BR112012019251B1

BR112012019251B1 - adjuvante para preparação de composições de vacina destinadas à prevenção contra coccidiose.

Info

Publication number: BR112012019251B1
Application number: BR112012019251-5A
Authority: BR
Inventors: Bertrand François; Dupuis Laurent; Devile Sebastian
Original assignee: Soc Dexploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2019-11-05
Also published as: EP2531214A1; FR2955775B1; MX2012008761A; US20140086956A1; US8703154B2; RU2012137229A; FR2955775A1; CN102740883A; EP2531214B1; EG26852A; CN102740883B; US20120308604A1; RU2517318C2; US9089551B2; IL220905A; ES2599997T3; BR112012019251B8; WO2011092413A1; BR112012019251A2

Abstract

adjuvante para preparação de composições de vacina destinadas à prevenção contra coccidiose. a invenção refere-se a um adjuvante de vacina que, com base em 100% em massa do mesmo, compreende entre 10 e 95 de um óleo mineral, contendo: entre 0,05% em massa e 10% em massa de cadeias hidrocarboneto tendo menos do que 16 átomos de carbono e entre 0,05 en massa e 5% em massa de cadeias de hidrocarbonetos tendo mais de 28 átomos de carbono. além disso, dito adjuvante tem uma razão de p/n, correspondendo à razão entre a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos parafínicos, para a quantidade em massa das cadeias de hidrocarbonetos naftênicos, entre 2,5 e 3, dito adjuvante sendo destinado à produção de uma composição de vacina para prevenir a coccidiose.

Description

ADJUVANTE PARA PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE VACINA DESTINADAS Ã PREVENÇÃO CONTRA COCCIDIOSE

A presente invenção refere-se a novos adjuvantes para a preparação de composições de vacina para a prevenção de coccidiose em aves, as composições de vacina compreendendo ditos adjuvantes, e o uso de um óleo mineral específico para a fabricação do dito adjuvante.

As coccidioses são doenças parasitárias comuns em aves.

As aves de capoeira são pássaros domésticos geralmente pertencentes aos pássaros galináceos ou palmípedes que são criados em fazendas para consumo de suas carnes ou seus ovos em um pátio de fazenda tradicional ou por fazendas industriais.

A expressão de aves de capoeira é destinada a significar: frango, peru, ganso, pato, galinhas-d¹ angola, pombo, codorna, faisão, avestruz.

O agente etiológico (ou transportador da doença) é um parasita protozoário intracelular, conhecido como coccídios, e pertence na maioria das vezes ao gênero Bimeria.

Existem vários tipos de coccídios aviários para cada espécie:

Coccidia de frango: E. acervulina, E. necatrix, E. maxima, E. brunetti, E. tenella, E, mitis, E, praecox.

Coccidia de peru: E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. dispersa, E. gallopavonis.

Coccídica de ganso: E. truncata (também pode afetar o pato e cisne), E, anseris.

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Coccídeos de pato: Tyzzeria perniciosa, E. mulardi. A doença afeta principalmente o pato mula.

Coccidia de galinhas-d'angola: E, numídia, E. grenieri (mais comuns, mas de menor patogenicidade).

Coccidia de pombos: E. labbeana

A prevenção da coccidiose baseia-se nas seguintes soluções:

a) um método de quimioprevenção:

Este método usa compostos químicos do tipo antibióticos e tem desvantagens, tais como:

gerar riscos de desenvolver alergias nos animais tratados com os antibióticos, especialmente por causa da presença de resíduos ou de subprodutos indesejados nestes antibióticos;

Gerar riscos de desenvolver a resistência a antibióticos entre espécies tratadas;

- ser regido por regulamentos restritivos;

- danificar a imagem da carne de ave de capoeira comercializada, com o risco de não mais se beneficiar de rótulos de qualidade que reivindicam uma criação em condições naturais.

b) um método de vacinação envolvendo vacinas vivas:

Vacinas derivadas de agentes vivos atenuados são preparadas pela multiplicação de agentes infecciosos em laboratório, até que perdem naturalmente ou artificialmente, por mutação, a sua patogenicidade.

As cepas resultantes são, então, totalmente incapazes de desenvolverem completamente a doença antes que eles geraram previamente.

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No entanto, estas cepas mantêm os seus antígenos, e à sua capacidade para induzir respostas imunes.

Este modo de vacinação torna possível, após administração a animais, colonizar o trato gastrointestinal e impedir o estabelecimento de cepas possuindo fatores de virulência.

Este método de vacinação tem desvantagens, tais como:

- possível retorno ã virulência;

- necessidae de realizar cultivo em larga escala de bactérias potencialmente patogênicas;

os animais vacinados neste modo podem excretar, assim, constituindo um patógeno potencial no ambiente e, portanto, potencial para a disseminação desses patógenos.

Esta última desvantagem é, por conseguinte, uma razão pela qual ele não é preferido, no caso de criações ao ar livre de aves de capoeira para vacinação contra a coccidiose, que é uma doença parasitica e, portanto, facilmente transmissível por disseminação.

As vacinas anticoccidianas são medicamentos veterinários. Como um resultado, eles estão sujeitos à legislação aplicável aos medicamentos veterinários, que dependem sobre a legislação de medicamentos.

Três vacinas anticoccidianas são autorizadas na França: elas são vacinas vivas que consistem em cepas de primitivas que são atenuadas por imunogenicidade e protetora contra espécies presentes no campo.

Estas três vacinas são apenas usadas para as espécies de galinhas (Gallus gallus), pois elas contêm apenas as

4/40 espécies capazes de parasitar as espécies de aves, não há imunidade cruzada contra diferentes espécies de coccídios.

c) os métodos convencionais de vacinação com um antígeno não-vivo ou inativado

A eficácia das vacinas existentes não é satisfatória, porque o nível do componente celular da resposta imune não é suficientemente elevado para induzir uma proteção eficaz no caso específico de doenças parasíticas tais como a coccidiose, em particular.

Muitos cDNAs que codificam antígenos de Eimeria têm sido descritos, e os testes de imunização são encaminhados com alguns deles. O desenvolvimento de resistência também depende de fundamentos genéticos e modo de administração (e do adjuvante). Alguns antígenos mostraram proteção parcial. A pesquisa visa antígenos comuns a várias espécies de coccídios: por exemplo, o antígeno GX3262 que é reativo com um anticorpo monoclonal que reconhece um antígeno esporozoíto que é comum para as sete espécies de coccídios de galinha, induz uma proteção parcial.

Assim, há a necessidade de melhorar as composições de vacinas inativadas.

desenvolvimento de vacinas inativadas ou vacinas contendo antígenos purificados é cada vez mais importante porque evita os efeitos colaterais mais indesejáveis nos sujeitos vacinados durante e após a vacinação. No entanto a melhoria da qualidade de antígenos é alcançada em detrimento da sua imunogenicidade. Isto é porque eles são combinados com os adjuvantes para aumentar a resposta imune nos sujeitos vacinados.

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Estes adjuvantes são de natureza diversa. Eles podem, por exemplo, consistir em lipossomas, emulsões que compreendem pelo menos uma fase oleosa e pelo menos uma fase aquosa, do tipo conhecida como adjuvantes de Freund ou, mais tipicamente em sais inorgânicos insolúveis em água. Entre os sais inorgânicos usados como adjuvantes para composições de vacina pode-se mencioanr, por exemplo, hidróxido de alumínio, nitrato de cério, sulfato de zinco, hidróxido de ferro coloidal ou cloreto de cálcio. O hidróxido de alumínio é o adjuvante mais comumente usado. Estes sia inorgânicos usados como aditivos em composições de vacina são descritos em particular no artigo de K. Rajesh Gupta et al Adjuvants, balance between toxicity e adjuvanticity, Vaccina, vol. 11, Edição 3, 1993, páginas 993-306.

Os aditivos acima mencionados têm como desvantagem uma baixa eficácia. Além disso, é sabido que o hidróxido de alumínio apenas eficientemente induz uma imunidade humoral e não imunidade celular. Além disso, pode-se induzir alguma toxicidade contra os sujeitos. Mais particularmente, quando estas composições de vacina são injetadas com os receptores da vacina, pode-se observar a formação de lesões e outras reações locais, tais como granulomas no local da injeção.

Outros adjuvantes, consistindo em sais de metais divalentes ou trivalentes ou em compostos simpatomiméticos são, respectivamente, descritos nos pedidos de patente internacionais publicados sob os números WO 96/32964, WO 98/17311 e WO 98/15288.

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As emulsões são misturas estáveis que consistem em dois líquidos imiscíveis, um dos quais sendo dividido em gotículas na outra. Assim, as emulsões compreendem óleos, uma fase aquosa e surfactantes que têm o papel de dispersar uma das duas fases na outra e para obter uma mistura homogênea e estável macroscopicamente. Elas são frequentemente usadas como adjuvantes de imunidade nas formulações de vacinas. O uso de óleos minerais como um adjuvante da vacina é conhecido há muitos anos (Freund 1956, Herbert 1967). Os óleos minerais usados já que os adjuvantes de vacinas são hidrocarbonetos líquidos, que são obtidos por destilação de petróleo e pelo uso de etapas de tratamento subsequentes, tais como, por exemplo, etapas de dessulfuração, de desasfaltagem, extração de compostos aromáticos, extração de ceras, e outras etapas de tratamento de finalização. Estudos sobre a influência da qualidade do óleo sobre a resposta imune apenas surgem gradualmente e de forma incompleta. Com efeito, a composição de óleos minerais é fortemente influenciada pela origem geográfica de óleos brutos usados no processo (produtos químicos e equipamentos) usados para a sua preparação. Estudos das diferentes frações foram destinados a avaliar a toxicidade para os trabalhadores, usuários, mas não para usos em saúde humana ou animal. Otimizações de composição destes óleos minerais, com base na caracterização macroscópica (viscosidade, ponto de fusão), foram feitas com graus de óleos minerais indústrias existentes, ou de produtos químicos de laboratórios puros que não correspondem às definições ou caracterização de

7/40 graus aceitáveis de matérias-primas. Assim, os estudos ainda extensos realizados em óleo mineral de grau industrial são definidos por parâmetros que refletem as suas propriedades biológicas causadas e ainda causam variações no comportamento durante o uso de vacinas com base na origem de uma grande quantidade de óleo mineral. Esses lotes, embora correspondentes com suas especificações e requerimentos analíticos macroscópicos e tendo o mesmo nome comercial, têm composições que são diferentes o suficiente para não dar as mesmas propriedades às vacinas. Além disso, a viscosidade das emulsões obtidas a partir de óleos minerais, sem otimização galênica, induziu uma influência na interpretação dos resultados.

A influência da distribuição entre cadeias lineares e ciclizadas foi avaliada para avaliar quanto a toxicidade potencial durante o uso de óleos minerais em injeção suspeitando do papel teratogênico das formas ciclizadas. Os critérios de toxicidade foram posteriormente identificados como provenientes de formas insaturadas, que são completamente removidas nos processos atuais por hidrogenação extensiva.

Nenhum estudo foi realizado com objetivo de avaliar a influência da razão de constituintes do tipo ciclizado ou linear sobre a qualidade da resposta imune.

Os óleos minerais foram usados durante muitas décadas como adjuvantes e para a preparação de aditivos para aumentar a eficácia das respostas imunes de vacinas. Com efeito, os antígenos foram emulsionados previamente em emulsões de água em óleo mineral (A/O) e, em seguida,

8/40 administrados por rota parentérica desencadeando respostas imunes (e, portanto, a proteção contra os agentes patogênicos) muito mais intensas e duradouras.

A natureza do óleo mineral usado para a preparação de adjuvante tem uma forte influência sobre a intensidade da resposta imune e reações adversas relacionadas com a injeção da vacina (reações locais e gerais).

Existem dois tipos de respostas imunes:

- A resposta imune humoral:

Ê a reação que é produzida quando linfócitos B com receptores específicos são estimulados por antígenos e diferenciam-se em um clone de plasmócitos que começam a secretar anticorpos. Estes são eficazes contra os agentes patogênicos que circulam no sangue e linfa. Além disso, a ativação seletiva de linfócitos B dota o organismo com células de memória com uma vida longa que interfere na resposta imune secundária, e

- A resposta celular imune

A resposta imune humoral ajuda a rede de defesa a reconhecer e destruir agentes patogênicos livre, mas é a reação mediada por células que combate patógenos já introduzido nas células. Os principais elementos na imunidade mediada por células são os linfócitos T.

Os linfócitos T apenas reagem com antigênicos determinantes expostos na superfície de células de organismos. Os linfócitos T reconhecem estes determinantes através dos seus receptores, proteínas de superfície incorporadas na sua membrana. 0 receptor de linfócitos T reconhece os antígenos combinados com as glicoproteínas do

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MHC do organismo. Além do seu papel na resposta humoral, os linfócitos T auxiliares podem também ativar outros tipos de linfócitos T para desencadear reações mediadas por células contra os antígenos. Os linfócitos T citotóxicos são as únicas células que matam outras células (as células infectadas por agentes patogênicos intracelulares).

Adjuvantes de óleo são conhecidos por aumentar o componente humoral da resposta imune (tipicamente medida por ensaios de imunoglobulinas do grupo 1 ou IGG1), enquanto que as respostas de tipo de células (medidas indiretamente por IgG2) são muito difíceis de obter.

Sabe-se que as emulsões Ά/0, que geram as respostas imunes mais fortes, também induzem um componente de tipo celular, mas em menor medida, por exemplo, do que algumas moléculas solúveis (saponinas ou tipo surfactante catiônico) conhecidas por dirigir as resposta para os mecanismos de células.

As emulsões com uma fase aquosa contínua, usando os óleos minerais normalmente no mercado, são promotoras muito pobres de respostas de células.

Com efeito, o tipo de resposta gerada por vacinas é influenciado pela estrutura dos antígenos, mas também pela forma como é apresentada ao sistema imune através de adjuvantes. Os aditivos têm efeitos diferentes sobre a resposta imune, porque podem induzir uma resposta imune ao longo de um período mais longo ou mais curto, com uma predominância de tipo de célula ou de tipo humoral.

A imunidade mediada por células é importante e, por vezes, essencial para a proteção contra bactérias

10/40 intracelulares, vírus e a maioria dos parasitas. Ela está envolvida na maior parte dos mecanismos de proteção da vacina para além da resposta humoral.

É, por exemplo, possível classificar um adjuvante para induzir uma resposta imune de tipo de célula para a composição de vacina compreendendo o mesmo pela comparação das razões de IGG1/IGG2 medidas após a administração parentérica da composição de vacina compreendendo o mesmo para sujeitos relevantes, em diferentes períodos após o dia de vacinação de ditos sujeitos. Quanto maior for esta razão, maios o adjuvante será dirigido para a resposta imune da composição de vacina para um componente humoral. Um valor de razão de IGG1/IGG2 próxima da unidade será considerado como um sinal de uma resposta imune equilibrada para a composição de vacina entre os seus dois componentes. Um valor da razão de IGG1/IGG2 menor que a unidade será a característica de uma resposta imune para a composição de vacina predominantemente celular.

Um objeto da presente invenção é fornecer um adjuvante para a preparação de composições de vacina, que se destina a melhorar o componente celular da resposta imune, mantendo o bom nível do componente humoral. Assim, há uma necessidade de obter adjuvantes de vacinas com uma resposta imune equilibrada ou mesmo predominantemente celular. Além disso, as vacinas preparadas com o adjuvante que é o objeto da presente invenção apresentarão uma boa segurança.

Para este fim, a presente invenção refere-se a um adjuvante de vacina compreendendo para 100% da sua massa:

11/40

- de 10% a 95% e preferencialmente de 20% a 90%, de urn óleo mineral que compreende:

- de 0, 05% em massa a 10% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com menos de 16 átomos de carbono;

- de 0,05% em massa a 5% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com mais de 28 átomos de carbono;

- e tendo uma razão de P/N, correspondendo à razão entre a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo parafina e a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo nafteno, entre 2,5 e 3, para a fabricação de uma composição de vacina para a prevenção contra a coccidiose.

Além disso, as modalidades da invenção podem compreender um ou mais dos seguintes:

Adjuvante, tal como definido acima, para a fabricação de uma composição de vacina para a prevenção contra a coccidiose em animais, particularmente aves de capoeira.

Adjuvante, tal como definido acima, caracterizado pelo fato de que dita razão de P/N está entre 2,5 e 3, preferencialmente, entre 2,8 e 2,9.

Adjuvante, tal como definido acima caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

- de 5% a 90% de pelo menos um surfactante. Preferencialmente, a partir de 5% a 50%.

Em um outro aspecto, o objetivo da invenção é fornecer uma vacina destinada à prevenção contra a coccidiose compreendendo o adjuvante, tal como definido acima e pelo menos um antígenos.

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vacina como definida acima, destinada para a prevenção da coccidiose em animais, em particular, de aves de capoeira,

- vacina como definida acima, caracterizada pelo fato de que os coccídios são selecionados de entre o grupo consistindo em Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia, Neospora, preferencialmente, Eimera,

- vacina como definida acima caracterizada pelo fato de que está na forma de emulsão de água em óleo (A/O) e

- vacina como definids acima caracterizada pelo fato de que o antígeno é uma proteína recombinante compreendendo a sequência 3-1 de Eimera Acervulina.

De acordo com outro aspecto, o objetivo da invenção é o uso de um óleo mineral para a fabricação de uma vacina como definida acima, caracterizado pelo fato de que o dito óleo compreende, para 100% de sua massa:

- de 0,05% a 10% de cadeias de hidrocarbonetos com menos de 16 átomos de carbono;

- de 0,05% a 5% de cadeias de hidrocarbonetos com mais de 28 átomos de carbono;

e tem uma razão de P/N, correspondente à razão entre a quantidade de massa de cadeia de carbono tipo parafina e a quantidade de massa de cadeias de carbono tipo nafteno, de entre 2,5 e 3, preferencialmente, entre 2,8 e 2,9.

A composição da invenção pode vantajosamente também compreender um ou mais surfactantes emulsionantes. O último apresenta uma natureza lipofílica ou hidrofílica

13/40 caracterizada por um valor HLB (equilíbrio hidrofílicolipofílico) de entre 1 e 19.

Tal surfactante pode consistir em um alquilpoliglicosídeo ou uma mistura de alquilpoliglicosídeos de fórmula R_a-(O)-Zn, onde Ra representa um radical alifático saturado, linear ou ramificado, contendo de 4 a 24 átomos de carbono, Z é o resíduo de um açúcar, preferencialmente, glicose e n está entre 1 e 5, preferencialmente, entre 1,1 e 2,

- Saponinas,

- Ésteres de sorbitano, tais como oleato de sorbitano, estearato de sorbitano, palmitato de sorbitano, laurato de sorbitano;

- Ésteres de manitano, tais como oleato de manitano, estearato de manitano, palmitato de manitano, laurato de manitano;

- Ésteres de sorbitano polioxietilados entre 5 moles e 20 moles de óxido de etileno, tais como, por exemplo, oleato de sorbitano etoxilado com 20 moles de óxido de etileno;

- Ésteres de manitano polioxietilado entre 5 moles e 20 moles de óxido de etileno, tais como, por exemplo, oleato de manitano etoxilado com 20 moles de óxido de etileno;

- Lecitinas;

Alcanóis polietoxilados tais como, por exemplo, aqueles comercializados sob o nome BRIJ e, mais particularmente, o BRIJ 21 e BRIJ 221 pela empresa UNIQEMA;

14/40 polímeros surfactantes compreendendo blocos de polioxietileno e polioxipropileno, tais como aqueles vendidos sob a designação de PLURONICS pela BASF;

- Poliglicol ou poliglicerol polihidroxiestearatos tais como, por exemplo, os produtos designados HYPERMER™ B24 6, ARLACEL™ P135 comercializado pela UNIQEMA.

Pela expressão antígeno entende-se qualquer molécula com propriedades imunogênicas que são capazes de induzir uma resposta imune específica. Estes antígenos podem ser agentes patógenos inativados, tais como bactérias inativadas, moléculas extraídas de agentes patógenos, moléculas de DNA recombinantes produzidas por microorganismos .

Os óleos minerais são obtidos da destilação, seguida por hidrogenação extensiva de produtos de origem de petróleo. Eles consistem em moléculas químicas da família dos alcanos saturados. Para tais moléculas, o número de átomos de carbono (n) é geralmente superior a 9 e inferior a 30, conferindo uma aparência líquida em 25°C. A expressão parafina líquida também é usada. As parafinas sólidas consistem em moléculas químicas da família de alcano para o qual n é maior que 30, até 50 e assim conferem um aspecto sólido em 25°C. As parafinas líquidas, ou óleos minerais, são líquidos transparentes e inodoros, cuj a viscosidade dinâmica pode variar de 2 milliPascal.segundo (mPa.s) a 1 Pascal.segundo. A viscosidade dinâmica de óleos minerais está diretamente relacionada com o comprimento médio das cadeias de carbono de alcanos que consistem em ditos óleos minerais. Os alcanos com as maiores cadeias de

15/40 hidrocarbonetos são responsáveis pelas maiores viscosidades dinâmicas. As moléculas envolvidas podem estar na forma de cadeias de hidrocarboneto lineares ou ramificadas (colectivamente conhecidos como parafínicas (P) ou ciclizadas (nafténicas N)), mas ainda saturados (sem ligações duplas que são removidas durante o processamento por hidrogenação). As viscosidades, pontos de fusão e pontos de ebulição são diretamente ligados ao número de carbonos que a cadeia de hidrocarboneto cotem. Um óleo mineral branco pode ser caracterizado pela sua faixa de destilação, sua viscosidade dinâmica, seu número médio de átomos de carbono, mas também pela sua razão de P/N entre as moléculas lineares e ramificadas e a quantidade de moléculas ciclizadas (determinada de acordo com o método DIN 51378). Note-se que o critério da viscosidade dinâmica pode ser alterado artificialmente pela mistura de dois cortes diferentes.

EXEMPLOS

I) PARTE I

Os seguintes exemplos servem para realçar as propriedades das composições adjuvantes da presente invenção.

Neste trabalho, um estudo das propriedades adjuvantes de vários óleos caracterizados finamente tornou possível identificar novas composições originais caracterizadas pelos limites das composições estabelecidos por cromatografia.

O estudo envolve composições de vacinas experimentais em um primeiro caso com fórmulas fornecidas na forma de

16/40 emulsões água-em-óleo (A/0) permitiu estabelecer as condições ótimas para a obtenção de respostas imunes equilibradas entre os seus dois componentes e uma resposta imune com um componente celular predominante para fórmulas que são bem toleradas em camundongos. A próxima fase dos testes experimentais, realizada em outros tipos de fórmulas e diferentes animais permitiu demonstrar que as composições adjuvantes da presente invenção fornecem as melhores respostas imunes tanto quantitativamente quanto qualitativamente.

Nos seguintes exemplos, os óleos minerais selecionados são caracterizados por:

• Fração curta (SF) , expressa em porcentagem, correspondente à proporção de entidades com um número de átomos de carbono C < 16.

• fração pesada (HL), expressa em porcentagem, correspondente à proporção de entidades com um número de átomos de carbono C > 28.

• distribuição molecular (MD) (expressa como o número de átomos de carbono C) , calculada como o baricentro da curva entre C16 e C28, atribuindo o coeficiente de superfície de frações C16 a C20 semelhantes a 18 átomos de carbono, 20 átomos de carbono a 24 átomos de carbono semelhantes a 22 átomos de carbono e 24 átomos de carbono semelhantes a 28 átomos de carbono semelhantes a 26 átomos de carbono • razão de P/N (obtida pelo método padrão DIN 51378).

Os vários óleos testados estão apresentados na Tabela 1.

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	Ref. Óleo	SF	MD	HF	P/N
		(<C16)		(>C28)
	1	13,7	20,6	3,3	1,78
	2	4,9	21,5	7,1	1,86
	3	4,2	20,5	1,5	1,86
5	4	4,4	21,6	4,7	1,86
	5	47,7	18,4	0,5	1,86
	6	0,3	22,2	9,6	2,03
	7	30	18,3	0,6	2,19
	8	16	21,8	10	2,13
	9	2	19,3	2,2	2,85
10	10	48,2	18,4	0,6	1,86
	11	8,6	20,7	2,4	1,94
	12	20,8	21,9	8,7	1,86

Tabela 1: Painel de óleos sintetizados e caracterizados por ensaios biológicos.

ESTUDO NA FORMA DE EMULSÃO AGUA EM ÓLEO A/O:

A formulação é realizada em um modelo tipo adjuvante de Freund incompleto uniforme (IFA) é usada a 50% na emulsão de vacina que em virtude da simplicidade de sua fórmula (monooleato de manido a 15% + óleo mineral a 8 5%) permite 20 uma comparação relevante.

As propriedades biológicas de vacinas assim formuladas (IFA a 50% + 50% de solução isotônica de albumina de ovo a 10 qg/dose; uma dose = 100 μΐ de emulsão) foram então comparadas no modelo do camundongo para os parâmetros de 25 segurança (Tabela 2), e eficiência de resposta humoral ou celular.

A segurança é avaliada pela observação do local de injeção de 7 dias após a vacinação e, em seguida, marcando as reações locais (LR) , em uma escala que varia de 0 a 4.

18/40 depó síti cons necr agru prep com

Os Λ

Ref. óleo	SF «C16’	MD	HF OC28	P/N	LR
1	13,7	20,6	3,3	1,78	2,5
2	4.9	21.5	7.1	1.86	0.5
- 3	4.2	20.5	1.5	1.86	0
4	4.4	21.6	4.7	1.86	0.5
5	47.7	18.4	0.5	1.86	4
6	0.3	22.2	9.6	2 03	0
7	30	18 3	0 6	2.19	3
8	16	21.8	10	2 13	.2.5
9	2	19.3	.. 2.2	2.85	0
10	48.2	.18.4	0.6	1.86	4
11	8.6	20.7	2.4	1 94	... 0.5 ...
12	20.8	21.9	8.7	1.86	3

comp apro uso

Ref. óleo	SF «C16	MD	HF OC28	P/N	LR
1	13,7	20,6	3,3	1,78	2,5
2	4.9	„.21.5	7.1	1.86	0.5
3	4.2	.....20.5	1.5	1.86	0
4	4.4	21.6	„4.7	1.86	0.5
5	47.7	184	0.5	1 86	. 4 ...
6	0.3	22.2	9.6	2 03	0
7	30	.18.3	0.6	2.19	3
8	.. 16	21.8	10	2.13	2.5
....................9. .	2	.... J9.3	2.2	2.85	0
10	.... 48.2	18.4	-. .0.6 .	1.86	4
11	8.6	20 7	2.4	1.94	0.5
12	.. 20.8	21.9	8.7	1.86	3

Tabela 2: Avaliação da Segurança de vários óleos.

As fórmulas selecionadas foram então testadas quanto à sua eficácia imunológica no modelo de camundongo. As fórmulas que apresentem reações inaceitáveis foram eliminadas. As Tabelas 3 e 4 mostram as titulações de anticorpos determinadas, em comparação com um hidróxido de alumínio de referência (adjuvante inorgânico sólido usado em medicina veterinária e humana). As titulações são dadas 14/28/42/56/90 dias após as primeiras injeções para a resposta humoral (IGG1) e celular (IGG2). Uma segunda

19/40 injeção de fórmulas é feita 28 dias após o registro de titulações de anticorpos. Os resultados para a resposta em longo prazo (90 dias) indicam uma forte correlação entre os valores baixos de fração pesada e a intensidade da resposta humoral aos 90 dias. A resposta é significativamente reduzida quando a fração é maior que 4,7¾ (7,1¾ e 9,6¾).

Estes resultados demonstram que o óleo mineral para um adjuvante de vacina na forma de emulsão A/O contendo menos de 10¾ de SF, menos de 5¾ de HF e uma razão de P/N maior que ou igual a 1,9 induz boa resposta do tipo celular.

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	□14	D28	D42	□56	D90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	9600	16 000	128 000	128 000	128 000
3	4,2	20,5	1,5	1,86	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
4	4,4	21,6	4,7	1,86	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	9600	16 000	64 000	64 000	64 000
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
AIOH					16 000	4 800	4 800	2400	2400

Tabela 3: Resposta de anticorpos do tipo IGG1 contra

OVA em camundongos após para vários óleos após injeção na forma de uma emulsão A/0 como uma função do tempo.

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	D14	D28	D42	D56	D90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	9600	16 000	48 000	48 000	48 000
3	4,2	20,5	1,5	1,86	9600	16 000	48 000	48 000	48 000
4	4,4	21,6	4,7	1,86	9600	16 000	48 000	48 000	48 000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16 000	128 000	256 000	256 000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	9600 ,	16 000	128 000	256 000	256 000
AIOH					16 000'	4800	4800	2400	2400

20/40

Tabela 4: Resposta de anticorpos do tipo IgG2 contra OVA em camundongos para vários óleos após a injeção na forma de uma emulsão A/O

ESTUDO SOB A FORMA DE UMA EMULSÃO DE FASE AQUOSA CONTÍNUA:

Dois tipos galênicos que representam uma emulsão aquosa de fase contínua (emulsão múltipla A/O/A e microemulsão O/A) foram testados.

Microemulsão de óleo -em-água:

A fórmula adjuvante compreende, para 100% de sua massa, 40% em massa, de um surfactante hidrofílico (polissorbato 80) e 60% em massa de óleo mineral a ser testado; a fase oleosa assim formulada é emulsionada à temperatura ambiente por um homogeneizador a alta pressão na presença de uma fase aquosa compreendendo os antígenos (OVA); a fase oleosa previamente preparada é usada para 10% em massa na composição final da vacina (10gg/dose de OVA, 100 μΐ por injeção), um controle sobre hidróxido de alumínio está incluído no teste. Os resultados são apresentados na Tabela 5. A baixa intensidade da resposta de IGG1 está diretamente correlacionada com a presença de HL, que inibe a resposta em curto prazo (28 dias, D28) e resposta em longo prazo (90 dias, D90).

Da mesma forma, a Tabela 6 apresenta as titulações de IGG2 .

Os resultados mostram uma correlação entre a razão de P/N e resposta de IGG2; as fórmulas 6 e 9 se separaram dos outros produtos.

21/40

Ref. Óleo	SF (<C16)	Λΐυ	HF (>C28)	P/N	D14	D28	D42	D56	D90
2	4,9	21,5	7,1	1,9	12 800	16 000	96 000	48 000	48 000
3	4,2	20,5	1,5	1,9	9600	48 000	128 000	256 000	256 000
4	4,4	21,6	4,7	1,9	12800	48 000	128 000	128 000	128 000
6	0,3	22,2	9,6	2,0	4800	16 000	48 000	48 000	32 000
9	2,0	19,3	2,2	2,8	6400	48 000	32 000	128 000	128 000
11	8,6	20,7	2,4	1,9	9600	48 000	128 000	256 000	256 000
A1OH					16 000	4800	4800	2400	2400

Tabela 5: A resposta de anticorpos do tipo IgGl contra

OVA em camundongos para vários óleos na formar de uma microemulsão O/A como uma função do tempo.

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/\	1)14	1)28	1)42	1)56	D90
	4,9	21,5	7,1	1,86	400	12000	24 000	4000	400
3	4,2	20,5	1,5	1,86	G00	16000	24 000	1000	1000
1	1,1	21,6	4,7	1,86	150	8000	8000	1000	1000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	1800	16000	32 000	sooo	4000
9		19,3	2,2	2,85	1600	32000	48 000	96 000	96000
11	8,6	20,7	2.4	1,94	600	16000	24 00O	1000	4000
Al OH					150	150	150	300	300

Tabela 6: Resposta de anticorpos do tipo IgG2 contra

OVA em camundongos para vários óleos na forma de uma microemulsão O/A em função do tempo.

Comparações das razões de IgGl/IgG2 indicam claramente uma diferença no comportamento da resposta para os grupos vacinados com óleo 9 a um grau menor e com óleo 6 em comparação com outros óleos (Tabela 7).

22/40

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	D14	D28	D42	D56	D90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	32	1	4	12	120
3	4,2	20,5	1,5	1,86	16	3	5	256	256
4	4,4	21,6	4,7	1,86	85	6	16	128	128
6	0,3	22,2	9,6	2,03	1	1	2	6	8
9	2	19,3	2,2	2,85	4	2	1	1	1
11	8,6	20,7	2,4	1,94	16	3	5	256	64
A1OH					107	32	32	8	8

Tabela 7: Razão contra IgGl/IgG2 contra OVA em camundongos para vários óleos, sob a forma de microemulsão O/A em função do tempo.

Múltipla emulsão de água-em-óleo-água (A/O/A):

A fórmula adjuvante é este tempo composto de um éter de octadecenoato de anidromanitol quer com um equilíbrio hidrofílico lipofílico (HLB) = 9, disperso em 15% em massa no óleo mineral a ser testado. A composição de vacina é preparada por mistura a 3 0 °C de uma parte por peso de adjuvante com uma parte por peso do meio de antigênico (fase aquosa) compreendendo o antígeno OVA.

Teste em camundongos: os resultados dos testes de camundongos para as respostas de IGG1 e respostas de IGG2 são apresentados nas Tabelas 8 e 9, respectivamente. No que diz respeito à resposta celular, a variação dos valores para as respostas de IGG2 mostram que o óleo 9 induz uma resposta sustentada e intensa, especialmente depois de 28 dias .

Teste de modelo bovino: neste caso, as mesmas vacinas foram testadas em cinco bovinos injetados com 2 ml por via subcutânea; as fórmulas 9 e 11 foram comparadas. Os

23/40 resultados são apresentados na Tabela 10. Não foram observadas diferenças para titulações de IGG1 (dados não mostrados). Um efeito adjuvante forte foi observado em comparação com o antígeno individualmente. A resposta de IgG2 é muito intensa com óleo 9, baixa com óleo 11 e inexistente para o antígeno individualmente.

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	D14	D28	D42	D56	D90
2,0	4,9	21,5	7,1	1,9	16000	32000	64000	64000	64000
3,0	4,2	20,5	1,5	1,9	16000	64000	128000	128000	128000
4,0	4,4	21,6	4,7	1,9	16000	64000	128000	128000	128000
6,0	0,3	22,2	9,6	2,0	16 000	64000	64 000	64 000	64000
9,0	2,0	19,3	2,2	2,8	16 000	64000	128000	128000	128000
11,0	8,6	20,7	2,4	1,9	16 000	64000	128000	128000	128000
A1OH					16 000	4800	4800	2400	2400

Tabela 8: Respostas de anticorpos do tipo IGG1 contra

OVA no camundongo para vários óleos na forma de uma emulsão

A/O/A como uma função do tempo.

Ref, Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	D14	D28	D42	D56	D90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	400	12 000	24 000	4000	400
3	4,2	20,5	1,5	1,86	400	12 000	24 000	4000	400
4	4,4	21,6	4,7	1,86	400	12 000	24 000	4000	400
6	0,3	22,2	9,6	2,03	400	4 000	12 000	4000	400
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16 000	128 000	25600 0	25600 0
11	8,6	20,7	2,4	1,94	300	600	1 200	1200	1200
AiOH					150	150	150	300	300

24/40

Tabela 9: Resposta de anticorpos do tipo IgG2 contra OVA em camundongos para vários óleos na forma de emulsão A/O/A como função do tempo.

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	D0	D28	D60	D140
9	2	19,3	2,2	2,85		600	6 000	10 000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	-	10	600	2 000

Tabela 10: Resposta de anticorpos tipo lgG2a contra OVA em bovinos para o óleo 9 e 11, na forma de uma emulsão A/O/A em função do tempo.

Para melhorar o componente celular da resposta imune procura-se:

- A) obter uma resposta imune caracterizada por uma razão de IgGl/IgG2 entre 0,25 e 4, e

- B) obter uma resposta imune cujo componente celular é também intenso, que é caracterizada por uma IgG2 maior que ou igual a 32 000 após a vacinação de reforço administrada após 28 dias e após a medição da titulação de IgG2 nessa data (resposta secundária e de longo prazo).

A- Razão de IgGl/IgG2

a) Caso de adjuvantes de vacinas que estão na forma de uma emulsão A/O/A, os resultados de IgGl/IgG2 experimentais são como seguem:

• para óleo 6: 40 (D14), 16 (D28), 5,3 (D42), 16 (D56) e 160 (D90). .

• para o óleo de 11: 53,3 (D14), 107 (D28) , 107 (D42) , 107 (D56) e 107 (D90).

25/40 • para óleo 9: 1,7 (D14), 4 (D28), 1 (D42), 0,5 (D56) e 0,5 (D90).

O óleo 9 torna possível obter uma razão de IgGl/IgG2 de 0,25 e 4 antes e depois da vacinação de reforço em D28 (vacinação de reforço realizado a D28, é administrada após medição da resposta imune).

b) Caso de adjuvantes de vacinas que estão na forma de uma microemulsão O/A, a divulgação da invenção compreende os seguintes resultados experimentais de IgGl/IgG2:

• para óleo 6:	1	(D14),	1	(D28), 2	(D42),	6 (D56)	e 8
(D90)
• para	óleo	11:	16	(D14)	, 3	(D28), 5	(D42),	256 (D56)	e
64 (D90)
• para	óleo	9 :	4	(D14),	2	(D28), 1	(D42),	1 (D56)	e	1
(D90)
Para o	óleo	9,	a	razão	de	IgGl/IgG2	! entre	0,25 e	4	é

sempre obtida antes da vacinação de reforço em D28 e permanece constante ao longo do tempo.

Para o óleo 6 , a razão IgGl/IgG2 entre 0,25 e 4 é também obtida antes da vacinação de reforço (resposta primária), mas não permanecem ao longo do tempo durante a medição da resposta secundária (após o reforço da vacinação em D28) e resposta de longo prazo (D90).

Para o óleo 11, a razão de IgGl/IgG2 entre 0,25 e 4 não é observada para a resposta secundária nem para a resposta de longo prazo.

c) Caso de adjuvantes de vacinas sob a forma de uma emulsão A/O, a divulgação invenção compreende os seguintes resultados experimentais de IgGl/IgG2:

26/40 • para 9 óleo: 1 (D14) , 1 (D28), 1 (D42), 1 (D56) e 1 (D90)

Todos esses resultados obtidos mostram bons resultados para a razão de IgGl/IgG2.

B- Intensidade de respostas de IgG2

a) Caso de adjuvantes de vacinas que estão na forma de uma emulsão A/O/A, os resultados experimentais de IgG2 são os seguintes (Tabela 9):

a. para o óleo 6 (D14) , 4 000 (D28) , 12 000 (D42) , 4 000 (D56) e 400 (D90)

b. para o óleo 11: 300 (D14) , 600 (D28) , 1200 (D42), 1200 (D56) e 1200 (D90)

c. para o	óleo	9: 9600 (	D14) , 16 000 (D28) ,	128 000
D42), 256 000	(D56)	e 256 000	(D90)
0 óleo 9	torna	possível	obter uma intensa	resposta

celular (de acordo com os critérios previamente definidos) após a vacinação de reforços administrados após 28 dias.

b) Caso de adjuvantes de vacinas na forma de uma microemulsão O/A, a divulgação da invenção compreende os seguintes resultados experimentais de IgG2 (Tabela 6):

a.	. para	óleo 6 :	4800	(D14)	, 16	000	(D28),	32	000	(D42),
8 000	(D56)	e 4000 1	:d9oj
b.	. para	óleo 11:	600	(D14)	, 16	000	(D28),	24	000	(D42),
1000 I	(D56) e	: 40000 (	:D90)
c .	para	o óleo	9 :	1600	(D14)	, 32	000	(D28	)	48 000

(D42), 96 000 (D56) e 96 000 (D90)

O óleo 9 torna possível obter uma intensa resposta celular (de acordo com os critérios previamente definidos)

27/40 para a resposta secundária (após a vacinação de reforço) e para a resposta de longo prazo (D90).

c) Caso de adjuvantes de vacinas, na forma de uma emulsão A/0, cu j a divulgação da invenção compreende os seguintes resultados experimentais de IgG2 (Tabela 4):

a. para o óleo 9: 9600 (D14) , 16 000 (D28), 128 000 (D42), 256 000 (D56) e 256 000 (D90)

Todos esses resultados mostram bons resultados registrados pela resposta de IgG2 .

De acordo com estes resultados ê mostrada claramente

que uma composição	de i	um óleo mineral para uso	como uma
injeção de adjuvante	de vacina, objeto da	presente
invenção, tal como	óleo	9 por exemplo, tendo as	seguintes
características:
- SF < 10% e HL	< 5%	f
- P/N entre 2,5	e 3	(cerca de 2,85 aqui);
assegura uma	boa	segurança, boa eficácia	como na

resposta humoral e uma forte resposta celular, tanto sob a forma de emulsão A/O e A/O/A quanto de microemulsão e O/A.

II) PARTE DOIS

TESTES série 1: trabalho experimental em um modelo de ¹¹ frango

No contexto de ensaios experimentais usados, a eficácia da resposta para cada fórmula baseia-se nos seguintes critérios:

a) titulação de anticorpo nos soros;

b) infiltração de células brancas no local da injeção;

28/40

c) desafio de virulência consistindo em inoculação de animais com 10 000 oocystes de cepa Eimeria acervulina de duas semanas após o tratamento, e de comparação:

a. ganho de peso por animais

b. o número de parasitas excretados

Tabela 11 Mostra as várias fórmulas que foram testadas:

GRUPO	A	B	C	D	E	F
EMULSÃO	A/0	A/0	A/O/A	A/O/A '	CFA	sem emulsão
ÓLEO	1	2	1	2	mineral padrão	sem óleo

Tabela 11

Os óleos envolvidos nos testes experimentais são caracterizados na tabela abaixo:

Ref. Óleo	SF (<C16)	MD	HF (>C28)	P/N	LR
Mineral padrão	4,9	21,5	7,1	1,86	0,5
Óleo 1 (01)	2	19,3	2,2	2,85	0
Óleo 2 (02)	8,6	20,7	2,4	1,94	0,5

As formulações dos grupos A e B, isto é, emulsões A/Ol (Grupo A) e emulsões A/02 (Grupo B), compreendem para 100% de sua massa:

0% em massa de uma fase aquosa compreendendo o ant ígeno e água em massa de óleo adjuvante contendo 100% de sua massa:

15% em massa de oleato de manitano

85% em massa de óleo (óleo 1 ou 2)

O antígeno, formulações em a proteína 3-1 E, está presente nestas uma quantidade tal que uma dose da

29/40 formulação injetada compreende 50 gg de antígeno, o volume da dose da formulação injetada sendo 100 μύ.

As formulações em grupos C e D, ou seja, microemulsões A/Ol/A (Grupo C) e microemulsões A/02/A (Grupo D) compreendem para 100% de sua massa:

90% em massa de uma fase aquosa compreendendo o antígeno e água

- 10% em massa de adjuvante de óleo compreendendo 100% da sua massa:

o 40% em massa de oleato de sorbitano etoxilado com moles de óxido de etileno (Polissorbato 80) o 60% em massa de óleo (óleo 1 ou 2).

O antígeno, a proteína 3-1 E, é (estão) presente(s) nestas formulações em uma proporção tal que uma dose de formulação injetada compreende 50 μg de antígeno, o volume da dose de formulação injetada, sendo 100 μΕ.

No caso de titulações de anticorpos nos soros, todos os grupos testados tiveram titulações de anticorpos séricas e equivalentes e elevadas exceto o grupo tenso a proteína individualmente (Grupo F) . A resposta humoral obtida para cada um dos grupos está a um nível elevado e satisfatório (resultados não mostrados).

No caso da infiltração de células brancas no local da injeção, as intensidades de infiltrações locais dessas células brancas (linfócitos e macrófagos) foram avaliadas por imunofluorescência indireta em seções de tecido para grupos diferentes.

As biópsias foram realizadas em 3 animais de cada grupo, no local da injeção, a fim de obter amostras da pele

30/40 destes animais. Esta biópsia foi realizada um dia após a segunda imunização de ditos animais, ou 28 dias após a primeira imunização. Estas imunizações consistiram em injeções de uma mistura de profilina e formulações testadas. Um controle, consistindo em uma injeção de profilina sem meio de vacina, também foi realizada nas mesmas condições de operação. As amostras assim obtidas foram imediatamente congeladas em meio contendo nitrogênio líquido e armazenadas a uma temperatura de - 20°C. Pedaços de 5 μΐϊΐ de cada amostra foram então colocados em suportes que foram pré-limpos e lavados em acetona durante 20 minutos a 4 °C, e fixos por um soro de cavalo a 10% durante 20 minutos a uma temperatura de 20⁰C. Anticorpos CD8 de galinha, diluídos de 1/200, foram adicionados e então a mistura resultante foi incubada em temperatura ambiente (20°C), durante 2 horas. Os suportes foram então lavados com tampão de fosfato e incubados com anticorpo secundário de IgG galinha antigalinha marcado com Alexa Fluor 488 (comercializado como Invitrogen pela empresa Carlsbad) a uma diluição de 1:500 durante 2 horas à temperatura ambiente (20°C). Os suportes foram então colocados em contato com um indicador colorimétrico, o Fluoromount-G, e observados com um microscópio eletrônico (comercializado como LSM 510 META pela empresa Carl Zeiss) .

Usando este protocolo, a visualização de células CD8+ foi avaliada por uma escala de avaliação por uma pontuação de acordo com a seguinte escala:

- pontuação 0: ausência de manchas de células CD8 + observadas,

31/40

- pontuação observação de uma presença, de uma baixa densidade de células CD8 + ,

- pontuação + +: observação de uma forte presença, de uma alta densidade de células CD8+, e

- pontuação ”+ + observação de uma presença muito forte, de uma densidade muito elevada de células CD8 + .

Quanto maior a quantidade e densidade de linfócitos e macrófagos observados no local da inj eção, maior será a capacidade para a vacina testada desenvolver uma resposta imune eficaz.

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 12

GRUPO	A	B	c	D	E	F
Adjuvante	A/01	A/02	A/01/A	A/02/A	CFA	SEM ADJUVANTE
Antígeno	sim	sim	sim	sim	sim	sim
Linfócito	+++		++	++	h	0
Macrófago	++	+			+	0

Tabela 12

Em comparação com a vacina compreendendo o adjuvante do estado da técnica (Grupo E) , as vacinas de acordo com a invenção melhoram a produção de linfócitos no local da injeção para os grupos D, C e A, enquanto que para os macrófagos, apenas a vacina de acordo com a invenção do grupo A torna possível melhorar a produção de macrófagos e outras vacinas de acordo com a invenção torna possível obter de resultados para a produção de macrófagos no local da inj eção semelhante ao da vacina compreendendo o adjuvante do estado da técnica.

32/40

NO caso de desafio de virulência, uma proteção eficaz pela vacina vai significar que os animais:

vão apresentar um ganho de peso semelhante em comparação com controles ao não vacinados e não desafiados;

vao apresentar uma redução da carga parasita (avaliada pelo número de parasitas excretados) em comparação com animais desafiados e não vacinados.

Em geral, o desafio de virulência corresponde a administração de uma dose controlada e precisa de agente patogênico contra a qual os animais foram previamente vacinados. A proteção induzida por vacinas experimentais é avaliada de acordo com vários critérios, dependendo do modelo animal e da natureza do agente patogênico.

Dois critérios principais foram monitorados por desafio pós-virulento:

- ganho de peso dos animais 10 dias após a infecção, e

- Redução do número de patógenos excretados.

o Ganho de peso dos animais 10 dias após a infecção.

A Tabela 13 resume os resultados obtidos durante a vacinação e infecção de galinhas contra coccidiose aviária (cepa usada Eimeria acervulina) . A patogenicidade desta cepa é importante e resulta em uma mudança no ganho de peso dos animais infectados.

GRUPO	A	B	C	D	E	F	G	H
EMULSÃO	A/01	A/02	A7O1/A	A/02/A	CFA	SEM ADJUVANTE	SEM VACINA	SEM VACINA
Antigen o	sim	sim	sim	sim	sim	sim	não	não
DESAFIO VIRULENTO	10 000 oocitos de Emeria acervulina	SEM ' DESAFIO
PESO GANHO APÓS DEZ DIAS DE DESAFIO	834	798	802	740	773	735	730	850
_

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TABELA 13: peso ganho de diferentes grupos após o desafio virulento.

Pode-se observar que, para indivíduos testados, a vacinação sem adjuvante não induz a proteção em termos de ganho de peso: já que controles sem adjuvante (Grupo F) e sem vacina (Grupo G) induzem resultados semelhantes.

Em comparação com o sujeito testado e não vacinado (Grupo G) , as vacinas de acordo com a invenção compreendendo um adj uvante à base de óleo 01 e 02 permitem ganho de peso significativo com a exceção das vacinas do Grupo D.

Em comparação com a vacina compreendendo o adjuvante do estado da técnica (Grupo E) , as vacinas de acordo com a invenção induzem um ganho de peso maior comn a exceção da vacina que está na forma de uma emulsão A/02/A (Grupo D).

Note-se também que as vacinas da invenção compreendendo um adj uvante à base de óleo 1 induzem um ganho de peso maior que as vacinas da invenção compreendendo um adjuvante à base de óleo 2.

No caso de vacinas de acordo com a invenção do grupo A, o ganho de peso é inferior a 1,9% em comparação com o ganho de peso de sujeitos não desafiados.

Além disso, para cada um dos óleos minerais considerados (01 ou 02) , será observado que as vacinas experimentais formuladas em emulsão de água/óleo parecem mais protetoras do que as fórmulas de água/óleo/água:

- para óleo 1, o ganho de peso para uma vacina sob a forma de uma emulsão A/01 (grupo A) é 834 g, um ganho de peso de 9 9g em comparação com animais do grupo sem

34/40 adjuvante (grupo F ), enquanto que para uma vacina na forma de uma emulsão A/Ol/A, o ganho de peso de (grupo C) é de 802 gramas e tem um ganho de peso de 67 g em comparação com animais do grupo sem adjuvante (grupo F ).

- para óleo 2, o ganho de peso para uma vacina na forma de uma emulsão A/02 (grupo B) é de 798 g, um ganho de peso de 63g em comparação com animais do grupo sem adjuvante (grupo F) , enquanto que para uma vacina na forma de um ganho de peso de emulsão A/O2/A (grupo D) é de 740 gramas e tem um ganho de peso de 5 g em comparação com animais do grupo sem adjuvante (grupo F).

o Redução no número de patógenos excretados:

Os resultados estão incluídos na Tabela 14.

Os resultados são expressos como uma redução no número de oocistos excretados (quanto mais animais são infectados, mais eles excretam, de modo que eles foram menos protegidos).

GRUPO	A	B	C	D	E	F
Adjuvante	A /OI	A /02	A/Ol/A	A/O2/A	CFA	SEM ADJUVANTE
Antígeno	sim	sim	sim	sim	sim	sim
Meio excretado (X10E 8)	1,42	2,75	2,54	3,09	2,13	2,86
DESVIO PADRÃO	0,23	0,52	0,8	0,39	0,49	0,36

TABELA 14

Comparadas com o grupo de controle F (antígeno mas sem adjuvante) , as vacinas da invenção induzem uma diminuição da média excretada.

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Comparada com o Grupo Ε (antígeno + adjuvante do estado da técnica) , a vacina de acordo com a invenção do grupo 1 fornece uma redução na média excretada.

Além disso, o desvio padrão para o Grupo A é a mais baixo, indicando uma resposta mais homogênea de animais vacinados. Este critério é importante porque isso significa que as sensibilidades individuais na resposta biológica dos animais são abrandadas pela a eficácia da vacina.

CONCLUSÃO DO TESTE 1

As vacinas incluindo adjuvantes de acordo com a invenção ajudam a fornecer uma melhor resposta imune e maior eficiência na prevenção de coccidiose em aves.

Além disso, a vacina de acordo com a invenção que está na forma de uma emulsão de A/Ol, com 01 caracterizado por uma razão de P/N > 2, tem a vantagem de estimular uma maior produção de glóbulos brancos no local da injeção, e de conciliar, após o desafio de virulência com uma cepa .Eimeria acervulina, tanto o ganho de peso mais alto quanto uma redução muito significativa na excreção de oocistos.

Séries de TESTE 2: Considerando a séries de TESTE 1 e suas conclusões, nomeadamente a observação de melhor desempenho para uma vacina que compreende:

- a proteína recombinante compreendendo a sequência de Eirnera acervulina 3-1.

- Óleo 1

- Água

- Um sistema surfactante na forma de uma emulsão A/0, os inventores realizaram dois tipos de desafio de virulência:

36/40 um desafio de virulência com a cepa Eimeria acervulina (AE),

- um desafio de virulência com cepas de Eimeria tenella (ET) .

As formulações testadas, nomeadamente emulsões A/Ol, para compreender 100% de sua massa:

0% em massa de uma fase aquosa compreendendo o antígeno e água

- 70% em massa de adjuvante de óleo compreendendo para 100% de sua massa:

o 15% de oleato de manitano;

o 85% em massa de óleo (óleo 1 ou óleo 2).

O antígeno, a proteína 3-1 E, está presente nestas formulações em uma quantidade tal que uma dose de formulação injetada compreende 30 qg de antígenos, o volume da formulação de dose injetada é de 100 gL.

Para identificar proteções cruzadas a expansão das propriedades da vacina experimental foi testada. Com efeito, a resposta imune induzida por tipo de célula, assim, tornou possível proteger contra várias cepas de parasitas.

A dose de proteína usada é de 30 gg/ml. O desafio virulento é realizado pela administração de 10000 oocistos por pássaro (Tabela 15) .

Os animais foram, então, monitorados sobre os parâmetros de ganho de peso, anticorpos, proliferação de linfócitos do baço após reestimulação antigênica ou com mitogenes (para quantificar a resposta celular) e proteção durante um desafio virulento.

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E. acervulína: é moderadamente patogênico. As lesões estão localizadas no intestino delgado, especialmente no duodeno, com manchas e então estrias na membrana da mucosa = lesões em escala. As lesões são causadas por oocistos.

E. tenella: é o coccidia mais patogênico, as lesões sendo causadas por esquizontes.

As lesões que são localizadas no ceco, que são cheias com o sangue, podem romper-se, ou se tornar gangrenosas. A carcaça pode estar anêmica. A mortalidade é geralmente alta.

A Tabela 15 descreve os vários grupos de teste:

GRUPO	A	B	C	D	E	F	G	H	I
Descrição	não vacinado	não vacinado	não vacinado	vacinado	vacinado	vacinado	vacinado	vacinado	vacinado
Antígeno 3-1 E (30 pg/ml)	não	não	não	sim	sim	sim	sim	sim	sim
Adjuvante	não vacinado	não vacinado	não vacinado	não	não	CFA	CFA	A.'01	A Ό1
Cepa de desafio de virulência	não desafiado	EA	ET	EA	ET	EA	ET	EA	ET

TABELA 15

CFA: Adjuvante de Freund completo (adjuvante do estado da técnica)

As galinhas vacinadas nos vários grupos são então monitoradas por diferentes critérios:

a) ganho de peso;

b) produção de titulações de anticorpos (sorologia);

c) avaliação das intensidades de infiltrações locais de glóbulos brancos (linfócitos) pelo método de imunofluorescência indireta em amostras de esplenócitos de baço tomadas 48 h após a vacinação (ou imunização) . Estas

38/40 imunizações consistiram em injeções de uma mistura de Profilina e formulações testadas. Um controle, consistindo em uma injeção de profilina sem meio de vacina, também foi realizada nas mesmas condições de operação. O procedimento usado é idêntico ao usado em amostras de peles de animais, o qual é descrito acima, a saber:

- conservação de amostras de esplenócitos a -20°C

- colocação de amostras de esplenócitos em suporte e lavagem em acetona durante 20 minutos a 20°C adição de anticorpo CD8 diluído de 1/200 e subsequente incubação durante 2 horas a 20°C

- lavagem de suportes obtidos com uma solução tampão de fosfato, e incubação subsequente com um anticorpo secundário de IgG galinha antigalinha marcado com Alexa Fluor 4 8 8 a uma di luição de 1/500 durante 2 horas à temperatura ambiente (20°C)

- contato com o Fluoromount-G indicador colorimétrico observação com um microscópio eletrônico (comercializado como LSM 510 META pela empresa Carl Zeiss).

Usando este protocolo, a visualização de células CD8+ (linfócitos) foi avaliada por uma escala de avaliação por uma pontuação de acordo com a seguinte escala:

- pontuação	0: ausência de	manchas de células CD8+
observadas,
- pontuação	” + ” : observação	de	uma presença, de uma
baixa densidade	de células CD8+,
- pontuação	¹¹ + + : observação	de	uma forte	presença, de

uma alta densidade de células CD8+, e

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- pontuação + + + : observação de uma presença muito forte, de uma densidade muito elevada de células CD8+;

d) número de oocistos excretados.

Resultados:

- ganho de peso: os grupos vacinados com a vacina que está na forma de uma emulsão A/Ol são caracterizados por um ganho de peso semelhante ao observado por outros grupos (resultados não mostrados) ;

Sorologia: elevada produção de titulações de anticorpos, maior que a observada para os grupos vacinados com a vacina tendo CFA como adjuvante e do que a observada para os grupos vacinados com uma vacina não tendo nenhum adjuvante (resultados não mostrados);

proliferação de linfócitos: as pontuações mais elevadas foram obtidas para os grupos Hei vacinados com o a vacina que está na forma A/O e que compreende o adjuvante com óleo 01.

GRUPO	A	B	C	D	E	F	G	H	1
índice de proliferação de linfócitos	0	0	0	0	0	0	0	++	++

- Número de oocistos excretados:

As Tabelas 16 e 17 mostram os resultados do número de oocistos excretados, respectivamente, para os grupos que foram submetidos a desafio de virulência com Eimeria acervulina e Eimeria tenella, respectivamente.

GRUPO	B	D	F	H
Média (X 10 E 8)	3,44	3,33	3,30	2,71
Desvio Padrão	0,50	0,67	0,89	0,27

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Tabela 16: Resultados da excreção após desafio virulento com a cepa EA

GRUPO	C	E	G	I
Médio (X 10 E 8)	1,49	1,20	1,11	0,95
Desvio Padrão	0,23	0,27	0,42	0,13

Tabela 17: Resultados da excreção após desafio virulento com a cepa ET.

Para ambas as cepas, os grupos vacinados com a vacina compreendendo o adjuvante de 01 mostrou uma média de excreção que é menor que a observada em grupos vacinados com a vacina compreendendo o adjuvante do estado da técnica (CFA) . O mesmo é verdadeiro em comparação com os grupos vacinados com uma vacina não contendo nenhum adjuvante (grupos D e E).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vacina adjuvante, caracterizada pelo fato de que compreende, para 100% de sua massa:

- de 10% a 95% de um óleo mineral que compreende:

- de 0,05% em massa a 10% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com menos de 16 átomos de carbono;

- de 0,05% em massa a 5% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com mais de 28 átomos de carbono;

- e tendo uma razão de P/N, correspondendo à razão entre a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo parafina e a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo nafteno, entre 2,5 e 3, para a fabricação de uma composição de vacina para a prevenção contra a coccidiose.
2. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição de vacina destinada para a prevenção contra coccidiose em animais, em particular, aves de capoeira.
3. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita razão de P/N está entre 2,8 e 2,9.
4. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:

- de 5% a 90% de pelo menos um surfactante.
5. Vacina destinada para a prevenção contra coccidiose, caracterizada pelo fato de que compreende o adjuvante tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, e pelo menos um antígeno.

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6. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é para a prevenção contra a coccidiose em animais, particularmente aves de capoeira.
7. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que os coccídios são selecionados de entre o grupo consistindo em Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia, Neospora, preferencialmente, Eimera,
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está na forma de emulsão do tipo água-em-óleo (A/0).
9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o antígeno é uma proteína recombinante contendo a sequência de Eimera Acervulina 3-1.
10. Uso de um óleo mineral para a fabricação de uma vacina, tal como definida em qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o dito óleo compreende, para 100% de sua massa:

- de 0,05% em massa a 10% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com menos de 16 átomos de carbono;

- de 0,05% em massa a 5% em massa de cadeias de hidrocarbonetos com mais de 28 átomos de carbono;

e tendo uma razão de P/N, correspondendo à razão entre a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo parafina e a quantidade em massa de cadeias de hidrocarbonetos do tipo nafteno, entre 2,5 e 3.