BR112012033213B1 - cassete de expressão, vetor incluindo um construto de arni e método de preparação de uma planta transgênica - Google Patents

Abstract

Plantas com níveis alterados de amido vegetativo São fornecidos vetores para alteração da expressão de uma ou mais enzimas de regulação de amido. São fornecidos métodos de transformação de tecidos de plantas para expressarem elementos que alteram a expressão de uma ou mais enzimas de regulação de amido, e as plantas transgênicas resultantes. São fornecidos métodos de utilização de plantas transgênicas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA EM RELAÇÃO A PEDIDO CORRELATO

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório dos Estados Unidos de número 61/358.720, depositado em 25 de junho de 2010, o qual é aqui incorporado por referência como se completamente apresentado.

AFIRMAÇÃO DE SUPORTE GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita, pelo menos em parte, com suporte governamental sob o prêmio número 2009-10001-05118, concedido pelo U.S. National Institute of Food and Agriculture, USDA. O governo tem certos direitos sobre esta invenção.

CAMPO TÉCNICO

[003] Esta invenção se refere a plantas com níveis alterados de amido vegetativo.

ESTADO DA TÉCNICA

[004] A glicose é uma matéria-prima molecular preferida, entretanto, sua disponibilidade e custo tornaram-se recentemente um fator limitante na demanda por uma matéria-prima para biocombustível barata e ração animal sustentável. A demanda por milho e cana de açúcar aumentou o preço destas commodities de maneira significativa. O amido é uma fonte superior de glicose, por causa de sua estrutura molecular simples (ligações glicosídicas a-1-4 e a-1-6) e da relativa facilidade com que estas ligações são acessadas e hidrolisadas por enzimas baratas e altamente eficazes (por exemplo, a- amilase e glicoamilase). A hidrólise de tecidos vegetais com altos teores em amido, como grãos, fornece glicose relativamente pura, que é transformada efetivamente em carne ou produtos químicos finais.

[005] A sacarose, um carboidrato de armazenamento solúvel, é também uma molécula de matéria-prima derivada de plantas, que é prontamente utilizada por organismos fermentativos. Sistemas de cultivo e de processamento, que usam matérias- primas de sacarose, tais como beterrabas açucareiras e sorgo doce, são limitados por estreitas janelas de colheita e por limitações de armazenamento e de estabilidade. O sorgo doce tem que ser processado similarmente à cana de açúcar, dentro de dias de suas colheita para limitar a fermentação microbiana da sacarose, devido ao elevado teor em umidade nos materiais coletados (deterioração). Períodos de campanha reduzem a efetividade de capital global de facilidades de processamento limitadas.

[006] Substratos de lignocelulose são matérias-primas menos atraentes por causa das dificuldades de processamento. A biomassa de lignocelulose contém uma mistura de hexoses e pentoses e sua recalcitrância à hidrólise (cristalinidade e reticulação em relação à lignina), torna difíceis a digestão e a degradação efetiva quanto aos custos, para formar açúcares úteis. Na produção de biocombustíveis, pré-tratamentos caros estão sendo desenvolvidos para auxiliar na hidrólise completa de materiais lignocelulósicos. A utilização completa das misturas de açúcares resultantes, para produção de combustível e de entes químicos, exige que organismos de fermentação especializados transformem os açúcares resultantes nos produtos finais, tais como etanol, butanol, ácido succínico e outros entes químicos.

SUMÁRIO

[007] Em um aspecto, a invenção se refere a uma planta transgênica compreendendo um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamentodirecionadora do silenciamento (driver sequence) incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador.

[008] Em um aspecto, a invenção se refere a uma planta transgênica derivada a partir de uma planta de cultura de energia, de uma planta de cultura de alimentos ou de uma planta de cultura de forragem, compreendendo um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene, na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento e à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. Quando da expressão da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento, uma seqüência de ARN, transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado, e uma seqüência de ARN, transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado, são capazes de se hibridizarem uma com a outra e de causarem a inibição de expressão do gene.

[009] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de processamento de agricultura ou de preparação de ração animal. O método inclui o fornecimento de uma planta transgênica. A planta transgênica inclui um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos. O construto de ARNi também inclui um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. O método também inclui o processamento da planta transgênica, sendo que a primeira e a segunda seqüências direcionadoras do silenciamentos foram expressas na planta transgênica. A expressão da primeira e da segunda seqüências pode ser antes da etapa de processamento. Em um aspecto, a invenção também se refere a um produto produzido pelo método de processamento de agricultura ou de preparação de ração animal.

[0010] Em um aspecto, a invenção de refere a um método de processamento de agricultura ou de preparação de ração animal. O método inclui o fornecimento de uma planta transgênica derivada a partir de uma planta de cultura de energia, de uma planta de cultura de alimentos ou de uma planta de cultura de forragem. A planta transgênica compreende um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene, na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento e à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. Quando da expressão da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento, uma seqüência de ARN, transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado, e uma seqüência de ARN, transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado, são capazes de se hibridizarem uma com a outra e de causarem a inibição de expressão do gene. O método também inclui o processamento da planta transgênica, sendo que a primeira e a segunda seqüências direcionadoras do silenciamentos foram expressas na planta transgênica. A expressão da primeira e da segunda seqüências direcionadora do silenciamentos pode ser antes da etapa de processamento. Em um aspecto, a invenção também se refere a um produto produzido pelo método de processamento de agricultura ou de preparação de ração animal.

[0011] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de alteração dos níveis de amido vegetativo em uma planta. O método inclui a expressão de um ácido nucléico isolado na planta. A expressão do ácido nucléico isolado na planta altera a atividade de pelo menos uma enzima relacionada ao metabolismo de amido na planta.

[0012] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de alteração dos níveis de amido vegetativo em uma planta. O método inclui a expressão de um ácido nucléico isolado na planta. A expressão do ácido nucléico isolado na planta altera a atividade de pelo menos uma enzima relacionada ao metabolismo de amido na planta. A planta é uma planta transgênica. A planta transgênica inclui um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador.

[0013] Em um aspecto, a invenção de refere a um método de alteração dos níveis de amido vegetativo em uma planta. O método inclui a expressão de um ácido nucléico isolado na planta. A expressão do ácido nucléico isolado na planta altera a atividade de pelo menos uma enzima relacionada ao metabolismo de amido na planta. A planta é uma planta transgênica derivada a partir de uma planta de cultura de energia, de uma planta de cultura de alimentos ou de uma planta de cultura de forragem. A planta transgênica inclui um construto de ARNi. O construto de ARNi compreende uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade, ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado, em relação a uma porção de um gene, na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo uma segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento e à segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. Quando da expressão da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento, uma seqüência de ARN, transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado, e uma seqüência de ARN, transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado, são capazes de se hibridizarem uma com a outra e de causarem a inibição de expressão do gene.

[0014] Em um aspecto, a invenção se refere a um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência apresentando pelo menos 90% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOS: 7 - 8, 11 -18, 21 - 23, 32 - 33, 37, 38 e 39 - 47.

[0015] Em um aspecto, a invenção se refere a um vetor incluindo um construto de ARNi. O construto de ARNi inclui uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene, na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador.

[0016] Em um aspecto, a invenção de refere a um método de preparação de uma planta transgênica. O método inclui a transformação da planta com um vetor. O vetor incluindo um construto de ARNi. O construto de ARNi inclui uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 90% de identidade ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene, na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo, e uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O construto de ARNi também compreende um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento, e um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador.

[0017] Em um aspecto, a invenção se refere a um vetor apresentando uma ácido nucléico isolado com pelo menos 90% de identidade em relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A seguinte descrição detalhada da modalidade preferida da presente invenção será melhor entendida quando lida em conjunto com os desenhos apensos. Para a finalidade de ilustração da invenção, são mostradas, nos desenhos, modalidades que são presentemente preferidas. Contudo, é entendido que a invenção não está limitada às disposições e às instrumentalidades precisas mostradas. Nos desenhos: - As FIGS. 1A-G ilustram estratégias para a expressão de ARNs de interferência nas plantas transgênicas. - A FIG. 2 ilustra um vetor de ARNi intermediário, pAL409. - A FIG. 3 ilustra cassetes de ARNi que se dirigem aos genes GWD, DSP e ISA3 de arroz. - A FIG. 4 ilustra a comparação de seqüências entre uma porção de GWD2 [SEQ ID NO: 9], derivada a partir do gene de glucano-água diquinase de arroz, e uma porção do gene GWD a partir de tomate (Solatium lycopersicon) [SEQ ID NO: 10]. - A FIG. 5 ilustra pAL409j SbGWDko2. - A FIG. 6 ilustra a detecção de homólogos de ISA3 via Southern blot. - A FIG. 7 ilustra o alinhamento de excertos a partir dos genes GWD de arroz (OsGWD)[SEQ ID NOS: 24 e 28], de sorgo (SbGWD)[SEQ ID NOS: 25 e 29], de milho (ZmGWD)[SEQ ID NOS: 26 e 30] e de tomate (S1GWD)[SEQ ID NOS: 27 e 31]. Os iniciadores dgGWup2 [SEQ ID NO: 32] e dgGWdown2 [SEQ ID NO: 33] são também ilustrados. - A FIG. 8 ilustra a comparação do comprimento relativo e do posicionamento de introns dentro do segmento de homologia de núcleo de genes GWD a partir de arroz, sorgo, Arabidopsis e grama de crescimento rápido (switchgrass). - A FIG. 9 ilustra uma imagem de matriz de pontos de alinhamento por BLASTn entre seqüências genômicas de grama de crescimento rápido e arroz para genes de glucano- água diquinase. Eixo horizontal, seqüência de grama de crescimento rápido; Eixo Vertical, seqüência de arroz. Os segmentos diagonais representam regiões, nas quais as duas seqüências são altamente homólogas. - A FIG. 10 ilustra os níveis de GWD mARN entre plantas portando ou pAG2100 ou pAG2101, e as plantas de controle de tipo selvagem (WT). - A FIG. 11 ilustra os níveis de DSP mARN entre plantas portando pAG2102 e os controles WT. - A FIG. 12 ilustra os níveis de ISA3 mARN entre plantas portando pAG2103 e os controles WT. - A FIG. 13 ilustra o amido elevado dentre linhagens selecionadas de arroz e de grama de crescimento rápido, que portam construtos de ARNi. - A FIG. 14 ilustra o teor em amido em linhagens de arroz transgênico, coletadas aproximadamente 19 semanas depois do plantio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[0019] Certa terminologia é usada na descrição seguinte somente por conveniência e não é limitante.

[0020] “Ácido nucléico isolado”, “polinucleotídeo isolado”, “oligonucleotídeo isolado”, “ADN isolado” ou “ARN isolado”, conforme usados aqui, se referem a um ácido nucléico, a um polinucleotídeo, a um oligonucleotídeo, a um ADN ou a um ARN separados do organismo a partir do qual eles se originam ou a partir do genoma, da localização ou das moléculas, que ocorrem naturalmente, com os quais eles estão normalmente associados, ou são um ácido nucléico que foi feito através de um processo sintético.

[0021] “Proteína isolada”, “polipeptídeo isolado", “oligopeptídeo isolado" ou “peptídeo isolado”, conforme usados aqui, se referem a uma proteína, a um polipeptídeo, a um oligopeptídeo ou a um peptídeo separados do organismo a partir do qual eles se originam ou a partir do local em que ocorram naturalmente, ou a moléculas com as quais eles estejam normalmente associados.

[0022] Conforme usado aqui, “variante” se refere a uma molécula que retém uma atividade biológica que seja a mesma ou substancialmente similar àquela da seqüência original. A variante pode ser da mesma espécie ou de espécie diferente ou ser uma seqüência sintética com base em uma molécula natural ou anterior.

[0023] Ácidos nucléicos, seqüências de nucleotídeos, proteínas ou seqüências de aminoácidos, aos quais se refere aqui, podem ser isolados, purificados, sintetizados quimicamente ou produzidos através de tecnologia de ADN recombinante. Todos esses métodos são bem conhecidos na técnica.

[0024] Conforme usado aqui, “ligado operavelmente” se refere à associação de duas ou mais biomoléculas em uma configuração relativa entre si, tal que a função normal das biomoléculas possa ser realizada. Em relação a seqüências de nucleotídeos, “operavelmente ligado” se refere à associação de duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos em uma configuração relativa entre si, tal que a função normal das seqüências possa ser realizada. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeos que codifica uma pré- seqüência ou líder secretório está ligada operavelmente a uma seqüência de nucleotídeos para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou um intensificador está ligado operavelmente a uma seqüência de codificação se ele afetar a transcrição da seqüência de codificação; e um sítio de ligação de ribossoma a ácido nucléico está ligado operavelmente a uma seqüência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a ligação do ribossoma ao ácido nucléico.

[0025] As palavras “um(a)” e “uns(umas)”, conforme usadas nas reivindicações e nas porções correspondentes do relatório descritivo, são definidas como incluindo um ou mais do item referenciado, a menos se especificamente afirmado de outra maneira. Essa terminologia inclui as palavras mencionadas especificamente acima, derivados das mesmas e palavras de importância similar. A expressão “pelo menos um(a)” seguida por uma lista de dois ou mais itens, tais como “A, B ou C”, significa qualquer um individualmente de A, B ou C, assim como qualquer combinação dos mesmos.

[0026] A Listagem de Seqüências, intitulada “Listagem de Seqüências”, apresentando um tamanho de arquivo de cerca de 219.033 bytes e depositado com este pedido, é aqui incorporada por referência como se fosse completamente apresentada.

[0027] Uma modalidade fornece um método para alteração na quantidade de amido que se acumula em tecidos vegetativos de plantas, por inibição da atividade de enzimas que são normalmente responsáveis pela mobilização de amido vegetativo (ao qual se refere, nas partes que se seguem, como “Amido Verde” ou “amido vegetativo") durantes os ciclos de dia/noite. Ácidos nucléicos isolados são fornecidos para alteração na quantidade de amido que se acumula em tecidos vegetativos de plantas, por inibição da atividade de enzimas que são normalmente responsáveis ela mobilização de Amido Verde. São fornecidas plantas transgênicas, que incluem ácidos nucléicos para alteração na quantidade de amido que se acumula em tecidos vegetativos de plantas, por inibição da atividade de enzimas que são normalmente responsáveis ela mobilização de Amido Verde. Qualquer planta pode ser fornecida como a planta transgênica. Em uma modalidade, arroz, grama de crescimento rápido, sorgo ou outras culturas de energia ou de forragem são fornecidas como a planta transgênica.

[0028] Em uma modalidade, são fornecidas aplicações para ração animal incluindo níveis aumentados de amido em tecidos vegetativos. Açúcares facilmente fermentáveis, em um processo de fermentação, podem ser fornecidos por modalidades aqui. A produção de biocombustíveis pode ser intensificada pelo fornecimento de açúcares facilmente fermentáveis. Métodos de fornecimento de açúcares facilmente fermentáveis e métodos de intensificação da produção de biocombustíveis são fornecidos como modalidades aqui.

[0029] Culturas com elevados níveis de amido vegetativo apresentam uma variedade de aplicações e de utilidades. Em uma modalidade, é fornecida biomassa a partir de plantas que acumulam níveis elevados de amido vegetativo em relação às plantas de tipo selvagem. Essas plantas podem apresentar valor agregado como matérias-primas para processos de fermentação ou para aplicações em rações animais. Por exemplo, em um processo celulósico típico, polissacarídeos, tais como celulose e hemiceluloses, que estão presentes na biomassa, são hidrolisados para formar açúcares simples, os quais podem, então, ser fermentados por micro-organismos, para formar etanol, butanol, isobutanol, ácidos graxos ou outros hidrocarbonetos. Por causa da recalcitrância da biomassa, a liberação dos açúcares simples a partir de polímeros, tais como celulose e hemiceluloses, freqüentemente exige ou uso de condições drásticas de pré-tratamento e hidrólise com misturas de enzimas relativamente caras. Em contraste, qualquer amido que esteja presente na biomassa representa uma fonte adicional de açúcares simples (a saber, glicose), que pode ser liberada muito facilmente e de maneira muito menos cara, seja com tratamentos com ácido diluído, seja com hidrólise por amilases, as quais estão correntemente disponíveis e são muito menos caras do que as enzimas necessárias para a digestão de celulose e de hemiceluloses. Como um resultado, um aumento na quantidade de amido presente na biomassa aumentará, simultaneamente, a quantidade de açúcar fermentável que pode ser recuperada (e, portanto, a quantidade de etanol, butanol, etc., que pode ser feita) com somente um aumento desproporcionalmente pequeno nos custos de processo (isto é, adição de uma amilase barata ou de pré-tratamento com ácido). Similarmente, a biomassa que contenha níveis elevados de amido pode apresentar maior valor em aplicações como forragem, nas quais o material vegetal é fornecido ao gado. Novamente, o excesso de amido presente nesse material é mais facilmente digerido pela maioria dos animais, do que o é o material celulósico, fornecendo mais energia por unidade de biomassa do que o faz a biomassa com níveis ordinários de amido. Modalidades incluem a utilização de uma planta transgênica, conforme apresentada aqui, para qualquer um desses métodos.

[0030] Os métodos aqui, incluindo aqueles no parágrafo anterior, podem incluir a modificação de plantas para criar plantas transgênicas, o cultivo das plantas transgênicas, a colheita das plantas e ainda o processamento delas para aplicações como ração animal como aquele que seria para outras culturas de forragem, ou secá-las e tratá-las para uso em processos de fermentação, similarmente à maneira de tratamento que é usada em processos celulósicos, mas com a adição de um tratamento, tal como hidrólise com ácido ou digestão com amilase para hidrolisar o amido para formar seus açúcares componentes. Qualquer uma etapa, conjunto de etapas ou todas as etapas apresentadas nesses parágrafos podem ser fornecidas em um método aqui.

[0031] Genes para se atingir a alteração de Amido Verde foram identificados. Qualquer enzima, proteína ou ácido nucléico envolvido no metabolismo de amido pode ser direcionado para a alteração dos níveis de Amido Verde. Em uma modalidade, a alteração é realizada por supressão da expressão de genes de genes relacionados ao Amido Verde. Em uma modalidade, a alteração é um aumento na quantidade de Amido Verde. Enzimas particulares que podem ser alvos incluem, mas não estão limitadas a Glucano-água Diquinase (também conhecida como GWD, R1, sex1); Fosfoglucano-água Diquinase (também conhecida como PWD); Proteína Fosfatase de Dupla Especificidade (também conhecida como DSP, sex4); β-amilase (BAM), isoamilase (também conhecida como ISA3), dextrinases limite (também conhecida como LDA); enzima de desproporcionamento; e outras enzimas desramificantes. GWD fosforila amido, que é, então, suscetível a enzimas que degradam amido. PWD fosforila amido, e pode ser dependente quando de ação anterior por GWD por epistase. DSP é reguladora, e pode ativar enzimas que degradam amido. DSP também pode fosforila amido. Além disso, suspeita-se que DSP tenha atividade de endo-amilase, que pode ser sinergística com mobilização de amido por β- amilase e isoamilase. BAM (mas não ct-amilase) e IS A3 estão envolvidas na mobilização de amido vegetativo. A atividade de BAM depende de GWD, e a atividade de ISA3 depende de BAM.

[0032] Em uma modalidade, os alvos são suprimidos e a supressão pode ser conseguida através de supressão de ARNi de expressão de gene. Construtos de ARNi são fornecidos para suprimir a expressão de genes de proteínas alvo. As proteínas alvo podem ser enzimas. A enzima alvo pode ser selecionada a partir de enzimas envolvidas na mobilização de Amido Verde. São fornecidos construtos de ARNi que suprimem pelo menos uma de GWD, PWD, DSP, BAM, isoamilase, LDA, enzima de desproprocionamento e outras enzimas desramificantes.

[0033] Inúmeras estratégias têm sido desenvolvidas para expressão de ARNi em plantas transgênicas. Ver, por exemplo, Horiguchi G., RNA silencing in plants: a shortcut to functional analysis (2004) Differentiation 72(2-3): 65-73, o qual é aqui incorporado por referência como se fosse completamente apresentado. Ver, também, Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM, Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs (2000) Nature 407:319-20; Stoutjesdijk PA, Singh SP, Liu Q, Hurlstone CJ, Waterhouse PA, Green AG, hpRN A- mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing (2002) Plant Physiol. 129(4): 1723-31, os quais são aqui incorporados por referência como se fossem completamente apresentados. Referindo-se às FIGS. 1A - G, são ilustradas estratégias representativas para ARNi. Modalidades aqui incluem construtos de ARNi, métodos e plantas transgênicas que implementem a estratégia de ARNi. Os promotores 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 e 108 podem permitir a transcrição de ácido nucléico nos construtos. A estratégia mostrada na FIG. 1E inclui um promotor 109 que responde a XVE, e a estratégia na FIG. 1D inclui fragmentos de promotor 110e111.Os terminadores 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 e 131 são também ilustrados, como são as seqüências transcritas de terminador 122a e 123a. Os espaçadores 132, 133 e 134 são ilustrados para estratégias nas FIGS. 1A, 1C e 1D, e os espaçadores transcritos 132a e 132b são ilustrados nas FIGS. 1A e 1C. Os introns 140, 141 e 142 e o íntron transcrito 140a são ilustrados nas FIGS. 1B, 1E e 1F. São mostrados os fragmentos de cADN 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,160 e 161, assim como os cADNs transcritos 150a, 151a, 152a, 153a, 154a, e a fita de dsARN 154a'. Nas FIGS. 1E e 1F, são ilustrados os sítios de loxP 170, 171 e 172. As modalidades incluem métodos utilizando ARNs motores separados por um espaçador de íntron conforme ilustrado na FIG. 1B, e os construtos de ARNi, vetores, vetores intermediários, vetores de transformação, iniciadores e plantas transgênicas para implementação da estratégia da FIG. 1B. No entanto, as modalidades aqui não estão limitadas à estratégia ilustrada na FIG. 1B.

[0034] Em uma modalidades, são fornecidos ácidos nucléicos isolados apresentando uma seqüência conforme apresentada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados aqui ou os complementos dos mesmos. Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos isolados apresentando uma seqüência que se hibridiza com um ácido nucléico apresentando a seqüência de qualquer ácido listado aqui ou do complemento dos mesmos. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de baixo rigor. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de moderado rigor. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de elevado rigor. Exemplos de protocolos de hibridização e de métodos para otimização de protocolos de hibridização são descritos nos seguintes livros: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, e J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000, os quais são aqui incorporados por referência, em suas totalidades, como se fossem completamente apresentados. Por meio de exemplo, mas não de limitação, os procedimentos para condições de hibridização de moderado rigor são como se seguem: filtros contendo ADN são previamente tratados, durante 2-4 horas, à 68°C, em uma solução contendo 6X SSC (Amresco, Inc., Solon, OH), SDS 0,5% (Amersco, Inc., Solon, OH), 5X Solução de Denhardt (Amersco, Inc., Solon, OH) e 100 pg/mL de ADN de salmão desnaturado (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). Aproximadamente 0,2 mL de solução de pré-tratamento são usados por centímetro quadrado de membrana usada. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: EDTA 0,01 M (Amersco, Inc., Solon, OH), 100 pg/mL de ADN de esperma de salmão, e 5-20 x 106 cpm de sondas marcadas de maneira fluorescente ou com 32P podem ser usados. Os filtros são incubados na mistura de hibridização durante 16-20 horas, à 68°C e, então, lavados durante 15 minutos à temperatura ambiente (dentro de cinco graus de 25°C) em uma solução contendo 2X SSC e SDS 0,1%, com agitação suave. Os filtros são tingidos a seco e expostos para revelação em um formador de imagens ou por autorradiografia. Se necessário, os filtros são lavados por uma terceira vez e expostos novamente para revelação. Por meio de exemplo, mas não de limitação, baixo rigor se refere às condições de hibridização que empregam baixa temperatura para hibridização, por exemplo, temperaturas entre 37°C e 60°C. Por meio de exemplo, mas não de limitação, elevado rigor se refere às condições de hibridização conforme apresentadas acima, mas com modificação para empregar elevadas temperaturas, por exemplo, temperaturas de hibridização acima de 68°C.

[0035] Em uma modalidade, são fornecidos os ácidos nucléicos isolados apresentando uma seqüência que apresenta pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade ao longo de seu comprimento em relação a uma porção contígua de um ácido nucléico apresentando qualquer uma das seqüências mostradas aqui ou os complementos das mesmas. A porção contígua pode ser o comprimento inteiro de uma seqüência mostrada aqui ou o complemento da mesma. A identidade pode ser medida pelo algoritmo de Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), “Identification of Common Molecular Subsequences”, Journal of Molecular Biology 147: 195-197, o qual é aqui incorporado por referência como se fosse completamente apresentado).

[0036] Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos isolados, apresentando uma porção da seqüência conforme mostrada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados aqui ou o complemento dos mesmos. Esses ácidos nucléicos, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos isolados não estão limitados a, mas podem apresentar, um comprimento na faixa de 10 ao comprimento completo, 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15 ou 20 a 30 nucleotídeos ou 10, 15, 20 ou 25 nucleotideos. Um ácido nucléico, polinucleotídeo ou oligonucleotídeo isolados, apresentando um comprimento dentro de uma das faixas acima, pode apresentar qualquer comprimento específico dentro da faixa mencionada, inclusive os pontos finais. O comprimento dos nucleotídeos mencionados pode começar em qualquer única posição dentro de uma seqüência de referência (isto é, qualquer um dos ácidos nucléicos aqui), onde nucleotídeos suficientes seguem a posição única para acomodar o comprimento mencionado. Em uma modalidade, uma sonda ou iniciador de hibridização é 85 a 100%, 90 a 100%, 91 a 100%, 92 a 100%, 93 a 100%, 94 a 100%, 95 a 100%, 96 a 100%, 97 a 100%, 98 a 100%, 99 a 100%, ou 100% complementar em relação a um ácido nucléico com o mesmo comprimento que a sonda ou o iniciador e apresentando uma seqüência escolhida a partir de um comprimento de nucleotídeos correspondendo ao comprimento da sonda ou do iniciador dentro de uma porção de uma seqüência, conforme mostrada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados aqui. Em uma modalidade, uma sonda ou iniciador de hibridização se hibridiza ao longo de seu comprimento a um comprimento correspondente de um ácido nucléico apresentando a seqüência conforme mostrada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados aqui. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de baixo rigor. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de moderado rigor. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de elevado rigor.

[0037] Qualquer um dos ácidos nucléicos isolados aqui pode ser fornecido em um kit. O kit pode ser usado para preparar um construto de ARNi, produzir plantas transgênicas, testar uma planta para a presença de um gene de interesse, testar uma planta em relação à presença de um construto de ARNi conforme descrito aqui, ou qualquer outro método ou finalidade aqui descritos. Um kit pode incluir um ou mais vetores aqui ou um ou mais sondas ou iniciadores.

[0038] Em uma modalidade, é fornecida uma planta transgênica. A planta transgênica pode ser derivada a partir de qualquer planta. A planta transgênica pode ser derivada a partir de uma planta de cultura de energia, de uma planta de cultura de forragem ou de uma planta de cultura de forragem. A planta de cultura de energia pode ser, mas não está limitada a, uma planta de milho, uma planta de grama de crescimento rápido, uma planta de choupo ou uma planta de miscanthus. A planta de cultura de forragem pode ser, mas não está limitada a, uma planta de sorgo. A planta de cultura de alimento pode ser, mas não está limitada a, uma planta de milho ou uma planta de tomate. A planta transgênica pode incluir um construto de ARNi. A planta pode incluir uma planta de arroz, uma planta de grama de crescimento rápido, uma planta de sorgo, uma planta de milho ou uma planta de tomate.

[0039] O construto de ARNi pode ser projetado para implementar qualquer estratégia de ARNi, incluindo, mas não limitada a, aquela ilustrada na FIG. 1A - G. Um construto de ARNi pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência correspondendo a uma porção de um gene na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode incluir um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade ao longo do comprimento do ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene na planta transgênica, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo. O comprimento do primeiro ácido nucléico pode ser qualquer comprimento adequado para fornecer um efeito de ARNi. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições in situ em uma planta transgênica. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de baixo rigor. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de moderado rigor. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de elevado rigor. A segunda seqüência de ácidos nucléicos pode ser um complemento invertido da primeira seqüência de ácidos nucléicos. O construto de ARNi também pode incluir um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento. Um espaçador ligado operavelmente pode fornecer uma conexão entre os primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados, tal que as seqüências de ARN transcritas a partir dos primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados podem se hibridizar uma com a outra. Um espaçador ligado operavelmente pode ser um íntron. O íntron pode unir a primeira e a segunda seqüências. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode estar à montante do e ser contígua ao espaçador. O espaçador pode estar à montante da e ser contígua à segunda seqüência direcionadora do silenciamento. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode estar à montante do e ser contígua ao espaçador, e o espaçador pode estar à montante da e ser contígua à segunda seqüência direcionadora do silenciamento. O construto de ARNi também pode incluir um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. O promotor ligado operavelmente pode permitir a transcrição da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento. O promotor ligado operavelmente pode ser qualquer tipo de promotor. O promotor ligado operavelmente pode ser um promotor induzível. O promotor ligado operavelmente pode ser um promotor constitutivo. Pode-se referir à transcrição da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento como expressão das seqüências direcionadora do silenciamentos e do espaçador. Quando da expressão da primeira seqüência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda seqüência direcionadora do silenciamento, a seqüência de ARN transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado e a seqüência de ARN transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado podem ser capazes de se hibridizarem uma com a outra, Os transcritos de ARN hibridizados das primeira e segunda seqüências direcionadoras do silenciamento podem ser capazes de inibirem a expressão do gene. Uma planta transgênica pode incluir mais do que um tipo de construto de ARNi. Cada tipo diferente de construto de ARNi pode ser dirigido para inibir um gene diferente, que expresse uma proteína alvo diferente.

[0040] O construto de ARNi pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode incluir uma primeira seqüência de ácidos nucléicos que apresenta qualquer seqüência adequada para afetar o ARNi de um gene que codifique uma proteína alvo. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode incluir um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45. A identidade pode ser medida ao longo do comprimento do primeiro ácido nucléico isolado. O comprimento do primeiro ácido nucléico isolado pode ser igual ao comprimento da seqüência de referência. O construto de ARNi pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou o complemento das mesmas, sob condições de baixo rigor. O construto de ARNi pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou o complemento das mesmas, sob condições de moderado rigor. O construto de ARNi pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou o complemento das mesmas, sob condições de elevado rigor. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento apresentando um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições in situ na planta transgênica. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento apresentando um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de baixo rigor. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento apresentando um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de moderado rigor. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento apresentando um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência de ácidos nucléicos sob condições de elevado rigor. O construto de ARNi pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação ao complemento de uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45. A identidade pode ser medida ao longo do comprimento do complemento da seqüência de referência. O comprimento do segundo ácido nucléico pode ser igual ao comprimento do complemento da seqüência de referência.

[0041] O espaçador pode ser qualquer seqüência. O espaçador pode ser um íntron. O íntron pode ser um íntron. O íntron pode ser o OsUbiintron. A seqüência do OsUbiintron pode ser encontrada com referência à FIG. 2, que ilustra pAL409 com o OsUbiintron entre as posições 4519 - 566. A seqüência de pAL409 é dada abaixa e na SEQ ID NO: 13. A numeração de nucleotídeos na SEQ ID NO: 13 pode variar daquela marcada na FIG. 2, mas a comparação de seqüências de seqüências de marco (por exemplo, sítios de restrição) entre a FIG. 2 e a SEQ ID NO: 13 permite a identificação de qualquer seqüência específica de uma característica de pAL409. O íntron pode apresentar uma seqüência que tenha pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação ao OsUbiintron. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou com um complemento do mesmo sob condições de baixo rigor. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou com um complemento do mesmo sob condições de moderado rigor. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou com um complemento do mesmo sob condições de elevado rigor.

[0042] O promotor pode ser qualquer promotor. O promotor pode ser um promotor induzível. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são um promotor induzível por álcool, um promotor induzível por tetraciclina, um promotor induzível por esteróide ou um promotor induzível por hormônio. O promotor pode ser um promotor constitutivo. O promotor pode estar ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. O promotor pode ser o promotor P-OsUbi. A seqüência do promotor P-OsUbi pode ser encontrada com referência à FIG. 2, que ilustra pAL409 com o promotor P-OsUbi entre as posições 3574 - 4507. A seqüência de pAL409 é dada abaixo e em SEQ ID NO: 13. A numeração de nucleotídeos em SEQ ID NO: 13 pode variar daquela marcada na FIG. 2, mas comparação de seqüências de marco (por exemplo, sítios de restrição) entre a FIG. 2 e SEQ ID NO: 13 permite a identificação de qualquer seqüências específica de uma característica de pAL409. O promotor pode incluir uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação ao promotor P-OsUbi. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou ao complemento do mesmo sob condições de baixo rigor. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou ao complemento do mesmo sob condições de moderado rigor. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou ao complemento do mesmo sob condições de elevado rigor.

[0043] A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando qualquer seqüência para afetar o ARNi de um gene que codifica uma proteína alvo. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que seja capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que seja capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que seja capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de elevado rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando qualquer seqüência adequada para afetar o ARNi de um gene que codifica uma proteína alvo. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento sob condições in situ em uma planta transgênica. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou ao complemento da mesma sob condições de baixo rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou ao complemento da mesma sob condições de moderado rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou ao complemento da mesma sob condições de elevado rigor.

[0044] A proteína alvo pode ser qualquer proteína envolvida com a regulação de Amido Verde. Por exemplo, a proteína alvo pode ser uma de Glucano-água Diquinase, Fosfoglucano-água Diquinase, Proteína Fosfatase de Dupla Especificidade, β-amilase, isoamilase, dextrinase limite, enzima de desproporcionamento ou uma enzima desramificante. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de elevado rigor.

[0045] Uma planta transgênica pode ser construída por qualquer método de transformação. Por exemplo, pode ser utilizada transformação biolística. A transformação pode ser feita com qualquer vetor adequado incluindo ou consistindo em qualquer um ou mais construtos de ARNi aqui. Transformação mediada por Agrobacterium pode ser utilizada. A transformação mediada por Agrobacterium pode utilizar qualquer vetor de transformação adequado abrigando qualquer um ou mais construtos de ARNi aqui. A transformação mediada por Agrobacterium pode ser feita com um vetor apresentando uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 47.

[0046] Qualquer planta transgênica aqui pode ser fornecida em um método de processamento de agricultura ou em aplicações de ração animal. A planta transgênica pode incluir qualquer um ou mais construtos de ARNi aqui descritos. Uma etapa de fornecimento da planta transgênica pode incluir a sua obtenção de outra parte que a produziu. Uma etapa de fornecimento pode incluir a preparação da planta. Um método de processamento de agricultura ou aplicações de ração animal podem incluir o processamento da planta transgênica. Seqüências direcionadoras do silenciamento, em um construto de ARNi na planta transgênica, podem ser expressas em qualquer ponto no método. Seqüências direcionadoras do silenciamento, em um construto de ARNi na planta transgênica, podem ser expressas antes da etapa de processamento da planta. Seqüências direcionadoras do silenciamento, em um construto de ARNi na planta transgênica, podem ser expressas durante a etapa de processamento da planta. A expressão pode ser induzida. O processamento de agricultura pode incluir a utilização de matéria-prima engenheirada com elevados níveis de amido. A material-prima pode incluir qualquer planta transgênica aqui, isoladamente ou em combinação com outros componentes. O outro componente pode incluir outro material de planta. O processamento de agricultura é a manipulação ou a conversão de qualquer matéria-prima de agricultura para um produto ou uso particulares. O processamento de agricultura incluiria, mas não está limitado a, pelo menos uma das operações de coleta, formação de fardos, ralação, moagem, corte, redução de tamanho, esmagamento, peletização, extração de um componente a partir de um componente a partir da matéria-prima, purificação de um componente ou porção da matéria-prima, extração ou purificação de amido, hidrólise de polissacarídeos em oligossacarídeos ou monossacarídeos, ensilamento, fermentação, conversão química catálise química da matéria-prima.

[0047] Uma modalidade inclui um método de alteração dos níveis de amido vegetativo em uma planta. O método pode incluir a expressão de um ácido nucléico isolado na planta. A expressão do ácido nucléico isolado na planta pode alterar a atividade de pelo menos uma enzima relacionada ao metabolismo de amido na planta. A planta pode ser qualquer planta transgênica aqui. A planta transgênica pode incluir um ou mais construtos de ARNi aqui descritos.

[0048] Uma modalidade fornece um ácido nucléico isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a qualquer uma de SEQ ID NOS: 7 - 8, 11 - 18, 21 - 23, 32 - 33, 37, 38 e 39 - 47. Uma modalidade fornece um ácido nucléico isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência que se hibridiza com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 7-8, 11 - 18, 21 - 23, 32 - 33, 37, 38 e 39 - 47 ou o complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. Uma modalidade fornece um ácido nucléico isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência que se hibridiza com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 7-8, 11 - 18, 21 - 23, 32 - 33, 37, 38 e 39 - 47 ou o complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. Uma modalidade fornece um ácido nucléico isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência que se hibridiza com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 7-8, 11 - 18, 21 - 23, 32 - 33, 37, 38 e 39 - 47 ou o complemento das mesmas sob condições de elevado rigor.

[0049] Uma modalidade inclui um vetor apresentando qualquer construto de ARNi aqui. O vetor pode ser um vetor intermediário. O vetor pode ser um vetor de transformação. O construto de ARNi no vetor pode apresentar uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade ao longo do comprimento do primeiro ácido nucléico isolado em relação a uma porção de um gene em uma planta, que codifica uma proteína alvo envolvida na mobilização de amido vegetativo. O construto de ARNi no vetor também pode incluir uma segunda seqüência direcionadora do silenciamento incluindo um segundo ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado sob condições in situ em uma planta, na qual o vetor possa ser transformado. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado sob condições de baixo rigor. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado sob condições de moderado rigor. O segundo ácido nucléico isolado pode ser capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado sob condições de elevado rigor. O construto de ARNi no vetor também pode incluir um espaçador ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento e à segunda seqüência direcionadora do silenciamento. O espaçador pode estar entre a primeira seqüência direcionadora do silenciamento e a segunda seqüência direcionadora do silenciamento. O construto de ARNi no vetor também pode incluir um promotor ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador.

[0050] Um vetor aqui pode ser configurado para expressão em um hospedeiro apresentando o gene dirigido pelo construto de ARNi. Quando da expressão em um hospedeiro apresentando o gene dirigido pelo construto de ARNi. Quando da expressão, uma seqüência de ARN, transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado, e uma seqüência de ARN, transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado, pode ser capaz de se hibridizarem uma com a outra e de causarem a inibição de expressão do gene no hospedeiro.

[0051] O vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento com um primeiro ácido nucléico isolado apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45. Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento com um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou um complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento com um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou um complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento com um primeiro ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 ou um complemento das mesmas sob condições de elevado rigor. Conforme mostrado acima, o segundo ácido nucléico isolado, em qualquer vetor descrito neste parágrafo, pode ser configurado para ser capaz de se hibridizar com o primeiro ácido nucléico isolado. A hibridização dos primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados pode ser sob condições in situ encontradas em uma planta, em que o vetor possa ser transformado. A hibridização dos primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados pode ser sob condições de baixo rigor. A hibridização dos primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados pode ser sob condições de moderado rigor. A hibridização dos primeiro e segundo ácidos nucléicos isolados pode ser sob condições de elevado rigor. O segundo ácido nucléico isolado pode ser um complemento invertido do primeiro ácido nucléico isolado.

[0052] O espaçador em um vetor aqui pode ser qualquer seqüência. O espaçador pode ser um íntron. O íntron pode ser qualquer íntron. O íntron pode ser o OsUbiintron. A seqüência do OsUbiintron pode ser encontrado com referência à FIG. 2, que ilustra pAL409 com o OsUbiintron entre as posições 4519 - 566. A seqüência de pAL409 é dada abaixo e em SEQ ID NO: 13. A numeração dos nucleotídeos em SEQ ID NO: 13 pode variar daquela marcada em FIG. 2, mas a comparação de seqüências de marco (por exemplo, sítios de restrição) entre a FIG. 2 e a SEQ ID NO: 13 permite a identificação de qualquer seqüência específica de uma característica de pAL409. O íntron pode apresentar uma seqüência que apresente pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a OsUbiintron. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou um complemento do mesmos sob condições de baixo rigor. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou um complemento do mesmos sob condições de moderado rigor. O íntron pode apresentar uma seqüência que se hibridize com o OsUbiintron ou um complemento do mesmos sob condições de elevado rigor.

[0053] O promotor em um vetor pode ser qualquer promotor. O promotor pode ser qualquer promotor induzível. O promotor pode ser um promotor constitutivo. O promotor pode ser ligado operavelmente à primeira seqüência direcionadora do silenciamento, à segunda seqüência direcionadora do silenciamento e ao espaçador. O promotor pode ser o promotor P-OsUbi. A seqüência do promotor P-OsUbi pode ser encontrada com referência à FIG. 2, a qual ilustra pAL409 com o promotor P-OsUbi entre as posições 3574 - 4507. A seqüência de pAL409 é dada abaixo e em SEQ ID NO: 13. A numeração de nucleotídeos em SEQ ID NO: 13 pode variar daquela marcada na FIG. 2, mas a comparação de seqüências de marco (por exemplo, sítios de restrição) entre a FIG. 2 e a SEQ ID NO: 13 permite a identificação de qualquer seqüência específica de uma característica de pAL409. O promotor pode incluir uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação ao P-OsUbi. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou o complemento do mesmo sob condições de baixo rigor. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou o complemento do mesmo sob condições de moderado rigor. O promotor pode incluir uma seqüência que se hibridize com o promotor P-OsUbi ou o complemento do mesmo sob condições de elevado rigor.

[0054] A primeira seqüência direcionadora do silenciamento em um vetor aqui pode ser um ácido nucléico isolado apresentando qualquer seqüência adequada para afetar o ARNi de um gene que codifica uma proteína alvo. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que é capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que é capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. A primeira seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando uma seqüência que é capaz de se hibridizar com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 37 ou o complemento das mesmas sob condições de elevado rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado apresentando qualquer seqüência adequada para afetar o ARNi de um gene que codifica uma proteína alvo. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento sob condições in situ em uma planta transgênica. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou o complemento da mesma sob condições de baixo rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou o complemento da mesma sob condições de moderado rigor. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento pode ser um ácido nucléico isolado capaz de se hibridizar com a primeira seqüência direcionadora do silenciamento ou o complemento da mesma sob condições de elevado rigor.

[0055] A proteína alvo que é o alvo de um construto de ARNi em um vetor aqui pode ser qualquer proteína envolvida com a regulação de Amido Verde. Por exemplo, a proteína alvo pode ser uma de Glucano-água iquinase, Fosfoglucano-água Diquinase, Proteína Fosfatase com Dupla Especificidade, β-amilase, isoamilase, dextrinase limite, enzima de desproporcionamento ou uma enzima desramificante. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência com pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente na ou consistindo na seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de baixo rigor. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de moderado rigor. O gene que codifica a proteína alvo pode apresentar uma seqüência que se hibridize com um ácido nucléico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 43 ou o complemento das mesmas sob condições de elevado rigor.

[0056] Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento à montante do e contíguo ao espaçador. Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento à montante da e contígua à segunda seqüência direcionadora do silenciamento. Um vetor aqui pode incluir uma primeira seqüência direcionadora do silenciamento à montante do e contígua ao espaçador, e o espaçador à montante da e contíguo à segunda seqüência direcionadora do silenciamento.

[0057] Um vetor aqui pode apresentar uma seqüência compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 47.

[0058] Um vetor aqui pode apresentar uma seqüência compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma seqüência apresentando pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma seqüência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14.

[0059] Uma modalidade fornece um método de preparação de uma planta transgênica. O método inclui a transformação de uma planta com qualquer um ou mais vetores aqui. A planta pode ser qualquer tipo de planta. A planta pode ser uma planta de cultura de energia, uma planta de cultura de alimento ou uma planta de cultura de forragem. A planta pode ser uma planta de arroz, uma planta de crescimento rápido, uma planta de sorgo, uma planta de milho ou uma planta de tomate.

[0060] Modalidades adicionais incluem aquelas formadas por leitura de qualquer reivindicação dependente no quadro reivindicatório abaixo, como sendo dependente de qualquer uma ou mais reivindicações precedentes até e incluindo a sua reivindicação independente de base.

[0061] Modalidades adicionais aqui incluem aquelas que podem ser formadas por suplementação de qualquer uma modalidade com um ou mais elementos a partir de uma ou mais outras modalidades aqui.

Exemplos - Os seguintes exemplos não limitantes são fornecidos para ilustrar modalidades particulares. As modalidades completas podem ser suplementadas com um ou mais detalhes a partir de qualquer um ou mais exemplos abaixo. Exemplo 1:

[0062] Bibliotecas de inserção de T-ADN a partir de diferentes organismos podem ser pesquisadas para localizar genes naqueles organismos relacionados com a regulação de amido. Com base na localização de tais genes, uma busca pode ser realizada para se encontrar genes similares em uma planta de interesse. Os genes de interesse podem ser usados em construtos aqui para afetar a alteração na regulação de amido.

[0063] Inúmeros outros métodos têm sido desenvolvidos para gerar ou identificar alelos nulos entre os genes. Dentre esses, estão TILLING (Till BJ, Cooper J, Tai TH, CoIowit P, Greene EA, Henikoff S, Cornai L, Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING (2007) BMC Plant Biol. 7:19), e o mapeamento de genes com retrotransposons Tos17 ou transposons Ac e Ds/sSpm de milho engenheirado (Zea mays) (Krishnan A, Guiderdoni E, An G, Hsing Yl, Han CD, Lee MC, Yu SM, Upadhyaya N, Ramachandran S, Zhang Q, Sundaresan V, Hirochika H, Leung H, Pereira A. 2009. Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses. Plant Physiol. 149:165-70 e referências neles), os quais são aqui incorporados por referência como se fossem completamente apresentados. Esses métodos podem ser usados para gerar ou identificar alelos nulos entre os genes relacionados com a regulação de amido.

Exemplo 2:

[0064] Um exemplo de um vetor de ARNi intermediário é pAL409, o qual está ilustrado na FIG. 2. Conforme mostrado na FIG. 2, cópias invertidas de segmentos a partir de uma região transcrita de um gene a se ter por alvo podem ser introduzidas em pAL409 no sítio 220 de Avrll 220 (posição 4507) e no sítio 210 de BspEI (posição 4519), e novamente no sítio 295 de Agel (posição 566) e no sítio 290 de Nhel (posição 620). Quando transcritas a partir do promotor de ubiquitina de arroz 230 (P-OsUbi3), as cópias invertidas dos segmentos (as seqüências direcionadoras do silenciamento) permitem que o ARN resultante forme um grampo de cabelo, no qual o íntron 200 de OsUbi3 serve como um espaçador entre os elementos repetidos. Um sinal de poliadenilação 280 (NOS 3') serve como o terminador transcricional. O cassete de expressão inteiro (do promotor até o terminador) pode ser excisado a partir desse plasmídeo como um fragmento Pacl-Xmal por digestão no sítio 240 de Pad (posição 3574) e no sítio 270 de Xmal (posição 911). pAL409 também inclui uma origem de replicação 260 de E. Coli, ColE1; e um marcador de resistência à ampicilina 250, bla. A seqüência de pAL409 é fornecida abaixo, mas a orientação e a numeração dos nucleotídeos diferem diferem daquelas retratadas na FIG. 2. O técnico especializado no assunto será capaz de alinhar a seqüência abaixo com o mapa de vetor da FIG. 2 em vista dos marcos do vetor. Um vetor de ARNi intermediário, tal como pAL409, pode ser usado para introduzir cópias invertidas tandem de virtualmente quaisquer seqüências direcionadoras do silenciamento. seqüência pAL409 TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCA GCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACA AGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAA CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAA ATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCAT TCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGG GCGGTTAATTAACTAATCGACTCTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTA ATTCGGCTTGTCGACCACCCAACCCCATATCGACAGAGGATGTGAAGAACAG GTAAATCACGCAGAAGAACCCATCTCTGATAGCAGCTATCGATTAGAACAAC GAATCCATATTGGGTCCGTGGGAAATACTTACTGCACAGGAAGGGGGCGAT CTGACGAGGCCCCGCCACCGGCCTCGACCCGAGGCCGAGGCCGACGAAGCG CCGGCGAGTACGGCGCCGCGGCGGCCTCTGCCCGTGCCCTCTGCGCGTGGG AGGGAGAGGCCGCGGTGGTGGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCAGCTGGT GCGGCGGCGCGGGGGTCAGCCGCCGAGCCGGCGGCGACGGAGGAGCAGGG CGGCGTGGACGCGAACTTCCGATCGGTTGGTCAGAGTGCGCGAGTTGGGCT TAGCCAATTAGGTCTCAACAATCTATTGGGCCGTAAAATTCATGGGCCCTGG TTTGTCTAGGCCCAATATCCCGTTCATTTCAGCCCACAAATATTTCCCCAGAG GATTATTAAGGCCCACACGCAGCTTATAGCAGATCAAGTACGATGTTTCCTG ATCGTTGGATCGGAAACGTACGGTCTTGATCAGGCATGCCGACTTCGTCAAA GAGAGGCGGCATGACCTGACGCGGAGTTGGTTCCGGGCACCGTCTGGATGG TCGTACCGGGACCGGACACGTGTCGCGCCTCCAACTACATGGACACGTGTG GTGCTGCCATTGGGCCGTACGCGTGGCGGTGACCGCACCGGATGCTGCCTC GCACCGCCTTGCCCACGCTTTATATAGAGAGGTTTTCTCTCCATTAATCGCAT AGCGAGTCGAATCGACCGAAGGGGAGGGGGAGCGAGAGCTTTGCGTTCTCT AATCGCCTCGTCAAGCCTAGGTGTGTGTCCGGAGTCAAGGTAACTAATCAAT CACCTCGTCCTAATCCTCGAATCTCTCGTGGTGCCCGTCTAATCTCGCGATTT TGATGCTCGTGGTGGAAAGCGTAGGAGGATCCCGTGCGAGTTAGTCTCAATC TCTCAGGGTTTCGTGCGATTTTAGGGTGATCCACCTCTTAATCGAGTTACGG TTTCGTGCGATTTTAGGGTAATCCTCTTAATCTCTCATTGATTTAGGGTTTCG TGAGAATCGAGGTAGGGATCTGTGTTATTTATATCGATCTAATAGATGGATT GGTTTTGAGATTGTTCTGTCAGATGGGGATTGTTTCGATATATTACCCTAATG ATGTGTCAGATGGGGATTGTTTCGATATATTACCCTAATGATGTGTCAGATG GGGATTGTTTCGATATATTACCCTAATGATGGATAATAAGAGTAGTTCACAG TTATGTTTTGATCCTGCCACATAGTTTGAGTTTTGTGATCAGATTTAGTTTTA CTTATTTGTGCTTAGTTCGGATGGGATTGTTCTGATATTGTTCCAATAGATGA ATAGCTCGTTAGGTTAAAATCTTTAGGTTGAGTTAGGCGACACATAGTTTATT TCCTCTGGATTTGGATTGGAATTGTGTTCTTAGTTTTTTTCCCCTGGATTTGG ATTGGAATTGTGTGGAGCTGGGTTAGAGAATTACATCTGTATCGTGTACACC TACTTGAACTGTAGAGCTTGGGTTCTAAGGTCAATTTAATCTGTATTGTATCT GGCTCTTTGCCTAGTTGAACTGTAGTGCTGATGTTGTACTGTGTTTTTTTACC CGTTTTATTTGCTTTACTCGTGCAAATCAAATCTGTCAGATGCTAGAACTAGG TGGCTTTATTCTGTGTTCTTACATAGATCTGTTGTCCTGTAGTTACTTATGTC AGTTTTGTTATTATCTGAAGATATTTTTGGTTGTTGCTTGTTGATGTGGTGTG AGCTGTGAGCAGCGCTCTTATGATTAATGATGCTGTCCAATTGTAGTGTAGT ATGATGTGATTGATATGTTCATCTATTTTGAGCTGACAGTACCGATATCGTAG GATCTGGTGCCAACTTATTCTCCAGCTGCTTTTTTTTACCTATGTTAATTCCA ATCCTTTCTTGCCTCTTCCAGGGATCCACCGGTCCGATCGAGCTTACTGAAA AAATTAACATCTCTTGCTAAGCTGGGAGCGCTAGCTCCCCGAATTTCCCCGA TCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTC TTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCC GCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAG GATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGGCGA GCTCGCCCGGGCGGGCGAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG TGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCAT AAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCG TTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATT AATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTT CCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGC GGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGAT AACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGT AAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGC ATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATA AAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCG ACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGG CGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCG CTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGC CACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCG GTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGAC AGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTG TTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTT GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGG ATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTA AAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACA GTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGT TCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGG GCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACC GGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAG AAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGG GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA TTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAG CTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAA AAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCG CAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG CCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCT GAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGG ATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACG TTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCG ATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAG CGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT AAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATT GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATT TAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC CTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGT ATCACGAGGCCCTTTCGTC [SEQ ID NO: 13]

[0068] Modalidades aqui fornecem vetores de ARNi intermediários, que se replicam em cópias elevadas em E. coli, apresentam baixa complexidade e vários sítios de restrição convenientes. pAL409 apresenta essas três características. Vetores com tais características seriam úteis para montagem de cassetes de expressão de ARNi, os quais podem, então, ser transferidos para um vetor de transformação de Agrobacterium.

Exemplo 3:

[0069] Um vetor de transformação exemplificativo, pAG2004, está ilustrado na FIG. 3. pAG2004 [SEQ ID NO: 14], pAG2004 inclui um íntron de ubiquitina de arroz 300 (íntron OsUbi3), um promotor de ubiquitina de arroz 330 (P-OsUbi3), um sítio 340 de Pad (posição 155), um sítio 370 de Xmal (posição 214), um sinal de poliadenilação NOS 3' 380 e uma origem de replicação 360 de E. coli, ColE1. pAG2004 também inclui um gene de fosfomanose isomerase (PMI) 390, um RB 391, um st AT 392 e um aadA 393. pAG2004 ou vetores similares podem ser transferidos a partir de E. coli para Agrobacterium tumefaciens LBA4404 via transferência conjugal, durante a qual o plasmídeo se integrará ao pSBI (um plasmídeo Ti residente) via recombinação homóloga. O cultivo conjunto da cepa de Agrobacterium recombinante resultante com células vegetais pode resultar na transferência do ADN derivado de pAG2004- para o genoma da planta. Modalidades aqui incluem um vetor recombinante apresentando quaisquer seqüências direcionadoras do silenciamento relacionadas a alvos para alteração de Amido Verde. Modalidades aqui incluem um vetor de transformação apresentando um fragmento a partir de pAL409 incluindo seqüências direcionadoras do silenciamento relacionadas a alvos para alteração de Amido Verde. Modalidades aqui incluem um vetor de transformação apresentando um fragmento de Pacl-Xmal a partir de pAL409 incluindo seqüências direcionadoras do silenciamento relacionadas a alvos para alteração de Amido Verde em lugar do fragmento Pacl-Xmal de pAG2004.

Exemplo 4:

[0070] Seqüências a partir de qualquer gene relacionado à regulação de amido podem ser fornecidas em um vetor de ARNi intermediário, em um vetor de transformação ou em uma planta transgênica aqui. Três genes exemplificativos, para serem alvos para interferência de ARN em arroz, são GWD, DSP e ISA3. SEQ ID NOS: 1 - 3 listam as seqüências para os genes de GWD, DSP e ISA3 de arroz, respectivamente. SEQ ID NOS: 4-6 listam as seqüências de codificação previstas para os genes GWD, DSP e ISA3, respectivamente. As seqüências de genes GWD, DSP e IS A3 são oriundas do banco de dados RiceGE: números de acesso 0s06g30310 (GWD); 0s03g01750 (DSP) e Os09g29404 (ISA3).

Exemplo 5:

[0071] Com base nas seqüências de codificação em SEQ ID NOS: 3-4, foram sintetizados cADNs artificiais e fornecidos como um recurso para expressão das proteínas correspondentes em sistemas heterólogos (por exemplo, E. coli ou leveduras), os quais, por sua vez, tornariam possível gerar anticorpos para uso na análise das plantas transgênicas planejadas.

[0072] ADNs de plasmídeo portando as seqüências de codificação inteiras de SEQ ID NOS: 3- 4 foram usados como moldes em reações de PCR para preparar seqüências direcionadoras do silenciamento a serem usadas nos construtos de ARNi. Para o gene GWD, foram preparadas duas seqüências direcionadoras do silenciamento diferentes. > seqüência direcionadora do silenciamento de GWD1 (uma cópia) TAGCGCTAAGGAAGGGAGAGATATCCATCCGGATCCCGGAAGCCGAA TCCATCCATCCATCCATCCCATACTGCCCTTACGATCGAGCTGTTTGA TATTCGTGCAGATGAGCGGATTCTCCGCGGCAGCTGCTGCGGCCGAG CGCTTGTCGGAAGGTTCACCCTGGATGCCAACTCCGAGCTTAAGGTG ACATTGAACCCAGCACCGCAGGGTTCGGTGGTGGAGATCAATCTAGA GGCAACTAACACCAGCGGCTCCCTGATACTGCATTGGGGCGCCCTTC GCCCGGATAGAGGAGAATGGCTCCTACCAT [SEQ ID NO: 7] > seqüência direcionadora do silenciamento de GWD2 (uma cópia) AGCAGATCTAGTTGACCAAGCAAGAGATAATGGATTATTGGGTATTAT TGGAATTTTTGTTTGGATTAGGTTCATGGCTACAAGGCAACTAATATG GAACAAGAACTACAATGTGAAGCCACGTGAGATAAGCAAAGCACAAG ATAGGTTTACAGATGATCTTGAGAATATGTACAGAACTTACCCACAAT ATCAGGAGATCTTAAGAATGATAATGTCTGCTGTTGGTCGGGGAGGT GAAGGTGATGTTGGTCAACGCATTCGTGATGAGATATTAGTAATCCAG AGAAATAATGACTGCAAAGGTGGAATGATGGAGGAGTGGCACCAGAA ACTGCACAACAATACAAGCCCAGATGATGTAGTGATCTGCCAGGCCCT ACTTGATTATATCAAGAGTGATTTTGATATTGGTGTTTACTGGGACAC CTTGAAAAAAGATGGTATAACAAAAGAGCGTCTATTGAGCTATGATCG ACCGATTCATTCAGAGCCAAATTTCAGGAGTGAACAGAAAGATGGCTT ACTCCGTGACTTGGGCAATTATATGAGAAGCCTCAAGATGGAGGGTA CCC [SEQ ID NO: 8]

[0074] GWD1 é derivada a partir de uma região próximo à extremidade 5' da seqüência de codificação de GWD. A segunda seqüência direcionadora do silenciamento de GWD, GWD2, é derivada a partir de uma região mais próxima ao meio da seqüência de codificação de GWD, que corresponde a uma região de conservação de seqüência relativamente mais elevada dentre os genes de GWD a partir de espécies divergentes. Ver a FIG. 4, que ilustra uma comparação entre GWD2, derivada a partir do gene de glucano- água diquinase de arroz, e o gene GWD a partir de tomate (Solatium lycopersicon). Inesperadamente, análise com BLAST [Zhang Z, Schwartz S, Wagner L, e Miller W, A greedy algorithm for aligning DNA sequences (2000) J Comput Biol 2000] 7(1-2):203-14, o qual é aqui incorporado por referência, como se fosse completamente apresentado] dessas duas seqüências revela extensa homologia, apesar da distância filogenética que separa essas duas espécies (o arroz é uma planta monocotiledônea, enquanto que o tomate é uma planta dicotiledônea). Isso sugere que essa porção do gene GWD serviria como um alvo largamente aplicável para interferência de ARN. Na FIG. 4, a Cons, (seqüência de cima) é uma porção da seqüência direcionadora do silenciamento de GWD2 de arroz [SEQ ID NO: 9]; e a Sbjct (seqüência de baixo) é a seqüência de cADN de GWD de arroz [SEQ ID NO: 10]. Devido à homologia de seqüências através dessa região, é possível que um construto de ARNi direcionado contra esta região no gene de arroz também poderia ser útil para suprimir a expressão de genes de GWD homólogos em outras espécies vegetais. Modalidades incluem métodos, vetores e plantas transgênicas incluindo seqüências para ARNi que tem por alvo GWD.

[0075] Porções dos genes DSP e ISA3 a partir de arroz também foram selecionados para servirem como seqüências direcionadoras do silenciamento. > seqüência direcionadora do silenciamento de DSP1 CTCCAATCGTGGGATCCAGGTCCATGAGGCGGCCCTCGCCGCTCAAT CTGACGATGGTTCGTGGCGGGAGTCGCCGATCAAACACTGTCAAAAC CGCATCCGGGGCGTCTACTTCTAGCGCCGAGAGTGGCGCAGTGGAGG CGGGCACGGAGAAATCCGATACGTACAGCACCAACATGACGCAAGCT ATGGGAGCAGTGTTGACGTATAGACATGAGCTTGGAATGAACTACAA TTTCATACGCCCAGACTTGATCGTGGGCTCCTGCTTACAGAGCCCACT TGATGTTGATAAACTTAGGGACATTGGTGTAAAAACAGTATTCTGCCT GCAGCAAGATCCAGACCTTGAATATTTTGGAGTTGACATCTGTGCCAT T [SEQ ID NO: 11] > seqüência direcionadora do silenciamento de ISA3 CTAGCGAATACACTGAACTGCAACCATCCTGTTGTCAAGGAGCTCATT CTTGACAGCTTGAGACACTGGGTTGAGGAGTATCACATAGATGGATTT CGATTTGACCTTGCAAGTGTTCTTTGTCGTGGACCAGATGGTTGTCCT CTTGATGCACCTCCACTCATCAAGGAAATTGCCAAAGATGCTGTATTA TCTAGATGTAAGATCATTGCTGAACCTTGGGATTGCGGCGGCCTTTAT CTCGTAGGGCGTTTCCCTAACTGGGACAGGTGGGCTGAATGGAACGG CAAATACAGAGATGATCTTCGAAGATTTATTAAGGGTGACCCTGGTAT GAAGGGGGTGTTTGCGACTCGTGTGTCTGGATCTGCTGATCTCTATCA GGTGAACGAGCGGAAGCCTTACCATGGTGTAAATTTTGTGATTGCACA TGATGGATTTACTTTATGTGACCTTGTTTCTTACAACTTAAAGCACAAT GATGCTAATGGAGAAGGTGGCTGTGATGGATC [SEQ ID NO: 12]

[0076] Cada uma das seqüências direcionadoras do silenciamento de GWD1, GWD2, DSP1 e ISA3 foi amplificada por PCR tal que cada uma delas fosse flanqueada com sítios de reconhecimento de enzimas de restrição (por exemplo, Nhel e Xmal). Os fragmentos foram primeiramente ligados em pCRBIunt II TOPO (Jnvitrogen), confirmados via múltiplas digestões com enzimas de restrição e seqüenciamento, a seguir, excisadas (usando-se enzimas de restrição que clivam os sítios flanqueantes introduzidos) e ligados primeiramente aos sítios de BspEI e Avrll e, então, aos sítios de Nhel e Agel de pAL409 (FIG. 2), o que posicionou as duas cópias em orientações opostas. Os cassetes de ARNi resultantes foram excisados a partir dos derivados de pAL409 como fragmentos Pacl-Xmal e ligados ao pAG2004 (FIG. 3), resultando nos plasmídeos pAG2100, pAG2102 e pAG2103. FIG. mostra cassetes de ARNi que se direcionam aos genes GWD, DSP e ISA3, onde as duas seqüências de topo são derivadas a partir do gene GWD, o meio a partir do gene DSP e o fundo a partir do gene ISA3. Cada um dos elementos motores é representado como cópias invertidas em duplicata separadas por e proximais em relação ao íntron OsUbi3. À esquerda, estão listados os nomes dos construtos que foram montados no plasmídeo pAL409. À direita, estão listados os nomes dos plasmídeos que resultaram quando os cassetes de ARNi foram excisados a partir de pAL409 como fragmentos de Pacl-Xmal e inseridos em pAG2004.

[0077] Ainda com referência à FIG. 3, o construto pAL409-6WDko1 inclui o promotor P-OsUbi 331, a seqüência direcionadora do silenciamento GWD1 310, o íntron OsUBi 301, a seqüência direcionadora do silenciamento GWD1 invertida 311 e a seqüência de poliadenilação NOS 3' 381. O construto pAL409-6WDko2 inclui o promotor P-OsUbi 332, a seqüência direcionadora do silenciamento GWD2 312, o íntron OsUBi 302, a seqüência direcionadora do silenciamento GWD2 invertida 313 e a seqüência de poliadenilação NOS 3' 382. O construto pAL409-DSPko1 inclui o promotor P-OsUbi 333, a seqüência direcionadora do silenciamento DSP1 314, o íntron OsUBi 303, a seqüência direcionadora do silenciamento DSP1 invertida 315 e a seqüência de poliadenilação NOS 3' 383. O construto pAL409-ISA3ko1 inclui o promotor P-OsUbi 334, a seqüência direcionadora do silenciamento ISA3 316, o íntron OsUBi 304, a seqüência direcionadora do silenciamento ISA3 invertida 317 e a seqüência de poliadenilação NOS 3' 384. A substituição do fragmento de Pacl-Xmal de pAG2004 pelos fragmentos de Pacl-Xmal dos construtos pAL409-6WDko1, pAL409-6WDko2, pAL409-DSPko1 e pAL409-ISA3ko1, produziu os plasmídeos pAG2100 [SEQ ID NO: 15], pAG2101 [SEQ ID NO: 16], pAG2102 [SEQ ID NO: 17] e pAG2103 [SEQ ID NO: 18], respectivamente.

Exemplo 6:

[0078] Geração de Plantas Transgênicas

[0079] Cepas de E. coli, portando pAG2100, pAG2101, pAG2102 ou pAG2103, foram usadas para conjugação com Agrobacterium e subseqüente transformação de arroz, milho e grama de crescimento rápido.

[0080] Construto de ARNi de sorgo

[0081] Um esboço da seqüência genômica correspondendo ao gene GWD putativo a partir de Sorghum bicolor [SEQ ID NO: 19] foi obtido por meio do Joint Genome Institute (JGI) Sorghum bicolor Home Page (http://genome.jgi-psf.org/Sorbi1/Sorbi1.home.html). A partir dessa seqüência, uma região correspondendo grosseiramente à região de GWD2 do gene de arroz [SEQ ID NO: 20] foi identificada. No sorgo, as seqüências de codificação nessa região estão interrompidas por um ou mais introns, conforme identificado por JGI, e os introns estão aproximadamente nos nucleotídeos 140-342, nucleotídeos 507-628 e nucleotídeos 723-795 na SEQ ID NO: 20. Um íntron nativo derivado a partir do genoma de sorgo foi utilizado na montagem de um cassete de ARNi para desativar o gene GWD a partir do sorgo. Uma porção do gene GWD de sorgo foi amplificada. A porção amplificada incluía um éxon complete (com base na previsão de JGI) na região de meio altamente conservada (descrita mais cedo, ver a FIG. 4), o íntron adjacente e 10 bases do éxon subseqüente (para preservar o limite íntron/éxon 3’)- Um sítio de Xmal foi incorporado à montante do primeiro éxon, e os sítios de Agel e Nhel foram incorporados à jusante do segundo éxon truncado durante a amplificação com PCR deste produto. Esse produto (SbGWDko2a) foi primeiramente ligado a pCRBIuntll TOPO (Invitrogen), e sua composição foi confirmada via múltiplas digestões com enzimas de restrição e seqüenciamento. > SbGWDko2a (com sítios de restrição flanqueantes) GGTTCAATAACCCGGGAGTGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTA CAGATGATCTTGAGAATATGTACAGAACTTATCCTCAGTACAGAGAGA TACTAAGAATGATAATGGCTGCTGTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGAC GTTGGTCAACGCATTCGTGATGAGATATTAGTAATACAGGTAAAACTG ATGGTCCTTGGTGAATATACAGTTATTTTCGTTCATTGCTCTGCTGAAT TGAGCAGTTGGTAGTGCTCATCCAAAACGTAGACATTGTCAACAATAA AATGTTTGGTGTGTTACAGAGAAATACCGGTGCAAAGCTAGCATGATG GAAGAATGG [SEQ ID NO: 21]

[0082] Um segundo produto de PCR (SbGWDko2b), correspondendo somente ao primeiro éxon mencionado acima, também foi amplificado por PCR com sítios de Nhel e Xmal flanqueantes introduzidos nas extremidades 5' e 3' (relativas à direção de transcrição), e ligado ao pCRBIuntll TOPO. A composição desse fragmento também foi confirmada via múltiplas digestões com enzimas de restrição e seqüenciamento. > SbGWDko2b (com sítios de restrição flanqueantes) GGTTCAATAAGCTAGCAGTGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTA CAGATGATCTTGAGAATATGTACAGAACTTATCCTCAGTACAGAGAGA TACTAAGAATGATAATGGCTGCTGTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGAC GTTGGTCAACGCATTCGTGATGAGATATTAGTAATACAGCCCGGGCTG ATGGTCC [SEQ ID NO: 22]

[0083] A seguir, SbGWDko2b foi excisado a partir de pCRBIuntll como um fragmento de Nhel-Xmal, e ligado aos sítios de Nhel e Agel do plasmideo portando SbGWDko2a, o posicionamento de SbGWDko2b à jusante do íntron e na orientação oposta de SbGWDko2a. Nessa orientação, as seqüências na porção sbGWDko2b do plasmídeos são apresentadas como um complemento invertido das seqüências dentro da porção sbGWDko2a. Referindo-se à FIG. 5, esse cassete inteiro foi excisado como um fragmento de Xmal-Nhel e ligado ao pAL409j, resultando no plasmideo pAL409j SbGWDko2 [SEQ ID NO: 47], pAL409j porta um cassete de ARNi que se direciona ao gene GWD Sorghum bicolor. A seqüência direcionadora do silenciamento 510 (sbGWDko2a) está ilustrada na FIG. 5 à montante do íntron 520 (sbGWDi), o qual está ilustrado à montante da seqüência direcionadora do silenciamento 530 (sbGWDko2b). pAL409j difere de pAL409 somente no fato de que a junção entre o promotor OsUbi3 e o íntron Osllbi3i tinha sido modificada para refletir seu contexto nativo no genoma de arroz. Como tal, essa orientação pode preservar as funções de intensificador de Osllbi3i com respeito ao promotor OsUbi3. Conforme mostrado na FIG. 5, duas seqüências direcionadoras do silenciamento homólogas invertidas, derivadas a partir de um éxon dentro do gene GWD de sorgo (GWDex) estão separadas por um éxon GWD de sorgo nativo (SbGWDi). Outros elementos são denominados como na FIG. 2.

[0084] O cassete de ARNi inteiro a partir de pAL409j SbGWDko2 foi, então, excisado como um fragmento de Pacl-Xmal e ligados aos sítios de Pad e Xmal de pAG2004, produzindo o vetor de transformação de Agrobacterium pAG2106 [SEQ ID NO: 23] de uma maneira similar àquela descrita em referência à FIG. 3. Uma cepa de E. coli portando pAG2106 foi usada para conjugação a Agrobacterium e subseqüente transformação de sorgo.

Exemplo 7:

[0085] Seqüenciamento dos Gene(s) GWD de Grama de Crescimento Rápido

[0086] Homólogos para GWD e ISA3 foram detectados no genoma de grama de crescimento rápido e o número de homólogos que estão presentes para cada um foram estimados usando-se uma estratégia de Southern blotting. Os resultados com o Southern blot usando-se a sonda ISA3 de arroz são mostrados na FIG. 6. A FIG. 6 mostra a detecção de homólogos de ISA3 via Southern blot. O ADN genômico foi extraído a partir de arroz, sorgo, milho e grama de crescimento rápido, digerido com Hindlll, e separado via eletroforese em gel de agarose. Os ADNs foram subseqüentemente transferidos para membranas de nylon via blotting capilar, e os blots sondados com ADN marcado com DIG, derivado do gene de arroz clonado ISA3. Embora a sonda se hibridizou com somente fragmentos únicos em arroz e sorgo, a mesma sonda se hibridizou com 3-5 fragmentos nos genomas de milho e de grama de crescimento rápido. O controle era o ADN de plasmídeo portando a seqüência de codificação de ISA3 de arroz; e o marcador era padrões de peso molecular de ADN. Resultados similares foram obtidos quando o fragmento GWD2 de arroz foi usada como uma sonda (não mostrada). Determinou-se que, de maneira diferente que arroz e sorgo, que contêm somente cópias únicas de GWD e ISA3, grama de crescimento rápido contém homólogos múltiplos de cada um desses genes.

[0087] Uma porção do gene de grama de crescimento rápido GWD foi identificada e clones usando uma abordagem de PCR degenerada. POR degenerada emprega iniciadores de nucleotídeos com uma ou mais bases ambíguas que permitem que os iniciadores de anelem às seqüências de molde para os quais somente informações de seqüência aproximadas estão disponíveis. Em outras palavras, em regiões de forte conservação de seqüência entre genes de espécies amplamente divergentes, pode-se inferir a gama de seqüências possíveis que poderiam estar presentes no gene correspondente a partir de uma espécie subcaracterizada, tal como grama de crescimento rápido. Pode-se, então, projetar iniciadores degenerados, que se anelarão com as seqüências previstas, permitindo à amplificação com PCR e a clonagem de uma porção do gene em questão.

[0088] Prosseguindo com a estratégia de PCR degenerada, porções dos genes GWD derivados de arroz, sorgo, milho e tomate, foram alinhadas. Os alinhamentos mais fortes ocorreram na região dos genes GWD, que foi descrita na FIG. 4. Regiões curtas (~40 nt) próximo às extremidades dessas regiões de homologia foram selecionadas para uma comparação de seqüências mais detalhada (FIG. 7). A FIG. 7 ilustra o alinhamento de entes retirados dos genes GWD de arroz (OsGWD) [SEQ ID NOS: 24 (em cima) e 28 (em baixo)], sorgo (SbGWD) [SEQ ID NOS: 25 (em cima) e 29 (em baixo)], milho (ZmGWD) [SEQ ID NOS: 26 (em cima) e 30 (em baixo)], e tomate (SIGWD) [SEQ ID NOS: 27 (em cima) e 31 (em baixo)]. As posições de nucleotídeos, que estão conservadas em pelo menos duas das quatro seqüências estão destacadas em cinza claro. Subjacente a cada conjunto, é apresentada a seqüência de consenso em relação às quais os iniciadores degenerados (dgGWDup2 e dgGWDdown2 [SEQ ID NOS: 32 e 33, respectivamente]) foram projetados para amplificação com PCR. Observe-se que somente a seqüência parcial está disponível para o homólogo de milho, com uma região de seqüência desconhecida representada por Ns. As quatro seqüências alinhadas no segmento de topo correspondem à porção das seqüências de codificação de GWD, que podem ser encontradas a partir dos nucleotídeos 1803-1840 da seqüência de codificação de tomate (conforme definido na FIG. 4), embora os alinhamentos no segmento de baixo correspondam aos nucleotídeos 2208-2249 da seqüência de tomate. As abreviações de nucleotídeos para nucleotídeos degenerados são como se seguem: Y, C ou T; W, A ou T; K, G ou T; R, A ou G, M, A ou C; H, A ou C ou T; S, G ou C; D, A ou G ou T. A partir desta informação, foram projetados iniciadores degenerados (dgGWDup2: 5'- TGGAATTYTTGTWTGGATKAGRTTCATGGCTACMAGGCA-3' e dgGWDdown2: 5'- GGYTCWGAATGRATMGSWCGRTCATARCTCAADAGACGCTCT-3'). ADN genômico, que tinha sido isolado a partir de sorgo, foi, então, usado como um molde em reações de PCR com esses iniciadores. PCR degenerada, com ADN genômico de sorgo como um molde, deu origem a um produto de PCR com aproximadamente 800 pb. O seqüenciamento desse produto de PCR revelou que ele correspondeu de maneira próxima com a seqüência que foi prevista para o gene GWD de sorgo pelo banco de dados JGI (ver acima), o que indicou que os iniciadores degenerados amplificariam de maneira confiável um segmento do gene GWD.

[0089] Os mesmos iniciadores foram então, usados em reações de PCR, que usaram ADN genômico de grama de crescimento rápido (ecotipo Álamo) como um molde. Essas reações produziram produtos de PCR discretos de aproximadamente 1.100 pb. Esses produtos foram ligados a pCRBIuntll TOPO e cinco dos plasmídeos resultantes foram seqüenciados. Dessas cinco seqüências, determinou-se que: • Cada produto de PCR clonado era derivado a partir de um gene com homologia muito forte em relação ao gene GWD de arroz; • Dentre os cinco produtos seqüenciados, havia claramente três classes de seqüências (altamente homólogas), sugerindo que os clones foram derivados a partir de três homólogos de GWD diferentes dentro do genoma da grama de crescimento rápido. Essa observação concorda com os dados a partir de Southern blots que sugeriram que múltiplas genes GWD residem dentro do genoma da grama de crescimento rápido; • As principais diferenças nos tamanhos dos produtos que surgiram a partir de PCR degenerada de sorgo e de grama de crescimento rápido podem ser atribuídas as diferenças nos comprimentos dos introns putativos em cada um dos respectivos genes.

[0090] Referindo-se à FIG. 8, é ilustrada uma comparação de comprimento e posicionamento relativos de introns dentro do segmento de homologia de núcleo dos genes GWD a partir de arroz, sorgo, Arabidopsis e grama de crescimento rápido. Caixas escuras representam éxons e caixas claras representam introns. Seqüências de éxons estão muito bem conservadas e são facilmente reconhecidas. Enquanto que as posições relativas de cada um dos introns estão também bem conservadas através das espécies, o comprimento e a seqüência dos introns não estão bem conservados. Os comprimentos dos introns e dos éxons são indicados em pb dentro de cada elemento.

[0091] Conforme mostrado abaixo, um alinhamento das seqüências, a partir de três dos produtos de PCR degenerada derivados de grama de crescimento rápido, demonstra que relativamente poucas mudanças de nucleotídeos únicos e duas inserções / eliminações algo mais longas distinguem estes três homólogos de GWD nessa região. Esses três produtos são PvGWD-2 [SEQ ID NO: 34], PvGWD-5 [SEQ ID NO: 35] e PvGWD- 1 [SEQ ID NO: 36].

[0092] CLUSTAL 2.0.10 Alinhamento de múltiplas seqüências PvGWD-2 TGGAATTCTTGTTTGGATGAGATTCATGGCTACCAGGCAACTAACATGGAATAAGAACTA 6 0 PvGWD-5 TGGAATTCTTGTTTGGATTAGGTTCATGGCTACCAGGCAACTAACATGGAATAAGAACTA 6 0 PvGWD-1 TGGAATTTTTGTTTGGATGAGATTCATGGCTACAAGACAACTGACATGGAATAAGAACTA 6 0 ******* ********** ** *********** ** ***** ***************** PvGWD-2 TAATGTGAAGCCCCGGTATATACCTGTCTTTATCATTTACTTCAGTGATGTTTACTCTCT 120 PvGWD-5 TAATGTGAAGCCCCGGTATATACCTGTCTTTATCATTTACTTCAGTGATGTTTACTCTCT 120 PvGWD-1 TAATGTGAAGCCACGGTATATACCTGTCTTTATTATTTACTTCAGTAATGTTTACTCTCT 120 ************ ******************** ************ ************* PvGWD-2 GCTTAAAAATTTAAAGAATCTGAAGCTGTCCTTTTCTTTTGTGCGGGAACATAATTGAGA 180 PvGWD-5 GCTTAAAAATTTAAAGAATCTGAAGCTGTCCTTTTCTTTTGTGCGGGAACATATTTGAGA 180 PvGWD-1 GCTTTAAAAGTTAAAGAATCAGAAGTTGTCCCTTTCTTTTGTGCGGGAACATAATTGAAA 180 **** **** ********** **** ***** ********************* **** * PvGWD-2 AATTGGTGTTTTTGCCACTACTTCATGATGCAATTGTAATTTTTCCCTCATTTTTTTCAA 240 PvGWD-5 AATTGGTGTTTTTGCCACTACTTCATGATGCAATTGTAATTTTTCCCTCATTTTTTTCAA 240 PvGWD-1 AGTTGGTGTTCTTGCCACTAC 201 * ******** ********** PvGWD-2 CTTTGTGATTTTGCCCTTTACTATTCACAAGTCAACGCAATTTTGCTCCTGTTTTGACCG 300 PvGWD-5 CTTTGTGATTTTGCCCTTTACTATTCACAAGTCAACGCAATTTTGCTCCTGTTTTGACCG 300 PvGWD-1 AAGTCAACGCGATTTTACCCCT-CGTCAACGG 232 ********** ***** * *♦* * ** * PvGWD-2 TTGACTGAG-GGAAAAATCGCGTTAACTTGTGAATAGTAAGTGCAAAATTGCAAAGTTGA 359 PvGWD-5 TTGACTGAG-GGAAAAATCGCGTTAACTTGTGAATAGTAAGTGCAAAATTGCAAAGTTGA 359 PvGWD-1 TCAAAACAGTAGCAAAATCGCGTTGACTTGTGAATAGTAAGGGCAAA-TCACAAAGTTGG 291 ★ ★ ** * •k -k •k * •k ★ •k * -k •k * * •k * * it -k ** * ★ ir ir ir * ir k kkkkk ir ir ir ir it k ir ir ir PvGWD-2 AAAAAACAAGGACAAAATCACAATTGCACTGCAAAGTAGGGGTGGAAACACAAATGCCCC 419 PvGWD-5 AAAAAACAAGGACAAAATCACAATTGCACTGCAAAGTAGGGGTGGAAACACAAATGCCCC 419 PvGWD-1 AAAAAACAAGGACAAAATCACAATTGCACTGCAAAGTAGTCGCGGAAACACAAATGCCCC 351 *************************************** * ***************** PvGWD-2 AAAATAATTTGGCTGTTTGTCCTGATAGAAAACAATACAATTCAGTACTCAGAGAATATT 479 PvGWD-5 AAAATAATTTGGCTGTTTGTCCTGATAGAAAACAATACAATTCAGTACTAAGAGAATATT 479 PvGWD-1 AAAATAATTTGGCTGTTTGTCCTGATAAAAAACAATACAATTCAGTACTCAGAGAATATT 411 **★**★**★*★★★★*★★******★★** ********★★*********★♦ ********** PvGWD-2 ATATTTCTATAAATGAAAAACATAACTCATGTCACATTCTTT GGCATCTCAT 531 PvGWD-5 ATATTTCTATAAATGAAAAACATAACTCATGTCACATTCTTT GGCATCTCAT 531 PvGWD-1 ATATTTCTATAAATGAAAAACATAACTCATGTCGCATTCTTTCATTCTTTGGCATCTCAT 471 ********************************* ******** ********** PvGWD-2 ATCGATCAATAACTATGCAGTGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTACAGATGATCTT 591 PvGWD-5 ATCGATCAATAACTATGCAGTGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTACAGATGATCTT 591 PvGWD-1 ATTGATTAATAACTACGCAGTGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTACAGATGATCTT 531 ** *** ******** ******************************************** PvGWD-2 GAGAACATGTACAAAGCTTATCCTCAGTGCAGAGAGATATTAAGAATGATAATGGCTGCT 651 PvGWD-5 GAGAACATGTACAAAGCTTATCCTCAGTGCAGAGAGATATTAAGAATGATAATGGCTGCT 651 PvGWD-1 GAGAACATGTACAAAGCTTATCCTCAGTACAGAGAGATATTAAGAATGATAATGGCTGCT 591 **************************** ******************************* PvGWD-2 GTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGATGTTGGTCAACGTATTCGTGATGAGATATTAGTAATA 711 PvGWD-5 GTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGATGTTGGTCAACGTATTCGAGATGAGATATTAGTAATA 711 PvGWD-1 GTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGATGTTGGTCAACGTATTCGTGATGAGATATTAGTAATA 651 ***************************************** ****************** PvGWD-2 CAGGTAAAATTAATGGTCCTAGGTGAATATACACTTACTTTTATTCATTGCTTCACCGAA 771 PvGWD-5 CAGGTAAAATTAATGGTCCTAGGTGAATATACACTTACTTTTATTCATTGCTTCACTGAA 771 PvGWD-1 CAGGTAAAATTAATGGTCCTAGGTGAATATACACCTACTTTTATTCATTGCTTCACTGAA 711 ********************************** ********************* *** PvGWD-2 TTATACGGTTGGTAGTTCTCATCCAAAAGATAGACATTGTGAATAATAATAAAATGCTTG 831 PvGWD-5 TTATACGGTTGGTAGTTCTCATCCAAAAGATAGACATTGTGAATAATAATAAAATGCTTG 831 PvGWD-1 TTATACGGTTGGTAGTTCTGATCCAAAAGATAGACATTGTGAATAATAATAAAATGCTTG 771 ★**★*★*★★★★**★**★★* ***★★+★★*★*★★*★■&★★★***★*★★★**★*★*★**★★★★ PvGWD-2 CTGCTTTAATAGAGAAATAATGACTGCAAAGGTGGAATGATGGAAGAATGGCACCAGAAA 891 PvGWD-5 CTGCTTTAATAGAGAAATAATGACTGCAAAGGTGGAATGATGGAAGAATGGCACCAGAAA 891 PvGWD-1 CTGCTTTTATAGAGAAATAATGACTGCAAAGGTGGAATGATGGAAGAATGGCACCAGAAA 831 * Jr JrJrJrJrJr**JrJrJrJrJtJtwJr***JrJrJrJrJrJrJrJtJrJrJrJr*JrJrJrJrJr*JrJrw*JrJrJr*Jr*JrJrJr*Jir PvGWD-2 TTGCACAACAATACAAGCCCAGATGATGTAGTGATATGCCAGGTAATGGATATTTTGAAT 951 PvGWD-5 TTGCACAACAATACAAGCCCAGATGATGTAGTGATATGCCAGGTAATGGATATTTTGAAT 951 PvGWD-1 TTGCACAACAATACAAGCCCAGATGATGTAGTGATATGCCAGGTATTGGATATTTTGAAT 891 PVGWD-2 TCTTAATACAGTAAGTATTTAAGCATTGAGGTTTTCATGGTTATGTCTCTCCTTGGGCAG ion PvGWD-5 TCTTAATACAGTAAGTATTTAAGCATTGAGGTTTTCATGGTTATGTCTCTCCTTGGGCAG 1011 PvGWD-1 TCTTAATACTGTAAGTATTTAAGCATTGAGGTTTTTATGGTTATGTCTCTCCTTGGGCAG 951 * Jr Jr** Jr Jr JrJr ************************* ************************ PvGWD-2 GCACTAATTGATTATATCAAGAGTGATTTTGATATAAGTGTTTACTGGGACACCTTGAAC 1071 PvGWD-5 GCACTAATTGATTATATCAAGAGTGATTTTGATATAAGTGTTTACTGGGACACCTTGAAC 1071 PvGWD-1 GCATTAATTGATTATATCAAGAGTGATTTTGATATAAGTGTTTACTGGGACACCTTGAAC 1011 * *★ ******************************************************** PvGWD-2 AAAAATGGCATAACCAAAGAGCGTCTCTTGAGCTATGATCGAG-CTATCCATTCAGAACC 1130 PvGWD-5 AAAAATGGCATAACCAAAGAGCGTCTATTGAGTTATGACCGTC-CGATCCATTCCAGACC 1130 PvGWD-1 AAAAATGGCATAACCAAAGAGCGTCTTTTGAGCTATGATCGTTGCTATCCATTCAGAACC 1071 * ************************* ***** ***** ic-k * •it it * •k * * •k •k iekit

[0093] As seqüências dos éxons a partir de gene(s) GWD de grama de crescimento rápido foram inferidas a partir das informações acima. As seqüências inferidas foram usadas para (1) desenvolver um construto de ARNi, que se direcionaria a essa região central de um ou de todos os genes GWD de grama de crescimento rápido; e (2) determinar mais da seqüência genômica para cada um desses (pelo menos três) homólogos de GWD em grama de crescimento rápido.

[0094] Para desenvolver um construto de ARNi, PCR foi usada para amplificar porções a partir de dois dos éxons englobados nos produtos de PCR degenerada descritos acima. Esses dois produtos foram, então, fundidos por SOE PCR (Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension (1989) Gene 77(1):61-8), o qual é aqui incorporado por referência como se fosse completamente aproveitado). Os produtos fundidos incluíam uma seqüência contígua, a qual esperou-se corresponder mais proximamente a um ou mais dos mARNs de GWD de grama de crescimento rápido. Sítios de Nhel e Xmal foram incorporados aos terminais do produto fundido para permitir a clonagem subseqüente em pAL409. A seqüência desse produto (denominado "PvGWDko2" em conjunto com os sítios de restrição flanqueantes) é retratada abaixo.

[0095] PvGWDko2 seqüência direcionadora do silenciamento de ARNi GGCTAGCGAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGTTTACAGATGATCTTG AGAACATGTACAAAGCTTATCCTCAGTACAGAGAGATATTAAGAATGA TAATGGCTGCTGTTGGTCGTGGAGGTGAAGGTGATGTTGGTCAACGT ATTCGTGATGAGATATTAGTAATACAGGAGAAATAATGACTGCAAAGG TGGAATGATGGAAGAATGGCACCAGAAATTGCACAACAATACAAGCC CAGATGATGTAGTGATATGCCCGGGAGG [SEQ ID NO: 37]

[0096] Uma cópia desse elemento foi ligado nos sítios de Avrll e BspEI de pAL409, então, uma segunda cópia foi ligada aos sítios de Nhel e Agel do plasmídeo resultante, produzindo o cassete de ARNi pAL409 PvGWDko2, que apresentava os elementos dispostos em orientações opostas, separados pelo íntron OsUbi3, conforme descrito em referência à FIG. 3. O cassete de ARNi foi excisado a partir desse plasmídeos como um fragmento de Pacl-Xmal ligado aos sítios de Pad e Xmal de pAG2004 (FIG. 3). O vetor de transformação em Agrobacterium resultante foi denominado pAG2104 [SEQ ID NO: 38]. Uma cepa de E. coli portando esse plasmídeo foi usado para conjugação com Agrobacterium e subseqüente transformação de grama de crescimento rápido.

[0097] Pelo aprendizado das seqüências genômicas completas de cada um dos genes GWD em grama de crescimento rápido, a pode ser possível a identificação das seqüências potencialmente únicas (regiões não traduzidas de 5' e 3'), que flanqueiam cada um destes genes. Com essas informações, pode ser capaz de projetar construtos de ARNi que se direcionam especificamente a um ou outros desses genes.

[0098] Para identificar mais das seqüências associadas com cada um dos homólogos de GWD, foi empreendida uma estratégia que empregou PCR inversa (iPCR), assim como PCR degenerada. ADN genômico a partir de grama de crescimento rápido foi digerido com EcoRI, Hindlll ou Bglll. Essas foram, então, submetidas à autoligação, diluída aproximadamente 100 vezes, e usadas como moldes em reações de PCR inversas. As seqüências dos primeiros iniciadores usados em reações de iPCR estão resumidas na Tabela 1.

[0099] Tabela 1. Seqüências de iniciadores usadas para PCR inversa

[00100] Reações de PCR inversa ou com os iniciadores PvGWDi-1 e PvGWDi-2 ou com os iniciadores PvGWDi-3 e PvGWDi-4, foram realizadas usando-se os moldes digeridos (e autoligados) com EcoRI ou Hindlll. Essas reações deram origem a um pequeno número de produtos claros, os quais foram purificados a partir de géis de agarose e ligados a pCRBIuntll-TOPO. A análise de seqüências dos plasmídeos resultantes permitiu estender a seqüência conhecida a partir de genes GWD de grama de crescimento rápido em ambas as extremidades 5' e 3' até um total de 3,4 Kb. Novamente, as seqüências a partir de clones individuais diferiram em 1-2 %, o que é consistente com a idéia de que os produtos de PCR clonados foram derivados a partir de homólogos de GWD separados, mas muito similares, no genoma de grama de crescimento rápido. Esse exercício foi repetido com iniciadores recém-projetados, incorporando tanto PCR inversa, quanto PCR degenerada, para estender adicionalmente a seqüência conhecida. Foi identificada uma seqüência de GWD de grama de crescimento rápido de aproximadamente 7 Kb.

[00101] É fornecida uma seqüência amalgamada representando as seqüências de gene GWD de grama de crescimento rápido aqui desenvolvidas. A seqüência apresentada não inclui todas as variações identificadas entre os homólogos. Portanto, a seqüência poderia ser visualizada como uma quimera desses homólogos. Essa seqüência abrange aproximadamente 1-2 Kb, para a qual na há dados de seqüências. Esse segmento é representado como uma cadeia de Ns. Referindo-se à FIG. 9, é ilustrada uma retratação de matriz de pontos de alinhamentos com BLASTn entre seqüências genômicas de grama de crescimento rápido e de arroz para genes de glucano-água diquinase. O eixo horizontal representa a seqüência de grama de crescimento rápido; e o eixo vertical representa a seqüência de arroz. Os segmentos diagonais representam regiões, nas quais as duas seqüências são altamente homólogas. Este diagrama mostra a similaridade da seqüência de grama de crescimento rápido abaixo em relação à seqüência correspondente do gene GWD de arroz. > homólogos de GWD de grama de crescimento rápido GCAACGACAGTGTACAAGAACAGCGCTCTTCGGACGCCTTTTCTAAAGGTCAGTCTT G TT AC ATT ATG G AT CT CTTTG TT AC C AC AG AAC AC TCTG G TT AG C AG T AATG T C CATA ACTGTGCAGTCAGGAGGTGATAACTCCACGCTTAGAATTGAGATAGATGATCCTGCG GTGCAAGCTATTGAATTTCTCATCTTTGATGAGACACAGAACAAATGGTAACCCAGCT GTTTTCGTTACCATGTAGCACTGTTTGTTTGTTTGAATGCAAAAGGTATATAAACTAT G CAAAACTCTACATTG CACAG GTTTAAAAATAATGG CCAG AATTTTC AAATTCAG CTC CAATCGAGCCACCATCATGGTAGTGGCGCATCTGGTGCCTCATCTTCTGCTACTTCTG CCTTG GTGCCAG AG G ATCTTGTG CAG ATCCAAG CTTACCTACG GTGGG AAAG AAATG G AAAG CAGTCATACACACCG G AG CAAG AAAAG G AAAG CTTTTAGTTGTTTTTTTTTAT CTTCAGTCTGGAAGGAACTCAATGTACTAAGTTGATTAAAAATAAGAGGTGGTGTATT TTTTCTCCAGGAGGAGTATGAAGCTGCACGAGCTGAGTTAATAGAAGAATTAAATAG AGG TC TTTCTTTGG AG AAG CTTCG AG CTAAATTG AC AAAAG CACCTG AAGTG CCCGA CTCAGATGAAAATGATTCTCCTGCATCTCAAATTACTGTTGATAAAATTCCAGAGGAC CTTGTACAAGTCCAGGCTTATATAAGGTGGGAGAAAGCAGGCAAGCCAAACTATCCT CCTGAGAAGCAACTGGTAATGCATTGATTCAATAGCGTAAAATACCTTGTTGGCTTTA CACTTTATGGAGGTTCTTATCTCACAATTCGCTAGGTCGAGTTTGAGGAAGCAAGGAA GGAACTGCAGGCTGAGGTGGACAAGGGAATCTCGATTGATCAGTTGAGGAAGAAGAT TTTG AAAG G AAACATTG AG AGTAAAGTTTCG AAG CAG CTG AAG AATAAG AAGTACTT CTCTGTAG AAAGG ATTCAG CG CAAAAAG AG AG ATATCATG CAG ATTCTTAG TAAACAT AAGCATACTGTCATAGAAGAGCAAGCAGAGGTTGCACCAAAACAACTAACTGTTCTT GATCTCTTCACCAATTCATTACAGAAGGATGGCTTTGAAGTTCTAAGCAAAAAACTGT TCAAGTTCGGTGATAAACAGATCCTGGTTAGGATCCTTAAGATATTCTTTGTATCTCC AGATCTTTTTCTACCATGCTAATTAAGCTTCTCTCTTCTTAAGGCAATCTCCACCAAG GTTCTAAACAAATCAAAAGTTTACTTGGCAACAAATCATACGGAGCCACTTATCCTTC ACTGGTCACTAGCGAAAAAGGCTGGAGAGTGGAAGGTTAAATTTCAAAATTGTTTCC AGTAGTTAAAGCCACAAACTCAGCAGCTTTTTTAAACACTGCTATCAGTACCAATGCG GTGTTATTTAACTGTGCAGGCACCTCCTTCAAACATATTGCCATCTGGTTCAAAATTG TTAGACATGGCATGCGAAACTGAATTTACTAAGTCTGAATTGGATGGTTTGCATTATC AGGTGGAAATAACATCTTCAACCTGTTATTTTATTCTTATTTTTATTAGCCCTCCTGCT ATCTCAAGGCTCTTAATTTCCAGGTTGTTGAGATAGAGCTTGATGATGGAGGATATAA AGGGATGCCATTCGTTCTTCGGTCTGGTGAAATGTGGATAAAAAATAATGGCTCTGAT TTTTACCTTGATCTCAGCACCCGTGATACCAGAAATATTAAGGCAAGTGTTTCTGTCC ATTTTACCTTTCAAACTTTAAACTATTGTCTTTGTTTTGTCTATG CAACTAGTCG CTAA ATTGTGAAGTAACCGATCTGTTCTTAATTGAAGGACACTGGTGATGCTGGTAAAGGTA CTGCTAAGGCATTGCTGGAAAGAATAGCAGAGCTGGAGGAAGATGCCCAGCGATCTC TTATGCACAGGTCAGGCACTAAAATATCCATAATAATATGACTGAATTTTACATGGAA AATTCTCCTAAACTACTTCTACTCCTTGACAGATTCAACATTGCAGCACATCTAGTTG ACCAAGCCAGAGATGCTGGACTATTGGGTATTGTTGGACTTTTTCTTTGGATTAGATT CATG G CTACAAGACAACTGACATG G AATAAG AACTATAATG TG AAG CCACG G TATAT ACCTGTCTTTATTATTTACTTCAGTAATGTTTACTCTCTGCTTTAAAAGTTAAAGAATC AGAAGTTGTCCCTTTCTTTTGTGCGGGAACATAATTGAAAAGTTGGTGTTCTTGCCAC TACAAGTCAACGCGATTTTACCCCTCGTCAACGGTCAAAACACTAGCAAAATCGCGTT GACTTGTGAATAGTAAGGGCAAATCACAAAGTTGCAAAAAACAAGGACAAAATCACA ATTGCACTGCAAAGTAGTCGCGGAAACACAAATGCCCCAAAATAATTTGGCTGTTTGT CCTGATAAAAAACAATACAATTCAGTACTCAGAGAATATTATATTTCTATAAATGAAA AACATAACTCATGTCGCATTCTTTCATTCTTTGGCATCTCATATTGATTAATAACTACG C AGTG AG AT AAG C AAAG C AC AAG ATAG G TTTAC AG ATG ATCTTG AG AAC ATG TAC AA AGCTTATCCTCAGTACAGAGAGATATTAAGAATGATAATGGCTGCTGTTGGTCGTGG AGGTGAAGGTGATGTTGGTCAACGTATTCGTGATGAGATATTAGTAATACAGGTAAA ATTAATGGTCCTAGGTGAATATACACCTACTTTTATTCATTGCTTCACTGAATTATACG GTTGGTAGTTCTGATCCAAAAGATAGACATTGTGAATAATAATAAAATGCTTGCTGCT T1TATAG AG AAATAATG ACTG CAAAGGTGG AATG ATG G AAG AATG G CACCAG AAATT GCACAACAATACAAGCCCAGATGATGTAGTGATATGCCAGGTATTGGATATTTTGAAT TCTTAATACTGTAAGTATTTAAGCATTGAGGTTTTTATGGTTATGTCTCTCCTTGGGC AGGCATTAATTGATTATATCAAGAGTGATTTTGATATAAGTGTTTACTGGGACACCTT GAACAAAAATGGCATAACCAAAGAGCATCTCTTGAGCTATGATCGTGCGATTCATTCA GAACCAAATTTCAGAAGTGAACAGAAGGAGGGTTTACTCCATGACCTGGGTAATTAC ATGAG AAGCCTG AAGGTATGTAAAACACTTAATATG G ATATAAAAAAAG G CATG CAA AAAAATCTGTG C ATTATCTITGAAATTG AG TATGG TATTTTCTAAAG AAAACATAG AA AAACACATATTGCCCTTTCAGTTCCGGAAAAAAATGATCTGCCATAAAGAGCATACAG TCAACTCATGTATTAGCACTCGCCTTTTCTGCTAATGGTATGTTGTGTTGTGTTCTGTT CTATTCAATATATGCTTTCAGTAATAATATTCTAGTGTTGACAACATCATTGCTCACAA CATACAGAAACTGTAGTATGCCCGGTACAGTATGAACTTGTCCTTGAGTCTCCTCATT TTTTCCTTATTCACGTCACAGCTTTATATCCTTCCAATGAATAATGATCAACTTGGAAA TCATTGGCATCTACAGTGAACCGTCCATTGTATTCTGATTTTGAACAACTTTTTTTCCC CTCAGAACACACAGTAATAGCCAAGTATAACGACCTTACATGGCCAAAACAACAACCT TACATGGCCAAAATAGCCAGGTAAGGGACAGAAGAAGAGAGAGGGTTGCCCTGCGG CAGATGTGGACAATGACTGATGATGTGGCTGTCCCAGTTATCAAAACAGGCAAATCC ACTGTTCATGTGGCCNAAGCCAGTAATGAGCTGGTTTTGGGAAACCCTGGGGGATTG AGTAAACAATTAGAGGGTTATGTGGATTTGGTCATAGTTCGGGGTAGGAATTTGGAA ATTTCCCTTTTGCTTGATAATTATGTTAGTCAAGAGATTAGACAAGTATTGTTAGGAG TTTGTTTCAGCTGGTTGAGATTGGATTTGGTTTCTTAGGTGATTGGTTAGTGCTACCC TTG CTCTATAATTG G G G ATTTG CTTTTAATAAAG AAAG CAG AAATAAACCCAATCCTT CTCCGGTTCTCCCTCTTTTGTCCGATGTTTGCAGATGCGGCCACTGATAAGGTCCAGG TCCATGTCCTCCCATCAACCACACACACATACAGCCTAAGATCTAATTCACCCCAGGA CACCCAAGCTCGTGAAAATATACCATGTCATCCCACTATTCATACTTTTTTTAAAAAA ATCCCACTAATCCTGCAAATGTCCTAATATAAGAACAACATCATTTTCAGTCATGTTG TACCTTTTCTTGGTGACAAAAAGAAGACATCCATTTCATCTCTTTTTAAGGGGCATTT TCTC ATCG TTTCTG C AATTG AATATTCTTTC C CTG ATG TAATCTTTG AATG AATG CTAT TGTGATTTGCTCATTCTGTTAGGCTGTGCATTCTGGTGCTGATCTTGAGTCTGCTATA GCAACTTGCATGGGATACAAATCGGAGGTATCATTCTCATTCCTTTTCATTCCGCTAG AATTCTTTAGATACCTGTGCTCATATCTAATGAACTAACTTTTGGGTACAGGGTGAAG GTTTCATGGTCGGTGTTCAGATCAATCCAGTGAAGGGTTTGCCATCTGGATTTCCTGT AAAAATCCCTCACCTTCTTTTCTCAACACATGTACTTTCTAAGTTTCTTATACTTGTGA CATTTACCTTTATAGGAATTGCTCAAATTTGTGCTTGACCATGTTGAGGACAAGTCAG CGGAACCACTTCTTGAGGTCAGTGATATAATCGAAGTTCCTGTTTGTAATAAAACGAA GAGAAGAAGCTGGGTTTTTCATCACAACTCAAATAATCAGATCTCACATAGCTGATTG AATTrTTAAACC AC c ATTTTTTG CG G NTACTATG NG AATC ACTTG TTG CTAAC AAAAT GCTACCTTGNAGGGGNNGGTGGAAGCTCNAGTTGAACTCCNCCCTNNNCTTCNTGN TTCACCNGNACGCATGAAAGAANNTATTTTTTTGGNCATTGCNCCTGATTCNACTTT TANGACAGCTATNGAAAGGNCATATGANGAGCTCCNCCATGGANNCCCCGANGNTG GG CNC CC NAATATTG NCC C CATG ATNNG NNNNANG NNNAG NNC CNNNANNNNNN NCNNNNNNNNNNTNNNNNANANNNNGNNTNNNNNANNNNNNNNNNNNGNNNN NNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNN NANNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNC NNNNNNAANNNNNNNNNATNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA NNNNNNNNNNNNNNCNNCNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNANNNNCAACNN NNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNN NNNNNNNNNANNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNCNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNN ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN ANNNNNNNNNNNNNTNNANNNCNNNNANTANNCNNNNNNNNNTNNNNGNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGANNNNNNNNNNNNNNNNAGNNNTNNNANN NNNCNNNNNNNNNNG NNNTNNNNNNNNNNNNNG NNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNG NNNNNNTNNNNNNNNG NNNNNNNNCNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNACNNNNNNNNNNNNNTCNCNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG G CNTNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNCNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNTN NNNNNCNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGN NNNNNCNNNNNNNNNNNNCANNNCNNNNGNAGATCTCGGAGACTCAACTTCAGC AATCAAGTTCTCCG G ATG CAG AAG CTG G CC ATG CACTACCATCTATTTCATTG GTCAA TAAGAAGTTTCTTGGAAAATATGCAATATCAGCTGAAGAATTCTCTGAGGAAATGGTT AGTAATATAAAATTTTGCATTAGGAAATCTGCCATTCGTAAGGAAGTCTTGATGAAAC C AATTG TT ATT ATG CTG GTTTCCTTTTCTTTTG G CCTTGTG CTTCTAGTACTCACTTTT ATGTTTTCAGGTTGGGG CT AAG T CTC G G AAT ATAG C ATAC CTCAAAG G AAAAG T AC CT TCGTGGG TTG G TG TCC C AAC ATC AGTTG CG ATAC C ATTTG G C ACTTTTG AG AAG G TTT TATCAGATGGGCTTAATAAGGTTGGTTGGTGGTTTATTTTGATGTATATACTTGAATA ATAGAACTGCATGGTTCTTGGAGAAGTCAGATTCTTTAACATGTTTGAAATACACTAC TGGGAAGGTAACAACGTGCAATTTAATGTCCACCAATATCTAAACAGCCATTTTTGGC ATTCAATTCACTATATATTTTATTTCATGAGCCTGCTCTATAAGTAGCGTCTTCAGTAG TTGTAG CTCATAG CTTCATAGTCTCATTCTACCATG AACTAATTTTG CTAACTTACATC TACTCTTG AAATAAGTAATACTTG TATATTATTATCTTTG ATTG T AAAAG AACTTC C CT TG CTCGTTTGTCAAG GTGTCTTTTAG ACAGG AG ATG G AATTG ACTG TTATCAAAG CAA ATGATAACAAGAAACCTCTTGTTGATTGGTTGAGCAGTTTCAACTAATCCATTTTTTTT TCTTTTTGGCATGTGATCTTTGTATTATTGGCCCAAATGAAATTCTATTTCTCCCATTA ACCACCCACAATGGCAGGTTTGGGTACATATAGGCCAACCATGGGTAGGTGGCTTAA AAGTTG AGTAAAG CAT AATTG GGG AT AAG GTG CACATAG G CACGG ACCACCCACAG A CAAAGTGCTTGCAGGCACTACTAATACATTATTCTATCACCATCAGGATTCAATTCTA ACATGTACTGTTTCTTCTTTTTCTTCTTTGTACAGTTCCTGTATAGACCCTTTTGTACA GTTTCCTAACAAATGAAAAAGATCAGTAGGAGACCCTCTTCTCCTGTTCCACAAAAAA TGTTAAAATGGTCTTTCTAATATTTGATTGTTCTTTCTTTTATGGCAGGAAGAGCGCA AAACATAGAAAAGCTT [SEQ ID NO: 43]

Exemplo 8:

[00103] Supressão de mARNs de genes envolvidos na mobilização de amido vegetativo

[00104] Para se determinar se os vetores de ARNi descritos acima estavam exercendo um efeito sobre mARNs direcionados em plantas transgênicas, ARN foi isolado a partir de várias plantas de controle e transgênicas, e PCR com transcriptase reversa em tempo real (RT-PCR em tempo real) foi usada para medir as abundâncias relativas de espécies de mARN (FIGS. 10,11 e 12). Esses resultados confirmaram que ARNi pode ser usados para diminuir o nível de mARNs em arroz transgênico.

[00105] Referindo-se às FIGs. 10, 11 e 12, estas figures ilustram que vetores de ARNi suprimem a acumulação de mARNs direcionados em arroz transgênico. RT-PCR em tempo real foi empregada para medir a abundância de diferentes espécies de mARN em relação àquela de genes de referência ("genes de manutenção doméstica" que são expressos nominalmente de maneira constitutiva em arroz). Em várias das linhagens transgênicas, constatou-se que os níveis dos mARNs direcionados estão bem abaixo daqueles vistos entre as plantas de controle. FIG. 10, níveis de mARN de GWD entre plantas portando pAG2100 ou pAG2101 debilitados e controles de tipo selvagem (WT); FIG. 11, níveis de mARN de DSP entre plantas portando pAG2102 e controles WT; FIG. 12, níveis de mARN de ISA3 entre plantas portando pAG2103 e controles WT.

Exemplo 9:

[00106] Acumulação de amido entre plantas transgênicas

[00107] Foram coletados tecidos de plantas de controle, assim como de plantas de arroz e de grama de crescimento rápido, que portam cópias integradas dos transgenes de ARNi descritos acima. Esses tecidos foram, então, secados e moídos para formar um pó fino. O teor em amido desses tecidos foi, então, determinado por métodos padrão (Smith AM e Zeeman SC, Quantification of starch in plant tissues (2006) Nat. Protocols 1:1342- 1345, o qual é aqui incorporado por referência, como se fosse completamente apresentado). Referindo-se à FIG. 13, é mostrado o teor em amido elevado entre linhagens selecionadas de arroz e grama de crescimento rápido para aquelas linhagens que portam construtos de ARNi. Resultados a partir de Nipponbarre e Alamo (linhagens de controle não transformadas para arroz e grama de crescimento rápido, respectivamente) representam as médias a partir de várias plantas diferentes. Outros resultados representam dados replicados 2-3 vezes a partir de plantas transgênicas únicas. Plantas transgênicas são identificadas de acordo com o gene de mobilização de amido direcionado. Plantas OsGWD-1 portam o vetor com ARNi pAG2100; plantas OsGWD-2 portam pAG2101; plantas OsDSP portam pAG2102; plantas OslSA3 portam pAG2103; plantas PvGWD portam pAG2104, um vetor de expressão de ARNi, que se direciona de maneira específica a transcritos de GWD de grama de crescimento rápido que lembram as seqüências descritas acima (ver a FIG. 9). Conforme mostrado na FIG. 13, várias linhagens transgênicas de arroz e grama de crescimento rápido foram identificadas,, que acumulam amido acima dos níveis vistos entre plantas de controle. Nesses Exemplos, o amido se acumulou até níveis tão altos quanto 6 % entre linhagens de arroz transgênico, enquanto que se cumulou somente em 3 % no nível mais elevado das linhagens de controle. Em grama de crescimento rápido, a linhagem Alamo mais elevada acumulou cerca de 2 % de amido, enquanto que a linhagem transgênica mais elevada acumulou cerca de 3,5 % de amido em peso seco.

[00108] Referindo-se à FIG. 14, constatou-se que o teor em amido em várias plantas de arroz aproximadamente 5 semanas mais velhas do que aquelas retratadas na FIG. 13, era 2 a 3 vezes do que aquele observado em plantas mais jovens. A FIG. 14 ilustra o teor em amido em linhagens de arroz transgênicas, coletadas aproximadamente 19 semanas depois do plantio. A nomenclatura das plantas está na FIG. 13. Dentre essas, uma linhagem expressando ARNi, que se direciona a GWD, acumulou amido em até ~16 % em peso seco, enquanto que as linhagens de controle acumularam não mais do que ~8 % amido.

[00109] Portanto, entende-se que esta invenção não está limitada às modalidades particulares descritas, mas pretende-se que cobra todas as modificações que estejam dentro do espírito e do escopo da invenção, conforme definida pelas reivindicações apensas; pela descrição acima; e/ou mostrada nos desenhos anexos.

Claims (17)

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um construto de ARNi compreendendo: uma primeira sequência direcionadora do silenciamento consistindo essencialmente de um primeiro ácido nucléico isolado apresentando uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44; uma segunda sequência direcionadora do silenciamento consistindo essencialmente de um segundo ácido nucléico isolado complementar á primeira sequência de ácidos nucléicos isolada; um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira sequência direcionadora do silenciamento e a segunda sequência direcionadora do silenciamento; e um promotor ligado operavelmente à primeira sequência direcionadora do silenciamento, à segunda sequência direcionadora do silenciamento e ao espaçador; em que o primeiro ácido nucléico isolado é complementar a uma sequência num gene que codifica uma proteína envolvida na mobilização de amido e quando da expressão da primeira sequência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda sequência condutora numa planta hospedeira possuindo o gene, uma sequência de ARN transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado e uma sequência de ARN transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado hibridiza e causa inibição da expressão do gene na planta hospedeira e, desse modo, aumenta o amido vegetativo na planta hospedeira.

2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espaçador é um íntron ligado operavelmente à primeira sequência direcionadora do silenciamento e à segunda sequência direcionadora do silenciamento.

3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucléico é um complemento invertido da primeira sequência de ácidos nucléicos.

4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de arroz, uma planta de grama de crescimento rápido, uma planta de sorgo, uma planta de milho e uma planta de tomate.

5. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência direcionadora do silenciamento está à montante do e é contígua ao espaçador, e o espaçador está à montante da, e é contíguo à segunda sequência direcionadora do silenciamento.

6. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser o produto ou a progenia de transformação mediada por Agrobacterium utilizando um vetor apresentando o construto de ARNi.

7. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor apresenta uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 47.

8. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro ácido nucléico isolado apresenta a sequência de SEQ ID NO: 44 e o segundo ácido nucléico tem a sequência de SEQ ID NO: 46.

9. Vetor incluindo um construto de ARNi, de acordo reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o construto de ARNi compreende: uma primeira sequência direcionadora do silenciamento consistindo essencialmente de um primeiro ácido nucléico isolado apresentando uma sequência selecionada de um grupo consistindo de sequência selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, eSEQ ID NO: 37; uma segunda sequência direcionadora do silenciamento consistindo essencialmente de um segundo ácido nucléico isolado complementar com o primeiro ácido nucléico isolado; um espaçador ligado operavelmente às e entre a primeira sequência direcionadora do silenciamento e a segunda sequência direcionadora do silenciamento; e um promotor ligado operavelmente à primeira sequência motora, à segunda sequência motora e ao espaçador; em que o primeiro ácido nucléico isolado é complementar a uma sequência num gene que codifica uma proteína envolvida na mobilização de amido e quando da expressão da primeira sequência direcionadora do silenciamento, do espaçador e da segunda sequência condutora numa planta hospedeira possuindo o gene, uma sequência de ARN transcrita a partir do primeiro ácido nucléico isolado e uma sequência de ARN transcrita a partir do segundo ácido nucléico isolado hibridiza e causa inibição da expressão do gene na planta hospedeira e, desse modo, aumenta o amido vegetativo na planta hospedeira.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o espaçador é um íntron ligado operavelmente à primeira sequência direcionadora do silenciamento e à segunda sequência direcionadora do silenciamento.

11. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência direcionadora do silenciamento está à montante do e contígua ao espaçador, e o espaçador está à montante da, e contíguo à segunda sequência direcionadora do silenciamento.

12. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de apresentar uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 47.

13. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser um vetor intermediário.

14. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser um vetor de transformação.

15. Método de preparação de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de compreender a transformação de uma planta com o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta é uma selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de cultura de energia, uma planta de cultura de alimentos ou uma planta de cultura de forragem.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta é uma selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de arroz, uma planta de grama de crescimento rápido, uma planta de sorgo, uma planta de milho e uma planta de tomate.

Images