BR102018073308A2 - Emulsificação de alfa toxina inativada de c. novyi formulado em emulsão água-óleo (w/o) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses - Google Patents

Abstract

emulsificação de alfa toxina inativada de c. novyi formulado em emulsão água-óleo (w/o) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses. a presente invenção refere-se a um novo método para a emulsificação de toxina inativada de clostridium novyi typo b (c. novyi) em emulsão agua-oleo (w/o) na proporção de 40/60, sendo aplicável em etapas de formulação de vacinas de múltiplos antígenos. o invento descreve o método de obtenção da emulsão w/o com fração oleosa composta do adjuvante montanide isa 61 vg (adjuvante isa) e fração aquosa a alfa toxina inativada de c.novyi tipo b. definiu a emulsão água-óleo (w/o), na proporção 40% de antígeno inativado (alfa toxina inativada) e 60% óleo mineral adjuvante isa. a emulsificação com antígeno inativado apresenta o caráter inovador na etapa de adsorção de antígenos, sendo importante para garantir alta eficácia vacinal com ganhos e interesse industrial para melhoria das vacinas empregadas atualmente. na presente invenção utilizamos camundongos swiss para avaliar a prova de conceito e emprego da emulsão contendo a alfa toxina inativada e descrever seu potencial uso no controle de necrose hepática de ruminantes e pequeno ruminantes. a emulsão empregada não provocou efeito adversos após etapa de analises de inoculação, e provocou estimulo do sistema imunológico de swiss imunizados quando associado a alfa toxina inativada. assim, o método pode ser empregado e possui interesse industrial sendo uma alternativa segura para a fabricação de vacinas contra clostridioses.

Description

EMULSIFICAÇÃO DE ALFA TOXINA INATIVADA DE C. NOVYI FORMULADO EM EMULSÃO ÁGUA-ÓLEO (W/O) 40/60 APLICÁVEL PARA FABRICAÇÃO DE VACINAS DE MÚLTIPLOS ANTÍGENOS CONTRA CLOSTRIDIOSES 1. ESTADO DA TÉCNICA DE VACINAS DE MÚLTIPLOS ANTÍGENOS VISANDO O CONTROLE DE CLOSTRIDIOSES.

[001] Bactérias do gênero Clostridium são classificadas como anaeróbios estritos, Gram positivas e produtoras de potentes exotoxinas causadoras de doenças em seres humanos e animais domésticos (Ma et al., 2007; Aronoff, 2013; Aquino et al., 2016; Navarro et al., 2017; Walker et al., 2016). A espécie Clostridium novyi (C. novyi) é comumente encontrada na flora do trato gastrointestinal animal e humano, trato genital feminino e uretra (Ma et al., 2007; Lobato et al., 2013).

[002] O C. novyi pode ser classificado em quatros tipos com base na produção de toxinas: A, B, C e D, sendo o C. novyi tipo D reconhecido como C. haemolyticum. Essas potentes exotoxinas geralmente medeiam a patogênese da clostridioses (Uzal et al., 2010; Navarro et al., 2017). A alfa toxina é produzida pelo C. novyi tipo A e B, e a beta toxina por C. novyi tipo B e D. A alfa toxina é classificada como letal; e a beta toxina, classificada como necrotizante e hemolítica (Navarro et al., 2017).

[003] Alfa toxina de C. novyi tipo B faz parte do grupo das grandes toxinas clostridiais com 2178 resíduos de aminoácidos com massa molecular compreendida entre 260 a 280 kDa (Pietrzykowski et al., 1991; Hofmann et al., 1995). É classificada como glicosiltransferase, responsável por catalisar a glicosilação de pequenas GTPases. É a mais atuante na patogenia do agente e se destaca por sua ação necrosante, letal e aumento da permeabilidade vascular (Ma et al., 2007; Uzal et al., 2010). Além disso, provoca a inativação das proteínas presentes no citoesqueleto e a desorganização dos filamentos de actina com o arredondamento celular, perda das junções intercelulares e aumento da permeabilidade endotelial (Lima et al., 2011; Gonçalves et al., 2013).

[004] Vacinas comerciais utilizadas na imunização de ruminantes e pequenos ruminantes contem toxinas inativadas sendo composta por múltiplos antígenos e empregada no controle da clostridioses. A composição visa controle de necroses, enterotoxemia, hemoglobinúria bacilar, botulismo e tétano. Todas são classificadas como polivalentes com exceção de duas vacinas monovalentes para C. chauvoei. O principal adjuvante empregado no mercado farmacêutico veterinário é composto por hidróxido de alumínio solúvel até a proporção de 25% da composição vacinal (Lobato et al., 2008; Lima et al., 2011; Lobato et al., 2013).

1.1 Formulações vacinais compostas de múltiplos antígenos

[005] No Brasil são produzidos cerca de 150 milhões de doses de vacinas clostridiais por ano e são controlados pelos órgãos oficiais os imunógenos de C. chauvoei e C. botulinum (Lobato et al., 2008; Lima et al., 2011; Lobato et al., 2013). A imunização dos animais, na maioria das vezes, é realizada com uso de toxinas inativadas concentradas e adsorvidas em hidróxido de alumínio (25%v/v) em duas doses vacinais e podem conferir imunidade do animal por até um ano (Lobato et al., 2013).

[006] O mercado farmacêutico veterinário vem apresentando crescimento devido a demanda do segmento de animais de produção, em particular à pecuária (IFAH, 2013). Esse mercado é dominado por empresas multinacionais com sede em países desenvolvidos, como Estados Unidos, França, Alemanha e Suíça. Os principais produtores de vacinas comercializadas no Brasil são as multinacionais Zoetis (Pfizer Animal Health), MSD (Animal Health), Merial (Sanofi-Aventis), Bayer Animal Health e Novartis Animal Health, além das nacionais Ouro fino Agronegócio, Vallée e Hertape Calier (Sindan, 2017).

[007] As normas para o controle de qualidade das vacinas são definidas pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL, 1997). A administração das vacinas clostridiais deve ser feita por via subcutânea com duas doses intercaladas com reforço 12 meses após a primeira imunização (Lobato et al., 2013). Em referência a alfa toxina inativada de C. novyi tipo B há necessidade de melhoria devido constante casos de baixa eficiência deste imunógeno em produtos à venda no mercado nacional (Nascimento et al. 2004).

1.2 Adjuvantes vacinais empregadas na indústria farmacêutica veterinária

[008] O adjuvante é um dos fatores mais importantes na composição vacinal e está diretamente ligado ao aumento da imunogenicidade das vacinas. A indução de respostas imunes fortes e duradouras requer adjuvantes potentes e seguros. Vacinas veterinárias empregam, na maioria das vezes, auxiliares à base de alumínio (Park et al., 2008). Vacinas com antígenos adsorvidos induzem respostas imunes e provocam proteção do organismo. Eles iniciam a resposta inata, e desempenhará um papel na ativação da resposta imune adaptativa no organismo imunizado (Veenstra et al., 2017).

[009] Adjuvantes à base de alumínio possuem diversas desvantagens, tais como a indução de respostas de anticorpos de curta duração que levam a revacinações frequentes, além de efeitos colaterais. Em contraste, adjuvantes à base de óleo possuem a vantagem de induzir títulos elevados e respostas de anticorpos de longa duração que levam a uma proteção efetiva (Park et al., 2008; Khorasani et al., 2016). A escolha entre adjuvantes deve ser feita com eficácia e segurança. Adjuvantes de óleo mineral induzem alto teor de anticorpos que persistem por longos períodos de tempo. No entanto, os adjuvantes podem ser responsáveis por reações locais e sistêmicas, como inflamação local, úlceras, febre e anafilaxia. Esses sintomas podem limitar a aceitação destas vacinas pelos agricultores. Assim, se torna necessário o estudo experimental visando a definição de concentrações seguras e eficazes para uso de adjuvantes oleosos em vacinas veterinárias (Petermann et al., 2017).

1.3 Principais empresas produtoras de vacinas contendo o imunógeno de C. novyi tipo B.

[010] Vacinas comumente empregadas para o controle da hepatite necrótica são constituídas de múltiplos antígenos e adsorvidas em hidróxido de alumínio podendo ocorrer interações entre antígenos acarretando baixa eficácia na proteção animal (Lobato et al., 2008; Lima et al., 2011; Lobato et al., 2013). Além disso, adjuvantes aquosos induzem resposta imunológica de curta duração e aumento do manejo animal em etapas de revacinações (Park et al., 2008; Khorasani et al., 2016).

[011] Alternativas que visem a redução do manejo animal, bem como a eliminação de interações entre antígenos são medidas necessárias para melhorias de composições vacinais de múltiplos antígenos (Khorasani et al., 2016). Assim, a emulsificação de antígenos pode ser uma alternativa promissora para melhoria da eficácia vacinal, redução do manejo e stress animal com indução de estímulos protetores por longos períodos (Brudeseth et al., 2013). A liberação controlada de antígenos na emulsão vacinal provoca uma massa semissólida no local da aplicação liberando lentamente o antígeno com aumento da resposta humoral (Tehrani et al., 2016; Veenstra et al., 2017). Antígenos emulsificados iniciam a resposta inata que desempenha um papel na ativação da resposta imune adaptativa liberando citocinas pró-inflamatórias que atraem células inflamatórias e células apresentadoras de antígeno (APC) (Grun; Maurer, 1989). Entretanto, é necessário estabelecer concentrações da fração oleosa adequadas para minimizar efeitos adversos e propiciar a proteção animal (Khorasani et al., 2016; Petermann et al., 2017).

[012] A multinacional Zoetis (Pfizer Animal Health) produz (2) duas vacinas para controle da necrose hepática, a Fortress® 7 e a Fortress® 8, ambas de aplicação via subcutânea com reforço em 21 dias. Os produtos são constituídos de culturas padronizadas e inativadas de C. chauvoei, C. novyi, C. septicum, C. sordellii, C. perfringens (tipos C e D), utilizando saponina como adjuvante. A Merial (Sanofi-Aventis) produz as vacinas Sintoxan® 9TH, Sintoxan® polivalente e Sintoxan® polivalente T, ambas com aplicação de (2) duas doses com um intervalo de 4 a 6 semanas.

[013] A nacional Ourofino Agronegócios produz a Ourovac POLI BT, uma vacina polivalente contra clostridioses incluindo a necrose hepática. Possui em sua composição toxóides de C. septicum, C. novyi tipo B, C. sordellii, C. perfringens tipos C e D, C. tetani, C. botulinum tipos C e D e a cultura de C. chauvoei. A aplicação é por via subcultânea com intervalo de 4 semanas para o reforço contendo o adjuvante hidróxido de alumínio. A Vallée (MSD Saúde Animal) produz a Poli-Star, vacina de múltiplo antígeno e que contém o imunógeno de C.noyvi para o controle da necrose hepática. Sua composição consiste em uma cultura inativada de C. chauvoei e toxóides de C. botulinum tipo C e D, C. septicum, C. novyi, C. perfringens tipo B, C e D e C. sordelli, formuladas com o adjuvante hidróxido de alumínio 25% v/v. A administração é por via subcutânea e é necessário um reforço após 4 semanas. A indústria Hertape Calier produz a Botulinomax no controle de botulismo e clostridioses, incluindo a necrose hepática. Sua composição consiste em suspensões de toxóides e bacterinas de C. chauvoei, C. novyi, C. perfringens tipo B, C. perfringens tipos C e D, C. septicum, C. sordellii, C. botulinum tipos C e D, adsorvidas pelo gel de fosfato de alumínio com função adjuvante. A aplicação é feita por via subcutânea e a reaplicação é feita em 4 semanas (Zoetis, 2017; Merial, 2017; Ourofino, 2017; Vallée, 2017; Hertape, 2017). Todas as vacinas são constituídas com hidróxido de alumínio. E o uso de adjuvante oleoso na proporção 40/60 é uma novidade na etapa de emulsificação e que contribuirá no manejo animal e na eficiência vacinal.

1.4 Adjuvantes oleosos

[014] Adjuvantes da classe Montanide são caracterizados por serem adjuvantes incompletos desenvolvidos pela indústria Seppic. São compostos por um óleo metabolizável natural e um emulsionante altamente refinado da família de monooleato manide. Esses adjuvantes combinam diferentes tensoativos com um óleo mineral não metabolizável, um óleo metabolizável ou uma mistura dos dois óleos. Formulações de vacinas com Montanide induzem uma imunidade forte e de longo prazo, com alta capacidade de estímulos e com efeitos secundários menores (SEPPIC, 2010; Tehrani et al., 2016).

[015] O Montanide ISA 61 VG é um novo adjuvante à base de óleo mineral, desenvolvido pela Seppic. Possui as características de ser emulsão água-em-óleo robusto (W/O), estável e de fácil inoculação (SEPPIC, 2010; Khorasani et al., 2016). Este adjuvante (ISA 61 VG) foi empregado no desenvolvimento deste trabalho.

1.5 Emulsões W/O

[016] Vacinas emulsionadas água-em-óleo são comercializadas a mais de duas décadas devido a sua rentabilidade, estabilidade e capacidade de conferir imunidade em longo prazo. Adjuvantes oleosos emulsionados influenciam o antígeno no tempo, local e concentração através do "efeito depósito". A emulsão forma uma massa semissólida no local da injeção liberando lentamente o antígeno no tecido ou sangue, aumentando e prolongando a resposta humoral (Tehrani et al., 2016; Veenstra et al., 2017).

[017] A nanotecnologia tem grande importância no desenvolvimento de adjuvantes vacinais, especificamente os adjuvantes em emulsão. Possuem alta estabilidade termodinâmica, são transparentes, isotrópicos e apresentam dispersões coloidais de baixa viscosidade. Devido à alta capacidade de solubilização e estabilidade termodinâmica, estes sistemas são atraentes em formulação adjuvante, possuindo vantagens de boa capacidade de injeção devido ao baixo teor de óleo e viscosidade, podendo facilmente apresentar o antígeno no local da aplicação (Leclercq et al., 2011; Sun et al., 2015).

[018] Antígenos com adjuvantes emulsificados desempenham um papel na ativação da resposta imune adaptativa, estimulando componentes específicos da resposta imune humoral ou mediada por células. O sistema imune libera citocinas pró-inflamatórias que atraem células inflamatórias e células apresentadoras de antígeno (APC) (Grun e Maurer, 1989). As APCs facilitam a apresentação do antígeno às células T. Quando células T se encontram ativas elas irão auxiliar na proliferação de células B e na produção de anticorpos. (Veenstra et al., 2017).

2. DETALHES DA INVENÇÃO 2.1 Produção, inativação de alfa toxina de C. novyi tipo B e a características físicas da emulsão agua-óleo (W/O) 40/60

[019] A alfa toxina produzida por C. novyi tipo B foi inativada com 0,6% v/v de formaldeído sob agitação por 7 dias e incubada à 37°C. Após a inativação a alfa toxina foi empregada como antígeno sob a forma emulsionada em adjuvante ISA (MONTANIDE ™ ISA 61 VG, Seppic, Brasil) (Figura 1). A fase aquosa foi constituída de 40% e a fração oleosa 60% (ISA). Seringas estéreis conectadas por uma mangueira de silicone foram empregadas para o desenvolvimento da emulsão W/O 40/60 com sucessivas passagens. A figura 2 mostra o fluxograma de analise de preparação da formulação vacinal, analise da emulsão obtida e os parâmetros experimentais avaliados. As características físicas da emulsão foram avaliadas na presença e ausência de toxina alfa inativada, como medidas de diâmetro das gotículas de emulsão, avaliando entrega do antígeno no local da aplicação; o Potencial Zeta (ZP), e a estabilidade da emulsão (Figura 3).

[020] O tamanho, intensidade e ZP são parâmetros que permitem analisar as interações, transporte de moléculas e a disponibilidade de antígeno no sítio de imunização (Veenstra et al., 2017). Valores de ZP está diretamente relacionado aos aspectos de estabilidade de produtos, sendo obtida pela relação de forças de repulsão entre partículas carregadas que evita a tendência natural à agregação (Sun et al., 2015). Aqui, a emulsão W/O 40/60 com alfa toxina inativada apresentou valor de ZP maior em comparação com a emulsão sem a alfa toxina inativada (Figura 3). Estes aspectos são relevantes sinalizando estabilidade do produto, liberação controlada e estímulo da resposta imune (Tehrani et al., 2016; Veenstra et al., 2017).

2.2 Uso de animais e termo de autorização de Comitê de Pesquisa em experimentação animal.

[021] Camundongos fêmeas da raça Swiss (Mus musculus), pesando entre 17 e 23 gramas, foram adquiridos do Hospital Central Goat de Goiânia - GO da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura, luminosidade e odor. Eles receberam alimentação (Biobase® - Brasil) e água purificada continuadamente. Os animais foram mantidos por um período de quarentena de 7 dias antes do início dos experimentos. O estudo foi autorizado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal do Tocantins (UFT) sob o número 23.101.006.832/2017-53 de acordo com as recomendações internacionais de ética em experimentação animal.

2.3 Antigenicidade e imunogenicidade da formulação vacinal

[022] A caracterização da alfa toxina inativada foi realizada por SDS/PAGE e a antigenicidade por imunoblotting. Camundongos fêmeas Mus musculus da linhagem Swiss foram separados em três grupos (PBS, Adjuvante e Imunizado) com 10 animais por grupo, imunizados nos tempos 0D, 21D, 42D por via intramuscular aplicados na coxa direita (Figura – 4 A e B).

[023] Os grupos experimentais foram desafiados com 157 DL50.g-1 após 7 dias da última imunização. Animais doentes foram anestesiados e eutanasiados, determinando a curva de sobrevivência Kaplan-Meier (Figura – 4 F). A inocuidade foi avaliada com análises do local da administração (coxa direita dos animais) visando assegurar os níveis seguro da concentração do adjuvante na formulação (Figura – 5).

[024] A imunogenicidade foi realizada com soro de animais dos grupos experimentais após a última imunização (42D), soro de animais saudáveis e doentes. Os soros foram diluídos nas concentrações de 1:100 a 1:800 e avaliados comparando a indução e proteção com a alfa toxina ativa e inativada (Figura – 4 C e D).

[025] Ao término da última imunização (42D) a eficácia vacinal foi determinada. Assim, os grupos experimentais foram desafiados com dose letal de alfa toxina ativa (157DL50.g1 ), determinando a eficácia vacinal pela curva não-paramétrica de Kaplan-Meier que estima a taxa de sobrevivência, tempo de sobrevivência e permite uma interpretação do efeito da concentração de antígenos empregado na emulsão W/O 40/60. 100% de mortes foram registrados nos grupos PBS (24 horas) e grupo de animais inoculados somente com adjuvante ISA 61 VG (44 horas) comprovando efeito letal da concentração da alfa toxina ativa empregada nesta fase. Em animais imunizados o efeito combinado da alfa toxina inativada na emulsão W/O estimularam maior produção de anticorpos e maior tempo e taxa de sobrevivência em comparação aos grupos PBS e adjuvante (ISA 61 VG). Entretanto, estes estímulos em animais imunizados não foram suficientes para proteção total sendo explicada pela baixa presença da alfa toxina inativada na emulsão W/O.

2.4 Dados morfológicos hematológicos e Função hepática

[026] A inocuidade da emulsão foi determinada após 7 dias após a última imunização (42D), avaliando a ocorrência de danos morfológicos no local da administração (coxa direita) e a analises de fígado e baço (Figura 5). O quadro clínico, toxicológico e a expansão de tamanho do baço de animais imunizados sugerem estímulos provocados pela resposta imunológica. Assim, verificamos que a emulsificação da alfa toxina inativada não provocaram efeitos adversos no local da administração. O menor peso de fígado de Swiss imunizados sugere ausência de hipertrofia ou congestão (Messias et al., 2010; Marques et al., 2012). No baço, as análises demostraram maior expansão morfológica e peso para os animais do grupo imunizado, sugerindo efeito provocados em resposta aos estímulos antigênicos com aumento de células apresentadoras de antígenos no local, hiperplasia na polpa branca caracterizada pelo aumento da celularidade (Messias et al., 2010; Marques et al., 2012; Cangussu et al., 2018).

[027] Alterações bioquímicas da aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT) e fosfatase alcalina (FA) determinam lesões hepatocelulares e permeabilidade de hepatócitos. Aqui, os níveis de AST, ALT e FA dos animais doentes (grupo PBS) foram elevados e significativos comparado aos animais imunizados e animais do grupo adjuvante (Figura – 6). Isto sugere elevada atividade metabólica no sangue sugerindo necrose ou moléstia nos tecidos alvos (Messias et al., 2010). Na análise hematológica também verificamos níveis elevados e significativos de hemoglobina e hematócrito em sangue de animais doentes sugerindo quadro de policitemias.

[028] A presente invenção comprova que o uso de alfa toxina inativada em emulsão W/O 40/60 é segura e tem capacidade de estimular respostas imunes em camundongos Swiss. É necessário o ajuste da concentração da alfa toxina inativada na fração aquosa (40%) para aumentar o efeito protetor. Entretanto, esses achados é uma alternativa inovadora na etapa de adsorção de antígenos para a fabricação de vacinas com múltiplos antígenos e representam avanços tecnológicos na imunização de animais para o controle das clostridioses de ruminantes e pequenos ruminantes.

Claims (5)

1. Emulsificação de alfa toxina inativada de C. novyi formulado em emulsão água-óleo (W/O) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses caracterizado por associação da alfa toxina inativada presente na fração aquosa com fração oleosa que induzem a resposta imunológica de camundongos Swiss sem ocorrência de efeitos adversos no local de inoculação
2. Emulsificação de alfa toxina inativada de C. novyi formulado em emulsão água-óleo (W/O) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses caracterizado por fração aquosa a 40% contendo o antígeno inativado e uma fração oleosa à 60% composta de óleo metabolizável natural e um emulsionante altamente refinado da família de monooleato manide
3. Emulsificação de alfa toxina inativada de C. novyi formulado em emulsão água-óleo (W/O) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses descrita na reivindicação 2 caracterizado por alfa toxina inativada de Clostridium sp
4. Emulsificação de alfa toxina inativada de C. novyi formulado em emulsão água-óleo (W/O) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses descrita na reivindicação 3 e caracterizado por uso no controle da clostridioses contra clostridioses
5. Emulsificação de alfa toxina inativada de C. novyi formulado em emulsão água-óleo (W/O) 40/60 aplicável para fabricação de vacinas de múltiplos antígenos contra clostridioses descrita na reivindicação 4 e caracterizado por uso no controle de necrose hepática em ruminantes e pequenos ruminantes

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