CN103348013B - 集成过程体系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种集成方法，其包括单细胞油生产过程和制浆和/或造纸工业过程。该方法包括在单细胞油生产过程中使用在包含来自制浆和/或造纸业的有机物质的培养基上培育时能够产生脂质或脂质和酶的微生物。在单细胞油生产过程和/或在与之关联的过程中由所述微生物产生脂质或脂质和酶。本发明也涉及所述方法中产生的脂质作为生物燃料或作为生物燃料组分或作为生物燃料的原料的用途和脂质生产过程中产生的酶作为酶制备物或作为酶来源在制浆和/或造纸业中或在其他应用中的用途。

Description

集成过程体系

本发明涉及一种集成过程体系，其中过程之一是制浆或造纸工业过程并且另一个过程是单细胞油生产过程(微生物脂质生产过程)。本发明也涉及用于在该集成系统中从制浆和/或造纸工业残余物产生脂质的方法和所述脂质的用途。

背景技术

半纤维素代表木质材料中相对大的级分，取决于木材种类一般占木质材料的20至40重量%。在化学制浆过程中，如硫酸盐纸浆过程和溶解浆过程，将木材脱木质素。除木质素之外，半纤维素还在化学制浆过程中很大程度地与纤维素分离，并且取决于工艺，最终纸浆产品仅含有少量半纤维素或不含半纤维素。因此，大约一半的木材溶解于化学制浆过程中。在制浆过程中，如硫酸盐制浆或亚硫酸盐制浆(溶解浆)，与纸浆分离的半纤维素级分主要被燃烧并且不被定价。

在主流制浆过程中，硫酸盐法制浆(硫酸盐制浆或蒸煮)，木材木质素和部分地半纤维素在严酷条件下在蒸煮器中溶解(蒸煮)。所得到的液体(黑液)中的半纤维素降解产物相当复杂，难以从黑液中分离并纯化，并且其微生物加工适应性差。出于这种原因，将黑液在回收锅炉中燃烧以产生电和热能。然而，半纤维素具有明显低于木质素的热值，燃烧溶解的半纤维素并不构成这种资源的最佳经济用途。因此，应当优选地在蒸煮之前提取半纤维素，以产生价值更高的产品。限定半纤维素价格的一种选择是通过微生物学过程将其转化成化学品和/或生物燃料(例如乙醇、丁醇)。然而，制浆之前的这种半纤维素预提取不应当降低纸浆产量或品质。

溶解浆(也称作溶解纤维素)是一种具有高纤维素含量(>90%)的漂白木浆。溶解浆是用作多种类型纤维素衍生物(例如人造丝(纺织品)、赛璐酚、醋酸纤维素和甲基纤维素)的原料的化学纸浆等级。溶解浆由采用制浆过程之前提取半纤维素的亚硫酸盐法或硫酸盐法产生。半纤维素是如今在锯木厂大多遭废弃的副产品，因为它经常在锅炉中燃烧并且大部分能量作为废热损耗。

可以在硫酸盐制浆之前应用几种不同的半纤维素预提取方法，如加压热水提取法(水热处理)和使用可能补充有酸催化剂(如SO₂)的醇类(例如乙醇、甲醇)和/或有机酸(例如乙酸、甲酸、苹果酸、乳酸或过乙酸)的各种有机溶剂方法。这些方法可以促进从纸浆部分主要地取出半纤维素或同时取出木质素和半纤维素。在大部分的这些预提取方法中，半纤维素至少部分地以低聚物形式获得。这些低聚物需要在可以通过微生物使它们转化成终产物之前水解成单体。取决于半纤维素的类型(取决于木材种类)，可以通过特异性酶，如木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶和/或甘露聚糖进行半纤维素中的糖低聚物向糖单体的转化。这类酶是由某些微生物（一般真菌或细菌）产生。

已经在现有技术中提出了包括在制浆过程之前预提取半纤维素和利用半纤维素级分产生乙醇或化学品的生物炼制概念。Huang等人,(2008)中提出半纤维素预提取方法的综述，并且由Marinova等人,(2009)提供包括半纤维素预提取的硫酸盐制浆生物炼制的概览。专利公布US20090165968描述一种在硫酸盐制浆过程之前预提取半纤维素的方法，所述方法增强纤维素对用于乙醇和化学品的生物发酵的易感性。Mendes等人,(2010)中描述了从源自桉树硫酸盐制浆过程的预提取半纤维素生产。

虽然在现有技术中已经描述可以借以提取木质材料并且尤其半纤维素用于制浆工业过程的各种方法，但是对于制浆工业过程，仍需要将促进木质材料、尤其半纤维素的分级和进一步维持价格的新工艺。

木质纤维素材料的降解和利用对于制浆工业过程以外的其他工业领域也是重要的。单细胞油已经在传统上用作专用产品，例如在健康食品中。为产生用于生物柴油生产的脂质，也已经描述相似类型的生产过程。然而，由于这种产品是一种价廉商业化学品，工艺成本不应当高于专用产品的工艺成本水平。另外，异养性微生物的脂质产率一般非常低，小于20重量%的所供给的糖，在最佳情况下，22-24%的可用糖可以转变成油。归咎于这些原因，必需利用低成本原料如木质纤维素原料用于油生产。

使用微生物的单细胞油生产过程通常包括在曝气生物反应器中培育微生物，允许细胞积累脂质，收获富含脂质的细胞并且从细胞回收。

已经在一些最近专利出版物中提出利用纤维素原料生产油。US2009/0064567A1公开了通过通过使用含纤维素原料作为主要碳源，培育原生藻菌(Stramenopile)界微生物，借助异养发酵生产生物油。纤维素由酶或由能够糖化纤维素的其他微生物水解。WO2009/0011480A1公开了通过微藻和真菌从解聚的纤维素物质产生生物油。

专利公布US2009/217569公开了从多种木质纤维素水解物和其他材料水解物（包括用于生产生物燃料的木材工业和制浆业和造纸业残余物）生产细胞油。该方法包括用水、酸或碱处理来源材料并且使其滤液或沉淀物与产脂质微生物接触。现有技术还描述了通过能够产生纤维素酶或半纤维素酶的生物，直接从木质纤维素中的聚合物糖如木聚糖(Fall等人,(1984))或纤维素(LinHui等人,(2010))中产生脂质。

酶促水解一般在生物燃料生产过程的单独步骤中由商业酶进行。一般地，购买并且在实际生物燃料生产过程中之外产生商业酶。酶价格是通过微生物学过程使纤维素物质转化成生物燃料时的主要成本因素。

概述

本发明的一个目的是为现有技术中遇到的问题提供解决方案。具体而言，本发明旨在为制浆和/或造纸业过程中遇到的问题提供技术上有益的解决方案。

另一个目的是为大规模生产单细胞油中遇到的问题提供技术上有益的解决方案。

本发明的又一个目的是提供解决方案，所述解决方案能够提高大规模生产单细胞油的经济性。

本发明的又一个目的是提供解决方案，所述解决方案能够减低环境负担。

本发明特别旨在解决与制造交通用生物燃料相关的问题。

为实现这些目的，本发明特征在于独立权利要求所列的特征。其他权利要求代表本发明的优选实施方案。

本发明方法基于以下研究结果：制浆和造纸工业过程的旁流包含显著量的养分，所述养分可以充当微生物的、尤其产脂质微生物的碳源。

现在已经令人惊讶地发现脂质生产过程产生显著量的蛋白质，尤其酶。更具体地，与单细胞油生产过程相关，可以产生显著量的能够降解来自制浆和/或造纸业的木质材料或有机物质的酶。在本发明中，已经发现脂质生产过程中产生的酶可以在制浆和/或造纸工业过程中再利用，如用于制浆工业过程中，例如用于纸浆漂白、纸浆脱墨、在化学制浆之前处理木质纤维素、制造溶解浆、剥皮（debarking）或纤维改性过程中。

在一个方面本发明提供一种集成系统，所述系统包括作为单细胞油生产过程的第一过程和作为制浆和/或造纸工业过程的第二过程。在该系统中，来自制浆和/或造纸业的有机物质导入脂质生产过程中，并且在脂质生产过程中使用在包含来自制浆和/或造纸业的有机物质的培养基上培育时能够产生脂质或者脂质和酶的微生物。在一个实施方案中，在单细胞油生产过程中由所述微生物产生脂质或脂质和酶。在一个实施方案中，在与单细胞油生产过程关联的过程中产生酶。

所述酶可以从微生物培养物、使用过的培养基（spentculturemedium）或上清液回收。

一般，上清液和微生物细胞与微生物培养物分离并且脂质从微生物细胞回收。在本发明的多种实施方案中，包含催化活性酶的上清液或所述上清液的蛋白质富集级分或所述上清液的稀释物从脂质生产过程或从与之关联的过程回收。在一个实施方案中，将包含酶的上清液或所述上清液的蛋白质富集级分从脂质生产过程导入制浆和/或造纸工业过程中。

在本发明的一个实施方案中，酶在独立于脂质生产过程的过程中或由不同于产脂质微生物的另一种微生物产生。

在本发明的一个优选实施方案中，酶和脂质由相同的微生物产生。

在本发明的一个优选实施方案中，微生物脂质生产过程利用来自制浆和/或造纸业的级分或残余物，如半纤维素或初沉污泥，如来自制浆过程或脱墨过程，并且它产生用于制浆和/或造纸工业过程的有用物质，如酶。同时，这种微生物过程产生可以用于各种目的例如用于生产生物燃料的大量脂质。这种集成过程体系提供一种更完整利用制浆和/或造纸工业过程中的木质纤维素生物质并维持其价格的方式。

制浆和/或造纸业可以潜在地通过维持旁流价格比现有技术过程生产种类更多的有价值副产物并且使竞争优势成为可能。

总之，可以得出结论，本发明提供以下益处：

-本文所述的本发明可以改善制浆和/或造纸工业过程的成本有效性。

-通过生产运输用生物燃料维持半纤维素流的价格产生经济益处。在现有技术的硫酸盐制浆厂中，半纤维素最终变成黑液并且被燃烧。

-转化来自制浆和/或造纸业的含有纤维素的残余物，如来自脱墨、剥皮、化学制浆过程、机械制浆过程或造纸过程的初沉污泥。通过微生物产生有价值的产物如脂质，增加当前有氧和/或无氧废水处理过程的价值。

-现场产生制浆和/或造纸工业过程中所需要的酶导致节省成本。这也减少使用之前稳定酶的需求。

-相比于以专用半纤维素生产和/或脂质生产工段为特征的过程，脂质生产的联合生物加工过程(在相同工艺步骤中酶消化和发酵)降低成本并提高效率。通过消除或减少外购酶的需要而降低成本。

-化学制浆过程产生大量过剩能量，主要是热。利用来自制浆过程的多余热导致改善能量效率。例如，来自制浆过程(木质素燃烧)的热用于浓缩半纤维素水解物(糖浆)中的糖、纯化水解物或用于回收脂质生产过程的油回收中的溶剂。

-处理木质纤维素材料或包含其他聚合物糖生物质的材料的能量成本因使用替代商业酶或除商业酶之外的来自单细胞油过程的酶本身和热机械和化学处理而降低。

-从单细胞油生产发酵过程的其余液体中取出酶蛋白减少了从单细胞油生产过程释放的发酵液的生物耗氧负荷。

-从发酵废水中减少或取出酶蛋白(而不是在工艺流中造成生物负荷)、将它们为催化目的再利用并且作为单细胞油生产过程或其他生物技术过程中的养分使用时，改善单细胞油过程的碳平衡。

附图简述

图1和图2显示过程示意图。

图3显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图4显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图5显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖和木二糖（xylobiose）。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图6显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图7显示在采用1ml商业木聚糖酶溶液的水解试验期间释放糖(木糖和葡萄糖)占底物(500mg天然纤维素或来自培养的残余生物质)的%。

图8显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图9显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

图10显示每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。

图11显示每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。

发明详述

“单细胞油生产过程”在本文中指一种方法，其包括以下步骤：形成脂质合成微生物或允许其形成并允许如此获得的生物物质产生和/或贮存(积累)脂质，从液相回收细胞，并且从细胞和/或从培养基或培养液提取或回收脂质。如本文稍后所述，在多种微生物群体中、如细菌、古细菌、真菌(丝状真菌)、酵母和藻类中为产生单细胞油的微生物。

如本文所述，本发明优选地使用能够产生脂质和酶两者的微生物。在本发明的一些实施方案中，“微生物”指两种或更多种微生物。在一些实施方案中，酶由一种微生物产生，单细胞油（脂质）由另一种微生物产生。

术语“单细胞油”指脂肪性物质，其分子通常含有脂族烃链作为部分，其溶解于非极性有机溶剂中但是在水中溶解不良。单细胞油是活细胞中重要的一组大分子。单细胞油例如是脂质、脂肪、蜡、蜡酯、固醇、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基链烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪醛、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和酰基甘油如三酰甘油、二酰甘油或单酰甘油。

本发明中，优选的单细胞油是脂质、脂肪、蜡、酰基甘油和脂肪酸和它们的衍生物，尤其三酰甘油和蜡酯。

与本发明相关，“脂质”作为单细胞油的同义词使用并且“脂质生产过程”作为单细胞油生产过程的同义词使用。

“制浆工业过程”在本文中指的过程旨在从木质纤维素材料或再循环的纤维生产纸浆以及纸浆生产所需要的纤维材料。

“制浆和/或造纸业”在本文中指产生各种类型的纸、纸板、纸张、新闻纸、卫生纸和纸板制品、纸浆和隔离板和硬质纤维板的产业分支。制浆和/或造纸业使用木质纤维素材料或再循环的纤维作为原料。制浆和/或造纸业包括多种方法，如化学制浆法、机械制浆法、半化学制浆法、化学热法机械制浆法、循环纤维法和造纸。

“化学制浆法”指一种方法，其中木质纤维素材料如木材或木屑用化学品和热处理，这导致移除大部分木质素并因而释放纤维，而不严重损伤纤维素纤维。一般，大部分木质素和半纤维素在化学制浆法中变成水溶性并且因此在纸浆中从纤维移除。大约一半的木质材料溶解于化学制浆过程中。用于化学制浆的主要方法是硫酸盐制浆法和溶解浆法(亚硫酸盐法)。苏打蒸煮法是硫酸盐蒸煮法的改进形式，其中不使用亚硫酸钠

“硫酸盐制浆法”或“硫酸盐制浆”或“硫酸盐蒸煮”指其中木质纤维素材料用氢氧化钠和硫化钠的混合物处理的化学制浆过程，所述混合物破坏使木质素与纤维素连接的键。苏打蒸煮法是硫酸盐蒸煮法的改进形式，其中不使用亚硫酸钠可以使用有机溶剂，如乙醇、甲醇和过乙酸作为硫酸盐制浆法中的强化化学品。

“溶解制浆法”或“亚硫酸盐法”指其中亚硫酸(H₂SO₃)和亚硫酸氢盐离子发挥降解和溶解木质素作用的化学制浆过程。酸性亚硫酸盐制浆在低pH1至2进行，而中性的亚硫酸盐制浆在pH7至9进行。可以使用有机溶剂，如乙醇、甲醇和过乙酸作为溶解浆法中的强化化学品。

“有机溶剂法”指其中使用有机化学品来实现移除木质素和释放纤维的化学制浆过程。有机溶剂法中使用的常见有机化学品包括但不限于甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、过乙酸、乙酸乙酯和丙酮。可以通过添加酸催化剂如硫酸或二氧化硫(SO₂)强化有机溶剂法中木质素的移除。

“机械制浆”指以机械方式如碾磨释放木质纤维素材料如木材或木屑中的纤维的过程。主要类型的机械浆包括石磨木浆和精磨浆。通过碾磨原木产生石磨木浆，并且如果木材在碾磨之前经蒸汽处理，则它称作压力磨木浆。通过将木屑供给至转盘中心(精磨)产生精磨浆，如果在精磨浆料之前用蒸汽处理浆料，则它称作热法机械浆。在制造化学-热法机械浆中，木材是用化学品如亚硫酸钠和蒸汽预处理以通过精磨木屑形成匀浆（refining）。在全部情况下，纸浆产率高，一般是95至98%、这意味着全部木材组分均留在纤维中，仅易水溶性物质少量丧失，这不同于纸浆产率显著较低的化学制浆过程。

“再循环纤维过程”或“纤维再循环过程”指使用用过的纸浆产品(如纸)并且使其再成为新纸浆或纸制品的过程。该过程使得纸浆和纸制品的再循环和再利用成为可能。再循环纤维过程通常由三个步骤：纸再制浆、移除杂质如油墨(脱墨)和纤维漂白组成。

根据本发明的一个优选实施方案，利用能够既产生能水解低聚糖的酶，又产生生物燃料的微生物，实施水解和生物燃料生产。一般，这在单个步骤中实施。

根据本发明的一个优选实施方案，至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、优选地至少50%、更优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%在制浆和/或造纸工业过程中使用的某些酶由还产生脂质的微生物产生。在制浆和/或造纸工业过程中，可以使用几种酶，其中通常一些酶或酶的组在集成单细胞油生产过程或与之相关的过程中产生并且一些酶或酶的组从其他来源获得，例如是商业酶。

产生脂质的微生物意指一种或多种产脂质微生物，优选地一种产脂质微生物。

根据本发明的另一个实施方案，酶在相同的脂质生产过程中或与所述过程相关的过程中由不同于产脂质微生物的一种或多种其他微生物产生。微生物可以是产生高效特异性酶，如水解酶的微生物，例如木霉属(Trichoderma)或芽孢杆菌属(Bacillus)微生物。“与脂质生产过程关联的过程与”例如意指其中用于脂质生产过程的原料例如用酶处理的过程。

根据本发明的又一个实施方案，酶在独立于脂质生产过程的过程中产生。这些酶例如在借助高效产生特异性酶（如水解酶）的微生物的单独方法中产生。可选地，酶是商业酶。

根据本发明的又一个优选实施方案，以相似的方式利用能够既产生能水解低聚糖的酶，又产生生物燃料的微生物，实施水解和生物燃料生产，但是产生的酶单独用来水解原料，如纤维素(或半纤维素)水解。然后水解产物用于发酵中。

根据本发明的又一个实施方案，将基于异养微生物的脂质生产过程集成至制浆和/或造纸工业过程中。异养微生物使用来自制浆和/或造纸业的残余物或级分作为脂质生产的原料。

在本发明的一个实施方案中，用于脂质生产的有机物质包含来自制浆和/或造纸业的至少30%、优选地至少50%、优选地60%的木质纤维素，优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%的木质纤维素或木质纤维素衍生物质。

在本发明的一个实施方案中，脂质生产过程中使用的来自制浆和/或造纸业的有机物质包含至少60%、优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%的木质纤维素级分，或衍生自木质纤维素的物质，如半纤维素或纤维素。

在本发明的一个实施方案中，脂质生产过程中使用的来自制浆和/或造纸业的有机物质包含至少5%、至少10%；至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%的聚合物糖。

单糖在来自脱木质素的水解物中的聚合度和量很大程度上取决于木质纤维素蒸煮法或预处理法。一般而言，木质纤维素材料的加压热水提取法产生主要由低聚半纤维素组成的半纤维素级分。另一方面，溶解制浆过程一般产生水解物，即使用过的亚硫酸液，其中半纤维素糖主要地处于单体形式。

在本发明的一个实施方案中，脂质生产过程中使用的来自制浆和/或造纸业、可能至少部分移除木质素的有机物质包含至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%的半纤维素或衍生自半纤维素的物质。

在本发明的一个实施方案中，脂质生产过程中使用的来自制浆和/或造纸业、至少部分移除木质素的有机物质包含至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%优选地至少70%、更优选地至少80%、仍更优选地至少90%的纤维素。

更具体地，用于微生物脂质生产的合适级分包括在实际制浆过程之前分离的半纤维素物质。这种整合可以用于不同类型的制浆过程中，包括硫酸盐制浆过程和溶解制浆过程。

在本发明的一个实施方案中，以一个步骤实施纤维素酶和/或半纤维素酶产生、纤维素和/或半纤维素水解和发酵。这提供比特征在于专门产生纤维素酶和/或半纤维素酶的过程更低的成本和更高的效率。这导致避免与纤维素酶和/或半纤维素酶生产相关的资本、底物和其他原料和基础设施的成本。此外，它提供获得更高水解速率并且降低反应器容积和资本投入的可能性。通过消除或至少减少对独立生物加工过程产生酶的需要，单一步骤方法显著降低成本。

在本发明的又一个实施方案中，异养微生物使用来自制浆和/或造纸业的初沉污泥，如脱墨、剥皮、化学制浆、机械制浆或造纸初沉污泥。初沉污泥可以与来自制浆和/或造纸业的其他级分或残余物如半纤维素或纤维素组合。

因为拥有外切酶，如能够降解半纤维素的半纤维素酶，脂质生产中使用的微生物从而优选地能够利用聚合物半纤维素。半纤维素酶，如木聚糖酶，阿拉伯糖酶，甘露聚糖酶，半乳糖苷酶，可以从来自脂质生产过程的使用过(用过)的培养基回收并且再用于制浆过程中，例如用于纸浆漂白、纸浆脱墨、制造溶解浆或纤维改性。这类酶可以例如由真菌或细菌产生，真菌优选地属于曲霉属(Aspergillus)、米曲霉(A.oryzae)、腐质霉属(Humicola)、根霉属(Rhizopus)或木霉属，或者细菌优选地属于链霉菌属(Streptomyces)。

在本发明的另一个实施方案中，使用能够利用半纤维素和纤维素中聚合物糖的产脂质微生物。半纤维素酶和/或纤维素酶可以从来自脂质生产过程的使用过(用过)的培养基回收并且再用于制浆过程中，例如用于纤维改性、处理再循环的纤维或脱墨。这类酶可以例如由真菌或细菌产生，真菌优选地属于曲霉属如土曲霉(A.terreus)，或细菌属于链霉菌属。

根据本发明的一个优选实施方案，从微生物过程中回收脂质生产时从制浆和/或造纸业旁流或残余物，如从制浆和/或造纸厂旁流或残余物(如半纤维素流或初沉污泥)中产生的酶并且将它们用于制浆和/或造纸业中，如用于制浆和/或造纸厂中。优选地，用于纸浆(预)漂白应用或用于从溶解制浆过程中移除残余木聚糖的半纤维素酶酶拥有低纤维素降解活性或无纤维素降解活性，以便不影响或降解纸浆中的纤维素纤维。这类酶可以例如由真菌产生，真菌优选地属于曲霉属如米曲霉，所述真菌还是含油的并且能够从半纤维素积累脂质。半纤维素酶类的另一种再利用应用是使它们再循环返回脂质生产过程。

酶可以在制浆和/或造纸业中还用来降低纸制造成本或改善产品。这些酶的主要用途包括纸浆漂白，其中使用半纤维素酶(例如木聚糖酶和甘露聚糖酶)和可能使用漆酶，以便促进半纤维素和/或木质素移除。酶在纸浆漂白中的用途减少漂白化学品的消耗并且产生经济益处和环境益处。制浆过程中使用的酶是独立酶工厂中生产的商业酶。现场生产酶可以节约成本，这归因于减少酶加工的需要，如在使用之前的稳定化。

另外，制浆和/或造纸业中存在酶的许多其他应用，如帮助脱墨、增强硫酸盐制浆、减少纸张掉毛(vesselpicking)、辅助浸解、选择性移除纤维组分、调节纤维性能、增加纤维柔性和共价连接侧链或官能团、剥皮、清洁造纸机和移除沥青及淀渣。

出于美感原因或为了改善纸性能，纸浆漂白，即从化学纸浆移除木质素，是必需的，因为亚硫酸盐制浆后留下的残余木质素赋予纸不想要的棕色。酶促处理的目的取决于实际工厂条件并且可以与环境要求、降低化学品成本或维持或改善产品质量相关。

木聚糖酶的最重要应用是预漂白硫酸盐纸浆，并且木聚糖酶已经作为有毒含氯化学品的替代品赢得重要性。用木聚糖酶处理化学纸浆导致节省漂白化学品消耗量、减轻环境负荷和/或增加纸浆的最终白度。主要驱动力已经是酶带给漂白厂的经济和环境优势。木聚糖酶也可以用于移除粗纤维束(制浆中尚未分离成单根纤维的纤维)。

木聚糖酶可以在溶解制浆过程中用于加工纤维素纸浆以除去残余木聚糖。酶能够选择性地降解半纤维素级分，而不影响纤维素。一旦半纤维素由半纤维素酶移除，则木质素更容易地由酶(如漆酶)可移动并可降解。为增强硫酸盐纸浆的脱木质素所需要的主要酶是内切-β-木聚糖酶，但是已经显示其他酶如甘露聚糖酶、脂肪酶和α-半乳糖苷酶的富集改善酶促处理硫酸盐纸浆的效果。木聚糖酶可以减少氧化性化学品需求至多到20%-40%(Beg等人,2001)。所得到的酶制备物必须完全不含任何纤维素酶活性。此外，需要在高温和碱性pH有活性并稳定的木聚糖酶(Beg等人,2001)。耐碱酶是优选的，因为它们可以在纸浆漂白时不调节pH的情况下发挥作用(Bajpai2004)。

用于产生木聚糖酶、尤其用于纸浆漂白的优选微生物是曲霉属和木霉属物种的真菌木聚糖酶和芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种和梭菌属物种的细菌木聚糖酶。这些属中，尤其曲霉属和链霉菌属包含含油（oleaginous）物种，即合适或最佳条件下培育时能够积累大量脂质(>15%其细胞干重)。

根据本发明，在来自制浆和/或造纸业的原料上培育时，所述微生物能够产生并积累占其细胞干重至少3%(w/w)的脂质，优选地至少5%、更优选地至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%的脂质。

酶也可以用于纸浆的纤维改性，尤其机械制浆过程的纸浆精磨。纤维的酶促改性旨在减少生产热法机械浆时的能量消耗并且增加化学浆的打浆性能或改善纤维性能。

木聚糖酶和果胶酶可以用来辅助剥皮并且可以导致剥皮过程中的显著能量消耗。

已经发现低浓度木聚糖酶和纤维素酶的混合物明显地增加再循环纤维的游离度，而基本上不降低产率。

溶解浆可以用来生产纤维素物质如乙酸酯、赛璐酚和人造丝。它们的制造以高度纯化的纤维素的衍生化和因此其溶解为特征。从纸浆移除半纤维素需要使用高度苛性的填料和适宜制浆条件，如亚硫酸盐制浆和酸预处理的硫酸盐制浆。溶解制浆过程中的木聚糖酶处理可以减少苛性提取期间所要求的化学加载或促进从硫酸盐纸浆提取半纤维素。

酶可以用于纸浆脱墨以便使次生纤维转化成高品质产品。脱墨中所用的酶可以例如是纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、酯酶、脂肪酶和果胶酶。

脂肪酶可以用于移除制浆中的树脂，所述树脂在纸机中造成操作问题。特定酶，如果聚糖水解酶、淀粉酶和蛋白酶也可以用来清除和减少造纸机中的淀渣。

半纤维素代表木质材料中相对大的级分，取决于木材种类一般占木质材料的20至40重量%。半纤维素还在制浆过程中与纤维素分离，并且取决于工艺，最终纸浆产品仅含有少量半纤维素或不含半纤维素。为了整合脂质生产过程与传统硫酸盐制浆过程，在实际制浆过程之前要求额外的半纤维素分离单元过程。这种单元过程可以是将半纤维素与木质纤维素材料分离的任何过程，如，但不限于加压热水提取法(水热处理)、酸处理或有机溶剂处理。

在溶解制浆过程的情况下，现有方法，如采用半纤维素提取(如酸处理)的溶解制浆法或硫酸盐法，产生含有可发酵糖的半纤维素流和木质素流，并且脂质生产过程可以更容易地集成至制浆过程。

可以通过任何已知的方法进行制浆之前从木质纤维素提取或分离半纤维素的方法。优选地，半纤维素的分离用以下方法进行，所述方法在可能的纯化和浓缩后产生不抑制产脂质微生物生长的水解物。优选地，所述方法提供半纤维素级分，其含有至少部分的低聚形式的糖。本发明的一个实施方案是使用提取半纤维素的加压热水提取法。除半纤维素之外，加压热水提取法还从木质纤维素材料取出矿物质，所述矿物质可能在发酵中是优选的并且降低在培养基中添加矿物质的需要。

在某些预处理应用中，如在一些有机溶剂处理中或在使用过的亚硫酸盐液中，可以从保持固态的纸浆级分中溶解明显量的半纤维素和木质素。在这些情况下，优选的是在有氧微生物脂质生产过程之前分离半纤维素糖和木质素。可以用任何已知的方法将木质素级分与半纤维素糖分开。在有机溶剂处理中，通过有机溶剂(乙醇、甲醇、丙酮、乙酸、甲酸、乙酸乙酯等)的直接作用溶解木质素并水解半纤维素级分，促进木质素移除。将木质素与半纤维素水解物分离的一般方法是添加水，这导致木质素沉淀。

在供给至微生物之前，半纤维素水解物可能需要用不同的单元操作处理。可能需要将木质素与木质素残余物分离。可以需要浓缩半纤维素水解物中的糖，例如通过蒸发水。另外，可能需要除去水解中所用的有机化合物如预处理中释放的酸(有机酸)或溶剂如醇类或酸或其他化合物如SO₂。可以使用多种方法，如但不限于流剥离、蒸发或蒸馏。这些蒸发、蒸馏或剥离工艺可以利用来自制浆过程的工艺热和流(木质素燃烧)。工艺热的利用是有利的，因为一般纸浆厂产生不能利用的多余热。此外，糖可能需要通过过滤或膜技术或应用进行浓缩。例如，可以通过膜过滤浓缩半纤维素中的低聚糖。在供给至微生物之前，半纤维素水解物可能需要进一步纯化。移除抑制性化合物的水解物调节(conditioning)方法可以包括但不限于沉淀、过滤、剥离或吸附或者酶处理。

所述的本发明可以适用于使用任何材料或其混合物的制浆过程，所述材料包括但不限于软木(如松树、云杉)、硬木(如桉树、桦树、山杨木、杨树、橡树)、竹、稻糠、大麦秆、小麦秆、玉米秆、油棕榈空果穗和甘蔗渣。优选地，使用来自木质纤维素材料的半纤维素级分作为脂质生产的原料。本发明不限于利用半纤维素流，或其任何级分作为脂质生产的原料，也利用含有纤维素的流、其任何级分，和/或可以使用适于单细胞油产生的其他化合物。脂质生产过程也可以利用来自制浆和/或造纸业的其他流，如来自制浆和/或造纸业的废弃纤维或初沉污泥。例如，半纤维素进料可以补充有来自制浆和/或造纸业的其他流。此外，脂质生产过程可以补充有除来自制浆和/或造纸业的那些原料之外的其他原料，如木质纤维素材料，如农业残余物、能源作物、废纸、藻类生物质、来自食品工业的残余物、城市固体有机废弃物、来自机构厨房的生物废弃物、淀粉(如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等)或糖，如来自甘蔗或甜菜(sugarbeet)的糖蜜。脂质生产的原料也可以包括在造纸过程中所用的添加剂原料，如淀粉或其残余物。

根据本发明的一个优选实施方案，来自制浆过程的或在制浆过程之前分离的半纤维素流用于借助微生物生产脂质。另外，制浆过程中产生的半纤维素的可发酵级分处于本发明范围内。为了生产脂质，使用能够利用源自半纤维素的糖的微生物。这些微生物可以是能够积累和/或产生脂质的任何生物(含油微生物)。这类种微生物是可以按异养性或混合营养方式生长的细菌、酵母、丝状真菌(霉菌)或藻类。

所述微生物可能能够利用半纤维素水解物中包含的除糖之外的其他化合物，如从木质纤维素生物质衍生的有机酸，用于生长和脂质生产。微生物也可以利用在半纤维素提取中作为试剂添加的用于生长和脂质生产的化合物，如有机酸或醇类。少量这些化合物，一般0.01%至10%，可以在移除大部分这些试剂后留在水解物中。这些化合物的存在可能有利于脂质生产的微生物过程。

半纤维素中的糖可以处于单体形式和/或处于低聚物形式用于脂质生产。在本发明的一个最优选的实施方案中，糖主要处于低聚物形式。一般，至少5%、至少10%、至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选的至少50%、优选地至少60%、优选地至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%的量的糖处于低聚物形式和/或聚合物形式。

在本发明的一个最优选的实施方案中，脂质生产过程利用能够通过外切酶如半纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、甘露聚糖酶或半乳糖苷酶利用聚合物糖的微生物。本发明中所用的微生物拥有或能够产生这样的酶，所述酶能够降解和利用来自不同材料(如木质材料)的低聚半纤维素糖，包括硬木中的半乳葡甘露聚糖和软木中的木聚糖以及草本材料(如稿秆)中的(阿拉伯糖基)木聚糖。由微生物产生的降解聚合物糖的外切酶可以从使用过的培养基浓缩或回收并且作为稀释物或作为工艺水再用于制浆过程中。半纤维素酶广泛地用于制浆过程中，例如用于纸浆漂白和纤维改性。为了纸浆漂白目的，优选的是半纤维素酶是热稳定性并且耐受碱性pH。这将减少酶促处理之前冷却浆料流和调节其pH的需要，这可以简化过程并导致资本成本和运行成本的节约。

取决于工艺，制浆和/或造纸业产生含有聚合物糖如纤维素和/或半纤维素的各种废物流或残余物流。在制浆及造纸厂所用的主要废水处理过程是其中移除固形物质的初级沉淀(澄清、沉降)。将此视为废水的一级处理，并且产生的固体称作初沉污泥。初沉污泥一般含有低聚物纤维素、半纤维素和木质素和/或无机化合物。初沉污泥是借助微生物生产脂质的合适原料。根据本发明，来自制浆和/或造纸业的初沉污泥用于借助微生物生产脂质。可以将初沉污泥预处理以改善糖的生物可降解性，或处理以便在供给至生物加工过程之前减少木质素或木质素残余物、无机化合物或抑制性化合物的量。

在本发明的优选实施方式中，使用能够产生脂质和能够水解聚合物糖的酶的这类微生物。这类酶从用过的培养基富集和/或回收并且在制浆和造纸工业过程中再利用。

来自制浆和/或造纸业的初沉污泥包括，如脱墨、剥皮、化学制浆、机械或半化学制浆或造纸初沉污泥。化学制浆法初沉污泥包括硫酸盐制浆过程初沉污泥和溶解制浆过程初沉污泥。机械制浆初级初沉污泥和半化学制浆初沉污泥包括来自石磨木制浆法(SGW)、压力磨木制浆法(PGW)、精磨机械制浆(RMP)法和热法机械制浆法(TMP)的那些。脱墨过程初沉污泥来自使用再循环纤维的造纸厂，这种污泥可能除纤维素纤维之外还含有染料、色料、胶水、粘合剂以及纸填料和其他添加剂。在供给至微生物脂质生产过程之前，这种污泥一般需要至少部分地将无机组分与纤维分离。来自造纸厂的初沉污泥除纤维素纤维之外还含有造纸填料如粘土、碳酸钙、滑石和二氧化钛。一般，供给至微生物脂质生产过程要求至少部分地分离这些无机化合物。

在本发明的一个实施方案中，将微生物脂质生产过程集成至再循环纤维过程(再循环制浆过程)。使用来自纸制浆和造纸工业过程的初沉污泥如脱墨污泥作为借助微生物生产脂质的原料。可以将脱墨污泥处理，以便在供给至生物加工过程之前减少无机化合物或有机或无机抑制性化合物的含量。脱墨污泥可以补充有来自制浆和/或造纸业或来自其他地方的其他原料，如农业木质纤维素残余物、能源作物、微藻、糖料作物、淀粉、蔗糖或糖蜜。使用来自再循环纤维过程(如脱墨过程)的至少一些初沉污泥或其他有机残余物的微生物过程产生可以回收并转化成生物燃料的脂质和例如能够水解聚合物糖的酶。这些酶可以从使用过的培养基回收和/或富集并且再用于制浆和/或造纸工业过程中，如用于再循环纤维过程中，用于纸脱墨中。回收的酶也可以用于制浆和造纸工业过程中的其他地方或出售和用于任何其他过程中。

使用过的培养基中的能够水解聚合物糖的酶例如包括纤维素酶和/或半纤维素酶，这取决于所用的微生物。优选地，使用过的培养基中包含纤维素酶和半纤维素酶两者。来自初沉污泥的脂质生产过程可以补充有来自制浆和/或造纸工业过程或来自其他地方原料的残余物，如农业残余物、食品工业残余物或木质纤维素生物质或淀粉或糖蜜。

通过向微生物供给已经从用于纸浆生产的相同材料提取的半纤维素，现场产生外切酶。因此，现场产生的外切酶非常适于现场漂白纸浆。

在本发明的一个实施方案中，因制浆和/或造纸工业过程中采用酶处理纸浆或制浆和/或造纸业流所产生的上清液再循环返回微生物脂质生产过程。这种上清液可以含有有利于产脂质微生物生长和脂质生产的化合物。例如，这种上清液可以含有适于微生物生长和脂质生产的糖、用于微生物生长的矿物质和/或水解聚合物糖的酶。在本发明的一个实施方案中，因酶预漂白纸浆(如半纤维素酶处理)所产生的上清液再循环返回微生物脂质生产过程。在另一个实施方案中，来自酶促处理溶解浆以移除纸浆中半纤维素的上清液再循环至脂质生产过程。在供给至微生物脂质生产过程之前，可以浓缩上清液和/或收集蛋白质级分。

根据本发明的一个实施方案，也可以使用不能够利用糖低聚物或聚合物以生产脂质的微生物并且这些微生物属于本发明的范围内。在这种情况下，将源自制浆和/或造纸业，如来自半纤维素、初沉污泥或废弃纤维的原料作为糖单体供给至脂质生产过程。水解半纤维素聚合物成单体可以因半纤维素提取过程或因添加能够水解糖聚合物的酶而发生。根据所谓同时糖化和发酵方案，原料中半纤维素和/或纤维素的酶促水解可以在与油积累分开的过程阶段或在油积累期间同时进行。

另外，在本发明的范围内存在一个实施方案，其中(两种或更多种)不同生物用于水解聚合物糖并且从糖单体生产脂质。这种过程的特征在于，该过程包含能够水解(解聚)聚合有机化合物-如半纤维素或纤维素的第一微生物，例如丝状真菌、酵母或细菌菌株，和能够利用所得到的水解产物以便其生长和生产单细胞脂肪的第二微生物，如酵母、细菌、藻类或丝状真菌菌株。这类过程步骤可以作为顺序过程或同时地实施。能够水解聚合有机化合物的微生物菌株可以通过利用能够水解这类有机化合物的酶来替换。酶处理可以在微生物生产单细胞脂肪之前或与之同时实施。采用两个或更多个物种的生物加工过程的操作可以通过任何方法进行，所述方法包括但不限于在相同的生物反应器中与共培养物相同的时间操作，或将半纤维素水解过程相和脂质生产过程相在时间或空间上分隔。根据本发明，在任何情况下，参与水解糖聚合物的酶可以从培养基回收并且再用于制浆过程中。

脂质生产过程也可以与机械制浆过程集成。脂质生产可以使用残余物(如制浆中产生的水溶性物质)作为原料。水溶性残余物总体上含有半纤维素组分，如乙酰化半乳葡甘露聚糖。脂质生产过程可以补充有来自制浆和/或造纸工业过程或来自其他地方的残余物，如农业残余物、食品工业残余物或木质纤维素生物质或淀粉或糖蜜。脂质生产中产生的酶可以再用于机械制浆，例如但不限于木屑预处理、或纤维改性或漂白。利用来自机械制浆过程的残余物生产脂质时产生的酶也可以回收并且再用于其他制浆过程如化学制浆法或用于处理来自化学制浆过程的产物。

一些含油微生物能够利用半纤维素中的糖单体，如木聚糖中的木糖或阿糖基木聚糖中的木聚糖和阿拉伯糖或半乳葡甘露聚糖中的甘露糖、半乳糖或葡萄糖。产脂质生物可以利用一种或几种上文提到的化合物。产脂质生物选自细菌、蓝细菌(Cyanobacteria)、真菌如酵母和霉菌(丝状真菌)、古细菌或微藻。这些微生物可以容易地积累脂质或已经被基因修饰以积累脂质或改善脂质的积累。产脂质生物包括但不限于以下生物：

属于下述属的微藻物种，所述属包括：杜氏藻属(Dunaliella)、小球藻属(Chlorella)、葡萄藻属(Botryococcus)、咸胞藻属(Brachiomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、隐甲藻(Crypthecodinium)、裸藻属（Euglena)，红球藻属(Haematococcus)、衣藻属(Chlamydomas)、等鞭金藻(Isochrysis)、颗石藻(Pleurochrysis)、巴夫藻属(Pavlova)、无绿藻属(Prototheca)、褐指藻属(Phaeodactylum)、拟绿球藻属(Pseudochlorella)、拟小球藻属(Parachlorella)、Bracteococcus，栅藻属(Scenedesmus)、骨条藻属(Skeletonema)、角毛藻属(Chaetoceros)、菱形藻属(Nitzschia)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、舟形藻属(Navicula)、微绿球藻属(Nannochloris)、裂殖壶菌属(Scihizochytrium)、骨条藻属(Sceletonema)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、四爿藻属(Tetraselmis)和集胞藻属(Synechocystis)。

属于下述属的丝状真菌物种：曲霉属、被孢霉属(Mortierella)、毛壳霉属(Chaetomium)、麦角菌属(Claviceps)、枝孢霉属(Cladosporidium)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、翘孢霉属(Emericella)、镰刀菌属(Fusarium)、球囊霉属(Glomus)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、腐霉属、根霉属、木霉属、接合霉属(Zygorhynchus)、腐质霉属、分枝孢子菌属(Cladosporium)、绒枝霉属(Malbranchea)、黑粉菌属(Ustilago)。

属于下述属的酵母：棒孢酵母属(Clavispora)、德巴利酵母属(Deparyomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耐碱酵母属(Galactomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、Waltomyces、拟内孢霉属(Endomycopsis)、隐球酵母属(Cryptococcus)如弯曲隐球酵母(Cryptococcuscurvatus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)如圆红冬孢酵母(Rohodosporidiumtoruloides)、红酵母属(Rhodotorula)如粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)、毕赤酵母属(Pichia)、如树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、假丝酵母属(Candida)如弯假丝酵母(Candidacurvata)、油脂酵母属(Lipomyces)如斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)和丝孢酵母属(Trichosporon)如皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)或茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)。

属于下述属的细菌：不动杆菌属(Acinetobacter)、不动杆菌属(Actinobacter)、食碱菌属(Alcanivorax)、Aerogenes、鱼腥藻属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、迪茨菌属(Dietzia)、戈登氏菌属(Gordonia)、埃希氏菌属(Escherichia)、Flexibacterium、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属、诺卡菌属(Nocardia)、念珠藻属、颤藻属、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、红微菌属(Rhodomicrobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、志贺氏菌属(Shigella)、链霉菌属(Streptomyces)和弧菌属(Vibrio)。最优选地，细菌包括混浊红球菌(Rhodococcusopacus)，不动杆菌属、诺卡菌属或链霉菌属。

在本发明的优选实施方案中，使用能够因外切酶(如半纤维素酶，例如木聚糖酶、半乳糖苷酶或甘露聚糖酶或纤维素酶)而利用聚合物半纤维素或纤维素的含油产脂质生物。这些生物包括但不限于细菌，如链霉菌属(Streptomyces)或芽孢杆菌属(Bacillus)、丝状真菌，如曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、根霉属(Rhizopus)、或木霉属(Trichoderma)、如黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、尖孢镰刀(F.oxysporum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、米根霉(Rhizopusoryzae)或里氏木霉、酵母如隐球酵母属(Cryptococcus)或丝孢酵母属(Trichosporon)、如浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、皮状丝孢酵母(Trichosproroncutaneum)。经基因修饰以能够利用半纤维素或纤维素中聚合物糖的含油微生物也是本发明的部分。另外，本发明中也包括能够利用半纤维素或纤维素中聚合物糖的经基因修饰以改善脂质产生的生物。

在本发明的最优选实施方案中，使用能够利用木质纤维素中聚合物糖、尤其半纤维素的产脂质生物。这类生物优选地是来自以下属的那些：曲霉属、腐质霉属、根霉属、木霉属丝状真菌、隐球酵母属酵母或链霉菌属细菌。

半纤维素酶之外的其他酶

半纤维素酶是制浆和/或造纸业中应用的主要酶。本发明也包括从脂质生产过程回收除半纤维素酶之外的其他酶并且用于制浆和/或造纸工业过程中。这类酶可以包括但不限于纤维素酶、漆酶、果胶酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶和蛋白酶。

本发明的另一个特征是利用在制浆或半纤维素预提取、(预)漂白、初沉污泥中产生或释放的或在其他制浆和/或造纸工业残余物中所包含的至少一部分木质素或其级分来产生能够降解、修饰或结构性改变木质素的酶。这类酶可以用于几种应用中，如，但不限于，纸浆(预)漂白、纸浆脱墨、化学制浆法之前处理木质纤维素、制造溶解浆、剥皮或纤维改性。

本发明的另一个特征是利用至少一部分纤维素级分(纸浆)产生能够降解纤维素的酶。这类酶可以例如用于纤维改性或纸浆脱墨。可以通过使用能够因拥有纤维素酶活性而利用纤维素的含油微生物进行纤维素酶的生产。因此，脂质和纤维素酶的可以如脂质和半纤维素酶的生产那样合并。

本发明的又一个特征是从制浆和造纸工业流产生果胶酶。果胶酶的生产可以与脂质生产组合。果胶酶可以例如用于纤维改性、纸浆脱墨、剥皮或纤维浸解。

通过生产生物产生外切酶减少外购酶的需要，这改善整个过程的成本。在相同地点利用酶减少因纯化和稳定酶所致的成本。可选地，可以将酶回收、纯化和稳定并作为高价值副产物出售。

脂质生产过程

微生物脂质生产可以用任何已知方法或未来开发的方法进行。一般，微生物脂质生产过程包括在曝气的生物反应器中以深层培养法培养微生物。微生物在包含碳源和能源如半纤维素糖和大分子养分和小分子养分的液体培养基中培育。培养可以例如按分批培养、补料分批培养、连续培养进行。培养可以也在级联过程中进行。在培养时，允许微生物生长并且在胞内积累脂质。一些微生物也可以能够分泌脂质至培养基。

微生物脂质生产过程可以也在其中自由水的量少或其中在固态或半固态表面上进行生产的反应器中实施。不溶解于水中的细胞物质或其他生物质可以用水溶液提取，以使得酶变成可溶性形式。

在本发明的多种实施方案中，可以使用本领域已知或未来开发的任何方法方法，从细胞生物质或培养液回收油或油的前体。例如，可以使用过滤或滗析技术从培养基分离微生物。可选地，用大体积容量工业规模商用离心机离心可以用来分离所需的产物。

在本发明的多种实施方案中，可以破坏细菌细胞以促进油与其他组分的分离。可以使用已知用于细胞破碎的任何方法，如超声波、渗透休克、机械剪切力、冷榨、热休克、酶催化或自我定向自溶。可以通过用有机溶剂提取或通过本领域已知的或未来开发的任何方法从细胞回收油。

除脂质之外的其他产物

本发明的部分还是在回收和/或在制浆过程中再利用酶后，从源自原料或制浆过程残余物的半纤维素和/或纤维素中微生物生产除脂质之外的其他化合物。这类产物包括微生物生产醇类，乙醇、丁醇、丙酮-乙醇-丁醇(ABE)、异丁醇、2,3丙二醇、乳酸和琥珀酸。

用所述方法产生的脂质或脂质级分部分的目的不限于任意某种应用。脂质可以例如用于但不限于食品或饲料目的、用于烹饪、用作营养药、用于生产肥皂或洗涤剂、用于生产化妆品、用作化学品或生产化学品的原料、用作生物燃料或用作生产生物燃料的原料或用作润滑剂、用作润滑剂基础油(润滑油)或用作生产润滑剂基础油的原料。

优选地，用本发明中所述方法从微生物生物质回收的脂质可以用作产生生物柴油、可再生柴油、喷气式发动机燃料或汽油的原料。生物柴油包含脂肪酸甲酯并且一般通过酯交换产生。在酯交换时，酰基甘油转化成长链脂肪酸烷基(甲基、乙基或丙基)酯。可再生柴油指通过脂质的氢处理(加氢脱氧、氢化或氢化加工)生产的燃料。在氢处理时，酰基甘油转化成相应的烷烃(石蜡)。烷烃(石蜡)可以通过异构化或通过其他工艺变体进一步修饰。可再生柴油工艺也可以用来产生喷气式发动机燃料和/或汽油。此外，可以进行脂质的裂化以产生生物燃料。另外，脂质可以在某些应用中直接用作生物燃料。

“生物燃料”指主要源自生物质或生物废弃物的固态、液态或气态燃料并且与源自史前微生物、植物和动物的有机残留物的化石燃料不同。

根据EU法令2003/30/EU，“生物柴油”指从植物油或动物油中产生的甲基酯，其具有用作作为生物燃料的柴油品质。最广泛地，生物柴油指来自植物油或动物油的具有柴油品质的长链烷基酯，如甲基酯、乙基酯或丙基酯。生物柴油也可以从微生物脂质产生，因而微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。

“可再生柴油”指这样的燃料，其通过氢处理动物源、植物源或微生物源脂质或其混合物产生，由此微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。可再生柴油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成从源自生物质的蜡产生。任选地，除氢处理之外，可以进行异构化或其他加工步骤。可再生柴油工艺也可以用来产生喷气式发动机燃料和/或汽油。可再生柴油的生产已经在专利出版物EP1396531、EP1398364、EP1741767和EP1741768中描述。

生物柴油或可再生柴油可以与基于矿物油的柴油掺合。可以将合适的添加剂如防腐剂和抗氧化剂添加至燃料产品。

“润滑剂”指当作为表面涂层施加至运动部件时减少摩擦的物质，如油脂、脂质或油。润滑剂的其他两种主要功能是散热和溶解杂质。润滑剂的应用包括但不限于作为发动机油用于内燃发动机中、燃料中的添加剂、用于油驱动装置如泵和液压设备，或用于不同类型的轴承中。一般，润滑剂含有75-100%基础油并且其余是添加剂。合适的添加剂是例如洗涤剂、储存稳定剂、抗氧化剂、腐蚀抑制剂、去雾剂、破乳剂、消泡剂、共溶剂和润滑性添加剂(见例如US7,691,792)。润滑剂的基础油可以源自矿物油、植物油、动物油或来自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。基础油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成源自从生物质衍生的蜡。粘度指数用来表征基础油。一般高粘度指数是优选的。

术语“脂质”指脂肪性物质，其分子通常含有脂族烃链作为部分，其溶解于非极性有机溶剂中但是在水中溶解不良。脂质是活细胞中重要的一组大分子。脂质例如是脂肪、油、蜡、蜡酯、固醇、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基链烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和酰基甘油。

术语“酰基甘油“指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油天然地作为脂肪和脂肪油存在。酰基甘油的例子包括三酰甘油(TAG，甘油三酯)、二酰甘油(二酰甘油)和单酰甘油(单酰甘油)。

“使用过的培养介质”或“使用过的培养基”指在培养微生物时使用并包含微生物积累的产物的培养基。更广泛地，使用过的培养基可以定义为从培养期间或其后的微生物培养中取出的培养基级分。使用过的培养基也可以称作使用过的培养液。

提取过油的细胞残余物可以用于能量生产，例如燃烧或用无氧消化过程处理，或用作动物饲料。也可以使提取过油的细胞残余物或细胞残余物级分再循环返回至培养过程，以便用作养分源。

所述的发明可以适用于任何制浆过程，包括但不限于硫酸盐法、溶解制浆过程或有机溶剂（organosolv）法。在溶解制浆过程的情况下，现有过程，如采用半纤维素提取(如酸处理)的如亚硫酸盐方法或硫酸盐法，可能已经包括在制浆之前分离半纤维素，并且脂质生产过程可以更容易地集成至制浆过程。

现场生产用于制浆和/或造纸过程的酶因几个原因而是有利的并且可以改善制浆过程的成本效率。

-下游加工成本降低，包括水和酶稳定，

-降低运输和包装成本，

-降低因直接转移酶至制浆过程所致的损耗，

-降低相对专用(远程)设施的资本，

-利用相同原料或来自用于酶生产和和制浆/造纸过程的原料导致直接诱导酶并使其适应于所述原料。

-简洁的过程控制和输出量调节并直接改善酶产生和制浆/造纸过程时生物炼制厂内部的机会。

从使用过的培养基回收酶

所述酶可以从微生物培养物、使用过的培养基、上清液通过任何已知且合适的方法或通过未来开发的任何合适方法回收。这同样也适用于可以将酶借以分离成具有所需酶活性的级分的方法。

可以通过任何已知的方法或未来开发的方法从使用过的培养基浓缩、分离或回收酶。用保护所需酶的活性的方法进行回收。也可以在没有酶的任何浓缩、分离或回收的情况下再利用使用过的培养基中的酶。

借以回收包含催化活性酶的微生物培养物或上清液或蛋白质富集级分的方法可以基于它们的分子大小、离子行为、在水中的溶解度、在不同溶质中的溶解度或在含有缓冲因子或表面活性因子或表面活性化合物或盐的混合物溶质中的溶解度。

可以通过各种方法从培养基回收酶，所述方法包括但不限于以下方法，如离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

如果需要，可以通过各种方法纯化或分离酶，所述方法但不限于色谱、电泳方法、差异性溶解度、SDS-PAGE或提取。

酶可以例如用盐、糖或甘油稳定。

另外，可以为所述应用配制酶。

“适合于脂质产生的条件”意指微生物能够生长和产生脂质的任何条件。

“适合于酶产生的条件”意指微生物能够产生酶的任何条件。

如本文所述，能够使用胞外聚合物化合物或低聚物化合物作为其营养源、碳源和/或能量源的微生物在包含具有这些化合物的聚合物生物质的培养基上培育。允许微生物产生脂质。

“培养介质”在本文中指用于培育微生物的介质。培养介质在本文中一般至少部分地来自制浆和/或造纸业的原料，其至少部分地含有聚合物化合物或低聚物化合物，如聚合物糖。培养介质可以补充有矿物质、小分子养分、大分子养分和缓冲剂。

在本发明的实施方案中，优选的原料是聚合物生物质，其包含木质纤维素、纤维素、半纤维素和/或木质素，或木质纤维素的其他组分本身或其组合，或以化学或物理方式或以其组合方式处理过以便改善水解酶对糖聚合物可及性的生物质。木质纤维素原料优选地是来自制浆和造纸业的残余物，其含有半纤维素和/或纤维素的至少一些聚合物糖。如来自制浆和/或造纸业的残余物包括但不限于来自化学制浆过程的半纤维素、来自化学制浆、机械制浆、脱墨或造纸过程的初沉污泥或废弃纤维。

预处理的生物质一般是包含己糖和/或戊糖的生物质。这些生物质可以在酶处理之前或之后由化学、物理(如(热)机械)或生物手段由其任意组合处理并且随后用于单细胞油生产。

“聚合物糖”指天然有机物质或由不同化学方法或物理方法或由其组合处理过的有机物质。聚合物糖在本文中一般意指工业产品或制浆和/或造纸业过程的旁流，如含有半纤维素或纤维素的级分。

“从培养介质分离上清液和微生物细胞”意指借以分离细胞级分并获得上清液级分的任何方法。

“酶”在本发明中尤其意指能够降解复杂糖和蛋白质的胞外酶。更具体地，酶是降解糖苷键、肽键、酯键或醚键或在氮和碳或者氮和氧之间的键的水解酶。酶优选地是纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶或酯酶。

如本文所述那样获得的酶制备物是包含催化活性酶的微生物培养物或优选地上清液或富集的蛋白质级分。一般，酶制备物是单细胞油生产过程的工艺水或其中蛋白质级分富集的工艺水。可以通过用于富集或浓缩生物活性形式的蛋白质的任何适合方法实施富集。

“富集蛋白质级分”在本文中指富集上清液中的蛋白质并维持所述蛋白质的催化活性的任何方法。更具体地，该方法包括来自单细胞油生产过程的液相(上清液)由富集液相中蛋白质的至少一种方法处理。与原始液相相比，将蛋白质级分富集至少10%、一般至少20%、在多种实施方案中富集至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。合适方法的例子是基于蛋白质的离子特性、分子大小、溶解度、表面活性特性或疏水相互作用的方法。优选地，在其中温度为70℃或更低的条件下实施酶级分的回收。

“纤维素酶”或“纤维素裂解酶”指主要由真菌(如丝状真菌或酵母)、细菌、植物或由动物产生的一组酶，它们催化纤维素的水解，也称作纤维素水解。纤维素酶酶类的EC编号是EC3.2.1.4。已知几个不同种类的纤维素酶，它们在结构和机制上不同。基于催化的反应类型，纤维素酶总体上包括纤维素内切酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶或β-葡糖苷酶、氧化性纤维素酶和纤维素磷酸化酶。

“半纤维素酶”指主要由真菌(如丝状真菌或酵母)、细菌、植物或由动物产生的一组酶，它们催化半纤维素的水解。例如，这些酶参与木聚糖的水解，它们包括内切木聚糖酶、乙酰基-木聚糖酯酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和β-木糖苷酶。此外，参与半乳葡甘露聚糖的水解的酶包括内切甘露聚糖酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-甘露糖苷酶。另外，参与水解阿拉伯半乳聚糖的酶包括β-半乳糖苷酶和内切α-L-阿拉伯聚糖酶。这些酶可以按以下EC编号找到：EC3.2.1.8、EC3.2.1.37、EC3.2.1.55、EC3.2.1.99、EC3.2.1.139、EC3.2.1.78、EC3.2.1.25、EC3.2.1.22、EC3.2.1.21、EC3.2.1.89、EC3.1.1.72、EC3.1.1.6、EC3.1.1.73。

“半纤维素”指木质纤维素材料中存在的一组复杂糖，其中与其他糖(例如，果胶)一起，所述杂糖包围植物细胞的纤维素纤维。半纤维素的组成取决于植物类型。最常见类型的半纤维素包括木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、葡糖甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、阿糖基木聚糖、木葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

“木质纤维素材料”或“木质纤维素生物质”指由纤维素、半纤维素和木质素组成的生物质。

“糖化”指聚合物糖水解成糖单体。一般是通过使用能够水解聚合物糖的酶实现糖化。

“含油微生物”在本文中指在适宜或最佳条件培养时能够积累占其生物质的至少15%(w/w)脂质的微生物。

“制浆和造纸工业初沉污泥”指在处理来自制浆和/或造纸工业过程的废水时产生的污泥。初沉污泥由制浆和造纸工业废水中的悬浮物质组成，一般含有低聚物纤维素、半纤维素和木质素和/或无机化合物。一般，初沉污泥通过沉淀废水中的(澄清、沉降)悬浮物质获得。除沉淀之外，其他方法也可以用来从制浆和造纸废水收集悬浮物质。将此视为废水的一级处理，并且产生的固体称作初沉污泥。

纤维素一般在自然界中不溶于水中。固态纤维素的水解需要三种不同类型的酶。葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4)大多作用于纤维素的非晶态部分，随机攻击纤维素大分子的内部键。外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)攻击的纤维素链的末端，一次主要地水解一个纤维二糖单元。葡聚糖外切酶也能够水解晶态纤维素聚合物。最后，纤维二糖至葡萄糖单体的水解由β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)完成。

纤维素水解需要许多不同的纤维素酶协作。所分析的不同葡糖基水解酶的数量极高，超过90种不同的酶已经按14个不同家族编号(甚至更多处于研究中)，例如，纤维二糖水解酶结构域(CBHI、II)、葡聚糖内切酶结构域(EGI、II.III、IV、V)和β葡糖苷酶结构域(BGLI、II)。在酶在制浆和造纸业中的许多应用中，如在纸浆(预)漂白中，纤维素纤维被纤维素酶降解是不利的。

为了完全酶促水解半纤维素(木聚糖、阿糖基木聚糖和葡糖甘露聚糖)，需要几种不同的酶，它们必须在大致相同的时间激活。通过多种酶如内切木聚糖酶(1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶)、内切阿拉伯糖酶(endoarabinase)和内切甘露聚糖酶(1,4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶)进行首次攻击。例如，里氏木霉(Trichodermareesei)具有至少4种不同内切木聚糖酶和一种内切甘露聚糖酶。

能够在内切半纤维素酶作用后水解半纤维素低聚物的酶是β-木糖苷酶、β-阿拉伯糖苷酶、β-甘露糖苷酶和β-葡糖苷酶(EC33.2.1.21)。为分解低聚物中所包含的残余侧键，需要α-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)、α-阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.55)和α-D-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.22)。为移除乙酰组分，需要酯酶(EC3.2.1.72)的作用。

另外，木质素的酶促水解需要氧化酶如木质素过氧化物酶(LiPEC1.11.1.14)、锰依赖性过氧化物酶(MnPEC1.11.1.13)和漆酶(EC1.10.3.2)的活性。木质素的修饰需要许多酶、辅酶和供体与最终接纳体之间的电子传递系统协作。木质素的化学结构及其与纤维素和半纤维素的附接比木质素的量更重要。

从中已经回收酶的来自脂质生产过程的使用过的培养基(流出物)或来自脂质回收过程的细胞残余物(残余生物质)可以用于几个目的。例如可以使它部分地或完全地再循环至脂质生产过程。可选地，可以在制浆和造纸业中的废水处理厂内处理它。流出物和/或生物质残余物含有养分，所述养分可以减少向制浆和/或造纸废水处理过程添加养分的需要。使用过的培养基和/或细胞残余物也可以在补充或不补充来自制浆和/或造纸过程废水处理的制浆和/或造纸生产残余物或污泥的情况下以无氧消化法处理成生物气体。来自无氧消化的污泥可以潜在地用作肥料。

总之，在下文借助以下编号的条目1-31描述本发明的多种实施方案：

条目

1.一种集成方法，其包括

-作为单细胞油生产过程的第一过程和作为制浆和/或造纸工业过程的第二过程，

其中来自制浆和/或造纸业的有机物质导入单细胞油生产过程中，并且其中，在单细胞油生产过程中使用在包含来自制浆和/或造纸业的有机物质的培养基上培育时能够产生脂质或脂质和酶的微生物，

-在单细胞油生产过程和/或在与之关联的过程中由所述微生物产生脂质或脂质和酶，

-从微生物培养物分离上清液和/或微生物细胞，

-从微生物细胞回收脂质，和

从单细胞油生产过程或从与之关联的过程回收包含催化活性酶的上清液或所述上清液的蛋白质富集级分或所述上清液的稀释物，并且任选地将它或它们导入制浆和/或造纸工业过程中。

2.根据条目1的方法，其中至少5%在制浆和/或造纸工业过程中所用的某些酶在单细胞油生产过程或在与该过程关联的过程中产生。

3.根据条目1或2的方法，其中酶和脂质由相同的微生物产生。

4.根据条目1至3中任一项的方法，其中酶和脂质由一种或多种微生物产生。

5.根据条目1至4中任一项的方法，其中产酶微生物和产脂质微生物是不同的。

6.根据条目1至5中任一项的方法，其中酶在集成至制浆和/或造纸工业过程中的与单细胞油生产过程分开的过程中产生。

7.根据条目1至6中任一项的方法，其中所述酶包括半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、过氧化物酶、漆酶、果胶酶、纤维素酶、葡糖苷酶、阿拉伯糖酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶或蛋白酶或其任何混合物。

8.根据条目1至7中任一项的方法，其中供给至单细胞油生产过程的有机物质包含至少50%木质纤维素或木质纤维素级分，优选地至少10%聚合物糖。

9.根据条目1至8中任一项的方法，其中有机物质包含至少20%、优选地至少30%半纤维素或半纤维素级分。

10.根据条目8或9的方法，其中有机物质包含来自溶解制浆法的或在硫酸盐制浆法中或在溶解制浆法中蒸煮之前提取的半纤维素或其级分。

11.根据条目1至10中任一项的方法，其中所述酶包括外切酶、优选地包括与半纤维素水解相关的酶。

12.根据条目11的方法，其中所述酶包括半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或酯酶或其任何混合物。

13.根据条目1至12中任一项的方法，其中有机物质包含至少20%纤维素、优选地至少30%纤维素或其级分。

14.根据条目1至13中任一项的方法，其中有机物质是来自制浆和/或造纸业的初沉污泥和/或纤维废弃物。

15.根据条目1至14中任一项的方法，其中酶包括外切酶、优选地包括与纤维素水解相关的酶。

16.根据条目1至15中任一项的方法，其中所述酶包括纤维素酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶或β-葡糖苷酶、氧化性纤维素酶、纤维素磷酸化酶或半纤维素酶或其任何混合物。

17.根据条目1至16中任一项的方法，其中纤维素酶和半纤维素酶均产生。

18.根据条目1至16中任一项的方法，其中来自制浆和/或造纸工业过程的聚合物糖的水解产物再循环至脂质生产过程中。

19.根据条目1至17中任一项的方法，其中制浆和/或造纸工业过程包含过程，如溶解制浆过程、在制浆中或在制浆之前处理木质纤维素(增强溶解制浆)、硫酸盐制浆法、在制浆中或在制浆之前处理木质纤维素(增强硫酸盐制浆)、纸浆(预)漂白，或机械制浆法、纤维改性、剥皮、再循环纤维过程、脱墨、纤维改性、造纸或淀渣和/或沥青移除。

20.根据条目1至19中任一项的方法，其中所述微生物是丝状真菌、酵母或细菌，优选地是属于选自曲霉属、腐质霉属、根霉属和木霉属的真菌，或属于隐球酵母属的酵母，或属于链霉菌属的细菌。

21.一种酶制备物，通过条目1至19中任一项的方法获得。

22.根据条目1至19中任一项的方法产生的酶或根据条目21的酶制备物在制浆和/或造纸业中或在其他应用中的用途，作为酶制备物或作为酶的来源。

23.根据条目1至20中任一项的方法产生的半纤维素酶或根据条目21的酶制备物的用途，用于纸浆(预)漂白、增强溶解制浆法、增强硫酸盐制浆法、剥皮、脱墨和/或纤维改性，优选地用于(预)漂白。

24.根据条目1-20中任一项的方法产生的纤维素酶或根据条目21的酶制备物的用途，用于脱墨、纤维改性、纸浆(预)漂白、增强溶解制浆法、增强硫酸盐制浆法和/或剥皮，优选地用于纤维改性和/或脱墨。

25.一种用于脂质生产和制浆和/或造纸业的集成过程体系，其包括脂质生产过程使用来自制浆和/或造纸业的有机物质作为脂质生产原料，并且制浆和/或造纸过程使用来自脂质生产过程的上清液。

26.一种用于脂质生产和化学制浆过程的集成过程体系，其包括脂质生产过程使用半纤维素、初沉污泥和/或其级分作为脂质生产原料，并且制浆和/或造纸过程使用从脂质生产过程获得的半纤维素酶。

27.一种用于脂质生产和再循环纤维过程的集成过程体系，其包括脂质生产过程使用脱墨污泥和/或其级分作为脂质生产原料，并且制浆和/或造纸过程使用从脂质生产过程获得的酶。

28.一种用于脂质生产和机械制浆过程的集成过程体系，其包括脂质生产过程使用来自机械制浆的残余物、初沉污泥和/或其级分作为脂质生产原料，并且制浆和/或造纸过程使用从脂质生产过程获得的酶。

29.一种用于产生脂质的方法，其包括

-在包含来自制浆和/或造纸业的有机物质的培养基上适于脂质产生和酶产生的条件下培育能够同时产生脂质和酶的微生物，并且通过所述微生物产生脂质和酶；

-从微生物培养物分离上清液和微生物细胞，

-从微生物细胞回收脂质，以及

-回收包含催化活性酶的上清液或所述上清液的蛋白质富集级分或所述上清液的稀释物。

30.根据条目1至20中任一项的方法产生的脂质或根据条目21的酶制备物的用途，用作生物燃料、用作生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。

31.根据条目30的用途，其中生物燃料是生物柴油或可再生柴油、汽油和/或喷气式发动机燃料。

以下实施例的目的是说明本发明，并且不应当以任何方式将它们解释为限制性本发明。

实施例

以纯纤维素和木聚糖作为底物，通过水解试验确定来自培养产脂肪丝状真菌的使用过的培养液中的酶活性。

方法

糖确定（Sugardefinition）：

为了确定溶液的糖浓度，将该溶液制成合适稀释物，所述稀释物在HPLC分析之前经0.2μm过滤。

糖确定中所用的柱是铅形式(固定相)的ShodexSugarSP0810离子交换物。柱尺寸是8.0mm(ID)x300mm。洗脱剂是水(流速0.6ml/分钟)并且柱温是60℃。检测器是RIShimatzuRID10A并且泵是A6，以及自动采样器是ShimatzuSIL20A。用Class-VP软件实施结果的处理。

脂肪酸分析：

如Suutari等人,(1990)中所述的方法那样确定样品的脂肪酸组成。样品中的脂质首先水解成游离脂肪酸，所述游离脂肪酸皂化成其钠盐并随后甲基化成甲酯。以气体色谱方式分析脂肪酸甲酯。

蛋白质浓度分析：

在培养液经Whatman3滤纸过滤后，分析培养液的蛋白质浓度。根据Bio-Rad蛋白质测定法(基于Bradford法)分析蛋白质浓度。

水解试验：

在水解试验之前，培养液经Whatman3滤纸过滤。

木聚糖酶活性如下测定。使用100ml锥形瓶作为反应容器。将其填充磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)中的20ml1%桦木木聚糖(Sigma)溶液作为底物、10ml过滤的培养液和20ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)。水解反应在50℃在搅拌的(140转/分钟)水浴中进行。在添加培养液后立即和在1、3、5、21/23小时后，从反应容器取出1ml样品。通过添加50μl1.33M硫酸降低pH，终止1ml样品中的水解反应。为移除盐和聚合物糖处理样品，以便适于HPLC-分析。以甘露醇作为标准物，通过HPLC(见糖确定)分析释放的糖。

以1gWhatman滤纸作为纤维素底物替代木聚糖，确定纤维素酶活性。反应体积是50ml，其含有等尺寸圆圈(直径约5mm)的1gWhatman滤纸作为底物、10ml过滤的培养液和40ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)。如同采用木聚糖那样进行实验。

微生物菌株：

产脂质微生物通常是公众从多个认可的微生物培养物(菌株)保藏中心如ATCC、DSM等可获得的。在以下实施例中通过使用如下微生物菌株讨论本发明的多种实施方案。米曲霉DSM1861、米曲霉DSM1864和土曲霉DSM1958。

实施例1

本实施例显示在采用基于半纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养米曲霉期间培养液中形成的酶活性。

在具有用加压热水提取法提取作为碳源的纯化桦木聚糖(Sigma)和云杉和桦半纤维素的烧瓶培养物中培育米曲霉。在含有50ml培养基的250ml锥形瓶中进行培养。生长培养基基体每升水含有：1g(NH₄)₂SO₄、1gMgSO₄·7H₂O、0.5gK₂HPO₄、1gKH₂PO₄和0.2gCaCl₂·2H₂O并且补充有碳源、酵母提取物和任选地支撑材料。培养基用1%(v/v)真菌孢子悬液接种并且将培养物在28℃温度孵育。

在纯化的木聚糖情况下，培养基基体补充有每升40g纯化的桦木聚糖(Sigma)和1g酵母提取物。将两份培养物在回转摇床(160转/分钟)中孵育6日。

在云杉和桦半纤维素的情况下，培养基基体补充有每升通过热水提取法产生的44g干燥云杉或桦半纤维素、0.5g酵母提取物和为真菌菌丝体提供机械支撑的2g纤维素。将三份培养物在回转摇床(180转/分钟)中孵育7日。

在孵育后，培养液经Whatman3滤纸过滤。从滤液测定蛋白质浓度和酶活性。用蒸馏水洗涤渗余物并干燥。从干燥的样品测定生物质浓度和脂质含量。

在纯化的桦木聚糖上培养6日后，米曲霉真菌产生16g/l生物质(干重)并且所述生物质含有10.5%脂质/干重。在水提取的桦半纤维素上培育的米曲霉在7日孵育期间产生14g/l干生物质。含有真菌菌丝体、残余半纤维素和纤维素的生物质含有等同于每升培养基1.26脂质的8.9%脂质/干重。对于脂质产生，桦木聚糖和半纤维素均好于云杉半纤维素，因为在云杉半纤维素上，产生含有3.7%脂质/干重的8.7g/l干生物质。

培养液的蛋白质浓度对于云杉半纤维素培养和桦半纤维素培养是0.06mg/ml和0.02mg/ml，并且对于桦木聚糖培养是0.05mg/ml。

图3和图4中提供从水解试验期中，随时间变化而变化的反应中每毫升培养液和每毫克蛋白质释放的木糖。在图3中显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。在图3中显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。

1毫升来自云杉半纤维素培养的培养液在21小时内释放1.2mg木糖和20.1mg/mg蛋白质。1毫升来自桦半纤维素培养的培养液在21小时内释放5.2mg木糖和234.6mg/mg蛋白质。1毫升来自桦木聚糖培养的培养液在23小时内释放5.0mg木糖和101.4mg/mg蛋白质。

来自具有半纤维素或木聚糖碳源的米曲霉培养的培养液显示显著的木聚糖酶活性。培养液不具有可检测的纤维素酶活性，因为没有在纤维素水解试验检测到游离葡萄糖。本实施例表明，来自用米曲霉从木材半纤维素水解物生产脂质中的使用过的培养基含有可以用于降解木质材料的半纤维素的半纤维素酶，如木聚糖酶，这是用于纸浆(预)漂白的有利性能。从源自木质材料的半纤维素生产脂质显示了脂质生产过程与采用半纤维素预提取步骤的硫酸盐制浆过程或溶解制浆过程可能整合的实例。另外，半纤维素酶的活性，但是缺少纤维素酶活性，表示这些酶对于纸浆(预)漂白应用的适用性。

实施例2

本实施例显示在采用基于木质纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养米曲霉期间培养液中形成的选择性木聚糖酶活性。

在基于纤维素的木质纤维素材料上培养米曲霉用于脂质生产。生长培养基基体每升水含有40g木质纤维素材料作为碳源、1.46g蛋白胨作为氮源、0.5g酵母提取物、1gMgSO₄·7H₂O、0.5gK₂HPO₄、1gKH₂PO₄和0.2gCaCl₂·2H₂O、0.00015gZnSO₄·7H₂O、0.0001gCuCl·2H₂O和0.00625gMnCl₂·4H₂O。碳源是含有大约15%半纤维素的磨碎和筛分(0.2mm)的漂白桦硬木纤维素硫酸盐。将这种纤维素物质添加至培养物以形成50g/l的终浓度。培养介质用50ml48小时预培养的米曲霉悬液接种。发酵以1L培养基体积在28℃温度进行，伴以0.8l/分钟通气和350-450转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在188小时孵育后测定酶活性。

如上文所述，分离培养液并测定蛋白质浓度及木聚糖酶和纤维素酶活性。培养液中的蛋白质浓度是0.11mg/ml。图5和图6中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。图5显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖和木二糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图6显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖和木二糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图7显示在采用1ml商业木聚糖酶溶液的水解试验期间作为底物的%(500mg天然纤维素或来自培养的残余生物质)的释放糖(木糖和葡萄糖)。

在188小时培养后留下显著量的残余纤维素物质。这种生物质用商业木聚糖酶处理(蛋白质10.6mg/ml)，以便确定残余物的组成。作为参考，天然桦树纤维素用相同的酶溶液处理。在水解试验中，500mg干燥的纤维素物质悬浮于49ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)和1ml酶溶液中。这个水解试验与酶活性测定法类似地进行。图7中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。

培养液的酶测定法(纤维素酶和木聚糖酶)仅显示出木聚糖酶活性，但是没有检测到纤维素酶活性。在采用木聚糖作为底物的水解试验中，释放显著量的木糖和木二糖。

采用商业木聚糖酶(具有低纤维素酶活性)针对残余生物质的水解试验显示仅可以从培养中的残余纤维素水解痕量的半纤维素(小于2%的释放木糖)。换而言之，在培养期间形成进入培养液的木聚糖酶已经有效地水解纤维素的半纤维素部分。

用木聚糖酶处理时，从培养中用作碳源的原始天然纤维素物质，11%的底物作为木糖释放。这种材料含有大约15%半纤维素。

该实施例显示当采用木质纤维素材料作为碳源培养时，米曲霉可以产生在脂质生产过程中具有选择性木聚糖酶活性(无纤维素酶活性)的酶。这种木聚糖酶可以用来选择性水解半纤维素，留下富集的纤维素级分完好无损。半纤维素酶的活性，但是缺少纤维素酶活性，表示这些酶在纸浆(预)漂白应用中的适用性。

实施例3

本实施例显示在采用基于半纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养土曲霉期间培养液中形成的酶活性。

在作为碳底物的小麦秆半纤维素上以2升容积在生物反应器中培育土曲霉用于脂质生产。培养基由50ml酵母氮基无（w/o）氨基酸和硫酸铵(Difco)10x母液组成，所述母液悬浮于2L水中并每升补充有：1.0g酵母提取物、1g(NH₄)₂SO₄、1gMgSO₄·7H₂O、0.5gK₂HPO₄、1gKH₂PO₄、0.2gCaCl₂·2H₂O和2g纤维素。培养基用150ml24小时预培养的土曲霉培养物接种。发酵在温度35℃进行，伴以3.0l/分钟通气和200-430转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在培养期间，将半纤维素溶液供给至发酵罐。在165小时孵育后测定酶活性。

分离培养液，并通过在Amicon搅拌式超滤室中用10000Da滤器(Millipore)超滤，部分地浓缩它。如上文，测定蛋白质和脂质浓度及木聚糖酶和纤维素酶活性。

在含有真菌菌丝体、残余半纤维素和纤维素的生物质中，脂质含量是15%每干重。蛋白质浓度在未浓缩培养液中是0.72mg/ml并且在浓缩的培养液中是2.15mg/ml。

图8至图11中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。

图8显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图9显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图10显示每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。图11显示每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。

本实施例表明土曲霉可以向培养液产生胞内脂质和胞外水解酶。该实施例显示土曲霉产生同时具有木聚糖降解活性及纤维素降解活性的酶并将它们分泌至生长培养基。可以将这些酶分离、浓缩并且在其中纤维素酶和半纤维素活性均是有利的应用中用于水解和处理木质纤维素材料。在制浆和/或造纸业中的这类应用可以包括如纤维改性、脱墨或剥皮。另外，对聚合物纤维素和半纤维素均具有活性的菌株适于随含有纤维素和半纤维素的制浆和/或造纸工业残余物(如来自脱墨、化学制浆和/或机械制浆的初沉污泥)一起使用。因此，该实施例表明脂质生产过程与化学制浆过程、机械制浆过程或纤维再循环过程集成的可能性。

参考文献

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Claims (27)

1.一种集成方法，其包括：

-作为单细胞油生产过程的第一过程和作为制浆和/或造纸工业过程的第二过程，

其中来自所述制浆和/或造纸工业过程的有机物质导入单细胞油生产过程中，并且其中，在单细胞油生产过程中使用在包含来自所述制浆和/或造纸工业过程的有机物质的培养基上培育时能够产生脂质和酶的微生物，

-在单细胞油生产过程中由所述微生物产生脂质和酶，

-从微生物培养物分离上清液和/或微生物细胞，

-从微生物细胞回收脂质，和

从单细胞油生产过程回收包含催化活性酶的上清液或所述上清液的蛋白质富集级分或所述上清液的稀释物，并且将它或它们导入制浆和/或造纸工业过程中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶和脂质由相同的微生物产生。

3.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述酶的微生物与产生所述脂质的微生物不同。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶包括半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、过氧化物酶、漆酶、果胶酶、纤维素酶、葡糖苷酶、阿拉伯糖酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶或蛋白酶或其任何混合物。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中供给至单细胞油生产过程的有机物质包含至少50％木质纤维素或木质纤维素级分。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中供给至单细胞油生产过程的有机物质包含至少10％聚合物糖。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述有机物质包含至少20％半纤维素或半纤维素级分，或至少20％纤维素或其级分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述有机物质包含至少30％半纤维素或半纤维素级分，或至少30％纤维素或其级分。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶包括外切酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶包括与半纤维素水解或纤维素水解相关的酶。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述制浆和/或造纸工业过程包含溶解制浆过程、硫酸盐制浆过程、纸浆预漂白、纸浆漂白、或机械制浆过程、纤维改性、剥皮、再循环纤维过程、脱墨、纤维改性、造纸、或淀渣和/或沥青移除。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微生物是丝状真菌、酵母或细菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述真菌是属于选自曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、根霉属(Rhizopus)和木霉属(Trichoderma)的真菌。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述酵母是属于隐球酵母属(Cryptococcus)的酵母。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述细菌是属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌。

16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的酶被作为酶制备物或作为酶的来源用在所述制浆和/或造纸工业过程中。

17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的酶为催化目的再利用于单细胞油生产过程中。

18.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的半纤维素酶被用在纸浆预漂白、纸浆漂白、增强溶解制浆法、增强硫酸盐制浆法、剥皮、脱墨和/或纤维改性中。

19.根据权利要求18所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的半纤维素酶被用在纸浆预漂白和/或纸浆漂白中。

20.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的纤维素酶被用在脱墨、纤维改性、增强溶解制浆法、增强硫酸盐制浆法和/或剥皮中。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的纤维素酶被用在脱墨和/或纤维改性中。

22.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在单细胞油生产过程中产生的脂质用作生物燃料或用作生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物燃料是生物柴油或可再生柴油、汽油和/或喷气式发动机燃料。

24.一种用于脂质生产和制浆和/或造纸业的集成过程体系，其用于实施根据权利要求1至23中任一项的方法，包括脂质生产过程使用来自制浆和/或造纸工业过程的有机物质作为脂质生产原料，并且制浆和/或造纸工业过程使用来自脂质生产过程的酶。

25.根据权利要求24所述的集成过程体系，其中所述制浆和/或造纸工业过程是化学制浆过程，并且其中所述脂质生产过程使用半纤维素、初沉污泥和/或其级分作为脂质生产的原料，并且制浆和/或造纸工业过程使用从所述脂质生产过程获得的半纤维素酶。

26.根据权利要求24所述的集成过程体系，其中所述制浆和/或造纸工业过程是再循环纤维过程，并且其中所述脂质生产过程使用脱墨污泥和/或其级分作为脂质生产的原料，并且制浆和/或造纸工业过程使用从所述脂质生产过程获得的酶。

27.根据权利要求24所述的集成过程体系，其中所述制浆和/或造纸工业过程是机械制浆过程，并且其中所述脂质生产过程使用来自机械制浆的残余物、初沉污泥和/或其级分作为脂质生产的原料，并且制浆和/或造纸工业过程使用从所述脂质生产过程获得的酶。