ES2599997T3 - Adyuvante para la preparación de composiciones de vacunas destinadas a la prevención de las coccidiosis - Google Patents

Abstract

Adyuvante de vacuna, que comprende para el 100 % de su masa: - de 10 % a 95 % de un aceite mineral que comprende: - de 0,05 % en masa a 10 % en masa, de cadenas hidrocarbonadas que tienen menos de 16 átomos de carbono; - de 0,05 % en masa a 5 % en masa, de cadenas hidrocarbonadas que tienen más de 28 átomos de carbono; - y que tiene una relación P/N, que corresponde a la relación de la cantidad en masa, de las cadenas hidrocarbonadas de tipo parafínico sobre la cantidad en masa, de las cadenas hidrocarbonadas de tipo nafténico, comprendida entre 2,5 y 3.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

DESCRIPCION

Adyuvante para la preparacion de composiciones de vacunas destinadas a la prevencion de las coccidiosis

La presente invencion se refiere a nuevos adyuvantes para la preparacion de composiciones de vacunas destinadas a la prevencion contra las coccidiosis en las aves de corral, a las composiciones de vacunas que comprenden dichos adyuvantes, asf como a la utilizacion de un aceite mineral espedfico para la fabricacion de dicho adyuvante.

Las coccidiosis son enfermedades parasitarias frecuentes en las aves de corral.

Un ave de corral es un ave domestica, que pertenece generalmente a las gallinaceas o a las palirnpedas, criada para la produccion de carne o de huevos, ya sea en una granja tradicional o en criaderos industriales.

Por aves de corral, se entiende: el pollo, el pavo, la oca, el pato, la gallina de guinea, la paloma, la codorniz, el faisan, el avestruz.

El agente etiologico (o portador de la enfermedad) es un parasito protozoario intracelular, que se denomina coccidio, y pertenece lo mas frecuentemente al genero Eimeria.

Hay varios tipos de coccidios para cada especie aviar:

Coccidios del pollo: E. acervulina, E. necatrix, E. maxima, E. brunetti, E. tenella, E. mitis, E. praecox.

Coccidios del pavo: E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. dispersa, E. gallopavonis.

Coccidios de la oca: E. truncata (que tambien puede afectar al pato de Berbena y al cisne), E. anseris.

Coccidios del pato: Tyzzeria perniciosa, E. mulardi. La enfermedad afecta sobre todo al pato mulard.

Coccidios de la gallina de Guinea: E. Numidia, E. grenieri (la mas comun, pero con menos poder patogeno). Coccidios de la paloma: E. labbeana.

La prevencion de la coccidiosis se basa en las siguientes soluciones:

a) Un metodo de quimioprevencion:

Este metodo utiliza compuestos qmmicos del tipo antibioticos y tiene como inconvenientes:

- generar riesgos de desarrollo de alergias en los animales tratados con estos antibioticos, especialmente debido a la presencia de “residuos” o de sub-productos no deseados en estos antibioticos;

- generar riesgos de desarrollo de resistencias frente a los antibioticos en las especies tratadas;

- estar regulado por una reglamentacion exigente;

- alterar el aspecto de la carne de las aves de corral comercializada, con el riesgo de no beneficiarse de los sellos de calidad que reivindican un criadero en condiciones “naturales”.

b) Un metodo de vacunacion que implica vacunas “vivas”.

Las vacunas derivadas de agentes vivos atenuados se preparan por la multiplicacion de los agentes infecciosos en el laboratorio hasta que pierden naturalmente o artificialmente, por mutacion, su caracter patogeno.

Las cepas obtenidas son incapaces, entonces, de desarrollar plenamente la enfermedad que generaban antes.

Estas cepas conservan, sin embargo, sus antfgenos, y su capacidad para inducir respuestas inmunitarias.

Este modo de vacunacion permite, despues de administracion a los animales, colonizar las vfas digestivas y evitar la implantacion de cepas que tengan factores de virulencia.

Este metodo de vacunacion presenta como inconvenientes:

- posibles retornos a la virulencia;

- tener que realizar cultivos a gran escala de bacterias potencialmente patogenas;

- los animales vacunados de este modo pueden excretar, constituyendo asf una fuente potencialmente patogena en el medio ambiente y, por los tanto la potencial diseminacion de estos patogenos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Este ultimo inconveniente, constituye, por tanto, una razon por la que no es favorable, en el caso de los criaderos de aves de corral al aire libre, para vacunar contra la coccidiosis que es una enfermedad parasitaria y por lo tanto facilmente transmisible por diseminacion.

Las vacunas anticoccidiales son medicamentos veterinarios. Por lo tanto, estan sometidas a la legislacion que se aplica a los medicamentos veterinarios, que depende a su vez de la legislacion sobre los medicamentos.

Tres vacunas anticoccidiales estan autorizadas en Francia: son vacunas vivas constituidas por cepas "precoces", atenuadas, pero inmunogenas y protectoras frente a las especies presentes sobre el terreno.

Estas tres vacunas no son utilizables mas que para la especie pollo (Gallus gallus), ya que contienen solamente cepas susceptibles de parasitar esta especie de ave, no existe inmunidad cruzada frente a las diferentes especies de coccidios.

c) Los metodos de vacunacion convencionales con un antigeno no vivo o "inactivado"

La eficacia de las vacunas existentes no es satisfactoria, porque el nivel del componente celular de la respuesta inmunitaria no es bastante elevado para inducir protecciones eficaces en el caso espedfico de enfermedades parasitarias, como la coccidiosis en particular.

Se han descrito muchos de los ADNc que codifican los antigenos de Eimeria, y estan en curso ensayos de inmunizacion con algunos de ellos. El desarrollo de la resistencia depende tambien de los antecedentes geneticos y del modo de administracion (y del adyuvante). Algunos antfgenos han mostrado una proteccion parcial. La investigacion tiene como objetivo antigenos comunes a varias especies de coccidios: por ejemplo, el antigeno GX3262 reactivo con un anticuerpo monoclonal que reconoce un antigeno de esporozoitos comun para las siete especies de coccidios de pollo, induce una proteccion parcial.

Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar estas composiciones de vacunas inactivadas.

El desarrollo de vacunas inactivadas o que contienen antigenos purificados, es cada vez mas importante ya que permite evitar al maximo los efectos secundarios indeseables en los sujetos vacunados durante y despues de la vacunacion. Sin embargo, la mejora de la calidad de los antigenos se hace en detrimento de su inmunogenicidad. Es por esta razon por lo que se asocian con adyuvantes que permiten aumentar la respuesta inmunitaria en los sujetos vacunados.

Estos adyuvantes son de diversa naturaleza. Pueden consistir, por ejemplo, en liposomas, en emulsiones que comprenden al menos una fase oleosa y al menos una fase acuosa, del tipo de los adyuvantes denominados de Freund o, de manera mas comun, en sales minerales insolubles en agua. Entre las sales minerales utilizadas como adyuvantes de composiciones vacunales, se pueden citar, por ejemplo, el hidroxido de aluminio, el nitrato de cerio, el sulfato de zinc, el hidroxido de hierro coloidal o el cloruro de calcio. El hidroxido de aluminio es el adyuvante utilizado mas comunmente. Estas sales minerales utilizadas como adyuvantes de composiciones vacunales se describen especialmente en el artfculo de Rajesh K. Gupta et al. "Adyuvants, balance between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, vol. 11, Issue 3, 1993, pages 993-306.

Los adyuvantes mencionados antes, presentan como inconveniente una eficacia baja. Ademas, se sabe que el hidroxido de aluminio no induce eficazmente mas que una inmunidad humoral, y no una inmunidad celular. Por otra parte, pueden inducir una cierta toxicidad frente a los sujetos tratados. Mas particularmente, cuando estas composiciones vacunales se inyectan a los sujetos a vacunar, se puede observar la formacion de lesiones y de otras reacciones locales, tales como granulomas en el sitio de inyeccion.

Otros adyuvantes, constituidos por sales de metales divalentes o trivalentes o incluso de compuestos simpaticomimeticos se describen, respectivamente, en las solicitudes de patentes internacionales publicadas con los numeros WO 96/32964, WO 98/17311 y WO 98/15288.

Las emulsiones son mezclas estables constituidas por un sistema de dos lfquidos no miscibles, de los cuales uno esta dividido en gotitas en el otro. Asf, las emulsiones comprenden aceites, una fase acuosa y agentes tensioactivos que tienen como funcion dispersar una de las dos fases en la otra y obtener una mezcla macroscopicamente homogenea y estable. A menudo se utilizan como adyuvantes de la inmunidad en las formulaciones vacunales (vease, por ejemplo, el artfculo de J. Aucouturier et al. “Montanide ISA 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines", Expert Review of Vaccines, vol. 1, n° 1, 1 juin 2002, pages 111-118).

La utilizacion de aceites minerales como adyuvantes de vacunas se conoce desde hace muchos anos (Freund 1956, Herbert 1967). Los aceites minerales utilizados como adyuvantes de vacunas son hidrocarburos lfquidos, que se obtienen por destilacion del petroleo y por la realizacion de etapas de tratamiento posteriores, como por ejemplo, las etapas de desulfuracion, desasfaltado, extraccion de los compuestos aromaticos, extraccion de las ceras, y otras etapas de tratamiento de acabado. Los estudios de la influencia de la calidad de los aceites sobre la respuesta inmunitaria solo se han realizado gradualmente y de manera incompleta. En efecto, la composicion de los aceites minerales esta muy influenciada por el origen geografico de los productos brutos utilizados asf como por el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

procedimiento (productos qmmicos y equipo) que se utiliza para su preparacion. Los estudios efectuados sobre las diferentes fracciones estaban destinados a evaluar el caracter toxico para los trabajadores que los utilizan, pero no para su utilizacion en la salud animal o humana). Se han realizado optimizaciones de composicion de estos aceites minerales, basadas en las caracterizaciones macroscopicas (viscosidad, punto de fusion), con los grados existentes de aceites minerales industriales o de productos qmmicos puros de laboratorio que no se corresponden con las definiciones ni con la caracterizacion de los grados de materias primas aceptables. Asf, los estudios, incluso avanzados, efectuados sobre los grados industriales de aceites minerales definidos por parametros que no reflejan sus propiedades biologicas, dieron lugary todavfa dan lugar a variaciones de comportamientos durante la utilizacion de las vacunas en funcion del origen de un lote de aceite mineral. Estos lotes, aunque responden a sus condiciones y especificaciones analfticas macroscopicas y tienen el mismo nombre comercial, tienen composiciones suficientemente diferentes para no dar las mismas propiedades a las vacunas. Ademas, la viscosidad de las emulsiones obtenidas a partir de los aceites minerales, sin optimizacion galenica, induda un sesgo en la interpretacion de los resultados.

La influencia de la distribucion entre cadenas lineales y dclicas ha sido evaluada para buscar una toxicidad eventual durante la utilizacion de los aceites minerales en inyectables, haciendo sospechar el papel teratogeno de las formas dclicas. Los criterios de toxicidades han sido identificados ademas como procedentes de las formas insaturadas, eliminadas perfectamente en los procedimientos actuales por hidrogenacion forzada.

No se ha realizado ningun estudio con el fin de evaluar la influencia de la relacion de constituyentes de tipo lineal o dclico sobre la calidad de la respuesta inmunitaria. Los aceites minerales han sido utilizados durante varios decenios como adyuvantes y para la preparacion de adyuvantes destinados a aumentar la eficacia de la respuesta inmunitaria de las vacunas. En efecto, los antfgenos previamente emulsionados en emulsiones de tipo agua en aceite mineral (W/O), despues de administrados por via parenteral, desencadenan respuestas inmunitarias (y en consecuencia, protecciones contra los patogenos) mucho mas intensas y duraderas.

La naturaleza del aceite mineral utilizado para la preparacion de un adyuvante tiene una influencia importante sobre la intensidad de la respuesta inmunologica y sobre las reacciones secundarias relacionadas con la inyeccion de la vacuna (reacciones locales y generales).

Hay dos tipos de respuestas inmunitarias:

- La respuesta inmunitaria humoral:

esta es la reaccion que se produce cuando los linfocitos B que tienen receptores espedficos, son estimulados por un antfgeno y se diferencian en clones de plasmocitos que comienzan a segregar anticuerpos. Estos son eficaces contra los agentes patogenos que circulan en la sangre y en la linfa. Ademas, la activacion selectiva de los linfocitos B dota al organismo de celulas de memoria con una duracion de vida prolongada que intervienen en la respuesta inmunitaria secundaria, y

- La respuesta inmunitaria celular

La reaccion inmunitaria humoral ayuda a la red de defensa a reconocer y destruir los agentes patogenos libres, pero es la reaccion con mediacion celular la que combate a los agentes patogenos ya introducidos en las celulas. Los principales actores de la inmunidad con mediacion celular son los linfocitos T.

Los linfocitos T no reaccionan mas que a los determinantes antigenicos expuestos en la superficie de las celulas del organismo. Los linfocitos T reconocen estos determinantes gracias a sus receptores, protemas de superficie encastradas en su membrana plasmatica. El receptor del linfocito T reconoce el antfgeno combinado con una de las glucoprotemas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) del organismo. Aparte de su papel en la respuesta humoral, los linfocitos T auxiliares pueden activar tambien otros tipos de linfocitos T para desencadenar las reacciones con mediacion celular contra los antfgenos. Los linfocitos T citotoxicos son las unicas celulas para matar a otras celulas (las celulas infectadas por agentes patogenos intracelulares).

Los adyuvantes oleosos son bien conocidos para aumentar el componente humoral de la respuesta inmunologica (medida en general por las dosis de inmunoglobulinas del grupo 1 o IGG1), mientras que las respuestas de tipo celular (medidas indirectamente por las IGG2) son muy diffciles de obtener.

Se sabe que las emulsiones de tipo agua en aceite (W/O), que dan las respuestas inmunitarias mas fuertes, inducen tambien un componente de tipo celular, pero en menor proporcion, por ejemplo, que ciertas moleculas solubles (tipo saponinas o tensioactivos cationicos) reconocidas para orientar la respuesta hacia los mecanismos celulares.

Las emulsiones de fase acuosa continua que utilizan los aceites minerales que normalmente se encuentran en el mercado, son muy malas promotoras de la respuesta celular.

En efecto, el tipo de respuesta provocada por las vacunas esta influenciada por la estructura del antfgeno, pero tambien por la forma en que este se presenta al sistema inmunitario a traves de los adyuvantes. Los adyuvantes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

tienen diferentes efectos sobre la respuesta inmunitaria, ya que pueden inducir una respuesta inmunitaria durante un penodo mas o menos largo, con un caracter predominante de tipo celular o de tipo humoral.

La inmunidad con mediacion celular es importante, a veces incluso esencial, para la proteccion contra las bacterias intracelulares, los virus y la mayor parte de los parasitos. Dicha inmunidad interviene en la mayor parte de los mecanismos de proteccion de la vacuna, como complemento de la respuesta humoral.

Se podra clasificar, por ejemplo, la capacidad de un adyuvante para inducir una respuesta inmunologica de tipo celular para la composicion vacunal que le comprende, comparando las relaciones IGG1/IGG2 medidas despues de la administracion por via parenteral de la composicion vacuna que le comprende, a los sujetos implicados, en diferentes penodos despues del dfa de la vacunacion de dichos sujetos. Cuanto mas alta sea esta relacion, mas habra orientado el adyuvante la respuesta inmunitaria de la composicion vacunal hacia un componente humoral. Un valor de la relacion IGG1/IGG2 proximo a la unidad, sera considerado como el signo de una respuesta inmunitaria de la composicion vacunal equilibrada entre sus dos componentes. Un valor de la relacion IGG1/IGG2 inferior a la unidad sera caractenstico de una respuesta inmunitaria de la composicion vacunal con predominio celular.

Un objetivo de la presente invencion es disponer de un adyuvante para la preparacion de composiciones vacunales, destinado a mejorar el componente celular de la respuesta inmunitaria, manteniendo a la vez el buen nivel del componente humoral. Por lo tanto, existe la necesidad de obtener adyuvantes de vacunas que tengan una respuesta inmunitaria equilibrada incluso con predominio celular. Ademas, las vacunas preparadas con el adyuvante objeto de la presente invencion deberan presentar una buena seguridad.

Con este fin, la presente invencion tiene por objetivo un adyuvante de vacuna tal como se define en la reivindicacion 1 y su utilizacion para la fabricacion de una composicion vacunal destinada a la prevencion contra la coccidiosis tal como se define en las reivindicaciones 2 y 3.

Segun otro aspecto, la invencion tiene por objeto una vacuna tal como se define en las reivindicaciones 4 a 8.

Segun otro aspecto, la invencion tiene por objeto la utilizacion de un aceite mineral para la fabricacion de una vacuna tal como se ha definido antes, caracterizada porque dicho aceite comprende, para el 100 % de su masa:

- de 0,05 % a 10 % de cadenas de cadenas hidrocarbonadas que tienen menos de 16 atomos de carbono;

- de 0,05 % a 5 % de cadenas de cadenas hidrocarbonadas que tienen mas de 28 atomos de carbono;

y tiene una relacion P/N, que corresponde a la relacion de la cantidad masica de cadenas carbonadas de tipo parafmico sobre la cantidad masica de cadenas carbonadas de tipo naftenico, comprendida entre 2,5 y 3, con preferencia entre 2,8 y 2,9.

La composicion segun la invencion puede comprender tambien ventajosamente uno o mas agentes tensioactivos emulsionantes. Este ultimo tiene un caracter lipofilo o hidrofilo caracterizado por un valor HLB (balance hidrofilo- lipofilo) comprendido entre 1 y 19.

Un tensioactivo tal puede consistir en:

- un poliglucosido de alquilo o una mezcla de poliglucosidos de alquilo de la formula Ra-(O)-Zn donde Ra representa un radical alifatico saturado, lineal o ramificado, que comprende de 4 a 24 atomos de carbono, Z es el residuo de un azucar, preferiblemente glucosa y n esta comprendido entre 1 y 5, con preferencia entre 1,1 y

2,

- saponinas,

- esteres de sorbitan, como por ejemplo, el oleato de sorbitan, el estearato de sorbitan, el palmitato de sorbitan, el laurato de sorbitan;

- esteres de manitan, como por ejemplo, el oleato de manitan, el estearato de manitan, el palmitato de manitan, el laurato de manitan;

- esteres de sorbitan polioxietilados entre 5 moles y 20 moles de oxido de etileno, como por ejemplo, el oleato de sorbitan etoxilado con 20 moles de oxido de etileno;

- esteres de manitan polioxietilados entre 5 moles y 20 moles de oxido de etileno, como por ejemplo, el oleato de manitan etoxilado con 20 moles de oxido de etileno;

- lecitinas;

- alcanoles polioxietilados como por ejemplo, los comercializados bajo el nombre BRIJ, y mas particularmente el BRIJ 21 y el BRIJ 221 por la compama UNIQEMA;

10

15

20

25

30

35

40

45

50

- poKmeros tensioactivos que comprenden bloques de polioxietilenos y polioxipropilenos tales como los comercializados bajo la denominacion PLURONlCs por la comparua BASF;

- polihidroxiestearatos de poliglicol o de poliglicerol como por ejemplo los productos denominados HYPERMER™ B246, ARLACE™ P135 comercializados por la comparMa UNIQeMa.

Por antigeno se entiende toda molecula que tiene propiedades inmunogenicas, que puede inducir una respuesta inmunitaria espedfica. Estos antigenos pueden ser patogenos inactivados, como por ejemplo, bacterias inactivadas, moleculas extrafdas de patogenos, moleculas producidas por recombinacion genetica de microorganismos.

Los aceites minerales se obtienen a partir de la destilacion despues de hidrogenacion forzada de productos de origen petrolffero. Estan constituidos por moleculas qrnmicas de la familia de los alcanos saturados. Para este tipo de moleculas, el numero de atomos de carbono (n) es en general superior a 9 e inferior a 30, lo que confiere entonces un aspecto lfquido a 25 °C. Se conocen tambien como parafinas lfquidas. Las parafinas solidas estan constituidas por moleculas qrnmicas de la familia de los alcanos, para las cuales n es superior a 30, pudiendo llegar hasta 50 y confieren entonces un aspecto solido a 25 °C. Las parafinas lfquidas o aceites minerales, son lfquidos transparentes e inodoros, cuya viscosidad dinamica puede variar de 2 miliPascales por segundo (mPa.s) a 1 Pascal por segundo. La viscosidad dinamica de los aceites minerales esta directamente relacionada con la longitud media de las cadenas carbonadas de los alcanos que componen dichos aceites minerales. Los alcanos con cadenas hidrocarbonadas mas largas son responsables de las viscosidades dinamicas mas altas. Las moleculas concernidas se pueden presentar en forma de cadenas hidrocarbonadas lineales o ramificadas (reagrupadas bajo la denominacion "parafrnicas" (P) o dclicas (naftenicas N)), pero siempre saturadas (sin dobles enlaces, que se eliminan durante el tratamiento por hidrogenacion). Las viscosidades, puntos de fusion y puntos de ebullicion estan directamente relacionados con el numero de carbonos que presenta la cadena hidrocarbonada. Un aceite mineral blanco podra ser caracterizado, por tanto, por su intervalo de destilacion, su viscosidad dinamica, su numero medio de atomos de carbono, pero tambien por su fraccion P/N, en moleculas lineales y ramificadas sobre la cantidad de moleculas dclicas (determinada segun el metodo DIN 51378). Se debe tener en cuenta que el criterio de viscosidad dinamica se puede modificar artificialmente por la mezcla de dos fracciones diferentes.

Ejemplos

I) Primera parte

Los siguientes ejemplos permiten poner de manifiesto las propiedades de las composiciones adyuvantes segun la presente invencion.

En este trabajo, un estudio de las propiedades adyuvantes de diferentes aceites, caracterizados finamente, ha permitido poner de relieve nuevas composiciones originales caracterizadas por los lfmites de las composiciones establecidos por cromatograffa.

El estudio realizado sobre composiciones vacunales experimentales, en un primer tiempo con formulas que se presentan en la forma de emulsiones tipo agua en aceite (W/O), ha permitido establecer las condiciones optimas de obtencion de respuestas inmunitarias equilibradas entre sus dos componentes y de una respuesta inmunitaria con componente celular predominante para las formulas bien toleradas, en ratones. La continuacion de los ensayos experimentales, realizados sobre otros tipos de formulas y diferentes animales ha permitido poner de manifiesto que las composiciones adyuvantes objetos de la presente invencion, aseguran las mejores respuestas inmunologicas tanto cuantitativas como cualitativas.

En los ejemplos que siguen, los aceites minerales seleccionados se caracterizan por su:

• fraccion corta (FC), expresada en porcentaje, que corresponde a la proporcion de entidades que tienen un numero de atomos de carbono C <16.

• fraccion pesada (FP), expresada en porcentaje, que corresponde a la proporcion de entidades que tienen un numero de atomos de carbono C > 28.

• distribucion molecular (RM) (expresada en numero de atomos de carbono C), calculada como el baricentro de la curva comprendida entre C16 y C28 asignando el coeficiente de superficie de las fracciones C16 a C20 asimiladas a 18 atomos de carbono, 20 atomos de carbono a 24 atomos de carbono asimiladas a 22 atomos de carbono y 24 atomos de carbono a C28 asimiladas a 26 C.

• relacion P/N (obtenida segun el metodo normalizado DIN 51378).

Los diferentes aceites ensayados se enumeran en la tabla 1.

Ref. Aceite

FC RM FP P/N

(<C16) >C28)

1

13,7 20,6 3,3 1,78

2

4,9 21,5 7,1 1,86

3

4,2 20,5 1,5 1,86

4

4,4 21,6 4,7 1,86

5

47,7 18,4 0,5 1,86

6

0,3 22,2 9,6 2,03

7

30 18,3 0,6 2,19

8

16 21,8 10 2,13

9

2 19,3 2,2 2,85

10

48,2 18,4 0,6 1,86

11

8,6 20,7 2,4 1,94

12

20,8 21,9 8,7 1,86

Tabla 1: Panel de aceites sintetizados y caracterizados por ensayos biologicos.

Estudio bajo la forma de emulsion tipo agua en aceite W/O:

La formulacion se realiza en un modelo tipo adyuvante incomplete de Freund (IFA) utilizado al 50 % en la emulsion vacunal, que por la sencillez de su formula (15 % de monooleato de manida + 85 % de aceite mineral) permite una 5 comparacion pertinente.

Las propiedades biologicas de las vacunas asf formuladas (50 % de IFA + 50 % de solucion isotonica de albumina de huevo a 10 pg/dosis; 1 dosis = 100 pi de emulsion) se comparan entonces sobre un modelo de raton para los parametros de seguridad (tabla 2), y de eficacia para la respuesta humoral o celular.

La seguridad se evalua mediante la observacion del sitio de inyeccion 7 dfas despues de la vacunacion y la 10 calificacion posterior de las reacciones locales (RL) sobre una escala que va de 0 a 4. Los valores de 0 a 2 son aceptables (se trata como maximo de un deposito oleoso sin alopecia, sin induracion palpable ni sitio de inyeccion visible); los valores superiores a 2 se consideran como no deseados e inaceptables (se trata de necrosis, alopecias, induracion, palpables). Los resultados se agrupan en la tabla 2; los aceites minerales ensayados en la preparacion de la formulacion tipo agua en aceite (W/O) se han clasificado en funcion de su FC (fraccion corta). Se ve muy 15 claramente que las formulaciones W/O que comprenden aceites minerales que tienen una FC < 13,7 son apropiadas para la preparacion de composiciones vacunales utilizables por via inyectable.

Ref. Aceite

FC (<C16) RM FP >C28) P/N RL

1

13,7 20,6 3,3 1,78 2,5

2

4,9 21,5 7,1 1,86 0,5

3

4,2 20,5 1,5 1,86 0

4

4,4 21,6 4,7 1,86 0,5

5

47,7 18,4 0,5 1,86 4

6

0,3 22,2 9,6 2,03 0

7

30 18,3 0,6 2,19 3

8

16 21,8 10 2,13 2,5

9

2 19,3 2,2 2,85 0

10

48,2 18,4 0,6 1,86 4

11

8,6 20,7 2,4 1,94 0,5

12

20,8 21,9 8,7 1,86 3

Tabla 2: Evaluacion de la seguridad de los diferentes aceites.

Las formulas aceptadas se han ensayado a continuacion para determinar su eficacia inmunologica en el modelo de 20 raton. Se han eliminado las formulas que dan reacciones inaceptables. Las tablas 3 y 4 muestran los tftulos de anticuerpos obtenidos, comparados con una referencia de hidroxido de aluminio (adyuvante solido mineral utilizado en medicina veterinaria y humana). Los tftulos se dan a los 14/28/42/56/90 dfas despues de la fecha de las primeras inyecciones, para la respuesta humoral (IGG1) y celular (IGG2). Una segunda inyeccion de las formulas se realiza a los 28 dfas, despues del registro de los tftulos de anticuerpos. Los resultados de la respuesta a largo plazo (90 dfas)

5

10

15

20

25

indican una fuerte correlacion entre los valores bajos de la fraccion pesada y la intensidad de la respuesta humoral a los 90 dfas. La respuesta disminuye significativamente cuando esta fraccion es superior a 4,7 % (7,1 % y 9,6 %).

Estos resultados demuestran que un aceite mineral como adyuvante de vacuna bajo la forma de emulsion tipo agua en aceite (W/O) que contenga menos de 10 % de FC (fraccion corta), menos de 5 % de FP (fraccion pesada) y una relacion P/N superior o igual a 1,9, induce una buena respuesta de tipo celular.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL Q P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,86 9.600 16.000 128.000 128.000 128.000

3

4,2 20,5 1,5 1,86 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

4

4,4 21,6 4,7 1,86 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

6

0,3 22,2 9,6 2,03 9.600 16.000 64.000 64.000 64.000

9

2 19,3 2,2 2,85 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

11

8,6 20,7 2,4 1,94 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

AlOH

16.000 4.800 4.800 2.400 2.400

Tabla 3: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG1 contra OVA (ovoalbumina) en el raton, para diferentes aceites, despues de inyeccion bajo la forma de emulsion agua en aceite (W/O), en funcion del tiempo.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL Q P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,86 9.600 16.000 48.000 48.000 48.000

3

4,2 20,5 1,5 1,86 9.600 16.000 48.000 48.000 48.000

4

4,4 21,6 4,7 1,86 9.600 16.000 48.000 48.000 48.000

6

0,3 22,2 9,6 2,03 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

9

2 19,3 2,2 2,85 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

11

8,6 20,7 2,4 1,94 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

AlOH

16.000 4.800 4.800 2.400 2.400

Tabla 4: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG2 contra OVA, en el raton, para diferentes aceites despues de inyeccion bajo la forma de emulsion agua en aceite (W/O).

Estudio bajo la forma de emulsion de fase continua acuosa:

Se han probado dos tipos de presentaciones galenicas que representan las emulsiones de fase continua acuosa (emulsion multiple agua/aceite/agua (W/O/W) y microemulsion de aceite en agua (W/O)).

Microemulsion de aceite en agua:

La formula del adyuvante comprende, para el 100 % de su masa 40 % en masa, de un tensioactivo hidrofilo (polisorbato 80) y 60 % en masa, del aceite mineral a ensayar; la fase oleosa formulada de este modo, se emulsiona a temperatura ambiente mediante un homogeneizador de alta presion en presencia de una fase acuosa que comprende el antfgeno (OVA); la fase oleosa preparada precedentemente, se utiliza al 10 % en masa, en la composicion de vacuna final (OVA 10 pg/dosis, 100 pi por inyeccion); se incluye en el ensayo un testigo de hidroxido de aluminio. Los resultados se presentan en la tabla 5. La baja intensidad de la respuesta de IGG1 esta directamente relacionada con la presencia de la fraccion pesada, que inhibe la respuesta a corto plazo (28 dfas, Dfa 28) y a largo plazo (90 dfas, Dfa 90).

Del mismo modo, la tabla 6 presenta los tttulos de IGG2.

Los resultados indican una correlacion entre la relacion P/N y la respuesta de IGG2; las formulas 6 y 9 se desmarcan de los demas productos.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL Q P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,9 12.800 16.000 96.000 48.000 48.000

3

4,2 20,5 1,5 1,9 9.600 48.000 128.000 256.000 256.000

4

4,4 21,6 4,7 1,9 12.800 48.000 128.000 128.000 128.000

6

0,3 22,2 9,6 2,0 4.800 16.000 48.000 48.000 32.000

9

2,0 19,3 2,2 2,8 6.400 48.000 32.000 128.000 128.000

11

8,6 20,7 2,4 1,9 9.600 48.000 128.000 256.000 256.000

AlOH

16.000 4.800 4.800 2.400 2.400

Tabla 5: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG1 contra OVA en el raton, para diferentes aceites bajo la forma de microemulsion tipo aceite en agua, en funcion del tiempo.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL O P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,86 400 12.000 24.000 4.000 400

3

4,2 20,5 1,5 1,86 600 16.000 24.000 1.000 1.000

4

4,4 21,6 4,7 1,86 150 8.000 8.000 1.000 1.000

6

0,3 22,2 9,6 2,03 4.800 16.000 32.000 8.000 4.000

9

2 19,3 2,2 2,85 1600 32.000 48.000 96.000 96.000

11

8,6 20,7 2,4 1,94 600 16.000 24.000 1.000 4.000

AlOH

150 150 150 300 300

5 Tabla 6: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG2 contra OVA en el raton, para diferentes aceites bajo la forma de microemulsion tipo aceite en agua (O/W), en funcion del tiempo.

Las comparaciones de las relaciones IGG1/IGG2 indican claramente una diferencia de comportamiento de la respuesta para los grupos vacunados con el aceite 9 y a menor nivel con el aceite 6, con respecto a los otros aceites 10 (tabla 7).

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL O A^ P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,86 32 1 4 12 120

3

4,2 20,5 1,5 1,86 16 3 5 256 256

4

4,4 21,6 4,7 1,86 85 6 16 128 128

6

0,3 22,2 9,6 2,03 1 1 2 6 8

9

2 19,3 2,2 2,85 4 2 1 1 1

11

8,6 20,7 2,4 1,94 16 3 5 256 64

AlOH

107 32 32 8 8

Tabla 7: Relacion IgG1/IgG2 contra OVA en el raton, para diferentes aceites bajo la forma de microemulsion tipo aceite en agua (O/W) en funcion del tiempo.

Emulsion multiple tipo agua-en aceite-agua (W/O/W):

15 La formula del adyuvante esta compuesta esta vez, de un eter octadecenoato de manitol anhidro de equilibrio hidrofilo-lipofilo (hLb) = 9, dispersado al 15 % en masa en el aceite mineral a ensayar. La composicion vacunal se prepara mezclando a 30 °C una parte en peso del adyuvante con una parte en peso de medio antigenico (fase acuosa) que comprende el antfgeno OVA.

Ensayo sobre raton: los resultados del ensayo sobre raton para las respuestas IGG1 y para las respuestas IGG2 se 20 presentan en las tablas 8 y 9, respectivamente. En cuanto a la respuesta celular, la evolucion de los valores de las respuestas de IGG2 indica que el aceite 9 induce una respuesta intensa y duradera, especialmente despues de 28 dfas.

5

10

15

20

25

Ensayo sobre modelo bovino: en este caso, las mismas vacunas se han ensayado sobre 5 bovinos inyectados con 2 ml por via subcutanea; se han comparado las formulas 9 y 11. Los resultados se presentan en la tabla 10. No se observa ninguna diferencia para los tttulos de IGG1 (no se presentan datos). Se observa un fuerte efecto adyuvante con respecto al antigeno solo. La respuesta de IGG2 es muy intensa con el aceite 9, es debil con el aceite 11 y es inexistente para el antigeno solo.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL O P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2.0

4,9 21,5 7,1 1,9 16.000 32.000 64.000 64.000 64.000

3.0

4,2 20,5 1,5 1,9 16.000 64.000 128.000 128.000 128.000

4.0

4,4 21,6 4,7 1,9 16.000 64.000 128.000 128.000 128.000

6.0

0,3 22,2 9,6 2,0 16.000 64.000 64.000 64.000 64.000

9.0

2 19,3 2,2 2,8 16.000 64.000 128.000 128.000 128.000

11.0

8,6 20,7 2,4 1,9 16.000 64.000 128.000 128.000 128.000

AlOH

16.000 4.800 4.800 2.400 2.400

Tabla 8: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG1 contra OVA en el raton, para diferentes aceites bajo la forma de emulsion tipo agua/aceite/agua (W/O/W), en funcion del tiempo.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL O P/N Dfa 14 Dfa 28 Dfa 42 Dfa 56 Dfa 90

2

4,9 21,5 7,1 1,86 400 12.000 24.000 4.000 400

3

4,2 20,5 1,5 1,86 400 12.000 24.000 4.000 400

4

4,4 21,6 4,7 1,86 400 12.000 24.000 4.000 400

6

0,3 22,2 9,6 2,03 400 4.000 12.000 4.000 400

9

2 19,3 2,2 2,85 9.600 16.000 128.000 256.000 256.000

11

8,6 20,7 2,4 1,94 300 600 1.200 1.200 1.200

AlOH

150 150 150 300 300

Tabla 9: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG2 contra OVA en el raton, para diferentes aceites bajo la forma de

emulsion tipo agua/aceite/agua (W/O/W), en funcion del tiempo.

Aceite Ref.

CD RM 00 CL CM LL O A^ P/N Dfa 0 Dfa 28 Dfa 60 Dfa 140

9

2 19,3 2,2 2,85 - 600 6.000 10.000

11

8,6 20,7 2,4 1,94 - 10 600 2.000

Tabla 10: Respuesta de anticuerpos de tipo IgG2A contra OVA en el bovino, para los aceites 9 y 11, bajo la forma de emulsion tipo agua/aceite/agua (W/O/W), en funcion del tiempo.

Como una mejora del componente celular de la respuesta inmunitaria, se entiende:

- A) obtener una respuesta inmunitaria que se caracteriza por una relacion IgG1/IgG2 comprendida entre 0,25 y 4, y

- B) obtener una respuesta inmunitaria cuyo componente celular es tambien intenso, esto es caracterizada por una IgG2 superior o igual a 32.000 despues de la vacunacion de refuerzo practicada despues de 28 dfas y despues de la medida del tttulo de IGG2 en esa fecha (respuesta secundaria y a largo plazo).

A- relacion IgG1/IgG2

a) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una emulsion tipo agua/aceite/agua (W/O/W), los resultados experimentales de IgG1/IgG2 son los siguientes:

• para el aceite 6: 40 (Dfa 14), 16 (Dfa 28), 5,3 (Dfa 42), 16 (Dfa 56) y 160 (Dfa 90).

• para el aceite 11: 53,3 (Dfa 14), 107 (Dfa 28), 107 (Dfa 42), 107 (Dfa 56) y 107 (Dfa 90).

10

5

10

15

20

25

30

35

40

• para el aceite 9: 1,7 (Dia 14), 4 ^a 28), 1 ^a 42) 0,5 (Dia 56) y 0,5 ^a 90).

El aceite 9 permite obtener una relacion IGG1/IGG2 comprendida entre 0,25 y 4 antes y despues de la vacunacion de refuerzo del Dfa 28 (la vacunacion de refuerzo realizada el D^a 28, se realiza despues de la medida de la respuesta inmunitaria).

b) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una microemulsion tipo aceite en agua (O/W), la declaracion de la invencion comprende los siguientes resultados experimentales de IgGl/lgG2:

• para el aceite 6: 1 (Dia 14), 1 (D28), 2 (Dia 42), 6 ^a 56) y 8 (Dia 90)

• para el aceite 11: 16 (Dia 14), 3 ^a 28), 5 ^a 42), 256 (Dia 56) y 64 ^a 90)

• para el aceite 9: 4 (Dia 14), 2 ^a 28), 1 ^a 42), 1 (Dia 56) y 1 ^a 90)

Para el aceite 9, la relacion IgG1/IgG2 comprendida entre 0,25 y 4, se obtiene siempre antes de la vacunacion de refuerzo del Dfa 28, y se mantiene constante en el tiempo.

Para el aceite 6, la relacion IgG1/IgG2 comprendida entre 0,25 y 4, se obtiene tambien antes de la vacunacion de refuerzo (respuesta primaria), pero no permanece en el tiempo durante la medida de la respuesta secundaria (despues de la vacunacion de refuerzo del Dfa 28) y de la respuesta a largo plazo (Dfa 90).

Para el aceite 11, la relacion IgG1/IgG2 comprendida entre 0,25 y 4, no se observa para la respuesta secundaria ni para la respuesta a largo plazo.

c) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una emulsion tipo agua en aceite (W/O), la declaracion de la invencion comprende los siguientes resultados experimentales de IGG1/IGG2:

• para el aceite 9: 1 (Dia 14), 1 (Dia 28), 1 (Dia 42), 1 (Dia 56) y 1 (Dia 90)

Todos estos resultados registrados son buenos resultados para la relacion IgG1/IgG2.

B- Intensidad de las respuestas IgG2.

a) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una emulsion tipo agua/aceite/agua (W/O/W), los resultados experimentales de IgG2 son los siguientes (tabla 9):

a. para el aceite 6: (Dia 14), 4.000 (Dia 28), 12.000 (D42), 4.000 (Dia 56) y 400 (Dia 90)

b. para el aceite 11: 300 (Dia 14), 600 (Dia 28), 1200 (dia 42), 1200 (Dia 56) y 1200 (Dia 90)

c. para el aceite 9: 9600 (Dia 14), 16.000 (Dia 28), 128.000 (Dia 42), 256.000 (Dia 56) y 256.000 (Dia 90)

El aceite 9 permite tener una respuesta celular intensa (segun los criterios definidos anteriormente) despues de la vacunacion de refuerzo practicada despues de 28 dfas.

b) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una microemulsion tipo aceite en agua (O/W), la declaracion de la invencion comprende los siguientes resultados experimentales de IgG2 (tabla 6):

a. para el aceite 6: 4.800 (Dia 14), 16.000 (Dia 28), 32.000 (Dia 42), 8.000 (Dia 56) y 4.000 (Dia 90)

b. para el aceite 11: 600 (Dia 14), 16.000 (Dia 28), 24.000 (Dia 42), 1000 ^a 56) y 40.000 ^a 90)

c. para el aceite 9: 1600 (Dia 14), 32 000 (Dia 28), 48 000 ^a 42), 96 000 ^a 56) y 96.000 (Dia 90)

El aceite 9 permite tener una respuesta celular intensa (segun los criterios definidos anteriormente) para la respuesta secundaria (despues de la vacunacion de refuerzo) y para la respuesta a largo plazo (Dia 90).

c) en el caso de los adyuvantes de vacunas que se presentan bajo la forma de una emulsion tipo agua en aceite (W/O), la declaracion de la invencion comprende los siguientes resultados experimentales de IgG2 (tabla 4):

a. para el aceite 9: 9.600 (Dia 14), 16.000 (Dia 28), 128.000 (Dia 42), 256.000 (Dia 56) y 256.000 (Dia 90)

Todos estos resultados registrados son buenos resultados para la respuesta de IgG2.

Segun estos resultados se demuestra que una composicion de un aceite mineral destinada a ser utilizada como adyuvante para vacunas inyectables, objeto de la presente invencion, como el aceite 9 por ejemplo, que presenta las siguientes caracteristicas:

• FC <10% y FP < 5 %;

5

10

15

20

25

30

• P/N comprendido entre 2,5 y 3 (aqu alrededor de 2,85);

garantiza una buena seguridad, una buena eficacia con respecto a la respuesta humoral y una fuerte respuesta celular tanto en la forma de emulsion tipo agua en aceite (W/O) y agua/aceite/agua (W/O/W) como en la forma de microemulsion tipo aceite en agua (O/W).

II) Segunda parte

Serie de ensayos 1: trabajo experimental en un modelo de "pollo"

En el marco de los ensayos experimentales llevados a cabo, la eficacia de la respuesta para cada formula se basa en los siguientes criterios:

a) tttulos de anticuerpos en los sueros;

b) infiltracion de globulos blancos en el sitio de inyeccion;

c) prueba de virulencia que consiste en inocular a los animales 10.000 oocitos de la cepa Eimeria acervulina dos semanas despues del tratamiento, y comparacion:

a. del aumento de peso de los animales

b. del numero de parasitos excretados

La tabla 11 indica las diferentes formulas que han sido ensayadas:

Grupo

A B C D E F

Emulsion

W/O W/O W/O/W W/O/W CFA Sin emulsion

Aceite

1 2 1 2 Mineral estandar Sin aceite

Tabla 11

Los aceites implicados en los ensayos experimentales se caracterizan en la siguiente tabla

Ref. Aceite

FC (<C16) RM FP (>C28) P/N RL

Mineral estandar

4,9 21,5 7,1 1,86 0,5

Aceite 1 (O1)

2 19,3 2,2 2,85 0

Aceite 2 (O2)

8,6 20,7 2,4 1,94 0,5

Las formulaciones de los grupos A y B, es decir, las emulsiones tipo agua en aceite 1 (W/O1) (Grupo A) y las emulsiones tipo agua en aceite 2 (W/O2) (Grupo B), comprenden para el 100 % de su masa:

- 30 % en masa, de una fase acuosa que comprende el antfgeno y el agua

- 70 % en masa, de adyuvante oleoso que comprende, para el 100 % de su masa:

o 15%en masa, de oleato de manitan

o 85 % en masa, de aceite (aceite 1 o aceite 2)

El antfgeno, la protema 3-1 E, esta presente en estas formulaciones en una proporcion tal que una dosis de la formulacion inyectada comprende 50 |jg de antfgeno, siendo el volumen de la dosis de formulacion inyectada de 100 Ml.

Las formulaciones de los grupos C y D, es decir, las microemulsiones agua-aceite 1-agua (W/O1/W) (Grupo C) y las microemulsiones agua-aceite 2-agua (W/O2/W) (Grupo D), comprenden para el 100 % de su masa:

- 90 % en masa, de una fase acuosa que comprende el antfgeno y el agua

- 10 % en masa, de adyuvante oleoso que comprende, para el 100 % de su masa:

o 40 % en masa, de oleato de sorbitan etoxilado con 20 moles de oxido de etileno Polisorbato 80) o 60 % en masa, de aceite (aceite 1 o aceite 2).

El antigeno, la protema 3-1 E, esta presente en estas formulaciones en una proporcion tal que una dosis de formulacion inyectada comprende 50 |jg de antfgeno, siendo el volumen de la dosis de formulacion inyectada de 100 Ml.

Al nivel de los tttulos de anticuerpos en los sueros todos los grupos ensayados han presentado tttulos de anticuerpos 5 sericos importantes y equivalentes excepto el grupo que comprende la protema sola (Grupo F). La respuesta humoral obtenida para cada uno de los grupos esta en un nivel alto y satisfactorio (no se presentan los resultados).

Al nivel de las infiltraciones de globulos blancos en el sitio de inyeccion, las intensidades de las infiltraciones locales de dichos globulos blancos (linfocitos y macrofagos) han sido evaluadas por inmunofluorescencia indirecta sobre secciones de tejido para los diferentes grupos.

10 Las biopsias se han practicado en 3 animales de cada grupo, al nivel del sitio de inyeccion, con el fin de obtener muestras de la piel de estos animales. Esta biopsia se ha realizado un dfa despues de la segunda inmunizacion de dichos animales, esto es 28 dfas despues de la primera inmunizacion. Estas inmunizaciones han consistido en inyecciones de una mezcla de profilina y de las formulaciones ensayadas. Un testigo, que consiste en una inyeccion de profilina sin medio vacunal, se ha realizado tambien en las mismas condiciones operatorias. Las muestras asf 15 obtenidas se han congelado inmediatamente en un medio que contiene nitrogeno lfquido y se han conservado a una temperatura de - 20 °C. A continuacion, se han puesto trozos de 5 Mm de cada muestra sobre soportes previamente limpiados, y se han lavado con acetona durante 20 minutos a una temperatura de 4 °C, y se han "fijado" con suero de caballo al 10 % durante 20 minutos a una temperatura de 20 °C. Se han anadido anticuerpos CD8 de pollo, diluidos 1/200, y despues la mezcla resultante se ha incubado a temperatura ambiente (20 °C) durante 2 horas. A 20 continuacion, se han lavado los soportes con una solucion tampon de fosfato y se han incubado con un anticuerpo secundario IGG de pollo "Alexa Fluor 488-labeled antichicken" (comercializado con la denominacion Invitrogen por la comparua Carlsbad) a una dilucion de 1/500 durante 2 horas a temperatura ambiente (20 °C). Los soportes se han puesto entonces en contacto con un revelador colorimetrico, el Fluoromount-G, y se han observado con un microscopio electronico (comercializado bajo la denominacion LSM 510 META por la comparMa Carl Zeiss).

25 Por este protocolo, la visualizacion de las celulas CD8+ ha sido evaluada mediante una calificacion segun la siguiente escala:

- calificacion "0": ausencia de manchas de celulas CD8+ observadas,

- calificacion "+": observacion de una presencia, de debil densidad, de celulas CD8+,

- calificacion "++": observacion de una fuerte presencia, de densidad elevada, de celulas CD8+, y

30 - calificacion "+++": observacion de una presencia muy fuerte, de densidad muy elevada, de celulas CD8+.

Cuanto mayor sea la cantidad y la densidad de linfocitos y de macrofagos observados al nivel del sitio de inyeccion, en mayor medida sera posible para la vacuna ensayada, la capacidad de desarrollar una respuesta inmunitaria eficaz.

Los resultados obtenidos se indican en la tabla 12

Grupo

A B C D E F

Adyuvante

W/O1 W/O2 W/O1/W W/O2/W CFA Sin adyuvante

Antfgeno

Si Si Si Si Si Si

Linfocitos

+ + + + + + + + + 0

Macrofagos

+ + + + + + 0

35 Tabla 12

Con respecto a la vacuna que comprende el adyuvante de la tecnica anterior (Grupo E), las vacunas segun la invencion mejoran la produccion de linfocitos en el sitio de inyeccion para los grupos D, C y A; mientras que para los macrofagos, solo la vacuna segun la invencion del grupo A permite mejorar la produccion de macrofagos y las otras vacunas segun la invencion permiten obtener resultados de produccion de macrofagos sobre el sitio de inyeccion 40 similares a la vacuna que comprende el adyuvante de la tecnica anterior.

Al nivel de la prueba de virulencia, una proteccion eficaz de las vacunas implicara que los animales:

- presentaran un aumento de peso similar con respecto a los testigos no vacunados y no sometidos a prueba;

- presentaran una reduccion de la carga parasitaria (evaluada por el numero de parasitos excretados) con respecto a los animales sometidos a prueba y no vacunados.

45 De forma general, la prueba de virulencia corresponde a la administracion de una dosis precisa y controlada del agente patogeno contra el cual los animales han sido vacunados previamente. La proteccion inducida por las

5

10

15

20

25

30

35

vacunas experimentales se evalua segun diversos criterios, en funcion del modelo animal y de la naturaleza del agente patogeno.

Se han seguido dos criterios principales despues de la prueba de virulencia:

- aumento de peso de los animales 10 dfas despues de la infeccion, y

- reduccion del numero de agentes patogenos excretados.

Aumento de peso de los animales 10 dfas despues de la infeccion.

La tabla 13 resume los resultados obtenidos durante la vacunacion y la infeccion del pollo contra la coccidiosis aviar (cepa utilizada Eimeria acervulina). El poder patogeno de esta cepa es importante y da lugar a una modificacion del aumento de peso de los animales infectados.

Grupo

A B C D E F G H

Emulsion

W/O1 W/O2 W/O1/W W/O2/W CFA Sin adyuvante Sin vacuna Sin vacuna

Antfgeno

Sf Sf Sf Sf Sf Sf No No

Prueba de virulencia

10.000 oocistos de Eimeria acervulina Sin prueba

Aumento de peso diez dfas despues de la prueba (g)

834 798 802 740 773 735 730 850

Tabla 13: aumento de peso de los diferentes grupos despues de la prueba de virulencia.

Se puede observar que, para los sujetos sometidos a prueba, la vacunacion sin adyuvante no indujo proteccion en terminos de aumento de peso: los testigos sin adyuvante (Grupo F) y sin vacuna (Grupo G) indujeron resultados similares.

Con respecto al sujeto sometido a prueba y no vacunado (Grupo G), las vacunas segun la invencion que comprenden un adyuvante a base de aceites O1 y O2 permiten aumentos de peso significativos con excepcion de las vacunas del Grupo D.

Con respecto a la vacuna que comprende el adyuvante de la tecnica anterior (Grupo E), las vacunas segun la invencion inducen un aumento de peso superior con excepcion de la vacuna que se presenta en forma de una emulsion W/O2/W (Grupo D).

Es preciso remarcar tambien que las vacunas segun la invencion que comprenden un adyuvante a base de aceite 1 inducen un aumento de peso mas importante que las vacunas segun la invencion que comprenden un adyuvante a base de aceite 2.

Para las vacunas segun la invencion del grupo A, el aumento de peso no es inferior mas que en un 1,9 % con respecto al aumento de peso de los sujetos no sometidos a prueba.

Ademas, para cada uno de los aceites minerales considerados (O1 u O2), se observara que las vacunas experimentales formuladas en emulsion de agua en aceite, parecen ser mas protectoras que las formulas tipo agua/aceite/agua:

- para el aceite 1, el aumento de peso para una vacuna bajo la forma de una emulsion W/O1 (Grupo A) es de 834 g, esto es, un aumento de peso de 99 g con respecto a los animales del grupo sin adyuvante (Grupo F), mientras que para una vacuna bajo la forma de una emulsion W/O1/W, el aumento de peso (grupo C) es de 802 gramos y presenta un aumento de peso de 67 g con respecto a los animales del grupo sin adyuvante (grupo F).

- para el aceite 2, el aumento de peso para una vacuna bajo la forma de una emulsion W/O2 (grupo B) es de 798 g, esto es, un aumento de peso de 63 g con respecto a los animales del grupo sin adyuvante (Grupo F) mientras que para una vacuna bajo la forma de una emulsion W/O2/W, el aumento de peso (grupo D) es de 740 gramos y presenta un aumento de peso de 5 g con respecto a los animales del grupo sin adyuvante (grupo F).

Reduccion del numero de patogenos excretados:

Los resultados obtenidos se incluyen en la tabla 14.

5

10

15

20

25

30

35

Los resultados se expresan como la reduccion del numero de oocistos excretados (cuantos mas infectados estan los animales, mas excretan, por lo tanto, estanan menos protegidos).

Grupo

A B C D E F

Adyuvante

W/O1 W/O2 W/O1/W W/O2/W CFA Sin adyuvante

Antfgeno

Si Si Si Si Si Si

Media excretada (X10 E 8)

1,42 2,75 2,54 3,09 2,13 2,86

Desviacion estandar

0,23 0,52 0,8 0,39 0,49 0,36

Tabla 14

Con respecto al testigo del grupo F (antigeno, pero sin adyuvante), las vacunas segun la invencion inducen por lo tanto una disminucion de la media excretada.

Con respecto al grupo E (antfgeno + adyuvante de la tecnica anterior), la vacuna segun la invencion del grupo 1 proporciona una disminucion de la media excretada.

Ademas, la desviacion estandar para el grupo A es la mas baja, lo que indica una respuesta mas homogenea de los animales vacunados. Este criterio es un punto importante porque significa que las susceptibilidades individuales de respuesta biologica de los animales son borradas por la eficacia de la vacuna.

Conclusion del ensayo 1

Las vacunas que comprenden los adyuvantes segun la invencion permiten aportar una respuesta inmunitaria mejorada y una mejor eficacia para prevenir la coccidiosis de las aves de corral.

Por otra parte, la vacuna segun la invencion al presentarse en la forma de una emulsion W/O1, con el aceite 1 (O1) caracterizado por una relacion P/N > 2, tiene la ventaja de estimular una mayor produccion de globulos blancos al nivel del sitio de inyeccion, y de conciliar, tras una prueba de virulencia con la cepa Eimeria acervulina, a la vez el aumento de peso mas elevado y una reduccion muy importante de la excrecion de oocistos.

Serie de ensayos 2: Teniendo en cuenta la serie de ensayo 1 y sus conclusiones, es decir la observacion de los mejores resultados para una vacuna, que comprende:

- la protema recombinante que consta de la secuencia 3-1 de Eimera acervulina.

- el aceite 1

- el agua

- un sistema tensioactivo

y que se presenta en la forma de una emulsion tipo agua en aceite, los inventores han realizado dos tipos de pruebas de virulencia:

- una prueba de virulencia con la cepa Eimeria acervulina (AE)

- una prueba de virulencia con la cepa Eimeria tenella (ET).

Las formulaciones ensayadas, es decir las emulsiones tipo agua en aceite 1 (W/O1), comprenden para el 100 % de su masa:

- 30 % en masa, de una fase acuosa que comprende el antfgeno y el agua

- 70 % en masa, de adyuvante oleoso que comprende, para el 100 % de su masa:

o 15% en masa, de oleato de manitan;

o 85 % en masa, de aceite (aceite 1 o aceite 2).

El antfgeno, la protema 3-1 E, esta presente en estas formulaciones en una cantidad tal que una dosis de formulacion inyectada comprende 30 |jg de antfgeno, siendo el volumen de la dosis de formulacion inyectada de 100 Ml.

5

10

15

20

25

30

35

Para identificar las protecciones cruzadas que ampUan las propiedades de la vacuna experimental ensayada. En efecto, la respuesta inmunitaria inducida de tipo celular, permite proteger despues contra diferentes cepas de parasitos.

La dosis de protema utilizada es de 30 pg/ml. La prueba de virulencia se lleva a cabo mediante la administracion de 10.000 oocistos por ave (tabla 15).

Los animales se controlan a continuacion en cuanto a los parametros de aumento de peso, de anticuerpos, de proliferacion de los linfocitos del bazo despues de la re-estimulacion antigenica o por mitogenos (para cuantificar la respuesta celular) y la proteccion despues de una prueba de virulencia.

E. acervulina: es moderadamente patogena.

Las lesiones se localizan en el intestino delgado sobre todo en el duodeno, con manchas despues de las estnas blanquecinas en la mucosa = lesiones en "escala". Las lesiones son causadas por los oocistos.

E. tenella: es el coccidio mas patogeno, siendo causadas las lesiones por los esquizontes.

Las lesiones se localizan en el intestino ciego, que se llena de sangre, que se puede romper o se puede gangrenar. La canal puede ser anemica. La mortalidad es con frecuencia elevada.

La tabla 15 describe los diferentes grupos ensayados:

Grupo

A B C D E F G H I

Descripcion

No vacunado No vacunado No vacunado Vacunado Vacunado Vacunado Vacunado Vacunado Vacunado

Antigeno 31 E (30 pl)

No No No Si Si Si Si

Adyuvante

No vacunado No vacunado No vacunado No No CFA CFA W/O1 W/O1

Cepa de prueba de virulencia

Sin prueba EA ET EA ET EA ET EA ET

TABLA 15

CFA: Adyuvante completo de Freund (adyuvante de la tecnica anterior)

Despues se hace seguimiento de los pollos vacunados en los diferentes grupos, segun los siguientes criterios diferentes:

a) aumento de peso;

b) produccion de tttulos de anticuerpos (serologfa);

c) evaluacion de las intensidades de las infiltraciones locales de los globulos blancos (linfocitos) por el metodo de inmunofluorescencia indirecta sobre extracciones de esplenocitos de rata realizadas 48 horas despues de la vacunacion (o inmunizacion). Estas inmunizaciones han consistido en inyecciones de una mezcla de profilina y de las formulaciones ensayadas. En las mismas condiciones operatorias, se ha realizado tambien un testigo, que consiste en una inyeccion de profilina sin medio vacunal. El modo operatorio utilizado es identico al llevado a cabo sobre las extracciones de pieles de animales descritas anteriormente, a saber:

- conservacion de las muestras extrafdas de esplenocitos a -20 °C.

- instalacion de las extracciones de los esplenocitos sobre soportes y lavado en acetona durante 20 minutos a 20 °C.

- adicion de anticuerpos CD8 diluidos a 1/200 y posterior incubacion durante 2 horas a 20 °C

- lavado de los soportes obtenidos con una solucion tampon de fosfato, y posterior incubacion con un anticuerpo secundario IGG de pollo "Alexa Fluor 488-labeled antichicken" a una dilucion de 1/500 durante 2 horas a temperatura ambiente (20 °C)

- puesta en contacto con el revelador colorimetrico Fluoromount-G

- observacion con un microscopio electronico (comercializado con la denominacion LSM 510 META por la comparna Carl Zeiss).

Por este protocolo, la visualizacion de las celulas CD8+ (linfocitos) ha sido evaluada mediante una calificacion segun la siguiente escala:

5

10

15

20

25

- calificacion "0": ausencia de manchas de celulas CD8+ observadas

- calificacion "+": observacion de una presencia, de baja densidad, de celulas CD8+

- calificacion "++": observacion de una fuerte presencia, de alta densidad, de celulas CD8+

- calificacion "+++": observacion de una presencia muy fuerte, de una densidad muy alta, de celulas CD8+;

d) numero de oocistos excretados.

Resultados:

- aumentos de peso: los grupos vacunados con la vacuna que se presenta en la forma de una emulsion

agua/aceite 1, se caracterizan por un aumento de peso similar al observado en los otros grupos (no se presentan resultados);

- serologfa: una alta produccion de tftulos de anticuerpos, superior a la observada para los grupos vacunados con

la vacuna que presenta como adyuvante el CFA y a la observada para los grupos vacunados con una vacuna

que no comprende adyuvante (no se presentan resultados);

- proliferacion de los linfocitos: las calificaciones mas altas se obtienen para los grupos H e I vacunados con la vacuna que se presenta en la forma agua/aceite y que comprende el adyuvante con el aceite O1.

Grupo

A B C D E F G H I

indice de proliferacion de linfocitos

0 0 0 0 0 0 0 + + + +

- numero de oocistos excretados:

Las tablas 16 y 17 indican los resultados del numero de oocistos excretados, para los grupos que se han sometido a la prueba de virulencia con Eimeria acervulina (EA) y Eimeria tenella (ET) respectivamente.

Grupo

B D F H

Media (X 10 E 8)

3,44 3,33 3,30 2,71

Desviacion estandar

0,50 0,67 0,89 0,27

Tabla 16: Resultados de excrecion despues de la prueba de virulencia con la cepa EA

Grupo

C E G I

Media (X 10 E 8)

1,49 1,20 1,11 0,95

Desviacion estandar

0,23 0,27 0,42 0,13

Tabla 17: Resultados de excrecion despues de la prueba de virulencia con la cepa ET

Para las dos cepas, los grupos vacunados con la vacuna que comprende el adyuvante a base de aceite 1, muestran una media de excrecion inferior a la observada en los grupos vacunados con la vacuna que comprende el adyuvante de la tecnica anterior (CFA). Es lo mismo para la comparacion con los grupos vacunados con una vacuna que no contiene adyuvante (grupos D y E).

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Adyuvante de vacuna, que comprende para el 100 % de su masa:

   - de 10 % a 95 % de un aceite mineral que comprende:

   - de 0,05 % en masa a 10 % en masa, de cadenas hidrocarbonadas que tienen menos de 16 atomos de carbono;

   - de 0,05 % en masa a 5 % en masa, de cadenas hidrocarbonadas que tienen mas de 28 atomos de carbono;

   - y que tiene una relacion P/N, que corresponde a la relacion de la cantidad en masa, de las cadenas hidrocarbonadas de tipo paraffnico sobre la cantidad en masa, de las cadenas hidrocarbonadas de tipo naftenico, comprendida entre 2,5 y 3.
2. 2. La utilizacion de un adyuvante de vacunas tal como se ha definido en la reivindicacion 1, para la fabricacion de una composicion vacunal destinada a la prevencion contra la coccidiosis.
3. 3. La utilizacion segun la reivindicacion 2, para la fabricacion de una composicion vacunal destinada a la prevencion contra la coccidiosis en animales, en particular las aves de corral.
4. 4. Una vacuna para utilizacion en la prevencion contra la coccidiosis, que comprende el adyuvante tal como se ha definido en la reivindicacion 1, asf como al menos un anffgeno.
5. 5. La vacuna para utilizacion segun la reivindicacion 4, para utilizacion en la prevencion contra la coccidiosis en animales, en particular las aves de corral.
6. 6. La vacuna para utilizacion segun una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque los coccidios se seleccionan del grupo que consiste en Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia, Neospora, con preferencia Eimera.
7. 7. La vacuna para utilizacion segun la reivindicacion 6, caracterizada porque esta en la forma de una emulsion de tipo agua en aceite (W/O).
8. 8. La vacuna para utilizacion segun una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizada porque el anffgeno es una protema recombinante que tiene la secuencia 3-1 de Eimera Acervulina.
9. 9. La utilizacion de un aceite mineral para la fabricacion de una vacuna tal como se define en una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque dicho aceite comprende, para el 100 % de su masa:

   - de 0,05 % a 10 % de cadenas hidrocarbonadas que tienen menos de 16 atomos de carbono;

   - de 0,05 % a 5 % de cadenas hidrocarbonadas que tienen mas de 28 atomos de carbono;

   y tiene una relacion P/N, que corresponde a la relacion de la cantidad en masa, de cadenas carbonadas de tipo paraffnico sobre la cantidad en masa, de cadenas carbonadas de tipo naftenico, comprendida entre 2,5 y 3.