BR112012008588B1 - métodos para introduzir um ácido nucleico de interesse em uma célula vegetal, para expressar um gene de maneira estável e para transferir um plasmídeo de dna para uma célula vegetal - Google Patents

Abstract

USO DE NANOTECNOLOGIA DE DENDRÍMERO DE LIBERAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM CÉLULAS DA PLANTA. A presente invenção refere-se a métodos para produzir uma molécula de interesse em uma célula da planta possuindo uma parede celular usando dendrímeros, e opcionalmente um ou mais CPPs. Os métodos são fornecidos para modificar geneticamente as plantas ou de outra maneira para tratar ou prevenir doenças em células de planta compreendendo uma parede celular.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa tente Provisório dos Estados Unidos número de série US 61/252,607, depositado 16 de outubro de 2009, para o "USO DA NANOTECNO- LOGIA DE DENDRÍMERO DA LIBERAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM CÉLULAS DA PLANTA".

ANTECEDENTES

[002] As nanopartículas têm propriedades únicas que foram ex ploradas para uso na liberação de DNA em células. Nanopartículas metálicas, tais como as nanopartículas de ouro (Au) foram usadas pa ra a liberação de DNA por causa da sua citotoxicidade baixa e a tran quilidade da funcionalização com vários ligantes da significância bioló gica. Adicionalmente às nanopartículas metálicas, as nanopartículas semicondutoras (por exemplo, pontos quantum) ("QD") dentro do faixa de variação de tamanho de 3 a 5 nm também foram usadas como transportadoras para liberar moléculas em células. DNA e as proteínas podem ser ligados ao ligante preso à superfície do QD (ver, por exem plo, F. Patolsky et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)).

[003] As nanopartículas foram usadas para liberar o DNA de plasmídeo em diferentes células de animais. Encontrou-se que quando nanopartículas revestidas de DNA são incubadas com células não possuindo uma parede celular, as células tomam as nanopartículas e começam a expressar qualquer gene codificado no DNA. Entretanto, a liberação de genes em plantas contemporâneas é desafiante devido à presença de paredes celulares nas plantas, que leva à dependência comum aos meios de liberação invasivos para transformação genética de plantas. Quando a liberação mediada por nanopartícula em células normalmente possuindo uma parede celular é desejada, a parede da célula é despida antes da adição das partículas aos protoplastos da planta (ver, F. Torney et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007)). Em célu las da planta, a parede celular atua como uma barreira contra a libera ção de moléculas exogenicamente aplicadas. Muitos métodos invasi- vos, como a pistola genética (biolística), a microinjeção, a eletropora- ção, e o Agrobacterium, foram empregados para atingir o gene e a li beração pequena de molécula nestas células da planta emparedadas, mas a liberação de proteínas só foi atingida pela microinjeção. A libe ração de pequenas moléculas e proteínas na presença de uma parede celular de planta permanece inexplorada e seria vantajoso desenvolver tecnologias de autorização a serem desdobradas na célula de planta intata / tecido ou órgão de manipulações de in vivo e in vitro.

[004] Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são uma classe nova e de crescimento rápido de peptídeos curtos que são conhecidos por desempenhar um papel importante na deslocação de uma ampla variação de complexos de carga incluem proteínas e DNA através das biomembranas em linhas de célula humana e mamífera. J. Schwartz e S. Zhang (2000), Peptide-Mediated Cellular Delivery, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167; U Langel (2002), Prefácio em: Cell Penetrating Pep tides; Processes and Applications, U. Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton; E. Vives e B. Lebleu (2002), THE Tat-Derived Cell-Penetrating Peptides em: Cell-Penetrating Peptides; Processes and Applications, U. Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton: páginas 3-22. Enquanto se mostrou que CPPs facilita a liberação de carga em células de mamífe ro, o uso de CPP em células da planta de estudos de transfecção foi limitado por um número de fatores. Um obstáculo principal à adapta ção desta tecnologia a plantas consiste em que, diferentemente de cé- lulas dos animais, as células da planta apresentam um sistema de bar reira dual (parede celular e membrana plasmática) para a internaliza- ção de CPPs e as suas cargas. Por isso, CPPs deve superar estas duas barreiras eficientes de translocação. Os CPPs foram usados em células da planta, mas tipicamente dependem do uso de agentes de permeabilização e técnicas com o uso de CPPs para efetuar a libera ção da de carga liberando nas células da planta. O VIH 1 BILRA o do mínio de transdução de proteína (PTD) é um dos peptídeos de deslo caçãoo mais bem estudados. Os relatórios recentes mostraram que o potencial de BILRA-PTD e os seus oligômeros da liberação de plasmí- deo formando um complexo com o DNA negativamente carregado em células de mamífero. I. Ignatovich, E. Dizhe, A. Pavlotskaya, B. Akifiev, S. Burov, S. Orlov, e A. Perevozchikov (2003), Complexes of Plasmid DNA with Basic Domain 47-57 of the HIV-1 Tat Protein Are Transferred to Mammalian Cells by Endocytosis-mediated Pathways, J. Biol. Chem. 278:42625-42636; C. Rudolph, C. Plank, J. Lausier, U. Schil- linger, R.H. Muller, e J. Rosenecker (2003), Oligomers of the Arginine- Rich Motif of the HIV-1 TAT Protein are Capable of Transferring Plas mid DNA into Cells, J. Biol. Chem. 278:11411-11418; Z. Siprashvili, F. Scholl, S. Oliver, A. Adams, C. Contag, P. Wender, e P. Khavari (2003), Gene Transfer via Reversible Plasmid Condensation with Cys- teine-Flanked, Internally Spaced Arginine-Rich Peptides, Hum. Gene. Ther. 14 (13):1225-33; I. Hellgren, J. Gorman, e C. Sylvén (2004), Fac tors Controlling the Efficiency of Tat-mediated Plasmid DNA Transfer, J. Drug. Target. 12 (1):39-47.

[005] Os dendrímeros são "moléculas em cascata" com a concha principal única arquitetura macromolecular. Os dendrímeros foram primeiro criados no laboratório em 1979 por Donald Tomalia (D.A. To- malia et al., Preimpressões do 1oSPSJ Int'l Polymer conference, Soci ety of Polymer Science, o Japão, o Quioto, 1984, p. 65; ver também Patente dos Estados Unidos No. 6.316.694). Os dendrímeros foram usados para liberar DNA e outras biomoléculas em células dos ani mais. Entretanto, a presença de paredes celulares de planta apresen tou desafios à liberação de genes em plantas. Adicionalmente, a inte gração genômica estável de transgenes que usam liberação baseada no dendrímero não foi relatada ou demonstrada em plantas. Assim, lá ainda permanece uma necessidade de um método da incorporação estável de genes e outras moléculas do interesse em plantas através do uso da liberação baseada no dendrímero.

DESCRIÇÃO

[006] As seguintes modalidades são descritas em conjunto com sistemas, as ferramentas e os métodos que estão destinados a ser exemplos e ilustrativos, e não limitante no alcance.

[007] A presente invenção se refere a métodos que usam den- drímeros, e opcionalmente um ou mais CPPs, para liberar não- invasivamente substâncias moleculares em células possuindo uma parede celular para incorporação estável das substâncias moleculares no mesmo.

[008] Uma modalidade da invenção inclui um método de introdu zir uma molécula de interesse em uma célula da planta possuindo uma parede celular para realizar a transformação estável de uma planta e sementes. O método inclui o fornecimento à uma célula da planta pos suindo uma parede celular e a interação com um dendrímero, e opcio nalmente um ou mais CPPs, com uma molécula de interesse para formar uma estrutura ativada de dendrímero. A célula e a estrutura ati vada de dendrímero são colocadas em contato uma com a outra, sob condições, que permitam a absorção do mesmo pela célula possuindo uma parede celular.

[009] Outra modalidade da invenção inclui um método de ex pressar um gene de maneira estável. O método inclui o fornecimento de uma célula da planta possuindo uma parede celular e interagindo um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPs, com um gene pa ra formar uma estrutura ativada de dendrímero. A célula da planta possuindo uma parede celular e a estrutura ativada de dendrímero são colocadas em contato uma com a outra, e o dendrímero e o gene são colocados sob condições que permitem a absorção do mesmo na célu la da planta possuindo uma parede celular. O gene na progênie de uma planta possuindo a célula da planta é então expressado.

[010] Ainda outra modalidade da invenção inclui um método para transferir uma substância molecular para uma célula da planta. O mé todo inclui a interação de um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPs, com o DNA de um plasmídeo para formar uma estrutura ativada de dendrímero. A estrutura ativada de dendrímero é colocada em con tato com uma célula da planta intacta que carrega a parede sob condi ções que permitem a absorção do dendrímero e um gene do plasmí- deo DNA na célula da planta.

[011] Além dos exemplos de aspectos e modalidades descritos acima, os aspectos adicionais e as modalidades ficarão evidentes em vista das seguintes descrições.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012] A Figura 1 mostra o Plasmídeo pDAB3831.

[013] A Figura 2 mostra o Plasmídeo pDAB7331.

[014] A Figura 3 é uma imagem em gel corado com brometo de etídio mostrando a amplificação do PAT PCR de DNA genômico da planta transgênica Arabidopsis: 100 dupla fita de DNA (Promega Inc) 1; Arabidopsis linha transgênica de SUPERFECT™ com tratamento pDAB3831 2; Plasmídeo DNA pDAB3831 como um controle positivo; os Asteriscos indicam o PAT amplicon de PCR.

[015] Figura 4 é uma imagem de gel mostrando YFP amplificação de PCR de DNA genômico da planta transgênica Arabidopsis: 100 dupla fita de DNA (Promega Inc) 1; Arabidopsis linha transgênica de SUPER- FECT™ com tratamento pDAB3831 2; Plasmídeo DNA pDAB3831 como um controle positivo; os Asteriscos indicam o amplicon de PCR YFP.

[016] Figura 5 mostra níveis de expressão de proteína de PAT de tecidos de folha mediados por dendrímero (SUPERFECT™) das plan tas Arabdopsis transformadas; usando Kit comercial ELISA, a proteína de PAT foi detectada nas plantas transgênicas mediadas no dendríme- ro e em comparação com plantas que foram transformadas via Agrobacterium tumefaciens.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[017] Na descrição e tabelas que se seguem, diversos termos são usados. Para fornecer uma compreendendo clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluem o alcance a ser dado tais termos, as seguintes definições são fornecidas:

[018] Retrocruzamento. O retrocruzamento pode ser um proces so no qual um criador repetidamente cruza a progênie híbrida para atrás com um dos pais, por exemplo, um primeiro híbrido de geração F1 com um dos genótipos paternos do híbrido F1.

[019] Embrião. O embrião pode ser a pequena planta contida dentro de uma semente madura.

[020] Dendrímero. Os dendrímeros são macromoléculas nanomé- tricas tri dimensionais, hiper-ramificados, monodispersas obtidas por uma sequência reiterativa de reações. Os dendrímeros são costumei ramente sintetizados como "nanoestruturas" ajustáveis que podem ser projetadas e reguladas como uma função do seu tamanho, forma, química superficial e espaço vazio interior. Os dendrímeros podem ser obtidos com o controle estrutural que se aproxima daquela de bioma- cromoléculas tradicionais, tais como DNNPNA ou proteínas e são dife renciadas pelo seu sistema de nanoescala preciso e propriedades de nanorrecipiente. Os dendrímeros são partículas microscópicas com pelo menos uma dimensão de nanoescala, normalmente menos de 100 nm. Os dendrímeros adequados para uso na presente invenção podem ter um tamanho de 1 nm a 0,4 μm.

[021] Resistente ao Glifosato. A resistência a uma dosagem do glifosato se refere à capacidade de uma planta de sobreviver (isto é a planta não pode ser morta) por aquela dosagem do glifosato. Em al guns casos, as plantas tolerantes podem temporariamente amarelar ou de outra maneira exibir o dano induzido pelo glifosato algum (por exemplo, excessivos brotamento e/ou inibição de crescimento), mas se recuperam.

[022] Estabilizado. Estabilizado se refere a características de uma planta que são reprodutivelmente passadas de uma geração para a próxima geração de plantas geradas da mesma variedade.

[023] Absorção. A absorção se refere à translocação de uma par tícula, tal como um dendrímero, através de uma parede celular ou uma membrana celular, em que a translocação não ocorre sozinha em con-sequência do momento comunicado à partícula por outra coisa diferen te da célula na qual a partícula está sendo absorvida. Os exemplos não limitantes de dispositivos ou métodos que causam a translocação de uma partícula através de uma parede celular ou uma membrana celular somente sozinho em consequência do momento comunicado à partícula são biolístico, arma genética, microinjeção, e/ou tecnologias de impalefecção.

[024] Em uma modalidade particular, a invenção se refere ao pe dido do dendrímero como uma opção da nanoengenharia para desen volver uma carga paga para à moda materiais de pedidos em pequena molécula, liberação de biomolécula, liberação de genes, visualização, e várias diagnósticas biotecnológicas e funções sentem. A arquitetura de dendrímero fornece diversas propriedades distintivas que os dife renciam de outro polímero e nanopartículas, tais como o método gra- dual da síntese, que pode prover um tamanho bem definido e estrutura com um índice de polidispersidade comparativamente baixo. Adicio nalmente, a química de dendrímero pode ser adaptável e, assim, facili tar a síntese de um largo faixa de variação de moléculas com a funcio nalidade diferente. O uso de dendrímeros métodos particulares de acordo com da presente invenção facilita biomoléculas e liberação de genes através do uso de uma alta densidade de grupos terminais.

[025] Em outras modalidades da invenção, múltiplos sítios de li gação ou de carga de uma molécula "acrescentado" ou "hóspede" po de ser projetada nos dendrímeros em vários e/ou múltiplos sítios. Esta propriedade pode ser empregada, por exemplo, em direcionamento específico e edição de sítios moleculares dentro de células para áreas, tais como biomiméticos, liberações direcionadas, para opções de or ganismonão-geneticamente modificadas, e opções de transformação transientes em uma variedade de árvore ou colheitas vegetais para ;opções de traço e resistência a doença. As modalidades da invenção também podem ser empregadas para desenvolver biosensores ade quados.Além disso, cromossomos artificiais (ASES) podem ser em pregados com os métodos da invenção como uma alternativa para ve-toreseucarióticos atuais de direcionamento preciso e opções de re- combinação homólogas.

[026] De acordo com as modalidades da invenção, pode ser for neceu um método de introduzir uma molécula de interesse em uma célula da planta compreendem uma parede celular, o método compre endendo, colocando um dendrímero contêm uma molécula de interes se no contato com a célula da planta e permitindo a absorção do den- drímero através da parede celular de planta. Particularmente os aspec tos da invenção, o dendrímero pode ser qualquer dendrímero e pode conter reversivelmente ou irreversivelmente, pode interagir, ou de ou tra maneira ser ligado a e/ou transportar uma molécula de interesse. Em certas modalidades, uma molécula de interesse pode ser introdu zida ao dendrímero antes de contato com uma célula da planta pos suindo uma parede celular ou concorrentemente com a introdução do dendrímero a uma célula da planta possuindo uma parede celular.

[027] De acordo com modalidades da presente invenção, uma célula da planta possuindo uma parede celular pode ser qualquer célu la da planta compreendem uma parede celular intacta e completa. Os exemplos das células possuindo uma parede celular incluem, mas não é limitada a, algáceo, fumo, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, feijão-soja, cana-de-açúcar, Oryza sp., Arabidopsis sp., e Ricinus sp., preferivelmente fumo, milho de cenouras, algodão, canola, feijão-soja e cana-de-açúcar; mais preferivelmente fumo e ce nouras. As modalidades da invenção podem incluir células compreen dendo uma parede celular de qualquer tecido ou onde quer que eles sejam encontrados, incluindo, mas não limitados a, em embriões, célu las de meristemático, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, dicas de raiz, flores, sementes, vagens, troncos, e cultura de tecido.

[028] Nas modalidades da invenção, uma molécula de interesse pode ser qualquer molécula que pode ser liberada a uma célula da planta de acordo com moléculas de interesse, ou componentes de mo léculas do interesse, podem compreender, mas não são limitadas a, ácidos nucleicos, DNA, RNA, moléculas de RNAi, genes, plasmídeos, cosmídios, YACs, BACs, Cromossomos Artificiais de Planta, Minicro- mossomos de Planta, Planta Lugares de Traço Projetados DNA; poli- peptídeos, enzimas, hormônios, glico-peptídeos, açúcar, gorduras, peptídeos sinalizadores, anticorpos, vitaminas, mensageiros, segun dos mensageiros, aminoácidos, CAMPO, drogas, herbicidas, fungici das,antibióticos, e/ou combinações dos mesmos.

[029] As modalidades da invenção incluem métodos da preven ção ou tratamento da doença. As modalidades de exemplo não-limitam incluem a liberação de fungicidas, antibióticos, e/ou outras drogas a células na necessidade que dos mesmos usa métodos da presente invenção.

[030] Em aspectos da invenção, o dendrímero pode ser absorvi do em várias partes de células. Os exemplos de localizações que um dendrímero pode ser absorvido em inclui, mas não é limitado a, citos- sol, núcleo, tonoplastos, plastídios, etioplastos, cromoplastos, leuco- plastos, elaioplastos, proteinoplastos, amiloplastos, cloroplastos, e o lúmen de uma membrana dupla. Em outras modalidades da invenção, a absorção de dendrímero em uma célula compreende uma parede celular pode ocorrer via a via de apoplástico ou o simplástico.

[031] As modalidades adicionais da invenção incluem células de planta geneticamente modificadas e métodos para gerá-los, em que as células de planta têm um ou mais ácidos nucleicos introduzidos no mesmo via métodos da presente invenção. Em um exemplo de uma modalidade, um plasmídeo compreende um gene do interesse e um marcador selecionável pode ser em introduzido em uma célula da planta possuindo uma célula bem via um dendrímero de acordo com a presente invenção. Em modalidades adicionais, transformantes está veis podem ser selecionados, que têm integrado de maneira estável o gene do interesse e/ou o marcador selecionável. Em modalidades al ternativas, uma célula da planta agora compreende o gene do interes se pode ser propagado para produzir outras células compreendem uma molécula de interesse. Em outras modalidades, as células de planta agora compreendem uma molécula de interesse pode ser uma célula de regenerável que pode ser usou para regenerar uma planta inteira incluindo a molécula de interesse.

[032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece os métodos de criar células de planta de regenerável compreendem uma molécula de interesse para uso em cultura de tecido. A cultura de tecido será preferivelmente capaz de regenerar plantas possuindo substancial mente o mesmo genótipo que as células de regenerável. As células de regenerável em tais culturas de tecido podem ser embriões, protoplas- tos, células de meristemático, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, dicas de raiz, flores, sementes, vagens ou troncos. Ainda também, uma mo dalidade da invenção fornece plantas regeneradas das culturas de te cido da invenção.

[033] Alternativamente, a presente invenção fornece um método de introduzir um traço desejado em uma célula da planta possuindo uma parede celular, em que o método compreende: colocação de um dendrímero e uma molécula de interesse capaz de fornecer o traço desejado à célula da planta no contato com a célula e permitir a absor ção do dendrímero através da parede celular. Os exemplos de traços desejados incluem, mas não são limitados a, traços selecionados de esterilidade masculina, resistência a herbicida, resistência a inseto, e resistência à doença bacteriana, doença fúngica, e/ou doença viral.

[034] Os aspectos adicionais da invenção fornecem os métodos da geração de linhas de planta estabilizadas compreendendo um traço desejado ou a molécula de interesse, em que o traço desejado ou a molécula de interesse pode ser primeiro introduzido pela ab sorção de um dendrímero através de uma parede celular de planta. Os métodos de gerar linhas de planta estabilizadas são bem conhe cidos a um de normalmente versado na técnica e podem incluir téc nicas tal como, mas não limitados a, autofecundação, retrocruza- mento, produção híbrida, cruzes a populações, e assim por diante. Todas as plantas e as células de planta compreendem um traço de sejado ou a molécula de interesse primeiro introduzido na célula da planta (ou os seus predecessores) pela absorção de um dendrímero através de uma parede celular estão dentro dos limites da presente invenção. Vantajosamente, as células de planta compreendem um traço desejado ou a molécula de interesse primeiro introduzido na planta ou célula (ou os seus predecessores) pela absorção de um dendrímero através de uma parede celular podem ser usadas em cruzamentos com outras, diferentes, células de planta para produzir a primeira geração (F1) híbrida de células, sementes, e/ou plantas com características superiores.

[035] Em modalidades em que a molécula de interesse com preende um ou mais o genes, o gene pode ser um alelo dominante ou recessivo. Por meio do exemplo, o gene conferirá tais traços co mo resistência a herbicida, resistência a inseto, resistência a resis tência bacteriana, resistência fúngica, resistência à doença viral, a fertilidade masculina, esterilidade masculina, melhora na qualidade nutritiva, e o uso industrial.

[036] Com o advento de técnicas biológicas moleculares que permitiram o isolamento e a caraterização de genes que codificam pro teínas específicas ou produtos de RNA (por exemplo, RNAi), os cien tistas no campo da biologia da planta desenvolveram um grande inte resse na engenharia do genoma de células para conter e expressar genes estranhos, ou versões adicionais ou modificadas de genes nati vos ou endógenos (possivelmente dirigido por promotores diferentes) para alterar os traços de uma célula em uma maneira específica. Tais genes adicionais e/ou modificados estranhos entregam-se a aqui cole tivamente como "transgenes". Durante quinze a vinte anos passados, vários métodos para produzir células transgênicas foram desenvolvi dos e, em modalidades particulares, a presente invenção se refere a versões transformadas de células e métodos para produção deles via a introdução em uma célula possuindo uma parede celular um trans gene via a absorção de um dendrímero através de uma parede celular. Em modalidades da invenção, o transgene pode ser contido em um vetor de expressão.

[037] A transformação de célula pode envolver a construção de um vetor de expressão que funcionará em uma célula particular. Tal vetor pode compreender DNA que inclui um gene sob controle de, ou operacionalmente ligado a, um elemento regulador (por exemplo, um promotor). O vetor de expressão pode conter um ou mais gene ligado de tal operacionalmente / combinações de elemento reguladoras. O vetor pode estar na forma de um plasmídeo e pode ser usado sozinho ou em combinação com outros plasmídeos para fornecer células trans formadas que usam métodos de transformação como descrito aqui pa ra incorporar o transgene no material genético de uma célula da planta compreendendo uma parede celular.

[038] Particularmente as modalidades da invenção, um STAR BURST® PAMAM de uso múltiplo (poliamidoamina) o protótipo de dendrímero exibe propriedades adequadas para ser usado como: (i) MRI visado, diagnóstico (visualização de ressonância magnética) INIR (perto-IR) contrastam agentes, (ii) e/ou para a liberação controlada da terapia de câncer. Entre eles, um candidato principal é (núcleo: 1,4- diaminobotano; G (geração) [PAMAM (CO2Na) 64J. Esta nanoestrutu- ra dendrítica (isto é diâmetro de -5,0 nm) foi selecionada com base em um perfil de biocompatibilidade muito favorável (The Nanotechnology Characterization Laboratory (NCL), um afiliado do Instituto Oncológico Nacional (NCI), concluíram estudos in vitro extensos do composto de chumbo e encontraram que ele é muito benigno e altamente biocom- patível, a expectativa que é isto ele exibirá propriedades de excreção de rim mamíferas desejáveis e características de direcionamento de-monstradas. Os dendrímeros usados com os métodos da invenção representam uma classe do polímero caracterizado pela sua estrutura bem definida, com um alto grau de uniformidade molecular e polidis- persidade baixa. Além disso, mostrou-se que estes dendrímeros são capazes de ignorar a transportadores de efluxo.

[039] O uso de dendrímeros de acordo com os métodos da pre sente invenção produziram plantas transformadas de maneira estável e demonstraram-se a expressão do gene de herbicida transformado de maneira estável com o fenótipo onde a alta tolerância de herbicida foi tornada na planta de T1 transgênica. Mostrou-se que esta planta era fértil como produziu sementes de T2.

[040] Em uma modalidade particular, reagente de transfecção SUPERFECT™ foi usado. Este reagente é um policátion possuindo uma forma definida e diâmetro, disponível como reagente SUPER- FECT®da Qiagen (Catálogo Qiagen #301307) como uma solução de dendrímeros ativados especificamente projetados. Os dendrímeros são moléculas de poliamidoamina esféricas com ramos que irradiam de um núcleo central e terminam em grupos de amino carregados. A ativação química promove a absorção eficiente de DNA por células eucarióticas. Não limitado a uma teoria particular, pensa-se que este reagente monta DNA em estruturas compactas, assim otimizando a entrada de DNA em células. Para estabilizar o complexo SUPER- FECT®-DNA durante o seu transporte ao núcleo, o reagente SUPER- FECT®é projetado par tamponar o lisossoma após a fusão com o en- dossoma, levando à inibição via pH de nucleases lisossômicas.

[041] Vetores de expressão para absorção via Dendrímero: mar cadoresgenéticos.

[042] Os vetores de expressão podem incluir pelo menos um marcador genético, operacionalmente ligado a um elemento regulador (um promotor, por exemplo) que permite que as células transformadas contenham o marcador a ser recuperado pela seleção negativa (isto é, inibindo crescimento de células que não contêm o gene de marcador selecionável) ou pela seleção positiva (isto é, avaliando para o produto codificado pelo marcador genético). Muitos marcadores genéticos se lecionáveis da transformação são bem conhecidos nas técnicas de transformação e incluem, por exemplo, genes que codificam para en zimas que o metabolicamente desintoxifica um agente químico seletivo que pode ser um antibiótico ou uma herbicida, ou genes que codificam um objetivo alterado que pode ser insensível ao inibidor. Alguns méto dos de seleção positivos também são conhecidos na técnica.

[043] Um gene de marcador selecionável comumente usado adequado para a transformação de planta pode incluir o gene fosfo- transferase de neomicina II (nptII) sob o controle de sinais reguladores da planta, que confere a resistência à canamicina. Ver, por exemplo, Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Outro gene de marcador selecionável comumente usado pode ser o gene de fosfo- transferase de higromicina, que confere a resistência ao antibiótico hi- gromicina. Ver, por exemplo, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985).

[044] Os marcadores genéticos selecionáveis adicionais da ori gem bacteriana que conferem a resistência a antibióticos incluem o transferase de acetil de gentamicina, o fosfotransferase de estreptomi- cina, aminoglicosídio-3'-adenil transferase, e o determinante de resis tência a bleomicina. Ver et al Hayford., Plant Physiol. 86:1216 (1988); Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990); Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Outros marcadores genéticos selecionáveis conferem a resistência a herbici das, tais como glifosato, glifosinato ou bromoxinil. Ver et al Comai., Nature 317:741-744 (1985); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990); e Stalker et al., Science 242:419-423 (1988).

[045] Outros marcadores genéticos selecionáveis adequados pa ra a transformação de planta não são da origem bacteriana. Estes ge nes incluem, por exemplo, o reductase de di-hidrofolato de rato, plan tam o sintetase 5-enolpiruvillshikimato-3-fosfato e o sintetase de aceto- lactato de planta. Ver et al Eichholtz., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987); Xá et al., Science 233:478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).

[046] Outra classe de marcadores genéticos adequados para a transformação de planta necessita a avaliação de células de planta presuntivamente transformadas em vez da seleção genética direta de células transformadas da resistência a uma substância tóxica, tais como um antibiótico. Estes genes são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o modelo espacial da expressão de um gene em tecidos específicos e são frequentemente se referem como genes de repórter porque eles podem ser fundidos a um gene ou gene se quência reguladora da investigação da expressão gênica. Os genes comumente usados para avaliar células transformadas incluem β- glucuronidase (GUS), β-galactosidase, luciferase e acetiltransferase de cloranfenicol. Ver Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Representante 5:387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989); Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:131 (1987); DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984).

[047] Recentemente, os métodos de in vivo para visualizar a ati vidade de GUS que não necessitam da destruição do tecido de planta foram postos à disposição. A publicação 2908 de Molecular Probes, Imagene GreenTM, pp. 1-4 (1993); e Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991). Entretanto, estes métodos de in vivo para visualizar a atividade de GUS não provaram útil para a recuperação de células transformadas por causa de sensibilidade baixa, altos antecedentes fluorescentes, e limitações associadas com o uso de genes de lucife rase como marcadores selecionáveis.

[048] Mais recentemente, genes que codificam Proteínas Fluo rescentes (por exemplo, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, e YFP) foram utili zados como marcadores da expressão gênica em células procarióticas e eucarióticas. Ver et al Chalfie., Science 263:802 (1994). Proteínas fluorescentes e mutações de proteínas fluorescentes podem ser usa das como marcadores de avaliável. Vetores de expressão para absorção via Dendrímero: Promotores

[049] Os genes incluídos em vetores de expressão devem ser dirigidos por uma sequência de nucleotídeo compreendendo um ele mento regulador, por exemplo, um promotor. Vários tipos de promoto ressão bem conhecidos agora nas técnicas de transformação, como são outros elementos reguladores que pode ser usado sozinho ou em combinação com promotores.

[050] Como usado aqui, o "promotor" inclui a referência para uma região de DNA que pode ser a montante da partida da transcrição e isto pode ser envolvido no reconhecimento e de ligação do polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta. Os exemplos de promotores o controle sob desenvolvente inclui promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em cer tos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos de xile- ma, traqueídeos, ou esclerênquima. Tais promotores mencionam-se "preferido ao tecido". Os promotores que iniciam a transcrição só em certos tecidos se mencionam "específico para o tecido". Um "tipo de célula"promotor específico principalmente dirige a expressão em certa célula datilografa um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível"pode ser um promotor que pode ser sob controle ambiental. Os exemplos de condições am-bientais que podem realizar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença da luz. Específico para o tecido, preferido ao tecido, tipo de célula os promotores específicos, e induzíveis constituem a classe de promotores "não-constitutivos". Um promotor "constitutivo" pode ser um promotor que pode ser ativo sob a maior parte de condições ambientais.

1. Promotores induzíveis.

[051] Um promotor induzível pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. Opcionalmente, o promotor in- duzível pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de nucleo- tídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacional mente ligado a um gene de expressão em uma célula. Com um promo tor induzível, a taxa da transcrição aumenta em resposta a um agente de induzimento.

[052] Qualquer promotor induzível pode ser usado na invenção imediata. Ver a Ala et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Os exemplos de promotores induzívéis incluem, mas não são limitados a: aqueles do sistema ACEI que responde ao cobre (Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); o gene de In2 do milho que responde ao herbi cida de benzenossulfonamida safeners (Hershey et al., Mol. Gen Ge netics 227:229-237 (1991); e Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); e Tet repressor de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)). Um promotor induzível particularmente útil pode ser um promotor que responde a um agente de induzimento que as plantas não respondem normalmente. Um promotor induzível exemplar pode ser o promotor induzível de um gene hormonal de esteroide, a atividade transcricional do qual pode ser induzido por um hormônio de glicocorticosteroide. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991).

8. Promotores constitutivos.

[053] Um promotor constitutivo pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula ou o promotor constitutivo po de ser operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula.

[054] Os promotores constitutivos diferentes podem ser utilizados na invenção imediata. Os promotores constitutivos exemplares inclu em, mas não são limitados a: promotores de vírus de planta, tais como o promotor 35S da CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); promotores de genes de actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitin (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619 632 (1989); e Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (et alÚltimo., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); e milho histona de H3 (Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992); e Atanassova et al., o Jornal 2 (3):291-300 (1992) de Planta). O promotor ALS, frag mento de Xba1/NcoI 5' ao Brassica napus ALS3 gene estrutural (ou uma similaridade de sequência de nucleotídeo a dito fragmento de Xba1/NcoI), representa um promotor constitutivo particularmente útil. Ver o pedido de PCT WO 96/30530.

9. Promotores específicos para o tecido ou preferidos do tecido.

[055] Um promotor específico para o tecido pode ser operacio nalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. Opcional mente, o promotor específico para o tecido pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. As plantas transformadas com um gene do operacio nalmente de interesse ligado a um promotor específico para o tecido podem produzir o produto de proteína do transgene exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico.

[056] Qualquer promotor específico para o tecido ou preferido ao tecido pode ser utilizado na invenção imediata. Os promotores especí ficos para o tecido ou preferidos ao tecido exemplares incluem, mas não são limitados a, um promotor preferido à raiz-tal como isto do ge ne de faseolina (Murai et al., Science 23:476-482 (1983); e Sengupta- Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)); um promotor específico para a folha e induzido pela luz, tal como o de cab ou rubisco (Simpson et al., EMBO J. 4 (11):2723-2729 (1985); e Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); um promotor específico para a an tera, tal como aquele de LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)); um promotor específico para o pólen, tal como aquele de Zm13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) ou um promotor preferido ao microesporo, tal como aquele de apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)).

[057] O transporte da proteína produzida por transgenes para um compartimento subcelular, tais como o cloroplasto, vacúolo, peroxis- soma, glioxissoma, parede celular ou mitocôndria ou para a secreção no apoplasto pode ser realizado por meio do operacionalmente que liga a sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de sinal para a região 5' e/ou 3‘ de um gene que codifica a proteína do interes se. Visando as sequências nas extremidades 5' e/ou 3' do gene estru tural pode determinar, durante a síntese de proteína e o processamen to, onde a proteína codificada pode ser enfim compartimentada. Alter nativamente tais proteínas de direcionamento de compartimento sub- celulares podem ser diretamente ligadas a um dendrímero para dirigir o dendrímero revestido da molécula de interesse ao compartimento subcelular desejado.

[058] A presença de uma sequência de sinal dirige um polipeptí- deo a uma organela intracelular ou a compartimento subcelular, ou pa ra a secreção ao apoplasto. Muitas sequências de sinal são conheci das na técnica. Ver, por exemplo, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992); P.S. Perto, a Tese de Mestrado, Universidade Estadual de Io wa (1993); C. Knox et al., "Structure and Organization of Two Diver gent Alpha-Amylase Genes from Barley,"Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987); Lerner et al., Plant Physiol. 91:124-129 (1989); Fontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991); Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991); Gould et al., J. Cell. Biol. 108:1657 (1989); Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991); Kalderon, et al., A short amino acid se quence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509 (1984); Steifel, et al., Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glyco protein gene in early leaf and root vascular differenciation, Plant Cell 2:785-793 (1990). Genes de Proteína Estranha e Genes Agronômicos Estranhos.

[059] Com plantas transgênicas de acordo com a presente inven ção, uma proteína estrangeira pode ser produzida em quantidades comerciais. Assim, as técnicas da seleção e a propagação de plantas transformadas, que são bem entendidas na técnica, produzem uma pluralidade de plantas transgênicas que são colhidas em uma maneira convencional, e uma proteína estrangeira depois pode ser extraída de um tecido do interesse ou da biomassa total. A extração de proteína da biomassa de planta pode ser realizada por métodos conhecidos que são discutidos, por exemplo, por Heney e Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981).

[060] Em aspectos da invenção, a planta transgênica proveu a produção comercial da proteína estrangeira pode ser uma célula ou uma planta. Em outros aspectos, a biomassa do interesse pode ser semeia. Para relativamente pequeno número de plantas transgênicas que mostram níveis mais altos da expressão, um mapa genético pode ser gerado principalmente via RFLP convencional, PCR e análise SSR, que identifica a localização cromossômica aproximada da molé cula de DNA integrada. Para exemplos de metodologias neste sentido, ver Glick e Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Bio technology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993). Informação sobre mapa acerca de localização cromossômica pode ser útil para proteção proprietária de uma planta transgênica sujeita. Se propagação não au torizada pode ser empreendida e cruzamentos feitos com outro ger- moplasma, o mapa da região de integração puder ser em comparação com mapas semelhantes de plantas de suspeito para determinar se os últimos têm uma ascendência comum com a planta sujeita. As compa rações de mapa envolveriam hibridizações, RFLP, PCR, SSR e se- quenciamento, todos do qual são técnicas convencionais.

[061] De mesmo modo, os genes agronômicos podem ser ex pressos em células transformadas ou o seu progênie. Mais particular mente, as plantas podem ser geneticamente projetadas via os méto dos da invenção para expressar vários fenótipos do interesse agronô mico. Os exemplos de genes que podem ser usados neste sentido in cluem, mas não são limitados a, aqueles categorizados abaixo.

10. Os genes Que Conferem a Resistência a Pragas ou Doença e Que Codificam:

[062] A) Genes de resistência à doença de planta. A defesa de planta muitas vezes é ativada pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de uma avirulência correspondente (Avr) gene no agente patogênico. Uma va riedade de planta pode ser transformada com genes de resistência clonados para projetar plantas que são resistentes a cepas patógenas específicas. Ver, por exemplo, Jones et al., Science 266:789 (1994) (clonagem do gene de tomate Cf-9 de resistência a Cladosporium ful- vum); Martin et al., Science 262:1432 (1993) (o gene de tomate Pto da resistência a Pseudomonas syringae pv. codifica uma quinase de pro teína do tomate); Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994) (Arabidops pode ser o gene RSP2 da resistência a Pseudomonas syringae).

[063] B) Gene conferindo resistência a uma praga, tal como cisto de nematoide de feijão-soja. Ver por exemplo, Pedido de PCT WO 96/30517; Pedido de PCT WO 93/19181.

[064] C) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado dos mesmos ou um polipeptídeo sintético modelado do mesmo. Ver, por exemplo, Geiser et al., o Gene 48:109 (1986), que divulga a clonagem e sequência de nucleotídeo de um Bt δ-gene de endotoxina. Além dis so, as moléculas de DNA que codificam δ-genes de endotoxina podem ser compradas da Coleção Americana de Cultura de Tipos, Manassas, Va., por exemplo, sob Acesso ATCC N° 40098, 67136, 31995 e 31998.

[065] D) Uma lecitina. Ver, por exemplo, a divulgação por Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994), quem divulgam as se quências de nucleotídeo de vários genes de lecitina de Clivia miniata manose de ligação.

[066] E) Uma proteína de vitamina de ligação, tal como avidina. Ver o pedido de PCT US93/06487. O pedido ensina o uso de avidina e homologos da avidina como larvicidas contra pragas de inseto.

[067] F) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de pro tease ou proteinase ou um inibidor de amilase. Ver, por exemplo, Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987) (sequência de nucleotídeo de inibidor de proteinase de cisteína de arroz); Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993) (sequência de nucleotídeo de cDNA que codifica inibidor de proteinase de fumo I); Sumitani et al., Biosci. Biotech. Bio- chem. 57:1243 (1993) (sequência de nucleotídeo de Streptomyces ni- trosporeus α-inibidor de amilase) e Patente dos Estados Unidos N° 5.494.813 (Hepher e Atkinson, emitido 27 de fevereiro de 1996).

[068] G) Um hormônio específico para o inseto ou feromona, tal como um ecdysteroid ou hormônio juvenil, uma variante dos mesmos, um à base de mimético nisso, ou um antagonista ou agonista dos mesmos. Ver, por exemplo, a divulgação pela Rede para dormir et al., Nature 344:458 (1990), de expressão de baculovírus de esterase hor monal juvenil clonado, um inactivator de hormônio juvenil.

[069] H) Um peptídeo específico para o inseto ou neuropeptídio que, segundo a expressão, interrompe a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, ver as divulgações de Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994) (expressão que clona produtos de codificação de DNA do re ceptor hormonal de diurético de inseto); e Pratt et al., Biochem. Bi ophys. Res. Comm. 163:1243 (1989) (uma alostatina pode ser identifi cada em Diploptera puntata). Ver também Patente dos Estados Unidos N° 5.266.317 para Tomalski et al., que divulga genes que codificam neurotoxinas paralíticas específicas para o inseto.

[070] I) Um veneno específico para o inseto produzido na nature za por uma cobra, uma vespa, ou qualquer outro organismo. Por exemplo, ver a Pang et al., Gene 116:165 (1992), para divulgação de expressão heteróloga em plantas de uma codificação genética de um peptídeo insetotóxico de escorpião.

[071] J) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula não-proteína com ativi dade inseticida.

[072] K) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modi ficação pós-translação, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, um nuclease, um ciclase, um transaminase, um esterase, um hidrolase, um fosfatase, um quinase, um fosforilase, um polimerase, um elastase, um quitinase e um glucanase, ou natural ou sintético. Ver o pedido de PCT WO 93/02197 em nome de Scott et al., que divulga a sequência de nucleotídeo de um gene de calase. As moléculas de DNA que contêm sequências codificam o quitinase podem ser obtidas, por exemplo, do ATCC sob Acesso N° 39637 e 67152. Ver também Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993), quem ensi nam a sequência de nucleotídeo de um cDNA que codifica quitinase de lagarta do tabaco; e Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21:673 (1993), quem fornecem a sequência de nucleotídeo da salsa ubi4-2 gene de polibiquitina.

[073] L) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, ver a divulgação por Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994), de sequências de nucleotídeo de calmodulina de feijão mung clones de cDNA, e Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994), quem fornecem a sequência de nucleotídeo de uma calmodulina de milho clone de cDNA.

[074] M) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Ver o pedido de PCT WO 95/16776 (a divulgação de derivados de peptídeo de Ta- chyplesin que inibem agentes patogênicos de planta fúngicos) e pedi do de PCT WO 95/18855 (ensina peptídeos de antimicrobiano sintéti cos que conferem a resistência à doença).

[075] N) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, ver a divulgação de et al Jaynes., Plant Sci 89:43 (1993), da expressão heteróloga de um ce- cropin-β-litico análogo de peptídeo para tornar plantas de fumo trans- gênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[076] O) Uma proteína viral e invasiva ou uma toxina complexa derivaram disto. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento virais em células de planta transformadas comunica a resistência ao desenvolvimento de doença e/ou infecção viral efetuado pelo vírus de que o gene de proteína de revestimento pode ser derivado, bem como por vírus relacionados. Ver Beachy et al., Rev Ann Phytopathol. 28:451 (1990). A resistência mediada na proteína de revestimento foi conferi da a plantas transformadas contra vírus de mosaico de alfafa, vírus de mosaico de pepino, vírus de faixa de fumo, vírus de batatas X, vírus de batatas Y, vírus de corrosão do fumo, o vírus de batida de fumo e o vírus de mosaico de fumo. Id.

[077] P) Um anticorpo específico para o inseto ou uma imunoto- xina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo visado a uma função metabólica crítica no intestino de inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Conforme. Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium em Molecular Plant-Microbe Interactions (Edimburgo, a Escócia) (1994) (inativação enzimática em fumo transgênico via pro dução de fragmentos de anticorpo de cadeia única).

[078] Q) Um anticorpo específico para o vírus. Ver, por exemplo, Tavladoraki et al., Nature 366:469 (1993), quem mostram que as plan tas transgênicas que expressam genes de anticorpo de recombinante são protegidas do ataque de vírus.

[079] R) Uma proteína desenvolvente-arrestiva produzida na na tureza por um agente patogênico ou um parasita. Por exemplo, α-endo fúngico-1,4-D-polygalacturonases facilita a colonização fúngica e plan ta a liberação nutriente solubilizando parede celular de planta homo-α- 1,4-D-galacturonase. Ver o Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992). A clonagem e a caraterização de um gene que codifica uma proteína de endopolygalacturonase-inibição de feijão pode ser descrita por et al Toubart., Plant J. 2:367 (1992).

[080] S) Uma proteína desenvolvente-arrestive produzida na Na tureza por uma planta. Por exemplo, Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992), mostraram que as plantas transgênicas que expressam o gene de inativante da ribossoma de cevada têm uma resistência aumentada à doença fúngica.

11. Os Genes Que Conferem a Resistência a Um Herbicida:

[081] A) Um herbicida que inibe o ponto crescente ou meristema, tal como uma imidazolinona, sulfonamida, ou uma sulfonilureia. Os genes exemplos nesta categoria codificam para ALS mutante e enzima AHAS como descrito, por exemplo, pelo Sotavento et al., EMBO J. 7:1241 (1988), e et al Miki., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990), respec tivamente.

[082] B) O glifosato (resistência conferida por, por exemplo, sinte- tase 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato mutante (EPSPs) genes (via a introdução de ácidos nucleicos de recombinante e/ou várias formas do mutagênese de in vivo de genes EPSPs nativos), aroA genes e trans ferase de acetil de glifosato (GAT) genes, respectivamente), outros compostos phosphono, tais como glifosinato (transferase de acetil de fosfinotricina (PAT) genes de espécies Streptomyces, Streptomyces hygroscopicus incluindo Streptomyces viridichromogenes), e piridoxina ou fenoxiácidos propiônicos e ciclo-hexonas (genes de codificando do inibidor de ACCase), Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 4.940.835 ao Xá, et al. e Patente dos Estados Unidos 6.248.876 a Barry et. al., que divulgam sequências de nucleotídeo de formas de EPSPs que pode conferir a resistência a glifosato a uma planta. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob número de acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeo do gene mutante pode ser divulgado na Patente dos Estados Unidos N° 4.769.061 a Comai. Solicitação de patente europeia n° 0 333033 a et al. Kumada., e Patente dos Estados Unidos N° 4.975.374 a et al Goo dman., divulgue sequências de nucleotídeo de genes de sintetase de glutamina que conferem a resistência a herbicidas, tais como L- fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene de PAT pode ser fornecido em pedido europeu n° 0 242246 a et al Leemans., De- Greef et al., Bio/Technology 7:61 (1989), descreva a produção de plan tas transgênicas que expressam a codificação genética de bar quimé rica da atividade de PAT. Exemplo de genes conferindo resistência ao fenoxiácidos propiônicos e as ciclo-hexonas, tais como setoxidima e haloxifop incluem o Acc1-S1, Acc1-S2 e genes Acc1-S3 descritos pelo Marechal et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992). Os genes de GAT capazes da conferição de resistência a glifosato são descritos no WO 2005012515 ao Castle et al. Os genes conferindo resistência a ácido 2,4-D, fenoxipropriônico e herbicidas de auxina de piridilóxi são descri tos no WO 2005107437 destinado para Dow AgroSciences LLC.

[083] C) Uma herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (psbA e gs + genes) ou uma benzonitrila (gene de nitralase). Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991), descreva a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutan- tes. As sequências de nucleotídeo de genes de nitralase são divulga das em Patente dos Estados Unidos N° 4.810.648 a Stalker, e molécu las de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob a Acesso ATCC N° 53435, 67441, e 67442. Clonagem e expressão da codifica ção de DNA de um S-transferase de glutationa pode ser descrito por Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992).

12. Genes Que Conferenciam ou Contribuem para um Traço de Valor Agregado, tal como:

[084] A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, transformando uma planta com um gene de antissenso do dessaturase estearílico-ACP para aumentar o teor ácido esteárico da planta. Ver et al Knultzon., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992).

[085] B) O teor de fitato reduzido: 1) Introdução de um gene de phytase-codificando realçaria o esgotamento do fitato, acrescentando fosfato mais livre à planta transformada. Por exemplo, ver Van Har- tingsveldt et al., Gene 127:87 (1993), para uma divulgação da sequên cia de nucleotídeo de um gene fitase para Aspergillus niger. 2) Um ge ne pode ser introduzido aquele teor de fitato reduzido. No milho, por exemplo, isto pode ser realizado clonando e depois reintrodução de DNA associado com o alelo único que pode ser responsável por mu- tantes de milho caracterizados por níveis baixos de ácido fítico. Ver et al Raboy., Maydica 35:383 (1990).

[086] C) A composição de carboidrato modificada efetuou, por exemplo, transformando plantas com uma codificação genética de uma enzima que altera o modelo que ramifica do amido. Ver et al Shi- roza., J. Bacteol. 170:810 (1988) (sequência de nucleotídeo de gene de frutosiltransferase de mutantes de Estreptococo); Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985) (sequência de nucleotídeo de Bacillus subtilis pode ser gene levansucrase); Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992) (produção de plantas transgênicas que expressam Baci llus lichenifonn pode ser α-amilase); Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21:515 (1993) (sequências de nucleotídeo de genes de invertase de tomate); Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268:22480 (1993) (mutagenes dirigidos para o sítio pode ser α-gene de amilase de cevada); e Fisher et al., Plant Physiol. 102:1045 (1993) (enzima de ramificação de amido de endosperma de milho II).

EXEMPLOS

[087] A presente invenção é também descrita na sequência exemplos, que são oferecidos por meio da ilustração e não são desti nados para limitar a invenção em qualquer maneira.

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE DENDRÍMERO / COMPLEXO DE DNA E TRATA MENTO DE CÉLULAS. 1.1 - Preparação de plasmídeo

[088] Plasmídeo de pDAB3831 DNA (Figura 1) (SEQ. ID. NOS. 1 e 2) foi isolado e preparou-se para a transformação de planta mediada no dendrímero. Os experimentos de transformação foram testados usando tanto enviaram circulares a DNA como linearizaram DNA.

[089] Para linearizar pDAB3831, uma reação de PCR foi concluí da. o pDAB3831 foi o usando amplificado de PCR de um sistema de Ciclização Térmico Contínuo, que foi descrito anteriormente em, por exemplo, WO 2008045288. Em vez de usar pequenos tubos, os ciclis tas térmicos contínuos usam uma corrente constante ou contínua de fluido repetitivamente passou por zonas de temperatura diferentes pa ra amplificar DNA. A mistura de reação de PCR foi injetada em um flu ido de transportadora com o qual a mistura de reação de PCR é imis- cível. O fluido de transportadora foi depois passado através de uma pluralidade de zonas de temperatura para facilitar a amplificação de DNA dentro da mistura de reação de PCR. Uma amostra foi preparada contendo: MgCI2 de 12 % (25 mM), Taq de 0,33 % polimerase de DNA (5 unidades / μL), dNTP's de 2,0 % (trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguano- sina (dGTP) e trifosfato de deotimidina (dTTP), padrão de 8,0 % (2 μg/mL), solução F108 Plurônica de 61,66 % (solução de 1,5 %), 4 % expedem o iniciador, 4 % invertem o iniciador, e o tampão de reação de 8 % (10X concentração). Os setores adjacentes do sistema foram ajustados na temperatura de 95°C, 59°C e 72°C para dissociação, re- cozimento e objetivos de extensão, respectivamente. A mistura de re ação de PCR foi bombeada através do sistema que usa um vaso pres surizado em 13,79 N/cm2. Após a mistura de reação foi alimentada ao corpo de controle de temperatura, o óleo mineral foi usado para em purrar a amostra através do comprimento inteiro do tubulação. A taxa de fluxo da mistura de reação foi controlada com uma válvula de fluxo a 0,25 mL / minuto. A presente de sequência de DNA específico na amostra foi amplificado como ele passou ciclicamente através das zo nas de temperatura. Após o trigésimo ciclo, os teores foram coletados. o produto de PCR foi purificado em uma coluna de filtração de gel se guida da precipitação de etanol. Uma amostra do produto purificado foi analisada em um eletroforese de gel de agarose bem como Bioanali- sador Agilent para confirmar o tamanho e a concentração do produto de PCR.

[090] O padrão usado para o PCR descrito acima foi o plasmídeo DAS pDAB3831, que contém o gene PAT de marcador selecionável dirigido pelo Arabidopsis ubiquitin 10 promotor (AtUbi10) e o gene de Proteína de Fluorescência Amarela Philadium (PhiYFP) dirigido pelo promotor de Vírus de Mosaico de Veia Casssava (CsVMV). Iniciador promotor SEQ ID NO: 3 e iniciador reverso SEQ ID NO:4 foram sinteti zados para amplificar os 4,6 kbp a cassete de expressão completa (is toé o DNA linearizado) contém ambos os genes e os seus promoto res.Além disso, para facilitar a conjugação do dsDNA linear à superfí cie de nanopartículas, uma molécula de biotina foi quimicamente liga da ao grupo de fosfato dos iniciadores que usam biotina-TEG-CE- fosforamidita. Esta fosforamidita tem um braço de espaçador de pola ridade variado de 15 átomos extendidos baseado em um ligante de trietileno glicol. Este braço de espaçador extendido pode separar a função de biotina do resto de um oligo para reduzir vantajosamente qualquer efeito de impedimento estérico possível durante a ligação à molécula de estreptavidina. Quando o iniciador de avanço foi marcado, a biotina foi no início do DNA. Quando o iniciador reverso foi marcado, a biotina foi no fim do fragmento de DNA. O biotinilado (ambas as ori entações) fragmento de DNA, por isso, pode ser ligado a nanopartícu- las revestidas de estreptavidina. Usando o oligos biotinilado e o siste ma de ciclização térmico contínuo, aproximadamente 20 mg do frag mento de DNA linear foi produzido.

1.2 - Preparação do DNA/Complexo de Dendrímero.

[091] Os dendrímeros usados para estes experimentos foram a poliamidoamina catiônica esférica (PAMAM) polímero de cascata que consiste de aminas primárias nas aminas superficiais e terciárias no interior. Os dendrímeros são parcialmente degradados pelo tratamento de calor em solventes solvolíticos, assim resultando em menos cons trangimento esterical e maior flexibilidade. A carga altamente positiva do dendrímero facilita interações eletrostáticas com DNA, e a estrutura flexível permite o dendrímero a compacto quando ligado a DNA e au mento quando liberado do DNA. A eficiência de transformação ou transfecção é aumentada em consequência da carga positiva e a pro priedade estrutural flexível do dendrímero.

[092] Os dendrímeros foram obtidos da Qiagen (Germantown, Maryland), que são vendidos como SUPERFECT™®Reagente de Transfecção (Cat. n° 301305). O plasmídeo DNA foi misturado com 0,6 mL de SUPERFECT™®reagente e incubou durante 30 minutos em 24°C para formar um DNA / complexo de dendrímero. Concentrações variadas de plasmídeo circularizado DNA (0,1 mg e 0,5 mg) foram usados para formar o complexo de DNA / Dendrímero. Além disso, o linearizado DNA descrito acima no Exemplo 1,1 foi usado para formar um complexo de DNA / Dendrímero. Concentrações de 0,1 mg e 0,5 mg de DNA linear foram usados. Após a formação do complexo de DNA / Dendrímero, uma solução de volume de 10 mL contendo a sa carose de 5 % e Silwet-L77 de 0,02 a 0,04 % foi acrescentada àa rea ção de DNA / Dendrímero.

EXEMPLO 2 Liberação de Complexo de DNA/Dendrímero e Transformação Estável de ARABIDOPSIS THALIANA. 2.1 - Material de planta para transformação in planta:

[093] A germinação sincronizada da semente é importante para assegurar a uniformidade do desenvolvimento floral nas plantas T0. Arabidopsis thaliana cv. A semente de Colômbia foi suspensa na solu ção de ágar a 0,1 % e incubada a 4°C durante 48 horas para concluir a estratificação. 60 mg da semente foi pesado e transferido para um tu bo de 15 mL. 13 mL da solução de ágar a 0,1 % foi acrescentado e foi agitado em vórtex até que a semente fosse completamente dispersa da. Isto criou uma concentração de semente de 4,6 mg / solução de 1 mL (ou aproximadamente 230 sementes / mL). Prepararamse seis tu bos (72 mL de solução) semeadura 4 bandeja que continham 18 potes (7,6 cm) em cada bandeja. A solução foi incubada em 4°C durante 48 horas para concluir a estratificação. Cada pote foi semeado individu almente com 1,0 mL da solução de semente estratificada por pote. Quando todos os potes foram semeados, as cúpulas de propagação foram colocadas nas bandejas para manter o solo úmido. As cúpulas foram removidas 5 dias após a data de semeadura. As sementes fo ram germinadas e as plantas foram cultivadas em um CONVIRON ® (os modelos CMP4030 e CMP3244, Ambientes Controlados Limitados, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob mais longas condições de dia (16 horas iluminadas / 8 horas escuras) em uma intensidade de luz de 120-150 μmols/m2s e sob constante temperatura (22°C) e umidade (40 a 50 %). As plantas foram regadas de 10 a 14 dias que após semeiam as plantas com a solução de Hoagland e, posteriormente, com a água de DI para guardar o solo úmido, mas não molhadas. Após quatro se-manas pós-semeiam a data, as flores foram cortadas para produzir um mais até o crescimento de flores secundárias. Na quinta semana pós- semeadura, as plantas estiveram preparadas para o processo de transformação.

2.2 - Transformação in plantae avaliando as plantas resistentes T1:

[094] Transformação mediada no dendrímero de Arabidosis thali- ana cv. Colômbia foi concluída usando um protocolo modificado de Clough e Bent. (S.J. Clough e A.F. Bent, 1998, Plant J 16:735-43). Uma suspensão de 10 mL foi feita com a solução de DNA / Dendríme- ro e usada para tratamentos das plantas de Arabidopsis (os grupos de flor pela maior parte imaturos com as mesmas sólicas fertilazadas). Tanto complexos de DNA circular/Dendrímero como complexos de DNA linear/Dendrímero foram usados independentes um de ou outro. Antes de mergulhar plantas, Silwet L-77 a uma concentração de 0,05 % (250 ul / 500 mL) a 0,005 % foi acrescentada a solução de DNA/Dendrímero e misturaram-se bem. As partes na terra da planta foram mergulhadas em solução de DNA / Dendrímero durante 2 a 30 segundos, com a agitação suave. As plantas tratadas foram guardadas sob uma cobertura de cúpula plástica durante 16 a 24 horas em 22 a 24°C. As plantas foram transferidas para o CONVIRONS®e deixadas para desenvolver e cultivar sementes. As bandejas de seleção (bande jas de 25,4 cm x 53,3 cm x 2,54 cm) foram usadas para avaliar a se mente de colheita de volume de plantas de T0, aproximadamente 10.000 sementes em cada bandeja. Dois controles foram usados para assegurar que a seleção borrifar foi feita corretamente: o controle Clough 0 transformante negativo e a Colômbia Clough 0 tipo selvagem cravado com homozigotos semeia para PAT (acetil transferase de fos- finotricina) o marcador selecionável como um controle transformante positivo. Para atingir a sincronização, as sementes foram estratificadas em uma solução de àgar a 0,1 % durante 48 horas antes da dissemi nação. Para fornecer 10.000 sementes por bandeja de seleção, 200 mg de sementes foi acrescentado a uma solução de àgar a 0,1 % e agitado em vortéx até que as sementes fossem exatamente suspen sas. As sementes estratificadas foram depois semeadas em bandejas de seleção enchidas de LP5 de mistura de Luz solar e subirrigadas com a solução de Hoagland. Para aumentar a eficácia do borrifo de seleção, 40 mL da semente suspensa foi semeado exatamente para a bandeja de seleção. As cúpulas de propagação após semeadura fo ram colocadas em cada bandeja de seleção e as plantas foram culti vadas para a seleção, as cúpulas de propagação foram removidas aproximadamente cinco dias pós-semeadura.

[095] Adicionalmente, um experimento de controle foi concluído em que uma solução concentrada de DNA, sem dendrímeros, foi usa da para transformar Arabidopsis thaliana. O protocolo anteriormente descrito foi usado para a transformação de DNA nu. Tanto as formas lineares como circulares de DNA foram usadas independentemente umas das outras.

[096] Uma transformação de controle adicional de Arabidopsis tha- liana usando Agrobacterium foi concluída. Esta transformação foi usada como uma marca de referência para determinar a eficiência da trans formação mediada no dendrímero. O plasmídeo, pDAB7331 (Figura 2), foi transformado em Agrobacterium usando de um protocolo modificado de Hanahan (1983), esta cepa foi usada para a transformação de Ara- bidopsis thaliana cv. Colômbia mediada por Agrobacterium.

[097] Arabidopsis foi transformado usando o método de mergulho floral descrito por Clough e Bent. Uma colônia Agrobacteriumselecio nada foi usada para inocular um ou mais pré-culturas de 100 mL de cal do YEP contendo espectinomicina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi incubada durante a noite em 28°C com a agitação constan te em 225 rpm. As células foram peletizadas em aproximadamente 5000 xg durante 10 minutos na temperatura ambiente, e o sobrenadan- te resultante foi descartado. A pastilha de célula foi suavemente ressus- pensa em 400 mL de meio de rega contendo: 5 % (p/v) sacarose, 10 μg/L de 6-benzylaminopurine, e 0,04 % Silwet L-77. As plantas de apro ximadamente um mês foram mergulhadas no meio durante 5-10 minu tos com a agitação suave. As plantas foram estabelecidas nos seus la dos e cobertas (transparente ou opaco) durante 2-3 horas, e depois co-locadas direito. As plantas foram cultivadas em 22°C, com um período de 16 horas de luz / 8 horas de escuro. Aproximadamente quatro sema nasapós o mergulho, as sementes foram colhidas.

2.3 - Seleção de plantas transformadas.

[098] A semente de T1 recentemente colhida foi permitida para secar durante sete dias na temperatura ambiente. A semente de T1 foi semeada em 26,5 bandejas de germinação de 51 cm x, cada um que recebe umas partes alíquotas de 200 mg da semente de T1 estratifica da (~10,000 semente) que tinha sido anteriormente suspenso em 40 mL da solução de agarose a 0,1 % e guardado em 4°C durante dois dias para concluir exigências de dormência e assegurar a germinação de semente síncrona.

[099] Mistura de luz solar LP5 foi coberto da vermiculita perfeita e subirrigado com a solução de Hoagland até molhar, depois deixando drenar por gravidade. Cada alíquota de 40 mL da semente estratifica da foi semeada exatamente para a vermiculita com uma pipeta e co berta de cúpulas de umidade durante 4 a 5 dias. As cúpulas foram re movidas um dia antes da seleção transformante inicial que usa borrifo de pós-emergência de glifosinato.

[0100] Sete dias que após plantam (DAP), plantas de T1 (cotilédo ne e etapa 2-4-lf, respectivamente) foram borrifados cinco vezes den tro de cinco dias com uma solução de 0,2 % do herbicida Liberty (200 g ae/L glifosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, Missouri) em um volume de borrifo de 10 mL / bandeja (703 L/ha) usando de uma ponta de borrifo de ar comprimido DeVilbiss para liberar uma taxa eficaz de 280 g ae/ha glifosinato por aplicação. Os sobreviventes (plantas que ativamente cresceram) foram identificados 4 a 7 dias após o borrifo final e transplantadas individualmente em potes de 7,6 cm preparados com o meio potting (Metro Mix 360). As plantas transplantadas foram cobertas de cúpulas de umidade durante 3 a 4 dias e colocadas em uma câmara de crescimento a 22°C como antes ou movidas direta mente para uma estufa. As cúpulas foram posteriormente removidas e as plantas criadas na estufa (22±5°C, UR de 50±30 %, 14 h luz : 10 h escuro, 500 μE/m2s1 luz natural + luz suplementar).

EXEMPLO 3. ANÁLISE MOLECULAR DA INTEGRAÇÃO GENÔMICA DE TRANSGE NES NA PROGÊNIE T1 DE ARABIDOPSIS THALIANA CV COLÔMBIA. 1. 1 - amplificação de transgenes por gDNA PCR.

[0101] DNA genômico de plantas transgênicas Arabidopsis foi ex traído do material de folha total de plantas de seis semanas usando um kit Plant DNAZOL de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores de PCR foram projetados para a detecção de transgenes de PAT e YFP. Os iniciadores YFP são representados como SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6. Os iniciadores de PAT são representados como SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8.

[0102] As reações de amplificação de PCR de PAT e YFP foram concluídas usando o kit TaKaRa EXTAQ®(Takara, Otsu, Shiga, Ja pão). Os genes produzidos foram amplificados em um volume de rea ção total de 50 μL. A reação de PCR continha 100 ng de DNA genômi- co padrão, 1X tampão de reação ExTaq, 0,2 mM dNTP, 10 pMols de cada iniciador, e 0,025 unidade/μL de ExTaq. As seguintes condições de PCR foram usadas: 1 ciclo em 96°C durante cinco minutos e 31 ci clos das seguintes condições 94°C durante 15 segundos, 65°C duran te 30 segundos, 72°C durante um minuto, e uma extensão final de 72°C durante 7 minutos. O produto de amplificação de PCR foi anali sado em eletroforese de gel de agarose a 0,8 % de TAE e visualizado pela coloração de brometo de etídeo. As Figura 5 e Figura 6 mostram os produtos de amplificação que foram obtidos destas reações.

[0103] Os fragmentos de PCR foram sequenciados usando o inici ador de avanço do PAT (SEQ ID NO:7) e o iniciador de avanço do YFP (SEQ ID NO:5) usando de tecnologia de sequenciamento Sanger avançada (MWG Biotech, Huntsville, Alabama). Os dados de sequên cia foram analisados usando o software Sequencher.

[0104] Os resultados de sequenciamento do PAT e YFP por PCR amplicons combinaram com a sequência de nucleotídeo esperada destes genes. Estes resultados indicam que as sequências de PAT e YFP de pDAB3831 ficaram integrados de maneira estável no gDNA da Arabidopsis usando o Reagente de Transfecção SUPERFECT®.

2. 2 - Avaliação por ELISA de PAT.

[0105] A proteína foi extraída das folhas da planta de Arabidopsis transgênica de seis semanas para a detecção da proteína de PAT ex pressada via ELISA (ensaio imunossorbente de ligação enzimática). Um tubo de microcentrífuga contendo as amostras de folha foi resfria do em nitrogênio líquido. O material de folha foi moído a um pó usando um homogeneizador disponível. Após equilibrar em gelo durante 5 mi nutos, 200 μL de tampão de extração (PBST; fosfato de 20 mM a sali na tamponada contendo 0,05 % (v/v) TWEEN ®20) foi acrescentado. Os teores foram misturados com um vórtice e centrifugados em 4°C durante 10 minutos em 13.000 g. O sobrenadante foi extraído do detri to de célula e guardado em gelo até a análise adicional.

[0106] O teste ELISA foi executado usando um protocolo modifi cado para o kit QUALIPLATE®de LIBERTYLINK ®PAT/pat- (Envirologix, Portland, Maine). A placa de ELISA e outros reagentes foram equilibrados na temperatura ambiente. 50 μL da Enzima Conju gada foram acrescentados a cada fonte da placa. Mais 50 μL do Tam pão de Extração foram acrescentados a cada fonte da placa. As dilui ções seriais da proteína Arabidopsistransgênica purificada foram acrescentadas aos poços. As concentrações de 10, 5, 2,5, e 1,25 ng/mL foram usadas. Os padrões adicionais e os extratos de planta foram acrescentados aos poços como controles. A placa foi agitada em 200 rpm e incubada na temperatura ambiente durante 2 horas. Após a incubação, a placa foi lavada cinco vezes com o Tampão de Extração em um lavador de placa. Para a detecção, 100 μL do subs trato do kit foram acrescentados a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos. A atividade foi lida e registrada usando de um lei tor de micro placa em uma absorvância de 595 nm.

[0107] A absorvância dos sinais de ELISA dos padrões indicou que o sinal de absorvância foi diretamente proporcional às quantida des presentes de PAT em cada poço. Estes dados são representados na Figura 5. As amostras do SUPERFECT®e plantas transformadas mediadas por Agrobacterium mostram sinais fortes de ELISA. Estas quantidades são três vezes mais altas como o padrão de 10 ng/mL, o padrão mais alto testado no ensaio. Estes resultados indicam que PAT é expressa nas plantas transgênicas Arabidopsis que foram transfor madas via transformação da planta mediada por SUPERFECT®.

[0108] Embora a presente invenção tenha sido descrita em certas modalidades, a presente invenção pode ser também modificada dentro do espírito e do alcance desta divulgação. Este Pedido, por isso, está destinado a cobrir qualquer variação, usos, ou adaptações da inven ção usando os seus princípios gerais. Também, este Pedido está des tinado a cobrir tais fugas da presente divulgação como estando dentro da prática conhecida ou usual na técnica à qual esta invenção perten ce e que estão incluídos nos limites das reivindicações acrescentadas e os seus equivalentes.

Claims (20)

1. Método para introduzir um ácido nucleico de interesse em uma célula vegetal possuindo uma parede celular para realizar a transformação estável, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal possuindo uma parede celular; interagir um dendrímero de poliamidoamina, e um ou mais peptídeos de penetração celular (CPPs), com um ácido nucleico de interesse para formar uma estrutura de dendrímero ativado; colocar a célula vegetal possuindo uma parede celular e a estrutura de dendrímero ativado em contato uma com a outra; e permitir absorção da estrutura do dendrímero ativado na cé lula vegetal que possui uma parede celular, de modo a introduzir o ácido nucleico de interesse dentro da célula possuindo uma parede celular; e integrar o ácido nucleico de interesse no genoma da célula vegetal possuindo uma parede celular de modo a criar um transfor- mante estável.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que interagindo um dendrímero de poliamidoamina com o ácido nucleico de interesse compreende a montagem do ácido nuclei- co de interesse na superfície do dendrímero de poliamidoamina.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que interagindo um dendrímero de poliamidoamina com o ácido nucleico de interesse compreende interagir grupos negativamente carregados do ácido nucleico de interesse com grupos amino carrega dos em uma extremidade terminal do dendrímero de poliamidoamina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a absorção da estrutura do den- drímero ativado em um compartimento da célula vegetal possuindo uma parede celular.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o compartimento é selecionado dentre o grupo consis tindo em citossol, núcleo, tonoplastos, plastídio, etioplasto, cromoplas- to, leucoplasto, elaioplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto, e o lúmen da membrana dupla.

6. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal que possuindo uma parede celular é selecionada dentre o grupo consistindo em células de tabaco, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, soja, Oryza sp., Ara- bidopsis sp., Ricinus sp., e cana-de-açúcar.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe lo fato de que a célula vegetal é de um tecido selecionado dentre o grupo consistindo em embrião, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, ante ras,raízes, pontas de raízes, flores, sementes, vagens e caules.

8. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a derivatização da superfície do dendrímero de poliamidoamina.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que o ácido nucleico de interesse compreende um componente selecionado dentre o grupo consistindo em ácidos nuclei- cos, DNA, RNA, moléculas de RNAi, genes, plasmídeos, cosmídeos, YACs, BACs e combinações dos mesmos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de interesse compreende um gene.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o gene é um gene de proteína externa, um gene agronômico, ou um gene marcador.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda selecionar células que integraram de maneira estável o ácido nucleico de interesse.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza do pelo fato de que as células selecionadas são células regeneráveis.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza do pelo fato de que compreende ainda regenerar uma planta a partir das células regeneráveis, em que a planta regenerada ou sementes das mesmas compreendem o ácido nucleico de interesse.

15. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dendrímero de poliamidoamina compreende um re agente de dendrímero.

16. Método para expressar um gene de maneira estável, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma célula vegetal possuindo uma parede celular; interagir um dendrímero de poliamidoamina, e um ou mais CPPs, com um gene para formar uma estrutura de dendrímero ativado; colocar a célula vegetal possuindo uma parede celular e a estrutura de dendrímero ativado em contato uma com a outra; permitir a absorção da estrutura do dendrímero ativado na célula vegetal possuindo uma parede celular, para obter uma célula vegetal estavelmente transformada compreendendo o gene; e expressar o gene na progênie de uma planta possuindo a célula vegetal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza do pelo fato de que o gene é expressado em um cloroplasto.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza do pelo fato de que compreende ainda selecionar células que expres sam o gene de maneira estável antes de regenerar uma planta a partir da célula vegetal estavelmente transformada.

19. Método para transferir um plasmídeo de DNA para uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: interagir um dendrímero de poliamidoamina, e um ou mais CPPs, com um plasmídeo de DNA para formar uma estrutura de den- drímero ativado; e contatar a estrutura do dendrímero ativado com uma célula vegetal possuindo parede intacta sob condições que permitem a ab sorção da estrutura do dendrímero ativado dentro da célula vegetal.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza do pelo fato de que compreende ainda expressar estavelmente o gene na progênie de uma planta que apresenta a célula vegetal.

Images