BR102016017335A2 - Composição anti-inflamatória e vacina contra esquistossomose contendo o antígeno recombinante sm1477 e uso - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas anti-inflamatórias e composições vacinais compreendendo a proteína recombinante sm1477sps (sm1477 sem o peptídeo sinal). a tecnologia trata também do uso de tal composição vacinal no tratamento e prevenção contra esquistossomose.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO ANTIINFLAMATÓRIA E VACINA CONTRA ESQUISTOSSOMOSE CONTENDO O ANTÍGENO RECOMBINANTE SM1477 E USO (51) Int. Cl.: A61K 39/00; C07K 14/435; A61P 33/12 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS (72) Inventor(es): SÉRGIO COSTA OLIVEIRA; SUELLEN BATISTONI DE MORAIS; BÁRBARA DE CASTRO PIMENTEL FIGUEIREDO; NATAN RAIMUNDO GONÇALVES DE ASSIS (57) Resumo: A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas anti-inflamatórias e composições vacinais compreendendo a proteína recombinante Sml477sps (Sml477 sem o peptídeo sinal). A tecnologia trata também do uso de tal composição vacinai no tratamento e prevenção contra esquistossomose.

1/21 “COMPOSIÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E VACINA CONTRA ESQUISTOSSOMOSE CONTENDO O ANTÍGENO RECOMBINANTE Sm1477 E USO” [001] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas antiinflamatórias e composições vacinais compreendendo a proteína recombinante Sm1477sps (Sm1477 sem o peptídeo sinal). A tecnologia trata também do uso de tal composição vacinal no tratamento e prevenção contra esquistossomose.

[002] A esquistossomose é uma doença que afeta cerca de 210 milhões de pessoas e 779 milhões vivem em risco de infecção em 76 países (Chitsulo, LD et al. The global status of schistosomiasis and its control. Acta Trop 77(1): 41-51,2000).Os principais agentes causadores da esquistossomose são Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum e Schistosoma haematobium. A espécie S. mansoni, endêmica em 54 países, é a espécie causadora da esquistossomose no Brasil, totalizando 7 milhões de casos dentre as 35 milhões de pessoas em risco de infecção (Chitsulo, LD et al. The global status of schistosomiasis and its control. Acta Trop 77(1): 4151,2000), e os principais estados atingidos são Minas Gerais e Bahia, sendo que a infecção se estende até os estados do Maranhão e Pará totalizando 35 milhões de pessoas em risco de infecção (Chitsulo, LD et al. The global status of schistosomiasis and its control. Acta Trop 77(1): 4151,2000).

[003] Schistosoma mansoni apresenta um complexo ciclo de vida, o qual apresenta hospedeiros intermediários e definitivos (Han, ZG et al. Schistosoma genomics: new perspectives on schistosome biology and hostparasite interaction. Annu Rev Genomics Hum Genet 10: 211-240,2009). É transmitido para o homem através da água contendo caramujos do gênero Biomphalaria contaminados. Na transmissão, o parasito na forma de

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2/21 cercária penetra no homem através da pele e se transforma em esquistossômulo. Este migra para os pulmões e depois para o fígado, onde o amadurecimento sexual é completo e ocorre a cópula entre os vermes adultos macho e fêmea. Os casais migram para os vasos mesentéricos onde se inicia a postura dos ovos pelas fêmeas. Em seguida os ovos podem atravessar o tecido mesentérico para a luz do intestino, onde são eliminados junto com as fezes ou também podem continuar no sistema circulatório e ficarem retidos nos pequenos vasos sinusoidais no fígado. A retenção dos ovos nos tecidos do homem é a principal causa das patologias severas ocorridas nesta doença (Gryseels, B et al. Human schistosomiasis. Lancet 368:110618, 2006).

[004] No momento da transmissão pode ocorrer uma reação do tipo alérgica na pele desencadeada pela penetração do parasito. Febre, dor de cabeça, calafrios, sudorese, fraqueza, falta de apetite, dor muscular, tosse e diarréia, são os sintomas da esquistossomose em sua fase aguda. O fígado e o baço também aumentam devido às inflamações causadas pela presença do verme e de seus ovos. Se não for tratada, a doença pode evoluir para sua forma crônica, onde as fezes geralmente aparecem com sangue e o doente sente tonturas, palpitações, impotência e emagrecimento. Alguns sintomas são decorrentes da obstrução das veias do baço e do fígado, sendo que o desvio do fluxo de sangue pode causar até varizes no esôfago.

[005] As estratégias utilizadas atualmente para o controle da esquistossomose consistem no controle da transmissão e no controle da morbidade. O controle da transmissão visa interromper o ciclo evolutivo do parasito, impedindo que haja infecção de novos casos. No controle da morbidade, o objetivo é impedir o aparecimento de formas hepatoesplênicas. Tal objetivo é alcançado através da realização do diagnóstico e tratamento químico dos pacientes utilizando praziquantel.

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Porém, essas estratégias possuem limitações, sendo a principal delas o desenvolvimento de resistência às drogas utilizadas para o tratamento (Cioli, D. Praziquantel: is there real resistance and are there alternatives? Curr Opin Infect Dis 13(6): 659-663.2000; Doenhoff, MJJR et al. Resistance of Schistosoma mansoni to praziquantel: is there a problem?. Trans R Soc Trop Med Hyg 96(5): 465-469,2000), podendo-se considerar essa abordagem de controle limitada. Visando isso, estratégias diferentes são defendidas, e uma delas seria uma abordagem terapêutica capaz de controlar efetivamente a esquistossomose em longo prazo. Tal abordagem consistiria na combinação da quimioterapia com uma vacina antiesquistossomose (Bergquist, NR. Schistosomiasis: from risk assessment to control. Trends Parasitol 18(7): 309-314,2002) capaz de promover mesmo que uma redução parcial da carga parasitária, diminuindo consideravelmente a patologia e limitando a transmissibilidade da doença (Chitsulo, LP et al. Schistosomiasis. Nat Rev Microbiol 2(1): 12-13,2004). [006] Embora ainda não existam relatos sobre uma vacina efetiva contra parasitos do gênero Schistosoma (Katz, N. Problems in the development of a vaccine against schistosomiasis mansoni. Rev Soc Bras Med Trop 32(6): 705-711,1999; Bergquist, NR. Schistosomiasis: from risk assessement to control.Trends Parasitol 18(7): 309-314,2002; Hagan, P. e Sharaf, O.Schistosomiasis vaccines. Expert Opin Biol Ther 3(8): 1271-1278,2003), nos últimos anos grandes esforços vêm sendo despendidos por organismos internacionais e institutos de pesquisa visando desenvolver uma vacina contra a esquistossomose (Katz, N. Problems in the development of a vaccine against schistosomiasis mansoni. Rev Soc Bras Med Trop 32(6): 705-711,1999; McWilliam, HEP et al.Novel immunomic technologies for schistosome vaccine development. Parasite Immunol 34(5): 276-284,2012). [007] A publicação dos transcriptomas dos parasitos S. japonicum e S. mansoni em 2003 (Hu, WQ et al.Evolutionary and biomedical implications of

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4/21 a Schistosoma japonicum complementary DNA resource. Nat Genet 35(2): 139-147,2003; Verjovski-Almeida, SR et al. Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2): 148157,2003) propiciaram avanços consideráveis na área genômica (El-Sayed, NM et al. Advances in schistosome genomics. Trends Parasitol 20(4): 154157,2004) e no estudo da biologia molecular de vermes do gênero Schistosoma (Loukas, A et al. Schistosome membrane proteins as vaccines.Int J Parasitol 37(3-4): 257-263,2004), como também na descrição e caracterização de genes e suas funções (Farias, LP et al. Schistosoma mansoni Stomatin like protein-2 is located in the tegument and induces partial protection against challenge infection. PLoS Negl Trop Dis 4(2): e597,2010). Assim, o genoma de S. mansoni foi totalmente sequenciado em 2009 (Berriman, MBJ et al.The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature 460(7253): 352-358,2009) e os demais trabalhos publicados têm proporcionado muitas informações importantes na identificação de antígenos para o desenvolvimento de vacinas, diagnóstico e entendimento da relação parasita-hospedeiro em diversas doenças.

[008] Como verificado nesses trabalhos, candidatos vacinais incluem proteínas que são preferencialmente secretadas ou expostas na superfície do parasito, como também expressas em estágios infectantes aos mamíferos. Proteínas homólogas às toxinas, receptores para fatores do hospedeiro, moléculas envolvidas em adesão celular, proteínas de membrana ou expostas à superfície, enzimas e inibidores são postuladas como sendo candidatos potenciais para o desenvolvimento de vacinas (Verjovski-Almeida,S.T ranscriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2): 148-157,2003).

[009] Proteínas ancoradas e secretadas na superfície do helminto são as que apresentam os resultados mais promissores quando testadas como vacina. Em testes realizados com o tegumento purificado de S. mansoni

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5/21 (Smteg) verificou-se que este induziu proteção parcial em modelo murino (Araujo JM et al. Schistosoma mansoni schistosomula tegument (Smteg) immunization in absence of adjuvant induce IL-10 production by CD4+ cells and failed to protect mice against challenge infection. Acta Trop 124:140146,2012). Estudos realizados com as proteínas do tegumento Sm29 (Cardoso FC et al. Schistosoma mansoni tegument protein Sm29 is able to induce a Th1-type of immune response and protection against parasite infection. PLoS Negl. Trop. Dis. ;2:e308,2008). e SmTSP-2 (Tran MH et al.Tetraspanins on the surface of Schistosoma mansoni are protective antigens against schistosomiasis. Nature Med. 12:835-840,2006) recombinantes, demonstraram potencial protetor contra esquistossomose quando utilizadas como vacina em camundongos C57BL/6.

[0010] Apesar dos resultados promissores, nenhum antígeno alcançou altos níveis de proteção. Dessa forma, a busca por antígenos mais eficientes permanece e uma proteína secretada de S. mansoni se tornou alvo de estudos para produção de uma vacina anti-esquistossomose. A proteína denominada Sm1477.sps (Inibidor de serino protease do tipo Kunitz de S. mansoni) é produzida e secretada pelo parasito, possui o domínio Kunitz, região presente em inibidores de serino proteases e provavelmente realiza esta atividade biológica nos parasitos. Em geral, as serino proteases e seus inibidores estão envolvidos em processos fisiológicos fundamentais em invertebrados que têm paralelo com processos existentes em animais como, por exemplo, bloqueio de canais iônicos, coagulação sanguínea, e a resposta imune inata de alguns animais (Agarwala KL, et al. Limulus intracellular coagulation inhibitor type 3. Purification, characterization, cDNA cloning, and tissue localization. J Biol Chem. 271(39):23768-74,1996; Imler JL e Hoffmann JA.Toll and Toll-like proteins: an ancient family of receptors signaling infection. Rev Immunogenet. 2(3):294-304,2000; Yuan CH, et al. Discovery of a distinct superfamily of Kunitz-type toxin (KTT) from

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6/21 tarantulas. PLoS ONE 3: e3414,2008; Wan H, et al. A Spider-Derived Kunitz-Type Serine Protease Inhibitor That Acts as a Plasmin Inhibitor and an Elastase Inhibitor. PLoS ONE 8(1): e53343, 2013).

[0011] Estudos realizados para desenvolver a presente tecnologia levaram ao isolamento e identificação de uma proteína candidata ao desenvolvimento de vacina contra a esquistossomose e identificação da mesma como uma molécula anti-inflamatória. A proteína Sm1477.sps é um inibidor de proteases, e tais inibidores são constituídos de cerca de 60 em resíduos de aminoácidos que exibem características tais como dois ou três pontes de dissulfeto, que contribuem para a natureza estável do peptídeo enovelado em sua conformação ativa, e um aminoácido chamado P1, local que corresponde à especificidade do sítio catalítico da enzima alvo. (Zupunski V. Adaptive evolution in the snake venom Kunitz/BPTI protein family. FEBS Lett 547(1-3): 131-136, 2003; Yuan CH, et al. Discovery of a distinct superfamily of Kunitz-type toxin (KTT) from tarantulas. PLoS ONE 3: e3414,2008). A Sm1477.sps possui um domínio do tipo Kunitz que pode funcionar como inibidor de serinopreoteases (Ranasinghe SL, et al.Functional expression of a novel Kunitz type protease inhibitor from the human blood fluke Schistosoma mansoni. Parasites & Vectors. 8:408, 2015), e geralmente demonstram atividade inibitória contra a tripsina (Zhao R, et al. SdPI, the first functionally characterized Kunitz-type trypsin inhibitor from scorpion venom.PLoS One 6(11): e27548, 2011), e quimotripsina (Wang H, et al. Functional peptidomics of amphibian skin secretion: A novel Kunitz-type chymotrypsin inhibitor from the African hyperoliid frog, Kassina senegalensis.Biochimie 94(3): 891-899,2012), ou de ambas (He YY, et al.Isolation, expression and characterization of a novel dual serine protease inhibitor, OH-TCI, from king cobra venom. Peptides 29(10): 16921699,2008).

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7/21 [0012] O documento de patente US5597570, intitulado “Protein recognized by antibodies raised against native P28 of Schistosoma mansoni” relata o desenvolvimento de uma vacina contra Schistosoma. O documento descreve um antígeno que inclui epitopos da proteína P28, um vírus da família poxviridae contendo o gene que codifica a dita proteína, uma célula incorporando um vetor para expressão da proteína, um método para preparação da proteína, uma sequencia de DNA codificadora para a proteína P28, uma composição farmacêutica, anticorpos contra a proteína e sua aplicação por diversas formas como agente de diagnóstico para esquistossomose. A tecnologia se difere do presente pedido por se tratar de outra molécula proteíca, não relacionada.

[0013] O documento de patente US5730984, intitulado “Vaccine against helminth infection comprising Sm-14 fatty acid binding protein of Schistosoma mansoni” descreve uma vacina contra infecção por helmintos, compreendendo uma proteína Sm14 de S. mansoni. A invenção relata um material antigênico derivado de helmintos capaz de induzir resposta efetiva e proteção de longa duração contra parasitas, em particular antígenos que mediam imunidade contra helmintos. Além disto, uma composição imunogênica apta a conferir proteção parcial contra helmintos patogênicos, compreendendo uma soma efetiva da proteína isolada Sm14, protegendo contra S. mansoni também incorpora o documento de patente. A tecnologia se difere da contida no presente pedido por se tratar de outra proteína.

[0014] O documento de patente US5804200, intitulado “Parasitic nematode proteins and vaccines” diz respeito à obtenção e uso de proteínas e vacinas de parasitas nematóides imunogênicos derivados de proteínas isoláveis de nematóides parasitas em mamíferos, nos estágios de larva L3 e L4, incluindo uma proteína de aproximadamente 20,5 kDa. As proteínas da invenção são identificadas com uso de materiais biológicos utilizados para destruir ou prejudicar o parasita nematóide num hospedeiro. A tecnologia

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8/21 se difere do presente pedido por se tratar de outro tipo proteico contido em outra espécie de organismo, Dirofilaria immitis.

[0015] Ranasinghe e colaboradores caracterizaram (2015) funcionalmente a proteína inibidora de protease do tipo Kunitz de S. mansoni SmKI-1. Os autores descrevem que a proteína é expressa apenas em vermes adultos, tem propriedade anticoagulante e atividade inibitória para algumas proteases (Ranasinghe SL, et al.Functional expression of a novel Kunitz type protease inhibitor from the human blood fluke Schistosoma mansoni. Parasites & Vectors. 8:408, 2015). Na presente tecnologia descreve-se a proteína Sm1477.sps, de 126 aminoácidos, que apresenta uma estrutura tridimensional diferente da proteína do documento citado, além de apresentar maior solubilidade e maior rendimento de produção da proteína recombinante. Além do mais, a presente invenção descreve composições anti-inflamatórias e uma composição vacinal para prevenção e tratamento de infecções por S. mansoni, o que não está previsto no documento citado. [0016] Dessa forma, não foi encontrado no estado da técnica uma tecnologia semelhante à presente invenção, que trata de composições farmacêuticas anti-inflamatórias e composições vacinais contendo a proteína recombinante Sm1477.sps, a qual possui atividade antigênica contra infecção pelo mesmo parasita, obtendo-se assim um veículo vacinal contra a esquistossomose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0017] A figura 1 apresenta a sequencia de aminoácidos e a predição da estrutura quaternária da proteína Sm1477.sps sem os aminoácidos que determinam o peptídeo sinal. (A) Região rica em cisteínas forma o domínio Kunitz, região de interação com tripsina e quimiotripsina. Metionina adicionada a sequência aminoacídica da proteína Sm1477.sps, uma vez que foi retirado o peptídeo sinal da mesma, destacada em azul. Em amarelo estão evidenciados os aminoácidos cisteína (3 pares), em

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9/21 vermelho o aminoácido arginina na posição P1 e a sequência sublinhada corresponde ao domínio Kunitz da Sm1477.sps. (B) Predição do modelo 3D determinado pelo programa PHYRE2.

[0018] A figura 2 representa o perfil de expressão de Sm1477.sps em diferentes fases do ciclo de vida de S. mansoni. Análise por RT-PCR quantitativo demonstra os níveis relativos de transcritos de Sm1477.sps em diferentes fases do ciclo de vida de S. mansoni (ovos, miracídio, cercária, esquistossômulo e verme adulto). Diferenças estatisticamente significativas em relação aos miracídios, cercárias e ovos são indicadas por *, # e &, (p< 0,05). As barras de erro indicam o desvio padrão das médias de duplicatas em um mesmo ensaio.

[0019] A figura 3 representa a análise da purificação de rSm1477.sps. Expressão heteróloga e purificação de rSm1477.sps são mostradas. (A) SDS-PAGE corado com Coomassie azul brilhante mostrando a rSm1477.sps eluída após purificação por cromatografia em coluna carregada com Ni2+. (B) Análise por Western blot da proteína rSm1477.sps purificada e reconhecida por anticorpo anti-His monoclonal produzido em camundongo. O padrão de proteína de peso molecular (PM) utilizado é précorado.

[0020] A figura 4 apresenta a cinética de produção de anticorpos anti-IgG, IgG1 e IgG2a específicos contra rSm1477.sps nos soros de camundongos vacinados com preparações rSm1477.sps e Freund. (A) Cinética da produção de IgG anti-rSm1477.sps em camundongos imunizados. Coletouse os soros de 8 animais de cada grupo imunizados nos dias 15, 30, 45, 60, 75 e 90 e avaliados por ELISA. As setas indicam cada imunização. (B) Cinética de IgG1 e (C) IgG2a específicos.*Grupo rSm1477.sps estatisticamente significativo em relação ao grupo controle PBS. Valores de p<0,05. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

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10/21 [0021] A figura 5 descreve a proteção conferida aos camundongos contra infecção por S. mansoni após vacinação com rSm1477.sps. Carga parasitária de camundongos imunizados com rSm1477.sps e desafiados com S. mansoni é indicada. Camundongos vacinados com rSm1477.sps apresentaram redução de 45,3-51,4% da carga de helmintos adultos no ensaio. A diferença estatisticamente significativa entre o número de helmintos recuperados em camundongos vacinados com rSm1477.sps e o grupo controle é denotada por dois asteriscos (**). P <0,05.

[0022] A figura 6 apresenta o oograma do fígado de camundongos vacinados com rSm1477.sps. Oograma representando a redução de 25,736% do número de ovos por grama de tecido hepático avaliados em camundongos imunizados é mostrado. A diferença estatisticamente significativa entre o número de ovos presentes no fígado de camundongos vacinados com rSm1477.sps e o grupo controle é denotada por dois asteriscos (**). P <0,05.

[0023] A figura 7 representa a análise histológica do tecido hepático de camundongos vacinados com rSm1477.sps. (A) Uma redução de 33 % foi observada na área do granuloma (média+/-SD) em secções do fígado de vacinados com rSm1477.sps (barras pretas) em relação ao grupo controle (barras brancas). (B) Redução de 31 % no número de granulomas em camundongos vacinados é observada após a vacinação com rSm1477.sps (barras pretas) contra o controle. (C) Imagem representativa de um granuloma detectado em uma secção do fígado corado eosina-hematoxilina de um camundongo controle (PBS), comparada com a de um camundongo vacinado com rSm1477.sps. A barra representa 0,05 mm.

[0024] A figura 8 descreve o perfil de citocinas em camundongos imunizados com rSm1477.sps. Uma semana após a imunização final, os esplenócitos de cinco camundongos foram isolados e testados quanto a produção de IFN-γ (A), TNF-α (B) e IL-10 (C), em resposta ao meio,

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11/21 rSm1477.sps (25 pg/ml), ConA e LPS, conforme indicado. O grupo controle foi imunizado com PBS mais adjuvante de Freund (CFA / IFA). Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão para cada grupo. A diferença estatisticamente significativa entre as citocinas produzidas por células de baço de camundongos vacinados com rSm1477.sps e o grupo controle é denotada por três asteriscos (***). P<0,001. Os resultados apresentados são representativos de três ensaios independentes [0025] A figura 9 descreve a inibição de serino proteases por Sm1477.sps recombinante. As enzimas foram incubadas com rSm1477.sps e BSA (controle) na mesma concentração. A inibição das enzimas foi detectada durante a incubação de duas horas da Tripsina (A), Elastase (B) e Plasmina (C) com rSm1477.sps. As barras de erro indicam a média ± desvio padrão. Os asteríscos indicam diferenças estatisticamente significativas na presença da rSm1477.sps (barras pretas) em comparação com grupo controle (barras brancas) e grupos incubados com BSA (barras cinza) (p<0,05). Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.

[0026] A figura 10 apresenta a inibição da atividade da Elastase Neutrofílica pela proteína Sm1477.sps recombinante em cultura de neutrófilos ativados. Os neutrófilos em cultura foram ativados com ou sem fMLP e a liberação da enzima Elastase foi mensurada pela degradação do sustrato colorimétrico presente no sobrenadate. Na presença da proteína recombinante Sm1477.sps é evidenciada a diminuição da atividade da enzima elastase em cultura, representada pela diminuição da leitura da absorbância em filtro 405nm. A inibição foi considerada dose dependente. Os asteríscos indicam diferenças estatisticamente significativas na presença da rSm1477.sps (barras pretas) em comparação com grupos controle (barras brancas)

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12/21 (p<0,05). Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.

[0027] A figura 11 representa a redução de lesão hepática induzida por APAP pela proteína Sm1477.sps de S. mansoni. As atividades das enzimas (A) elastase e (B) MPO foram mensuradas a partir do fígado que foi induzido hepatotoxicidade com APAP e inoculação de rSm1477.sps. (C) Número de neutrófilos por campo de visão (FOV) no fígado e (D) imagens de microscopia confocal intravital representam a migração de neutrófilos (anti- GR1 PE em vermelho) para zonas necróticas do tecido hepático (Sytox, coloração verde) após 24 horas do desafio com APAP. Barra de escala 100pm. (E e F) A histologia e os níveis séricos de ALT confirmaram lesão hepática grave no grupo APAP e redução da necrose hepática no APAP+Sm1477.sps.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [0028] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas antiinflamatórias e composições vacinais compreendendo a proteína recombinante Sm1477sps (Sm1477 sem o peptídeo sinal). A tecnologia trata também do uso de tal composição vacinal no tratamento e prevenção contra esquistossomose.

[0029] Mais especificamente, a composição vacinal proposta caracteriza-se por compreender a proteína recombinante definida pela SEQ ID N°1 e excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, sendo capaz de induzir imunidade protetora humoral contra a esquistossomose e modular o sistema imunológico com indução de citocinas, tais como IL-10, TNF-α e IFN-γ. Preferencialmente, o excipiente pode ser constituído de adjuvante de Freund ou qualquer outro adjuvante capaz de gerar respostas imunológicas do tipo humoral e celular.

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13/21 [0030] A composição vacinai proposta pode ser inoculada por via subcutânea ou qualquer outra via capaz de induzir a produção de anticorpos e uma resposta celular específicos para a Sm1477.sps .

[0031] A composição vacinai proposta pode ser usada no tratamento e na prevenção contra esquistossomose.

[0032] A composição anti-inflamatória proposta na presente invenção caracteriza-se por compreender a proteína recombinante definida pela SEQ ID N° 1 e excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, podendo ser administrada através de injeção intravenosa, ou qualquer outra forma de inoculação, sob forma de medicamento e/ou coquetel antiinflamatório, em diferentes concentrações, as quais promovam redução da migração de neutrófilos para o sítio da inflamação ocasionado por ingestão de drogas que promovam lesão tecidual ou inflamação desencadeada por patógenos que desencadeiem migração neutrofílica.

[0033]Análises da estrutura primária de aminoácidos da Sm1477 foram realizadas utilizando o ExPASy (Expert Protein Analysis System), sendo este um site público de programas de bioinformática com acesso livre. A presença do peptídeo sinal (sequência de exportação para o meio extracelular) foi identificada através do programa SignalP 4.1. Apresenta tamanho de 26 aminoácidos na porção N-terminal (1 MFSFCLYGTLLLICVQSVASY 21). Além disso, foi identificado o domínio Kunitz presente em inibidores de serino proteases através do programa Pfam 3.8. Onde se verificou em sua sequência 3 pares de cisteína (amarelo), que contribuem para a natureza estável da estrutura quaternária do peptídeo, e um aminoácido arginina na posição P1 (vermelho) (Figura

1), que corresponde ao aminoácido presente na posição P1 do substrato específico para a enzima alvo. Na presente tecnologia foi utilizado parte da proteína, com a retirada do peptídeo sinal da sequência gênica da Sm1477.sps para promover maior solubilidade e melhor rendimento da

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14/21 proteína recombinante, assim como alteração do enovelamento da molécula recombinante que impacta na sua função. A obtenção da Sm1477.sps solúvel é de extrema importância para experimentação da mesma em ensaios vacinais e de inibição da resposta inflamatória. Dessa forma, a clonagem da sequência do gene da Sm1477.sps foi fabricada pela empresa DNA 2.0, Inc. EUA (https://www.dna20.com) utilizando algoritmos de otimização da sequência gênica para a expressão em Escherichia coli. O plasmídeo escolhido foi pJexpress 414.

[0034] A produção da proteína dessa forma apresentou resultados que evidenciam sua capacidade como vacina anti-esquistossomose e molécula anti-inflamatória quando utilizada nessa conformação.

[0035] As análises de transcrição da Sm1477.sps nos estágios do parasito mostram que esta é expressa em todas as fases que estão em contato com o hospedeiro mamífero, principalmente em esquistossômulos de fase pulmonar (Figura 2). Desta forma, pode-se inferir que bloqueando a atividade deste antígeno seria possível combater a esquistossomose em fases recentes da infecção, causadas pelo esquistossômulo, não permitindo o desenvolvimento de formas mais severas da doença.

[0036] A obtenção de proteína recombinante foi realizada em sistema procarioto, podendo ser utilizado qualquer sistema de expressão recombinante procarioto ou eucarioto capaz de produzir a proteína recombinante em questão, sendo preferencialmente utilizado o sistema com bactérias Escherichia coli.

[0037] Qualquer método de purificação capaz de isolar Sm1477.sps pode ser aplicado, sendo preferencial a utilização de sistema de afinidade para cauda de seis histidinas.

[0038] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.

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EXEMPLO 1. OBTENÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE Sm1477.sps [0039] A proteína Sm1477.sps recombinante foi expressa em bactérias (Escherichia coli) e após a otimização das condições de expressão e purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel, observouse um bom rendimento e excelente pureza como demonstrado por eletroforese em gel de poliacrilamida e western blot (Figura 3).

[0040] Produção da proteína Sm1477.sps recombinante.. Para obtenção da proteína Sm1477.sps recombinante sem peptídeo sinal (rSm1477.sps), o fragmento do cDNA codificador da proteína correspondente a região da sequência de aminoácidos 22 - 146, sem peptídeo sinal N-terminal, é expresso em E. coli. Este fragmento de cDNA foi subclonado no vetor de expressão pJexpress 414 (DNA 2.0, USA) que expressa a proteína recombinante com uma fusão C-terminal de seis histidinas. Para indução da expressão da Sm1477.sps, 1 litro de cultura contendo meio LB e bactéria BL21(DE3) com o plasmídeo recombinante é crescido à 37°C até a OD600 de 0.6 - 0.8. Após atingir OD₆₀₀ desejada, a cultura é induzida com IPTG durante 5 horas, as células coletadas por centrifugação e ressuspendidas em tampão de lise. As células são lisadas por sonicação e a Sm1477.sps recombinante contida nos corpos de inclusão é ressupendida em tampão desnaturante.

[0041] A purificação da Sm1477.sps recombinante é feita em sistema de afinidade para cauda de seis histidinas. Esta metodologia permite uma produção em larga escala com a vantagem de se obter um material altamente purificado, eliminando proteínas contaminantes indesejáveis presentes nos cultivos celulares. Para tal, a purificação da proteína recombinante é realizada através de cromatografia de afinidade ao níquel sob condição desnaturante, podendo ser usado qualquer outro sistema de purificação capaz de purificar a Sm1477.sps recombinante. Primeiramente, a coluna de níquel é equilibrada com tampão de corrida desnaturante,

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16/21 seguida da solução contendo a proteína recombinante. Após lavagem da coluna com tampão de ligação para eliminação de contaminantes, a proteína recombinante é desligada da coluna com tampão de eluição. A dessalinização da Sm1477.sps purificada é realizada em coluna de gel filtração, podendo ser usado qualquer outro método de dessalinização que seja capaz de trocar o tampão de eluição por um tampão fisiológico. Para tal, a coluna de gel filtração é equilibrada com tampão fisiológico, seguida da proteína purificada. A separação do sal contido na proteína recombinante purificada ocorre quando esta passa pela coluna, onde o tampão desnaturante da proteína purificada é substituído por tampão fisiológico.

EXEMPLO 2. PROTEÇÃO CONTRA INFECÇÃO POR S. mansoni CONFERIDA A ANIMAIS VACINADOS COM Sm1477.sps [0042] A vacinação de camundongos com a Sm1477.sps recombinante foi realizada em três doses em intervalos de 15 dias com o objetivo de manter uma elevada produção de anticorpos específicos e ativar o sistema imunológico celular, garantindo a formação da memória imunológica, podendo ser realizada com outra quantidade e em qualquer número de doses, desde que estas sejam suficientes para manter uma elevada estimulação.

[0043] Sm1477.sps foi administrada por via subcutânea, podendo ser administrada por qualquer outra via capaz de induzir a produção de anticorpos e uma resposta celular específicos para a Sm1477.sps. O preparo da vacina para imunização apresenta uma formulação que contém 10-50 Dg de proteína Sm1477.sps adicionada ou não de adjuvante de Freund. O adjuvante de Freund associado a Sm1477.sps é utilizado para potencializar a formação da resposta imunológica humoral e celular, sendo que este pode ser substituído por qualquer outro adjuvante capaz de ativar a formação de uma resposta imunológica humoral e celular satisfatória. A

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17/21 metodologia usada para a vacinação de animais utilizando a Sm1477.sps recombinante e adjuvante de Freund completo e incompleto é descrita em quatro fases: 1^a: Dose da vacina contendo 10-50 Dg de proteína Sm1477.sps adicionada ou não de adjuvante de Freund; 2a: Dose através de injeção via subcutânea; 3a: Dose após 15 dias, na terceira fase é aplicada a primeira dose de reforço com 10-50 Dg; 4a: Dose após 30 dias da primeira dose, na fase quatro é aplicada a segunda dose de reforço com 10-50 Dg de proteína Sm1477.sps acrescida ou não de adjuvante de Freund.

[0044] Ensaios pré-clínicos de vacinação em animais experimentais. Ensaios clínicos revelaram a produção de altos níveis de anticorpos IgG totais, IgG1 e IgG2a específicos contra a Sm1477.sps (Figura 4) e uma redução do número de vermes adultos em torno de 51,4% (Figura 5) em animais vacinados com a rSm1477.sps comparados a animais nãovacinados após a infecção com 100 cercárias. Quando avaliado o fígado de animais experimentais, observa-se uma redução no número de ovos por grama do órgão, pelos animais imunizados com rSm1477.sps em comparação com imunizado com apenas PBS de 36% (Figura 6). Também foi avaliado o desenvolvimento dos granulomas nos animais imunizados e verificou-se redução no número de granulomas e da área dos mesmos, presentes no fígado de camundongos vacinados com a rSm1477.sps, 33% e 31% respectivamente (Figura 7).

[0045] Avaliação da resposta imune celular de animais imunizados com Sm1477.sps recombinante. A produção de citocinas pela cultura de esplenócitos de animais imunizados foi avaliada com os estímulos, rSm1477.sps ou controles positivos (ConA ou LPS). Após as imunizações, altos níveis de IFN-γ e TNF-α foram detectados nos sobrenadantes de células de animais imunizados com rSm1477.sps e estimuladas com essa proteína em comparação com células de animais imunizados com PBS

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18/21 (Figura 7). Estes resultados indicam que rSm1477.sps promove o desenvolvimento de um perfil de resposta Th1 em células T de camundongos imunizados com a rSm1477.sps. Quanto aos níveis de IL-10 avaliados, verificou-se que a proteína Sm1477.sps induz níveis elevados de IL-10, quando comparado com o grupo controle em experimento realizado após a terceira imunização com rSm1477.sps PBS (Figura 8).

EXEMPLO 3. INIBIÇÃO DE PROTEASES PELA PROTEÍNA Sm1477.sps [0046] Foram monitoradas as cinéticas de inibição através da análise de variações na densidade ótica das amostras. A atividade inibitória da Sm1477.sps foi testada sobre três serino proteases, Tripsina, Elastase e Plasmina. Como controle negativo para inibição foi utilizado 200 nM de albumina de soro bovino (BSA) em todos os ensaios. A atividade enzimática residual de cada enzima avaliada foi determinada a 405 nm de acordo com o respectivo substrato colorimétrico específico para cada enzima.

[0047] Avaliação do efeito inibitório de serino proteases pela proteína Sm1477.sps recombinante in vitro. No primeiro ensaio, a tripsina bovina (100 nM) foi incubada em 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo CaCl₂ 20 mM e 0,05% de Triton X-100 com 100 nM de rSm1477.sps a 37°C por duas horas. A atividade enzimática residual foi determinada a 405 nm a cada 30 minutos, utilizando o substrato BApNA 0,5 mM. Também foram conduzidos outros testes de inibição contendo 100 nM de elastase de neutrófilos humana (e 250 nM rSm1477.sps, com incubação a 37°C durante duas horas em tampão 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), e a atividade residual da enzima foi determinada a 405 nm a cada 30 minutos, usando 0,5 mM de substrato S4760. Além disso, 300 nM de plasminogênio humano foi incubado com 50 ng de tPA (ativador de Plasminogênio) (em conjunto 600 nM de rSm1477.sps em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) a 37°C durante quatro horas e a atividade enzimática residual foi determinada a 405 nm a

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19/21 cada 60 minutos, utilizando o substrato de 0,5 mM de D-Val-Leu-Lys dicloridrato de 4-nitroanilida. Foi observado que utilizando rSm1477.sps em baixas concentrações nestes ensaios enzimáticos, obteve-se a redução da atividade das três serino proteases testadas neste trabalho em aproximadamente 90% (Figura 9). Estes resultados mostram que rSm1477.sps tem atividade anti elastolítica e também atividade antifibrinolítica descrita primeiramente neste trabalho.

[0048] Ensaios de inibição da atividade enzimática da Elastase secretada por Neutrófilos em cultura na presença do antígeno recombinante Sm1477.sps. A atividade da elastase neutrofílica foi avaliada a partir de neutrófilos ativados. Neutrófilos (1,0x 10⁷ células) foram preparados em meio de incubação contendo tampão PBS, CaCl2 0,9 mM e 0,49 mM MgCl₂, durante 10 minutos a 37°C. Os neutrófilos foram então estimulados com fMLP (N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine) com 100 μΜ durante mais 10 minutos antes da adição de concentrações crescentes da proteína Sm1477.sps (15μΜ, 20μΜ e 40μΜ) e de BSA (40μΜ). Após meia hora de incubação foi adicionado 0,25mM do substrato colorimétrico N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide S4760 (Sigma). A clivagem do substrato foi monitorida a partir de 2 horas com leitura do sobrenadante a 405 nm. Cada reação (200 μL) foi realizada em triplicata em uma placa de 96 poços.

[0049] Avaliação do efeito inibitório da Elastase em cultura de Neutrófilos pela proteína Sm1477.sps recombinante in vitro. A inibição da atividade da elastase em cultura de neutrófilos foi observada através da determinação da quantidade de substrato degradado no meio, indicado pela alteração de cor do sobrenadante. Amostras contendo concentrações cescentes da proteína Sm1477.sps (15μΜ, 20μΜ e 40μΜ) apresentaram menor atividade da elastase quando comparados com as amostras contendo apenas neutrófilos e substrato assim como as amostras contendo

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40μΜ de BSA (proteína controle) (Figura 10). Foi demonstrada que a inibição da atividade da elastase neutrofílica é dose dependente, uma vez que aumentando a concentração da Sm1477.sps foi possível diminuir a atividade enzimática em cultura durante as 20 horas de experimento em até 70%, após o tratamento dos neutrófilos com 40μΜ de Sm1477.sps (Figura 10).

EXEMPLO 3. ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DE Sm1477.sps [0050] Avaliação do efeito anti-inflamatório da proteína Sm1477.sps recombinante in vivo em um modelo de lesão hepática induzida por paracetamol Paracetamol (APAP) foi dissolvido em salina morna antes de gavagem. Os camundongos foram mantidos em jejum durante 15 horas antes da administração de APAP (600 mg/kg) ou solução salina estéril quente como veículo. Imediatamente após o tratamento de APAP, rSm1477.sps foi administrada via intravenosa nos grupos de APAP+SmKI. Após 24 horas de lesão induzida, atividade no soro das enzimas alanina aminotransferase (ALT) foi realizada utilizando um teste de cinética. Os fragmentos de fígado foram recolhidos para histologia hepática hematoxilina e eosina [H & E]), mieloperoxidase (MPO) e a atividade da elastase neutrofílica. Enzimas estas, que são secretadas por neutrófilos que migram para o local de inflamação. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue, e que conduzem a primeira onda de defesa do hospedeiro contra infecção ou danos nos tecidos. No entanto, o excesso de infiltração e ativação de neutrófilos no local de dano do tecido podem causar inflamação crônica, limitar a reparação de lesão e levar à perda function de um órgão.

[0051] Para realização da microscopia intravital do fígado, os camundongos foram anestesiados. Todos os fluoróforos foram injetados via intravenosa 10 minutos antes da imagiologia, eles foram: Sytox verde (^L/camundongo) e anti-GR1 conjugado com PE (^L/camundongo).

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Os fígados dos animais foram observados usando um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti do Centro de Aquisição e Processamento de Imagens. Capturadas as imagens, o número de neutrófilos presentes no fígado dos grupos de trabalho foi contabilizado.

[0052] Os paramêtros para determinação da lesão hepática foram analisados em animais que receberam APAP e um segundo grupo que além de receberem APAP receberam injeção de rSm1477.sps. O grupo que APAP+rSm1477.sps apresentou redução da atividade enzimática da elastase neutrofílica e mieloperoxidade de 46% e 65% respectivamente (Figura 11 A e B). E também foi observado a redução da concentração da enzima ALT presente no soro dos animais que receberam APAP+rSm1477.sps em 44% com relação ao APAP (Figura 11 F), resultado que corrobora com a histopatologia dos fígados dos respectivos grupos tratados (Figura 11 E), que demonstra a menor área de lesão do fígado em animais do grupo APAP+rSm1477.sps. Quando avaliados os fígados dos camundongos em experimento intravital foi observado a diminuição da lesão induzida por APAP e também no número de de neutrófilos presentes no fígado do grupo que recebeu rSm1477.sps intravenosa em 72% (Figura 11 C e D).

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Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA ESQUISTOSSOMOSE, caracterizada por compreender a proteína recombinante definida pela SEQ ID N°1 e adjuvantes e/ou excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.
2. 2- COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA ESQUISTOSSOMOSE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela capacidade de induzir imunidade protetora humoral contra a esquistossomose e pela modulação do sistema imunológico com indução de citocinas, tais como IL-10, TNF-α e IFN-γ.
3. 3- COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA ESQUISTOSSOMOSE, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo adjuvante ser preferencialmente o adjuvante de Freund, ou qualquer outro adjuvante capaz de gerar respostas imunológicas do tipo humoral e celular.
4. 4- COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA ESQUISTOSSOMOSE, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser inoculada por via subcutânea ou qualquer outra via capaz de induzir a produção de anticorpos e uma resposta celular específicos para a Sm1477.sps .
5. 5- COMPOSIÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA, caracterizada por compreender a proteína recombinante definida pela SEQ ID N° 1 e excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.
6. 6 - COMPOSIÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser administrada através de injeção intravenosa, ou qualquer outra forma de inoculação, sob forma de medicamento e/ou coquetel anti-inflamatório, em diferentes concentrações, as quais promovam redução da migração de neutrófilos para o sítio da inflamação ocasionado por ingestão de drogas que promovam lesão tecidual ou inflamação desencadeada por patógenos que desencadeiem migração neutrofílica.

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   6- USO DA COMPOSIÇÃO VACINAL definida pelas reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser no tratamento e prevenção contra esquistossomose.

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   DESENHOS

   A

   MrkgnsdclldydegicRallkrfyydsvnqtceifyyggclgngnnflskee

   ÇERKÇGGQIYMTEKSFETTKQMETTSTSIDRSDNTETTITTQKPLSVGAKIVLGIL

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   B