CN104024416B - 用于植物基因表达的终止子序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能用于植物中调控基因表达的多核苷酸序列。公开了来源于高粱(Sorghum bicolor)的在植物中起作用的终止子序列。

Description

用于植物基因表达的终止子序列

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2011年8月2日的美国临时申请No.61／514,055的权益，其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域。更具体地，其涉及用于调控植物基因表达的新型植物终止子序列及其应用。

背景技术

植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的大门。这些转基因植物在其基因组中典型地具有重组DNA构建体，其具有可操作地连接至多个调控区的蛋白质编码区，所述调控区使转基因准确的表达。转基因植物中一些帮助调控基因表达的调控元件的例子为启动子、内含子、终止子、增强子和沉默子。

植物基因工程已发展至将多种性状引入商业上重要的植物中，也叫基因堆积。这是通过多基因转化实现的，其中多种基因被转化以产生可表达复合表型或多种表型的转基因植物。然而最优化地调节或控制每种转基因的表达是重要的。调控元件需要多种多样的，以避免导入相同的转基因植物重复序列，相同的转基因植物重复序列与对转基因的表达和稳定性的不可取的负面影响是相关联的(Peremarti等人(2010)Plant Mol Biol73：363-378；Mette等人(1999)EMBO J18：241-248；Mette等人(2000)EMBO J19：5194-5201；Mourrain等人(2007)Planta225：365-379、美国专利No.7632982、美国专利No.7491813、美国专利No.7674950、PCT专利申请No.PCT/US2009／046968)。因此，发现和表征能被用于在重要的农作物物种中表达异源性核酸的新型调控元件是重要的。各种不同的调控区能够被用于最优化地控制每种转基因的表达。

调控序列位于编码区的下游，所述编码区包含用于转录终止和3′mRNA加工的所需信号，并被称为终止子序列。所述终止子序列在mRNA加工、定位、稳定性和翻译中起关键作用(Proudfoot，N，(2004)Curr.Op.Cell Biol16：272-278；Gilmartin，2005)。包含在终止子序列中的所述3′调控序列能够影响基因的表达水平。已经发现植物细胞中嵌合基因的优化表达依赖于合适的3′序列的存在(Ingelbrecht，I.L.W.等人(1989)Plant Cell1：671-680)。通过基因的渗漏终止子的通读转录可导致从另一个基因的启动子的一个转基因的无益转录。转基因植物中转基因的双向、趋同转录也可由于分离的趋同基因的渗漏转录终止或来自基因组启动子而发生。趋同、重叠转录可降低转基因表达、或生成反义RNA(Bieri，S.等人(2002)Molecular Breeding10：107-117)。这强调了发现新型和高效转录终止子的重要性。

发明内容

本发明涉及用于调控植物基因表达的调控序列。具体地，本发明涉及终止子序列。本发明提供了包含终止子序列的重组DNA构建体。

本发明的一个实施例是分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含：(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18所示的序列；(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分离的多核苷酸序列在植物细胞中作为终止子起作用。本发明的另一个实施例是包含分离的多核苷酸序列的重组构建体，所述分离的多核苷酸序列包含：(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18所示的序列；(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分离的多核苷酸序列在植物细胞中作为终止子起作用。这个重组构建体还可包含启动子和异源多核苷酸，其中所述启动子和异源多核苷酸可操作地连接至分离的多核苷酸序列。

本发明的另一个实施例是在植物中表达异源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将上文所述的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物；以及(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述转基因植物和子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。

在另一个实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的载体、病毒、细胞、微生物、植物、或种子，所述重组DNA构建体包含本发明所述的终止子序列。

本发明涵盖了包含上文所述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、由其产生的转基因种子、T1和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植株和种子可以包含至少一种所关注的重组DNA构建体。

在另一个实施例中，包含本发明所述终止子序列的植物或种子是单子叶植物或种子。在另一个实施例中，包含本发明所述终止子序列的植物或种子是玉米植物或种子。

在另一个实施例中，任何表达异源多核苷酸的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞，例如，玉米植物细胞。

附图说明和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规定。

图1显示了PHP31801的图谱、用于在扩增后克隆SB-GKAF终止子的载体。

图2显示了PHP34074的图谱、用于测试SB-GKAF终止子的载体。

图3显示了在瞬时测定中SB-GKAF终止子相对于PINII终止子的测试结果。其显示了用PHP34074(SB-GKAF终止子)和PHP34005(PINII终止子)转化的BMS细胞中GUS报告基因表达的定量分析。

图4A和图4B显示了用SB-GKAF(PHP34074)和PINII(PHP34005)终止子构建体稳定转化的Gaspe Flint来源的玉米品系中GUS报告基因表达的定量分析。图4A显示了在蛋白水平测定的GUS报告基因表达，图4B显示了用qRT-PCR(定量反转录-聚合酶链反应)测定的GUS报告基因表达。

图5显示了采用SB-GKAF终止子和PINII终止子下游的两套引物，稳定转化的GaspeFlint来源的玉米品系的qRT-PCR测定结果。

图6A-6C显示了克隆的SB-GKAF终止子(SEQ ID NO：1)和NCBI GI NO：671655(SEQID NO：18)的1863至2322位核苷酸的比对。共有序列显示于顶部，与共有序列完全匹配的残基加框。

SEQ ID NO：1是459bp SB-GKAF终止子的序列。

SEQ ID NO：2和3是用于扩增SB-GKAF终止子的正向和反向引物的序列。

SEQ ID NO：4是PHP31801的核苷酸序列，在PCR扩增后用于克隆SB-GKAF终止子的载体。

SEQ ID NO：5是PHP34074的核苷酸序列，用于测试SB-GKAF终止子的载体。

SEQ ID NO：6是PHP34005的核苷酸序列，作为PINII终止子对照的测试载体。

如表2所述，SEQ ID NOS：7-9是在转基因玉米植物中用于通过qRT-PCR测定GUS表达的正向引物、反向引物和探针的序列。

如表3所述，SEQ ID NOS：10-17是在转基因玉米植物中用于以qRT-PCR定量通读转录通过SB-GKAF和PINII终止子的引物序列。

SEQ ID NO：18对应于NCBI GI NO：671655的1863至2322位核苷酸。

具体实施方式

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。

如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵义包括多株此类植物，“细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的它们的等同物等等。

如本文所用：

术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下科：十字花科(Brassicaceae)植物、豆科(Leguminosae)植物、和茄科(Solanaceae)植物。

术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

“转基因”指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、植物繁殖体、种子和植物细胞以及相同的子代。植物细胞无限制地包括来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。

“繁殖体”包括能够繁殖新的植株的减数分裂和有丝分裂的全部产物，包括但不限于种子、孢子以及作为营养生殖的途径的植物的部分，诸如球茎、块茎、侧枝、或纤匐枝。繁殖体还包括接枝，在其中植株的一部分被枝接至不同的植株(甚至是不同的物种的植株)的另外的部分以产生活的生物体。繁殖体还包括通过克隆或集合减数分裂产物、或允许减数分裂产物(天然地或在人工干预下)集合在一起以形成胚芽或受精卵，而产生的全部植株和种子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

基因改良种质的商业开发也已经进展至向农作物导入多个性状的阶段，其通常称为基因堆叠法(gene stacking approach)。在该方法中，可将赋予不同所关注特性的多种基因导入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及具有不同转基因的品系的杂交。

“转基因植物”还包括对在其基因组中包含超过一种异源多核苷酸的植物。各异源多核苷酸均可赋予所述转基因植物不同的性状。

相对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和／或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“编码区”是指编码蛋白质或多肽的信使RNA的部分(或另外的核酸分子如DNA分子的对应的部分)。“非编码区”是指信使RNA或其他核酸分子的不是编码区的全部部分，包括但不限于例如，启动子区域、5′非翻译区(“UTR”)、3′UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”本文中可互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”本文中可互换使用。

“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常由通过cDNA插入序列的单个序列获得。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自但不限于由EST、FIS和PCR序列组成的基团的两种或更多种序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸分子和／或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分去除。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。

“重组体”也指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化／转导／转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“重组DNA构建体”和“重组构建体”本文可互换使用。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”或“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和／或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子的例子包括但不限于受光、热、压力、水涝或干旱、病原体、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

“增强子序列”是指能够增加基因表达的序列。这些序列能够位于转录区域的上游、内含子内、或下游。转录区域由外显子和居间的内含子组成，从启动子直至转录终止区。基因表达的增强能够通过多种机制实现，包括但不限于提高转录效率、成熟mRNA的稳定化和翻译的强化。

“内含子”是基因的居间序列，其被转录至RNA，然后在产生成熟mRNA的过程中被切除。该术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是被转录的基因序列的一部分，存在于得自该基因的成熟信使RNA中，并且不是编码最终基因产物的序列的必需部分。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和／或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“过表达”是指基因产物在转基因生物中超过在来自相同实验的沉默分离(或非转基因)生物中的水平的生产。

“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。

术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

“有利等位基因”为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的细胞壁消化性，或作为另外一种选择，为允许具有降低的细胞壁消化性的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除(“反选择”)。标记的有利等位基因是与有利表型分离的标记等位基因，或者作为另外一种选择，与不利植物表型分离，从而提供鉴定植物的有益效果。

术语“导入”指将核酸(例如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中的手段。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合进细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体／表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质／酶的水平上的抑制，和／或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”，包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括而且不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Mamatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

“转录终止子”、“终止序列”或“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的聚腺苷酸化识别序列和其他序列。聚腺苷酸化信号通常其特征在于影响聚腺苷酸区域添加到mRNA前体的3′末端。不同的3′非编码序列的使用示例于Ingelbrecht，I.L.等人，Plant Cell1：671-680(1989)中。具有“终止子活性”的多核苷酸序列指当被可操作地连接至待表达的第二多核苷酸序列的3′端时，能够终止从所述第二多核苷酸序列转录的多核苷酸序列。转录的终止是通过RNA聚合酶的RNA合成被停止并且RNA和所述酶均从DNA模板上释放的过程。

RNA转录物的错误终止能够影响RNA的稳定性，并从而能够影响蛋白质的表达。转基因表达的可变性有时归因于终止效率的可变性(Bieri等人(2002)MolecularBreeding10：107-117)。

本文可互换使用术语“SB-GKAF终止子”、“GKAF终止子”和“γ-高粱醇溶蛋白终止子”，每个是指编码高粱(Sorghum Bicolor)γ-高粱醇溶蛋白基因的3′非翻译区(3′UTR)的序列和从所述3′UTR下游约300bp的序列。在SEQ ID NO：1中给出了SB-GKAF终止子的序列。高粱(Sorghum Bicolor)γ-高粱醇溶蛋白基因编码γ-谷醇溶蛋白，在NCBI GI NO：671655中给出了该基因的序列。谷醇溶蛋白是许多谷类的主要储存蛋白。高粱γ-高粱醇溶蛋白，其为高粱的γ-谷醇溶蛋白，占高粱胚乳中总谷醇溶蛋白的约2-5％，是由27kDa的单条多肽组成的(de Freitas FA等人(1994)Mol Gen Genetics245(2)：177-86)。

本发明包括本文所公开的终止子序列的功能性片段和变体。

终止子的“功能性片段”被定义为本文所公开的终止子序列的连续核苷酸的任何子集，其能够实施与本文所公开的全长终止子序列相同或基本上相似的功能。与本文所公开的全长终止子具有基本上相似功能的“功能性片段”，是指在很大程度上保持在全长终止子序列相同水平的终止转录能力的功能性片段。包含可操作地连接至本文所公开的终止子序列的“功能性片段”的异源性多核苷酸的重组构建体，表现出与包含可操作地连接至全长终止子序列的异源性多核苷酸的对应重组构建体基本上相似的异源性多核苷酸表达水平。

如本文所用，“变体”是包含改变的终止子的序列或终止子的功能性片段的序列，其中原始序列的一个或多个核苷酸被删除、添加、和／或替换，同时基本上维持了终止子的功能。一个或多个碱基对能够在终止子内部被插入、删除、或替换，而不会影响其活性。片段和变体能够通过例如定点诱变和合成构建的方法获得。

这些终止子功能性片段可包含本文所公开的特定终止子核苷酸序列的至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或450个连续的核苷酸。此类片段可以通过使用限制性酶来裂解天然存在的本文所公开的终止子核苷酸序列；通过合成来自天然存在的终止子DNA序列的核苷酸序列获得；或可通过使用PCR技术而获得。具体参见Mullis等人，Methods Enzymol.155：335-350(1987)和Higuchi，R.In PCRTechnology：Principles和Applications for DNA Amplifications；Erlich，H.A.编辑；Stockton Press Inc.：New York，1989)。同样，这些终止子片段的变体，例如产生自定点诱变的那些，包括在本发明的组合物之中。

如本文所用，术语“基本上类似于”和“基本上相当的”是指核酸片段，尤其是终止子序列，其中在一个或多个核苷酸碱基中的改变基本上不改变终止子终止转录的能力。这些术语还指本发明的核酸序列的修改形式，包括缺失和变异，所述修改形式是通过一个或多个核苷酸的缺失或插入，其基本上不改变所产生的终止子相对于初始的未修改的终止子的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。

如对于本领域的技术人员将是显而易见的，任何受关注的异源性多核苷酸均能够被可操作地连接至本发明所描述的终止子序列。能够被可操作地连接至本发明所描述的终止子序列的受关注的多核苷酸的例子包括但不限于，包含调控元件诸如内含子、增强子、启动子、翻译前导序列，蛋白质编码区如疾病和抗昆虫性基因、赋予营养价值的基因、赋予产量和杂种优势的提高的基因、赋予雄性和／或雌性不育性的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因等等的多核苷酸。同样地，本发明所描述的终止子序列能够被用于终止任何控制基因表达的核酸的转录。能够被用于控制基因表达的核酸的例子包括但不限于反义寡核苷酸、抑制性DNA构建体或编码转录因子的核酸。

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一种调控序列。在本发明的一个实施例中，本文所公开的调控序列可操作地连接至任何其它调控序列。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

本文可互换使用术语“实时聚合酶链反应(real-time PCR)”、“定量聚合酶链反应(quantitative PCR)”、“定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time PCR)”和“QPCR”，代表用于定量样品中的DNA或RNA的标准聚合酶链反应(PCR)技术的变型。使用序列特异性引物和探针，测定特定DNA或RNA序列的相对数量或拷贝数。使用术语相对是因为这个技术比较了不同基因相对于特定内参基因的相对拷贝数。通过测量在PCR过程中的每个循环扩增产物的量，量化升高。使用荧光水解探针，测量对于每个后续PCR循环增加的荧光以获得扩增产物的量化。Ct(循环阈值)被定义为对于荧光信号超过阈值(即超过背景水平)所需的循环数。来自具有更高拷贝数基因的DNA／RNA会在更少的PCR循环后出现；因此Ct值越低，在特定样品中存在的拷贝越多。为了定量RNA，在QPCR或实时PCR之前为反转录mRNA至cDNA的步骤。本文这被称为“实时RT-PCR”或“定量RT-PCR”或“定量RT-PCR”或“qRT-PCR”。

PCR产物定量的Taqman方法使用荧光报告基因探针。由于设计的探针是序列特异性的，并仅结合至特异性PCR产物上，因此这是更精确的。即使存在非特异性DNA扩增，探针特异性使定量成为可能。这使多重(定量)成为可能，其通过使用具有不同发射光谱的探针在同一试管中定量多个基因。通过Taq聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性降解探针，除去淬灭剂，使得PCR产物被检测到。

当绘制在一个线性标度时，所述荧光射线随着PCR循环数增加而增加呈S型，具有指数期和平台期。平台期是由主混合物中的引物量而非核苷酸模板量确定的。通常垂直标度是以对数形式绘制的，使得曲线图与阈值的交集呈线性，更易于可视化。理论上，在指数期每个循环DNA的量加倍，但这受到所用引物效率的影响。正对照使用内参基因，例如，在所有细胞类型中相对丰富的“持家基因”，它的使用也使得样品间的比较成为可能。通过将结果与通过已知浓度的DNA／RNA连续稀释制备的标准曲线比较，测定DNA／RNA的量。

本发明包括多核苷酸，所述多核苷酸包含：(i)基于Clustal V(或Clustal W)比对方法，在与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)基于ClustalV(或Clustal W)比对方法，在与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18的功能性片段进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(iii)(i)或(ii)的核酸序列的全长互补序列，其中所述多核苷酸在植物细胞中作为终止子。

序列比对和同一性百分比计算可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)进行，默认参数(空位罚分(GAPPENALTY)＝10，空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10)。使用Clustal V方法进行配对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。

作为另外一种选择，可以使用Clustal W比对方法。Clustal W比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))可见于生物信息计算包(Inc.，Madison，Wis.)的MegAlign^TMv6.1程序。用于多重比对的默认参数对应GAP PENALTY＝10、GAP LENGTHPENALTY＝0.2、Delay Divergent Sequences＝30％、DNA Transition Weight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet Series、DNA Weight Matrix＝IUB。用于配对比对的默认参数是Alignment＝Slow-Accurate(缓慢-准确)、Gap Penalty＝10.0、Gap Length＝0.10、Protein Weight Matrix＝Gonnet250、以及DNA Weight Matrix＝IUB。用Clustal W程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值。

本发明的实施例包括：

本发明涉及终止子序列。本发明提供了包含终止子序列的重组DNA构建体。

本发明一个的实施例是分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列包含(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18所示的序列；(b)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18具有至少95％的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分离的多核苷酸序列在植物细胞中作为终止子起作用。在另一方面，本发明涉及重组DNA构建体，其包含启动子、至少一个异源核酸片段和本发明的任何终止子、或终止子元件的组合，其中所述启动子、至少一个异源核酸片段和终止子被可操作地连接起来。

在另一个实施例中，功能性片段可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18的至少450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175或150个连续核苷酸。

通过将本发明的核酸片段，如SEQ ID NO：1或18中所示的终止子序列或如SEQ IDNO：1或18中所示的核苷酸序列的功能性片段，可操作地连接至异源核酸片段，可构建重组DNA构建体。

另一个实施例是转化细胞(或微生物)的方法，所述方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体转化细胞(或微生物)。(本发明)也包括用这个方法转化的细胞(或微生物)。在特定实施例中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞，例如细菌细胞。所述微生物可为农杆菌属(Agrobacterium)，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

本发明的另一个实施例是在植物中表达异源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：将上文所述的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞，从转化的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体并表现出所述异源多核苷酸的表达。

本发明的另一个实施例是在植物中表达异源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：将上文所述的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞；从上文所述的可再生的植物细胞再生转基因植物；以及从转基因植物获得子代植物，其中所述转基因植物和子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。

在另一个实施例中，任何表达异源多核苷酸的方法，其中所述植物细胞是单子叶的或双子叶植物，例如，玉米或大豆植物细胞。植物细胞还可来自向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。

在另一个实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的载体、病毒、细胞、微生物、植物、或种子，所述重组DNA构建体包含本发明所述的终止子序列。

本发明包括包含上文所描述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、T1和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植株和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体。

在一个实施例中，包含本发明所述的终止子序列的所述植物(或来源于所述植物的种子)是单子叶或双子叶植物，例如，玉米或大豆植物。所述植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。所述植物可为近交植物或杂交植物。

实例

本发明将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。

实例1

扩增和克隆高粱(Sorghum bicolor)γ-高粱醇溶蛋白终止子序列

根据高粱(Sorghum bicolor)基因组序列数据库设计引物(SEQ ID NOS：2和3)用于扩增来自高粱(Sorghum bicolor)的γ-高粱醇溶蛋白基因(SB-GKAF)的终止子。下文给出了所述引物序列，带下划线的区域是与基因组模板不同源的：

TMS2039(正向引物；SEQ ID NO：2)：

CAGATCTGATATCGATGGGCCCACTAACTATCTATACTGTAATAATGTTGTATAG

TMS2040(反向引物；SEQ ID NO：3)：

CGGACCGGGTGACCAAGCTTAAGCGAACATATGTCCCTC

使用这些引物通过PCR扩增出504bp的产物，其包含465bp SB-GKAF终止子序列(SEQ ID NO：1)。产物被克隆至pGEMTeasy(Promega)(PHP31801；图1；SEQ ID NO：4)并确认序列。克隆的SB-GKAF终止子包括165bp的预测的SB-GKAF的3′非翻译区(UTR)以及约300bp的下游序列。然后将扩增的SB-GKAF终止子(SEQ ID NO：1)序列克隆至农杆菌属(Agrobacterium)转化载体(PHp34074；图2；SEQ ID NO：5)，其在不同方向具有下列表达盒：

SB-GKAF TERMINATOR：GUSINT：BSV PRO和

UBI-PRO：UBI INTRON：MOPAT：PINII TERM。

BSV PRO是香蕉条纹病毒启动子，是强效组成型启动子。将以马铃薯PINII终止子(Keil等人(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-5650)代替了SB-GKAF终止子的构建体用作对照(PHP34005；SEQ ID NO：6)。

实例2

瞬时转化以测试SB-GKAF终止子的功效

在重组构建体中测试分离的SB-GKAF终止子序列(SEQ ID NO：1)有效充当终止子起作用的能力。通过其终止转录的能力和通过其增加蛋白表达的能力测试其作为终止子的功效。由于不正确的终止子可导致mRNA的3′末端的不正确加工，从而影响RNA稳定性，已经发现终止子影响蛋白表达水平。已经表明不同终止子可导致转基因表达效率有至多100倍的变化(Bieri等人，(2002)Molecular Breeding10：107-117；An等人(1989)Plant Cell1：115-122；Ingelbrecht等人(1989)，Plant Cell，1：671-680；Ali和Taylor(2001)PlantMol.Bio.，46：251-261)。从而我们对于SB-GKAF序列(SEQ ID NO：1)与熟知的PINII终止子相比增加蛋白表达的能力进行了测试。使用实例1所述的农杆菌属(Agrobacterium)转化载体PHP34074(SEQ ID NO：5)和PHP34005(SEQ ID NO：6)瞬时转化BMS(墨西哥黑甜玉米，Black Mexican Sweet)细胞。转化5天后收获细胞并用于量化GUS活性(MUG测定)。当GUS表达归一化至MOPAT表达(图3；表1)时，SB-GKAF构建体(PHP34074；SEQ ID NO：5)表达比PINII构建体(PHP34005，SEQ ID NO：6)高～35％。通过使得蛋白表达等于或高于PINII终止子的蛋白表达，这个信息表明分离的SB-GKAF序列(SEQ ID NO：1)有效地充当终止子的能力。

表1

*被测量为：nmoles MU／mg总蛋白／小时／ppm PAT

实例3

稳定转化测定以测试SB-GKAF终止子活性

实例1中所述农杆菌属(Agrobacterium)转化载体PHP34074(SEQ ID NO：5)和PHP34005(SEQ ID NO：6)，被用于实例2中所述的瞬时转化测定，也被用在Gaspe-Flint来源的玉米品系中进行稳定转化以再生转基因玉米植物。

从稳定转化植物组织进行定量反转录酶-PCR(qRT-PCR)和GUS测定，以测试分离的SB-GKAF终止子序列(SEQ ID NO：1)终止转录(防止转录通读转录)的能力，并与具有PINII终止子的相比比较GUS表达。

GUS表达测定：

在蛋白以及转录水平测定转基因植物中GUS基因的表达。为在蛋白水平测定表达，对幼苗叶片材料进行MUG测定。为在转录水平测定表达，使用表2中所示引物进行qRT-PCR。

表2

植株生长在温室中，在发育的R1期采集叶片样本用于表达分析。对于每个构建体测试多个植株。分析每个植株GUS基因的表达。在蛋白(图4A)和转录(图4B)水平，带有SB-GKAF终止子的GUS基因与PINII终止子有相同范围的GUS表达。

定量反转录酶PCR(qRT-PCR)以测定通读转录通过SB-GKAF终止子：

用来自使用PHP34074和PHP34005生成的稳定转化子的叶片组织进行qRT-PCR测定。测试每个植株通读转录(通过PINII终止子和SB-GKAF终止子(SEQ ID NO：1))的存在。为了评估将指示这种转录正持续通过所述终止子的产物的存在，扩增靶向被测试的所述终止子的下游(序列)。设计了被测试终止子下游(序列)的两组引物。

-引物组Term1距离终止子～100nt

-引物组Term2.1距离终止子～500nt

对于每个构建体测试了多个植株。所述引物显示于表3中。

表3

1终止子后引物组

2内参基因

根据qRT-PCR结果将测试植株分为3类：

1.表现出完全终止作用的植株：其中所有GUS转录本在其到达特异性引物组位置前被完全终止；

2.表现出高度终止作用的植株：其中GUS转录本的大部分在其到达特异性引物组位置前被终止，也被称为：

引物组Term1-ΔCT＞13

引物组Term2.1-ΔCT9；和

3.表现出很差终止作用的植株。

如从图5可以看到，与PINII终止子相比SB-GKAF终止子被证实拥有“很差终止作用”的植株数量更少(图5)。因此对于SB-GKAF终止子，针对通过终止子的转录本的存在的qRT-PCR分数低于对于PINII终止子的。

Claims (4)

1.包含分离的多核苷酸序列的重组构建体，所述分离的多核苷酸序列由以下组成：

由如SEQ ID NO:1中所示序列组成的核苷酸序列；

其中所述分离的多核苷酸序列在植物细胞中作为转录终止子起作用，并且其中所述分离的多核苷酸序列可操作地连接至启动子和异源多核苷酸序列。

2.在植物中表达异源多核苷酸的方法，包括以下步骤：

(a) 将权利要求1的重组构建体导入到可再生的植物细胞中；

(b) 由步骤(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含权利要求1的重组构建体；以及

(c) 由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物包含权利要求1的重组构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是玉米植物。