resíduos de aricultural, resíduos da indústria alimentar ou biomassa lignocelulósica ou amido ou melaço. As enzimas produzidas na produção de lipídios podem ser reutilizadas na polpação mecânica, por exemplo, mas não se limitando a um pré-tratamento das lascas de madeira, ou modificações de fibras ou de branqueamento. As enzimas produzidas na produção de lipídios utilizando os resíduos provenientes do processo de polpação mecânica também podem ser recuperadas e reutilizadas em outros processos de polpação, tais como a polpação química ou no tratamento dos produtos a partir de processo de polpação química.

Alguns microrganismos oleaginosos capazes de utilizar monômeros de açúcar na hemicelulose, tal como xilose ou xilana em xilana e arabinose em arabinoxilano ou manose, galactose ou glicose em galactooglucomanana. Os organismos produtores de lipídios podem utilizar um ou vários dos compostos acima mencionados. Os organismos produtores de lipídios são selecionados a partir do grupo de bactérias, cianobactérias, fungos, tais como leveduras e fungos filamentosos (bolores), arqueobactérias, ou microalgas. Os microrganismos podem facilmente acumular lipídios ou foram geneticamente modificados para acumular lipídios ou para melhorar o acúmulo dos lipídios. Os organismos produtores de lipídios incluem, mas não estão limitados, aos seguintes organismos:

Espécies de microalgas pertencentes aos gêneros, compreendendo Dunaliella, Chlorella, Botryococcus, Brachiomonas, Chlorococcum, Crypthecodinium, Euglena, Haematococos, Chlamydomas, Isochrysis, Pleurochrysis, Pavlova, Prototheca, Phaeodactylum, Pseudochlorella, Parachlorella, Bracteococcus, Scenedesmus, Skeletonema, Chaetoceros, Nitzschia, Nannochloropsis, Navicula, Nannochloris, Scihizochytrium, Sceletonema, Thraustochytrium, Ulkenia, Tetraselmis e Synechocyst.

Espécies de fungos filamentosos pertencentes aos seguintes gêneros Aspergillus, Mortierella, Chaetomium, Claviceps, Cladosporidium, Cunninghamella, Emericella, Fusarium, Glomus, Mucor, Paecilomyces, Penicillium, Pythium, Rhizopus, Trichoderma, Zygorhynchus, Humicola, Cladosporium, Malbranchea, Ustilago.

Leveduras pertencentes aos seguintes gêneros Clavispora, Deparyomyces, Pachysolen, Kluyveromyces, Galactomyces, Hansenula, Saccharomyces, Waltomyces, Endomycopsis, Cryptococcus, tais como Cryptococcus curvatus, Rhodosporidium, tais como toruloides Rohodosporidium, Rhodotorula, tal como Rhodotorula glutinis, Yarrowia, tais como a Yarrowia lipolytica, Pichia, tais como Pichia stipitis, Candida, tais como Candida curvata, Lipomyces como Lipomyces starkeyi, Trichosporon tal como Trichosporon cutaneum ou Trichosporon pullulans.

Bactérias pertencentes aos gêneros Acinetobacter, Actinobacter, Alcanivorax, Aerogenes, Anabaena, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Dietzia, Gordonia, Escherichia, Flexibacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Nostoc, Oscillatoria, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodomicrobium, Rhodopseu- Pseudomonas, Shewanella, Shigella, Vibrio e Streptomyces. Mais preferencialmente as bactérias compreendem Rhodococcus opacus, Acinetobacter,

Nocardia ou Streptomyces.

Em concretizações preferidas da invenção, a produção de lipídios a partir de organismos oleaginosos que são capazes de utilizar hemicelulose polimérica ou de celulose devido às exoenzimas (como por exemplom as hemicelulases, xilanases, galactosidases ou mannanases ou celulases) é usada. Estes organismos incluem, mas não estão limitados a bactérias, tais como, Streptomyces ou Bacillus, fungos filamentosos, tais como Aspergillus, Fusarium, Humicola, Penicillium, Phanerochaete, Rhizopus, ou Trichoderma, tal como A. niger, A. terreus, A. oryzae, A. nidulans, F. oxysporum, Phanerochaete chrysosporium, Rhizopus oryzae ou Trichoderma reesei, leveduras, tais como o Cryptococcus ou Trichosporon, como Cryptococcus albidus, Trichosproron cutaneum. Os microrganismos oleaginosos que são geneticamente modificados para serem capazes de utilizar açúcares poliméricos em hemicelulose ou celulose, também são parte da invenção. Além disso, os organismos capazes de utilizar açúcares poliméricos em hemicelulose ou celulose, que são geneticamente modificados para melhorar a produção de lipídios, também estão incluídos na presente invenção.

Nas concretizações mais preferidas da invenção, organismos que produzem lipídios são usados, os quais são capazes de utilizar os açúcares poliméricos na lignocelulose, especialmente, hemicelulose. Tais organismos são, preferencialmente, aqueles dos seguintes gêneros de fungos filamentosos Aspergillus, Humicola, Rhizopus, Trichoderma, leveduras Cryptococcus ou bactéria Streptomyces.

Outras enzimas do que as hemicelulases

As hemicelulases são as principais enzimas aplicadas na celulose e/ou na indústria do papel. Além disso, a recuperação e utilização de outras enzimas do que as hemicelulases do processo de produção de lipídios de celulose e/ou do processo da indústria de papel são abrangidas pela invenção. Tais enzimas podem incluir, mas não estão limitadas a celulases, lacases, lipases, pectinases, amilases, esterases e proteases.

Outra característica da invenção é a utilização de pelo menos, uma parte de frações da lignina, produzidas ou liberadas na produção de pasta ou da pré-extração de hemicelulose, (pré) branqueamento, misturas primárias ou incluídas em outra pasta e/ou resíduos da indústria de papel são usadas para a produção de enzimas que são capazes de degradação, modificação ou alterações estruturais da lignina. Tais enzimas podem ser utilizadas em várias aplicações, tais como, mas não se limitando a, (pré) branqueamento da pasta, destintagem da pasta, tratamento do material lignocelulósico antes da polpação química, fabricação de pasta de dissolução, descascamento ou a modificação da fibra.

Outra característica da invenção é a utilização de pelo menos, uma parte da fração de celulose (pasta) para produzir enzimas capazes de degradar a celulose. Tais enzimas podem ser utilizadas, por exemplo, na modificação das fibras de celulose ou destintagem. A produção de celulases pode ser realizada através da utilização de microrganismos oleaginosos capazes de utilizar celulose por possuírem atividade de celulase. Portanto, a produção de lipídios e celulases pode ser combinada tanto para a produção de lipídios e hemicelulases.

Ainda, outra característica da invenção consiste em produzir pectinases a partir de correntes da indústria de papel e pasta. A produção de pectinases pode ser combinada com a produção de lipídios. Pectinases podem ser usadas, por exemplo, na modificação das fibras, destintagem da pasta, descasque ou maceração de fibras flexíveis.

A produção de exoenzimas por organismos produtores diminui a necessidade de compra de enzimas externa, o que melhora a relação custo-eficiência de todo o processo. A utilização de enzimas no mesmo local diminui os custos atribuídos à purificação e estabilização de enzimas.

Alternativamente, as enzimas podem ser recuperadas, purificadas e estabilizadas, e vendidas como um elevado valor de produto.

Processo de produção de lipídios

A produção microbiana de lipídios pode ser efetuada com qualquer método conhecido ou um método desenvolvido no futuro. Tipicamente, o processo microbiano de produção de lipídios inclui o cultivo de microrganismos em biorreatores gaseificados em cultivo submerso. Os microrganismos são cultivados em um meio de cultura líquido compreendendo fontes de carbono e de energia, tais como os açúcares de hemicelulose, e macro e micronutrientes. O cultivo pode ser realizado, por exemplo, como o cultivo em bateladas, cultivo batelada alimentada e cultivo contínuo. O cultivo pode também ser realizado em um processo em cascata. No cultivo, os microrganismos são colocados para crescer e acumular lipídios intracelulares. Alguns microrganismos também podem ser capazes de excretar os lipídios para o meio de cultura.

O processo microbiano de de produção de lipídios pode ser realizado também em reatores, onde a quantidade de água livre é baixa, ou quando a produção é realizada sobre uma superfície sólida ou semissólida. A massa celular ou outra biomassa não dissolve em água podendo ser extraída com soluções aquosas a fim de obter enzimas em forma solúvel.

Em várias concretizações da invenção, o óleo ou precursores de óleo podem ser recuperados a partir da biomassa celular ou meio de cultura por quaisquer métodos conhecidos no estado da técnica ou desenvolvidos no futuro. Por exemplo, os microrganismos podem ser separados a partir do meio utilizando uma filtração ou técnicas de decantação. Alternativamente, centrifugações de escala industrial com centrifugadores comerciais de grande capacidade de volume podem ser utilizados para separar os produtos desejados.

Em várias concretizações da invenção, as células bacterianas podem ser interrompidas para facilitar a separação de óleo e outros componentes. Qualquer método conhecido por ruptura celular pode ser utilizado, tais como ultrassom, choque osmótico, força de cisalhamento mecânico, prensa fria, choque térmico, autólise auto-dirigida ou catalisada por enzima. O óleo pode ser recuperado a partir de células, por extração com solventes orgânicos ou por qualquer método conhecido no estado da técnica ou desenvolvidos no futuro.

Outros produtos diferente de lipídios

Também a produção microbiológica de outros compostos diferente de lipídios de hemicelulose e/ou de celulose a partir de matérias-primas ou resíduos do processo de celulose após a recuperação e/ou reutilização de enzimas no processo de polpação é parte da invenção. Tais produtos incluem a produção microbiológica de álcoois, etanol, butanol, acetona-etanol-butanol (ABE), iso-butanol, 2,3 propanodiol, ácido láctico e ácido succínico.

A finalidade para os lipídios ou uma fração de lipídios produzidos com o método descrito, não é restrita a qualquer determinada aplicação. Os lipídios podem ser usados, por exemplo, mas não limitado a, em fins de alimentação humana ou animal, na culinária, como produtos nutracêuticos, na produção de sabão ou de detergentes, produção de cosméticos como produtos químicos ou matériaprima para a produção de produtos químicos, como biocombustível ou como matéria- prima para a produção de biocombustível ou como lubrificantes como os óleos de base para lubrificantes (óleos de lubrificação) ou como matériaprima para produção de óleos básicos para lubrificantes.

De preferência, os lipídios recuperados a partir da biomassa microbiana com o método descrito na presente invenção podem ser usados como matéria-prima para a produção de biodiesel, diesel renovável, combustível de jato ou gasolina. O biodiesel é constituído por ésteres metílicos dos ácidos graxos, e é tipicamente produzido por transesterificação. Na transesterificação, os acilgliceróis são convertidos em ésteres alquil de ácidos graxos de cadeia longa (metil, etil ou propil) . Diesel renovável se refere a um combustível que é produzido por tratamento de hidrogênio (desoxigenação de hidrogênio, hidrogenação ou hidroprocessamento) de lipídios. No tratamento de hidrogênio, acilgliceróis são convertidos aos alcanos correspondentes (parafinas). Os alcanos (parafinas) podem ainda ser modificados por isomerização ou por outras alternativas de processo. Processo diesel renovável também pode ser usado para a produção de combustíveis de jato e/ou gasolina. Além disso, o fracionamento de lipídios pode ser realizado para a produção de biocombustíveis. Além disso, os lipídios podem ser utilizados como biocombustíveis diretamente em determinadas aplicações.

Biocombustível se refere a combustível sólido, líquido ou gasoso derivado, principalmente, da biomassa ou de resíduos biológicos, e se diferencia daqueles combustíveis fósseis, os quais são derivados a partir de restos orgânicos de microrganismos pré-históricos, plantas e animais.

De acordo com a diretriz da União Europeia 2003/30/EU biodiesel se refere um éster metílico produzido a partir de óleo vegetal ou óleo de origem animal, com qualidade de diesel para ser usado como biocombustível. De forma mais abrangente, o biodiesel se refere a ésteres alquílicos de cadeia longa, tais como: metil, etil ou propil, ésteres de óleo vegetal ou óleo de origem animal de qualidade de diesel. O biodiesel pode ser produzido a partir de lipídios, em que os lipídicos dos microorganismos podem se originar a partir de uma bactéria, um fungo (uma levedura ou de um bolor), uma alga ou outro microrganismo.

Diesel renovável se refere a um combustível, o qual é produzido por um tratamento de hidrogênio dos lipídios de origem animal, vegetal ou de microrganismo, ou de suas misturas, pelo qual o lipídio do microrganismo pode ter origem a partir de uma bactéria, um fungo (uma levedura ou de um bolor), algas ou outro microrganismo. Diesel renovável pode ser produzido também a partir de ceras derivadas de biomassa por gaseificação e síntese FischerTropsch. Opcionalmente, em adição ao tratamento com hidrogênio, a isomerização pode ser executada em outras etapas do processamento. O processo de diesel renovável também pode ser utilizado para a produção de combustíveis de jato e/ou gasolina. A produção de diesel renovável foi descrita nas publicações de patente EP 1396531, EP 1398364, EP 1741767 e EP 1741768.

Biodiesel ou diesel renovável pode ser misturado com o diesel à base de óleo mineral. Os aditivos adequados, tais como: conservantes e antioxidantes podem ser adicionados ao produto, o combustível.

Lubrificante se refere a uma substância, tal como a graxa, lipídio ou o óleo que reduz o atrito, quando aplicado como um revestimento de superfície de componentes móveis. Duas outras principais funções de um lubrificante é a remoção de calor e a dissolução das impurezas. Aplicações de lubrificantes incluem, mas não se limitam a utilização em motores de combustão interna, como os óleos para motores, aditivos em combustíveis, em dispositivos a óleo, tais como as bombas e equipamentos hidráulicos, ou em diferentes tipos de rolamentos. Tipicamente, lubrificantes contêm 75 - 100% de óleo de base e o resto são aditivos. Os aditivos adequados são, por exemplo, detergentes, estabilizadores de armazenamento, antioxidantes, inibidores de corrosão, agente redutor de turbidez, desemulsionantes, agentes antiespuma, cossolventes e aditivos de lubricidade (ver, por exemplo, US 7,691,792). Óleo de base para lubrificante pode ter origem a partir de óleo mineral, óleo vegetal, óleo animal ou a partir de uma bactéria, fungos (uma levedura ou de um bolor), uma alga ou outro microrganismo. Óleo de base também pode ser proveniente de ceras derivadas de biomassa por gaseificação e síntese Fischer-Tropsch. O índice de viscosidade é usado para caracterizar o óleo de base. Tipicamente, o elevado índice de viscosidade é o preferido.

O termo lipídio se refere a uma substância gordurosa, cuja molécula contém, tipicamente, como uma parte, uma cadeia de hidrocarboneto alifático, o qual se dissolve em solventes orgânicos não polares, mas é fracamente solúvel em água. Os lipídios são um grupo essencial de moléculas grandes em células vivas. Os lipídios são, por exemplo, gorduras, óleos, ceras, ésteres de cera, esteróis, terpenos, isoprenóides, carotenóides, polihidroxil conoatos, ácidos nucleicos, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, fosfolipídios, glicolipídios, esfingolipídios e glicerídeos.

O termo aciglicerol se refere a um éster de glicerol e ácidos graxos. Os acilgliceróis ocorrem naturalmente como gorduras e óleos graxos. Os exemplos de acilgliceróis incluem triacilgliceróis (TAG, triglicerídeos), diacilgliceróis (diglicerídeos) e monoacilgliceróis (monoglicerídeos).

Meio de cultivo gasto ou meio de cultura gasto se refere a um meio utilizado na cultura de microrganismos e que compreende os produtos acumulados pelos microrganismos. De forma mais abrangente, o meio de cultura gasto pode ser definido como uma fração do meio de cultura feita a partir

de uma	cultura	microbiana, durante ou	após	o	cultivo.	O
meio de	cultivo	gasto pode ser chamado	também	como caldo	de
cultivo	gasto.
Os	resíduo	s de células extraídos	de óleo	podem	ser

usados para a produção de energia, por exemplo, queimada ou tratados com o processo de digestão anaeróbia, ou utilizados como ração animal. Os resíduos de células extraídos de óleo, ou uma fração de resíduos das células, também podem ser reutilizados nos processos biológicos para serem usados como uma fonte de nutrientes.

A invenção aqui descrita pode ser aplicada a todos os processos de polpação incluindo, mas não limitados a, processo Kraft, processo de dissolução de pasta ou processo Organosolv. No caso do processo de dissolução de pasta, o atual processo, tal como o processo de sulfito ou Kraft, processo com extração de hemicelulose (por exemplo, tratamento ácido), já pode incluir a separação de hemicelulose, antes de polpação, e o processo de produção de lipídio pode ser rapidamente integrado ao processo de polpação.

A produção de enzimas para processos de pasta e/ou de papel no local é vantajosa por diversas razões e pode melhorar o custo-eficácia do processo de polpação.

- Redução dos custos de processamento a jusante, incluindo água e estabilização da enzima,

- Diminuição dos custos de transporte e embalagem,

- Redução das perdas por meio de transferência direta de enzimas para o processo de produção de pasta,

- Diminuição dos custos de capital versus instalações dedicadas (remotas),

- A utilização da mesma matéria-prima ou matéria-prima da mesma fonte para produção de enzimas resulta no processo de pasta / papel na indução direta e adaptação de enzimas para a matéria-prima

- Frente de controle de processo e oportunidades de otimização e melhoria diretamente dentro da biorrefinaria na produção de enzimas de saída e processos de pasta / papel.

Recuperação de enzimas a partir de meio de cultura gasto

As enzimas podem ser recuperadas a partir de cultura de microrganismos, o meio de cultura gasto, o sobrenadante por qualquer método conhecido e adequado ou por qualquer método adequado desenvolvido no futuro. O mesmo se aplica se também aos métodos pelos quais as enzimas podem ser separadas em frações com as atividades enzimáticas pretendidas.

A concentração, separação ou a recuperação de enzimas a partir de meio de cultura gasto pode ser feito por qualquer método conhecido ou um método desenvolvido no futuro. A recuperação é realizada com um método que preserva a atividade desejada de enzima(s). As enzimas em meio de cultura gasto podem ser também reutilizadas sem qualquer concentração, separação ou recuperação das enzimas.

Um método pelo qual a cultura do microrganismo ou do sobrenadante ou fração de proteína enriquecida compreendendo enzima(s) cataliticamente ativa podem ser recuperadas com base no seu tamanho molecular, comportamento iônico, solubilidade em água, solubilidade em diferentes solutos ou solubilidade em mistura de solutos contendo um fator de tamponamento ou um fator de atividade de superfície ou um composto com atividade de superfície ou seu sal.

As enzimas podem ser recuperadas a partir do meio de cultura por vários procedimentos, incluindo, mas não se limitando a procedimentos, tais como a centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Se necessário às enzimas podem ser purificados ou isolados por vários procedimentos, incluindo, mas não limitado à cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, SDS-PAGE, ou extração.

As enzimas podem ser estabilizadas, por exemplo, pelo sal, o açúcar ou o glicerol.

Além disso, as enzimas podem ser formuladas para a aplicação desejada.

Por condições adequadas para a produção de lipídio se destinam quaisquer condições em que o microrganismo seja capaz de crescer e produzir lipídios.

Por condições adequadas para a produção da enzima se destinam quaisquer condições em que o microrganismo seja capaz de produzir enzimas.

Conforme aqui descrito, um microrganismo capaz de usar compostos poliméricos ou oligoméricos extracelulares como sua alimentação, carbono e/ou fontes de energia, são cultivados em um meio de cultura compreendendo a biomassa polimérica contendo estes compostos. O microrganismo tem permissão para produzir lipídios.

Um meio de cultivo se refere aqui a um meio utilizado para o cultivo de microrganismos. O meio de cultura disposto aqui, tipicamente, pelo menos em parte de matéria-prima de celulose e/ou da indústria de papel que contenha compostos parcialmente, poliméricos ou oligoméricos, tais como açúcares poliméricos. Os meios de cultura podem ser suplementados com minerais, micronutrientes, macronutrientes e agentes tamponantes.

A matéria-prima preferida em algumas concretizações da invenção é a biomassa polimérica que compreende lignocelulose, celulose, hemicelulose e/ou lignina, ou outros componentes de material lignocelulósico, como tal ou como uma combinação, ou biomassa tratada quimicamente ou fisicamente, ou pela combinação destes, a fim de melhorar o acesso das enzimas hidrolíticas aos polímeros de açúcar. A matéria-prima de lignocelulose é, de preferência, um resíduo da indústria de celulose e de papel, que contenha, pelo menos, alguns poliméricos de açúcares de hemicelulose e/ou celulose. Como resíduo de celulose e/ou da indústria de papel, incluem, mas não estão limitados a hemicelulose do processo de polpação química, a mistura primária de polpação química, polpação mecânica, destintagem ou processo de fabricação de papel ou de fibra de resíduos.

A biomassa pré-tratada é, tipicamente, uma biomassa que compreende açúcares hexose e/ou pentoses. As biomassas podem ser tratadas antes ou depois do tratamento enzimático, por meios físicos (por exemplo, (termo) mecânico), biológicos e químicos, ou quaisquer combinações dos mesmos e usados posteriormente para a produção de óleo de célula única.

Açúcar Poliméricos se refere à matéria orgânica natural ou material orgânico tratado por diferentes métodos químicos ou físicos ou por sua combinação. Açúcar polimérico, aqui, significa tipicamente um produto industrial ou de uma corrente lateral de um processo de pasta e/ou da indústria de papel, tal como uma fração contendo hemicelulose ou celulose.

A separação do sobrenadante e células do microrganismo a partir do meio de cultura significa qualquer processo pelo qual uma fração de células e uma fração do sobrenadante são obtidas.

Por enzima significa na presente invenção, em particular, uma enzima extracelular capaz de degradar proteínas e carboidratos complexos. Mais especificamente, a enzima é uma enzima hidrolítica degradando uma ligação glicosídica ou peptídica, ligação éster ou éter ou uma ligação entre o nitrogênio e carbono ou nitrogênio e oxigênio. A enzima é, preferencialmente, uma celulase, xilanase, mananase, galactase, pectinase, lipase, esterase ou protease.

A preparação da enzima obtida como aqui descrito é a cultura do microrganismo ou do sobrenadante ou a fração de proteína enriquecida compreendendo enzima cataliticamente ativa. Tipicamente, a preparação de enzima é a água do processo de um processo de produção de óleo de células únicas, ou uma água de processo, onde a fração de proteína é enriquecida. O enriquecimento pode ser realizado por qualquer método apropriado utilizado para o enriquecimento ou para concentração de proteínas em sua forma biologicamente ativa.

O enriquecimento de uma fração de proteína se refere aqui a qualquer método de enriquecimento de proteínas no sobrenadante mantendo a atividade catalítica das proteínas. Mais especificamente, o método compreende que a fase líquida (sobrenadante) a partir de um processo de produção de óleo de células únicas é tratada com pelo menos um método de enriquecimento de proteínas em fase líquida. A fração de proteína é enriquecida em pelo menos 10%, tipicamente, pelo menos 20%, em várias concretizações, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, em menos 90% em comparação com a fase líquida inicial. Exemplos de métodos apropriados são métodos baseados nas propriedades iônicas de proteínas, tamanho de molécula, a solubilidade, propriedades ativas de superfície ou de interações hidrofóbicas. Preferencialmente, a recuperação da fração de enzima é realizado sob condições, onde a temperatura é de 70° C ou inferior.

Celulase ou enzima celulolítica se refere a um grupo de enzimas produzidas principalmente por fungos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, bactérias, plantas, pelos animais que catalisam a hidrólise da celulose, também denominados como celulolise. O número EC para as enzimas de celulase é EC 3.2.1.4. Diversos tipos diferentes de celulases são conhecidos, os quais diferem estruturalmente e mecanicamente. Em geral, as celulases incluem baseado no tipo de reação catalisada, endocelulases, exocelulases, celobiases ou beta-glicosidases, celulases oxidativas, e fosforilases de celulose.

Hemicelulase se refere a um grupo de enzimas produzidas principalmente por fungos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, bactérias, plantas, pelos animais que catalisam a hidrólise de hemicelulose. Por exemplo, as enzimas envolvidas na hidrólise de xilano incluem endoxilanases, acetil-xilanesterases, a-Dglucuronidases, a-L-arabinofuranosidases, esterase de ácido ferúlico e β-xilosidases. Além disso, as enzimas envolvidas na hidrólise de galactoglucomannan incluem endo-mananases, acetil-mannanesterases, a-Galactosidases, β-Glucosidases, β-Manosidases. Além disso, as enzimas envolvidas na hidrólise de arabinogalactana incluem β-Galactosidase e Endo-a-L-arabinanase. Estas enzimas podem ser encontradas sob os seguintes números EC: EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.37, EC 3.2.1.55, EC 3.2.1.99, EC 3.2.1.139, EC 3.2.1.78,

EC 3.2.1.25, EC 3.2.1.22, EC 3.2.1.21, EC 3.2.1.89, EC 3.1.1.72, EC 3.1.1.6, EC 3.1.1.73.

Hemicelulose se refere a um grupo de carboidratos complexos encontrados em um material lignocelulósico que, com outros carboidratos (por exemplo, pectinas), envolvem as fibras de celulose das células vegetais. A composição de hemiceluloses é dependente do tipo de planta. Tipos mais comuns de hemiceluloses incluem xilana, glucoronoxilan, gluco-manana, galactoglucomannan, arabinoxilano, xiloglucano e arabinogalactana.

Material lignocelulósico ou biomassa lignocelulósica se refere à biomassa, que é composta por celulose, hemicelulose, e lignina.

Sacarificação se refere à hidrólise de açúcares poliméricos para monômeros de açúcar. Sacarificação é tipicamente realizada através da utilização de enzimas capazes de hidrolisar açúcares poliméricos.

“Microorganismo oleaginoso se refere aqui como um microrganismo que seja capaz de acumular de pelo menos 15% (p/p) de lipídios da sua biomassa quando cultivada em condições adequadas ou ideais.

Mistura primária da Indústria de Papel e pasta se refere a uma mistura gerada no tratamento primário das águas residuais do processo de pasta e/ou da indústria de papel. A mistura primária constante do material em suspensão na água de resíduos da indústria de celulose e papel normalmente contém celulose oligomérica, hemicelulose e lignina e/ou compostos inorgânicos. Tipicamente, a mistura primária é obtida por sedimentação (clarificação, sedimentação) do material em suspensão é de águas residuais. Além de sedimentação, outros métodos podem ser utilizados para recolher o material em suspensão a partir de pasta de papel e de águas residuais. Isto é considerado como um tratamento primário de águas residuais e os sólidos produzidos são conhecidos como mistura primária.

A celulose in natura tipicamente não se dissolve em água. A hidrólise de celulose sólida requer três tipos diferentes de enzimas. Endoglicanases, exoglucanases e βglucosidases Endoglicanases (EC 3.2.1.4), operadas principalmente sem parte amorfo de celulose, atacam aleatoriamente em reservatórios internos da macromolécula de celulose. Exoglucanases ou celobiohidrolases (CE 3.2.1.91) atacam ao final da cadeia de celulose, hidrolisando principalmentenuma unidade de celobiose de cada vez. Exoglucanases também são capazes de hidrolisar polímero de celulose cristalina. Por último, a hidrólise de celobiose a monômeros de glicose é realizada por βglucosidase (EC 3.2.1.21).

Hidrólise da celulose necessita de cooperação de diversas quantidades de celulases. O montante das diferentes glicosilhidrolases analisadas é muito alto, mais de 90 diferentes enzimas já estão numeradas (ainda mais em estudo) em 14 famílias diferentes como domínios, a exemplo, celobiohidrolase (CBH I, II), domínios endoglucaneses (EG I, II, III, IV, V) e domínios betaglucosidases (BGL I, II). Em diversas aplicações das enzimas na indústria de papel e celulose, tal como na pasta (pré) branqueamento, as fibras de celulose de degradação por celulases é desfavorável.

Para a hidrólise enzimática total da hemicelulose (xilanas, arabinoxilanas e glucomannans) são necessárias várias enzimas diferentes, que devem ser ativadas ao mesmo tempo. Primeiro ataque é realizado por enzimas, tais como endoxilanases (1,4-p-D-xilano xilanohidrolases), endoarabinases e endomannanases (1,4-p-D-manana mananohidrolases). Por exemplo, Trichoderma reesei tem, pelo menos, quatro endoxilanases diferentes e uma endomananase.

As enzimas capazes de hidrolisar a hemicelulose oligomérica após a operação endo-hemicelulases são β-xilosidase, β-arabinosidase, β-manosidase e β-glicosidase (EC 33.2.1.21). Para frear as ligações laterais residuais incluídas nos oligômeros, «-glucuronidase (EC 3.2.1.139), α-arabinodase (EC 3.2.1.55) e α-D-galactosidase (EC 3.2.1.22) são necessários. Para a remoção de acetilcomponentes é necessária à operação das esterases (EC 3.2.1.72).

Além disso, a hidrólise enzimática da lignina requer atividade de enzimas oxidativas, como lignina peroxidase (LIP EC 1.11.1.14), peroxidase dependente de manganês (MnP EC 1.11.1.13) e lacase (Ec 1.10.3.2). Modificação da lignina necessita da cooperação de muitas enzimas, coenzimas e sistema de transporte de elétrons entre doadores e receptores finais. A estrutura química e ligação de lignina para a celulose e hemicelulose são mais importantes do que a quantidade de lignina.

O meio de cultura gasto (efluente) a partir de processo de produção de lipídio ou de resíduos celulares (biomassa residual) do processo de recuperação de lípido a partir de enzimas que têm sido recuperadas pode ser usado para vários fins. Ele pode ser, por exemplo, parcial ou totalmente reciclado para o processo de produção de lipídio. Alternativamente, ele pode ser tratado na estação de tratamento de águas residuais da indústria de papel e celulose. O efluente e/ou biomassa residual contém nutrientes que podem diminuir a necessidade da adição de nutrientes a celulose e/ou processo de tratamento de águas residuais de papel. O meio de cultura gasto e/ou resíduos celulares também podem ser tratados na digestão anaeróbica a biogás, com ou sem suplementação de celulose e/ou resíduos da produção de papel ou de mistura de celulose e/ou processo de tratamento de águas residuais de papel. A mistura da digestão anaeróbia pode ser potencialmente utilizada como fertilizante.

Em resumo, as várias concretizações da invenção são descritas abaixo com o auxílio das seguintes reivindicações numeradas 1 - 31:

Claims

REIVINDICAÇÕES:

1. Processo integrado caracterizado pelo fato de que compreende

- um primeiro processo, o qual é um processo de produção de óleo de célula única, e um segundo processo, o qual é um processo industrial de papel e/ou pasta, em que o material orgânico do processo industrial de papel e/ou pasta é introduzido no processo de produção de óleo de célula única, e em que no processo de produção de óleo de célula única são utilizados microrganismos capazes de produzir lipídios enzimas quando cultivados em um meio compreendendo material orgânico do processo industrial de papel e/ou pasta,

- produzir lipídios e enzimas por meio dos referidos microrganismo no processo de produção de óleo de célula única,

- separar o sobrenadante e as células de microrganismo da cultura de microrganismo,

- recuperar lipídios das células de microrganismo, e

- recuperar o sobrenadante ou uma fração enriquecida de proteína do sobrenadante compreendendo enzimas cataliticamente ativas ou uma diluição do sobrenadante compreendendo enzimas cataliticamente ativas do processo de produção de óleo de célula única e introduzir o mesmo ou os mesmo no processo industrial de papel e/ou pasta.

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REIVINDICAÇÕES

1. Um processo integrado compreendendo:

- um primeiro processo, o qual é um processo de produção de óleo de célula única, e um segundo processo, o qual é um processo da indústria de papel e/ou pasta, onde o material orgânico a partir da pasta e/ou da indústria de papel é introduzido no processo de produção de óleo de célula única, e onde, no processo de produção de óleo de célula única é usado um microrganismo capaz de produzir lipídios ou lipídios e enzimas quando cultivado em um meio compreendendo material orgânico da pasta e/ou da indústria de papel,

- a produção de lipídios ou lipídios e enzimas pelo referido microrganismos no processo de produção de óleo de célula única e/ou em um processo ligado a ele,

- Separação do sobrenadante e/ou células do microrganismo a partir da cultura de microrganismos,

- Recuperação de lipídios a partir de células de microrganismos, e recuperação do sobrenadante ou uma fração enriquecida de proteína do sobrenadante ou uma diluição do sobrenadante compreendendo enzimas cataliticamente ativas do processo de produção de óleo de célula única ou de um processo a ele ligado e, opcionalmente, introduzindo neste ou dentro do processo de pasta e/ou da indústria de papel.

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2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas e lipídios são produzidas pelo mesmo microrganismo.

Petição 870190069368, de 22/07/2019, pág. 33/48

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, onde pelo menos 5% de determinada enzima (s) utilizada no processo de pasta e/ou na indústria de papel são produzidos no processo de produção de óleo de célula única ou em um processo relacionado ao processo.

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3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo produtor de enzima e o microrganismo produtor de lipídio são diferentes

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

onde as enzimas e os lipídios são produzidos pelo mesmo microrganismo. 4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde as enzimas e os lipídios são produzidos por um ou mais microrganismos. 5. Processo, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 4, onde as enzimas produzidas por microrganismo e os lipídios produzidos por microrganismo são diferentes.

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4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as enzimas compreendem hemicelulases, xilanases, mananases, galactosidases, peroxidases, lacases, pectinases, celulases, glicosidases, arabinases, amilases, lipases, esterases ou proteases ou as suas misturas.

4 mostra a xilose liberada no ensaio de hidrólise por proteína. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano de madeira de bétula.

Um mililitro de caldo de cultura a partir do cultivo da hemicelulose de abeto libera 1,2 mg de xilose em 21 horas e 20,1 mg/mg de proteína. Um mililitro de caldo de cultura a partir do cultivo da hemicelulose de bétula libera

5. Processo , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material orgânico alimentado ao processo de produção de óleo de célula única compreende pelo menos 50% de lignocelluloses ou uma fração de lignocelulose, de preferência, pelo menos 10% de açúcare s poliméricos. 6. Processo , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o material orgânico compreende pelo menos 20 %, preferencialmente, pelo menos 30% de hemiceluloses, ou a

fração(ões) da hemicelulose.

5,2 mg de xilose em 21 horas e 234,

6 mg/mg de proteína. Um mililitro de caldo de cultura a partir do cultivo de xilano de bétula libera 5,0 mg de xilose em 23 horas e 101,4 mg/mg de proteína.

Os caldos de cultura de Aspergillus oryzae com hemicelulose ou fonte de carbono xilano apresentaram atividade significante de xilanase. Os caldos de cultura não tinham atividades de celulase detectáveis, como glicose livre não foi detectada no ensaio de hidrólise da celulose. Os exemplos indicam que o meio de cultura gasto de produção de lipídios com Aspergillus oryzae a partir de hidrolisados de hemicelulose de madeira contém as hemicelulases, tais como as xilanases, as quais podem constar na degradação da hemicelulose de materiais de madeira, que é uma propriedade favorável para a celulose (pré) branqueamento. A produção de lipídios de hemiceluloses a partir de material de madeira apresenta uma possibilidade de integração do processo de produção de lipídios a um processo de pasta Kraft ou um processo de pasta de dissolução de hemicelulose com etapa de pré-extração. Além disso, a atividade de hemicelulases, porém a falta de atividade da celulase indica a aplicabilidade das enzimas para a celulose (pré) aplicações de branqueamento.

Exemplo 2

Este exemplo mostra a atividade de xilanase seletiva formada no caldo de cultura, durante o cultivo de Aspergillus oryzae com material à base de lignocelulose, como fonte de carbono para a produção de lipídios.

Aspergillus oryzae foi cultivado para a produção de lipídios com base na celulose de materiais lignocelulósicos. O meio de crescimento de base, continha por litro de água 40 g de material lignocelulósico como fonte de carbono, 1,46 g de peptona como fonte de nitrogênio, 0,5 g de extrato de levedura, 1 g de MgSO47H₂O, 0,5 g de K₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄ e 0,2 g CACl₂-2H₂O, 0,00015 g ZnSO4-7H2O, 0,0001 g de CuCl-2h2O e 0,00625 g MnCl2-4H2O. A fonte de carbono foi moída e peneirada (0,2 mm) de fibra branqueada curta de celulose de sulfato de bétula contendo cerca de 15% de hemicelulose. Este material de celulose foi adicionado à cultura para dar uma concentração final de 50 g/l. O meio de cultura foi inoculado com 50 ml de 48 horas pré-cultivados em suspensão de Aspergillus oryzae. A fermentação foi realizada em 1L de cultura de volume médio de 28°C de temperatura com 0,8 l/min de aeração e 350-450 rpm de agitação. O PH da cultura era de 5,7 e, foi ajustado com 3 M de NaOH durante o cultivo. As atividades enzimáticas foram determinadas depois de 188 horas de incubação.

Os caldos de culturas foram separados e a concentração de proteína e a atividade de xilanase e celulase testadas como descrito acima. A concentração de proteína no meio de cultura foi de 0,11 mg/ml. O açúcar liberado durante os testes de hidrólise como miligramas por mililitro de caldo de cultura e miligrama por miligrama de proteína em função do tempo está apresentado nas Figuras 5 e 6. A Figura 5 mostra a xilose e xilobiose liberada no teste de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano madeira de bétula. A Figura 6 mostra a xilose e a xilobiose liberadas no teste por hidrólise de proteínas. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano madeira de bétula. A Figura 7 mostra o açúcar liberado (xilose e glicose) como % de substrato (500 mg de celulose nativa ou biomassa residual da cultura) durante o teste os testes de hidrólises com 1 ml de solução de xilanase comercial.

Um montante significativo de resíduo de material celulósico ficou após 188 horas de cultivo. Esta biomassa foi tratada com xilanase comercial (proteína de 10,6 mg/ml), a fim de determinar a composição do resíduo. Como celulose de bétula nativa de referência, foi tratada com a mesma solução de enzima. Nos testes de hidrólise a 500 mg de material de celulose seca foi suspensa em 49 ml de tampão fosfato (0,02 M, pH 5) e 1 ml de solução de enzima. O teste de hidrólise foi realizado de maneira semelhante, como os testes de atividade da enzima. O açúcar liberado durante os testes de hidrólise como miligramas por mililitro de caldo de cultura e miligrama por miligrama de proteína em função do tempo é apresentado na Figura 7.

O ensaio de enzima (celulase e xilanase) para o caldo de cultura apresentou apenas atividade de xilanase, mas nenhuma atividade de celulase foi detectada. No teste de hidrólise com xilano como substrato, quantidades significativas de xilose e xilobiose foram liberadas.

O teste de hidrólise com a xilanase comercial (com pequena atividade de celulase) para a biomassa residual apresentou apenas traços de hemicelulose (menos do que 2% de xilose liberada) poderia ser hidrolisada a partir do resíduo de celulose do cultivo.

Em outras palavras, a xilanase formada para o caldo durante a cultura, tinha efetivamente hidrolisada a parte de hemicelulose da celulose.

A partir do material de celulose nativo original usado no cultivo como fonte de carbono, 11% do substrato foi liberado como xilose, quando tratada com xilanase. O material continha cerca de 15% hemiceluloses.

Este exemplo mostra que o Aspergillus oryzae podem produzir enzimas com atividade de xilanase seletiva (sem atividade de celulase) no processo de produção de lipídios quando cultivadas com o material de lignocelulose, como fonte de carbono. Esta xilanase pode ser usada para hidrolisar a hemicelulose seletivamente, deixando uma fração enriquecida de celulose intacta. A atividade de hemicelulases, mas a falta de atividade da celulase indica a aplicabilidade das enzimas na pasta (pré) aplicações de branqueamento.

Exemplo 3

Este exemplo mostra a atividade enzimática formada no caldo de cultura durante o cultivo de Aspergillus terreus com o material à base de hemicelulose como fonte de carbono para a produção de lipídios.

Aspergillus terreus foi cultivado para a produção de lipídios em uma hemicelulose de palha de trigo como substrato de carbono em volume de 2 litros em um biorreator. O meio de cultura constituído por 50 ml de levedura a base de nitrogênio sem aminoácidos e sulfato de amônio (Difco) 10 x solução de stock suspensa em 2L de água e suplementada com por litro: 1,0 g de um extrato de levedura, 1 g de (NH4)2S04, 1 g de MgS0₄-7H₂0, 0,5 g de K₂HP0₄ , 1 g de KH₂P0₄, 0,2 g CACl₂-2H₂0 e 2 g de celulose. O meio de cultura foi inoculado com 150 ml de 24 horas cultura pré-cultivados Aspergillus terreus. A fermentação foi realizada à temperatura de 35°C, com 3,0 l/min de aeração e 200 - 430 rpm de agitação. O pH da cultura foi de 5,7 e foi ajustado com 3 M NaOH, durante o cultivo. Durante o cultivo de hemicelulose, a solução foi alimentada ao fermentador. As atividades enzimáticas foram determinadas depois de 165 horas de incubação.

O caldo de cultura foi separado e foi parcialmente concentrado por ultrafiltração em uma célula agitada Amicon ultrafiltração com um filtro de 10 000 Da (Millipore). A concentração de proteínas e lipídios e a atividade de xilanase e celulase foram testados como descrito acima.

O teor de lipídios na biomassa contendo micélio do fúngico, hemicelulose e celulose residual foram de 15% por peso seco. A concentração de proteína foi de 0,72 mg/mL em caldo de cultura não concentrado e 2,15 mg/ml do caldo concentrado.

O açúcar liberado durante os testes de hidrólise, como miligramas por mililitro de caldo de cultura e miligrama por miligrama de proteína em função do tempo é apresentado nas Figuras 8 - 11.

A Figura 8 mostra a xilose liberada no teste de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano de madeira de bétula. A Figura 9 mostra a xilose liberada no teste de hidrólise por proteína. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano de madeira de bétula. A Figura 10 mostra a glicose liberada nos testes de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 1 g de celulose. Alguma xilose foi liberada da hemicelulose, proveniente do caldo de cultura utilizado. A Figura 11 mostra a glicose liberada no teste de hidrólise por proteína. Como substrato foi utilizado 1 g de celulose. Alguma xilose foi liberada da hemicelulose, proveniente do caldo de cultura utilizado.

Este exemplo indica que o Aspergillus terreus pode produzir os lipídios intracelulares e enzimas hidrolíticas para o caldo de cultura. O exemplo mostra que o Aspergillus terreus produz e excreta para as enzimas, meio de crescimento que tem xilano e atividade de degradação da celulose. Estas enzimas podem ser separadas, concentradas e utilizadas na hidrólise e no tratamento do material lignocelulósico em aplicações foram atividades tanto de celulase e hemicelulose são favoráveis. Tais aplicações em celulose e/ou na indústria de papel podem incluir tais como: a modificação da fibra, destintagem ou descascamento. Além disso, a cepa para a atividade de direção de ambas, celulose e hemicelulose polimérica é aplicável para utilização com ceulose e/ou resíduos da indústria de papel que contém celulose e hemicelulose, tal como mistura primária de destintagem, polpação química e/ou polpação mecânica. Portanto, este exemplo indica uma possibilidade de integrar o processo de produção de lipídios com polpação química, polpação mecânica ou processos de reciclagem de fibras.

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Suutari M, Liukkonen K, Laakso S. 1990. Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids. Journal of General Microbiology 136:1469 - 1474.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, onde as enzimas são produzidas em um processo separado do processo de produção de óleo de célula única integrado no processo de pasta e/ou de indústria de papel.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as enzimas compreendem exoenzimas, de preferência, enzimas associadas com a hidrólise da hemicelulose

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõess 1 a 6, onde as enzimas compreendem as hemicelulases, xilanases, mananases, galatosidases, peroxidases, lacases, pectinases, celulases, glucosidases, arabinases, lipases, amilases, esterases ou proteases ou quaisquer misturas destas.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o material orgânico compreende pelo menos 20%, preferencialmente, pelo menos 30% de celulose, ou a frações da mesma.

Petição 870190069368, de 22/07/2019, pág. 34/48

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde o material orgânico alimentado ao processo de produção de óleo de célula única compreende pelo menos 50% de lignoceluloses ou uma fração de lignocelulose, de preferência, pelo menos, 10% de açúcares poliméricos.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as enzimas compreendem exoenzimas, de preferência, enzimas associadas com a hidrólise da celulose.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, onde o material orgânico compreende pelo menos 20%, preferencialmente, pelo menos, 30% de hemicelulose ou fração (s) de hemicelulose.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo industrial de papel e/ou pasta é selecionado do grupo de um processo de dissolução de pasta, processo de Kraft-pasta, processo de polpa mecânica ou (pré) branqueamento de pasta, ou um processo de pasta mecânico, modificação da fibra, processo industrial de remoção de impurezas, processo de reciclagem de fibras, remoção de manchas, modificação de fibras, produção de papel, ou remoção de lodo e/ou manchas.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, onde o material biológico compreende a hemicelulose ou uma

fração do processo de dissolução de pasta ou extraídos antes do cozimento no processo de pasta kraft ou em

processo de dissolução de pasta.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um fungo filamentoso, levedura ou uma bactéria, de preferência, um fungo que pertence a um gênero selecionado de entre o grupo de Aspergillus, Humicola, Rhizopus e Trichoderma, ou uma levedura pertencendo ao gênero Cryptococcus, ou uma bactéria pertencente ao gênero Streptomyces.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, onde as enzimas compreendem exoenzimas, de preferência, enzimas associadas com a

hidrólise da hemicelulose.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as enzimas produzidas no processo de produção de óleo de célula única são utilizada no processo industrial de papel e/ou pasta como uma preparação de enzimas ou como um fonte de enzimas.

Petição 870190069368, de 22/07/2019, pág. 35/48

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, onde as enzimas compreendem hemicelulases, xilanases, mananases, arabinases, galactosidases, glicosidases, manosidases, xilosidases, arabinofuranosidases ou esterases ou quaisquer misturas destas.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as enzimas produzidas no processo de produção de óleo de célula única são utilizadas para fins catalíticos no processo industrial de papel e/ou pasta. 14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as hemicelulases produzidas no processo de produção de óleo de

célula única são utilizadas em (pré)branqueamento de pasta, aprimorando processo de dissolução de pasta, aprimorando processo de Kraft-pasta, processo de polpa mecânica ou (pré)branqueamento de pasta, processo industrial de remoção de impurezas, remoção de manchas e/ou modificação de fibras, preferencialmente, em (pré)branqueamento.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, onde o material orgânico compreende, pelo menos, 20% de celulose, de preferência, pelo menos, 30% de celulose ou suas frações.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 13, onde o material orgânico é mistura primária e/ou resíduos de fibras de celulose e/ou da indústria de papel.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as celulases produzidas no processo de produção de óleo de célula única são utilizadas em remoção de manchas, modificação de fibras, aprimorando processo de dissolução de pasta, aprimorando processo de Kraft-pasta e/ou processo industrial de remoção de impurezas, preferencialmente, em modificação de fibras e remoção de manchas.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que as enzimas compreendem exoenzimas, de preferência, enzimas associadas com a

hidrólise de celulose.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, onde as enzimas de celulases compreendem endocelulases, exocelulases, cellobiases ou beta-glicosidases, celulases oxidativas, fosforilase de celulose ou de hemicelulases ou quaisquer misturas destas.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que tanto as celulases quanto as hemicelulases são produzidas.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 , em que os produtos da hidrólise de açúcares poliméricos de celulo se e/ou do processo da indústria de papel são reciclados para o processo de produção de lipídios. 19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 , em que o processo de pasta e/ou da

indústria de papel compreende um processo, como um processo de dissolução de celulose, tratamento de material lignocelulósico em, ou antes, de polpação (aumentando a dissolução de polpação), processo de pasta Kraft, tratamento de lignocelulose em, ou antes, de polpação (aumentando a polpação Kraft), (pré) branqueamento da pasta, ou processo de pasta mecânica, modificação de fibras, descascamento, processo de reciclagem da fibra, destintagem, modificação de fibras, fabricação de papel, ou remoção de mistura e/ou pinche.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que o microrganismo é um fungo filamentoso, levedura ou uma bactéria, de preferência, um fungo que pertence a um gênero selecionado a partir do grupo de Aspergillus, Humicola, Rhizopus, Trichoderma e, ou uma levedura que pertence ao gênero Cryptococcus, ou uma bactéria pertencente ao gênero Streptomyces.

21. Preparação de enzimas obtida pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a

19.

22. Uso da enzima produzida conforme o processo definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a preparação da enzima conforme definido pela reivindicação 21, em celulose e/ou da indústria de papel ou em outras aplicações, como uma preparação de enzima ou como uma fonte de enzimas.

23. Uso das hemicelulases produzidas conforme o processo definido por qualquer uma das reivindicações 1 a

20, preparação da enzima conforme definido pela reivindicação 21, em (pré) branqueamento da pasta, aumentando a dissolução do processo de celulose, aumentando o processo de pasta Kraft, descasque, destintagem e/ou modificação da fibra, de preferência, em (pré) branqueamento.

24. Uso de celulases produzidas conforme o processo definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou de preparação de enzima conforme definido pela reivindicação 21, em destintagem, modificação da fibra, aumento do processo de dissolução de pasta, aumento do processo de pasta Kraft e/ou descascamento, preferencialmente, em modificação da fibra e/ou destintagem.

25. Sistema de processo integrado para a produção de lipídios e de pasta e/ou da indústria de papel, o qual compreende que o processo de produção de lipídios usa material orgânico a partir de celulose e/ou da indústria de papel como matéria-prima para a produção de lipídios, e a fabricação de celulose e/ou papel utiliza as enzimas do sobrenadante do processo de produção de lipídios.

26. Sistema de processo integrado para a produção de lipídios e processo de polpação química, o qual compreende que o processo de produção de lipídios utiliza hemicelulose, mistura primária e/ou frações dela como matéria-prima para a produção de lipídios, e processo de celulose e/ou papel utiliza hemicelulases obtidas a partir de processo de produção de lipídios.

27. Sistema de processo integrado para a produção de lipídios e um processo de reciclagem de fibras, que compreende que o processo de produção de lipídios utiliza mistura e/ou frações de destintagem dela como matériaprima para a produção de lipídios, e processo de celulose e/ou papel utiliza enzimas obtidas a partir de processo de produção de lipídios.

28. Sistema de processo integrado para a produção de lipídios e processo de polpação mecânica, o qual compreende que o processo de produção de lipídios utiliza resíduos de pasta mecânica, mistura primária e/ou suas frações como matéria-prima para a produção de lipídios, o processo de celulose e/ou papel usa enzimas obtidas a partir de processo de produção de lipídios.

29. Processo para a produção de lipídios, que compreende:

- Cultivar um microrganismo capaz de produzir lipídios e enzimas em condições adequadas para a produção de lipídios e a produção de enzima em um meio compreendendo um material orgânico a partir de celulose e/ou da indústria de papel, e produzindo lipídios e enzimas pelos referidos microrganismos,

- Separar o sobrenadante e as células de microrganismos a partir da cultura de microrganismos,

Recuperar os lipídios partir de células de microrganismos, e

- recuperar o sobrenadante, ou uma fração enriquecida de proteína do sobrenadante ou de uma diluição do sobrenadante contendo enzimas cataliticamente ativas.

30. Uso dos lipídios produzidos conforme definido pelo processo conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou a preparação de enzima de acordo com a reivindicação 21, como biocombustíveis, como um componente de biocombustível ou como uma matéria-prima para a produção de biocombustíveis.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, em que o biocombustível é o biodiesel ou diesel renovável, gasolina e/ou combustível de jato.

É um objetivo dos exemplos seguintes ilustrar a invenção e não deve ser considerado como limitativo a invenção de qualquer maneira.

Exemplos

As atividades enzimáticas em caldo de cultura gasto a partir de cultivos de fungos filamentosos produtores de gordura foram determinadas através de testes de hidrólise com celulose pura e xilano como substrato.

Métodos

Definição de Açúcar:

De modo a definir a concentração de açúcar de uma solução, a solução foi feita em uma diluição adequada, que foi filtrada através de 0,2 gm, antes da análise de HPLC.

A coluna usada na definição de açúcar foi a de trocaiônica Shodex Sugar SP 0810 em formato de chumbo (na fase estacionária). As dimensões da coluna era 8,0 mm (ID) x 300 mm. O eluente era água (taxa de fluxo de 0,6 ml/min) e a temperatura da coluna era de 60°C. O detector foi RI Shimatzu 10A RID e a bomba foi A6 e o autoamostrador foi Shimatzu SIL 20A. O processamento dos resultados foi realizado com o software de Classe VP.

Análise de ácidos graxos:

A composição de ácidos graxos das amostras foi determinada, tal como no método descrito por Suutari e colaboradores (1990). Os lipídios nas amostras, primeiramente foram hidrolisados em ácidos graxos livres, os quais foram saponificados em seus sais de sódio e em seguida metilados em ésteres de metil. Os ésteres de metil de ácidos graxos foram analisados por cromatografia a gás.

Análise da concentração de proteína:

A concentração de proteínas dos caldos de cultura foi analisada após a filtração do caldo, através de papel de filtro Whatman3. A concentração de proteína foi analisada de acordo com o Ensaio de Proteínas Bio-Rad (baseado no método de Bradford).

Testes de hidrólise: O caldo de cultura foi filtrado através de papel de filtro Whatman3 antes do teste de hidrólise. A atividade de xilanase foi determinada da seguinte forma. Um frasco de 100 ml de Erlenmeyer foi usado como

recipiente de reação. Ele foi preenchido com 20 ml de solução a 1% de xilano de madeira de bétula (Sigma), em tampão fosfato (0,02 M, PH 5) como substrato, a 10 ml de caldo de cultura filtrado e 20 ml de tampão fosfato (0,02 M, pH 5). A reação de hidrólise foi realizada em um banhomaria agitado (140 rpm) a 50 C. As amostras de 1 ml foram tomadas a partir do recipiente de reação, imediatamente

após a adição do caldo de cultura e depois de 1, 3, 5, 21/23 horas. A reação de hidrólise foi interrompida, na amostra de 1 ml, através da diminuição do pH pela adição de

50 pl de ácido sulfúrico a 1,33 M. As amostras foram tratadas, para a remoção de sal e açúcar polimérico para atender HPLC-análise. Os açúcares liberados foram analisados por meio de HPLC (ver definição do açúcar) com manitol como padrão.

A atividade de celulase foi determinada com 1 g de papel de filtro Whatman de celulose como substrato, em vez de xilano. O volume de reação foi de 50 ml, contendo 1 g de papel de filtro Whatman em círculos de tamanhos iguais

(cerca d e 5 mm de diâmetro) como substrato, a 10 ml de caldo de cultura filtrado e 40 ml de tampão fosfato (0,02 M, PH 5) . A experiência foi realizada de outra maneira, como com xilano. Cepas de microrganismos:

Os microrganismos produtores de lipídios, tipicamente, estão disponíveis para o público, a partir de uma pluralidade de coleções de cultura microbiana reconhecida (cepa), tais como a ATCC, DSM, etc. Várias concretizações da invenção são discutidas nos exemplos seguintes, utilizando cepas de microrganismos, como se segue. Aspergillus oryzae DSM 1861, Aspergillus oryzae DSM 1864 e Aspergillus terreus DSM 1958.

Exemplo 1

Este exemplo apresenta a atividade enzimática formada no caldo de cultura, durante o cultivo de Aspergillus oryzae com o material à base de hemicelulose como fonte de carbono para a produção de lipídios.

Aspergillus oryzae foi cultivada em culturas em frascos com xilano de bétula purificada (Sigma) e abeto e hemiceluloses de bétula extraídas com a extração de água quente pressurizada como fonte de carbono. Os cultivos foram realizados em frascos de 250 ml de Erlenmeyer, contendo 50 ml de meio de cultura. O meio de crescimento de base, continha por litro de água, 1 g de (NH₄)₂SO₄, 1 g de MgSO₄-7H₂O, 0,5 g de K₂HPO₄, 1 g de KH₂P0₄ e 0,2 g CACl₂-2H₂0 e foi suplementado com fonte de carbono, extrato de levedura e, opcionalmente, material de apoio. Os meios de cultura foram inoculados com 1% (v/v), a suspensão de esporos dos fungos e as culturas foram incubadas a 28°C de temperatura.

No caso da base de xilano purificado, o meio foi suplementado com 40 g por litro de xilano de bétula purificado (Sigma) e 1 g de extrato de levedura. Culturas duplicatas foram incubadas no agitador orbital (160 rpm) durante 6 dias.

No caso da hemicelulose de bétula e abeto, o meio foi suplementado com 44 g por litro de abeto seco ou hemicelulose de bétula produzida por extração de água quente, 0,5 g de extrato de fermento e 2 g de celulose para se obter um suporte mecânico para o micélio fúngico. Cultivos em triplicado foram incubados em agitador orbital (180 rpm) durante 7 dias.

Após a incubação, o caldo de cultura foi filtrado através de papel de filtro Whatman 3. As atividades de concentração da proteína e enzimas foram determinadas a partir do filtrado. O produto retido foi lavado com água destilada e seco. A concentração de biomassa e o conteúdo lipídico foram determinados partir das amostras secas.

No purificado xilano de bétula após 6 dias do cultivo Aspergillus oryzae, o fungo produziu 16 g/l de biomassa (peso seco) e da biomassa contida 10,5% de lipídios/peso seco. Aspergillus Oryzae cultivado em água extraída de hemicelulose bétula, produziu 14 g/l de biomassa seca durante 7 dias de incubação. A biomassa contendo micélio fúngico, hemiceluloses e resíduo de celulose continha 8,9% de lipídios/peso seco o equivalente a 1,26 lipídios por litro do meio de cultura. Para a produção de lipídios, ambos xilano de bétula e hemicelulose foram melhores do que a

hemicelulose de abeto, como na hemicelulose de abeto 8,7 g/l de biomassa seca contendo 3,7% de lipídios/peso seco foi produzido. A concentração de proteínas dos caldos de cultura foi de 0,06 e 0,02 mg/ml para o abeto, bétula e cultivos de hemiceluloses e 0,05 mg/ml para o cultivo de xilano de

bétula.

A xilose liberada no teste de hidrólise, o xilano como uma função do tempo por mililitro de caldo de cultura e por miligrama de proteína na reação é apresentado nas Figuras 3 e 4. A Figura 3 mostra a xilose liberada no ensaio de hidrólise por volume de caldo de cultura. Como substrato foi utilizado 200 mg de xilano madeira de bétula. Na Figura

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que os lipídios produzidos no processo de produção de óleo de célula única são utilizados como biocombustível ou como um componente de biocombustível ou como um material de partida para a produção de biocombustíveis.