BR102018004676A2 - Microrganismo com vias metabólicas sintéticas otimizado para produção de l-lisina a partir de multiplas fontes de carbono - Google Patents

Microrganismo com vias metabólicas sintéticas otimizado para produção de l-lisina a partir de multiplas fontes de carbono Download PDF

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Abstract

a presente invenção se refere a estirpes da bactéria escherichia coli otimizadas para a utilização eficiente de glucose, glicerol, xilose e arabinose como fontes de carbono visando a produção de l-lisina, além da superexpressão e repressão/deleção de determinados genes visando otimizar o processo fermentativo para produção do referido aminoácido. a presente invenção descreve um microrganismo modificado através de uma metodologia baseada na técnica mage (multiplex automated genomic engineering) como ferramenta para a geração de mutações aleatórias em genes específicos utilizando a dna polimerase humana ¿ para a geração de fragmentos alterados. a técnica descrita para a obtenção do microrganismo é utilizada em conjunto com recombinases virais visando a integração dos fragmentos mutados ao cromossomo de estirpes da bactéria e. coli. além disso, é utilizado o sistema de edição gênica baseado na tecnologia crispr/cas9 para a interação de genes a serem superexpressos em alvos pré-determinados a serem excluidos do genoma das estirpes descritas nesta patente. as alterações gênicas favoráveis ao fenótipo desejado constituem rotas metabólicas sintéticas que permitem a viabilização de processos fermentativos para a produção de l-lisina em escala industrial.

Description

MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MÚLTIPLAS FONTES DE CARBONO
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA [001 ] O desenvolvimento de processos fermentativos utilizando bactérias, como a Escherichia coli, é largamente empregado visando a produção de biomoléculas, como aminoácidos, ácidos orgânicos, entre outras (Wendisch et al., 2016).
[002] Para atingir níveis desejados para a produção de bioprodutos, é muito comum o uso de ferramentas de biologia molecular para a realizar modificações genéticas específicas em vias metabólicas conhecidas, tornando assim o microrganismo em questão apto para o uso em escala industrial.
[003] As modificações genéticas podem incluir deleções de genes inteiros ou parte deles, inclusão de genes do próprio microrganismo ou genes heterólogos, provenientes de outros organismos, e ainda a regulação da expressão gênica através da modificação de regiões promotoras a fim de permitir a expressão constitutiva de um determinado gene, ou a diminuição desta, levando a níveis basais de expressão. Também é comum o uso de modelos computacionais que permitem a simulação destas modificações genéticas visando a obtenção de informações específicas sobre o comportamento do microrganismo frente a modificação desejada (Wright, 2000, Edwards et al., 2002).
[004] No âmbito industrial, é importante que um microrganismo, mesmo que este possua diversas modificações genéticas, seja capaz de metabolizar diferentes moléculas como fonte de carbono. Neste quesito, as estirpes de E. coli são vantajosas em relação a outros microrganismos utilizados na indústria, como Corynebacterium glutamicum e Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, pois naturalmente são capazes
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2/50 de utilizar glicose, glicerol, arabinose, xilose e outras moléculas como fontes de carbono.
[005] A possibilidade de utilizar fontes de carbono variadas permite que o microrganismo seja mantido em produção mesmo na ausência de fontes puras de carbono e ainda permite o uso de resíduos da indústria de biocombustíveis, resíduos de indústrias de papel e celulose, entre outras.
[006] O uso das fontes puras faz com que, normalmente, a purificação do produto final ocorra de maneira mais simplificada, porém os processos de purificação estão cada vez mais robustos, fazendo com que, independente da fonte de carbono inicial, pura ou não, o processo de finalização do produto seja o mesmo, mantendo a qualidade e as características do produto final.
[007] Mesmo a E. coli sendo capaz de metabolizar todos diversas fontes de carbono, ela não é capaz de consumi-las de forma simultânea, de modo que a fonte de carbono preferencial a ser utilizada é a glicose, responsável por suprimir a expressão de genes associados ao metabolismo de glicerol, arabinose e xilose em um fenômeno conhecido como repressão catabólica (Aidelberg et al., 2014, Desai e Rao, 2009).
[008] A produção de aminoácidos por métodos fermentativos envolve processos muito difundidos. O principal organismo para a produção de aminoácidos é a bactéria C. glutamicum, de modo que sua aplicação principal é a produção de L-lisina. Contudo, para o processo fermentativo ser eficiente e comercialmente viável, estirpes desta espécie foram submetidas a modificações genéticas a fim de atingir os níveis de produção desejados. Diversas patentes descrevem as modificações e vias metabólicas para a produção de aminoácidos em C. glutamicum, como por exemplo as patentes WO 02/10209, WO2006/008097, WO2005/059093, que revelam detalhes funcionais dos fatores regulatórios envolvidos no controle da síntese de L-lisina. Além disso, as patentes US005661012, US2010190216 e US2010173368 discorrem sobre a modificação da enzima aspartoquinase III, produto do gene lysC, a qual é desensibilizada
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3/50 para a L-lisina, de modo a permanecer parcialmente ativa mesmo na presença de altas concentrações de lisina. A patente US20150337346 descreve uma nova mutação também na aspartoquinase III, de modo que a enzima possui maior resistência à inibição por L-lisina, tornando o processo de produção deste aminoácido mais eficiente. Além disso, esta patente discorre sobre outros genes centrais para o metabolismo de síntese da L-lisina em E. coli, descrevendo um processo fermentativo altamente eficiente para a produção do referido aminoácido em outro organismo que não a bactéria C. glutamicum.
[009] Além das modificações envolvendo a via metabólica diretamente relacionada à determinados aminoácidos, modificações genéticas são amplamente empregadas para que a C. glutamicum seja capaz de metabolizar outras fontes de carbono diferentes de glicose. A patente US939984E2 discorre sobre a superexpressão dos genes xylA e xylB de E. coli em C. glutamicum, por exemplo, visando a produção de aminoácidos a partir de xilose utilizada como fonte de carbono. Ainda, a patente EP2513302A1 discorre sobre a superexpressão dos genes araA, araB e araD de E. coli para que a C. glutamicum seja capaz de metabolizar arabinose como fonte de carbono para a produção de aminoácidos. Além disso, a patente US8426165B2 discorre sobre a superexpressão dos genes glpF, glpK e glpD da própria estirpe para promover a otimização do uso de glicerol como fonte de carbono.
[010] Em relação a E. coli, uma vez que este organismo é capaz de metabolizar glicose, glicerol, arabinose e xilose como fontes de carbono, as patentes existentes descrevem modificações genéticas para otimizar o microrganismo a fim de que este seja capaz de metabolizar determinados substratos de forma simultânea. A patente WO2014025747A1, por exemplo, discorre sobre uma estirpe de E. coli modificada para a coutilização de glicose e xilose por meio da inativação de genes do sistema da fosfotransferase (PTS), reduzindo o efeito da repressão catabólica, além
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4/50 de superexpressar os genes envolvidos no metabolismo e transporte de xilose, como xylA, xylB e xylE.
[011] Outras patentes, como a US2005214911A1 discorre sobre o uso de uma estirpe de E. coli modificada e otimizada para o uso de xilose como fonte de carbono em substratos compostos por glicose e arabinose. As modificações realizadas envolvem a superexpressão de genes do sistema xylABFGHR. A patente WO 2010/051324 discorre sobre o uso de uma estirpe de E. coli modificada e otimizada para o consumo de glicerol como fonte de carbono, por meio da superexpressão de genes como glpK e glpD. [012] A fim de tornar a presente invenção sustentável, descreve-se a otimização de genes e promotores de maneira sintética envolvidos no metabolismo de diversas fontes de carbono. Ainda, decreve-se a superexpressão ou repressão/deleção de genes centrais que fazem parte da via metabólica para a síntese de L-lisina, bem como a superexpressão de determinados genes que promovem a divisão celular mais rápida, tornando o processo fermentativo mais eficiente, e a repressão/deleção de determinados genes que naturalmente atenuam o metabolismo do ciclo do ácido cítrico em condições de microaerobia e anaerobia. Estas modificações podem ser empregadas para a otimização do processo de síntese essencialmente de L-lisina, mas não se restringe à esta, de modo que o processo pode ser empregado para a síntese de outros aminoácidos e também de outras biomoléculas, como ácidos orgânicos, antibióticos, biopolímeros, entre outros, dadas as modificações genéticas necessárias para tal.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [013] Como mencionado no estado da arte da invenção, várias estirpes da bactéria E. coli podem ser utilizadas para engenharia metabólica visando maior produção de aminoácidos, preferencialmente L-lisina. No caso da presente invenção, as estirpes de E. coli provenientes da estirpe K-12
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5/50 podem ser utilizadas para as otimizações propostas, como a estirpe MG1655.
[014] Para a otimização de promotores e genes, é empregada a técnica similar a técnica MAGE (Multiplex Automated Genomic Engineering), a qual utiliza moléculas de DNA de fita simples carregando mutações aleatórias previamente sintetizadas quimicamente. Estas sequências são posteriormente transformadas em E. coli previamente preparadas, e então, por recombinação homóloga a partir da ação de recombinases virais, são integradas ao genoma das células, gerando populações com diferentes mutações do mesmo gene ou de genes diferentes.
[015] O processo descrito na presente invenção difere da técnica de MAGE pelo fato de não utilizar genes sinteticos com mutações previamente determinadas, mas sim do uso de mutações totalmente aleatórias e da amplificação do DNA de determinado gene nativo do microrganismo a ser alterado utilizando a reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) onde é empregada uma DNA polimerase com alta taxa de incorporação de mutações.
[016] A reação de PCR aqui descrita visa a geração de moléculas de DNA de fita dupla semelhantes a do gene em utilizado como molde, contudo, uma vez que emprega-se uma DNA polimerase com alta taxa de erro ao incorporar nucleotídeos à nova cadeia (DNA polimerase η humana, Johnson et al., 2000), esta por sua vez gera fragmentos mutados do gene molde com uma taxa de mutação de aproximadamente 1 erro a cada 100 nucleotídeos. Desta maneira, um pool de fragmentos que carregam mutações aleatórias é gerado em um curto intervalo de tempo.
[017] Visando a integração dos fragmentos mutados ao genoma da E. coli, estes são então inseridos nas células previamente preparadas seguindo um protocolo de eletroporação. A integração dos fragmentos ao genoma é obtida por meio da ação de recombinases virais, gerando uma população heterogênea de células carregando mutações do mesmo gene, podendo estas afetarem positivamente ou negativamente as características da
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6/50 enzima obtida após a expressão do gene em questão. Este processo, por sua vez, caracteriza a geração de enzimas totalmente sintéticas que podem ser utilizadas para a otimização de vias metabólicas diversas.
[018] Visando a alteração de regiões promotoras que antecedem os genes, é possível utilizar a mesma técnica de geração de sequências de DNA mutadas, de modo que a inserção de mutações aleatórias pode resultar em promotores sintéticos livres de regulação e/ou com força promotora maior ou menor, podendo ser utilizados em conjunto ou não com as enzimas otimizadas para a geração de uma via metabólica sintética.
[019] Visando aumentar a incorporação de erros ao amplificar a cadeia de DNA, o gene molde pode ser previamente exposto à luz ultravioleta para induzir a geração de mutações aleatórias que serão somadas as mutações incorporadas pela ação da própria DNA polimerase.
[020] Uma vez ocorrido o evento de recombinação homóloga, as bactérias são plaqueadas em placas contendo meio mínimo sólido para E. coli contendo apenas a fonte de carbono determinada (ex. meio mínimo contendo ágar suplementado exclusivamente com xilose ou com outra fonte de carbono de interesse). Ao selecionar as colônias que apresentam maior crescimento, estas são submetidas as mesmas condições anteriores, porém em meio líquido, para que uma avaliação de crescimento em relação ao tempo seja estabelecida, a fim de selecionar as melhores populações de E. coli capazes de metabolizar a fonte de carbono determinada com maior eficiência, indicando a geração de vias metabólicas otimizadas.
[021] A fim de verificar as mutações específicas que geraram o fenótipo desejado, é realizado um sequenciamento da região específica do gene que foi integrado ao genoma contendo as alterações nucleotídicas obtidas no processo de incorporação de mutações aleatórias. Desta forma, é possível determinar também as mutações aminoacídicas na enzima resultante da expressão do gene em estudo. Em relação à região promotora que antecedem genes, um sequenciamento da região específica
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7/50 do promotor em estudo pode ser realizado a fim de determinar a alteração nucleotídica específica gerada.
[022] Visando a otimização da utilização de glicerol pela E. coli, por meio da técnica para geração de mutações aleatórias apresentada anteriormente, os genes glpF, glpK e glpD, que codificam para o transportador de glicerol, para a enzima glicerol quinase, e para a glicerolfosfato desidrogenase, respectivamente, são mutados a fim de gerar um transportador de glicerol mais eficiente, bem como enzimas menos susceptíveis à regulação alostérica e mais eficientes em termos de atividade. Além disso, a expressão dos referidos genes pode se dar pelo controle de um promotor constitutivo sintético livre de regulação também mutado aleatoriamente. Estas modificações geram a estirpe NBlys1801.
[023] Visando a otimização da utilização de xilose pela E. coli, os genes xylA, xylB e xylR, que codificam para a enzima xilose isomerase, xiluloquinase e para o regulador transcricional xylR, respectivamente, são mutados a fim de gerar enzimas menos susceptíveis à regulação alostérica e mais eficientes em termo de atividade. Além disso, no caso do regulador xylR, determinadas mutações podem gerar domínios de maior afinidade para xilose e/ou domínios com maior afinidade para as regiões -35 e -10 dos promotores nativos dos genes xylA, xylB, e outros genes associados ao metabolismo de xilose. Além disso, a expressão dos referidos genes pode se dar pelo controle de um promotor constitutivo sintético livre de regulação também mutado aleatoriamente. Estas modificações geram a estirpe NBlys1802.
[024] Visando a otimização da utilização de arabinose pela E. coli, os genes araE, araA, araB e araD, que codificam para o transportador de arabinose e para as enzimas arabinose isomerase, ribuloquinase e ribulose-5-fosfato-4-epimerase, respectivamente, são mutados a fim de gerar um transportador mais eficiente e com maior afinidade pela arabinose, e enzimas menos suceptíveis a regulação alostérica e mais eficientes em termos de atividade. Além disso, o gene araC, que codifica
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8/50 para o regulador transcricional araC, é mutado a fim de gerar domínios de maior afinidade para as regiões -35 e -10 dos promotores nativos dos genes araA, araB, araD, e outros genes associados ao metabolismo de arabinose. Ainda, a expressão dos referidos genes pode se dar pelo controle de um promotor constitutivo sintético livre de regulação também mutado aleatoriamente. Estas modificações geram a estirpe NBlys1803.
[025] Além das modificações mencionadas anteriormente, tem-se como objetivo da presente patente a obtenção de um microrganismo otimizado para a produção do aminoácido L-lisina. Para tanto, diversos genes envolvidos na via metabólica para a produção deste aminoácido devem ser regulados de forma específica, seja por meio de sua superexpressão por meio de plasmídeos ou otimização do processo de transcrição e/ou tradução, ou por meio de sua atenuação e/ou deleção do genoma do referido organismo. Além disso, otimizações da sequência aminoacídica de uma determinada proteína podem ser realizadas a fim de aumentar ou diminuir sua atividade metabólica frente à determinado substrato, ou mesmo a fim de diminuir e/ou eliminar a regulação alostérica decorrente de outros metabólicos que constituem um sistema de feedback negativo.
[026] Visando a edição do conjunto gênico envolvido para a otimização da produção de L-lisina, além da técnica para a geração de mutações aleatórias decorrente da atividade de enzimas DNA polimerase com taxa de incorporação de erros mais elevada, pode-se utilizar também a ferramenta de edição gênica que faz uso do sistema CRISPR/Cas9 ou análogo, associado ao uso de recombinases virais para a integração, edição ou excisão de um fragmento de DNA do genoma da E. coli.
[027] No caso da presente patente, as modificações são realizadas com o sistema de edição gênica utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 adaptado para E. coli, conforme descrito por Jiang et al., 2015. Os genes de interesse a serem clonados, assim como os RNAs guia para o sistema CRISPR são obtidos por síntese gênica comercial. A clonagem dos RNAs guia e regiões de homologia para os genes alvo são clonados em vetor utilizado para a
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9/50 edição gênica por meio do emprego das enzimas de restrição Ndel e PstI. Os genes de interesse a serem superexpressados ou editados são clonados no vetor utilizado para a edição gênica por meio do emprego das enzimas de restrição EcoRI e SpeI. O princípio da técnica de edição gênica utilizando o referido sistema se dá inicialmente pela eletroporação das células com o plasmídeo pNB_Ecol_Cas contendo os genes da enzima Cas9 e da recombinase lambda. Após a seleção de colônias positivas para esta construção, os plasmídeos da série pNB_Ecol_gRNA são também eletroporados nas células contendo o primeiro plasmídeo. A modificação gênica por meio do sistema CRISPR ocorre após indução da expressão do RNA guia com L-arabinose, e a confirmação da edição é realizada por meio de PCR e sequenciamento utilizando primers específicos para as regiões de interesse. Clones positivos são selecionados, subcultivados e preparados para novas etapas de edição gênica. As modificações genéticas executadas são descritas a seguir.
[028] A fim de gerar uma estirpe capaz de produzir L-lisina com maior eficiência, as seguintes modificações foram geradas, caracterizando um organismo base como já descrito na patente 9896734:
[029] O gene ppc, que codifica para a enzima fosfoenolpiruvato carboxilase, é superexpresso na estirpe MG1655 sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1801. Esta modificação visa o aumento do fluxo metabólico para a produção oxaloacetato. Ainda, o gene adhE, que codifica para a enzima alcool desidrogenase, é utilizado como alvo de integração para o gene ppc, de modo que o gene adhE possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima alcool desidrogenase na referida estirpe. Esta modificação visa a maior disponibilidade de acetil-CoA intracelular.
[030] O gene lysC, que codifica para a enzima aspartato quinase, é superexpresso na estirpe 2NBlys1801 sob controle do promotor constitutivo j23118, gerando a estirpe 2NBlys1802. A sequência aminoacídica deste gene é alterada de modo a apresentar uma substituição do aspartato na
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10/50 posição 340 por uma alanina, como já descrito na patente 9896734. Esta modificação visa o aumento do fluxo metabólico para a produção de Laspartil-4-fosfato e a liberação do sistema de feedback negativo causado pela interação com a L-lisina. Ainda, o gene IdhA, que codifica para a enzima lactato desidrogenase, é utilizado como alvo de integração para o gene lysC mutado, de modo que o gene IdhA possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima lactato desidrogenase na referida estirpe. Esta modificação visa a maior disponibilidade de piruvato intracelular e diminuição do acúmulo de lactato no processo fermentativo.
[031] Os genes asd e dapA que codificam para as enzimas aspartatosemialdeido desidrogenase e 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato sintase, respectivamente, são superexpressos na estirpe 2NBlys1802 em forma de operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1803. A sequência aminoacídica do gene dapA é alterada de modo a apresentar uma substituição do ácido glutâmico na posição 84 por uma treonina, como já descrito na patente 9896734. Esta modificação visa o aumento do fluxo metabólico para a produção de 4-hidroxi-2,3,4,5tetrahidrodipicolinato e a liberação do sistema de feedback negativo causado pela interação com a L-lisina. A superexpressão do gene asd visa o aumento do fluxo metabólico para a produção de L-aspartatosemialdeido. Ainda, o gene pflB, que codifica para a enzima piruvatoformato liase, é utilizado como alvo de integração para o operon asd e dapA mutado, de modo que o gene pflB possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima piruvato-formato liase na referida estirpe. Esta modificação visa a maior disponibilidade de piruvato intracelular e diminuição do acúmulo de formato no processo fermentativo.
[032] Os genes dapB e dapD, que codificam para as enzimas 4-hidroxitetrahidrodipicolinato redutase e tetrahidrodipicolinato succinilase, respectivamente, são superexpressos na estirpe 2NBlys1803 em forma de
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11/50 operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1804. Estas modificações visam o aumento do fluxo metabólico para a produção de 2,3,4,5-tetrahidropicolinato e N-succinil-2-amino-6cetopimellato. Ainda, o gene focA, que codifica para o transportador de formato, é utilizado como alvo de integração para o operon dapB e dapD, de modo que o gene focA possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência do transportador de formato na referida estirpe. Esta modificação visa a diminuição do acúmulo de formato no processo fermentativo.
[033] Os genes serC e dapE, que codificam para as enzimas N-succinildiaminopimelato aminotransferase e succinil-diaminopimelato desuccinilase, respectivamente, são superexpressos na estirpe 2NBlys1804 em forma de operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1805. Estas modificações visam o aumento do fluxo metabólico para a produção de N-succinil-2,6diaminopimelato e L-diaminopimelato. Ainda, o gene poxB, que codifica para a enzima piruvato oxidase, é utilizado como alvo de integração para o operon serC e dapE, de modo que o gene poxB possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima piruvato oxidase na referida estirpe. Esta modificação visa a maior disponibilidade de piruvato intracelular.
[034] Os genes dapF e lysA, que codificam para as enzimas diaminopimelato epimerase e diaminopimelato decarboxilase, respectivamente, são superexpressos na estirpe 2NBlys1805 em forma de operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1806. Estas modificações visam o aumento do fluxo metabólico para a produção de meso-diaminopimelato e L-lisina. Ainda, o gene cadA, que codifica para a enzima lisina decarboxilase, é utilizado como alvo de integração para o operon dapF e lysA, de modo que o gene cadA possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima lisina decarboxilase na referida estirpe. Esta modificação visa a
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12/50 maior produção de L-lisina, uma vez que a enzima lisina decarboxilase utiliza este aminoácido como substrato para a produção de cadaverina.
[035] Os genes pntA e pntB, que codificam para a enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo transhidrogenase, são superexpressos na estirpe 2NBlys1806 em forma de operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1807. A expressão destes genes visa a produção mais elevada de NADPH, visto que o fluxo metabólico aumentado para a produção de L-lisina apresenta consumo elevado desta molécula. Ainda, o gene IdcC, que codifica para a enzima lisina decarboxilase 2, é utilizado como alvo de integração para o operon pntA e pntB, de modo que o gene IdcC possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência da enzima lisina decarboxilase 2 na referida estirpe. Esta modificação visa a maior produção de L-lisina, uma vez que a enzima lisina decarboxilase 2 utiliza este aminoácido como substrato para a produção de cadaverina.
[036] Os genes ftsA e fstZ, que codificam para as proteinas de divisão celular ftsA e ftsZ, respectivamente, são superexpressos na estirpe 2NBlys1807 em forma de operon sob controle do promotor constitutivo J23118, gerando a estirpe 2NBlys1808. A expressão destes genes visa a elevação da taxa de divisão celular, promovendo o acúmulo de níveis mais elevados de células em menor período de tempo no processo fermentativo, levando assim à maior produção de L-lisina. Ainda, o gene arcA, que codifica para a o regulador transcricional arcA, é utilizado como alvo de integração para o operon ftsA e ftsZ, de modo que o gene arcA possui sua sequência nucleotídica interrompida, portanto resultando na ausência do regulador transcricional arcA na referida estirpe. Esta modificação visa a anulação da regulação do sistema de transição de crescimento em condição aeróbica para microaeróbica ou anaeróbica, desta forma mantendo a expressão de determinados genes, como os do ciclo do ácido cítrico, constantemente ativos, mesmo em condições de microaerobia ou
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13/50 anaerobia, caso estas condições venham a ocorrer temporariamente durante o processo fermentativo.
[037] Os genes thrA e metL, que codificam para as enzimas aspartato quinase/homoserina desidrogenase tipos 1 e 2, respectivamente, possuem seus promotores substituídos pelo promotor constitutivo J23113 na estirpe 2NBIys1808, gerando a estirpe 2NBIys1809. A alteração da região promotora destes genes torna a expressão destes menos ativa, gerando, por consequência, menos proteínas no meio intracelular. Estas modificações visam a diminuição da formação de L-homoserina a partir de L-aspartato semialdeido, sendo a homoserina utilizada na produção de metionina e/ou treonina.
[038] Os genes ackA e pta, que codificam para as enzimas acetato quinase e fosfato acetiltransferase, respectivamente, possuem seus promotores substituídos pelo promotor constitutivo J23113 na estirpe 2NBIys1809, gerando a estirpe 2NBIys1810. A alteração da região promotora destes genes torna a expressão destes menos ativa, gerando, por consequência, menos proteínas no meio intracelular. Estas modificações visam a diminuição da formação de acetato, resultando na diminuição do consumo de acetil-CoA.
[039] A tabela 1 representa as estirpes geradas a partir das modificações genéticas descritas nesta patente.
Tabela 1 - Estirpes modificadas geneticamente para produção de Lmetionina.
NBIys1801 J23118_glpF_glpKjglpD
NBIys1802 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR
NBIys1803 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD
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2NBIys1801 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; adhE::J23118_ppc
2NBIys1802 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; adhE J23118_ppc; ldhA::J23118_lysCD340A
2NBIys1803 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T
2NBIys1804 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA::J23118_dapB_dapD
2NBIys1805 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE
2NBIys1806 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA ::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE; cadA::J23118_dapF_lysA
2NBIys1807 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA ::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE; cadA::J23118_dapF_lysA; ldcC::J23118_pntA_pntB
2NBIys1808 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc;
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ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA ::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE; cadA::J23118_dapF_lysA; ldcC::J23118_pntA_pntB; arcA::J23118_ftsA_ftsZ
2NBIys1809 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA ::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE; cadA::J23118_dapF_lysA; ldcC::J23118_pntA_pntB; arcA::J23118_ftsA_ftsZ; thrA::J23113_thrA; metL::J23113_metL
2NBIys1810 J23118_glpF_glpK_glpD; J23118_xylA_xylB_xylR; J23118_araE_araA_araB_araD; J23118_adhE::ppc; ldhA::J23118_lysCD340A; pflB::J23118_asd_dapAE84T; focA ::J23118_dapB_dapD; poxB::J23118_serC_dapE; cadA::J23118_dapF_lysA; ldcC::J23118_pntA_pntB; arcA::J23118_ftsA_ftsZ; thrA::J23113_thrA; metL::J23113_metL; ackA::J23113_ackA; pta::J23113_pta
[040] Os termos “aumento de expressão” ou superexpressão do gene são usados ao longo do texto e têm significados semelhantes.
[041 ] Com o intuito de implementar um maior fluxo metabólico por meio da expressão dos referidos genes, a geração de enzimas com mutações aleatórias a fim de gerar enzimas mais eficientes constituindo vias metabólicas sintéticas, além da técnica apresentada nesta patente utilizando uma DNA polimerase com alta taxa de incorporação de mutações associada ou não a exposição à luz ultravioleta, outras técnicas podem ser utilizadas para fins semelhantes.
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16/50 [042] Os genes aqui descritos podem ser expressos preferencialmente a partir do DNA cromossomal, com a possibilidade de serem expressos também por meio de DNA plasmidial. Os genes aqui descritos podem ter sua atividade modificada contanto que este acumule mutações que codifiquem para a enzima com a otimização desejada.
[043] As sequências codificadoras dos genes molde descritos podem ser obtidas por PCR utilizando enzimas de alta fidelidade e com baixa taxa de incorporação de mutações, ou por síntese química realizada por empresas especializadas no serviço.
[044] O sistema de otimização de enzimas e promotores aqui descrito permite a geração de estirpes de E. coli com vias metabólicas sintéticas para a utilização de diferentes fontes de carbono visando a criação de um microrganismo versátil e eficiente para o estabelecimento de processos industriais que visam a produção de L-lisina com elevada produtividade e com o consumo de variadas fontes de carbono.
[045] Após a aplicação de técnicas de engenharia genética de modificação, ainda podem ocorrer alterações por pressão seletiva, onde o microrganismo é forçado a se adaptar geneticamente a uma condição fora do padrão, além de alterações genéticas que ocorrem de maneira natural, gerando assim um organismo diferente do inicial.
DEFINIÇÕES [046] Fica descrito aqui que o citado “glicose” refere-se à fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C6H12O6 em sua composição. [047] Fica descrito aqui que o citado “xilose” refere-se à fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C5H10O5 em sua composição. [048] Fica descrito aqui que o citado “arabinose” refere-se à fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C5H10O5 em sua composição.
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17/50 [049] Fica descrito aqui que quando citado “glicerol”, é a fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C3H8O3 em sua composição. [050] Um microrganismo pode ser modificado para expressar genes exógenos se esses genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos para sua expressão. A modificação do microrganismo com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para especialistas na arte.
[051] O termo microrganismo utilizado aqui refere-se preferencialmente, mas não se limita à estirpe de E. coli MG1655.
[052] Define-se como sequência de deoxinucleotídeos qualquer cadeia de polinucleotídeos constituída por deoxinucleotídeos em cadeias simples fita ou dupla fita e que será referida na invenção como apenas sequência de DNA.
[053] O termo “lisina” refere-se ao aminoácido de fórmula química C6H14N2O2 e número CAS 56-87-1 especificamente para o isômero L.
[054] O termo “metionina” refere-se ao aminoácido de fórmula química C5H11NO2S e número CAS 63-68-3 especificamente para o isômero L.
[055] O termo “treonina” refere-se ao aminoácido de fórmula química C4H9NO3 e número CAS 72-19-5 especificamente para o isômero L.
[056] Define-se por gene xylA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3565, entre os deoxinucleotídeos 3.729.433 a 3.730.765, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[057] Define-se por gene xylB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3564, entre os deoxinucleotídeos 3.727.917 a 3.729.371, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[058] Define-se por gene xylR a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estiper E. coli K12 Mg1655 como b3569, entre os deoxinucleotídeos 3.734.979 a 3.736.157, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
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18/50 [059] Define-se por gene araA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0062, entre os deoxinucleotídeos 66.835 a 68.337, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[060] Define-se por gene araB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0063, entre os deoxinucleotídeos 68.348 a 70.048, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[061] Define-se por gene araC a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0064, entre os deoxinucleotídeos 70.387 a 71.265, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[062] Define-se por gene araD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0061, entre os deoxinucleotídeos 65.855 a 66.550, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[063] Define-se como gene glpK a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3926 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.115.714 a 4.117.222 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[064] Define-se como gene glpF a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3927 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.117.245 a 4.118.090 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[065] Define-se como gene glpD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3426 e localizada entre os deoxinucleotídeos 3.562.013 a 3.563.518 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[066] Define-se como gene adhE a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b1241 e
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19/50 localizada entre os deoxinucleotídeos 1.295.446 a 1.298.121 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[067] Define-se como gene ppc a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3956 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.150.447 a 4.153.098 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[068] Define-se como gene IdhA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b1380 e localizada entre os deoxinucleotídeos 1.441.854 a 1.442.843 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[069] Define-se como gene lysC a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b4024 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.231.884 a 4.233.233 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[070] Define-se como gene pflB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0903 e localizada entre os deoxinucleotídeos 951.272 a 953.554 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[071] Define-se como gene asd a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3433 e localizada entre os deoxinucleotídeos 3.573.775 a 3.574.878 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[072] Define-se como gene dapA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2478 e localizada entre os deoxinucleotídeos 2.598.882 a 2.599.760 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[073] Define-se como gene focA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0904 e localizada entre os deoxinucleotídeos 953.609 a 954.466 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
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20/50 [074] Define-se como gene dapB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0031 e localizada entre os deoxinucleotídeos 28.374 a 29.195 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[075] Define-se como gene dapD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0166 e localizada entre os deoxinucleotídeos 185.123 a 185.947 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[076] Define-se como gene poxB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0871 e localizada entre os deoxinucleotídeos 909.331 a 911.049 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[077] Define-se como gene serC a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0907 e localizada entre os deoxinucleotídeos 957.653 a 958.741 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[078] Define-se como gene dapE a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2472 e localizada entre os deoxinucleotídeos 2.591.607 a 2.592.734 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[079] Define-se como gene cadA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b4131 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.356.470 a 4.358.617 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[080] Define-se como gene dapF a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3809 e localizada entre os deoxinucleotídeos 3.994.762 a 3.995.586 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[081] Define-se como gene lysA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2838 e
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21/50 localizada entre os deoxinucleotídeos 2.977.637 a 2.978.899 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[082] Define-se como gene IdcC a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0186 e localizada entre os deoxinucleotídeos 209.679 a 211.820 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[083] Define-se como gene pntA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b1603 e localizada entre os deoxinucleotídeos 1.676.371 a 1.677.903 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[084] Define-se como gene pntB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b1602 e localizada entre os deoxinucleotídeos 1.674.972 a 1.676.360 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[085] Define-se como gene arcA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b4401 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.639.590 a 4.640.306 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[086] Define-se como gene ftsA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0094 e localizada entre os deoxinucleotídeos 103.982 a 105.244 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[087] Define-se como gene ftsZ a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0095 e localizada entre os deoxinucleotídeos 105.305 a 106.456 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[088] Define-se como gene thrA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0002 e localizada entre os deoxinucleotídeos 337 a 2799 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
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22/50 [089] Define-se como gene metL a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3940 e localizada entre os deoxinucleotídeos 4.129.835 a 4.132.267 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[090] Define-se como gene ackA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2296 e localizada entre os deoxinucleotídeos 2.413.470 a 2.414.672 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
[091] Define-se como gene pta a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2297 e localizada entre os deoxinucleotídeos 2.414.747 a 2.416.891 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).
SEQUENCIAS DOS GENES CITADOS NESTA PATENTE xylA atgcaagcctattttgaccagctcgatcgcgttcgttatgaaggctcaaaatcctcaaacccgttagcatt ccgtcactacaatcccgacgaactggtgttgggtaagcgtatggaagagcacttgcgttttgccgcctg ctactggcacaccttctgctggaacggggcggatatgtttggtgtgggggcgtttaatcgtccgtggcag cagcctggtgaggcactggcgttggcgaagcgtaaagcagatgtcgcatttgagtttttccacaagtta catgtgccattttattgcttccacgatgtggatgtttcccctgagggcgcgtcgttaaaagagtacatcaat aattttgcgcaaatggttgatgtcctggcaggcaagcaagaagagagcggcgtgaagctgctgtggg gaacggccaactgctttacaaaccctcgctacggcgcgggtgcggcgacgaacccagatcctgaag tcttcagctgggcggcaacgcaagttgttacagcgatggaagcaacccataaattgggcggtgaaaa ctatgtcctgtggggcggtcgtgaaggttacgaaacgctgttaaataccgacttgcgtcaggagcgtga acaactgggccgctttatgcagatggtggttgagcataaacataaaatcggtttccagggcacgttgctt atcgaaccgaaaccgcaagaaccgaccaaacatcaatatgattacgatgccgcgacggtctatggc ttcctgaaacagtttggtctggaaaaagagattaaactgaacattgaagctaaccacgcgacgctggc aggtcactctttccatcatgaaatagccaccgccattgcgcttggcctgttcggttctgtcgacgccaacc gtggcgatgcgcaactgggctgggacaccgaccagttcccgaacagtgtggaagagaatgcgctg gtgatgtatgaaattctcaaagcaggcggtttcaccaccggtggtctgaacttcgatgccaaagtacgtc
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23/50 gtcaaagtactgataaatatgatctgttttacggtcatatcggcgcgatggatacgatggcactggcgct gaaaattgcagcgcgcatgattgaagatggcgagctggataaacgcatcgcgcagcgttattccggc tggaatagcgaattgggccagcaaatcctgaaaggccaaatgtcactggcagatttagccaaatatg ctcaggaacatcatttgtctccggtgcatcagagtggtcgccaggaacaactggaaaatctggtaaac cattatctgttcgacaaataa xylB atgtatatcgggatagatcttggcacctcgggcgtaaaagttattttgctcaacgagcagggtgaggtgg ttgctgcgcaaacggaaaagctgaccgtttcgcgcccgcatccactctggtcggaacaagacccgga acagtggtggcaggcaactgatcgcgcaatgaaagctctgggcgatcagcattctctgcaggacgtta aagcattgggtattgccggccagatgcacggagcaaccttgctggatgctcagcaacgggtgttacgc cctgccattttgtggaacgacgggcgctgtgcgcaagagtgcactttgctggaagcgcgagttccgca atcgcgggtgattaccggcaacctgatgatgcccggatttactgcgcctaaattgctatgggttcagcgg catgagccggagatattccgtcaaatcgacaaagtattattaccgaaagattacttgcgtctgcgtatg acgggggagtttgccagcgatatgtctgacgcagctggcaccatgtggctggatgtcgcaaagcgtg actggagtgacgtcatgctgcaggcttgcgacttatctcgtgaccagatgcccgcattatacgaaggca gcgaaattactggtgctttgttacctgaagttgcgaaagcgtggggtatggcgacggtgccagttgtcgc aggcggtggcgacaatgcagctggtgcagttggtgtgggaatggttgatgctaatcaggcaatgttatc gctggggacgtcgggggtctattttgctgtcagcgaagggttcttaagcaagccagaaagcgccgtac atagcttttgccatgcgctaccgcaacgttggcatttaatgtctgtgatgctgagtgcagcgtcgtgtctgg attgggccgcgaaattaaccggcctgagcaatgtcccagctttaatcgctgcagctcaacaggctgat gaaagtgccgagccagtttggtttctgccttatctttccggcgagcgtacgccacacaataatccccagg cgaagggggttttctttggtttgactcatcaacatggccccaatgaactggcgcgagcagtgctggaag gcgtgggttatgcgctggcagatggcatggatgtcgtgcatgcctgcggtattaaaccgcaaagtgtta cgttgattgggggcggggcgcgtagtgagtactggcgtcagatgctggcggatatcagcggtcagca gctcgattaccgtacggggggggatgtggggccagcactgggcgcagcaaggctggcgcagatcg cggcgaatccagagaaatcgctcattgaattgttgccgcaactaccgttagaacagtcgcatctacca gatgcgcagcgttatgccgcttatcagccacgacgagaaacgttccgtcgcctctatcagcaacttctg ccattaatggcgtaa xylR
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24/50 atgtttactaaacgtcaccgcatcacattactgttcaatgccaataaagcctatgaccggcaggtagtag aaggcgtaggggaatatttacaggcgtcacaatcggaatgggatattttcattgaagaagatttccgcg cccgcattgataaaatcaaggactggttaggagatggcgtcattgccgacttcgacgacaaacagatc gagcaagcgctggctgatgtcgacgtccccattgttggggttggcggctcgtatcaccttgcagaaagtt acccacccgttcattacattgccaccgataactatgcgctggttgaaagcgcatttttgcatttaaaagag aaaggcgttaaccgctttgctttttatggtcttccggaatcaagcggcaaacgttgggccactgagcgcg aatatgcatttcgtcagcttgtcgccgaagaaaagtatcgcggagtggtttatcaggggttagaaaccg cgccagagaactggcaacacgcgcaaaatcggctggcagactggctacaaacgctaccaccgca aaccgggattattgccgttactgacgcccgagcgcggcatattctgcaagtatgtgaacatctacatatt cccgtaccggaaaaattatgcgtgattggcatcgataacgaagaactgacccgctatctgtcgcgtgtc gccctttcttcggtcgctcagggcgcgcggcaaatgggctatcaggcggcaaaactgttgcatcgatta ttagataaagaagaaatgccgctacagcgaattttggtcccaccagttcgcgtcattgaacggcgctca acagattatcgctcgctgaccgatcccgccgttattcaggccatgcattacattcgtaatcacgcctgtaa agggattaaagtggatcaggtactggatgcggtcgggatctcgcgctccaatcttgagaagcgttttaa agaagaggtgggtgaaaccatccatgccatgattcatgccgagaagctggagaaagcgcgcagtct gctgatttcaaccaccttgtcgatcaatgagatatcgcaaatgtgcggttatccatcgctgcaatatttcta ctctgtttttaaaaaagcatatgacacgacgccaaaagagtatcgcgatgtaaatagcgaggtcatgtt gtag araA atgacgatttttgataattatgaagtgtggtttgtcattggcagccagcatctgtatggcccggaaaccctg cgtcaggtcacccaacatgccgagcacgtcgttaatgcgctgaatacggaagcgaaactgccctgca aactggtgttgaaaccgctgggcaccacgccggatgaaatcaccgctatttgccgcgacgcgaatta cgacgatcgttgcgctggtctggtggtgtggctgcacaccttctccccggccaaaatgtggatcaacgg cctgaccatgctcaacaaaccgttgctgcaattccacacccagttcaacgcggcgctgccgtgggac agtatcgatatggactttatgaacctgaaccagactgcacatggcggtcgcgagttcggcttcattggcg cgcgtatgcgtcagcaacatgccgtggttaccggtcactggcaggataaacaagcccatgagcgtat cggctcctggatgcgtcaggcggtctctaaacaggatacccgtcatctgaaagtctgccgatttggcga taacatgcgtgaagtggcggtcaccgatggcgataaagttgccgcacagatcaagttcggtttctccgt caatacctgggcggttggcgatctggtgcaggtggtgaactccatcagcgacggcgatgttaacgcgc tggtcgatgagtacgaaagctgctacaccatgacgcctgccacacaaatccacggcaaaaaacga
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25/50 cagaacgtgctggaagcggcgcgtattgagctggggatgaagcgtttcctggaacaaggtggcttcc acgcgttcaccaccacctttgaagatttgcacggtctgaaacagcttcctggtctggccgtacagcgtct gatgcagcagggttacggctttgcgggcgaaggcgactggaaaactgccgccctgcttcgcatcatg aaggtgatgtcaaccggtctgcagggcggcacctcctttatggaggactacacctatcacttcgag aaaggtaatgacctggtgctcggctcccatatgctggaagtctgcccgtcgatcgccgcagaagaga aaccgatcctcgacgttcagcatctcggtattggtggtaaggacgatcctgcccgcctgatcttcaatac ccaaaccggcccagcgattgtcgccagcttgattgatctcggcgatcgttaccgtctactggttaactgc atcgacacggtgaaaacaccgcactccctgccgaaactgccggtggcgaatgcgctgtggaaagc gcaaccggatctgccaactgcttccgaagcgtggatcctcgctggtggcgcgcaccataccgtcttca gccatgcactgaacctcaacgatatgcgccaattcgccgagatgcacgacattgaaatcacggtgatt gataacgacacacgcctgccagcgtttaaagacgcgctgcgctggaacgaagtgtattacgggtttcg tcgctaa araB atggcgattgcaattggcctcgattttggcagtgattctgtgcgagctttggcggtggactgcgctaccgg tgaagagatcgccaccagcgtagagtggtatccccgttggcagaaagggcaattttgtgatgccccga ataaccagttccgtcatcatccgcgtgactacattgagtcaatggaagcggcactgaaaaccgtgcttg cagagcttagcgtcgaacagcgcgcagctgtggtcgggattggcgttgacagtaccggctcgacgcc cgcaccgattgatgccgacggaaacgtgctggcgctgcgcccggagtttgccgaaaacccgaacgc gatgttcgtattgtggaaagaccacactgcggttgaagaagcggaagagattacccgtttgtgccacg cgccgggcaacgttgactactcccgctacattggtggtatttattccagcgaatggttctgggcaaaaat cctgcatgtgactcgccaggacagcgccgtggcgcaatctgccgcatcgtggattgagctgtgcgact gggtgccagctctgctttccggtaccacccgcccgcaggatattcgtcgcggacgttgcagcgccggg cataaatctctgtggcacgaaagctggggcggcctgccgccagccagtttctttgatgagctggaccc gatcctcaatcgccatttgccttccccgctgttcactgacacttggactgccgatattccggtgggcacctt atgcccggaatgggcgcagcgtctcggcctgcctgaaagcgtggtgatttccggcggcgcgtttgact gccatatgggcgcagttggcgcaggcgcacagcctaacgcactggtaaaagttatcggtacttccac ctgcgacattctgattgccgacaaacagagcgttggcgagcgggcagttaaaggtatttgcggtcagg ttgatggcagcgtggtgcctggatttatcggtctggaagcaggccaatcggcgtttggtgatatctacgc ctggtttggtcgcgtactcggctggccgctggaacagcttgccgcccagcatccggaactgaaaacgc aaatcaacgccagccagaaacaactgcttccggcgctgaccgaagcatgggccaaaaatccgtctc
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26/50 tggatcacctgccggtggtgctcgactggtttaacggccgccgcacaccgaacgctaaccaacgcct gaaaggggtgattaccgatcttaacctcgctaccgacgctccgctgctgttcggcggtttgattgctgcc accgcctttggcgcacgcgcaatcatggagtgctttaccgatcaggggatcgccgttaataacgtgatg gcactgggcggcatcgcgcggaaaaaccaggtcattatgcaggcctgctgcgacgtgctgaatcgc ccgctgcaaattgttgcctctgaccagtgctgtgcgctcggtgcggcgatttttgctgccgtcgccgcgaa agtgcacgcagacatcccatcagctcagcaaaaaatggccagtgcggtagagaaaaccctgcaac cgtgcagcgagcaggcacaacgctttgaacagctttatcgccgctatcagcaatgggcgatgagcgc cgaacaacactatcttccaacttccgccccggcacaggctgcccaggccgttgcgactctataa araC atggctgaagcgcaaaatgatcccctgctgccgggatactcgtttaacgcccatctggtggcgggttta acgccgattgaggccaacggttatctcgatttttttatcgaccgaccgctgggaatgaaaggttatattctc aatctcaccattcgcggtcagggggtggtgaaaaatcagggacgagaatttgtctgccgaccgggtg atattttgctgttcccgccaggagagattcatcactacggtcgtcatccggaggctcgcgaatggtatca ccagtgggtttactttcgtccgcgcgcctactggcatgaatggcttaactggccgtcaatatttgccaata cgggtttctttcgcccggatgaagcgcaccagccgcatttcagcgacctgtttgggcaaatcattaacgc cgggcaaggggaagggcgctattcggagctgctggcgataaatctgcttgagcaattgttactgcggc gcatggaagcgattaacgagtcgctccatccaccgatggataatcgggtacgcgaggcttgtcagtac atcagcgatcacctggcagacagcaattttgatatcgccagcgtcgcacagcatgtttgcttgtcgccgt cgcgtctgtcacatcttttccgccagcagttagggattagcgtcttaagctggcgcgaggaccaacgca ttagtcaggcgaagctgcttttgagcactacccggatgcctatcgccaccgtcggtcgcaatgttggtttt gacgatcaactctatttctcgcgagtatttaaaaaatgcaccggggccagcccgagcgagtttcgtgcc ggttgtgaagaaaaagtgaatgatgtagccgtcaagttgtcataa araD atgttagaagatctcaaacgccaggtattagaagccaacctggcgctgccaaaacacaacctggtca cgctcacatggggcaacgtcagcgccgttgatcgcgagcgcggcgtctttgtgatcaaaccttccggc gtcgattacagcgtcatgaccgctgacgatatggtcgtggttagcatcgaaaccggtgaagtggttgaa ggtacgaaaaagccctcctccgacacgccaactcaccggctgctctatcaggcattcccctccattgg cggcattgtgcatacgcactcgcgccacgccaccatctgggcgcaggcgggtcagtcgattccagca accggcaccacccacgccgactatttctacggcaccattccctgcacccgcaaaatgaccgacgca
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47/50 ccgcacaaccgcaggttgatgaagggctttcttacccgttgctgcaacagctgctggtgcaacatccgg gcaaacgtctggtggtgaccggatttatcagccgcaacaacgccggtgaaacggtgctgctggggcg taacggttccgactattccgcgacacaaatcggtgcgctggcgggtgtttctcgcgtaaccatctggag cgacgtcgccggggtatacagtgccgacccgcgtaaagtgaaagatgcctgcctgctgccgttgctgc gtctggatgaggccagcgaactggcgcgcctggcggctcccgttcttcacgcccgtactttacagccg gtttctggcagcgaaatcgacctgcaactgcgctgtagctacacgccggatcaaggttccacgcgcatt gaacgcgtgctggcctccggtactggtgcgcgtattgtcaccagccacgatgatgtctgtttgattgagttt caggtgcccgccagtcaggatttcaaactggcgcataaagagatcgaccaaatcctgaaacgcgcg caggtacgcccgctggcggttggcgtacataacgatcgccagttgctgcaattttgctacacctcagaa gtggccgacagtgcgctgaaaatcctcgacgaagcgggattacctggcgaactgcgcctgcgtcag gggctggcgctggtggcgatggtcggtgcaggcgtcacccgtaacccgctgcattgccaccgcttctg gcagcaactgaaaggccagccggtcgaatttacctggcagtccgatgacggcatcagcctggtggc agtactgcgcaccggcccgaccgaaagcctgattcaggggctgcatcagtccgtcttccgcgcagaa aaacgcatcggcctggtattgttcggtaagggcaatatcggttcccgttggctggaactgttcgcccgtg agcagagcacgctttcggcacgtaccggctttgagtttgtgctggcaggtgtggtggacagccgccgc agcctgttgagctatgacgggctggacgccagccgcgcgttagccttcttcaacgatgaagcggttga gcaggatgaagagtcgttgttcctgtggatgcgcgcccatccgtatgatgatttagtggtgctggacgtta ccgccagccagcagcttgctgatcagtatcttgatttcgccagccacggtttccacgttatcagcgccaa caaactggcgggagccagcgacagcaataaatatcgccagatccacgacgccttcgaaaaaacc gggcgtcactggctgtacaatgccaccgtcggtgcgggcttgccgatcaaccacaccgtgcgcgatct gatcgacagcggcgatactattttgtcgatcagcgggatcttctccggcacgctctcctggctgttcctgc aattcgacggtagcgtgccgtttaccgagctggtggatcaggcgtggcagcagggcttaaccgaacct gacccgcgtgacgatctctctggcaaagacgtgatgcgcaagctggtgattctggcgcgtgaagcag gttacaacatcgaaccggatcaggtacgtgtggaatcgctggtgcctgctcattgcgaaggcggcagc atcgaccatttctttgaaaatggcgatgaactgaacgagcagatggtgcaacggctggaagcggccc gcgaaatggggctggtgctgcgctacgtggcgcgtttcgatgccaacggtaaagcgcgtgtaggcgt ggaagcggtgcgtgaagatcatccgttggcatcactgctgccgtgcgataacgtctttgccatcgaaag ccgctggtatcgcgataaccctctggtgatccgcggacctggcgctgggcgcgacgtcaccgccggg gcgattcagtcggatatcaaccggctggcacagttgttgtaa ackA
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48/50 atgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcactgaaatttgccatcatcgatgcagta aatggtgaagagtacctttctggtttagccgaatgtttccacctgcccgaagcacgtatcaaatggaaa atggacggcaataaacaggaagcggctttaggtgcaggcgccgctcacagcgaagcgctcaacttt atcgttaatactattctggcacaaaaaccagaactgtctgcgcagctgactgctatcggtcaccgtatcg tacacggcggcgaaaagtataccagctccgtagtgatcgatgagtctgttattcagggtatcaaagatg cagcttcttttgcaccgctgcacaacccggctcacctgatcggtatcgaagaagctctgaaatctttccc acagctgaaagacaaaaacgttgctgtatttgacaccgcgttccaccagactatgccggaagagtctt acctctacgccctgccttacaacctgtacaaagagcacggcatccgtcgttacggcgcgcacggcac cagccacttctatgtaacccaggaagcggcaaaaatgctgaacaaaccggtagaagaactgaacat catcacctgccacctgggcaacggtggttccgtttctgctatccgcaacggtaaatgcgttgacacctct atgggcctgaccccgctggaaggtctggtcatgggtacccgttctggtgatatcgatccggcgatcatct tccacctgcacgacaccctgggcatgagcgttgacgcaatcaacaaactgctgaccaaagagtctgg cctgctgggtctgaccgaagtgaccagcgactgccgctatgttgaagacaactacgcgacgaaaga agacgcgaagcgcgcaatggacgtttactgccaccgcctggcgaaatacatcggtgcctacactgcg ctgatggatggtcgtctggacgctgttgtattcactggtggtatcggtgaaaatgccgcaatggttcgtga actgtctctgggcaaactgggcgtgctgggctttgaagttgatcatgaacgcaacctggctgcacgtttc ggcaaatctggtttcatcaacaaagaaggtacccgtcctgcggtggttatcccaaccaacgaagaact ggttatcgcgcaagacgcgagccgcctgactgcctga pta gtgtcccgtattattatgctgatccctaccggaaccagcgtcggtctgaccagcgtcagccttggcgtgat ccgtgcaatggaacgcaaaggcgttcgtctgagcgttttcaaacctatcgctcagccgcgtaccggtg gcgatgcgcccgatcagactacgactatcgtgcgtgcgaactcttccaccacgacggccgctgaacc gctgaaaatgagctacgttgaaggtctgctttccagcaatcagaaagatgtgctgatggaagagatcgt cgcaaactaccacgctaacaccaaagacgctgaagtcgttctggttgaaggtctggtcccgacacgt aagcaccagtttgcccagtctctgaactacgaaatcgctaaaacgctgaatgcggaaatcgtcttcgtt atgtctcagggcactgacaccccggaacagctgaaagagcgtatcgaactgacccgcaacagcttc ggcggtgccaaaaacaccaacatcaccggcgttatcgttaacaaactgaacgcaccggttgatgaa cagggtcgtactcgcccggatctgtccgagattttcgacgactcttccaaagctaaagtaaacaatgttg atccggcgaagctgcaagaatccagcccgctgccggttctcggcgctgtgccgtggagctttgacctg atcgcgactcgtgcgatcgatatggctcgccacctgaatgcgaccatcatcaacgaaggcgacatca
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49/50 atactcgccgcgttaaatccgtcactttctgcgcacgcagcattccgcacatgctggagcacttccgtgc cggttctctgctggtgacttccgcagaccgtcctgacgtgctggtggccgcttgcctggcagccatgaac ggcgtagaaatcggtgccctgctgctgactggcggttacgaaatggacgcgcgcatttctaaactgtgc gaacgtgctttcgctaccggcctgccggtatttatggtgaacaccaacacctggcagacctctctgagc ctgcagagcttcaacctggaagttccggttgacgatcacgaacgtatcgagaaagttcaggaatacgt tgctaactacatcaacgctgactggatcgaatctctgactgccacttctgagcgcagccgtcgtctgtctc cgcctgcgttccgttatcagctgactgaacttgcgcgcaaagcgggcaaacgtatcgtactgccggaa ggtgacgaaccgcgtaccgttaaagcagccgctatctgtgctgaacgtggtatcgcaacttgcgtactg ctgggtaatccggcagagatcaaccgtgttgcagcgtctcagggtgtagaactgggtgcagggattga aatcgttgatccagaagtggttcgcgaaagctatgttggtcgtctggtcgaactgcgtaagaacaaagg catgaccgaaaccgttgcccgcgaacagctggaagacaacgtggtgctcggtacgctgatgctgga acaggatgaagttgatggtctggtttccggtgctgttcacactaccgcaaacaccatccgtccgccgctg cagctgatcaaaactgcaccgggcagctccctggtatcttccgtgttcttcatgctgctgccggaacagg tttacgtttacggtgactgtgcgatcaacccggatccgaccgctgaacagctggcagaaatcgcgattc agtccgctgattccgctgcggccttcggtatcgaaccgcgcgttgctatgctctcctactccaccggtactt ctggtgcaggtagcgacgtagaaaaagttcgcgaagcaactcgtctggcgcaggaaaaacgtcctg acctgatgatcgacggtccgctgcagtacgacgctgcggtaatggctgacgttgcgaaatccaaagc gccgaactctccggttgcaggtcgcgctaccgtgttcatcttcccggatctgaacaccggtaacaccac ctacaaagcggtacagcgttctgccgacctgatctccatcgggccgatgctgcagggtatgcgcaagc cggttaacgacctgtcccgtggcgcactggttgacgatatcgtctacaccatcgcgctgactgcgattca gtctgcacagcagcagtaa
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 demonstra as vias metabólicas simplificadas de utilização de diferentes fontes de carbono por microrganismos, em específico bactérias do tipo E. coli. Na figura estão demonstrados os principais genes que podem ser otimizados por meio da técnica apresentada nesta invenção, levando à criação de novas enzimas com maior conversão de substrato em produto e/ou menor suceptibilidade à regulação alostérica. As representações gráficas em vermelho se referem aos genes que codificam
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50/50 para suas respectivas enzimas que catalizam as reações representadas pelas setas na figura.

Claims (14)

  1. REINVIDICAÇÕES
    1. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MÚLTIPLAS FONTES DE CARBONO caracterizado por se tratar de um microrganismo gerado através de um processo de geração de enzimas e fatores de regulação de vias metabólicas envolvidas no metabolismo de glucose, glicerol, xilose e arabinose em E. coli, não se limitando aos genes envolvidos nestas vias metabólicas, podendo ocorrer alterações nas vias centrais e laterais de produção de L-lisina.
  2. 2. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MÚLTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com a reinvidicação 1 caracterizado por se tratar de um microrganismo onde é aplicado engenharia genética para obtenção de estirpes de E. coli capazes de metabolizar múltiplas fontes de carbono.
  3. 3. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MÚLTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por se tratar de um organismo onde é utilizada enzima DNA polimerase humana η para a geração de fragmentos específicos de genes contendo mutações aleatórias.
  4. 4. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MÚLTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por se tratar da obtenção dos promotores nativos dos genes xylA, xylB e xylR mutados no microrganismo a fim de otimizar a expressão dos referidos genes.
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    2/4
  5. 5. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 4, caracterizado por se tratar da obtenção dos genes xylA, xylB e do fator de regulação transcricional xylR mutados no microrganismo a fim de gerar as respectivas enzimas sintéticas após sua expressão, caracterizando a via de metabolismo de xilose otimizada em E. coli.
  6. 6. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 5, caracterizado por se tratar obtenção dos promotores nativos dos genes araA, araB, araC e araD mutados a fim de otimizar a expressão dos referidos genes no microrganismo.
  7. 7. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 6, caracterizado por se tratar da obtenção dos genes araA, araB, araD e do fator de regulação transcricional araC mutados a fim de gerar as respectivas enzimas sintéticas após sua expressão, caracterizando a via de metabolismo de arabinose otimizada em E. coli.
  8. 8. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 7, caracterizado por se tratar obtenção dos promotores nativos dos genes glpF, glpK e glpD mutados a fim de otimizar a expressão dos referidos genes no microrganismo.
  9. 9. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 8,
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    3/4 caracterizado por se tratar da obtenção dos genes glpF, glpK e glpD mutados a fim de gerar o respectivo transportador de glicerol sintético bem como as respectivas enzimas sintéticas após sua expressão, caracterizando a via de metabolismo de glicerol otimizada em E. coli.
  10. 10. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado por se tratar da obtenção dos genes ftsA e ftsZ superexpressos sob controle de um promotor constitutivo sintético, a fim de gerar um organismo com maior capacidade de replicação celular caracterizando a otimização do processo fermentativo.
  11. 11. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado por se tratar da eliminação do controle de repressão do ciclo do ácido cítrico quando em condições de anaerobia ou microaerobia, por meio da deleção do gene arcA, não se limitando a este, podendo também ocorrer a deleção do gene arcB, a fim de gerar um microrganismo que permaneça com o ciclo do ácido cítrico em atividade mesmo em condições de anaerobia ou microaerobia, levando a constante síntese de L-lisina.
  12. 12. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reinvindicações 1 a 11, caracterizado por se tratar da obtenção de um microrganismo geneticamente otimizado para a utilização de múltiplas fontes de carbono para a produção de biomoléculas em escala industrial, como aminoácidos (L-lisina, L-metionina e L-treonina), biopolímeros, antibióticos, entre outros.
  13. 13. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS
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    4/4
    FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado por modificar alterações pré-existentes no microrganismo, fazendo com que o organismo após a aplicação da técnica seja considerado uma nova estirpe, por apresentar um genoma diferente da estirpe inicial.
  14. 14. MICRORGANISMO COM VIAS METABÓLICAS SINTÉTICAS OTIMIZADO PARA PRODUÇÃO DE L-LISINA A PARTIR DE MULTIPLAS FONTES DE CARBONO de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser um microrganismo que possui alterações causadas por pressão seletiva, mutação natural, ou edição gênica direcionada, após a aplicação da técnica principal de modificação ou de outras técnicas de edição gênica.
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