BR112012008588A2 - uso de nanotecnologia de dendrímero de liberação de biomoléculas em células da planta - Google Patents

Abstract

USO DE NANOTECNOLOGIA DE DENDRÍMERO DE LIBERAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM CÉLULAS DA PLANTA. A presente invenção refere-se a métodos para produzir uma molécula de interesse em uma célula da planta possuindo uma parede celular usando dendrímeros, e opcionalmente um ou mais CPPs. Os métodos são fornecidos para modificar geneticamente as plantas ou de outra maneira para tratar ou prevenir doenças em células de planta compreendendo uma parede celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "USO DE NA- NOTECNOLOGIA DE DENDRÍMERO DE LIBERAÇÃO DE BIOMOLÉCU- LAS EM CÉLULAS DA PLANTA". RElVlNDICAçÃO DE PRIORIDADE 5 O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos número de série 61/252.607, depositado 16 de outubro de 2009, para o "USO DA NANOTECNOLOGIA DE DENDRÍME- RO DA LIBERAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM CÉ.LULAS DA PLANTA".

ANTECEDENTES 10 As nanopartículas têm propriedades únicas que foram explora- das para uso na liberação de DNA em céiulas. Nanopartículas metálicas, tais como as nanopartículas de ouro (Au) foram usadas para a liberação de DNA h por causa da sua citotoxicidade baixa e a tranquilidade da funcionalização b com vários ligantes da significância biológica. Adicionalmente às nanoparti- 15 culas metálicas, as nanopartículas semicondu'toras (por exemplo, pontos quantum) ("QD") dentro do faixa de variação de tamanho de 3 a 5 nm tam- bém foram usadas como transportadoras para liberar moléculas em células. DNA e as proteínas podem ser ligados ao ligante preso à superfície do QD (ver, por exemplo, F. Patolsky et al., j. Am- Chem. Soc. 125, 13918 (2003))- 20 As nanopartículas foram usadas para iiberar o DNA de pIasmídio em diferentes células de animais. Encontrou-se que quando nanopartlculas revestidas de DNA são incubadas com células nâo possuindo uma parede celular, as células tomam as nanopartículas e começam a expressar qual- quer gene codificado no DNA. Entretanto, a liberação de genes em plantas 25 contemporâneas é desafiante devido à presença de paredes celulares nas plantas, que leva à dependência comum aos meios de liberação invasivos para transformação genética de plantas. Quando a liberação mediada por nanopartícula em células normalmente possuindo uma parede celular é de- sejada, a parede da célula é despida antes da adição das partículas aos pro- 30 toplastos da planta (ver, F. Torney et al., Nature Nanotechnol- 2, (2007)). Em céluias da planta, a parede celular atua como uma barreira contra a libera- ção de moléculas exogenicamente aplicadas. Muitos métodos invasivos,

como a pistola genética (biolística), a microinjeção, a eletroporação, e o A- grobacterium, foram empregados para atingir o gene e a Iiberação pequena de molécula nestas células da planta emparedadas, mas a liberação de pro- teínas só foi atingida pela microinjeção. a liberação de pequenas moléculas 5 e proteínas na presença de uma parede celular de planta permanece inex- pIorada e seria vantajoso desenvolver tecnologias de autorização a serem desdobradas na célula de planta intata / tecido ou órgão de manipulações de in vivo e in vitro.

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são uma classe no- lO va e de crescimento rápido de peptídeos curtos que são conhecidos por de- sempenhar um papel importante na deslocação de uma ampla variação de complexos de carga incluem proteínas e DNA através das biomembranas ,. em linhas de célula humana e mamífera.

J.

Schwartz e S.

Zhang (2000),

, Peptide-Mediated Ce//u/ar Deliveiy, Curr.

Opin.

Mol.

Ther. 2:162-167; U Lan- 15 gel (2002), Prefácio em: Ce// Penetrating Peptides: Processes and App/icati- ons, U.

Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton; E.

Vives e B.

Lebleu (2002), THE Tat-Derived Ce//-Penetrating Peptides em: Ce/l-·Penetrating Peptides," Processes and Applications, U.

Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton: pá- ginas 3-22. Enquanto se mostrou que CPPS facilita a liberação de carga em 20 células de mamifero, o uso de CPP em células da planta de estudos de transfecção foi limitado por um número de fatores.

Um obstáculo principal à adaptação desta tecnologia a plantas consiste em que, diferentemente de células dos animais, as células da pIanta apresentam um sistema de barreira dual (parede celular e membrana plasmática) para a internalização de CPPS 25 e as suas cargas.

Por isso, CPPS deve superar estas duas barreiras eficien- tes de translocação.

Os CPPS foram usados em células da planta, mas tipi- camente dependem do uso de agentes de permeabilização e técnicas com o uso de CPPS para efetuar a liberação da de carga liberando nas células da planta.

O VIH 1 BILRA o domínio de transdução de proteína (PTD) é um dos 30 peptídeos de deslocação o mais bem estudados.

Os relatórios recentes mostraram que o potencial de BILRA-PTD e os seus oligômeros da liberação de plasmidio formando um complexo com o DNA negativamente carregado

· b 3/34

U em células de mamífero. [. lgnatovich, E. Dizhe, A. Pavlotskaya, B. Akifiev, S. Burov, S. Orlov, e A. Perevozchikov (2003), Comp/exes of P/asmid DNA with Basic Domain 47-57 of the H/V-l Tat Protein Are Transferred to Mam- ma/ian Ce//s by Endocytosis-mediated Pathways, J. Biol. Chem. 278:42625- 5 42636; C. Rudolph, C. Plank, J. Lausier, U. Schiliinger, R.H. Muller, e J. Ro- senecker (2003), O/igomers of the Arginine-Rich Motif of the H/V-l TA T Pro- tein are Capable of Transferring P/asmid DNA into Ce//s, J. Biol. Chem. 278:11411-11418; Z. Siprashvili, F. Scholl, S. Oliver, A. Adams, C. Contag, P. Wender, e P. Khavari (2003), Gene Transfer via Reversib/e P/asmid Con- lO densation with Cysteine-F/anked, /nterna//y Spaced Arginine-Rich Peptides, Hum. Gene. Ther 14 (13):1225-33; [. Hellgren, J. Gorman, e C. Sylvén (2004), Factors Contro//ing the Ehiciency of Tat-mediated P/asmid DNA i..h Transfeg J. Drug. Target. 12 (1):39-47. w Os dendrímeros são "moléculas em cascata" com a concha prin- 15 cipal única arquitetura macromolecular. Os dendrímeros foram primeiro cria- dos no laboratório em 1979 por Donald Tomalia (D.A. Tomalia et al., Preim- pressões do 1° SPSJ /nt'/ Po/ymer conference, Society of Po/ymer Science, o Japão, o Quioto, 1984, p. 65; ver também Patente dos Estados Unidos No.

6.316.694). Os dendrímeros foram usados para liberar DNA e outras biomo- 20 léculas em células dos animais- Entretanto, a presença de paredes celulares de planta apresentou desafios à Iiberação de genes em plantas. Adicional- mente, a integração genômica estável de transgenes que usam Iiberação baseada no dendrímero não foi relatada ou demonstrada em plantas. Assim, Iá ainda permanece uma necessidade de um método da incorporação está- 25 vel de genes e outras moléculas do interesse em plantas através do uso da liberação baseada no dendrímero.

DESCRIÇÃO As seguintes modalidades são descritas em conjunto com siste- mas, as ferramentas e os métodos que estão destinados a ser exemplos e 30 ilustrativos, e não limitante no alcance. A presente invenção se refere a métodos que usam dendríme- ros, e opcionalmente um ou mais CPPS, para liberar não-invasivamente substâncias moleculares em células possuindo uma parede celular para in- corporação estável das substâncias moleculares no mesmo. Uma modalidade da invenção inclui um método de introduzir uma molécula de interesse em uma célula da planta possuindo uma parede 5 celular para realizar a transformação estável de uma planta e sementes. O método inclui o fornecimento à uma célula da planta possuindo uma parede celular e a interação com um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPs, com uma molécula de interesse para formar uma estrutura ativada de dendrímero. A célula e a estrutura ativada de dendrimero são colocadas em 10 contato uma com a outra, sob condições, que permitam a absorção do mesmo pela célula possuindo uma parede celular. Outra modalidade da invenção inclui um método de expressar 4 um gene de maneira estável. O método inclui o fornecimento de uma célula W da planta possuindo uma parede celular e interagindo um dendrímero, e op- 15 cionalmente um ou mais CPPS, com um gene para formar uma estrutura ati- vada de dendrímero. A célula da planta possuindo uma parede celular e a estrutura ativada de dendrímero são colocadas em contato uma com a outra, e o dendrímero e o gene são colocados sob condições que permitem a ab- sorção do mesmo na célula da planta possuindo uma parede celular. O gene 20 na progênie de uma planta possuindo a célula da planta é então expressado. Ainda outra modalidade da invenção inclui um método para transferir uma substância molecular para uma célula da planta- O método inclui a interação de um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPs, com o DNA de um plasmídio para formar uma estrutura ativada de dendrí- 25 mero. A estrutura ativada de dendrímero é colocada em contato com uma célula da pIanta intacta que carrega a parede sob condições que permitem a absorção do dendrímero e um gene do plasmídio DNA na célula da pIanta. Além dos exemplos de aspectos e modalidades descritos acima, os aspectos adicionais e as modalidades ficarão evidentes em vista das se- 30 guintes descrições.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra o Plasmidio pDAB3831.

+ Afigura 2 mostra o Plasmídio pDAB7331. A figura 3 é uma imagem em gel corado com brometo de etídio mostrando a amplificação do PAT PCR de DNA genômico da planta trans- gênica Arabidopsis: 100 dupla fita de DNA (Promega lnc) 1: Arabidopsis Ii- 5 nha transgênica de SUPERFECT"" com tratamento pDAB3831 2; PIasmídio DNA pDAB3831 como um controle positivo; os Asteriscos indicam o PAT amplicon de PCR. figura 4 é uma imagem de gei mostrando YFP amplificação de PCR de DNA genômico da planta transgênica Arabidopsis: 100 dupla fita de 10 DNA (Promega lnc) 1; Arabidops/s linha transgênica de SUPERFECT" com tratamento pDAB3831 2; Plasmldio DNA pDAB3831 como um controle posi- tivo; os Asteriscos indicam o amplicon de PCR YFP.

T figura 5 mostra níveis de expressão de proteína de PAT de teci- . dos de folha mediados por dendrímero (SUPERFECT"") das plantas Arab- 15 dopsis transformadas; usando Kit comercial ELISA, a proteína de PAT foi detectada nas plantas transgênicas mediadas no dendrímero e em compa- ração com plantas que foram transformadas via Agrobacterium tumefaciens.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO Na descrição e tabelas que se seguem, diversos termos são u- 20 sados. Para fornecer uma compreendendo clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluem o alcance a ser dado tais termos, as seguintes definições são fornecidas: Retrocruzamento. O retrocruzamento pode ser um processo no qual um criador repetidamente cruza o progênie híbrido para atrás com um 25 dos pais, por exemplo, um primeiro híbrido de geração F, com um dos genó- tipos paternos do híbrido F1. Embrião. O embrião pode ser a pequena planta contida dentro de uma semente madura. Dendrímero. Os dendrímeros são macromoléculas nanométricas 30 tri dimensionais, hiper-ramificados, monodispersas obtidas por uma sequên- cia reiterativa de reações. Os dendrímeros são costumeiramente sintetiza- dos como "nanoestruturas" ajustáveis que podem ser projetadas e reguladas como uma função do seu tamanho, forma, química superficial e espaço va- . zio interior.

Os dendrímeros podem ser obtidos com o controle estrutural que se aproxima daquela de biomacromoléculas tradicionais, tais como DNNPNA ou proteínas e são diferenciadas pelo seu sistema de nanoescala preciso e 5 propriedades de nanorrecipiente.

Os dendrímeros são partículas microscópi- cas com pelo menos uma dimensão de nanoescala, normalmente menos de 100 nm.

Os dendrímeros adequados para uso na presente invenção podem ter um tamanho de 1 nm a 0,4 µm.

Resistente ao Glifosato.

A resistência a uma dosagem do glifo- lO sato se refere à capacidade de uma planta de sobreviver (isto é a planta não pode ser morta) por aqueía dosagem do glifosato.

Em alguns casos, as plan- tas tolerantes podem temporariamente amarelar ou de outra maneira exibir o - dano induzido pelo glifosato algum (por exemp/o, excessivos brotamento

% e/ou inibição de crescimento), mas se recuperam. 15 Estabilizado.

Estabilizado se refere a caracteristicas de uma planta que são reprodutivelmente passadas de uma geração para a próxima geração de plantas geradas da mesma variedade- Absorção.

A absorção se refere à translocação de uma partícula, tal como um dendrímero, através de uma parede celular ou uma membrana 20 celular, em que a translocação não ocorre sozinha em consequência do momento comunicado à partícula por outra coisa diferente da célula na qual a partícula está sendo absorvida.

Os exemplos não limitantes de dispositivos ou métodos que causam a translocação de uma partícuia através de uma parede celular ou uma membrana celular somente sozinho em consequência 25 do momento comunicado à partícula são biolístico, arma genética, microinje- ção, e/ou tecnologias de impalefecção.

Em uma modalidade particular, a invenção se refere ao pedido do dendrímero como uma opção da nanoengenharia para desenvolver uma carga paga para à moda materiais de pedidos em pequena molécula, libera- 30 ção de biomolécula, liberação de genes, visuaíização, e várias diagnósticas biotecnológicas e funções sentem.

A arquitetura de dendrímero fornece di- versas propriedades distintivas que os diferenciam de outro polimero e na-

~ b noparüculas, tais como o método gradual da sÍntese, que pode prover um tamanho bem definido e estrutura com um Índice de polidispersidade compa- rativamente ba ixo.

Adicionalmente, a química de dendrimero pode ser adap- tável e, assim, facilitar a síntese de um Iargo faixa de variação de moiéculas 5 com a funcionalidade diferente.

O uso de dendrímeros métodos particulares de acordo com da presente invenção facilita biomoléculas e liberação de genes através do uso de uma alta densidade de grupos terminais.

Em outras modalidades da invenção, múltiplos sÍtios de ligação ou de carga de uma molécula "acrescentado" ou "hóspede" pode ser proje- lo tada nos dendrimeros em vários e/ou múltiplos sÍtios.

Esta propriedade pode ser empregada, por exemplo, em direcionamento específico e edição de SÍ- tios moleculares dentro de células para áreas, tais como biomiméticos, libe- - rações direcionadas, para opções de organismo não-geneticamente modifi-

- cadas, e opções de transformação transientes em uma variedade de árvore 15 ou colheitas vegetais para ;opções de traço e resistência a doença.

As mo- dalidades da invenção também podem ser empregadas para desenvolver biosensores adequadoq.

Além disso, cromossomos artificiais (ASES) podem ser empregados com os métodos da invenção como uma alternativa para vetores eucarióticos atuais de direcionamento preciso e opções de recombi- 20 nação homólogas.

De acordo com as modalidades da invenção, pode ser forneceu um método de introduzir uma molécula de interesse em uma célula da planta compreendem uma parede celular, o método compreendendo, colocando um dendrímero contêm uma molécula de interesse no contato com a célula da 25 planta e permitindo a absorção do dendrímero através da parede celular de planta.

Particularmente os aspectos da invenção, o dendrímero pode ser qualquer dendrímero e pode conter reversivelmente ou irreversivelmente, pode interagir, ou de outra maneira ser Iigado a e/ou transportar uma molé- cula de interesse.

Em certas modalidades, uma molécula de interesse pode 30 ser introduzida ao dendrímero antes de contato com uma célula da planta possuindo uma parede celular ou concorrentemente com a introdução do dendrimero a uma célula da planta possuindo uma parede celular.

De acordo com modalidades da presente invenção, uma céjula * da planta possuindo uma parede celular pode ser qualquer célula da planta compreendem uína parede celular intacta e completa.

Os exemplos das cé- lulas possuindo uma parede celular incluem, mas não é limitada a, algáceo, 5 fumo, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, feijáo-soja, cana-de-açúcar, Oryza sp., Arabidopsis sp., e Ricinus sp., preferivelmente fumo, milho de cenouras, algodão, canola, feijão-soja e cana-de-açúcar; mais preferivelmente fumo e cenouras.

As modalidades da invenção podem incluir células compreendendo uma parede celular de qualquer tecido ou 10 onde quer que eles sejam encontrados, incluindo, mas não limitados a, em embriões, células de meristemático, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, di- cas de raiz, flores, sementes, vagens, troncos, e cultura de tecido. - Nas modalidades da invenção, uma molécula de interesse pode

- ser qualquer molécula que pode ser liberada a uma célula da planta de a- 15 cordo com moléculas de interesse, ou componentes de moléculas do inte- resse, podem compreender, mas não são limitadas a, ácidos nucleicos, DNA, RNA, moléculas de RNA1, genes, plasmidios, cosmídios, YACS, BACS, Cromossomos Artificiais de Planta, Minicromossomos de Planta, Planta Lu- gares de Traço Projetados DNA; polipeptídeos, enzimas, hormônios, glico- 20 peptídeos, açúcar, gord uras, peptídeos sinaíizadores, anticorpos, vitaminas, mensageiros, segundos mensageiros, aminoácidos, CAMPO, drogas, herbi- cidas, fungicidas, antibióticos, e/ou combinações dos mesmos.

As modalidades da invenção incluem métodos da prevenção ou tratamento da doença- As modalidades de exemplo não-limitam incluem a 25 liberação de fungicidas, antibióticos, e/ou outras drogas a células na neces- sidade que dos mesmos usa métodos da presente invenção.

Em aspectos da invenção, o dendrímero pode ser absorvido em várias partes de células.

Os exemplos de localizações que um dendrímero pode ser absorvido em inclui, mas não é limitado a, citossol, núcleo, tono- 30 plastos, plastldios, etioplastos, cromoplastos, leucoplastos, ela ioplastos, pro- teinoplastos, amiloplastos, cloroplastos, e o lúmen de uma membrana dupla.

Em outras modalidades da invenção, a absorção de dendrímero em uma

B célula compreende uma parede celular pode ocorrer via a via de apoplástico ou o simplástico.

As modalidades adicionais da invenção incluem células de pIan- ta geneticamente modificadas e métodos para gerá-los, em que as células 5 de planta têm um ou mais ácidos nucleicos introduzidos no mesmo via mé- todos da presente invenção.

Em um exemplo de uma modalidade, um plas- midio compreende um gene do interesse e um marcador selecionável pode ser em introduzido em uma célula da planta possuindo uma célula bem via um dendrimero de acordo com a presente invenção.

Em modalidades adi- lO cionais, transformantes estáveis podem ser selecionados, que têm integrado de maneira estável o gene do interesse e/ou o marcador selecionável.

Em modalidades alternativas, uma célula da planta agora compreende o gene do - interesse pode ser propagado para produzir outras células compreendem

~ uma molécula de interesse.

Em outras modalidades, as células de planta 15 agora compreendem uma molécula de interesse pode ser uma célula de re- generável que pode ser usou para regenerar uma planta inteira incluindo a molécula de interesse.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece os métodos de criar células de pIanta de regenerável compreendem uma molécula de inte- 20 resse para uso em cultura de tecido.

A cultura de tecido será preferivelmente capaz de regenerar plantas possuindo substancialmente o mesmo genótipo que as células de regenerável.

As células de regenerável em tais culturas de tecido podem ser embriões, protoplastos, células de meristemático, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, dicas de raiz, flores, sementes, vagens ou 25 troncos.

Ainda também, uma modaíidade da invenção fornece plantas rege- neradas das culturas de tecido da invenção- Alternativamente, a presente invenção fornece um método de in- troduzir um traço desejado em uma célula da planta possuindo uma parede celular, em que o método compreende: colocação de um dendrimero e uma 30 molécula de interesse capaz de fornecer o traço desejado à célula da planta no contato com a célula e permitir a absorção do dendrímero através da pa- rede celular.

Os exemplos de traços desejados incluem, mas não são limita-

¥ dos a, traços selecionados de esterilidade masculina, resistência a herbicida, resistência a inseto, e resistência à doença bacteriana, doença fúng ica, e/ou doença viral.

Os aspectos adicionais da invenção fornecem os métodos da 5 geração de linhas de planta estabilizadas compreendendo um traço deseja- do ou a molécula de interesse, em que o traço desejado ou a molécula de interesse pode ser primeiro introduzido pela absorção de um dendrímero através de uma parede celular de planta.

Os métodos de gerar linhas de planta estabilizadas são bem conhecidos a um de normalmente versado na 10 técnica e podem incluir técnicas tal como, mas não limitados a, autofecunda- ção, retrocruzamento, produção híbrida, cruzes a populações, e assim por diante.

Todas as plantas e as células de planta compreendem um traço de- - sejado ou a molécula de interesse primeiro introduzido na célula da planta

% (ou os seus predecessores) pela absorção de um dendrímero através de 15 uma parede celular estão dentro dos limites da presente invenção.

Vantajo- samente, as células de planta compreendem um traço desejado ou a molé- cula de interesse primeiro introduzido na planta ou cé|L||a (ou os seus prede- cessores) pela absorção de um dendrímero através de uma parede celular podem ser usadas em cruzamentos com outras, diferentes, células de pIanta 20 para produzir a primeira geração (Fi) híbrida de células, sementes, e/ou plantas com caracteristicas superiores.

Em modaíidades em que a molécula de interesse compreende um ou mais o genes, o gene pode ser um alelo dominante ou recessivo.

Por meio do exemplo, o gene conferirá tais traços como resistência a herbicida, 25 resistência a inseto, resistência a resistência bacteriana, resistência fúngica, resistência à doença viral, a fertilidade masculina, esterilidade masculina, melhora na qualidade nutritiva, e o uso industrial.

Com o advento de técnicas biológicas moleculares que permiti- ram o isolamento e a caraterização de genes que codificam proteínas espe- 30 cÍficas ou produtos de RNA (por exemplo, RNA1), os cientistas no campo da biologia da planta desenvolveram um grande interesse na engenharia do genoma de células para conter e expressar genes estranhos, ou versões

E adicionais ou modificadas de genes nativos ou endógenos (possivelmente dirigido por promotores diferentes) para alterar os traços de uma célula em uma maneira específica. Tais genes adicionais e/ou modificados estranhos entregam-se a aqui coletivamente como "transgenes". Durante quinze a vin- 5 te anos passados, vários métodos para produzir células transgênicas foram desenvolvidos e, em modalidades particulares, a presente invenção se refe- re a versões transformadas de células e métodos para produção deles via a introdução em Llma célula possuindo uma parede celular um transgene via a absorção de um dendrímero através de uma parede celular. Em modalida- lO des da invenção, o transgene pode ser contido em um vetor de expressão. A transformação de célula pode envolver a construção de um ve- tor de expressão que funcionará em uma célula particular. Tal vetor pode

V compreender DNA que inclui um gene sob controle de, ou operacionalmente ~ ligado a, um elemento regulador (por exemplo, um promotor). O vetor de 15 expressão pode conter um ou mais gene ligado de tal operacionalmente / combinações de elemento reguladoras. O vetor pode estar na forma de um plasmídio e pode ser usado sozinho ou em combinação com outros plasmí- dios para fornecer células transformadas que usam métodos de transforma- ção como descrito aqui para incorporar o transgene no material genético de 20 uma célula da planta compreendendo uma parede celular. Particularmente as modalidades da invenção, um STAR- BURST® PAMAM de uso múftiplo (poliamidoamina) o protótipo de dendríme- ro exibe propriedades adequadas para ser usado como: (i) MRI visado, di- agnóstico (visualização de ressonância magnética) INIR (perto-lR) contras- 25 tam agentes, (ii) e/ou para a liberação controlada da terapia de câncer. Entre eles, um candidato principal é (núcleo: 1,4-diaminobotano; G (geração) [PA- MAM (CO2Na) 64J. Esta nanoestrutura dendrítica (isto é diâmetro de -5,0 nm) foi selecionada com base em um perfil de biocompatibilidade muito favo- rável (The Nanotechnology Characterization Laboratory (NCL), um afiliado 30 do lnstituto Oncológico Nacional (NCl), concluíram estudos 117 vitro extensos do composto de chumbo e encontraram que ele é muito benigno e altamente biocompatível, a expectativa que é isto ele exibirá propriedades de excreção de rim mamíferas desejáveis e características de direcionamento demons- . tradas.

Os dendrímeros usados com os métodos da invenção representam uma classe do polímero caracterizado pela sua estrutura bem definida, com um alto grau de uniformidade molecular e poIidispersidade baixa.

Além dis- 5 so, mostrou-se que estes dendrímeros são capazes de ignorar a transporta- dores de efluxo.

O uso de dendrímeros de acordo com os métodos da presente invenção produziram plantas transformadas de maneira estável e demons- traram-se a expressão do gene de herbicida transformado de maneira está- lO vel\ com o fenótipo onde a alta tolerância de herbicida foi tornada na planta de Tl transgênica.

Mostrou-se que esta planta era fértil como produziu se- mentes de T2. ~ Em uma modalidade particular, reagente de transfecção SU-

. PERFECT"" foi usado.

Este reagente é um policátion possuindo uma forma 15 definida e diâmetro, disponível como reagente SUPERFECT" da Qiagen (Catálogo Qiagen #301307) como uma solução de dendrímeros ativados especificamente projetados.

Os dendrímeros são moléculas de poliamidoa- mina esféricas com ramos que irradiam de um núcleo central e terminam em grupos de amino carregados.

A ativação química promove a absorção efici- 20 ente de DNA por cétulas eucarióticas.

Não limitado a uma teoria particular, pensa-se que este reagente monta DNA em estruturas compactas, assim otimizando a entrada de DNA em células.

Para estabilizar o complexo SU- PERFECT'g-DNA durante o seu transporte ao núcleo, o reagente SUPER- FECT® é projetado par tamponar o lisossoma após a fusão com o endosso-

25 ma, levando à inibição via pH de nucleases lisossômicas- Vetores de expressão para absorção via Dendrímero: marcado- res genéticos.

Os vetores de expressão podem incluir pelo menos um marca- dor genético, operacionalmente ligado a um elemento regulador (um promo- 30 tor, por exemplo) que permite que as células transformadas contenham o marcador a ser recuperado pela seleção negativa (isto é, inibindo crescimen- to de células que não contêm o gene de marcador selecionável) ou pela se-

leção positiva (isto é, avaliando para o produto codificado pelo marcador ge- nético). Muitos marcadores genéticos selecionáveis da transformação são bem conhecidos nas técnicas de transformação e incluem, por exemplo, ge- nes que codificam para enzimas que o metabolicamente desintoxifica um 5 agente químico seletivo que pode ser um antibiótico ou uma herbicida, ou genes que codificam um objetivo alterado que pode ser insensível ao inibi- dor.

Alguns métodos de seleção positivos também são conhecidos na técni- ca.

Um gene de marcador selecionável comumente usado adequa- lO do para a transformação de planta pode incluir o gene fosfotransferase de neomicina [| (nptll) sob o controle de sinais reguladores da planta, que con- fere a resistência à canamicina.

Ver, por exemplo, Fraley et al., Proc.

Natl. - Acad.

Sci.

U.S.A., 80:4803 (1983). Outro gene de marcador selecionável

- comumente usado pode ser o gene de fosfotransferase de higromicina, que 15 confere a resistência ao antibiótico higromicina.

Veg por exemp/o, Vanden Elzen et al., P/ant Mol.

Biol., 5:299 (1985). Os marcadores genéticos selecionáveis adicionais da origem bacteriana que conferem a resistência a antibióticos incluem o transferase de acetil de gentamicina, o fosfotransferase de estreptomicina, aminoglicosi- 20 dio-3'-adenil transferase, e o determinante de resistência a bleomicina.

Ver et al Hayford., P/ant Physiol. 86:1216 (1988); Jones et al., Mol.

Gen.

Genet., 210:86 (1987): Svab et al., P/ant Mol.

Biol. 14:197 (1990); Hille et al., P/ant Mol.

Biol. 7:171 (1986). Outros marcadores genéticos selecionáveis confe- rem a resistência a herbicidas, tais como glifosato, glifosinato ou bromoxinil. 25 Ver et al Comai., Nature 317:741-744 (1985): Gordon-kamm et al., P/ant Ce/l 2:603-618 (1990); e Stalker et al., Science 242:419-423 (1988). Outros marcadores genéticos selecionáveis adequados para a transformação de planta não são da origem bacteriana.

Estes genes inclu- em, por exemplo, o reductase de di-hidrofolato de rato, plantam o sintetase 30 5-enolpiruvillshikimato-3-fosfato e o sintetase de acetolactato de planta.

Ver et al Eichholtz., Somatic Cell Mol.

Genet. 13:67 (1987): Xá et al., Science 233:478 (1986); Charest et al., P/ant Ce// Rep. 8:643 (1990).

Outra classe de marcadores genéticos adequados para a trans- . formação de pIanta necessita a avaliação de células de pIanta presuntiva- mente transformadas em vez da seleção genética direta de células transfor- madas da resistência a uma substância tóxica, tais como um antibiótico. Es- 5 tes genes são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o modelo espacial da expressão de um gene em tecidos específicos e são frequente- mente se referem como genes de repórter porque eles podem ser fundidos a um gene ou gene sequência reguladora da investigação da expressão gêni- ca. Os genes comumente usados para avaiiar células transformadas incluem 10 j3-glucuronidase (GUS), Í3-ga|actosidase, Iuciferase e acetiltransferase de cloranfenicol. Ver Jefferson, R. A., P/ant Mol. Biol. Representante 5:387 (1987): Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989): Koncz et al., Proc. Natl. Acad. - Sc/ U.S.A- 84:131 (1987); DeBlock et al., EMBO j. 3:1681 (1984).

- Recentemente, os métodos de in vivo para visualizar a atividade 15 de GUS que não necessitam da destruição do tecido de planta foram postos à disposição. A pubíicação 2908 de Mo/ecu/ar Probes, lmagene green"M, pp.

1-4 (1993); e Naleway et al., J. Ce// Biol- 115:151a (1991). Entretanto, estes métodos de in vivo para visualizar a atividade de GUS não provaram útil pa- ra a recuperação de células transformadas por causa de sensibilidade baixa, 20 altos antecedentes fluorescentes, e Iimitações associadas com o uso de ge- nes de luciferase como marcadores selecionáveis. Mais recentemente, genes que codificam Proteinas Fluorescen- tes (por exemplo, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, e YFP) foram utilizados como marcadores da expressão gênica em células procarióticas e eucarióticas. 25 Ver et al Chalfie., Science 263:802 (1994). Proteínas fluorescentes e muta- ções de proteínas fluorescentes podem ser usadas como marcadores de avaliável- Vetores de expressão para absorção via Dendrímero: Promoto- res 30 Os genes incluídos em vetores de expressão devem ser dirigi- dos por uma sequência de nucelotídeo compreendendo um elemento regu- lador, por exemplo, um promotor. Vários tipos de promotores são bem co-

nhecidos agora nas técnicas de transformação, como são outros elementos reguladores que pode ser usado sozinho ou em combinação com promoto- res. Como usado aqui, o "promotor" inclui a referência para uma re- 5 gião de DNA que pode ser a montante da partida da transcrição e isto pode ser envolvido no reconhecimento e de ligação do polimerase de RNA e ou- tras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta. Os exem- plos de promotores o controle sob desenvolvente inclui promotores que pre- lO ferencialmente in iciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, ral- zes, sementes, fibras, vasos de xilema, traqueideos, ou esclerênquima. Ta is promotores mencionam-se °'preferido ao tecido". Os promotores que iniciam - a transcrição só em certos tecidos se mencionam "específico para o tecido".

. Um "tipo de célula" promotor específico principalmente dirige a expressão 15 em certa célula datilografa um ou mais órgãos, por exemplo, células vascula- res em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode ser sob controle ambiental. Os exemplos de condições ambientais que podem realizar a transcrição por promotores induziveis incluem condições anaeróbicas ou a presença da luz. Específico para o tecido, preferido ao te- 20 cido, tipo de célula os promotores específicos, e induzíveis constituem a cIasse de promotores "não-constitutivos". Um promotor "constitutivo" pode ser um promotor que pode ser ativo sob a maior parte de condições ambien- tais. A. Promotores induzíveis. 25 Um promotor induzível pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. Opcionalmente, o promotor induzível po- de ser operacionalmente ligado a uma sequência de nucelotídeo que codifi- ca uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. Com um promotor induzivel, a taxa da trans- 30 crição aumenta em resposta a um agente de induzimento. Qualquer promotor induzível pode ser usado na invenção imedi- ata. Ver a Ala et al., P/ant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Os exemplos de promotores induzívéis incluem, mas não são limitados a: aqueles do sistema ACEI que responde ao cobre (Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); o gene de ln2 do milho que responde ao herbicida de benzenossulfonamida safeners (Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991): e Gatz et 5 al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); e Tet repressor de TnlO (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-·237 (1991)). Um promotor induzível particu- larmente útil pode ser um promotor que responde a um agente de induzi- mento que as pIantas não respondem normalmente. Um promotor induzível exemplar pode ser o prornotor induzível de um gene hormonal de esteroide, 10 a atividade transcricional do qual pode ser induzido por um hormônio de gli- cocorticosteroide. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991)- B. Promotores constitutivos.

- Um promotor constitutivo pode ser operacionalmente ligado a 15 um gene de expressão em uma célula ou o promotor constitutivo pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de nucelotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligado a um gene de ex- pressão em uma célula. Os promotores constitutivos diferentes podem ser utilizados na 20 invenção imediata. Os promotores constitutivos exemplares incluem, mas não são limitados a: promotores de vÍrus de planta, tais como o promotor 35S da CaMV (Odell et al-, Nature 313:810-812 (1985)): promotores de ge- nes de actina de arroz (McElroy et al., P/ant Ce// 2:163-171 (1990)); ubiquitin (Christensen et al., P/ant Mol. Biol. 12:619-632 (1989); e Christensen et al., 25 P/ant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (et al Último., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)): MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); e milho histona de H3 (l-epetit et al., Mol. Gen- Genetics 231:276-285 (1992); e Atanassova et al., o Jornal 2 (3):291-300 (1992) de Planta). O promotor ALS, fragmento de Xba1/Ncol 5' ao Brassica napus ALS3 gene estrutural (ou uma 30 similaridade de sequência de nucelotídeo a dito fragmento de Xba1/Ncol), representa um promotor constitutivo particularmente útil, Ver o pedido de PCT WO 96/30530.

¶ C. Promotores específicos para o tecido ou preferidos do tecido. Um promotor específico para o tecido pode ser operacionalmen- te ligado a um gene de expressão em uma célula. Opcionalmente, o promo- tor especifico para o tecido pode ser operacionalmente ligado a uma se- 5 quência de nucelotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operacionalmente ligado a um gene de expressão em uma célula. As plantas transformadas com um gene do operacionalmente de interesse ligado a um promotor específico para o tecido podem produzir o produto de proteína do transgene exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido especifico. 10 Qualquer promotor especifico para o tecido ou preferido ao teci- do pode ser utilizado na invenção imediata. Os promotores específicos para q tecido ou preferidos ao tecido exemplares inciuem, mas não são limitados

N a, um promotor preferido à raiz-tal como isto do gene de faseolina (Murai et - al., Science 23:476-482 (1983); e Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. 15 Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)); um promotor específico para a folha e in- duzido pela Íuz, tal como o de cab ou rubisco (Simpson et al., EMBO j. 4 (11):2723-2729 (1985); e Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); um pro- motor específico para a antera, tal como aquele de LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)): um promotor específico para o pólen, tal 20 como aquele de Zm13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) ou um promotor preferido ao microesporo, tal como aquele de apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)). O transporte da proteína produzida por transgenes para um compartimento subcelular, tais como o cloroplasto, vacúolo, peroxissoma, 25 glioxissoma, parede celular ou mitocôndria ou para a secreção no apoplasto pode ser realizado por meio do operacionalmente que liga a sequência de nucelotídeo que codifica uma sequência de sinal para a região 5' e/ou 3' de um gene que codifica a proteína do interesse. Visando as sequências nas extremidades 5' e/ou 3' do gene estrutural pode determinar, durante a sÍnte- 30 se de proteína e o processamento, onde a protelna codificada pode ser en- fim compartimentada. Alternativamente tais proteínas de direcionamento de compartimento subcelulares podem ser diretamente ligadas a um dendríme-

ro para dirigir o dendrímero revestido da molécula de interesse ao comparti- . mento subcelular desejado.

A presença de uma sequência de sinal dirige um polipeptídeo a uma organela intracelular ou a compartimento subcelular, ou para a secre- 5 ção ao apoplasto.

Muitas sequências de sinal são conhecidas na técnica.

Ver, por exemplo, Becker et al., P/ant Mol.

Blol. 20:49 (1992); P.S.

Perto, a Tese de Mestrado, Universidade Estadual de lowa (1993): C.

Knox et al., "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley," P/ant Mol.

Biol. 9:3-17 (1987); Lerner et al., P/ant Physiol. 91:124- 10 129 (1989); Fontes et al., Plant Ce// 3:483-496 (1991); Matsuoka et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci. 88:834 (1991); Gould et al., J.

Cell.

Biol. 108:1657 (1989); Creissen et al., Plant J- 2:129 (1991); Kalderon, et al., A short amino acid 0 sequence ab/e to speci/j' nuc/ear location, Cell 39:499-·509 (1984); Steifel, et

- al., Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in 15 early leaf and root vascular differenciation, P/ant Ce// 2:785-793 (1990). Genes de Proteína Estranha e Genes Aqronômicos Estranhos.

Com plantas transgênicas de acordo com a presente invenção, uma proteína estrangeira pode ser produzida em quantidades comerciais.

Assim, as técnicas da seleção e a propagação de plantas transformadas, 20 que são bem entend idas na técnica, produzem uma pluralidade de plantas transgênicas que são coihidas em uma maneira convencional, e uma proteí- na estrangeira depois pode ser extraída de um tecido do interesse ou da bi- omassa total.

A extração de proteína da biomassa de planta pode ser reali- zada por métodos conhecidos que são discutidos, por exemplo, por Heney e 25 Orr, Anal.

Biochem. 114:92-6 (1981). Em aspectos da invenção, a planta transgênica proveu a produ- ção comercial da proteína estrangeira pode ser uma célula ou uma planta.

Em outros aspectos, a biomassa do interesse pode ser semeia- Para relati- vamente pequeno número de pIantas transgênicas que mostram níveis mais 30 altos da expressão, um mapa genético pode ser gerado principalmente via RFLP convencional, PCR e análise SSR, que identifica a localização cro- mossômica aproximada da molécula de DNA integrada.

Para exemplos de metodologias neste sentido, ver GIick e Thompson, Methods in Plant Mo/e- . cu/ar Bio/ogy and Biotechno/ogy CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993). lnformação sobre mapa acerca de |oca|jzação cromossômica pode ser útil para proteção proprietária de uma planta transgênica sujeita. Se propagação 5 não autorizada pode ser empreendida e cruzamentos feitos com outro ger- moplasma, o mapa da região de integração puder ser em comparação com mapas semelhantes de plantas de suspeito para determinar se os últimos têm uma ascendência comum com a planta sujeita. As comparações de ma- pa envolveriam hibridizações, RFLP, PCR, SSR e sequenciamento, todos do 10 qua! são técnicas convencionais. De mesmo modo, os genes agronômicos podem ser expressos em células transformadas ou o seu progênie. Mais particularmente, as plan- . tas podem ser geneticamente projetadas via os métodos da invenção para - expressar vários fenótipos do interesse agronômico. Os exemplos de genes 15 que podem ser usados neste sentido incluem, mas não são limitados a, a- queles categorizados abaixo.

1. Os genes Que Conferem a Resistência a Pragas ou Doença e Que Codificam: A) Genes de resistência à doença de planta. A defesa de planta 20 muitas vezes é ativada pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de uma avirulência corres- pondente (Avr) gene no agente patogênico. Uma variedade de planta pode ser transformada com genes de resistência clonados para projetar plantas que são resistentes a cepas patógenas especificas. Ver, por exemplo, Jones 25 et al., Science 266:789 (1994) (clonagem do gene de tomate Cf-9 de resis- tência a C/adosporium fu/vum); Martin et al., Science 262:1432 (1993) (o ge- ne de tomate Pto da resistência a Pseudomonas syringae pv. codifica uma quinase de proteina do tomate); Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994) (Arabi- dops pode ser o gene RSP2 da resistência a Pseudomonas syringae)- 30 B) Gene conferindo resistência a uma praga, tal como cisto de nematoide de feijão-soja. Ver por exemplo, Pedido de PCT WO 96/30517; Pedido de PCT WO 93/19181.

W C) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado dos mesmos ou um polipeptídeo sintético modelado do mesmo. Ver, por exem- plo, Geiser et al., o Gene 48:109 (1986), que divulga a clonagem e sequên- cia de nucelotideo de um Bt õ-gene de endotoxina. Além disso, as moléculas 5 de DNA que codificam iS-genes de endotoxina podem ser compradas da Co- leção Americana de Cultura de Tipos, Manassas, Va., por exemplo, sob A- cesso ATCC N° 40098, 67136, 31995 e 31998. D) Uma lecitina. Ver, por exemplo, a divulgação por Van Damme et al., P/ant Mo/ec. Biol. 24:25 (1994), quem divulgam as sequências de nu- lO celotideo de vários genes de lecitina de C/ivia miniata manose de ligação. E) Uma proteína de vitamina de ligação, tal como avidina. Ver o pedido de PCT US93/06487. O pedido ensina o uso de avidina e homologos

B da avidina como larvicidas contra pragas de inseto. F) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ~ 15 ou proteinase ou um inibidor de amilase. Ver, por exemplo, Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987) (sequência de nucelotídeo de inibidor de proteina- se de cisteina de arroz); Huub et al., Plant Mo/ec. Biol. 21:985 (1993) (se- quência de nucelotldeo de CDNA que cod ifica inibidor de proteinase de fumo I); Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) (sequência de 20 nucelotídeo de Streptomyces nitrosporeus a-inibidor de amilase) e Patente dos Estados Unidos N° 5.494.813 (Hepher e Atkinson, emitido 27 de feverei- ro de 1996). G) Um hormônio específico para o inseto ou feromona, tal como um ecdysteroid ou hormônio juvenil, uma variante dos mesmos, um à base 25 de mimético nisso, ou um antagonista ou agonista dos mesmos- Ver, por exemplo, a divulgação pela Rede para dormir et al-, Nature 344:458 (1990), de expressão de baculovlrus de esterase hormonal juvenil clonado, um inac- tivator de hormônio juvenil. H) Um peptídeo especifico para o inseto ou neuropeptídio que, 30 segundo a expressão, interrompe a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, ver as divulgações de Regan, J. Biol. Chenz 269:9 (1994) (expressão que clona produtos de codificação de DNA do receptor hormonal de diurético de inseto); e Pratt et al., Biochem.

Biophys.

Res.

Comm. 163:1243 (1989) (uma alostatina pode ser identificada em Dip/optera puntata). Ver também Patente dos Estados Unidos N° 5.266.317 para Tomalski et al-, que divulga genes que codificam neurotoxinas paralíticas específicas para o inseto. 5 I) Um veneno específico para o inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, ou qualquer outro organismo.

Por exemplo, ver a Pang et al., Gene 116:165 (1992), para divulgação de expressão heteróloga em plantas de uma codificação genética de um peptldeo insetotóxico de es- corpião. 10 J) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um mono- terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula não-proteina com atividade inseticida. q

K) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modifica-

- ção pós-translação, de uma molécula biologicamente ativa: por exemplo, 15 uma enzima glicolitica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolitica, um nuclease, um ciclase, L|m transaminase, um esterase, um hidrolase, um fos- fatase, um quinase, um fosforilase, um polimerase, um elastase, um quitina- se e um glucanase, ou natural ou sintético- Ver o pedido de PCT WO 93/02197 em nome de Scott et al., que divulga a sequência de nucelotideo 20 de um gene de calase.

As moléculas de DNA que contêm sequências codifi- cam o quitinase podem ser obtidas, por exemplo, do ATCC sob Acesso N" 39637 e 67152. Ver também Kramer et al., lnsect Biochem.

Molec.

Biol. 23:691 (1993), quem ensinam a sequência de nucelotídeo de um cDNA que codifica quitinase de lagarta do tabaco; e Kawalleck et al., Plant Mo/ec.

Biol. 25 21:673 (1993), quem fornecem a sequência de nucelotídeo da salsa ubi4-2 gene de polibiquitina.

L) Uma molécula que estimula a transdução de sinal.

Por exem- pio, ver a divulgação por Botella et a!., P/ant Mo/ec.

Biol. 24:757 (1994), de sequências de nucelotídeo de calmodulina de feijão mung clones de CDNA, 30 e Griess et al., P/ant Physiol. 104:1467 (1994), quem fornecem a sequência de nucelotídeo de uma calmodulina de milho cIone de cDNA.

M) Um peptídeo de momento hidrofóbico.

Ver o pedido de PCT f WO 95/16776 (a divulgação de derivados de peptídeo de Tachyplesin que inibem agentes patogênicos de planta fúngicos) e pedido de PCT WO 95/18855 (ensina peptideos de antimicrobiano sintéticos que conferem a resistência à doença). 5 N) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, ver a divulgação de et al Jaynes., P/ant Sci 89:43 (1993), da expressão heteróloga de um cecropin-Í3-1Ítico análogo de peptideo para tornar plantas de fumo transgênicas resistentes a Pseudo- monas so/anacearum. 10 O) Uma proteína viral e invasiva ou uma toxina complexa deriva- ram disto. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento virais em células de planta transformadas comunica a resistência ao desenvolvimento

W de doença e/ou infecção viral efetuado pelo vírus de que o gene de proteína - de revestimento pode ser derivado, bem como por vÍrus relacionados. Ver 15 Beachy et al., Rev Ann Phytopathol. 28:451 (1990). A resistência mediada na proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra vírus de mosaico de alfafa, vÍrus de mosaico de pepino, vÍrus de faixa de fumo, vÍrus de batatas X, vÍrus de batatas Y, virus de corrosão do fumo, o vírus de batida de fumo e o vÍrus de mosaico de fumo. ld. 20 P) Um anticorpo específico para o inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo visado a uma função metabólica crítica no intestino de inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inse- to. Conforme. Taylor et al., Abstract #497, Seventh lnt'l Symposium em Mo- /ecu/ar P/ant-Microbe lnteractions (Edimburgo, a Escócia) (1 994) (inativação 25 enzimática em fumo transgênico via produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única). Q) Um anticorpo específico para o virus. Ver, por exemplo, Ta- vladoraki et al., Nature 366:469 (1993), quem mostram que as plantas trans- gênicas que expressam genes de anticorpo de recombinante são protegidas 30 do ataque de vÍrus. R) Uma proteína desenvolvente-arrestiva produzida na natureza por um agente patogênico ou um parasita. Por exemplo, a-endo fúngico-1,4-

D-polygalacturonases facilita a coIonização fúngica e planta a liberação nu- . triente solubilizando parede celular de planta homo-a-1,4-O-galacturonase. Ver o Lamb et al-, Bio/Technology 10:1436 (1992). A clonagem e a carateri- zação de um gene que codifica uma proteína de endopolygalacturonase- 5 inibição de feijão pode ser descrita por et al Toubart., Plant J. 2:367 (1992). S) Uma proteína desenvolvente-arrestive produzida na Natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann et al., Bio/l"echnology 10:305 (1992), mostraram que as plantas transgênicas que expressam o gene de inativante da ribossoma de cevada têm uma resistência aumentada à doen- lO ça fúngica.

2. Os Genes Que Conferem a Resistência a Um Herbicida: A) Urn herbicida que inibe o ponto crescente ou meristema, tal

W como uma imidazolinona, sulfonamida, ou uma sulfonilureia. Os genes e- - xemplos nesta categoria codificam para ALS mutante e enzima AHAS como 15 descrito, por exemplo, pelo Sotavento et al-, EMBO J. 7:1241 (1988), e et al Miki., Theor. Appl. GRnet. 80:449 (1990), respectivamente. B) O glifosato (resistência conferida por, por exemplo, sintetase 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato mutante (EPSPS) genes (via a introdução de ácidos nucleicos de recombinante e/ou várias formas do mutagênese de 20 in vivo de genes EPSPs nativos), aroA genes e transferase de acetil de glifo- sato (GAT) genes, respectivamente), outros compostos phosphono, tais co- mo glifosinato (transferase de acetil de fosfinotricina (PAT) genes de espé- cies Streptomyces, Streptomyces hygroscopicus incluindo Streptomyces viri- dichromogenes), e piridoxina ou fenoxiácidos propiônicos e ciclo-hexonas 25 (genes de codificando do inibidor de ACCase), Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N" 4.940.835 ao Xá, et al. e Patente dos Estados Uni- dos 6.248.876 a Barry et. al., que divulgam sequências de nucelotídeo de formas de EPSPS que pode conferir a resistência a glifosato a uma planta. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida 30 sob número de acesso ATCC 39256, e a sequência de nucelotídeo do gene mutante pode ser divulgado na Patente dos Estados Unidos N° 4.769.061 a Comai. Solicitação de patente europeia n° 0 333033 a et al. Kumada., e Pa-

tente dos Estados Unidos N° 4.975.374 a et al Goodman., divulgue sequên- . cias de nucelotldeo de genes de sintetase de glutamina que conferem a re- sistência a herbicidas, tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucelotideo de um gene de PAT pode ser fornecido em pedido europeu n° 0 242246 a et 5 al Leemans., DeGreef et al., Bio/Techno/ogy 7:61 (1989), descreva a produ- ção de plantas transgênicas que expressam a codificação genética de bar quimérica da atividade de PAT. Exemplo de genes conferindo resistência ao fenoxiácidos propiônicos e as ciclo-hexonas, tais como setoxidima e haloxi- fop incluem o Accl-Sl, Acc1-S2 e genes ACC1-S3 descritos pelo Marechal et 10 al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992). Os genes de GAT capazes da confe- rição de resistência a glifosato são descritos no WO 2005012515 ao Castle et al. Os genes conferindo resistência a ácido 2,4-D, fenoxipropriônico e her- - bicidas de auxina de piridiióxi são descritos no WO 2005107437 destinado para Dow AgroSciences LLC. 15 C) Uma herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (psbA e gs + genes) ou uma benzonitrila (gene de nitralase). Przibila et al., P/ant Ce// 3:169 (1991), descreva a transformação de Chlamydomonas com plasmídios que codificam genes psbA mutantes, As sequências de nucelotí- deo de genes de nitralase são divulgadas em Patente dos Estados Unidos 20 N° 4.810.648 a Stalker, e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob a Acesso ATCC N° 53435, 67441, e 67442- CIonagem e ex- pressão da codificação de DNA de um S-transferase de glutationa pode ser descrito por Hayes et al., Biochem. j. 285:173 (1992).

3. Genes Que Conferenciam ou Contribuem para um Traço de Valor Aqre- 25 qado, tal como: A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, trans- formando uma planta com um gene de antissenso do dessaturase estearíli- CO-ACP para aumentar o teor ácido esteárico da pIanta. Ver et al Knuítzon., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 89:2624 (1 992). 30 B) O teor de fitato reduzido: 1) lntrodução de um gene de phyta- se-codificando realçaria o esgotamento do fitato, acrescentando fosfato mais livre à planta transformada. Por exemplo, ver Van Hartingsveldt et al., Gene

127:87 (1993), para uma divulgação da sequência de nucelotídeo de um ge- . ne fitase para Aspergi//us niger. 2) Um gene pode ser introduzido aquele teor de fitato reduzido. No milho, por exemplo, isto pode ser realizado cIonando e depois reintrodução de DNA associado com o alelo único que pode ser res- 5 ponsável por mutantes de rnilho caracterizados por níveis baixos de ácido fítico. Ver et al Raboy., Maydica 35:383 (1990). C) A composição de carboidrato modificada efetuou, por exem- plo, transformando plantas com uma codificação genética de uma enzima que altera o modelo que ramifica do amido. Ver et al Shiroza., J. Bacteol. 10 170:810 (1988) (sequência de nucelotídeo de gene de frutosiltransferase de mutantes de Estreptococo); Steinmetz et al., Mol, Gen. Genet. 20:220 (1985) (sequência de nucelotídeo de Bacil/us subti/is pode ser gene levansucrase); » Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992) (produção de plantas transgênicas . que expressam Baci//us lichenifonn pode ser a-amilase); Etliot et al., P/ant 15 Mo/ec. Biol. 21:515 (1993) (sequências de nucelotídeo de genes de inverta- se de tomate); Sogaard et al., J. B/o/. Chem. 268:22480 (1993) (mutagenes dirigidos para o sÍtio pode ser a-gene de amilase de cevada); e Fisher et al., P/ant Physiol. 102:1045 (1993) (enzima de ramificação de amido de endos- perma de milho 11)- 20 EXEMPLOS A presente invenção é também descrito na sequência exempios, que são oferecidos por meio da ilustração e não são destinados para limitar a invenção em qualquer maneira. EXEMPLO 1. 25 PREPARAÇÃO DE DENDRÍMERO / COMPLEXO DE DNA E TRATAMEN- TO DE CÉLULAS.

1.1 - Preparação de plasmídio Plasmídio de pDAB3831 DNA (figura 1) (SEQ. ID. NOS. 1 e 2) foi isolado e preparou-se para a transformação de planta mediada no den- 30 drímero. Os experimentos de transformação foram testados usando tanto enviaram circulares a DNA como iinearizaram DNA. Para linearizar pDAB3831, uma reação de PCR foi concluída. o

. pDAB3831 foi o usando amplificado de PCR de um sistema de Ciclização Térmico Contínuo, que foi descrito anteriormente em, por exemplo, WO

2008045288. Em vez de usar pequenos tubos, os ciclistas térmicos contí- nuos usam uma corrente constante ou contínua de fluido repetitivamente 5 passou por zonas de temperatura diferentes para amplificar DNA. A mistura de reação de PCR foi injetada em um fluido de transportadora com o qual a mistura de reação de PCR é imiscível- O fluido de transportadora foi depois passado através de uma pluralidade de zonas de temperatura para facilitar a amplificação de DNA dentro da mistura de reação de PCR. Uma amostra foi 10 preparada contendo: MgC|2 de 12 °/0 (25 mM), Taq de 0,33 °/) polimerase de DNA (5 unidades / µ1), dNTP's de 2,0 °/) (trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina e (dGTP) e trifosfato de deotimidina (dTTP), padrão de 8,0 °/0 (2 µg/ml), solu- · ção F108 Plurônica de 61,66 °/0 (solução de 1,5 °/0), 4 °/) expedem o inicia- 15 dor, 4 °/) invertem o iniciador, e o tampão de reação de 8 °/) (lOX concentra- ção). Os setores adjacentes do sistema foram ajustados na temperatura de 95°C, 59°C e 72°C para dissociação, recozimento e objetivos de extensão, respectivamente. A mistura de reação de PCR foi bombeada através do sis- tema que usa um vaso pressurizado em 13,79 N/cm2. Após a mistura de re- 20 ação foi alimentada ao corpo de controle de temperatura, o óleo mineral foi usado para empurrar a amostra através do comprimento inteiro do tubula- ção- A taxa de fluxo da mistura de reação foi controlada com uma válvula de fluxo a 0,25 ml / minuto. A presente de sequência de DNA especifico na a- mostra foi amplificado como ele passou ciclicamente através das zonas de 25 temperatura. Após o trigésimo ciclo, os teores foram coletados. o produto de PCR foi purificado em uma coluna de filtração de gel seguida da precipitação de etanol. Uma amostra do produto purificado foi analisada em um eletrofo- rese de gel de agarose bem como Bioanalisador Agilent para confirmar o tamanho e a concentração do produto de PCR. 30 O padrão usado para o PCR descrito acima foi o plasmidio DAS pDAB3831, que contém o gene PAT de marcador selecionável dirigido pelo Arabidopsis ubiquitin 10 promotor (Atljbl10) e o gene de Proteína de Fluo-

% rescência Amarela Phi/adium (PMYFP) dirigido pelo promotor de VÍrus de Mosaico de Veia Casssava (CSVMV). lniciador promotor SEQ ID NO: 3 e iniciador reverso SEQ ID NO:4 foram sintetizados para amplificar os 4,6 kbp a cassete de expressão completa (isto é o DNA linearizado) contém ambos 5 os genes e os seus promotores. Além disso, para facilitar a conjugação do dsDNA linear à superfície de nanopartículas, uma molécula de biotina foi quimicamente ligada ao grupo de fosfato dos iniciadores que usam biotina- TEG-CE-fosforamidita. Esta fosforamidita tem um braço de espaçador de polaridade variado de 15 átomos extendidos baseado em um Iigante de trieti- IO ieno glicol. Este braço de espaçador extendido pode separar a função de biotina do resto de um oligo para reduzir vantajosamente qualquer efeito de impedimento estérico possível durante a ligação à molécula de estreptavidi- . na. Quando o iniciador de avanço foi marcado, a biotina foi no início do DNA.

- Quando o iniciador reverso foi marcado, a biotina foi no fim do fragmento de 15 DNA. O biotinilado (ambas as orientações) fragmento de DNA, por isso, po- de ser íigado a nanopartículas revestidas de estreptavidina. Usando o oIigos biotinilado e o sistema de ciclização térmico contínuo, aproximadamente 20 mg do fragmento de DNA linear foi produzido.

1.2 - Preparação do DNA/Complexo de Dendrímero. 20 Os dendrímeros usados para estes experimentos foram a polia- midoamina catiõnica esférica (PAMAM) poIímero de cascata que consiste de aminas primárias nas aminas superficiais e terciárias no interior. Os dendrí- meros são parciaimente degradados pelo tratamento de calor em solventes solvoliticos, assim resultando em menos constrangimento esterical e maior 25 flexibilidade. A carga altamente positiva do dendrímero facilita interações eletrostáticas com DNA, e a estrutura flexíve! permite o dendrímero a com- pacto quando ligado a DNA e aumento quando liberado do DNA. A eficiência de transformação ou transfecção é aumentada em consequência da carga positiva e a propriedade estrutural flexível do dendrlmero. 30 Os dendrímeros foram obtidos da Qiagen (Germantown, Mar- yland), que são vendidos como SUPERFECT"m® Reagente de Transfecção (Cat. n° 301305). O plasmídio DNA foi misturado com 0,6 ml de SUPER-

ÇÊ FECTm® reagente e incubou durante 30 minutos em 24°C para formar um DNA / complexo de dendrímero. Concentrações variadas de plasmídio circu- larizado DNA (0,1 mg e 0,5 mg) foram usados para formar o complexo de DNA / Dendrímero. Além disso, o linearizado DNA descrito acima no Exem- 5 plo 1,1 foi usado para formar um complexo de DNA / Dendrimero. Concen- trações de 0,1 mg e 0,5 mg de DNA linear foram usados. Após a formação do complexo de DNA / Dendrímero, uma solução de volume de 10 ml con- tendo a sacarose de 5 °/) e Silwet-L77 de 0,02 a 0,04 °/) foi acrescentada àa reação de DNA / Dendrímero. 10 EXEMPLO 2 Liberação de Complexo de DNA/Dendrímero e Transformação Estável de ARAB/DOPS/S THAL/ANA. €

2.1 - Material de planta para transformação in p/anta: - A germinação sincronizada da semente é importante para asse- 15 gurar a uniformidade do desenvolvimento floral nas plantas TO. Arabidopsis tha/iana cv. A semente de CoIômbia foi suspensa na solução de ágar a 0,1 °/) e incubada a 4°C durante 48 horas para concluir a estratificação. 60 mg da semente foi pesado e transferido para um tubo de 15 ml. 13 ml da solu- ção de ágar a 0,1 °/) foi acrescentado e foi agitado em vórtex até que a se- 20 mente fosse completamente dispersada. lsto criou uma concentração de semente de 4,6 mg / solução de 1 ml (ou aproximadamente 230 sementes / ml). Prepararamse seis tubos (72 ml de solução) semeadura 4 bandeja que continham 18 potes (7,6 cm) em cada bandeja. A solução foi incubada em 4°C durante 48 horas para concluir a estratificação. Cada pote foi semeado 25 individualmente com 1,0 ml da solução de semente estratificada por pote. Quando todos os potes foram semeados, as cúpulas de propagação foram colocadas nas bandejas para manter o solo úmido. As cúpulas foram remo- vidas 5 dias após a data de semeadura. As sementes foram germinadas e as plantas foram cultivadas em um CONVIRON ® (os modelos CMP4030 e 30 CMP3244, Ambientes Controlados Limitados, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob mais longas condições de dia (16 horas iluminadas / 8 horas escuras) em uma intensidade de luz de 120-150 µmoÍs/m2s e sob constante tempera-

& tura (22°C) e umidade (40 a 50 °/0). As plantas foram regadas de 10 a 14 dias que após semeiam as plantas com a soIução de Hoagland e, posterior- mente, com a água de Dl para guardar o solo úmido, mas não molhadas. Após quatro semanas pós-semeiam a data, as flQres foram cortadas para 5 produzir um mais até o crescimento de flores secundárias. Na quinta sema- na pós-semeadura, as plantas estiveram preparadas para o processo de transformação.

2.2 - Transformação in planta e avaliando as plantas resistentes Tl: Transformação mediada no dendrímero de Arabidosis tha/iana 10 cv. Coiômbia foi concluída usando um protocolo modificado de Clough e Bent. (S.J. Clough e A.F. Bent, 1998, P/ant J 16:735-43). Uma suspensão de 10 ml foi feita com a solução de DNA / Dendrímero e usada para tratamentos « das plantas de Arabidopsis (os grupos de flor pela maior parte imaturos com - as mesmas sólicas fertilazadas). Tanto complexos de DNA circu- 15 lar/Dendrimero como complexos de DNA linear/Dendrímero foram usados independentes um de ou outro. Antes de mergulhar pIantas, Silwet L-77 a uma concentração de 0,05 °/) (250 ul / 500 ml) a 0,005 °/) foi acresceritada a solução de DNA/Dendrímero e misturaram-se bem. As partes na terra da planta foram mergulhadas em solução de DNA / Dendrímero durante 2 a 30 20 segundos, com a agitação suave. As plantas tratadas foram guardadas sob uma cobertura de cúpula plástica durante 16 a 24 horas em 22 a 24"C- As plantas foram transferidas para o CONV|RONS® e deixadas para desenvol- ver e cultivar sementes. As bandejas de seleção (bandejas de 25,4 cm x 53,3 cm x 2,54 cm) foram usadas para avaliar a semente de colheita de vo- 25 lume de plantas de Tq, aproximadamente 10.000 sementes em cada bande- ja. Dois controles foram usados para assegurar que a seleção borrifar foi feita corretamente: o controle Clough 0 transformante negativo e a Colômbia Clough 0 tipo selvagem cravado com homozigotos semeia para PAT (acetil transferase de fosfinotricina) o marcador selecionável como um controle 30 transformante positivo. Para atingir a sincronização, as sementes foram es- tratificadas em uma solução de àgar a 0,1 °/) durante 48 horas antes da dis- seminação. Para fomecer 10.000 sementes por bandeja de seleção, 200 mg

+ de sementes foi acrescentado a uma soIução de àgar a 0,1 °/) e agitado em vortéx até que as sementes fossem exatamente suspensas.

As sementes estratificadas foram depois semeadas em bandejas de seleção enchidas de LP5 de mistura de Luz solar e subirrigadas com a solução de Hoagland.

Pa- 5 ra aumentar a eficácia do borrifo de seleção, 40 ml da semente suspensa foi semeado exatamente para a bandeja de seleção.

As cúpulas de propagação após semeadura foram coIocadas em cada bandeja de seleção e as plantas foram cultivadas para a seleção, as cúpulas de propagaçâo foram removidas aproximadamente cinco dias pós-semeadura. 10 Adicionalmente, um experimento de controle foi conciuído em que uma solução concentrada de DNA, sem dendrímeros, foi usada para transformar Arabidopsis tha/iana.

O protocolo anteriormente descrito foi usa- d do para a transformação de DNA nu.

Tanto as formas lineares como circula-

· res de DNA foram usadas independentemente umas das outras. 15 Uma transformação de controle adicional de Arabidopsis tha/iana usando Agrobacterium Íoi concluída.

Esta transformação foi usada como uma marca de referência para determinar a eficiência da transformação me- diada no dendrímero.

O plasmídio, pDAB7331 (figura 2), foi transformado em Agrobacterium usando de um protocolo modificado de Hanahan (1983), esta 20 cepa foi usada para a transformação de Arabidopsis tha/iana cv.

Colômbia mediada por Agrobacterium.

Arabidopsis foi transformado usando o método de mergulho flo- ral descrito por Clough e Bent.

Uma colônia Agrobacterium selecionada foi usada para inocular um ou mais pré-culturas de 100 ml de caldo YEP con- 25 tendo espectinomicina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi in- cubada durante a noite em 28°C com a agitação constante em 225 rpm.

As células foram peletizadas em aproximadamente 5000 xg durante 10 minutos na temperatura ambiente, e o sobrenadante resultante foi descartado.

A pas- tilha de célula foi suavemente ressuspensa em 400 ml de meio de rega con- 30 tendo: 5 °/) (p/v) sacarose, 10 µg/L de 6-benzylaminopurine, e 0,04 °/) Silwet L-77. As plantas de aproximadamente um mês foram mergulhadas no meio durante 5-10 minutos com a agitação suave.

As plantas foram estabelecidas nos seus lados e cobertas (transparente ou opaco) durante 2-3 horas, e de- . pois colocadas direito.

As plantas foram cultivadas em 22"C, com um perío- do de 16 horas de luz / 8 horas de escuro.

Aproximadamente quatro sema- nas após o mergulho, as sementes foram colhidas- 5 2.3 - Seleção de plantas transformadas.

A semente de T1 recentemente coIhida foi permitida para secar durante sete dias na temperatura ambiente.

A semente de T1 foi semeada em 26,5 bandejas de germinação de 51 cm x, cada um que recebe umas partes alíquotas de 200 mg da semente de T1 estratificada (-10,000 semen- lO te) que tinha sido anteriormente suspenso em 40 ml da solução de agarose a 0,1 °/) e guardado em 4°C durante dois dias para concluir exigências de dormência e assegurar a germinação de semente sÍncrona. q Mistura de luz solar LP5 foi coberto da vermiculita perfeita e su-

. birrigado com a solução de Hoagland até molhar, depois deixando drenar 15 por gravidade.

Cada alíquota de 40 ml da semente estratificada foi semeada exatamente para a vermiculita com uma pipeta e coberta de cúpulas de umi- dade durante 4 a 5 dias.

As cúpulas foram removidas um dia antes da sele- ção transformante inicial que usa borrifo de pós-emergência de glifosiriato.

Sete dias que após plantam (DAP), plantas de T1 (cotilédone e 20 etapa 2-4-lf, respectivamente) foram borrifados cinco vezes dentro de cinco dias com L|ma soIuçâo de 0,2 °/j do herbicida Liberty (200 g ae/L glifosinato, Bayer Crop Sclences, Kansas City, Missouri) em um volume de borrifo de 10 ml / bandeja (703 ljha) usando de uma ponta de borrifo de ar comprimido DeVilbiss para liberar uma taxa eficaz de 280 g ae/ha glifosinato por aplica- 25 ção.

Os sobreviventes (plantas que ativamente cresceram) foram identifica- dos 4 a 7 dias após o borrifo final e transplantadas individualmente em potes de 7,6 cm preparados com o meio potting (Metro Mix 360). As plantas trans- plantadas foram cobertas de cúpulas de umidade durante 3 a 4 dias e colo- cadas em uma câmara de crescimento a 22°C como antes ou movidas dire- 30 tamente para uma estufa.

As cúpulas foram posteriormente removidas e as plantas criadas na estufa (22±5°C, UR de 50±30 %, 14 h luz : 10 h escuro, 500 µE/m2s' luz natural + luz suplementar).

FXEMPLO 3. *

ANÁLISE MOLECULAR DA INTEGRAÇÃO GENÔMICA DE TRANSGENES NA PROGÊNIE Tl DE ARAB/DOPS/S THAL/ANA CV COLÔMB/A.

3.1 - ampiificação de transqenes por qDNA PCR. 5 DNA genômico de plantas transgênicas Arabidopsis foi extraído do material de folha total de plantas de seis semanas usando um kit Plant DNAZOL de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores de PCR foram projetados para a detecção de transgenes de PAT e YFP. Os iniciado- res YFP são representados como SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6. Os iniciado- lO res de PAT são representados como SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8. As reações de amplificação de PCR de PAT e YFP foram con- d cluídas usando o kit TakaRa EXTAQ® (Takara, Otsu, Shiga, japão). Os ge- nes produzidos foram amplificados em um volume de reação total de 50 µ1.

· A reação de PCR continha 100 ng de DNA genômico padrão, lX tampão de 15 reação ExTaq, 0,2 mM dNTP, 10 pMols de cada iniciador, e 0,025 unida- de/µL de ExTaq. As seguintes condições de PCR foram usadas: 1 ciclo em 96°C durante cinco minutos e 31 ciclos das seguintes condições 94°C duran- te 15 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante um minuto, e uma extensão final de 72°C durante 7 minutos. O produto de amplificação de 20 PCR foi analisado em eletroforese de gel de agarose a 0,8 °/0 de TAE e visu- alizado pela coloração de brometo de etideo. As figura 5 e figura 6 mostram os produtos de amplificação que foram obtidos destas reações. Os fragmentos de PCR foram sequenciados usando o iniciador de avanço do PAT (SEQ ID NO:7) e o iniciador de avanço do YFP (SEQ ID 25 NO:5) usando de tecnologia de sequenciamento Sanger avançada (MWG Biotech, Huntsville, Alabama). Os dados de sequência foram analisados u- sando o software Sequencher. Os resuitados de sequenciamento do PAT e YFP por PCR am- plicons combinaram com a sequência de nucelotideo esperada destes ge- 30 nes. Estes resultados indicam que as sequências de PAT e YFP de pDAB3831 ficaram integrados de maneira estável no gDNA da Arabidopsis usando o Reagente de Transfecção SUPERFECT""

3.2 -Avaliação por ELISA de PAT.

A proteína foi extraída das folhas da planta de Arabidopsis transgênica de seis semanas para a detecção da proteina de PAT expressa- da via ELISA (ensaio ímunossorbente de Iigação enzimática). Um tubo de 5 microcentrifuga contendo as amostras de folha foi resfriado em nitrogênio Iíquido.

O material de folha foi moído a um pó usando um homogeneizador disponível.

Após equilibrar em gelo durante 5 minutos, 200 µ1 de tampão de extração (PBST; fosfato de 20 mM a salina tamponada contendo 0,05 °/, (v/v) TWEEN ® 20) foi acrescentado.

Os teores foram misturados com um 10 vórtice e centrifugados em 4°C durante 10 minutos em 13.000 g.

O sobrena- dante foi extraído do detrito de célula e guardado em gelo até a análise adi- cional. a O teste ELISA foi executado usando um protocolo modificado

· para o kit QUALIPLATE" de LIBERTYLINK " PAT/pat-(Envirologix, Portland, 15 Maine). A placa de ELISA e outros reagentes foram equilibrados na tempera- tura ambiente. 50 µ1 da Enzima Conjugada foram acrescentados a cada fon- te da placa.

Mais 50 µ1 do Tampão de Extração foram acrescentados a cada fonte da pIaca.

As diluições seriais da proteína Arabidopsis transgênica puri- ficada foram acrescentadas aos poços.

As concentrações de 10, 5, 2,5, e 20 1,25 ng/ml foram usadas.

Os padrões adicionais e os extratos de planta fo- ram acrescentados aos poços como controles.

A placa foi agitada em 200 rpm e incubada na temperatura ambiente durante 2 horas- Após a incuba- ção, a placa foi lavada cinco vezes com o Tampão de Extração em um lava- dor de placa.

Para a detecção, 100 µ1 do substrato do kit foram acrescenta- 25 dos a cada poço e a placa foi incubada durante 30 minutos.

A atividade foi lida e registrada usando de um leitor de micro placa em uma absorvância de 595 nm.

A absorvância dos sinais de ELISA dos padrões indicou que o sinal de absorvância foi diretamente proporcional às quantidades presentes 30 de PAT em cada poço.

Estes dados são representados na figura 5. As a- mostras do SUPERFECT® e plantas transformadas mediadas por Agrobac- terium mostram sinais fortes de ELISA.

Estas quantidades são três vezes e mais altas como o padrão de 10 ng/ml, o padrão mais alto testado no ensaio. Estes resultados indicam que PAT é expressa nas plantas transgênicas Ara- bidopsis que foram transformadas via transformação da planta mediada por SUPERFECT".

5 Embora a presente invenção tenha sido descrita em certas mo- dalidades, a presente invenção pode ser também modificada dentro do espí- rito e do alcance desta divulgação. Este Pedido, por isso, está destinado a cobrir qualquer variação, usos, ou adaptações da invenção usando os seus principios gerais. Tambén"i, este Pedido está destinado a cobrir tais fugas da 10 presente divulgação como estando dentro da prática conhecida ou usual na técnica à qual esta invenção pertence e que estão incluídos nos limites das 4 reivindicações acrescentadas e os seus equivalentes.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de introduzir uma molécula de interesse em uma célu- la de planta possuindo uma parede celular para realizar a transformação es- tável de uma planta e de sementes, o método compreendendo: 5 fornecer a célula da planta possuindo uma parede celular; interagindo um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPs, com uma molécula de interesse para formar uma estrutura ativada de den- drímero; colocar a célula possuindo uma parede celular e a estrutura ati- lO vada de dendrimero em contato um com outro; e permitir absorção do dendrímero e a molécula de interesse para dentro da célula possuindo uma parede celular. d

   2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que interagindo · um dendrimero com uma molécula de interesse compreende a montagem da 15 molécula de interesse na superfície do dendrimero.

   3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que interagindo um dendrímero com uma molécula de interesse compreende a interagir gru- pos negativamente carregados da molécula de interesse com grupos amino carregados em uma extremidade terminal do dendrímero.

   20 4. Método de acordo com a reivindicação 1, também compreen- dendo a absorção do dendrímero em um compartimento da célula da planta compreendendo uma parede celular.

   5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o comparti- mento é selecionado do grupo consistindo em citossol, núcleo, tonoplastos, 25 plastídio, etioplasto, cromoplasto, leucoplasto, elaioplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto, e o lúmen da membrana dupla.

   6. Método de acordo com reivindicação 1, em que a célula da planta que compreende uma parede celular é selecionada do grupo consis- tindo em células de fumo, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, 30 amendoim, soja, Oryza sp., Arabidopsis sp., R/cinus sp., e cana-de-açúcar.

   7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula da pIanta é de um tecido selecionado do grupo consistindo em embrião, meris-

   P tema, calo, póIen, folhas, anteras, raizes, coifa, flores, sementes, vagens e troncos.

   8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dendríme- ro compreende um dendrímero de poliamidoamiria. 5 9- Método de acordo com reivindicação 1, também compreen- dendo a derivatização da superficie do dendrímero.

   10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de interesse compreende um componente selecionado do grupo consistindo de ácidos nucleicos, DNA, RNA, moléculas de RNA1, genes, pIasmídios, 10 cosmídios, YACS, BACS, polipeptídios, enzimas, hormônios, glicopeptídeos, açúcar, gorduras, peptídeos sinalizadores, anticorpos, vitaminas, mensagei- ros, mensageiros secundários, aminoácidos, CAMP, drogas, herbicidas, fun- d gicidas, antibióticos, e combinações dos mesmos.

   · 11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a molécula 15 de interesse compreende um gene.

   12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o gene é um gene de proteína estranha, um gene agronômico, ou um gene marcador.

   13. Método de acordo com a reivindicação 10, também compre- endendo a seleção de células que integraram de maneira estável a molécula 20 de interesse,

   14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que as células selecionadas são células regeneráveis.

   15. Método de acordo com a reivindicação 13, também compre- endendo a regeneração de uma planta a partir das células regeneráveis. 25 16. Método de acordo com reivindicação 1, em que o dendríme- ro compreende um reagente de dendrímero.

   17. Método de expressar um gene de maneira estável, o método compreendendo: fornecer uma célula da pIanta possuindo uma parede celular; 30 interagindo um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPS, com um gene para formar uma estrutura ativada de dendrímero: colocar a célula da planta possuindo uma parede celular e a es-

   trutura ativada de dendrímero em contato um com outro; permitir a absorção do dendrímero e do gene para dentro da cé- lula da planta compreendendo uma parede celular; e expressar o gene na progênie de uma planta possuindo a célula 5 da planta.

   18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o gene é expressado em um cloroplasto.

   19. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo também a seleção de células que de maneira estável expressam o gene.

   20. Método para transferir uma substância molecular para uma célula de pIan'ta, compreendendo: lnteração de um dendrímero, e opcionalmente um ou mais CPPS, com o DNA de um plasmídio para formar uma estrutura ativada de dendrímero; e contatar a estrutura ativada do dendrímero com uma célula da planta intacta que carrega a parede sob condições que permitem a absorção do dendrímero e um gene de plasmidio DNA na célula da planta.

   21. Método de acordo com a reivindicação 20, também compre- endendo estavelmente expressar o gene na progênie de uma pIanta possu- indo a célula da planta.

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