BR112013006764B1 - método in vitro para avaliar um paciente quanto a nefropatia diabética - Google Patents

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Abstract

BIOMARCADORES ASSOCIADOS À PRÉ-DIABETES, DIABETES E/OU UMA AFECÇÃO RELACIONADA À DIABETES. Trata-se de uma biomarcadores para pré-Diabetes, invenção que fornece Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes e os métodos para o uso dos mesmos, que incluem os biomarcadores nas Tabelas 1 e 2 como peroxiredoxina-2, subunidade B do subcomponente Clq de complemento, sulfidril oxidase 1 e apolipoproteína A-IV.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a biomarcadores associados com pré-Diabetes, Diabetes e afecções relacionadas à Diabetes, tal como nefropatia diabética, a métodos de uso dos biomarcadores para determinar o risco em que um indivíduo irá desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e afecções relacionadas à Diabetes, a métodos de triar uma população para identificar pessoas com risco de desenvolver pré- Diabetes, Diabetes e afecções relacionadas à Diabetes e a alvos do fármaco para pré-Diabetes, Diabetes e Diabetes.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
Diabetes mellitus é uma doença crônica e um dos problemas de saúde pública principais na presente época. Mundialmente, existe uma população sempre crescente de pacientes com diabetes que representam um grande fardo financeiro nos sistemas de saúde. O predomínio mundial de diabetes para todos os grupos de idades foi estimado como sendo 2,8% em 2000 e 4,4% em 2030. 0 número total de pessoas com diabetes é projetado para se elevar de 171 milhões em 2000 para 366 milhões em 2030. Em 2002, o predomínio de diabetes na população australiana era de 7,4% nos 25 anos e em diante, e o número de australianos com diabetes triplicou desde 1981.
A diabetes do tipo 2 é de longe a mais comum, por exemplo, afetando de 90 a 95% da população de diabéticos dos E.U.A. O predomínio de diabetes mellitus aumenta com a idade, e é esperado que os números de pessoas mais velhas com diabetes aumentem conforme a população idosa aumenta em número. Junto à taxa crescente de diabetes, também existe um predomínio maior de metabolismo de glicose debilitado, que é associado com um risco aumentado de doença no coração e diabetes. Diabesidade é um termo que abrange o predomínio de diabetes, obesidade, metabolismo de glicose debilitado e os fatores de risco associados de hipertensão e perfis de lipídio plasmático anormais (dislipidemia). A "epidemia de diabetes" irá continuar, mesmo se os níveis de obesidade permanecerem constantes. Dado o predomínio crescente da obesidade, é menos provável que essas situações subestimem a futura predominância de diabetes.
Diabetes mellitus é uma afecção em que o corpo não pode manter níveis de glicose no sangue normais. A maioria dos casos de diabetes mellitus se enquadra em três categorias amplas: diabetes de Tipo 1, de Tipo 2 e gestacional. A diabetes Tipo 1 resulta da falha do corpo na produção de insulina, e atualmente exige que a pessoa injete insulina. A diabetes do Tipo 2 resulta da resistência à insulina, uma afecção em que as células falham no uso de insulina apropriadamente, algumas vezes combinada com uma deficiência de insulina absoluta.
A diabetes do Tipo 2 pode, normalmente, ser controlado na primeira instância por exercício regular e dieta. Comprimidos e, eventualmente, injeções de insulina podem ser necessários conforme a doença progride. Ao longo do tempo, níveis de glicose no sangue altos podem danificar os vasos sanguíneos e os nervos. Essas complicações de diabetes podem causar dano aos olhos, nervos e rins, e aumentar o risco de ataque cardíaco, derrame, impotência e problemas nos pés. Esse dano pode acontecer antes que um indivíduo saiba que o mesmo tem diabetes se deixado não detectado por um longo tempo. Portanto, é importante diagnosticar e controlar a diabetes e suas complicações em um estágio muito precoce.
Diabetes também é a maior causa de doença no rim (nefropatia) em paises desenvolvidos, e é responsável por custos imensos em diálise. 10% a 20% das pessoas com diabetes irão morrer de falha do rim (renal) . As razões por trás da complicação de nefropatia em diabetes são complexas, e incluem os efeitos tóxicos de niveis de glicose altos; pressão sanguinea elevada; niveis de lipídio anormais e anormalidades de pequenos vasos sanguineos. O resultado cumulativo é que existe o espessamento dos glomérulos no rim que permitem que a proteina (albumina) seja excretada na urina.
A diabetes se tornou a causa mais comum de falha renal de estágio final (ESRF) em 40 a 50% de casos de ESRD, e despesas de Medicare da Austrália anuais são as maiores para pacientes com ESRF causada por diabetes comparada com todos os outros diagnósticos de ESRD primário. Até um terço dos adultos com diabetes do Tipo 2 recentemente diagnosticado já têm doença renal crônica, e dados sugerem que em muitos desses pacientes, a mesma pode ter se desenvolvido no curso do estado pré-diabético. A doença é progressiva e afeta mais homens que mulheres.
A nefropatia diabética é detectada primariamente pela medição da quantidade de albumina excretada na urina (albuminúria). A albuminúria é normalmente medida com o uso da razão entre a albumina e a creatinina (ACR) . Essa é a razão entre a albumina e a creatinina na urina. A razão considera a concentração da albumina em relação à taxa de filtração glomerular, que é determinada pela quantidade de creatinina na urina. A albuminúria é definida como: ACR >2,5mg/mmol (homens) ou >3,5mg/mmol (mulheres).
Apesar dos diversos estudos e algoritmos que foram usados para avaliar o risco de Diabetes e afecções relacionadas, permanece uma necessidade para métodos precisos para avaliar tais riscos ou afecções que podem ser prontamente adaptados por médicos de cuidados primários que são mais susceptíveis de encontrar inicialmente o pré- diabético ou diabético precoce não diagnosticado.
Consequentemente, permanece uma necessidade para métodos convenientes e relativamente pouco dispendiosos para triar as pessoas em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes e para monitorar pacientes com pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes. Tais métodos poderiam ser usados para triar uma grande população para identificar pessoas em risco de ter Diabetes, para testar uma única pessoa para determinar o risco daquele indivíduo de desenvolver Diabetes, para monitorar a saúde de pacientes de diabetes e avaliar a eficácia das intervenções projetadas para tratar Diabetes, pré-Diabetes e/ou afecções relacionadas. Também existe uma necessidade para identificar novos alvos do fármaco para pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes que incluem alvos do fármaco de proteína. A identificação de novos alvos do fármaco irá permitir o desenvolvimento de novas intervenções para pré- Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes.
É contra esse antecedente e os problemas e dificuldades associados com os mesmos que a presente invenção foi desenvolvida.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para avaliar um paciente para pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2. TABELA 1
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TABELA 2
Figure img0002
Figure img0003
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende reagentes para a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra de um paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista 5 de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um meio legivel por computador que tem instruções executáveis por computador para avaliar um paciente para pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, sendo que 10 o meio legivel por computador compreende uma rotina, armazenada no meio legivel por computador e adaptada para ser executada por um processador para armazenar dados de medição de biomarcador que representam pelo menos um biomarcador selecionado dentre a lista de biomarcadores na 15 Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para avaliar um tratamento para pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente que passa pelo tratamento, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2, pelo menos duas vezes durante o curso do tratamento.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para avaliar o risco de um paciente tem de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de monitoramento de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2, e comparar a medição obtida com outra medida do pelo menos um biomarcador.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnóstico ou identificação de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de diagnosticar de modo diferencial a doença no rim das afecções que também causam proteinúria em um paciente que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar de modo diferencial subclasses ou estágios de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente que compreende a medição de pelo menos um biomarcador, em uma amostra do paciente, selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um sistema de teste que compreende: (i) meio para obter dados de resultados de teste que representam os niveis de pelo menos um biomarcador selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2, em uma amostra do paciente; (ii) meio para coletar e rastrear os dados de resultados de teste qerados na etapa (i); (iii)meio para calcular um valor de indice de risco de pré-Diabetes, de Diabetes e/ou uma de afecção relacionada à Diabetes a partir dos dados de resultados de teste, em que o dito valor de indice de risco é representativo do risco de um individuo desenvolver ou ter pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes; e (iv) meio para relatar o dito valor de indice de risco.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para classificar ou agrupar uma população de indivíduos, que compreende: obter dados de indice de risco de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes para indivíduos na dita população; e classificar os indivíduos dentro da população em relação aos indivíduos restantes na população, ou dividir a população em pelo menos dois grupos, com base nos fatores que compreendem os ditos dados de indice de risco obtidos.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para estimar um desfecho substituto de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente, sendo que o método compreende: medir pelo menos um biomarcador dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2; e estimar um desfecho substituto de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes no paciente com base na dita medida.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para estimar o risco de um paciente desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para monitorar o risco de um paciente desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar ou identificar um paciente com pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para monitorar a terapia ou a intervenção de pré- Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar de modo diferencial um estado de doença ou subclasse de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a medição de 5 pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é selecionado dentre a lista de biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção 10 relacionada à Diabetes em um paciente, que compreende: estimar o risco, para o paciente, desenvolver pré- Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes com o uso de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2, e tratar o paciente quando identificado como sendo em risco 15 elevado de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes com um regime de tratamento para atrasar ou impedir o inicio de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um 20 método para classificar ou agrupar uma população de pacientes, que compreende: obter os dados que representam uma contagem de risco de pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes para pacientes compreendidos dentro da dita população, em que a dita contagem de risco 25 é calculada com o uso de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2, e classificar os pacientes dentro da população em relação aos indivíduos restantes na população, ou dividir a população em pelo menos dois grupos, com base nos fatores que compreendem os ditos 30 dados de contagem de risco obtidos.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar ou avaliar um agente para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende: (i) colocar em contato células que expressam pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2, com um aqente putativo; e (ii) comparar a expressão e/ou os niveis de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 nas células, antes do contato com o agente putativo com a expressão e/ou os niveis de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2 nas células depois do contato com o agente putativo; em que uma mudança no nivel ou expressão identifica o agente como um agente para tratar pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Assim, outro aspecto da presente invenção fornece o uso de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 como um alvo do fármaco para pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré- Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um paciente que compreende administrar uma quantidade eficaz de um agente adaptado para mudar a expressão ou o nivel de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 ao paciente.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um agente adaptado para mudar a expressão ou o nivel de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 para preparar uma medicação para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A seguinte Descrição Detalhada da Invenção, dada por meio de exemplo, mas não destinada a limitar a invenção às modalidades especificas descritas, pode ser entendida em conjunção com as Figuras anexas, em que:
A Figura 1 é uma tabela que lista os dados de proteina de biomarcador obtidos de três estudos com relação à presença de nefropatia diabética em pacientes com diabetes medidos pelo monitoramento de múltiplas reações (MRM);
A Figura 2 é uma série de diagramas de fio de bigode de caixa para cada biomarcador listado na Figura 1 do estudo de FDS1 (diagrama de caixa da esquerda: grupo diabético; diagrama de caixa da direita: grupo diabético com nefropatia severa; eixo geométrico x: proteina/peptideo; eixo geométrico y: Razão de abundância relativa; sequências de peptideo: ATA = ATAVVDGAFK; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; LEP = LEPYADQLR; e ISA = ISASAEELR)
A Figura 3 é uma série de diagramas de fio de bigode de caixa para cada biomarcador listado na Figura 1 do estudo de FDS2 (diagrama de caixa da esquerda: grupo diabético; diagrama de caixa da direita: grupo diabético com nefropatia severa; eixo geométrico x: proteina/peptideo; eixo geométrico y: Razão de abundância relativa; sequências de peptideo: IAF = IAFSATR; LEP = LEPYADQLR; ISA = ISASAEELR; ALA = ALAQCAPPPAVCAELVR; e FLN = FLNVLSPR; DAL DALSSVQESQVAQQAR; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; GDI = GDIGETGVPGAEGPR; TGD =TGDIVEFVCK; LVY =LVYPSCEEK);
A Figura 4 é uma série de diagramas de fio de bigode de caixa para cada biomarcador listado na Figura 1 do estudo de BDS (diagrama de caixa da esquerda: grupo diabético; diagrama de caixa da direita: grupo diabético com nefropatia severa; eixo geométrico x: proteina/peptideo; eixo geométrico y: Razão de abundância relativa; sequências de peptideo: LVG = LVGGDNLCSGR; IWL = IWLDNVR; SVS SVSLPSLDPASAK; e TEV = TEVIPPLIENR); e
A Figura 5 é uma tabela que lista os dados de proteina de biomarcador obtidos do estudo de BDS em relação aos pacientes com nefropatia diabética e aos pacientes saudáveis medidos por MRM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à identificação de biomarcadores associados com pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes, tal como nefropatia diabética. Consequentemente, a presente invenção caracteriza métodos para identificar pacientes que estão em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes, que inclui aqueles pacientes que são assintomáticos ou somente exibem indicadores não específicos de pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes pela detecção dos biomarcadores revelados no presente documento. Esses biomarcadores também são úteis para monitorar pacientes que passam por tratamentos e terapias para pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes, e para selecionar ou modificar terapias e tratamentos que seriam eficazes e, pacientes que têm pré- Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes, em que a seleção e o uso de tais tratamentos e terapias retardam a progressão de pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes, ou impede seu inicio. A presente invenção também caracteriza novos alvos do fármaco para pré- Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes que compreendem pelo menos um dos biomarcadores na Tabela 1 ou 2.
Definições
"Agentes para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes" incluem: insulina, tal como insulina madura, pró-insulina e c-peptideo solúvel (SCp), formas de ação rápida de insulina, insulina regular, insulina de ação intermediária e formas de ação prolongada de insulina; agentes hipoglicêmicos; agentes anti-inflamatórios; agentes de redução de lipidio; anti-hipertensivos tais como bloqueadores de canal de cálcio, bloqueadores de receptor beta-adenérgico, ciclooxigenase-2 inibidores que incluem profármacos de inibidores de COX-2, inibidores de sistema de agiotensina que incluem bloqueadores de receptor de angiotensina II (ARBs), inibidores de ACE e inibidores de renina que incluem aminoácidos e derivados dos mesmos, peptideos e derivados dos mesmos, e anticorpos para renina.
"Antagonistas de angiotensina II"são compostos que interferem com a atividade de angiotensina II pela ligação aos receptores de angiotensina II e interferir com sua atividade e incluir compostos de peptideo e compostos de não peptideo. A maior parte de antagonistas de angiotensina II são congêneres levemente modificados, em que a atividade agonista é atenuada pela reposição de fenilalanina na posição 8 com algum outro aminoácido. Exemplos de antagonistas de angiotensina II incluem: compostos peptidicos (por exemplo, saralasina, octapeptideo angiotensina-(1-8) e análogos relacionados); imidazol-2-ona N-substituido; derivados de imidazol acetato que incluem 2-N-butil-4-cloro-l-(2- clorobenzila) ácido imidazol-5-acético; ácido 4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilico e derivados análogos; análogos de N2-tetrazol beta-glucuronida; pirróis substituídos, pirazóis, e triazóis; derivados heterociclicos e fenol, tais como 1,3-imidazóis; geterociclos de anel com 7 membros fundidos com imidazol; anticorpos para angiotensina II; e compostos de aralquil imidazola, tais como imidazóis substituídos por bifenil-metil; ES8891 (N-morfolinoacet11-(-1-naftil)-L-alani-1-(4, tiazolil)-L-alanil (35,45)-4-amino-3-hidroxi-5-ciclo-hexapentanoil--N- hexilamida); SKF108566 ácido (E-alfa-2-[2-butil-l-(carboxi fenil) metil] lH-imidazola-5-il[metilan-e]-2-tiofenepropanóico); Losartan (DUP753/MK954);e Remikirin.
"Angiotensina que converte inibidores de enzima (ACE)"incluem aminoácidos e derivados dos mesmos, peptideos, que incluem di- e tri-peptideos e anticorpos para ACE que intervém no sistema de renina-angiotensina pela inibição da atividade de ACE, reduzindo ou eliminando, desse modo, a formação de substância vasoconstritora angiotensina II. Classes de compostos conhecidos como úteis como inibidores de ACE incluem acilmercapto e mercaptoalcanoil prolinas, tais como captopril e zofenopril, carboxialquil dipeptideos, tais como enalapril, lisinopril, quinapril, ramipril, e perindopril, imitações de carboxialquil dipeptideo, tais como cilazapril e benazapril, fosfinilalcanoil prolinas, tais como fosinopril e trandolopril.
Agentes "anti-inflamatórios" incluem: Alclofenac; Dipropionato de Alclometasona; Algestona Acetonida; Alfa Amilase; Amcinafal; Amcinafida; Amfenac Sódio; Hidrocloreto de Amiprilose; Anakinra; Anirolac; Anitrazafen; Apazona; Balsalazida Disódio; Bendazac; Benoxaprofen; Hidrocloreto de Benzidamina; Bromelainas; Broperamol; Budesonida; Carprofen; Cicloprofen; Cintazona; Cliprofen; Propionato de Clobetasol; Butirato de Clobetasona; Clopirac; Propionato de Cloticasona; Acetato de Cormetasona; Cortodoxona; Deflazacort; Desonida; Desoximetasona; Dipropionato de Dexametasona; Diclofenac Potássio; Diclofenac Sódio; Diacetato de Diflorasona; Diflumidona Sódio; Diflunisal; Difluprednato; Diftalona; Sulfóxido de Dimetil; Drocinonida; Endrisona; Enlimomab; Enolicam Sódio; Epirizol; Etodolac; Etofenamato; Felbinac; Fenamol; Fenbufen; Fenclofenac; Fenclorac; Fendosal; Fenpipalona; Fentiazac; Flazalona; Fluazacort; Ácido Flufenâmico; Flumizol; Acetato de Flunisolida; Flunixina; Flunixina Meglumina; Fluocortin Butil; Acetato de Fluorometolona; Fluquazona; Flurbiprofen; Fluretofen; Propionato de Fluticasona; Furaprofen; Furobufen; Halcinonida; Propionato de Halobetasol; Acetato de Halopredona; Ibufenac; Ibuprofen; Ibuprofen Alumínio; Ibuprofen Piconol; Ilonidap; Indomethacina; Indomethacina Sódio; Indoprofen; Indoxol; Intrazol; Acetato de Isoflupredona; Isoxepac; Isoxicam; Ketoprofen; Hidrocloreto de Lofemizol; Lornoxicam; Etabonato de Loteprednol; Meclofenamato de Sódio; Ácido Meclofenâmico; Dibutirato de Meclorisona; Ácido Mefenâmico; Mesalamina; Meseclazona; Suleptanato de Metilprednisolona; Morniflumato; Nabumetona; Naproxen; Naproxen Sódio; Naproxol; Nimazona; Olsalazina Sódio; Orgoteina; Orpanoxina; Oxaprozin; Oxifenbutazona; Hidrocloreto de Paranilina; Polisulfato de Pentosan Sódio; Glicerato de Fenbutazona Sódio; Pirfenidona; Piroxicam; Cinnamato de Piroxicam; Piroxicam Olamina; Pirprofen; Prednazato; Prifelona; Ácido Prodólico; Proquazona; Proxazol; Citrato de Proxazol; Rimexolona; Romazarit; Salcolex; Salnacedina; Salsalato; Salicilatos; Cloreto de Sanguinarium; Seclazona; Sermetacina; Sudoxicam; Sulindac; Suprofen; Talmetacina; Talniflumato; Talosalato; Tebufelona; Tenidap; Tenidap Sódio; Tenoxicam; Tesicam; Tesimida; Tetridamina; Tiopinac; Pivalato de Tixocortol; Tolmetina; Tolmetina Sódio; Triclonida; Triflumidato; Zidometacina; Glucocorticóides; Zomepirac Sódio, aspirina, inibidores de citocina, tais como antagonistas de citocina (por exemplo, antagonistas de receptor IL-6), aza-alquil lisofosfolipídeos (AALP), e inibidores de Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-alfa), tais como anticorpos de anti-TNF-alfa, receptor de TNF solúvel, TNF-alfa, moléculas de ácido nucléico anti-senso, guanilhidrazona multivalente (CNI-1493), N-acetilcisteína, pentoxifilina, oxpentifilina, análogos de nucleósido carbocíclico, inibidores de TNF-alfa e Dexanabinol, tais como Etanercept e Infliximab.
"Agentes bloqueadores de receptor beta-adrenérgico"antagonizam os efeitos cardiovasculares de catecolaminas em angina pectoris, hipertensão, e arritmias cardiacas e incluem atenolol, acebutolol, alprenolol, befunolol, betaxolol, bunitrolol, carteolol, celiprolol, hidroxalol, indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, methipranol, metindol, metoprolol, metrizoranolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, practolol, practolol, sotalolnadolol, tiprenolol, tomalolol, timolol, bupranolol, penbutolol, trimepranol, 2-(3-(1,1-dimetiletil)-amino-2-hidroxipropoxi)- 3-piridenecarbonitrilHCl- , l-butilamino-3-(2,5-diclorofenoxi-)-2-propanol, l-isopropilamino-3-(4-(2-ciclopropilmetoxietil)fenoxi)-2-propanol, 3-isopropilamino-l- (7-metilindan-4-iloxi)-2-butanol, 2-(3-t-butilamino-2-hidroxi-propiltio)-4-(5-carbamoil-2-tienil)tiazol e ftaleto de 7-(2-hidroxi-3-t-butilaminpropoxi). "Bloqueadores de canal de cálcio" pertencem a um dos três principais grupos quimicos de fármacos, as dihidropiridinas, tal como nifedipina, as fenil alquil aminas, tal como verapamila, e as benzotiazepinas, tal como diltiazem. Outros bloqueadores de canal de cálcio úteis de acordo com a invenção incluem aminona, amlodipina, benciclano, felodipina, fendilina, flunarizina, isradipina, nicardipina, nimodipina, perhexileno, galopamil, tiapamil e análogos de tiapamil, feniloin, barbiturates, e os peptideos dinorfina, omega-conotoxina, e omega-agatoxina.
"Diabetes" inclui Diabetes do Tipo 1, ambos auto- imune e idiopática, a Diabetes do Tipo 2 e a Diabetes gestacional. Diabetes pode ser caracterizada por hiperglicemia recorrente e persistente e pode ser diagnosticada pelos niveis de glicose no sangue aumentados e hemoglobina glicolisada 6,5%). De acordo com a definição atual, com duas medições de glicose em jejum acima de 126 mg/dl (7,0 mmol/1) é considerado o diagnóstico para Diabetes Mellitus.
"Afecção relacionada à Diabetes" inclui qualquer afecção ou doença que é um resultado ou complicação de, ou é, de outro modo, correlacionado ou associado com Diabetes que incluem uma afecção causada por niveis de glicose no sangue maiores que o normal e uma afecção selecionada dentre a lista que consiste de: hipoglicemia, cetoacidose diabética, neuropatia diabética, doença no rim que inclui nefropatia diabética, doença cardiovascular, derrame e retinopatia diabética e doença arteriovascular.
"Biomarcador" no contexto da presente invenção abrange, sem limitação, as proteinas na Tabela lor 2 e, de fato, medidas das mesmas; ácidos nucléicos que encodificam as proteinas na Tabela 1 ou 2; produtos de degradação e metabolites das proteinas na Tabela 1 ou 2; polimorfismos, mutações, variantes, modificações, subunidades, peptideos (tais como aqueles na Tabela 3) e fragmentos das proteinas na Tabela 1 ou 2; e complexos ligantes de proteina que incluem as proteinas na Tabela 1 ou 2. Os Biomarcadores também podem incluir as proteinas com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou similaridade com as proteinas na Tabela 1 ou 2, assim como formas mutadas das proteinas na Tabela 1 ou 2 e ácidos nucléicos que encodificam tais mutações. Os Biomarcadores podem ser usados para calcular indices matemáticos ou outras medições, que inclui tendências temporais e diferenças que são úteis em relação à presente invenção.
"Diabetes gestacional"refere-se à intolerância à glicose durante a gravidez. Essa afecção resulta em alto nivel de açúcar no sangue que se inicia ou é primeiro diagnosticada durante a gravidez.
Os agentes "hipoglicêmicos" incluem agentes hipoglicêmicos orais e incluem, sem limitação, sulfonilureia de primeira geração: Acetoexamida, Clorpropamida, Tolbutamida; sulfonilureia de segunda geração: Glipizida, Gliburida, Glimepirida; Biguanidas: Metformina; Inibidores de alfa-glucosidase: Acarbose, Miglitol, Tiazolidinadionas: Rosiglitazona, Pioglitazona, Troglitazona; Meglitinidas: Repaglinida; e outros hipoglicêmicos tais como Acarbose; Buformina; Cloridrato de butoxamina; Camiglibose; Ciglitazona; Englitazona Sódica; Darglitazona Sódica; Cloridrato de Etoformina; Gliamilida; Glibomurida; Glicetanila Gliclazida Sódica; Gliflumida; Glucagon; Gliexamida; Glimidina Sódica; Glioctamida; Gliparamida; Linoglirida; Fumarato de Linoglirida; Palmoxirato de Metila; Palmoxirato Sódico; Tartrato de Piroglirida; Pró-insulina Humana; Acetato de Seglitida; Tolazamida; Tolpirramida; Zopolrestato.
A "glicemia de jejum alterada" (IFG) é uma afecção pré-diabética associada a um nivel de glicose no sangue que é maior que o normal, mas não alto o suficiente para ser classificado como Diabetes. Um paciente com IFG pode ter um nivel de açúcar no sangue em jejum (glicose) abaixo ou igual a 125mg/l, entre 100 e 125mg/dl ou entre 105 e 125mg/dl.
O termo "identidade", usado no presente documento, se refere a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas, conforme determinado comparando-se as sequências. "Identidade" também significa o grau de associação de sequência entre o polipeptideo ou sequências de molécula de ácido nucleico, conforme o caso, como determinado pela compatibilidade entre cordas de nucleotideo ou sequências de aminoácido. "Identidade" mede o percentual de combinações idênticas entre duas ou mais sequências com alinhamentos de intervalo direcionados por um modelo matemático particular de programas de computador.
A "tolerância à glicose diminuída" (IGT) é uma afecção pré-diabética associada a um nível de glicose no sangue que é maior que o normal, mas não é alto o suficiente para ser classificada como Diabetes. Um paciente com IGT pode ter niveis de glicose de duas horas de 140 a 199 mg/dl (7,8 a 11,0 mmoles) no teste oral de tolerância à glicose 75-g.
"Agentes de redução de lipidio" incluem gemfibrozil, colistiramina, colestipol, ácido nicotinico, e inibidores de redutase de HMG-CoA, tais como sinvastatina, lovastatina, pravastatina sódica, fluvastatina, atorvastatina e cerivastatina.
O termo "medir" e variantes tais como "medida", conforme usado no presente documento, em relação aos biomarcadores descritos no presente documento se refere a determinar a presença e/ou quantidade de um dado biomarcador.
"Pré-Diabetes" é um' estado no qual alguns, mas não todos os critérios de diagnóstico para Diabetes são cumpridos. Isso inclui afecções em que os exibem niveis de glicemia entre normal e niveis diabéticos, afecções em que os pacientes sofrem de tolerância à glicose diminuída (IGT), glicemia de jejum alterada (IFG) e/ou hemoglobina glicosilada entre 5,7 e 6,4%.
Uma "amostra" no contexto da presente invenção é uma amostra biológica isolada de um paciente e pode incluir, por meio de exemplo e não limitação, todo o sangue, fração de sangue, soro, plasma, células sanguíneas, células endoteliais, biópsias de tecido, fluido linfático, fluido de ascite, fluido intersticial (também conhecido como "fluido extracelular" e abrange o fluido constatado em espaços entre as células, incluindo, entre outros, fluido gengival crevicular), medula óssea, liquido cefalorraquidiano (CSF), saliva, mucosa, catarro, suor, urina, ou qualquer outra secreção, excreção, ou outros fluidos corporais.
O termo "similaridade" é um conceito relacionado à "identidade", mas em contraste se refere a uma medida de similaridade que inclui tanto combinações idênticas quanto combinações de substituição conservadora. Visto que as substituições conservadoras se aplicam aos polipeptideos e não a moléculas de ácido nucleico, a similaridade lida somente com as comparações de sequência de polipeptideo. Se duas sequências de polipeptideo têm, por exemplo, 10 de 20 aminoácidos idênticos, e o restante for todo de substituições não conservadoras, então o percentual de identidade e similaridade seriam ambos de 50%. Se, no mesmo exemplo, houver mais 5 posições em que há substituições conservadoras, então o percentual de identidade permanece em 50%, mas o percentual de similaridade seria de 75% (15 de 20). Portanto, em casos em que há substituições conservadoras, o grau de similaridade entre duas sequências de polipeptideo será maior que o percentual de identidade entre essas duas sequências.
O termo "substituição conservadora de aminoácido" se refere a uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo normativo de modo que haja pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição. Por exemplo, uma substituição conservadora resulta do deslocamento De um resíduo não polar em um polipeptideo com qualquer outro resíduo não polar. Além do mais, qualquer resíduo nativo no polipeptideo pode ser também substituído por alanina. As regras gerais de substituição conservadora de aminoácidos são apresentadas na tabela abaixo no presente documento:
Figure img0004
A substituição conservadora de aminoácidos também abrange residues de aminoácido que ocorrem de modo não natural que são tipicamente incorporados por sintese de peptideo quimico ao invés de por sinteses em sistemas 5 biológicos. Esses incluem peptidomiméticos, e outras formas reversas ou invertidas de porções quimicas de aminoácido. As modificações conservadoras à sequência de aminoácido (e as modificações correspondentes aos nucleotídeos de encodificação) são esperadas para produzir polipeptideos que têm características funcionais e químicas s similares aos dos biomarcadores na Tabela 1. Em contraste, as modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas dos biomarcadores na Tabela 1 podem ser concluídas selecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito em manter (a) a estrutura da cadeia molecular na área da substituição, por exemplo, como uma lâmina ou conformação helicoidal, (b) a carga ou capacidade hidrofóbica da molécula no local visado, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os residues de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns de cadeia lateral: 1) hidrofóbica: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; 2) hidrofilica neutra: Cys, Ser, Thr; 3) ácida: Asp, Glu; 4) básica: Asn, Gin, His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam orientação de cadeia: Gly, Pro; e 6) aromática: Trp, Tyr, Phe.
Os métodos preferenciais para determinar a identidade e/ou similaridade são projetadas para proporcionar a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas publicamente disponíveis de computador. Os métodos de programas de computador preferenciais para determinar identidade e similaridade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, que inclui GAP (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 10 (1990)). 0 programa BLAST X é publicamente disponível a partir do Centro
Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI) e outras fontes (Altschul et al., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, Md.); Altschul et al., 1990, supra). O algoritmo Smith Waterman bem conhecido pode ser também usado para determinar 5 a identidade.
Um "paciente" no contexto da presente invenção é preferencialmente um mamifero. O mamifero pode ser um humano, primata não humano, camundongo, rato, cão, gato, cavalo ou vaca. Um paciente pode ser aquele que foi previamente 10 diagnosticado ou identificado como tendo Diabetes, pré- Diabetes, ou uma afecção relacionada à Diabetes, e opcionalmente já submetida, ou passa por uma intervenção terapêutica dos Diabetes, pré-Diabetes, ou afecção relacionada à Diabetes. De forma alternativa, um paciente 15 pode ser também aquele que não foi previamente diagnosticado como tendo pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes. Por exemplo, um paciente pode ser aquele que exibe um ou mais fatores de risco for pré- Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes, 20 ou um paciente que não exibe nenhum fator de risco ou um paciente que é assintomático para pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes. Um paciente pode ser também aquele que está sofrendo ou está em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção 25 relacionada à Diabetes.
Diagnósticos e Prognósticos
A invenção fornece diagnóstico e prognóstico aprimorados de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. O risco de desenvolver pré-Diabetes, 30 Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes pode ser analisada medindo um ou mais dos biomarcadores descritos no presente documento, e comparando os valores medidos para valores de referência ou de indice. Tal uma comparação pode ser feita com algoritmos ou fórmula matemática de modo a combinar informações a partir dos resultados de múltiplos biomarcadores individuais e outros parâmetros em uma única medição ou indice. Os pacientes identificados como tendo um maior risco de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes pode ser opcionalmente selecionado para receber regimes de tratamento, tais como administração de compostos profilácticos ou terapêuticos ou implantação de regimes de exercício ou suplementos dietéticos para evitar, tratar ou adiar um principio de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes.
A quantidade do biomarcador pode ser medida em uma amostra de teste e comparada a um nivel de referência ou normal, que utiliza técnicas tais como limites de referência, limites de discriminação, ou limiares de definição de risco para definir pontos de corte e valores anormais de pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. O nivel de controle normal é o nivel de um ou mais biomarcadores ou indices combinados de biomarcador tipicamente constatados em um paciente que não sofrem de pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Os niveis normal e abnormal e pontos de corte podem variar com base em se um biomarcador é usado sozinho ou em uma fórmula que se combina com outros biomarcadores em um indice. De forma alternativa, o nivel normal ou anormal pode ser uma base de dados de padrões de biomarcador ou "assinaturas" de pacientes previamente testados que desenvolveram ou não desenvolveram ou converteram à pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes em um horizonte temporal clinicamente relevante.
A presente invenção pode ser usada para criar medições continuas ou categóricas do risco de desenvolvimento ou conversão à pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes, que diagnosticam e definem desse modo o espectro de risco de uma categoria de pacientes com um estado clinico definido. No cenário categórico, os métodos da presente invenção podem ser usados para distinguir entre coortes normais e coorte com pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Em outras modalidades, a presente invenção pode ser usada de modo a distinguir pré- Diabetes de Diabetes, Diabetes de normal, afecções diferentes relacionadas à Diabetes ou afecções de diabetes diferentes do normal. Tal uso diferenciado pode requerer diferentes combinações de marcador em painéis individuais, algoritmos matemáticos, e/ou pontos de corte, mas sujeito às mesmas medições de medição mencionadas acima para o uso destinado.
Identificar um paciente antes que o mesmo desenvolva pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes permite a seleção e iniciação de varias intervenções terapêuticas ou regimes de tratamento de modo a adiar, reduzir ou evitar que a conversão do paciente a um estado de doença. O monitoramento dos niveis de pelo menos um biomarcador também permite o curso de tratamento de pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes a ser monitorado. Por exemplo, uma amostra pode ser fornecida de um paciente que passa por regimes de tratamento ou intervenções terapêuticas, por exemplo, tratamento de drogas, para pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Tais regimes de tratamento ou intervenções terapêuticas podem incluir regimes de exercido, modificação dietética, suplementação dietética, intervenção cirúrgica bariátrica, administração de produtos farmacêuticos, e tratamento com produtos terapêuticos ou profilácticos usados em pacientes diagnosticados ou identificados com pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. As amostras podem ser obtidas do paciente em vários pontos de tempo antes, durante, ou após o tratamento.
A presente invenção pode ser também usada para triar populações em uma variedade de configurações. Para grupos de pacientes podem ser triados: para identificar aquelas intervenções exigidas; para a coleta de dados epidemiológicos; para analisa-los para fins de seguro de saúde. Os dados obtidos através de triagens de população serão particularmente valiosos quando correlacionados com medições clinicas de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes e podem ser armazenadas em disposições de dados ou outras coletas em meio legivel por máquina para uso conveniente por fornecedores de serviço de cuidados com saúde e a indústria de saúde aliada para aprimorar a distribuição e eficiência de serviço e, portanto, aprimorar os resultados do paciente.
Um meio de armazenamento legivel por máquina inclui qualquer material de armazenamento de dados encodifiçados com dados legiveis em computador ou disposições de dados que, ao usar uma máquina programada com instruções para uso dos ditos dados, têm capacidade de uso para uma variedade de propósito, tais como, sem limitação, fornecer ou gerar informações de paciente relacionadas à pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes fatores de risco periodicamente ou em resposta a intervenções ou terapias e descoberta de drogas. A análise ou medição dos biomarcadores da invenção e/ou do risco correspondente determinado a partir da mesma pode ser implantada em execução de programas de computador em computadores programáveis, que compreende, entre outros, um processor, um sistema de armazenamento de dados (que inclui memória volátil e não volátil e/ou elementos de armazenamento), pelo menos um dispositivo de entrada e pelo menos um dispositivo de saida. O código de programa ou software pode ser aplicado para liberar dados, para realizar as funções exigidas para gerar a emissão exigida.
O código de programa ou software pode realizar uma ou mais das funções em relação aos dados relacionados aos biomarcadores que inclui: determinar os niveis normais e 5 anormais de um biomarcador e comparar um nivel de um biomarcador a um valor de referência, por exemplo, um paciente ou população de controle cujo estado de pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes é conhecido ou um valor de indice ou valor de linha de base. A 10 amostra de referência ou valor de indice ou valor de linha de base pode ser tomada ou derivada de um ou mais pacientes que foram expostos a um tratamento, ou pode ser tomada ou derivada de um ou mais pacientes que tem baixo risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada 15 à Diabetes, ou pode ser tomada ou derivada de pacientes que mostraram melhoras em um ou mais fatores de risco associados à pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à
Diabetes (que incluem parâmetros clinicos estabelecidos) como um resultado de exposição a um tratamento. A amostra de 20 referência ou valor de indice ou valor de linha de base pode ser também tomada ou derivada de um ou mais pacientes que não foram expostos ao tratamento. Por exemplo, amostras podem ser coletadas de pacientes que receberam tratamento inicial para pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes 25 e tratamento subsequente para pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes para monitorar o progresso do tratamento. Um valor de referência pode também compreender um valor derivado de um algoritmo de previsão de risco ou indices computados de estudos de população.
Os biomarcadores da presente invenção podem desse modo ser usados para gerar um perfil ou assinatura de biomarcador de pacientes: (i) que não têm e não são esperados para desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes e/ou (ii) que têm ou são esperados para desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. 0 perfil de biomarcador de um paciente pode ser comparado a um perfil de biomarcador pré- 5 determinado ou de referência para diagnosticar ou identificar pacientes em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes, para monitorar a progressão de doença, assim como a taxa de progressão de doença, e para monitorar a eficácia de tratamentos de pré- 10 Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Os perfis de biomarcador da presente invenção são preferencialmente contidos em um meio legivel por máquina e são "vivos" na medida em que podem ser atualizados com dados adicionais que são apresentados, que aprimoram desse modo a 15 força e a significância clinica dos biomarcadores. Os dados em relação aos biomarcadores da presente invenção podem ser também combinados ou correlacionados com outros dados ou resultados de testes, tais como, sem limitação, medições de parâmetros clinicos ou outros algoritmos para pré-Diabetes, 20 Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Outros dados incluem idade, etnia, indice de massa corporal (BMI), niveis de colesterol total, niveis de glicose no sangue, pressão sanguinea, niveis de LDL e HDL. A midia legivel por máquina pode compreender também informações de paciente tais como 25 histórico médico e qualquer histórico familiar relevante.
A presente invenção também fornece métodos para identificar agentes para tratar pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes que são apropriadas ou de outro modo customizadas para um paciente especifico. A esse 30 respeito, uma amostra de teste de um paciente, exposta a um agente terapêutico ou uma droga, pode ser tomada e o nivel de um ou mais biomarcadores pode ser determinado. O nivel de um ou mais biomarcadores pode ser comparado a uma amostra derivada do paciente antes e após o tratamento, ou pode ser comparada às amostras derivadas de um ou mais pacientes que mostraram melhoras em fatores de risco como um resultado de tal tratamento ou exposição.
Testes
Os biomarcadores e painéis do mesmo da presente invenção podem ser implantados em uma gama de sistemas de teste. Tipicamente, os sistemas de teste incluem um meio para obter restados de teste a partir de uma amostra, um meio para 10 coletar, armazenar, processar e/ou rastrear resultados de teste para a amostra, geralmente em uma base de dados e um meio para relatar os resultados de teste. O meio para obter os resultados de teste pode incluir um módulo adaptado para teste automático que utiliza uma ou mais dentre análises 15 bioquimicas, imunológicas e de detecção de ácido nucleico.
Alguns sistemas de teste podem processar múltiplas amostras e podem executar múltiplos testes em uma dada amostra. O meio para coletar, armazenar, processar e/ou rastrear resultados de teste pode compreender um dispositivo de armazenamento de 20 dados fisicos e/ou eletrônicos, tal como um disco rigido ou memória flash ou impressões de papel. 0 meio para relatar os resultados de teste pode incluir um visor visivel, um enlace para uma estrutura de dados ou base de dados, ou uma impressora. A esse respeito, o meio de relatório pode ser 25 simplesmente um enlace de dados que é adaptado para enviar resultados a outro dispositivo tal como uma base de dados, visor visual, ou impressora.
Desse modo, a presente invenção fornece um sistema de teste adaptado para auxiliar na identificação de 30 indivíduos em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes ou pré-Diabetes de diagnóstico, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes, sendo que o sistema de teste compreende um meio que usa dados que se referem a pelo menos um dos biomarcadores descritos no presente documento. Tipicamente, os resultados de teste do sistema da presente invenção servem como entradas a um computador ou microprocessador programado com um código de máquina ou software que leva os dados referentes a pelo menos um dos biomarcadores descritos no presente documento e determina o risco de desenvolver ou já ter pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Seleção de Biomarcador
Os biomarcadores na Tabela 1 foram identificados como sendo constatados por ter alterado ou modificado os niveis de presença ou concentração em pacientes que têm Diabetes e ou nefropatia diabética. Desse modo, os biomarcadores e métodos da presente invenção permitem que alguém versado na técnica identifique, diagnostique, ou de outro modo analise os pacientes que não exibam nenhum sintoma de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes, mas que apesar disso tenham ou estejam em risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Um ou mais dos biomarcadores na Tabela 1 ou 2 pode ser selecionado para formar um painel de marcadores. Por exemplo, uma modalidade da invenção é um método de avaliação do risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes, que compreende a etapa de medir os niveis de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 biomarcadores da Tabela 1 ou 2. Preferencialmente, o painel inclui pelo menos um dentre: Peroxiredoxina-2 (P32119), Proteina AMBP (P02760); Apolipoproteina UM-IV (P06727) e o Complemento Clq subunidade de subcomponente B (P02746); pelo menos um dentre Adiponectina (Q15848), proteina relacionada a fator H de complemento 2 (P36980), Subunidade de Hemoglobina beta (P68871), Apolipoproteina B-100 (P04114) e Oxidase de Sulfidrila 1 (000391) ou; pelo menos uma dentre Apolipoproteina C-III (P02656), proteina de ligação de fator de crescimento similar à insulina 3 (P17936), CD5 similar a antigeno (043866) e Componente de complemento C8 de cadeia beta (P07358)
Algoritmos clínicos
Os resultados obtidos que usam os biomarcadores da presente invenção podem ser combinados em índices úteis na prática da invenção que usam qualquer uma ou mais fórmulas. Conforme indicado acima, e sem limitação, tais índices podem indicar, entre as várias outras indicações, a probabilidade, similaridade, risco absoluto ou relativo, tempo de ou taxa de conversão de um estado de doença a outro, ou criar previsões de futuras medições de biomarcadores de pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Isso pode ser, por um período de tempo ou horizonte temporal específico, ou para o risco de tempo de vida restante, ou simplesmente ser fornecido como um índice relativo à outra população de paciente de referência.
As fórmulas preferenciais incluem a ampla classe de algoritmos de classificação estatística, tais como característica de operação relativa (ROC), o uso de análise discriminante, por exemplo, análise discriminante linear (LDA) . Os atributos podem ser identificados para a LDA que usa uma abordagem com base em gene eigen com diferentes limiares (ELDA) ou um algoritmo de escalonamento com base em uma análise multivariável de variância (MANOVA). Os algoritmos de avanço, retrocesso e escalonamento podem ser realizados de modo que minimizem a probabilidade de não separação com base na estatística Hotelling-Lawley. Outras fórmulas incluem uma máquina de vetor de suporte (SVM), uma floresta aleatória ou particionamento recursivo pode ser também usada separadamente ou em combinação para identificar as combinações de biomarcador que são mais importantes.
Outra fórmula pode ser usada de modo a pré- processar os resultados de medições de biomarcador individual em mais formas valiosas de informações, antes do 5 processamento adicional. 0 Pré-processamento inclui transformações raiz quadrada e inversa, normalização de resultados de biomarcador, usam transformações matemáticas tais como funções logarítmicas ou logísticas. As normalizações com base em parâmetros clínicos tais como 10 idade, gênero, raça, BMI ou sexo são particularmente preferenciais.
Um ou mais parâmetros clínicos podem ser usados na prática da invenção em combinação com os biomarcadores da presente invenção como uma entrada a uma fórmula ou como 15 critérios de pré-seleção que definem uma população relevante a ser medida com o uso de um painel de biomarcador particular e fórmula. Os parâmetros clínicos podem ser também úteis na normalização e pré-processamento do biomarcador, ou na Seleção de Biomarcador, construção de painel, seleção e 20 derivação de tipo de fórmula, e pós-processamento de resultado de fórmula.
Os painéis de biomarcador da presente invenção podem ser ajustados à população e desfecho ou ao uso que é destinado. Por exemplo, os painéis e fórmulas de biomarcador 25 podem ser usados para análise de pacientes para prevenção e diagnóstico primários e para prevenção e gerenciamento secundários. Para análise primária, os painéis e fórmulas podem ser usados para previsão e estratificação de risco para afecções, para o diagnóstico de afecções diabéticas, para o 30 prognóstico de nivel de glicose e taxa de mudança e para indicação de futuro diagnóstico. Para prevenção e gerenciamento secundários, os painéis e fórmulas podem ser usados para prognóstico e estratificação de risco para complicações de Diabetes. Os painéis e fórmulas podem ser usadas para suporte de decisão clinica, tais como determinar tanto para diferenciar a intervenção à próxima visita, para recomendar verificações preventivas normais, para recomendar maior frequência de visita, para recomendar teste aprimorado e para recomendar intervenção terapêutica. Os painéis e fórmulas podem ser também úteis para intervenção em pacientes com afecções diabéticas, tais como seleções terapêuticas e resposta, ajuste e dosagem de terapia, monitorar eficiência de progresso terapêutico e indicação para mudar a intervenção terapêutica.
Os desfechos de doença da invenção include pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Os painéis e fórmulas no presente documento podem ser usadas para avaliar o estado atual dos desfechos de doença auxiliando o diagnóstico e/ou na determinação de severidade da pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes e/ou determinação da subclasse da doença ou afecção. Os painéis e fórmulas no presente documento são também úteis para determinar o estado futuro da intervenção, tal como determinar o prognóstico de futura pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes com terapia, intervenção e terapia de medicamento. A invenção pode ser ajustada a uma intervenção especifica, classe de medicamento, classe terapêutica ou terapia ou terapia de medicamento ou uma combinação dos mesmos.
Os desfechos substitutos da invenção incluem medir HBAIc, glicose (I7PG e OGTT), e classe de glicose (tolerância de glicose normal (NGT) , IGT, IFG e T2DM) . Os painéis e fórmulas no presente documento são úteis para determinar o estado atual dos desfechos substitutos diagnosticando a classe de glicose com ou sem jejum. O estado futuro de desfechos substitutos pode ser determinado com o uso dos painéis de biomarcador no presente documento tal como determinação do prognóstico de futura classe de glicose. Os painéis de biomarcador e fórmulas são também úteis para determinar o estado futuro de intervenção, tais como determinação de prognóstico de futura classe de glicose com terapia de medicamento.
Os desfechos de complicação de afecções diabéticas incluem as afecções relacionadas à Diabetes no presente documento, tais como doença renal, retinopatia de olho, danos microvasculares, danos ao figado, amputação de membro e complicações cardiovasculares. Os painéis de biomarcador e fórmulas podem ser usados pàra avaliar o estado atual dos desfechos de doença auxiliando no diagnóstico de pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. 0 estado futuro de desfechos de complicação pode ser determinado com o uso de painéis de biomarcador e fórmulas, tais como determinação do prognóstico de futura pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Os painéis e fórmulas são também úteis para determinar o estado futuro de intervenção tais como determinar o prognóstico de futura pré- Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes com terapia.
Agentes para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes
Os biomarcadores da presente invenção podem também ser usados para identificar e analisar agentes para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes ou uma afecção relacionada à Diabetes. Assim, a presente invenção também fornece um método de identificar ou analisar um agente para tratar ou reduzir o rico de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes que compreende: (i) contatar as células que expressam pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2 com um agente putativo; e (ii) comparar a expressão ou nivel de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2 nas células antes de contatar com o agente putativo para a expressão de pelo menos um biomarcador da Tabela 1 ou 2 nas células após o contato com o agente putativo; em que uma alteração na expressão ou nivel identifica o agente como um agente para tratar pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
As células podem ser contatadas com o agente putativo in vivo, tal como em um modelo animal ou in vitro, tal como em uma linhagem ou cultura celular. A expressão ou nivel pode ser comparado com o uso de um software ou programa de acionamento por computador.
A presente invenção também fornece um método para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um agente adaptado para alterar a expressão ou nivel de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 ao indivíduo.
O agente pode ser administrado de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos conforme selecionado por um profissional qualificado. Os agentes podem ser administrados como parte de uma composição que compreende uma quantidade eficaz do agente na mistura com um agente farmaceuticamente aceitável tal como um carreador farmaceuticamente aceitável. O material de carreador pode ser água para injeção, preferencialmente suplementado com outros materiais comuns em soluções para administração à mamíferos. Os agentes farmaceuticamente aceitáveis tais como carreadores, diluentes e excipientes podem ser incluídos conforme desejado. Outras composições exemplificativas compreendem um tampão Tris de cerca de pH 7,0 a 8,5 ou tampão de acetato de cerca de pH 4,0 a 5,5 que pode incluir adicionalmente sorbitol ou um substituído adequado do mesmo.
A formulação ótima do agente será determinada por um versado na técnica dependendo da rota de administração pretendida, formato de entrega e dosagem desejada. Consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435 a 1712 (18a Edição, A. R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company 1990) . Tais composições podem influenciar o estado fisico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de afastamento in vivo.
Assim, a presente invenção também fornece um método o uso de um agente adaptado para alterar a expressão ou nivel de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 para preparar um medicamento para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes.
Preferencialmente, o agente adaptado para alterar a expressão ou nivel de pelo menos um biomarcador na Tabela 1 ou 2 é um agente para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou uma afecção relacionada à Diabetes conforme definido no presente documento.Outros Agentes para tratar ou reduzir o risco de desenvolver pré-Diabetes, Diabetes e/ou afecções relacionadas à Diabetes incluem inibidores de lipase tal como cetilistat; análogos de amilina sintéticos tal como pramlintide Symlin com ou sem leptina recombinante; inibidores de cotransportador de sódio-glicose 2 com sergliflozina, YM543, dapagliflozina, triglicerideo lipase adiposa dupla e ativadores de PI3 quinase como Adyvia; antagonistas de receptores Y2, Y4 e Y5 de neuropeptideo, análogo sintético de hormônios humanos PYY3-36 e polipeptideo pancreático; antagonistas de receptor CB1 canabinóide tal como rimonabanto, taranabanto, CP-945,598, hormônios como oleoil- estrona; inibidores de serotonina, dopamina e norepinefrina (também conhecidos na técnica como "inibidores de reabsorção de monoamina tripla") como tesofensina; inibidores de reabsorção de norepinefrina e dopamina, como Contrave (bupropion mais antagonista de naltrexona opióide) e Excalia (bupropion mais zonisamida anticonvulsivante); inibidores de 111.beta.-hidroxisteroide desidrogenase tipo 1 (llb-HSDl); inibidores de sintese de cortisol tal como cetoconazol; inibidores de gluconeogênese; ativadores de glucoquinase; inibidores antissenso da proteina tirosina fosfatase-lB; assim como outros agentes como injeções de gastrina e análogos de fator de crescimento epidérmico (EGF) tal como Terapia de Neogênese de Ilhotas (El-I.N.T.); e betahistina.
Medição de Biomarcador
Os biomarcadores podem ser medidos com o uso de uma ou mais dentre uma faixa de técnica. Preferencialmente, os biomarcadores são medidos de um modo que minimiza a variabilidade de individuo. Por exemplo, os mesmos podem ser medidos em um estado de jejum e, mais comumente, na manhã fornecendo um nivel reduzido de variabilidade de individuo devido tanto ao consumo e metabolismo de alimento quanto à variação diurna. Qualquer procedimento de amostragem com base em jejum ou temporal pode ser usados na presente invenção.
A medição real dos niveis dos biomarcadores no presente documento pode ser determinada no nivel de proteina ou ácido nucleico com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, no nivel de ácido nucleico, análise de hibridização de Northern e Southern, assim como ensaios de proteção de ribonuclease com o uso de sondas que reconhecem especificamente uma ou mais dessas sequências podem ser usados para determinar a expressão de gene. Os niveis de biomarcador podem também ser medidos com o uso de ensaios de PCR com base na transcrição reversa (RT-PCR), por exemplo, com o uso de iniciadores específicos para a sequência de genes expressa de modo diferente. Preferencialmente, os niveis de biomarcador são determinados no nivel de proteina, por exemplo, medindo-se os niveis de peptideos encodifiçados pelos produtos de gene descritos no presente documento ou atividades dos mesmos. Tais métodos incluem, por exemplo, imunoensaios com base em anticorpos para proteinas encodifiçadas pelos genes, aptâmeros ou impressões moleculares.
Os biomarcadores na Tabela 1 ou 2, polipeptideos, peptideos, mutações e polimorfismos dos mesmos podem ser detectados de qualquer maneira adequada, mas são tipicamente detectados contatando-se uma amostra do indivíduo com um anticorpo que liga a proteina, polipeptideo, mutação ou polimorfismo de biomarcador e, então, detectando a presença ou ausência de um produto de reação. Os anticorpos podem ser monoclonais, policlonais, quiméricos ou um fragmento dos anteriores e a etapa de detectar o produto de reação pode ser executada com qualquer imunoensaio adequado.
Os imunoensaios executados em concordância com a presente invenção podem ser ensaios homogêneos ou ensaios heterogêneos. Em um ensaio homogêneo, a reação imunológica envolve usualmente o anticorpo especifico para o biomarcador, um analito etiquetado e a amostra de interesse. O sinal que surge da etiqueta é modificado, direta ou indiretamente, mediante a ligação do anticorpo ao analito etiquetado. Tanto a detecção quanto a reação imunológica da extensão do mesmo podem ser executadas em uma solução homogênea. As etiquetas imunoquimicas que podem ser empregadas incluem radicais livres, resdioisótopos, corantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos ou coenzimas. reagentes são usualmente a amostra, o anticorpo e meios para produzir um sinal detectável. As amostras conforme descritas acima podem ser usadas. 0 anticorpo pode ser imobilizado em um suporte tal como uma microesfera (tal como microesferas de agarose de proteina A e proteina G) , placa ou lâmina e contatado com o espécime suspeito de conter o antigeno em uma fase liquida. O suporte é, então, separado da fase liquida e ou a fase de suporte ou a fase liquida é examinada para um sinal detectável que emprega meios para produzir tal sinal. O sinal é relacionado à presença do analito na amostra. Os meios para produzir um sinal detectável incluem o uso de etiquetas radioativas, etiquetas fluorescentes ou etiquetas de enzima. Por exemplo, se o antigeno a ser detectado contiver um segundo sitio de ligação, um anticorpo que se liga a esse sitio pode ser conjugado a um grupo detectável e adicionado à solução de reação de fase liquida antes da etapa de separação. A presença do grupo detectável no suporte sólido indica a presença do antigeno na amostra de teste. Os exemplos de imunoensaios adequados incluem oligonucleotideos, transferência por immunoblotting, immunoprecipitação, métodos de imunofluorescência, métodos de quimiluminescência, eletroquimiluminescência (ECL) ou imunoensaios ligados por enzima.
Usando as informações de sequência fornecidas pelas entradas de base de dados para os biomarcadores na Tabela 1, a expressão das sequências de biomarcador pode ser detectada'(se presente) e medida com o uso de técnicas bem conhecidas a um versado na técnica tal como análises de hibridização de Northern blot ou métodos que amplificam especifica e, de modo preferencial, quantitativamente as sequências de ácido nucleico. Como outro exemplo, as sequências podem ser usadas para construir iniciadores para amplificar especificamente as sequências de biomarcador em, por exemplo, métodos de detecção com base na amplificação tal como reação em cadeia de polimerase com base na transcrição reversa (RT-PCR). Quando as alterações na expressão de gene são associadas à amplificação de gene, deleção e mutações, comparações de sequência em populações de referência e de teste podem ser feitas comparando-se as quantidades relativas das sequências de DNA ou RNA examinadas nas populações de célula de referência e teste.
Os metabolites de ácido e/ou proteina de biomarcador podem também ser medidos com o uso de um ou mais dentre uma variedade de modos conhecidos por um versado na técnica, incluindo a espectroscopia de indice refrativo (RI), espectroscopia ultravioleta (UV), análise fluorescente, análise radioquimica, espectroscopia de infravermelho próximo (IR próximo), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), análise de dispersão da luz (LS), espectroscopia de massa incluindo espectroscopia de massa de monitoramento de reação múltipla (MRM), espectroscopia de massa de pirólise, nefelometria, espectroscopia de Raman dispersiva, cromatografia gasosa combinada com espectroscopia de massa, cromatografia liquida combinada com espectroscopia de massa, tempo de vôo e ionização de dessorção de laser assistida por matriz (MALDI-TOF) combinado com espectroscopia de massa, espectroscopia de aspersão de ion combinada com espectroscopia de massa, eletroforese capilar, NMR e detecção de IR.
Quando os biomarcadores são medidos com o uso de espectroscopia de massa, os mesmos podem ser medidos por meio de um peptideo selecionado a partir da lista de: (i) um peptideo de 5 a 25 aminoácidos de uma proteina da Tabela 1 ou 2; (ii) um peptideo de 5 a 20 aminoácidos de uma proteina da Tabela 1 ou 2; (iii) um peptideo de 10 a 20 aminoácidos de uma proteina da Tabela 1 ou 2; (iv) um peptideo de 10 a 15 aminoácidos de uma proteina da Tabela 1 ou 2; ou (v) um peptideo na Tabela 3.
Kits
A invenção também inclui um reagente de detecção de biomarcador, por exemplo, um anticorpo especifico para uma proteina de biomarcador na Tabela 1 ou 2 ou peptideo na Tabela 3 ou um ácido nucleico que identifica ou se liga especificamente a um ou mais ácidos nucleicos que encodificam uma proteina de biomarcador na Tabela 1 ou 2 ou um peptideo na Tabela 3 tendo sequências de ácido nucleico homólogas, tal como sequências ou aptâmeros de oligonucleotide©, complementares a uma porção do ácido nucleico embalados em conjunto na forma de um kit. O kit pode conter em recipientes separados um ácido nucleico ou anticorpo (ou já ligado a uma matriz sólida ou embalado separadamente com os reagentes para ligar os mesmos à matriz), formulações de controle (positivas e/ou negativas) e/ou uma etiqueta detectável tal como fluoresceina, proteina fluorescente verde, rodamina, corantes de cianina, corantes de Alexa, luciferase, radioetiquetas, dentre outros. As instruções para executar o ensaio podem também ser incluídas no kit. O ensaio pode, por exemplo, estar na forma de uma hibridização de Northern, ELISA sanduíche ou arranjo de anticorpo de proteina.
Os reagentes para detectar biomarcadores da presente invenção podem ser imobilizados em uma matriz sólida tal como uma tira porosa para formar pelo menos um sitio de detecção de biomarcador. A região de medição ou detecção da tira porosa pode incluir uma pluralidade de sitios que contêm um anticorpo ou ácido nucleico. Uma tira de teste pode também conter sitios para controles negativos e/ou positivos.
Alternativamente, os sítios de controle podem ser localizados em uma tira separada da tira de teste. Opcionalmente, os diferentes sítios de detecção podem conter diferentes quantidades de anticorpos ou ácido nucleicos imobilizados, por exemplo, uma quantidade maior no primeiro sítio de detecção e quantidades menores em sítios subsequentes. Mediante a adição da amostra de teste, o número de sítios que exibem um sinal detectável fornece uma indicação quantitativa da quantidade de biomarcador presente na amostra. Os sítios de detecção podem ser configurados em qualquer formato adequadamente detectável e estão tipicamente no formato de uma barra ou ponto atravessando a largura de uma tira de teste.
Alternativamente, o kit contém um arranjo de substrato de ácido nucleico que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico. Os ácido nucleicos no arranjo identificam especificamente uma ou mais sequências de ácido nucleico adaptadas para ligar uma sequências de ácido nucleico que encodifica um biomarcador na Tabela 1 ou 2. O arranjo de substrato pode estar em, por exemplo, um substrato sólido ou "fragmento". Alternativamente, o arranjo de substrato pode ser um arranjo sólido.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Identificação e Validação de Biomarcadores de Diabetes
1. Materiais/Métodos A. Descrição de Coorte A.l. Estudo de Diabetes Fremantle (Fase 1)
Racional: A coorte FDS1 compreendeu 1294 pacientes que tinham diabetes tipo 2. Os indivíduos diabéticos com e sem nefropatia diabética foram selecionados para gerarem apresentações fenotípicas diferentes permitindo a maior diferença na expressão de proteína.
O Estudo de Diabetes Fremantle (FDS) Fase I foi um estudo observacional longitudinal dos cuidados com o diabetes, controle, complicações e custo nos pacientes de uma comunidade urbana definida por código postal estável de 5 120.097 pessoas. Quando a Fase I foi concebida em 1991, havia poucos dados de história natural de diabetes publicados.
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A.2. Estudo de Diabetes Fremantle (Fase 2)
Racional: A coorte FDS2 recrutou diabéticos referidos por médicos na localidade Fremantle e aqueles da 10 base de dados de coorte FDS1. Os indivíduos diabéticos com e sem nefropatia diabética foram selecionados para gerarem apresentações fenotipicas diferentes permitindo a maior diferença na expressão de proteina.
A Fase II foi concebida em 2007 para a coleta de 15 dados melhorada e estendida a fim de caracterizar a natureza do diabetes na Austrália urbana contemporânea.
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A.3. Estudo de Diabetes Busselton
Racional: Expandir as informações nos pacientes diabéticos de uma comunidade rural. Complementar as informações obtidas a partir dos estudos urbanos FDS1 e FDS2.
Inclui indivíduos de controle não diabéticos correspondentes.
O Estudo de Saúde de Busselton é um dos programas de pesquisa epidemiológica em execução mais longos no mundo. Os residentes da cidade de Busselton, uma comunidade costeira no sudoeste da Austrália Ocidental, foram envolvidos em uma 10 série de pesquisas de saúde desde 1966. Até o momento mais de 16.000 homens, mulheres e crianças de todas as idades participaram das pesquisas e ajudaram a contribuir para o entendimento de muitas doenças comuns e afecções de saúde.
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B. Revelação de biomarcador de proteina com o uso de iTRAQ e 2D LC MALDI TOF/TOF
Essa metodologia revelada envolve etiquetar quimicamente o plasma de diferentes grupos de pacientes (por 5 exemplo, nefropatia diabética versus diabético sem nefropatia) e determinar por espectrometria de massa a razão relativa da presença de uma proteina particular. As proteinas com concentrações significantemente alteradas após a análise indicam uma alteração na bioquímica de um grupo de pacientes 10 versus outro. Essa técnica foi usada para medir as concentrações relativas de 130 a 200 proteinas por amostra. As proteinas de concentração significantemente diferente entre os grupos foram identificadas e essas foram selecionadas para exame adicional pela metodologia MRM (seção 15 C abaixo).
B.l. Preparação de amostra
Amostras de plasma (N = 10 ou 20) foram agrupadas antes da imunodeleção das 14 proteínas mais abundantes com o uso de uma coluna de HPLC MARS 14 (Agilent Technologies). As amostras imunodeletadas foram trocadas por tampão com o uso 5 de filtros de rotação de corte de lOkDa (Sartorius) em bicarbonato de Trietilamônio a 1M. As amostras de proteínas foram reduzidas, alciladas, digeridas por tripsina e etiquetadas de acordo com o protocolo iTRAQ (Applied Biosystems). 10
B.2. Análise instrumental
Os peptídeos foram dessalinizados em uma coluna de fase invertida polimétrica de 33 pM Strata-X (Phenomenex) antes da separação por cromatografia líquida de troca de cátion forte (SCX) em uma HPLC Agilent 1100 com o uso de uma 15 coluna de PoliSulfoetila (4,6 x 100 mm, 5 pm, 300 Â) . Os peptídeos foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 400 mM KC1. As frações de SCX foram dessalinizadas e carregadas em um sistema de HPLC Ultimate 3000 nano (Dionex C18, PepMap 100, 3 pm) e separadas com um gradiente de 10 a 40% de 20 acetonitrilo (0,1% de ácido fórmico) com manchamento com o uso de um localizador robótico ProBot (LC Packings). As manchas resultantes foram analisadas em um analisador TOF/TOF 4800 MALDI.
B.3. Análise de dados
A análise de dados foi realizada com o uso do software ProteinPilot™ 2.0.1 (Applied Biosystems). As taxas de revelação falsas foram calculadas com o uso do algoritmo PSPEP que funciona em conjunto com ProteinPilot™ 2.0.1 e somente as proteínas com uma taxa de revelação falsa global 30 (FDR) de ajuste de < 5% foram aceitas. C. Validação de candidato de biomarcador com o uso de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM)
O Monitoramento de Reação Múltipla (MRM) é uma abordagem com base na espectrometria de massa para direcionar especificamente transições (pares de ion precursor-fragmento) para um peptideo de assinatura, que representa um substituto para a proteina candidata de biomarcador inteira. Para cada candidato um ou dois peptideos exclusivos a essa proteina (quando comparada à Base de Dados Humana SwissProt versão 57.1) foram usados. Essa abordagem de alto rendimento foi usada para validar os biomarcadores da fase de revelação (consulte a Seção acima) em uma quantidade maior de amostras de plasma de paciente individuais.
C.l. Preparação de amostra
Amostras agrupadas idênticas aos experimentos iTRAQ anteriores assim como amostras individuais (N=10 por grupo) diferentes dos agrupamentos iTRAQ anteriores (amostras de validação) foram preparadas. As amostras foram imunoreduzidas das 14 proteinas mais abundantes com o uso de uma coluna de HPLC MARS 14. As amostras imunoreduzidas foram trocadas por tampão com o uso de filtros de rotação de corte de 10 kDa. As amostras de proteinas foram reduzidas, alciladas, digeridas por tripsina e dessalinizadas. Adicionalmente, uma amostra de referência de plasma (agrupamento de individuos saudáveis) foi etiquetada por 18O e finalmente encravada em cada amostra de coorte (1:1) antes da análise de LC-MRM/MS.
C.2. Tradução de listas de biomarcador em listas de transição de MRM
As listas de transição de MRM preliminares foram geradas por uma série de etapas que incluiram transferir por download sequências de proteina, digerir proteinas em silicio em conjunto com um filtro (por exemplo, 7 a 21 aminoácidos, 0 clivagem perdida) e selecionar um minimo de 4 transições por peptideo (usualmente carga de precursor z2, carga de produto zl). As informações úteis sobre peptideos proteotipicos da literatura e repositórios (PeptideoAtlas, MRMaid) foram também incorporadas e a seleção de transições foi suportadas por bibliotecas espectrais (ISB, NIST, GPM, BiblioSpec). Um software aberto chamado Skyline (MacCoss laboratory, University of Washington, Seattle, WA, EUA) foi usado para 5 gerar e refinar as transições de MRM assim como para analisar dados de transição de MRM.
Uma parte aliquota de 1 ug de digestão de plasma foi carregada diretamente em uma nanocoluna (Dionex C18, PepMap 100, 3 pm) e os peptideos foram eluidos com um 10 gradiente de 100 minutos de 2 a 30% de acetonitrilo (0,1% de ácido fórmico) em um 4000 QTrap equipado com uma fonte de ionização de nanoeletroaspersão. Um máximo de 200 MRMs foram adquiridos por execução com um tempo de contato de 20 milésimos de segundo e um ciclo de 5 segundos. As execuções 15 foram analisadas (isto é, os peptideos sem transições razoáveis foram deletados) e uma lista refinada de peptideos e transições foi submetida a um experimento de MS/MS acionado por MRM para validar a designação de peptideo. Já que a designação de peptideo para proteinas pouco abundantes é uma 20 tarefa bastante desafiadora sem padrões, as definições de varredura de ion de produto (EPI) variaram, por exemplo, a taxa de varredura (1.000 a 4.000), tempo de preenchimento LIT (20 a 300 milésimos de segundo) . As duas transições mais intensas por peptideo foram selecionadas para a validação e 25 foram enviadas para MS/MS (faixa de massa 200 a 1.200) quando uma transição excedeu um limite de 1.000 cps. Em total, 40 MRMs por execução foram usados com um tempo de contato de 20 milésimos de segundo e um ciclo de ~7 segundos. Os dados de MS/MS adquiridos foram pesquisados contra uma base de dados 30 SwissProt atual com filtro de taxonomia humana com o uso de MASCOT. Os peptideos identificados foram comparados com os dados MRM (sequência de peptideo, tempo de retenção). Finalmente, os peptideos validados foram testados para sua adequabilidade para serem usados com o método de etiquetagem por 18O de MRM. A lista de transição final para cada estudo de coorte consistiu em 1 a 2 peptídeos (consulte a Tabela 3) por proteina candidata (consulte a Tabela 1) e 3 transições 5 por peptideo. Se possivel, as sequências de peptideo que não foram exclusivas à proteína candidata e peptídeos com aminoácidos M, W, N-terminal Q ou E, etc. foram excluídas. Tabela 3
Figure img0010
Figure img0011
C.3. Análise instrumental
Todas as amostras foram reconstruídas e encravadas 1: 1 com um plasma de referência etiquetado por 180 (agrupamento de indivíduos saudáveis) antes da análise LC- 5 MRM/MS para corrigir a eficácia de aspersão e diferenças de ionização entre as execuções. Cada amostra foi injetada em duplicata diretamente em urna nanocoluna ( Dionex C18, PepMap 100, 3 μrn) e os peptídeos foram el uídos em um gradiente de 100 minutos de 2 a 30% de acetonitrilo (0,1% de ácido 5 fórmico) em um 4000 QTrap equipado com urna fonte de ionização de nanoeletroaspersão. A opção de MRM programada foi usada para toda aquisição de dados com um tempo de varredura alvo de 4 segundos (pelo menos 8 pontos de dados ao longo de um pico) e urna janela de detecção de MRM de 6 a 8 minutos que 10 resultou em tempos de contato mínimos de 50 a 60 milésimos de segundo.
C.4. Análise de dados
Todas as transições foram integradas e para cada peptideo uma razão (ponderada) da área do peptideo não etiquetado para a área do peptideo etiquetado foi calculada. As razões foram normalizadas para diferenças com base na população com base em um conjunto invariável de proteinas. Finalmente, um teste de Mann-Whitney para dados não paramétricos foi aplicado para as razões normalizadas e um valor p foi calculado que define uma proteina como expressa significantemente de modo diferentes entre dois grupos de indivíduos, por exemplo, saudáveis versus doentes.
A sensibilidade ou taxa positiva verdadeira, versus a taxa positiva falsa (curvas de Característica Operacional Relativa) foram também plotadas para uma faixa de marcadores (univariados e multivariados). Uma quantidade de transformações estatísticas foi usada para melhorar a força incluindo o logaritmo natural (ln), inverso (inv) e raiz quadrada (V).
2. Resultados D. Biomarcadores Dl. Biomarcadores para nefropatia diabética em pacientes diabéticos
A tabela na Figura 1 mostra dados de proteína de biomarcador do Busselton e ambos os Estudos de Diabetes Fremantle em relação à presença da nefropatia diabética em que todos os indivíduos tinham diabetes. A questão que é 5 abordada é 'quais são os biomarcadores para nefropatia diabética em pacientes diabéticos?"
Os resultados da tabela na Figura 1 são ilustrados como plotagens de caixa e fio de bigode na Figura 2 (Estudo FDS1), Figura 3 (Estudo FDS2) e Figura 4 (Estudo BDS). Para 10 cada candidato de biomarcador um a dois peptideos de assinatura por proteína foram medidos por MRM. (plotagem de caixa esquerda: grupo diabético; plotagem de caixa direita: grupo diabético com nefropatia grave; eixo geométrico x: proteína/peptídeo; eixo geométrico y: razão de abundância 15 relativa).
Os dados de ROC nas Tabelas 4 a 8 ilustram adicionalmente que o(s) biomarcador(es) podem ser usados como um diagnóstico para nefropatia diabética. Tabela 4 Análise univariada
Figure img0012
Tabela 5 Análise multivariada (Modelo 3)
Figure img0013
Tabela 6 Análise multivariada (Modelo FDS1)
Figure img0014
Tabela 7 Análise mui _t ivariac a (Modelo FDS2)
Figure img0015
Tabela 8 Análise multivariada (Modelo BDS)
Figure img0016
D2. Biomarcadores para diabéticos com nefropatia versus pacientes saudáveis
A tabela na Figura 5 descreve os biomarcadores descobertos para pacientes com nefropatia diabética versus um 5 grupo de controle saudável sem diabetes. Esses dados são derivados do estudo de Busselton.
Como deveria ser aparentes, várias alterações e formas equivalentes podem ser fornecidas sem se afastarem do espirito ou escopo da presente invenção. Isso inclui 10 modificações dentro do escopo das reivindicações anexas juntamente com todas as modificações, construções alternativas e equivalentes.
No presente relatório descritivo, a presença de recursos particulares não elimina a existência de recursos 15 adicionais. As palavras "compreender", "incluir" e "ter" devem ser interpretadas em um sentido inclusivo ao invés de um exclusivo.

Claims (14)

1. MÉTODO IN VITROPARA AVALIAR UM PACIENTE QUANTO A NEFROPATIA DIABÉTICA, caracterizado por compreender: medir pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente, em que o dito pelo menos um biomarcador é antígeno CD5.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um biomarcador compreender adicionamente um biomarcador selecionado da lista de biomarcadores compreendendo: peroxiredoxina-2, proteína AMBP, complementar Clq subcomponente subunidade B, factorapolipoproteina C-III, proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 3, adiponectina, proteína relacionada com o fator H de complemento de 2, subunidade beta da hemoglobina, a apolipoproteina B-100, sulfidrilo oxidase 1, componente complemento cadeia beta C8 e apolipoproteina A-IV.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um biomarcador compreender um biomarcador selecionado do grupo compreendendo Apolipoproteina A-IV e proteina de ligação de fator de crescimento semelhante a insulina 3.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um biomarcador compreender apolipoproteina A-IV e proteína de ligação de fator de crescimento semelhante a insulina 3.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela etapa de medir pelo menos um biomarcador em uma amostra do paciente compreender a detecção de um fragmento de peptideo do dito pelo menos um biomarcador.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fragmento de peptideo ser um fragmento de peptideo de aminoácido 5-25.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fragmento de peptideo ser selecionado do grupo compreendendo SEQ ID NO's:1- 2 0.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fragmento de peptideo ser selecionado do grupo compreendendo SEQ ID NO'S: 2, 3, 4, 5, 16 and 17.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo dito fragmento de peptideo ser detectado utilizando espectrometria de massas.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo paciente ser assintomático para ou apenas exibir indicadores não específicos de nefropatia diabética.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo paciente ter sido diagnosticado com nefropatia diabética.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo paciente ter doença renal.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo paciente ter microalbuminúria, macroalbuminúria ou doença renal em estágio final.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela amostra compreender uma amostra de sangue.
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