BR102019002793A2 - Vacina anti-gnrh - Google Patents
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
vacina anti-gnrh. essa descrição refere-se a uma vacina que compreende um antígeno que compreende gnrh e um adjuvante que compreende um oligonucleotídeo imunoestimulador que contém cpg, um esterol, um fosfolipídeo e um óleo, em que a dita vacina é uma formulação oleosa ou uma emulsão de a/o. os métodos para fazer e usar a vacina também são fornecidos.
Description
[001] Essa invenção está geralmente na área da vacinação do gado e regulação hormonal.
[002] O hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) é secretado pela glândula pituitária e atua como hormônio reprodutor principal através da regulação da liberação de dois hormônios gonadotrópicos principais, o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo-estimulante (FSH). Por sua vez, LH e SFH induzem o desenvolvimento das gônadas e a liberação de esteroides sexuais.
[003] Vacinas para GnRH estimulam a produção de anticorpos para inativar GnRH endógeno. A resposta imune anti-GnRH inibe a liberação de LH e FSH, que são necessários para o desenvolvimento e a manutenção das gônadas – testículos no homem e ovários na mulher. Assim a redução dos níveis de LH e FSH leva a perda da função reprodutora.
[004] O desenvolvimento das técnicas de imunocastração baseado na geração da resposta imune ao GnRH é desafiador devido ao fato de que GnRH é um peptídeo curto (10 aminoácidos de extensão) e GnRH está naturalmente presente no corpo. Portanto, é reconhecido pelo sistema imune como uma “autoproteína. Para superar esses problemas, GnRH tem sido conjugado a várias moléculas antigênicas, por exemplo, proteínas de transporte. As vacinações com tais construtos/moléculas resultaram em alguns níveis de sucesso em diferentes espécies, mas a baixa imunogenicidade permanece uma dificuldade persistente.
[005] Essa descrição soluciona estes e outros problemas da técnica anterior pelo fornecimento, em um aspecto, de uma vacina que compreende: um antígeno que compreende GnRH, um adjuvante que compreende um CpG que contém um oligonucleotídeo imunoestimulador, um esterol, um fosfolipídeo e um óleo, em que a dita vacina é uma formulação oleosa ou uma emulsão de água em óleo (A/O).
[006] Em certas modalidades, o esterol é o colesterol e o fosfolipídeo é fosfatidilcolina. Em certas modalidades, a vacina compreende até 2% de água.
[007] Em certas modalidades, as vacinas desta descrição são preparadas por um método que compreende as etapas de: preparar uma subsolução pela mistura de fosfatidilcolina, esterol, CpG que contém o oligonucleotídeo imunoestimulador e o antígeno; microfluidizar a subsolução; preparar niossomas pela liofilização da subsolução microfluidizada; reconstituir os niossomas no óleo e/ou na emulsão de A/O.
[008] Em certas modalidades, a etapa de preparação da subsolução compreende misturar o esterol e o fosfolipídeo, esterilizar por filtração a mistura de esterol e fosfolipídeo e misturar a mistura esterilizada por filtração de esterol-fosfolipídeo com uma solução aquosa que compreende CpG que contém o oligonucleotídeo imunoestimulador e o GnRH.
[009] Em certas modalidades, as vacinas descritas aqui são eficazes como vacinas de dose única.
[0010] Esta descrição também fornece o uso da vacina de acordo com qualquer uma das modalidades acima para a supressão da fertilidade ou para a suspensão da função ovariana em uma novilha ou vaca não prenha.
[0011] Em certas modalidades, a dita novilha ou vaca não prenha tem pelo menos 6 meses de idade ou pelo menos 15 meses de idade.
[0012] Em outro aspecto ainda, essa descrição também fornece o uso da vacina de acordo com qualquer uma das modalidades acima para a supressão da função testicular a para a melhora da qualidade da carcaça em um indivíduo bovino macho.
[0013] Em certas modalidades, o indivíduo bovino macho tem pelo menos 10 meses de idade.
[0014] Em um amplo aspecto, é descrita aqui uma vacina que compreende: um antígeno que compreende GnRH, um adjuvante que compreende um CpG que contém um oligonucleotídeo imunoestimulador, um esterol, um fosfolipídeo e um óleo, em que a dita vacina é uma formulação oleosa ou uma emulsão de A/O.
[0015] “Cerca de” ou “aproximadamente”, quando usados em conjunto com uma variável numérica mensurável, se referem ao valor indicado e a todos os valores da variável que estejam dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro de 95% do intervalo de confiança para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, o que for maior, a menos que cerca de seja usado em referência a intervalos de tempo em semanas onde “cerca de 3 semanas” são 17 a 25 dias e cerca de 2 a cerca de 4 semanas são 10 a 40 dias.
[0016] “Antígeno” ou “imunógeno” se referem a qualquer substância que é reconhecida pelo sistema imune do animal e que gera uma resposta imune. A expressão inclui bactérias, vírus e parasitas mortos, inativados, atenuados ou modificados. A expressão “antígeno” também inclui polinucleotídeos, polipeptídeos, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (incluindo células tumorais), tecidos, polissacarídeos ou lipídeos ou seus fragmentos, individualmente ou em qualquer combinação destes. A expressão antígeno também inclui anticorpos, tais como anticorpos anti-idiotípicos ou seus fragmentos e a mimótopos de peptídeo sintético que podem mimetizar um antígeno ou determinante antigênico (epítopo).
[0017] “Tampão” significa um sistema químico que previne a alteração na concentração de outra substância química, por exemplo, sistemas doadores e aceptores de próton servem como tampões que evitam alterações acentuadas na concentração do íon hidrogênio (pH). Um exemplo adicional de um tampão é uma solução que contém uma mistura de ácido fraco e seu sal (base conjugada) ou uma base fraca e seu sal (ácido conjugado).
[0018] “Que consiste essencialmente “ como aplicado às formulações adjuvantes, se refere a uma formulação que não contém agentes adjuvantes ou imunomoduladores adicionais não citados nas quantidades nas quais o dito agente exerce os efeitos adjuvantes ou imunomoduladores.
[0019] A referência a uma composição ou vacina como sendo “eficaz como uma vacina de dose única” se refere a uma vacina que após a administração a:
- a) uma população de indivíduos bovinos fêmeas, é capaz de evitar a gravidez em pelo menos 85% (por exemplo, 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) das novilhas de corte ou vacas por pelo menos 9 meses (por exemplo, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 12 meses) depois do tratamento; ou
- b) a uma população de indivíduos bovinos machos, suprime a testosterona em pelo menos 85% (por exemplo, 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) dos bois de corte por pelo menos 9 meses (por exemplo, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 12 meses) depois do tratamento comparados com bois não tratados.
[0020] A expressão “emulsificante” é usada amplamente na presente descrição. Ela inclui substâncias geralmente aceitas como emulsificantes, por exemplo, produtos diferentes das linhas de produtos TWEEN® ou SPAN® (ésteres de ácido graxo de sorbitol polietoxilado e tensoativos de sorbitana substituída por ácido graxo, respectivamente) e diferentes intensificadores da solubilidade tais colo PEG-40 Castor Oil ou outro óleo hidrogenado PEGuilado. Para os propósitos desta descrição, fosfolipídeos, tais como a fosfatidilcolina e mais especificamente a lecitina, estão excluídos dos “emulsificantes” como aqui descritos.
[0021] “Quantidade imunologicamente protetora” ou “quantidade imunologicamente eficaz” ou “quantidade eficaz para produzir uma resposta imune” de um antígeno é uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imunogênica no receptor. A resposta imunogênica pode ser suficiente para propósitos de diagnóstico ou outros testes ou pode ser adequada para evitar sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos adversos à saúde ou suas complicações, causados pela infecção com um agente de doença. A imunidade humoral ou a imunidade medida por célula ou ambas podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal à uma composição imunogênica pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através da medida de títulos de anticorpo, ensaios de proliferação de linfócito ou diretamente através da monitorização de sinais e sintomas depois da inoculação com uma cepa de tipo selvagem, enquanto que a imunidade protetora conferida pela vacina pode ser avaliada pela medida, por exemplo, da redução de sinais clínicos tais como mortalidade, morbidade, índice de temperatura, condição física global, saúde global e desempenho do indivíduo. A resposta imune pode compreender, sem limitação, a indução da imunidade celular e/ou humoral.
[0022] “Imunogênico” significa evocar uma resposta imune ou antigênica. Assim, uma composição imunogênica pode ser qualquer composição que induza uma resposta imune.
[0023] “Lipídeos” se referem a qualquer um de um grupo de compostos orgânicos, incluindo gorduras, óleos, ceras, esteróis e triglicerídeos que são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos não polares, são oleosos ao toque e junto com os carboidratos e proteínas constituem o material estrutural principal das células vivas.
[0024] A expressão “formulação oleosa” é intercambiável com a expressão “formulação essencialmente livre de água” e se refere a formulações que contêm menos do que 5% de água v/v. O conteúdo de água pode ser de cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0% v/v.
[0025] “Farmaceuticamente aceitável” se refere a substâncias que estão dentro do escopo do julgamento médico, adequadas para uso em contato com os tecidos dos indivíduos sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas e semelhantes, compatíveis com uma proporção risco-para-benefício razoável e eficaz para o uso pretendido.
[0026] Esteróis compartilham um núcleo químico comum que é uma estrutura de esteroide em anel, que possui um grupo hidroxila (OH), comumente acoplado ao carbono 3. A cadeia de hidrocarboneto do substituinte de ácido graxo varia em extensão, comumente entre 16 a 20 átomos de carbono e pode ser saturada ou insaturada. Os esteróis contêm comumente uma ou mais ligações duplas na estrutura em anel e também uma variedade de substituintes acoplados aos anéis. Esteróis e seus ésteres de ácido graxo são essencialmente insolúveis em água. A vista dessas similaridades químicas, é provável então que os esteróis que compartilham esse núcleo químico tenham propriedades similares quando usados nas composições de vacina da presente invenção. Esteróis são bem conhecidos na técnica e podem ser adquiridos comercialmente. Por exemplo, o colesterol está descrito no Merck Index, 12th. Ed., p. 369. Esteróis adequados incluem, sem limitações, β-sitosterol, estignaterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol.
[0027] Os adjuvantes aqui descritos contêm ainda fosfolipídeos. Os fosfolipídeos particularmente preferidos são as fosfatidilcolinas. As fosfatidilcolinas são fosfolipídeos que incorporam a colina como grupo principal. Elas são um componente principal das membranas biológicas e podem ser facilmente obtidas a partir de uma variedade de fontes prontamente disponíveis, tais como gema de ovo ou feijões de soja, a partir dos quais elas são mecanicamente ou quimicamente extraídas usando hexano. Elas também são um membro do grupo da lecitina de substâncias graxas marrom-amareladas que ocorrem nos tecidos de animais e plantas.
[0028] A lecitina é uma fosfatidilcolina que é particularmente adequada para o adjuvante aqui descrito. A lecitina pode ser obtida como uma mistura de fosfatídeos e triglicerídeos pela lavagem com água de óleos vegetais brutos e separando e secando as gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido pelo fracionamento da mistura para fosfolipídeos e glicolipídeos insolúveis em acetona que permanecem depois da remoção dos triglicerídeos e óleo vegetal pela lavagem da acetona. Alternativamente, a lecitina pode ser obtida a partir de várias fontes comerciais.
[0029] Outros fosfolipídeos adequados incluem fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Lisofosfolipídeos (por exemplo, lisofosfatidilcolina) também são adequados para essa invenção. Os fosfolipídeos podem ser isolados a partir de fontes naturais ou convencionalmente sintetizados.
[0030] Em certos aspectos, o esterol e o fosfolipídeo são usados em proporções em peso entre 1:3 a 1:20, esterol:fosfolipídeo ou uma subfaixa dessas. Por exemplo, as proporções em peso de esterol para fosfatidilcolina podem estar entre 1:5 a 1:15 ou 1:8 a 1:13 ou 1:9 a 1:11 ou cerca de 1:10.
[0031] O peso total do esterol e fosfolipídeo por dose da vacina pode estar entre cerca de 30 mg e cerca de 100 mg, por exemplo, cerca de 40 mg a cerca de 80 mg, ou cerca de 40 mg a cerca de 70 mg ou cerca de 50 mg a cerca de 70 mg ou cerca de 55 mg a cerca de 75 mg ou cerca de 60 mg.
[0032] O adjuvante também compreende CpG que contém oligonucleotídeos imunoestimuladores, que são oligonucleotídeos que incluem pelo menos um dinucleotídeo CpG não metilado. Um oligonucleotídeo que contém pelo menos um dinucleotídeo CpG não metilado é uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de dinucleotídeo citosina-guanidina não metilado (isto é, “CpG DNA” ou DNA que contém uma citosina 5’ seguida pela guanina 3’ e ligado por uma ligação de fosfato) e ativa o sistema imune. O oligonucleotídeo CpG completo pode ser não metilado ou porções podem ser não metiladas, mas pelo menos C de 5’ CG 3’ deve ser não metilado. As expressões oligonucleotídeo CpG ou ácido nucleico CpG como usadas aqui se referem a um oligonucleotídeo CpG imunoestimulador ou um ácido nucleico, a menos que indicado de outra maneira.
[0033] Em aspectos da invenção, moléculas imunes moduladoras incluem, mas não estão limitadas a oligonucleotídeos que são da Classe A, Classe B, Classe C, Classe T, Classe P ou qualquer Classe com uma modificação E.
[0034] Oligonucleotídeos Classe A são potentes para induzir IFN-α e a ativação da célula NK, mas é relativamente fraco na estimulação das células B. Os oligonucleotídeos Classe A tipicamente possuem sequências de poli-G nas terminações 5’ e 3’ e um dinucleotídeo CpG de fosfodiéster palindrômico que contém uma sequência de pelo menos 6 nucleotídeos e formam estruturas multiméricas. Oligonucleotídeos Classe A foram descritos na Pat U.S. No. 6.949.520, publicada em 27 de setembro de 2005 e pedido publicado PCT no. PCT/US00/26527 (WO 01/22990), publicado em 5 de abril de 2001.
[0035] Oligonucleotídeos Classe B são potentes na ativação das células B, mas é relativamente fraco na indução de IFN-α e a ativação da célula NK. Os oligonucleotídeos Classe B são monoméricos e podem ser completamente estabilizados com um arcabouço integralmente de fosforotioato. Os oligonucleotídeos Classe B também podem ter algumas ligações de fosfodiéster nativas, por exemplo, entre C e G de CpG, em cujo caso elas são referidas como semiflexíveis. Os oligonucleotídeos Classe B foram descritos nas Pat. U.S. Nos. 6.194.388 B1 e 6.239.116 B1, publicadas em 27 de fevereiro de 2001 e 29 de maio de 2001, respectivamente e no pedido publicado PCT no. WO/1996/002555, publicado em 1 de fevereiro de 1996 e no pedido publicado PCT no. WO/1998/018810, publicado em 7 de maio de 1998. Os oligonucleotídeos Classe C possuem ambas a sequência CpG “estimuladora” tradicional e um motivo “rico em GC” ou “neutralizante da célula B”. Os oligonucleotídeos CpG Classe C possuem propriedades intermediárias das Classes A e B, de modo que ativam as células B e as células NK e induzem IFN-alfa (Krieg A M et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas Z K et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6).
[0036] Os oligonucleotídeos Classe C contêm um palíndromo único tal que eles podem formar estruturas secundárias tais como haste-alças ou estruturas terciárias tais como dímeros. O arcabouço dos oligonucleotídeos Classe C podem ter um arcabouço completamente estabilizado, quimérico ou semiflexível. Os oligonucleotídeos Classe C incluem uma sequência do tipo da Classe B e um palíndromo rico em GC ou um quase palíndromo. Essa Classe foi descrita no pedido publicado U.S. no. 20030148976, publicado em 7 de agosto de 2003 e no pedido PCT publicado no. WO2008/068638, publicado em 12 de junho de 2008.
[0037] Os oligonucleotídeos Classe P possuem a habilidade em algumas circunstâncias de induzir níveis muito elevados de secreção de IFN-alfa do que os oligonucleotídeos Classe C. Os oligonucleotídeos Classe P possuem a habilidade de automontagem espontânea em concatâmeros in vitro e/ou in vivo.
[0038] Esses oligonucleotídeos têm, em sentido estrito, uma fita simples, mas a presença de palíndromos permite a formação de concatâmeros e possivelmente estruturas de haste e alça. A extensão global de oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P está entre 19 e 100 nucleotídeos, por exemplo, 19 a 30 nucleotídeos, 30 a 40 nucleotídeos, 40 a 50 nucleotídeos, 70 a 80 nucleotídeos, 80 a 90 nucleotídeos, 90 a 100 nucleotídeos.
[0039] Em um aspecto da invenção, o oligonucleotídeo imunoestimulador contém o domínio de ativação 5’ TLR e pelo menos duas regiões palindrômicas, uma região palindrômica sendo uma região palindrômica 5’ de pelo menos 6 nucleotídeos de extensão e conectada, diretamente ou através de um espaçador, a uma região palindrômica 3’ de pelo menos 8 nucleotídeos de extensão.
[0040] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P podem ser modificados de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, a modificação J se refere a nucleotídeos modificados com iodo, a modificação E se refere a nucleotídeos modificados com etila. Portanto, oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P E-modificados são oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P, em que pelo menos um nucleotídeo (preferivelmente, nucleotídeo 5’) é etilado. Modificações adicionais incluem o acoplamento de 6-nitro-benzimidazol, O-metilação, modificação com proinil-dU, modificação com inosina, acoplamento de 2-bromovinila (preferivelmente à uridina).
[0041] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P também podem conter uma ligação inter-nucleotídica modificada que inclui, sem limitações, ligações de fosfodiéster e ligações de fosforotioato. Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser sintetizados ou obtidos a partir de fontes comerciais.
[0042] Oligonucleotídeos da Classe P e oligonucleotídeos da Classe P modificados estão descritos adicionalmente no pedido publicado PCT no. WO2008/068638, publicado em 12 de junho de 2008. Exemplos não limitantes adequados de oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P modificados são fornecidos abaixo (Nas SEQ ID NOs 1-10, “*” se refere a uma ligação de fosforotioato e “_” se refere a uma ligação de fosfodiéster).
SEQ ID NO: 1 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 2 5' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 3 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO: 4 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 5 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 7 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 8 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 10 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 1 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 2 5' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 3 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO: 4 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 5 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 7 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO: 8 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
SEQ ID NO: 10 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
[0043] A quantidade de oligonucleotídeos imunoestimuladores da Classe P para uso nas composições adjuvantes aqui descritas varia entre cerca de 50 µg e 500 µg, por exemplo, entre 100 e 400 µg, ou 200 e 300 µg, ou 250 e 300 µg por dose, para aplicação a um animal de rebanho.
[0044] A expressão GnRH abrange GnRH de mamífero que ocorre naturalmente (SEQ ID NO: 11 (piro-EHWSYGLRPG-NH2)) e também inclui análogos de GnRH que são capazes de inibir a liberação de gonadotropinas pela glândula pituitária e, desse maneira, inibir a liberação de hormônios esteroides, estradiol, progesterona e testosterona. Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.444.759. Exemplos adicionais de análogos de GnRH incluem, sem limitações leuprolide (pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt; SEQ ID NO: 12), buserelina (pyrGlu-His-TrpSer-Tyr- D-Ser(Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt; SEQ ID NO: 13), deslorelina (pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt; SEQ ID NO: 14) e fertirelina (pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHEt; SEQ ID NO: 15).
[0045] GnRH pode ser conjugado a moléculas maiores para evocar uma melhor resposta imune. As toxinas são exemplos adequados de tais moléculas maiores, compostos baseados na toxina diftérica, toxina de ricina, exotoxina de pseudomonas, alfa-amanitina, proteína antiviral de uva-de-rato (PAP, pokeweed), proteínas que inibem o ribossoma, especialmente as proteínas que inibem o ribossoma de cevada, trigo, milho, centeio, gelonina e abrina, assim como certos químicos citotóxicos tais como, por exemplo, melfalan e daunomicina. Em certos aspectos, GnRH compreende GnRH conjugado com a Toxina Diftérica. Veja, por exemplo, 5.492.893.
[0046] As vacinas aqui descritas são formuladas como emulsões de água-em-óleo (A/O) ou como formulações essencialmente livres de água. Como notado acima, as formulações essencialmente livres de água contêm 0 a 2% de água v/v.
[0047] As emulsões de A/O contêm uma fase oleosa contínua na qual as gotículas aquosas estão espalhadas e, opcionalmente, um ou mais emulsificantes.
[0048] Múltiplos óleos e suas combinações são adequados para uso na presente invenção. Esses óleos incluem, sem limitações, óleos de origem animal, óleos vegetais assim como óleos não metabolizáveis. Exemplos não limitantes de óleos vegetais adequados na presente invenção são óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e óleo de oliva. Exemplo não limitante de óleos de origem animal é o esqualano. Exemplos não limitantes de óleos não metabolizáveis incluem óleo mineral leve, óleos saturados ramificados ou de cadeia linear e semelhantes. Adjuvantes baseados em óleo comercialmente disponíveis também são adequados para uso com as vacinas aqui descritas. Tais adjuvantes comercialmente disponíveis incluem os óleos MONTANIDE™da Seppic (Paris, França) incluindo, sem limitação ISA50V2 (uma emulsão de A/O que contém óleo mineral).
[0049] Tipicamente, a fase oleosa está presente em uma quantidade entre 50% a 95% em volume; preferivelmente, em uma quantidade maior do que 50% a 85%; mais preferivelmente, em uma quantidade maior do que 50% a 60% e mais preferivelmente, em uma quantidade maior do que 50% a 52% v/v da composição da vacina. A fase oleosa inclui óleo e emulsificantes (por exemplo, SPAN®80, TWEEN®80, etc.), se qualquer um de tais emulsificantes estiver presente. O volume da fase oleosa é calculado como uma soma dos volumes do óleo e do(s) emulsificante(s). Assim, por exemplo, se o volume do óleo é de 40% e o volume do(s) emulsificante(s) é de 12% de uma composição, então a fase oleosa estará presente em 52% v/v da composição. Similarmente, se o óleo está presente em uma quantidade de cerca de 45% e o(s) emulsificante(s) está/estão presente(s) na quantidade de cerca de 6% de uma composição, então a fase oleosa está presente em cerca de 51% v/v da composição.
[0050] Em um subgrupo de modalidades, aplicável a todos os adjuvantes/vacinas da presente invenção, o percentual em volume do óleo e do emulsificante solúvel em óleo juntos é de pelo menos 50%, por exemplo, 50% a 95% em volume; ou na quantidade entre 50% a 85%; ou, na quantidade entre 5% a 70% ou na quantidade entre 70% a 95%; ou na quantidade entre 70% a 90%; ou na quantidade entre 80% a 95%.
[0051] Emulsificantes adequados para uso nas presentes emulsões incluem emulsificantes naturais biologicamente compatíveis e tensoativos sintéticos não naturais.
[0052] Emulsificantes sintéticos não naturais adequados para uso nas formulações adjuvantes da presente invenção incluem tensoativos não iônicos baseados em sorbitana, por exemplo, tensoativos de sorbitana substituída com ácido graxo (comercialmente disponível sob o nome de SPAN® ou ARLACEL®), ésteres de ácido graxo de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de ácido graxo de polietileno glicol de fontes tais como óleo de rícino (EMULFOR®); ácido graxo polietoxilado (por exemplo, ácido esteárico disponibilizado sob o nome de SIMULSOL® M-53), polímero polietoxilado de isooctilfenol/formaldeido (TYLOXAPOL®), éteres de álcool graxo de polioxietileno (BRIJ®); éteres não fenílicos de polioxietileno (TRITON® N), éteres iso-octilfenílicos de polioxietileno (TRITON® X). Tensoativos sintéticos preferidos são os tensoativos disponíveis sob o nome de SPAN® e TWEEN®, tais como TWEEN®-80 (Monoleato de polioxietileno (20) sorbitana) e SPAN®-80 (monooleato de sorbitana).
[0053] Falando de modo geral, os emulsificantes podem estar presentes na composição de vacina em uma quantidade de 0,01% a 40% em volume, preferivelmente 0,1% a 15%, mais preferivelmente 2% a 10%.
[0054] Também são fornecidas vacinas que são formulações oleosas. Tais formulações são essencialmente ou completamente livres de água.
[0055] Existem vários métodos para a preparação da composição de vacina de acordo com a presente invenção. Por exemplo, uma subsolução pode ser preparada pela mistura do esterol, do fosfolipídeo e, opcionalmente, do emulsificante solúvel em lipídeo. A mistura resultante é aquecida se necessário e esterilizada por filtração. A mistura esterilizada por filtração é então misturada com uma solução aquosa que compreende o CpG que contém o oligonucleotídeo imunoestimulador, GnRH e, opcionalmente, o emulsificante solúvel em água e/ou excipientes, formando dessa maneira a subsolução.
[0056] A subsolução resultante é então passada através de um microfluidificador. Preferivelmente, são feitas 1 a 3 passagens, em uma taxa de cisalhamento de 1x106 por segundo a cerca de1x108 por segundo, por exemplo, cerca de 107 por segundo. Alternativamente, pode ser usada também a homogeneização por alto cisalhamento. A composição microfluidizada ou homogeneizada é então liofilizada. Como resultado, corpos lipídicos ou niossomas são formados. Os niossomas são reconstituídos em uma emulsão de A/O, por exemplo, a emulsão MONTANIDETM ISA50V2.
[0057] Como descrito acima, a administração de GnRH ou seu agonista induz a produção do anticorpo anti-GnRH. Os anticorpos antiGnRH se ligam a GnRH e inibem a ligação de GnRH ao seu receptor, dessa maneira diminuindo a produção de LH e FSH. A produção diminuída de LH e FSH por sua vez inibe a síntese e a liberação de esteroides sexuais e o desenvolvimento das gônadas.
[0058] Tais vacinas de dose única podem conter cerca de 400 µg de GnRH-DT, cerca de 100 a cerca de 300 µg de CpG, cerca de 4 a cerca de 7 mg de colesterol e cerca de 50 a cerca de 55 mg de lecitina. O volume da vacina administrada ao animal é de 0,5 a 5 ml, por exemplo, 0,75 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 0,5 a 1,5 ml, 1,2 ml, etc.
[0059] As vacinas aqui descritas são úteis como vacinas de dose única (ou produtos de dose única) para a regulação do desenvolvimento sexual (e suas consequências) em indivíduos bovinos. Indivíduos bovinos adequados incluem touros, novilhos e vacas e pertencem a espécies dentro do gênero Bos, incluindo sem limitação B. taurus e B. indicus.
[0060] Por exemplo, a vacina pode ser usada para a supressão temporária da fertilidade e/ou suspensão da função ovariana em novilhas e vacas não prenhas. Tais novilhas e vacas têm, preferivelmente cerca de 6 meses de idade ou mais (por exemplo, cerca de 7 meses de idade, cerca de 8 meses de idade, cerca de 9 meses de idade, cerca de 10 meses de idade, cerca de 11 meses de idade, cerca de 12 meses de idade, cerca de 13 meses de idade, cerca de 14 meses de idade, cerca de 15 meses de idade, cerca de 16 meses de idade, cerca de 17 meses de idade, cerca de 18 meses de idade, cerca de 19 meses de idade, ou cerca de 20 meses de idade).
[0061] A vacina aqui descrita também pode ser usada para a supressão temporária da função testicular e para a melhora da qualidade da carcaça em machos intactos. Machos adequados podem ter pelo menos 10 meses de idade (por exemplo, cerca de 11 meses de idade, cerca de 12 meses de idade, cerca de 13 meses de idade, cerca de 14 meses de idade, cerca de 15 meses de idade, cerca de 16 meses de idade, cerca de 17 meses de idade, cerca de 18 meses de idade, cerca de 19 meses de idade, ou cerca de 20 meses de idade).
[0062] A vacina pode ser administrada por injeção, por exemplo, por via intradérmica, subcutânea, parenteral ou intramuscular.
[0063] A vacina pode compreender ainda excipientes farmaceuticamente aceitáveis diferentes, por exemplo, tampões, retificadores do pH e/ou osmolaridade e/ou conservantes. Por exemplo, Clorocresol pode ser usado como um conservante na quantidade de 0,01 a 0,5% por dose, mais preferivelmente 0,05 a 0,2%, o mais preferivelmente cerca de 0,1%.
[0064] Os exemplos abaixo são apresentados como modalidades ilustrativas, mas não devem ser tomados como limitantes do escopo da invenção. Várias alterações, variações, modificações e outros usos e aplicações desta invenção ficarão aparentes para aqueles versados na técnica.
[0065] Uma suspensão aquosa de DT-GnRH, CpG e TWEEN®80 foi homogeneizada a 11.000 rpm. No processo de homogeneização, a mistura 10:1 de fosfatidilcolina e colesterol foi adicionada. Esta mistura foi adicionalmente homogeneizada através da medição em uma fase oleosa, resultando em uma emulsão de água em óleo que contém 45% de óleo mineral, 1,45% de TWEEN® 80 e 6,3% de tensoativo SPAN®80.
[0066] A preparação de acordo com o Exemplo 1 foi colocada em frascos de vidro com 35% do tamanho nominal do frasco, isto é, 35 ml em um frasco de vidro de 100 ml e liofilizada por 60 horas e, finalmente, reconstituída em uma emulsão ISA50V2.
[0067] O gado foi gerenciado no pasto em um sistema de gerenciamento de pasto projetado com cerca e instalações de alta qualidade. A propriedade forneceu um abrigo natural adequado e o animal tinha acesso a água a vontade. A pastagem consistiu em centeio e trevo de boa qualidade.
[0068] Um total de 156 novilhas de cruzamento Bos indicus estavam disponíveis para a seleção. Os critérios usados para a inclusão no estudo eram o temperamento, a saúde de modo geral, condição corporal, estado sorológico anti-GnRH (Dia -28), peso corporal (Dia -7) e avaliação por ultrassom do aparelho reprodutor (Dia -6). Inicialmente, vários animais foram excluídos devido ao temperamento difícil, má condição corporal, um canal pélvico muito pequeno, gravidez precoce possível e/ou aparelho reprodutor anormal. Em segundo lugar, animais com um título DELFIA anti-GnRH de > 10.000 unidades no Dia -28 foram excluídos. As 126 novilhas restantes foram classificadas pelo peso corporal e os 100 melhores animais escolhidos pelo peso foram selecionados para o estudo, com um ponto de corte sendo de 243 kg. Um total de 10 animais selecionados para o estudo tinham um título positivo baixo anti-GnRH (média de 7922 – 9960) no Dia -28; entretanto, no dia 0 apenas dois desses animais tiveram um título positivo (títulos de 7953 e 10744, respectivamente).
[0069] Em adição às novilhas arroladas para o estudo, seis touros jovens saudáveis foram obtidos para introdução para as novilhas com 16 semanas depois da vacinação (em times rotativos de dois touros por time). Todos os touros foram testados e encontrados serem negativos quanto ao anticorpo BVDV.
[0070] O gado foi mantido em um sistema baseado em pastagem que reflete as condições tipicamente associadas com fazendas de gado de corte comerciais no sudeste da Austrália. Os animais foram pastoreados em um pasto melhorado e tiveram acesso irrestrito à água sem contaminação de efluentes. Durante o final do outono e inverno (Maio – Setembro) os animais do estudo tiveram alimentação suplementar com feno de aveia para manter a condição corporal.
[0071] Os animais foram alocados aleatoriamente em grupos de tratamento de acordo com um plano de randomização pelo Biometrics Representative. Os 100 animais selecionados para o estudo foram classificados em 20 blocos de 5 animais. Dentro de cada bloco, os 5 animais forma aleatoriamente alocados para um dos quatro grupos de tratamento (T01 – T04) ou para o pool de novilhas sentinelas, com um animal por grupo de tratamento e uma sentinela por bloco. O pool de 20 sentinelas foi alocado em pares (de acordo com a ordem do bloco), com um animal de cada par alocado aleatoriamente para o grupo sentinela NT1 e o outro alocado para o grupo sentinela NT2.
[0072] A configuração experimental está resumida na Tabela 1 acima.
[0073] Cada dose da Vacina A usada para o tratamento do grupo T02 continha 400μg/mL de GnRH-DT, 45% de Óleo Mineral 6VR, 6,3% de SPAN®80, 1,45% de TWEEN®80, 250μg/mL de CpG (SEQ ID NO: 8, grau de 85%), 0,075μg/mL de DEAE Dextrano, 0,1% de Clorocresol, 10mM PBS – QS. Os animais foram tratados com 1,0 mL SC no pescoço usando um vacinador seguro. A expressão “grau de 85%” como aplicado a CpG se refere a uma formulação que compreende 85% da sequência nomeada (nesse caso, SEQ ID NO: 8) e 15% de impurezas (frequentemente pequenos fragmentos) presentes de modo geral como resultado da síntese da SEQ ID NO: 8.
[0074] Cada dose da Vacina B usada para o tratamento do grupo T03 continha 400μg/mL de GnRF-DT, 12% de LIPOID S 100/Colesterol (10:1), 250μg/mL de CpG (SEQ ID NO: 8, grau de 85%), 0,1% de Clorocresol, 10mM PBS – QS, depois adicionada em ISA 50V2. Os animais foram tratados com 1,0 mL SC no pescoço usando um vacinador seguro.
[0075] A Vacina C usada para o tratamento do grupo T04 foi preparada de acordo com o Exemplo 1. Cada dose da vacina continha 800μg/mL de GnRF-DT, 12% de LIPOID S 100/Colesterol (10:1), 500μg/mL de CpG (SEQ ID NO: 8, grau de 85%), 0,1% de Clorocresol, 10mM PBS – QS, liofilizada, depois suspensa novamente em uma emulsão de ISA 50V2 (90%) contendo óleo mineral. Os animais foram tratados com 1,0 mL SC no pescoço usando um vacinador seguro.
[0076] Amostras de sangue foram coletadas dos animais do estudo conforme o calendário de eventos como descrito na tabela acima. Aproximadamente 4 a 9 mL de sangue foram coletados através de punção venosa na cauda ou jugular, em um tubo de separação de soro simples de 10 mL. Os tubos com sangue foram rotulados com um único número de identificação de amostra registrado contra o número de identificação do animal correspondente. As amostras de sangue foram deixadas descansar até que o sangue tivesse coagulado satisfatoriamente. As amostras de sangue foram então centrifugadas a 3000 rpm por pelo menos 7 minutos e o soro decantado em um tubo de soro simples com tampa de rosca marcado com o número do estudo, número da ID da amostra e data da coleta do sangue. As amostras de soro foram armazenadas a 2 – 7ºC antes da análise.
[0077] Os ensaios com anticorpo anti-GnRH foram realizados através de imunoensaios DELFIA®.
[0078] Os ensaios para progesterona foram realizados por dois métodos separados e independentes como a seguir:
- • kit comercial para ELISA (Demeditec Diagnostic GmbH, Kiel, Alemanha) de acordo com as instruções do kit e
- • Um ensaio de espectrometria de massa validado pelo laboratório.
[0079] O aparelho reprodutor (útero, ovários esquerdo e direito) de todas as novilhas, incluindo as sentinelas, foi avaliado pelo exame ultrassonográfico por via retal. O exame e a avaliação dos ovários não foi necessário para as novilhas prenhas. Para os animais determinados estarem grávidos, foi feita uma estimativa do estágio da gestação (em semanas). A estimativa do estágio da gestação desde o primeiro (o mais precoce) diagnóstico de gravidez foi usada para determinar a data estimada da concepção. Cada ovário foi avaliado separadamente quanto a presença de um corpo lúteo (sim/não) e a atividade folicular foi avaliada usando o seguinte esquema de pontuação (adaptado de Balet et al., 2014, Journal of Dairy Science; 97:2193-2203):
Escore 1 = Nenhum folículo presente
Escore 2 = Um ou mais folículos com diâmetro ≤5 mm
Escore 3 = Um ou mais folículos com diâmetro de 6 – 9 mm
Escore 4 = Um ou mais folículos com diâmetro ≥10 mm
Escore 1 = Nenhum folículo presente
Escore 2 = Um ou mais folículos com diâmetro ≤5 mm
Escore 3 = Um ou mais folículos com diâmetro de 6 – 9 mm
Escore 4 = Um ou mais folículos com diâmetro ≥10 mm
[0080] Nota: No Dia 168, a avaliação da gravidez (incluindo uma estimativa do estágio da gestação) foi realizada pela palpação retal manual e os ovários não foram examinados nesse ponto de tempo.
[0081] Todos os animais foram avaliados quanto a presença de edema/nódulo/lesão no local da injeção. A região do sítio da injeção (metade direita do pescoço) foi observada primeiro visualmente e a observação registrada como visível ou não. A área foi então palpada e o achado registrado como palpável ou não. Qualquer edema ou nódulo observado ou palpado foi medido em milímetros em três dimensões.
[0082] Dois grupos de 10 novilhas sentinelas (NT1 e NT2) foram selecionados aleatoriamente no momento do estudo de randomização principal antes do Dia 0. As novilhas sentinelas permaneceram com os animais do estudo até o momento da introdução do touro (Dia 112), em cujo momento elas foram movidas para um curral separado. O primeiro grupo de 10 novilhas sentinelas (grupo NT1) foi reintroduzido no grupo de animais do estudo no Dia 196 (12 semanas depois da introdução do touro) e o segundo grupo de 10 novilhas sentinelas (grupo NT2) foi reintroduzido no grupo de animais do estudo no Dia 280 (24 semanas depois da introdução do touro). O propósito das novilhas sentinelas foi o de confirmar a fertilidade contínua do sistema animal.
[0083] Para cada grupo de tratamento (T01 – T04) e ponto de tempo, a média geométrica do título de anticorpo anti-GnRH, limites superior e inferior de 95% do intervalo de confiança e valores mínimo e máximo são fornecidos nas tabelas 2-5, respectivamente.
[0084] No grupo T03, a média geométrica do título permaneceu acima de 30.000 da semana 2 até a semana 43, caindo para 28.962 na semana 52 depois da vacinação. No grupo T04, a média geométrica do título subiu para 39.105 na semana 2, depois permaneceu acima de 40.000 da sena 4 até a coleta final na semana 52.
[0085] A média geométrica dos títulos foram significativamente maiores em:
- • T03 e T04 comparados com o controle (T01) da semana 2 a semana 52.
- • T02 comparado com o controle (T01) da semana 2 a semana 12.
- • T03 comparado com T02 da semana 8 a semana 36 (ponto de tempo final para T02).
- • T04 comparado com T02 da semana 6 a semana 36 (ponto de tempo final para T02).
- • T04 comparado com T03 da semana 36 a semana 52.
[0086] Para cada grupo de tratamento (T01 – T04) e ponto de tempo, a média geométrica de ELISA para progesterona, limites superior e inferior de 95% do intervalo de confiança e valores mínimo e máximo são fornecidos nas tabelas 6-9, respectivamente.
[0087] Depois da vacinação, a média geométrica de ELISA para progesterona estava abaixo de 7 nmol/L no grupo T02 nas semanas 12 e 16; no grupo T03 da semana 12 a semana 43; e no grupo T04 da semana 12 a semana 52 (exceto na semana 24 quando estava em 7,2 nmol/L). Considerando os pontos de tempo do Dia 0 ao Dia 112 (semana 16) apenas, os níveis da média geométrica de ELISA para progesterona foram significativamente menores em:
- • T01 (controle) comparado com T02 na semana 2.
- • T02 comparado com o controle (T01) na semana 8 e semana 12.
- • T03 e T04 comparados com o controle (T01) na semana 12 e semana 16.
- • T03 comparado com T02 na semana 16.
[0088] Para cada grupo de tratamento (T01 – T04) e ponto de tempo, a média geométrica para a progesterona por espectrometria de massa (MS), limites superior e inferior de 95% do intervalo de confiança e valores mínimo e máximo são fornecidos nas tabelas 10-13, respectivamente. 
[0089] Depois da vacinação, a média geométrica MS da progesterona estava abaixo de 0,3 nmol/L no grupo T02 nas semanas 8, 16 e 20; no grupo T03 da semana 12 a semana 43 (exceto na semana 36 quando ela estava em 0,71 nmol/L); e no grupo T04 da semana 4 a semana 43. Considerando os pontos de tempo do Dia 0 ao Dia 112 (semana 16) apenas, os níveis da média geométrica de ELISA para progesterona foram significativamente menores em:
- • Controle (T01) comparado com T02 na semana 2.
- • T03 comparado com o controle (T01) na semana 12 e semana 16.
- • T04 comparado com o controle (T01) na semana 10, 12 e 16.
- • T02 comparado com T03 na semana 8.
- • T04 comparado com T03 na semana 8.
- • T04 comparado com T02 nas semanas 12 e 16.
[0090] No grupo T04, todos os animais tinham um nível de progesterona sérica abaixo de 2 nmol/L da semana 20 a semana 43, com 19/20 animais atingindo esse nível de supressão na semana 16.
[0091] No grupo de controle com placebo (T01) 12/20 animais (60%) conceberam dentro de 9 semanas, 16/20 animais (80%) conceberam dentro de 16 semanas e 20/20 animais (100%) conceberam dentro de 24 semanas da introdução dos touros. As novilhas do grupo T02 conceberam em uma taxa similar aos controles com placebo, com 16/20 (80%) prenhas dentro de 24 semanas da introdução dos touros. Em contraste, o número de animais que engravidaram nos grupos T03 e T04 foi acentuadamente menor.
[0092] Ocorreram diferenças estatisticamente significativas (p,0,0001) na taxa cumulativa de concepção, usando os testes de Wilcox (ajustado para comparações múltiplas) com base nas estimativas de Kaplan-Meier da curva de sobrevida, entre o grupo de controle (T01) e os grupos vacinados T03 e T04.
[0093] Similarmente, a taxa cumulativa de concepção nos grupos T03 e T04 foi significativamente menor (p≤0,0006) do que no grupo T02. Não houve diferenças significativas em termos de curvas de sobrevida entre os grupos T01 e T02 ou entre os grupos T03 e T04.
[0094] A Tabela 14 mostra a taxa global de gravidez, com base na data estimada da concepção para os grupos T01, T03 e T04 em quatro pontos de tempo selecionados depois da vacinação, isto é, 6 meses (semana 26), 9 meses (semana 39), 12 meses (semana 52) e 15 meses (semana 65). A eficácia da vacina em cada ponto de tempo foi calculado usando a seguinte fórmula: 
[0095] A análise de animais individuais revelou que o título de anticorpo anti-GnRH de cada animal que concebeu no grupo T03 (n=7) e grupo T04 (n=4) caiu abaixo de 40.000 no ponto de tempo da amostragem imediatamente antes da (ou na semana da) concepção, com apenas duas exceções. Em uma destas exceções, o título de anticorpo foi de 41.833; entretanto, este animal não concebeu até a semana 65, algumas 13 semanas depois da amostra de sangue final. A tendência dos títulos de anticorpo neste animal era de declínio constante a partir da semana 16, tal que é possível que o título caia abaixo de 40.000 no período entre a amostra de sangue final e a semana estimada da concepção.
[0096] Os resultados desse estudo de rastreamento de formulação indicam que, depois da administração de uma única dose subcutânea a novilhas de cruzamento peri-púberes de Bos indicus, duas das três candidatas a vacina investigadas nesse estudo (Vacina B e Vacina C) produziram um efeito contraceptivo significativo por um período de 9 a 12 meses. A Vacina A não foi eficaz.
[0097] Com base na medida do resultado primário (isto é, prevenção de gravidez em comparação com um grupo de controle não vacinado), a eficácia da Vacina B (grupo T03) foi de 92,3% em 6 meses, 88,9% em 9 meses e 75% em 12 meses depois da vacinação; enquanto que a eficácia da Vacina C (grupo T04) foi de 100% em 6 meses, 100% em 9 meses e 89,5% em 12 meses depois da vacinação. O efeito contraceptivo de cada candidata à formulação de vacina continuou a declinar depois de 12 meses, com eficácia em 15 meses depois da vacinação sendo de 63,2% para a Vacina B e 78,9% para a Vacina C. As diferenças na taxa global de gravidez para cada um dos grupos T03 e T04, comparados com o grupo de controle (T01), foram estatisticamente significativas.
[0098] A taxa e o tamanho das reações no local da injeção observados nesse estudo estavam dentro dos limites aceitáveis como definido no perfil do produto para o mercado alvo. Uma melhora substancial na reatividade do sítio da injeção foi vista nesse estudo comparada com as formulações candidatas anteriores que continham diferentes excipientes e adjuvantes. Um animal apresentou um grave efeito adverso (doença respiratória bovina) que requereu sua remoção do estudo, mas isto foi considerado improvável estar relacionado à vacina de teste.
[0099] Todas as publicações citadas no pedido, ambas as publicações de patente e publicações de não patente são indicativas do nível de experiência daqueles versados na técnica a qual essa invenção pertence. Todas essas publicações estão completamente incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual estivesse especificamente e individualmente indicada como estando incorporada por referência.
Apesar da invenção ter sido descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que essas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve ser entendido que numerosas modificações podem ser feitas nas modalidades ilustrativas e que outros arranjos podem ser planejados sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção como definida pelas reivindicações a seguir.
Apesar da invenção ter sido descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que essas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve ser entendido que numerosas modificações podem ser feitas nas modalidades ilustrativas e que outros arranjos podem ser planejados sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção como definida pelas reivindicações a seguir.
Claims (16)
- Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende:
- a) um antígeno que compreende GnRH,
- b) um adjuvante que compreende um oligonucleotídeo imunoestimulador que contém CpG, um esterol, um fosfolipídeo e um óleo.
- Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que GnRH está conjugado a uma toxina.
- Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o esterol é o colesterol.
- Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo compreende fosfatidilcolina.
- Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende 0 a 2% de água.
- Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é preparada por um método que compreende as etapas de:
- a) preparar uma subsolução pela mistura de fosfatidilcolina, esterol, um oligonucleotídeo imunoestimulador que contém CpG e o antígeno;
- b) microfluidizar a subsolução;
- c) preparar niossomas pela liofilização da subsolução microfluidizada;
- d) reconstituir os niossomas no óleo ou na emulsão de A/O.
- Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a etapa de preparação da subsolução compreende misturar o esterol e o fosfolipídeo, esterilizar por filtração a mistura de esterol e fosfolipídeo e misturar a mistura esterilizada por filtração de esterolfosfolipídeo com uma solução aquosa que compreende CpG que contém o oligonucleotídeo imunoestimulador e o GnRH.
- Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ser eficaz como uma vacina de dose única.
- Método de preparação da vacina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende:
- a) preparar uma subsolução pela mistura de fosfatidilcolina, esterol, um oligonucleotídeo imunoestimulador que contém CpG e o antígeno;
- b) microfluidizar a subsolução;
- c) preparar niossomas pela liofilização da subsolução microfluidizada;
- d) reconstituir os niossomas no óleo ou na emulsão de A/O.
- Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação da subsolução compreende misturar o esterol e o fosfolipídeo, esterilizar por filtração a mistura de esterol e fosfolipídeo e misturar a mistura esterilizada por filtração de esterolfosfolipídeo com uma solução aquosa que compreende CpG que contém o oligonucleotídeo imunoestimulador e o GnRH.
- Uso da vacina, como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para a supressão da fertilidade ou para a suspensão da função ovariana em uma novilha ou vaca não prenha.
- Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita novilha ou vaca não prenha tem pelo menos 6 meses de idade.
- Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a dita novilha ou vaca não prenha tem pelo menos 15 meses de idade.
- Uso da vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser para a supressão da função testicular e para a melhora da qualidade da carcaça em um indivíduo bovino macho.
- Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo bovino macho tem pelo menos 10 meses de idade.
- Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo bovino macho tem pelo menos 13 meses de idade.
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|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |