BR112014002611B1 - construção recombinante e métodos de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE E MÉTODO DE EXPRESSÃO DE UM POLINU-CLEOTÍDEO HETERÓLOGO EM UMA PLANTA A presente invenção descreve sequências polinucleotídica que podem ser utilizadas para regular a expressão gênica em plantas. São reveladas sequências terminadoras de Sorghum bicolor que são funcionais em plantas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA OS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/514.055, depositado em 2 de agosto de 2011, cujo conteúdo é integralmente incorporado ao presente pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular vegetal e da engenharia genética em plantas. Mais especificamente, refere-se a novas sequências terminadoras vegetais e a utilização destas para regular a expressão gênica em plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Recentes avanços na engenharia genética de plantas abriram novas portas para desenvolver plantas com características ou traços melhorados. Estas plantas transgênicas caracteristicamente possuem construções de DNA recombinante em seus genomas que tem uma região codificante de proteína operacionalmente ligada a diversas regiões reguladoras que permitem a expressão exata do transgene. Alguns exemplos de elementos reguladores que auxiliam na regulação da expressão gênica em plantas transgênicas são: promotores, íntrons, terminadores, facilitadores (enhancers) e silenciadores.

[004] A engenharia genética de plantas avançou com introdução de múltiplas características em plantas comercialmente importantes, abordagem também conhecida como piramidação de genes (gene stacking). Isto é conseguido pela transformação multigênica, onde diversos genes são transferidos para criar uma planta transgênica que pode expressar um fenótipo complexo, ou múltiplos fenótipos. Mas é importante modular ou controlar a expressão de cada transgene de maneira ótima. Os elementos de regulação (ou regulatórios) precisam ser diversificados para evitar a introdução de sequências repetitivas nas mesmas plantas transgênicas, o que têm sido correlacionado com efeitos negativos e indesejáveis sobre a expressão e a estabilidade do transgene (Peremarti et al (2010) Plant Mol Biol 73:363-378; Mette et al (1999) EMBO J 18:241 -248; Mette et al (2000) EMBO J. 19:51945201; Mourrain et al (2007) Planta 225:365-379, Patente US 7.632.982, Patente US 7.491.813 , Patente US 7.674.950, Pedido PCT US2009/046968). Por isso, é importante descobrir e caracterizar novos elementos reguladores que podem ser utilizados para expressar ácidos nucleicos heterólogos em espécies de cultivares importantes. Diversas regiões reguladoras podem ser utilizadas para controlar a expressão de cada transgene de maneira ótima.

[005] As sequências regulatórias localizadas a jusante das regiões codificantes contêm sinais necessários para a terminação da transcrição e processamento 3’ do mRNA, e são chamadas de sequências terminadoras ou simplesmente “terminadores”. As sequências terminadoras desempenham um papel fundamental no processamento, localização, estabilidade e tradução (Proudfoot, N. (2004) Curr. Op. Cell Biol. 16:272-278; Gilmartin, 2005). As sequências reguladoras a 3’ contidas em sequências terminadoras podem afetar o nível de expressão de um gene. A expressão ótima de um gene quimérico em células vegetais foi encontrada como sendo dependente da presença de sequências 3’ adequadas (Ingelbrecht, I.L.W et al. (1989) Plant Cell 1: 671 -680). A leitura de transcrição através de um terminador aberto (leaky terminator) de um gene pode provocar a transcrição indesejada de um transgene a partir de outro promotor. Além disso, a transcrição convergente, bidirecional, de transgenes em plantas transgênicas pode ocorrer devido à terminação aberta (leaky) da transcrição de genes convergentes separados ou a partir de promotores genômicos. A transcrição convergente, sobreposta pode diminuir a expressão do transgene ou gerar RNA antisense (Bieri, S. et al (2002) Molecular Breeding 10:107 - 117). Isto realça a importância de descobrir novos e eficientes terminadores da transcrição.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção refere-se às sequências regulatórias para modulação da expressão gênica em plantas. Especificamente, a presente invenção refere-se às sequências terminadoras. São fornecidas construções de DNA recombinante compreendendo sequências terminadoras.

[007] Um exemplo de realização da presente invenção é uma sequência de polinucleotídeo isolado compreendendo: (a) a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, (b) uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; ou (c) uma sequência compreendendo um fragmento funcional de (a) ou (b), em que as sequências de polinucleotídeo isolado funcionam como um terminador em uma célula vegetal. Outro exemplo de realização da presente invenção é uma construção recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo isolado compreendendo: (a) a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; (b) uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; ou (c) uma sequência compreendendo um fragmento funcional de (a) ou (b).

[008] em que as sequências de polinucleotídeo isolado funcionam como um terminador em uma célula vegetal. Esta construção recombinante pode compreender adicionalmente um promotor e um polinucleotídeo heterólogo, em que o promotor e o polinucleotídeo heterólogo estão operacionalmente ligados à sequência do polinucleotídeo isolado.

[009] Outro exemplo de realização da presente invenção é um método de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta, compreendendo as etapas de; (a) a introdução da construção de DNA recombinante descrita acima em uma célula vegetal regenerável; (b) a regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável de (a); e (c) a obtenção de uma planta descendente da planta transgênica da etapa (b); em que a planta transgênica e a planta descendente compreendem a construção de DNA recombinante e exibem a expressão do polinucleotídeo heterólogo.

[010] Em outro exemplo de realização, a presente invenção diz respeito a um vetor, vírus, células, micro-organismo, planta ou semente que compreende uma construção de DNA recombinante que compreende as sequências terminadoras descritas na presente invenção.

[011] A invenção abrange plantas transgênicas regeneradas, maduras e férteis compreendendo as construções de DNA recombinante descritas acima, as sementes transgênicas produzidas a partir delas, gerações T1 e as gerações subsequentes. As células vegetais transgênicas, tecidos e sementes podem compreender pelo menos uma construção de DNA recombinante de interesse.

[012] Em outro exemplo de realização, a planta ou semente compreendendo a sequência terminadora descrita na presente invenção é uma planta ou semente monocotiledônea. Em outro exemplo de realização, a planta ou semente compreendendo a sequência terminadora descrita na presente invenção é uma planta ou semente de milho.

[013] Em outro exemplo de realização, em qualquer um dos métodos de expressão de um polinucleotídeo heterólogo a célula vegetal é uma célula vegetal de monocotiledônea, por exemplo, uma célula vegetal de milho.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[014] A presente invenção pode ser mais bem compreendida a partir da seguinte descrição detalhada e das Figuras e Listagem de Sequências anexas, que fazem parte do presente pedido. As Listas de Sequências contém o código de uma letra para caracteres da sequência de nucleotídeos e código de três letras para aminoácidos, tal como definido em conformidade com as normas da IUPAC-IUBMB descritas em Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) e em Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984), que são integralmente incorporadas ao presente pela referência. Os símbolos e formatos utilizados para os dados de sequências de nucleotídeos e aminoácidos obedecem as regras estabelecidas no Título 37 do CFR § 1,822.

[015] A Figura 1 mostra o mapa do PHP31801, o vetor utilizado para a clonagem do terminador SB-GKAF após a amplificação.

[016] A Figura 2 mostra o mapa do PHP34074, o vetor utilizado para testar o terminador SB-GKAF.

[017] A Figura 3 mostra os resultados dos testes do terminador SB-GKAF em comparação com o terminador PIN 11 em ensaios transitórios. Ela mostra a análise quantitativa da expressão do gene repórter GUS nas células BMS transformadas com PHP34074 (terminador SB-GKAF) e PHP34005 (terminador PIN 11).

[018] A Figura 4A e Figura 4B mostram a análise quantitativa da expressão do gene repórter GUS em linhagens de milho derivadas da Gaspe Flint estavelmente transformadas com as construções com terminadores SB- GKAF (PHP34074) e PINII (PHP34005). Fig. 4A mostra a expressão do gene repórter GUS avaliada ao nível de proteína, e a Fig.4B mostra a expressão do gene repórter GUS avaliada por qRT-PCR.

[019] A Figura 5 mostra os resultados de ensaios de qRT-PCR em linhagens de milho derivadas da Gaspe Flint estavelmente transformadas, utilizando dois conjuntos de primers a jusante do terminador SB-GKAF e do terminador PINII.

[020] As Figuras 6A - 6C mostram o alinhamento entre o terminador SB-GKAF clonado (SEQ ID NO: 1) e os nucleotídeos 1863-2322 do NCBI Gl NO: 671655 (SEQ ID NO: 18). A sequência de consenso é exibida no topo, e os resíduos que correspondem exatamente ao consenso estão dentro de caixas.

[021] SEQ ID NO:1 é a sequência de 459 bp do terminador SB- GKAF.

[022] SEQ ID NO: 2 e 3 são as sequências de primers direto (forward) e reverso (reverse) utilizadas para amplificar o terminador SB-GKAF.

[023] SEQ ID NO: 4 é a sequência de nucleotídeos do PHP31801, o vetor utilizado para a clonagem do terminador SB-GKAF após a amplificação por PCR.

[024] SEQ ID NO: 5 é a sequência de nucleotídeos do PHP34074, o vetor utilizado para testar o terminador SB-GKAF.

[025] SEQ ID NO: 6 é a sequência de nucleotídeos do PHP34005, o vetor de ensaio utilizado como controle com um terminador PINII.

[026] SEQ ID NOS :7-9 são as sequências do primer direto, primer reverso e da sonda utilizada para a avaliação da expressão de GUS por qRT-PCR em plantas de milho transgênicas, tal como descrito na Tabela 2.

[027] SEQ ID NOS :10-17 são as sequências dos primers utilizados para quantificar a leitura da transcrição através dos terminadores SB- GKAF e PINII por qRT-PCR em plantas de milho transgênicas, tal como descrito na Tabela 3.

[028] SEQ ID NO: 18 corresponde aos nucleotídeos 1863 a 2322 do NCBI Gl NO: 671655.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] A divulgação de cada referência aqui contida é integralmente incorporada ao presente pela referência.

[030] Como utilizado no presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um/uma” e “o/a” incluem a referência ao plural, a menos que o contexto expresse claramente de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a “uma planta” inclui uma pluralidade de tais plantas, a referência a “uma célula” inclui uma ou mais células e equivalentes destas conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto, e assim por diante.

[031] Conforme Utilizado no Presente: Os termos “monocot”, “monocotiledôneas” e “plantas monocotiledôneas” são utilizados de maneira indiferenciada na presente invenção. Uma monocotiledônea da presente invenção inclui Gramineae.

[032] Os termos “dicot” e “plantas dicotiledôneas” são utilizados de maneira indiferenciada na presente invenção. Uma dicotiledônea da presente invenção inclui as seguintes familias: Brassicaceae, Leguminosae e Solanaceae.

[033] Os termos “complemento total” e “complemento de comprimento total” são usados de maneira indiferenciada na presente invenção e referem-se a um complemento de uma dada sequência de nucleotídeos, em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

[034] “Transgênico” refere-se a qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de plantas ou plantas, cujo genoma foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo, tal como uma construção de DNA recombinante, incluindo os eventos transgênicos iniciais, bem como aqueles criados pelo cruzamento sexuado ou propagação assexuada a partir do evento transgênico inicial. O termo “transgênico”, da forma com é utilizado no presente, não abrange a alteração do genoma (cromossômica ou extracromossômica) por métodos convencionais de melhoramento de plantas que ocorrem naturalmente ou por eventos tal como a fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[035] O termo “genoma”, da forma com é utilizado na presente invenção se aplica a células vegetais e abrange não só o DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, como também o DNA de organelas encontradas dentro de componentes subcelulares (por exemplo, mitocôndria, plastídeo) da célula.

[036] “Planta” faz referência a plantas inteiras, órgãos de plantas, tecidos vegetais, propágulos de plantas, sementes, células vegetais e progênies das mesmas. As células vegetais incluem, sem se limitar a; células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calos, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

[037] “Propágulo” inclui todos os produtos da meiose e mitose capazes de propagar uma nova planta, incluindo, mas não se limitando a, sementes, esporos e partes de uma planta que sirva como um meio de propagação vegetativa, tais como cormos ou estolhos, tubérculos, offsets ou runners. O propágulo também inclui enxertos onde uma porção de uma planta é enxertado para outra porção de uma planta diferente (até mesmo uma planta de espécie diferente) para criar um organismo vivente. O propágulo também inclui todas as plantas e sementes produzidas pela clonagem ou por reunir produtos da meiose, ou por permitir que os produtos da meiose se juntem para formar um embrião ou óvulo fertilizado (de maneira naturalmente ou com a intervenção humana).

[038] “Progênie” compreende toda a geração subsequente de uma planta.

[039] Uma “planta transgênica” faz referência a uma planta que contém no seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Por exemplo, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de maneira estável no genoma, de modo que o polinucleotídeo é transmitido para as gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode estar integrado apenas no genoma ou como parte de uma construção de DNA recombinante.

[040] O desenvolvimento comercial de germoplasmas geneticamente melhorados também avançou para a fase de introdução de múltiplas características em plantas de cultivo, muitas vezes referido como uma abordagem piramidação de genes (gene stacking). Nesta abordagem, múltiplos genes que conferem diferentes características de interesse podem ser introduzidos em uma planta. A piramidação de genes (gene stacking) pode ser realizada por diversos meios, incluindo, mas não se limitando a cotransformação, retransformação, e cruzamento de linhagens com diferentes transgenes.

[041] “Planta transgênica” inclui também plantas que compreendem mais do que um polinucleotídeo heterólogo em seus genomas. Cada polinucleotídeo heterólogo pode conferir uma característica diferente para a planta transgênica.

[042] “Heterólogo” com relação a sequência, significa que a sequência é originada de uma espécie diferente, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada em relação a forma nativa em sua composição e/ou locusgenômico pela intervenção humana intencional.

[043] “Polinucleotídeo”, “sequência de ácido nucleico”, “sequência nucleotídica” ou “fragmento de ácido nucleico” são utilizados de maneira intercambiável para se referirem a um polímero de RNA ou DNA que pode ser de fita simples ou dupla-fita, contendo opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Os nucleotídeos (geralmente encontrados na forma 5'-monofosfato) são referidos pela sua designação de uma letra da seguinte forma: “A” para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou deoxicitidilato, “G” para guanilato ou deoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para deoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para o G ou T, “H” para A ou C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.

[044] “Polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” são utilizados de maneira intercambiável no presente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos também são aplicáveis aos polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo químico artificial de um aminoácido natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Para os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” estão também inclusas modificações que incluem e não se limitam a, glicosilação, ligação lipídica, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[045] “RNA mensageiro (mRNA)” refere-se ao RNA, que está sem os íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula.

[046] “cDNA” refere-se a um DNA que é complementar e é sintetizado a partir de um mRNA molde usando a enzima transcriptase reversa. O cDNA pode ser de fita simples ou convertido na forma de dupla-fita utilizando fragmentos Klenow da DNA polimerase I.

[047] “Região codificante” refere-se à porção de um RNA mensageiro (ou a porção correspondente de uma outra molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de DNA) que codifica uma proteína ou polipeptídeo. “Região não codificante” refere-se a todas as partes de um RNA mensageiro ou outra molécula de ácido nucleico que não são a de uma região codificante, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, região promotora, região 5’ não traduzida (“UTR”), 3’ UTR, íntron e terminador. Os termos “região codificante” e “sequência codificante” são utilizados no presente como sinônimos. Os termos “região não codificante” e “sequência não codificante” são utilizados no presente como sinônimos.

[048] Uma “Etiqueta de Sequência Expressa” (“EST”) é uma sequência de DNA derivada de uma biblioteca de cDNA e, portanto, é uma sequência que foi transcrita. Uma EST é geralmente obtida por uma única passagem de sequenciamento de uma inserção de cDNA. A sequência de inserção do cDNA inteira é denominada de “Sequência de Inserção Completa” (FIS - Full-Insert Sequence). Uma sequência “Contig” é uma sequência construída a partir de duas ou mais sequências que podem ser selecionadas, mas não limitadas a partir do grupo que consiste de uma sequência EST, FIS e de PCR. Uma sequência que codifica uma proteína inteira ou proteína funcional é denominada de “Sequência Gênica Completa” (CGS) e pode ser derivada de uma FIS ou uma contig.

[049] Uma proteína “madura” refere-se a um polipeptídeo processado pós-traducionalmente, ou seja, aquele no qual foi removido qualquer pré- ou pró-peptídeo presente no produto primário de tradução.

[050] Proteína “precursora” refere-se ao produto primário da tradução do mRNA, ou seja, com pré- e pró-peptídeos ainda presentes. Pré- e pró-peptídeos podem ser e não estão limitados a sinais de localização intracelular.

[051] “Isolado” refere-se a materiais, tais como moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas, que são substancialmente isentos ou removidos a partir de componentes que normalmente acompanham ou interagem com tais materiais em um ambiente natural. Polinucleotídeos isolados podem ser purificados a partir de uma célula hospedeira na qual eles ocorrem naturalmente. Podem ser utilizados métodos convencionais de purificação de ácidos nucleicos conhecidos pelos técnicos do assunto para a obtenção de polinucleotídeos isolados. O termo também abrange polinucleotídeos recombinantes e polinucleotídeos sintetizados quimicamente.

[052] O termo “recombinante” refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos separados de uma sequência de outra forma, por exemplo, pela síntese química ou pela manipulação de segmentos de ácidos nucleicos isolados através de técnicas de engenharia genética.

[053] “Recombinante” faz também a referência a uma célula ou um vetor, que foi modificado pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou célula derivada de uma célula assim modificada, mas não abrange a alteração da célula ou vetor por eventos naturais (por exemplo, mutação espontânea, transdução/transformação/transposição natural), bem como aqueles que ocorrem sem a intervenção humana deliberada.

[054] “Construção de DNA recombinante” refere-se a uma combinação de fragmentos de ácido nucleico que normalmente não são encontrados juntos na natureza. Consequentemente, uma construção de DNA recombinante pode conter sequências reguladoras e sequências codificantes que são provenientes de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma origem, mas dispostas de maneira diferente daquela que é normalmente encontrada na natureza. Os termos “construção de DNA recombinante” e “construção recombinante” são utilizados na presente invenção de maneira alternada.

[055] Os termos “clone de entrada” e “vetor de entrada” são utilizados no presente de maneira alternada.

[056] “Sequências regulatórias” ou “elementos regulatórios” são utilizados de maneira intercambiável e referem-se a sequências de nucleotídeos, localizadas a montante (sequencias não codificadoras 5'), dentro, ou a jusante (sequencias não codificadoras 3') de uma sequência codificadora, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências “reguladoras” ou “regulatórias” podem incluir e não estão limitadas a, promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação. Os termos “sequência regulatória” e “elemento regulador” são utilizados no presente como sinônimos.

[057] “Promotor” refere-se a um fragmento de ácido nucleico capaz de controlar a transcrição de outro fragmento de ácido nucleico.

[058] “Promotor funcional em uma planta” é um promotor capaz de controlar a transcrição em células vegetais, sendo este promotor proveniente ou não de uma célula vegetal.

[059] As expressões “promotor tecido-específico” e “promotor tecido-preferido” são utilizadas de maneira intercambiável para se referirem a um promotor que é expresso predominantemente, mas não necessariamente de maneira exclusiva em um tecido ou órgão e que também pode ser expresso em uma célula específica.

[060] “Promotor regulado pelo desenvolvimento” refere-se a um promotor, cuja atividade é determinada por eventos de desenvolvimento.

[061] Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares são na maioria das vezes comumente referidos como “promotores constitutivos”.

[062] Promotores induzíveis expressam seletivamente uma sequência de DNA operacionalmente ligada em resposta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, por exemplo, compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou do desenvolvimento. Exemplos de promotores induzíveis ou regulados incluem, mas não estão limitados aos promotores regulados por luz, calor, estresse, cheias (inundação) ou secas, patógenos, fitormônios, ferimentos ou produtos químicos, tal como o etanol, jasmonato, ácido salicílico ou compostos protetores.

[063] “Sequências facilitadoras (enhancers)” referem-se às sequências que pode aumentar a expressão do gene. Estas sequências podem estar localizadas a montante, dentro de íntrons ou a jusante da região transcrita. A região transcrita é constituída pelos éxons e íntrons intervenientes, do promotor para a região de término da transcrição. O aumento da expressão do gene pode ser por meio de vários mecanismos, que incluem, mas não estão limitados a, o aumento da eficiência de transcrição, estabilização do mRNA maduro e aumento da tradução.

[064] Um “íntron” é uma sequência de intervenção em um gene que é transcrita em RNA e, em seguida, retirada no processo de geração do mRNA maduro. O termo é também usado para as sequências de RNA excisadas. Um “éxon” é uma porção da sequência de um gene que é transcrita e é encontrada no RNA mensageiro maduro derivado do gene, e não é necessariamente uma parte da sequência codificante do produto final do gene.

[065] O termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação de fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de forma que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado com um fragmento de ácido nucleico quando este é capaz de afetar a expressão daquele fragmento de ácido nucleico.

[066] “Expressão” refere-se à produção de um produto funcional. Por exemplo, expressão de um fragmento de ácido nucleico pode referir-se à transcrição do fragmento de ácido nucleico (por exemplo, transcrição resultando em um mRNA ou RNA funcional) e/ou tradução do mRNA em uma proteína precursora ou madura.

[067] “Superexpressão” refere-se à produção de um produto gênico em organismos transgênicos que excede os níveis de produção em um organismo segregante nulo (não transgênico) a partir do mesmo experimento.

[068] “Fenótipo” quer dizer as características detectáveis de uma célula ou organismo.

[069] O termo “cruzado” ou “cruzar” significa a fusão de gametas através da polinização para produzir descendentes (por exemplo, células, sementes ou plantas). O termo abrange tanto os cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) como a autofecundação (autopolinização, por exemplo, quando o pólen e óvulo são da mesma planta). O termo “cruzamento” refere-se ao ato da fusão dos gametas por meio da polinização para produzir descendentes.

[070] Um “alelo favorável” é o alelo em um locusespecífico que confere ou contribui para um fenótipo desejável, por exemplo, aumento da digestibilidade da parede celular, ou alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas com a digestibilidade da parede celular diminuída que pode ser removida a partir de um programa de melhoramento ou plantio (“contraseleção”). Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável, ou, alternativamente, segrega com o fenótipo desfavorável da planta, proporcionando dessa forma a vantagem de identificar plantas.

[071] O termo “introduzido” significa fornecer um ácido nucleico (por exemplo, construção de expressão) ou proteína em uma célula. Introduzido inclui referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula, e faz referência ao fornecimento transitório de um ácido nucleico ou proteína para a célula. Introduzido inclui a referência aos métodos de transformação estáveis ou transitórios, bem como troca sexuada de material genético. Desse modo, o termo “introduzido” no contexto de inserção de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, uma construção de DNA recombinante/construção de expressão) em uma célula, significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e se refere à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, em que o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula (por exemplo, ao DNA cromossômico, plasmidial, plastidial ou mitocondrial), convertido em um repliconautônomo ou expresso de maneira transitória (por exemplo, o transfectado com mRNA ).

[072] “Construção de supressão de DNA” é uma construção de DNA recombinante que quando transformada ou integrada de maneira estável no genoma da planta, resulta no “silenciamento” de um gene-alvo na planta. O gene alvo pode ser endógeno ou transgênico para a planta. O termo “silenciamento” da forma com é utilizado na presente invenção, refere-se, de maneira geral, à supressão dos níveis de mRNA ou proteína/enzima expressa pelo gene-alvo, e/ou o nível da atividade enzimática ou funcionalidade proteica. Os termos “supressão”, “suprimindo” e “silenciamento” são utilizados de maneira intercambiável no presente, e incluem a diminuição, redução, declínio, decréscimo, inibição, eliminação ou prevenção. As expressões “silenciamento” ou “silenciamento gênico” não especifica o mecanismo e inclui, não se limitando a, antisense, cosupressão, supressão viral, supressão de grampo (hairpin), supressão de stem-loop, abordagens baseadas em RNAi, e abordagens baseadas em RNA pequeno.

[073] Técnicas-padrão de DNA recombinante e de clonagem molecular utilizadas na presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e estão descritas mais detalhadamente em Sambrook, J., Fritsch, EF, e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1989 (indicado a seguir como “Sambrook”).

[074] Os termos “terminador da transcrição”, “sequências terminadoras” ou apenas “terminador” referem-se às sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificante e inclui uma sequência de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificantes de sinais reguladores capazes de afetar o processamento do mRNA ou a expressão gênica. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de traços de ácido poliadenílico na extremidade 3’ do mRNA precursor. A utilização de diferentes sequências não codificantes 3’ é exemplificada por Ingelbrecht I. L. et al. Plant Cell 1:671-680 (1989). Uma sequência de polinucleotídeo com “atividade terminadora” refere-se a uma sequência polinucleotídica que, quando operacionalmente ligada à extremidade 3' de uma segunda sequência de polinucleotídeo que está sendo expressa, é capaz de terminar a transcrição a partir da segunda sequência polinucleotídica. A terminação da transcrição é o processo pelo qual a síntese de RNA pela RNA polimerase é interrompida e tanto o RNA quanto a enzima são liberadas a partir do DNA molde.

[075] A terminação inadequada de um RNA transcrito pode afetar a estabilidade do RNA, e, portanto, afetar a expressão da proteína. A variabilidade de expressão do transgene é por vezes atribuída a variabilidade da eficiência da terminação (Bieri et al (2002) Molecular Breeding 10: 107-117).

[076] O termos “terminador SB-GKAF”, “terminador GKAF” e “terminador gama-kafirina” são utilizados de maneira indiferente na presente invenção, e cada uma se refere à sequência da “região 3'não traduzida” (3’ UTR) do gene gama-kafirina de Sorghum bicolor com cerca de 300 bp de sequência a jusante a partir da 3' UTR. A sequência do terminador SB-GKAF é dada na SEQ ID NO: 1. O gene da gama-kafirina de Sorghum bicolor codifica uma proteína gama-prolamina, e a sequência para este gene é dada no NCBI Gl NO: 671655. As prolaminas são as principais proteínas de armazenamento de muitos cereais. A gama-Kafirina de sorgo, que é a Y-prolamina de sorgo, constitui cerca de 2-5% do total de prolamina no endosperma do sorgo, e é composta por um único polipeptídeo de 27 kDa (de Freitas F.A. et al (1994) Mol Gen Genetics 245 (2) :177-86).

[077] A presente invenção abrange os fragmentos e variantes funcionais das sequências terminadoras descritas na presente invenção.

[078] Um “fragmento funcional” do terminador é definido como qualquer subconjunto de nucleotídeos contíguos da sequência terminadora divulgada na presente invenção, que pode desempenhar a mesma função, ou uma função substancialmente semelhante à função da sequência terminadora de comprimento total divulgada na presente invenção. Um “fragmento funcional” com uma função substancialmente semelhante a do terminador de comprimento total divulgado na presente invenção refere-se a um fragmento funcional que retém a capacidade de terminar a transcrição em grande parte no mesmo nível que a sequência terminadora de comprimento total. Uma construção recombinante compreendendo um polinucleotídeo heterólogo operacionalmente ligado a um “fragmento funcional” de uma sequência terminadora divulgada na presente invenção apresenta níveis de expressão do polinucleotídeo heterólogo substancialmente semelhantes a uma construção recombinante correspondente que compreende um polinucleotídeo heterólogo operacionalmente ligado à sequência terminadora de comprimento total. Um “variante” conforme utilizado na presente invenção, é a sequência terminadora ou sequência de um fragmento funcional de um terminador contendo alterações, em que um ou mais nucleotídeos da sequência original são deletados, adicionados e/ou substituídos, enquanto mantém substancialmente a função terminadora. Um ou mais pares de bases podem ser inseridos, deletados ou substituídos internamente ao terminador, sem afetar a sua atividade. Os fragmentos e variantes podem ser obtidos por meio de métodos como mutagênese sítio-dirigida e construção sintética.

[079] Estes fragmentos funcionais terminadores podem compreender, pelo menos, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 ou 450 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos terminadora particular divulgada na presente invenção. Tais fragmentos podem ser obtidos pela utilização de enzimas de restrição para clivar a sequência de nucleotídeos terminadora de ocorrência natural divulgada; pela síntese de uma sequência de nucleotídeos a partir da sequência de DNA terminadora de ocorrência natural, ou pode ser obtida pelo uso da tecnologia PCR. Vide, especificamente, Mullis et al., Methods Enzymol. 155:335-350 (1987), e Higuchi, R. Em “PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplifications; Erlich, H. A., Ed.; Stockton Press Inc. Nova Iorque, 1989. Mais uma vez as variantes destes fragmentos terminadores, tais como aquelas resultantes da mutagênese sítio-dirigida, são englobadas pelas composições da presente invenção.

[080] Os termos “substancialmente similar” e “substancialmente correspondente” conforme utilizados na presente invenção referem-se a fragmentos de ácidos nucleicos, em particular, sequências terminadoras, em que as alterações em uma ou mais bases nucleotídicas não alteram substancialmente a capacidade do terminador de parar a transcrição. Estes termos também se referem a modificações, incluindo deleções e variantes, das sequências de ácido nucleico da presente invenção, obtidas por meio da deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais da sequência terminadora resultante em relação ao terminador não modificado. Fica deste modo compreendido, assim como os técnicos hábeis no assunto compreenderão, que a invenção abrange mais do que as sequências exemplares específicas.

[081] Como será evidente para um técnico hábil no assunto, qualquer polinucleotídeo heterólogo de interesse pode ser operacionalmente ligado às sequências terminadoras descritas na presente invenção. Exemplos de polinucleotídeos de interesse que podem ser operacionalmente ligados às sequências terminadoras descritas na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos compreendendo elementos reguladores, tais como íntrons, facilitadores (enhancers), promotores, sequências líderes de tradução, regiões codificantes de proteínas como de genes de resistência às doenças e insetos, genes que conferem valor nutritivo, genes que conferem aumento do rendimento e heterose, genes que conferem esterilidade em macho e/ou fêmea, genes antifúngicos, antibacterianos ou antivirais e similares. Do mesmo modo, as sequências terminadoras descritas na presente invenção podem ser utilizadas para terminar a transcrição de qualquer ácido nucleico que controla a expressão gênica. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser utilizados para controlar a expressão gênica incluem, mas não se limitam a, oligonucleotídeos antisense, construções de DNA de supressão ou ácidos nucleicos que codificam fatores de transcrição.

[082] A construção de DNA recombinante (incluindo a construção de DNA de supressão) da presente invenção pode compreender pelo menos uma sequência reguladora. Em um exemplo de realização da presente invenção, as sequências reguladoras divulgadas na presente invenção podem estar operacionalmente ligadas a qualquer outra sequência reguladora.

[083] Uma variedade de promotores pode ser utilizada nas construções de DNA recombinante da presente invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado, e podem incluir promotores constitutivos, tecido-específicos, induzível ou outros promotores para a expressão em um organismo hospedeiro.

[084] Os termos “PCR em tempo real”, “PCR quantitativa”, “ PCR quantitativa em tempo real” e “qPCR” são usados na presente invenção de maneira alternada e representam uma variação da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão utilizada para quantificar DNA ou RNA em uma amostra. Utilizando primers sequência-específicos e uma sonda, o número relativo ou de cópias de uma sequência de DNA ou RNA específica é determinado. O termo relativo é utilizado uma vez que esta técnica compara os números de cópias relativas entre diferentes genes com relação a um gene de referência específico. A quantificação decorre pela medição da quantidade de produto amplificado em cada ciclo durante o processo da PCR. A quantificação do produto amplificado é obtida utilizando sondas de hidrólise fluorescente que medem o aumento da fluorescência em cada ciclo da PCR subsequente. O Ct (limiar de ciclo) é definido como o número de ciclos necessários para o sinal de fluorescência cruzar o limiar (ou seja, exceder o nível de fundo). DNA/RNA a partir de genes com números de cópias mais elevados aparecerão após poucos ciclos da PCR, assim quanto menor o valor Ct, mais cópias estão presentes na amostra específica. Para quantificar o RNA, a qPCR ou PCR em tempo real é precedida pela etapa de transcrição reversa do mRNA em cDNA. Isto é referido na presente invenção como “RT-PCR em tempo real” ou “RT- PCR quantitativa” ou “qRT-PCR”.

[085] O método Taqman de quantificação produto da PCR utiliza uma sonda repórter fluorescente. Este método é mais preciso uma vez que a sonda foi projetada para ser sequência-específica e só irá se ligar ao produto específico da PCR. A especificidade da sonda permite a quantificação, mesmo na presença de amplificação de DNA não específico. Isto permite a multiplexagem, que quantifica vários genes no mesmo tubo, utilizando sondas com diferentes espectros de emissão. A quebra da sonda pela atividade de exonuclease de 5' para 3' da Taq polimerase remove o inibidor da fluorescência (quencher) e permite que o produto da PCR seja detectado.

[086] Quando representados em uma escala linear, o aumento de emissão de fluorescência com o número de ciclos da PCR tem uma forma sigmoidal com uma fase exponencial e uma fase de platô. A fase de platô é determinada pela quantidade de primer na mistura principal (master mix) ao invés do molde nucleotídico. Normalmente, a escala vertical é traçada de forma logarítmica, permitindo a intersecção do gráfico com o limiar que é linear e mais facilmente visualizado. Teoricamente, a quantidade de DNA duplica a cada ciclo durante a fase exponencial, mas esta é afetada pela eficiência dos primers utilizados. Um controle positivo utilizando um gene de referência, por exemplo, um gene constitutivo para controle interno (gene housekeeping), que é relativamente abundante em todos os tipos de células também é realizado para permitir comparações entre amostras. A quantidade de DNA/RNA é determinada comparando os resultados em uma curva padrão produzida por diluições seriadas de concentrações conhecidas de DNA/RNA.

[087] A presente invenção inclui um polinucleotídeo que compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100 % de identidade de sequência, com base no método de alinhamento Clustal V (ou Clustal W), quando comparada com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; ou (ii) uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, com base no método de alinhamento Clustal V (ou Clustal W), quando comparada com um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; ou (iii) um complemento total da sequência de ácido nucleico de (i) ou (ii), em que o polinucleotídeo age como um terminador em uma célula vegetal.

[088] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de percentagem de identidade podem ser determinados usando uma variedade de métodos de comparação, criados para detectar sequências homólogas incluindo, mas não se limitando ao programa Megalign®, da suíte de programas LASERGENE®bioinformatics computing suite (DNASTAR® Inc., Madison, Wl). Salvo se indicado de outra forma, os alinhamentos múltiplos das sequências contidas na presente invenção foram realizados utilizando o método de alinhamento Clustal V (Higgins e Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153) com parâmetros predefinidos (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Os parâmetros predefinidos para os alinhamentos em pares e o cálculo da percentagem de identidade das sequências proteicas utilizando o método Clustal V são: KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos estes parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências, utilizando o programa Clustal V, é possível obter uma “percentagem de identidade” e valores de “divergências”, visualizando a tabela “distâncias das sequências” no mesmo programa; A menos que especificado de outra forma, a percentagem de identidade e as divergências fornecidas e reivindicadas no presente foram calculadas desta forma.

[089] Alternativamente, pode ser utilizado o método de alinhamento Clustal W. O “método de alinhamento Clustal W” (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989), Higgins, DG et al. Comput. Appl. Biosci 8:189-191 (1992)) pode ser encontrado no programa MegAlign® V6.1 da suíte de programas LASERGENE® bioinformatics computing (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os parâmetros-padrão para o alinhamento múltiplo correspondem a: GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB. Para alinhamentos em pares os parâmetros-padrão são: Alignment=Slow-Accurate, Gap Penalty=10.0, Gap Length=0.10, Protein Weight Matrix=Gonnet 250 e DNA Weight Matrix=IUB. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal W, é possível obter uma “percentagem de identidade” (percent identity) e “divergência” (divergence) pela visualização da tabela “distâncias de sequência” (sequence distances) no mesmo programa.

[090] Exemplos de realização da invenção incluem: A presente invenção está relacionada às sequências terminadoras. São fornecidas construções de DNA recombinante compreendendo sequências terminadoras.

[091] Um exemplo de realização da presente invenção é uma sequência de polinucleotídeo isolado compreendendo (a) a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; (b) uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; ou (c) uma sequência compreendendo um fragmento funcional de (a) ou (b), em que a sequência de polinucleotídeo isolado funciona como um terminador em uma célula vegetal. Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma construção de DNA recombinante que compreende um promotor, pelo menos, um fragmento de ácido nucleico heterólogo, e qualquer terminador, ou combinação de elementos terminadores da presente invenção, em que o promotor, pelo menos um fragmento de ácido nucleico heterólogo, e o(s) terminador(es) estão operacionalmente ligados.

[092] Em outro exemplo de realização, um fragmento funcional pode compreender, pelo menos, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175 ou 150 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18 .

[093] As construções de DNA recombinante podem ser construídas pela ligação de modo operacional do fragmento de ácido nucleico da presente invenção, da sequência terminadora apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 18, ou fragmento funcional da sequência nucleotídica descrita na SEQ ID NO: 1 ou 18, a um fragmento de ácido nucleico heterólogo.

[094] Outro exemplo de realização é um método para transformação de uma célula (ou micro-organismo), que compreende a transformação de uma célula (ou micro-organismos) com qualquer um dos polinucleotídeos isolados ou construções de DNA recombinante da presente invenção. A célula (ou micro-organismo) transformada por este método também está incluída. Em um exemplo de realização específico, a célula pode ser eucariótica, por exemplo, uma levedura ou célula vegetal, ou de inseto, ou procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana. O micro-organismo pode ser o Agrobacterium, por exemplo, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.

[095] Outro exemplo de realização da presente invenção é um método de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta, compreendendo as etapas de introduzir a construção de DNA recombinante descrita acima em uma célula vegetal regenerável e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável transformada, em que a planta compreende a construção de DNA recombinante e exibe a expressão do polinucleotídeo heterólogo.

[096] Outro exemplo de realização da presente invenção é um método de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta, compreendendo as etapas de introdução da construção de DNA recombinante descrita acima em uma célula vegetal regenerável; a regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável descrita acima; e a obtenção de uma planta descendente da planta transgênica, em que a planta transgênica e a planta descendente compreendem a construção de DNA recombinante e exibem a expressão do polinucleotídeo heterólogo.

[097] Em outro exemplo de realização, qualquer um dos métodos de expressão de um polinucleotídeo heterólogo a célula vegetal é uma célula vegetal de monocotiledônea ou dicotiledônea, por exemplo, uma célula vegetal de milho ou soja. A célula vegetal pode ser também de girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milho painço, cana de açúcar ou switchgrass.

[098] Em outro exemplo de realização, a presente invenção diz respeito a um vetor, vírus, células, micro-organismo, planta ou semente que compreende uma construção de DNA recombinante que compreende as sequências terminadoras descritas na presente invenção.

[099] A invenção abrange plantas transgênicas regeneradas, maduras e férteis compreendendo as construções de DNA recombinante descritas acima, as sementes transgênicas produzidas a partir delas, gerações T1 e as gerações subsequentes. As células vegetais transgênicas, tecidos e sementes podem compreender pelo menos uma construção de DNA recombinante de interesse.

[0100] Em um exemplo de realização, a planta (ou sementes derivadas da planta) que compreende as sequências terminadoras descritas na presente invenção é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, por exemplo, uma planta de milho ou de soja. A célula vegetal também pode ser de girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milho painço, cana de açúcar ou switchgrass. A planta pode ser uma planta de linhagem pura ou uma planta híbrida.

EXEMPLOS

[0101] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a seguir, nos quais as partes e percentagens estão expressas em peso e graus Celsius, salvo quando indicado de outra forma. Deve ser compreendido que estes Exemplos, embora indicando exemplos de realizações da presente invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um técnico hábil no assunto pode determinar as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do espírito e do escopo da presente invenção, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la aos diversos usos e condições. Além disso, várias modificações da invenção além daquelas exibidas e descritas no presente serão evidentes para os técnicos do assunto a partir das descrições anteriormente expostas. Tais modificações visam também serem abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1 AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM DE UMA SEQUÊNCIA TERMINADORA DA GAMA-KAFIRINA DE SORGHUM BICOLOR

[0102] Os primers (SEQ ID NOS: 2 e 3) foram desenhados para amplificar o terminador do gene da gama-Kafirina de Sorghum bicolor (SB- GKAF) com base no banco de dados de sequência genômica do Sorghum bicolor. As sequências dos primers são fornecidas abaixo, a região sublinhada não é homóloga com molde genômico: TMS2039 (primer direto; SEQ ID NO:2): CAGATCTGATATCGATGGGCCCACTAACTATCTATACTGTAAT AATGTTGTATAG TMS2040 (primer reverso; SEQ ID NO:3): CGGACCGGGTGACCAAGCTTAAGCGAACATATGTCCCTC.

[0103] Um produto de 504 bp compreendendo a sequência terminadora SB-GKAF de 465 bp (SEQ ID NO: 1) foi amplificado por PCR utilizando estes primers. O produto foi clonado no pGEMTeasy (Promega) (PHP31801; FIG.1; SEQ ID NO: 4) e a sequência foi confirmada. O terminador SB-GKAF clonado incluía 165 bp da 3’ UTR prevista do SB-GKAF juntamente com cerca de 300 bp de sequência a jusante. A sequência amplificada do terminador SB-GKAF (SEQ ID NO: 1) foi então clonada em um vetor de transformação de Agrobacterium (PHP34074; FIG.2; SEQ ID NO: 5), que tinha os seguintes cassetes de expressão em orientação divergente: TERMINADOR SB-GKAF: GUSINT: BSV PRO e UBI-PRO:UBI INTRON:MOPAT:PINII TERM.

[0104] O BSV PRO é o promotor do vírus das estrias da bananeira (Banana Streak Virus - BSV), que é um forte promotor constitutivo. Uma construção com um terminador PINII de batata (Keil et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-5650), no lugar do terminador SB-GKAF foi utilizada como controle (PHP34005, SEQ ID NO: 6).

EXEMPLO 2 TRANSFORMAÇÃO TRANSITÓRIA PARA TESTAR A EFICÁCIA DE UM TERMINATORSB- GKAF

[0105] A sequência terminadora SB-GKAF (SEQ ID NO: 1) isolada foi testada quanto à sua capacidade para atuar de modo eficaz como um terminador em uma construção recombinante. A sua eficácia como um terminador foi testada pela sua capacidade para impedir a transcrição e pela sua capacidade para aumentar a expressão de uma proteína. Uma vez que a terminação inadequada pode levar ao processamento inadequado da extremidade 3' do mRNA, e, consequentemente, afetar a estabilidade do RNA, foi observado que os terminadores afetam os níveis de expressão de proteína. Demonstrou-se que diferentes terminadores podem causar uma variação de 100 vezes na eficiência de expressão do transgene (Bieri et al, (2002) Molecular Breeding 10: 107-117; An et al (1989) Plant Cell 1: 115-122; Ingelbrecht et al (1989), Plant Cell, 1:671-680; AN e Taylor (2001) Plant Mol. Bio., 46:251-261). Por isso nós avaliamos sequência SB-GKAF (SEQ ID NO: 1) quanto à sua capacidade de aumentar a expressão de uma proteína em comparação com o terminador bem conhecido PINII. Os vetores de transformação de Agrobacterium PHP34074 (SEQ ID NO: 5) e PHP34005 (SEQ ID NO: 6) descritos no Exemplo 1 foram usados para a expressão transitória em células de milho da linhagem BMS (Black Mexican Sweet). As células foram coletadas 5 dias após a transformação e enviadas para a quantificação da atividade de GUS (ensaio MUG). A construção SB-GKAF (PHP34074, SEQ ID NO: 5) tinha 35% mais expressão do que a construção PINII (PHP34005, SEQ ID NO: 6), quando a expressão de GUS foi normalizada pela expressão de MOPAT (Fig. 3; Tabela 1). Esta informação foi indicativa da capacidade da sequência SB-GKAF isolada (SEQ ID NO: 1) em atuar de maneira eficaz como um terminador, permitindo a expressão da proteína de maneira igual a ou superior ao do terminador PINII. TABELA 1

* Medido como: nmoles MU/mg de proteína total/hora/ppm PAT

EXEMPLO 3 ENSAIOS DE TRANSFORMAÇÃO ESTÁVEL PARA TESTAR A ATIVIDADE DO TERMINADOR SB-GKAF

[0106] Os vetores de transformação para Agrobacterium PHP34074 (SEQ ID NO: 5) e PHP34005 (SEQ ID NO: 6) descritos no Exemplo 1, que foram utilizados para ensaios de expressão transitória, tal como descrito no Exemplo 2, foram também utilizados nas linhagens derivadas da Gaspe- Flint para transformação estável para gerar plantas de milho transgênicas.

[0107] A PCR por Transcriptase Reversa Quantitativa (qRT- PCR) e ensaios GUS foram realizados a partir de tecidos vegetais transformados de forma estável para testar a capacidade de uma sequência terminadora isolada SB-GKAF (SEQ ID NO: 1) de impedir a transcrição (ou seja, evitar a transcrição da leitura) e para comparar a expressão de GUS em relação ao terminador PINII.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GUS:

[0108] A expressão do gene GUS nas plantas transgênicas foi avaliada pelos níveis de proteína, bem como pelos níveis de transcrição. Para avaliar a expressão ao nível da proteína, o ensaio MUG foi realizado no material foliar de mudas. Para avaliar a expressão ao nível da transcrição, a qRT-PCR foi realizada utilizando os primers apresentados na Tabela 2. TABELA 2

[0109] As plantas foram cultivadas em estufa e as folhas foram amostradas na fase de desenvolvimento R1 para a análise da expressão. Várias plantas foram testadas para cada construção. Cada planta foi analisada para a expressão do gene GUS. O gene GUS com o terminador SB-GKAF possuía a expressão GUS no mesmo intervalo que o gene GUS com o terminador PINII, tanto no nível de proteína (Fig. 4A) quando no nível de transcrito (Fig.4B).

PCR POR TRANSCRIPTASE REVERSA QUANTITATIVA (QRT-PCR) PARA DETERMINAR A LEITURA DA TRANSCRIÇÃO ATRAVÉS DO TERMINADOR SB-GKAF:

[0110] Os ensaios de qRT-PCR foram realizados com o tecido foliar a partir dos transformantes estáveis gerados usando PHP34074 e PHP34005. Cada planta foi testada quanto a presença da leitura da transcrição que havia passado através do terminador PINII e terminador SB- GKAF (SEQ ID NO: 1). Para avaliar a presença de produtos que indicam que a leitura de transcrição continuou após o terminador, a amplificação foi direcionada a jusante do terminador a ser testado. Foram desenhados dois conjuntos de primers a jusante dos terminadores testados. - Conjunto de primerTerml ~ 100 nt do terminador - Conjunto de primer Term2.1 ~ 500 nt do terminador

[0111] Várias plantas foram testadas para cada construção. Os primerssão apresentados na Tabela 3: TABELA 3

1 Conjunto de Primerpós-terminador 2 Gene de referência

[0112] As plantas do ensaio foram classificadas em três categorias dependendo dos resultados da qRT-PCR: 1. Plantas exibindo terminação completa: onde todas as transcrições GUS são completamente terminadas antes de chegarem ao local do conjunto de primerespecífico; 2. Plantas que apresentam um alto grau de terminação: onde uma grande porção das transcrições GUS é terminada antes de chegarem ao local do conjunto específico de primers, também definidas como: Conjunto de primerTerm1 - ΔCT > 13 Conjunto de primerTerm2.1 - ΔCT > 9; e 3. Plantas que exibem terminação ruim.

[0113] Como pode se observar a partir da Fig. 5, o terminador SB-GKAF provou ter menos plantas com “terminação ruim” do que o terminador PINII (Fig. 5). Assim, a pontuação por qRT-PCR para a presença de transcrições que tinham prosseguido através do terminador foi menor para o terminador SB-GKAF do que para o terminador PINII.

Claims (5)

1. CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, caracterizada por compreender uma sequência de polinucleotídeo operacionalmente ligada a uma sequência polinucleotídica heteróloga em que a sequência de polinucleotídeo compreende: (a) uma sequência nucleotídica que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1; em que a sequência do polinucleotídeo funciona como um terminador da transcrição em uma célula vegetal.

2. CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo polinucleotídeo estar operacionalmente ligado a um promotor.

3. MÉTODO DE EXPRESSÃO DE UM POLINUCLEOTÍDEO HETERÓLOGO EM UMA PLANTA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução da construção recombinante, conforme definida na reivindicação 2, em uma célula vegetal regenerável; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável da etapa (a), em que a planta transgênica compreende a construção recombinante, conforme definida na reivindicação 2; e (c) obtenção de uma progênie vegetal a partir da planta transgênica da etapa (b), em que a progênie vegetal compreende a construção recombinante, conforme definida na reivindicação 2, e exibe a expressão do polinucleotídeo heterólogo.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela planta ser uma planta monocotiledônea.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela planta ser uma planta de milho.

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