BR102016004653A2 - processo compacto de produção de vacina antirrábica veterinária utilizando células bhk-21, vírus pv e método de perfusão - Google Patents

Abstract

processo compacto de produção de vacina antirrábica veterinária utilizando células bhk-21, vírus pv e método de perfusão. a invenção descreve um processo de produção de vacina antirrábica para uso veterinário moderno, de alta qualidade, eficaz, com baixo custo de produção e com capacidade de competir em igualdade com as tecnologias disponíveis no brasil e exterior. além disso, o processo desenvolvido buscou reduzir ao máximo a quantidade de operações pós coleta do antígeno viral para compactar a área de produção e, dessa forma, reduzir os custos de implantação da tecnologia e de produção, simplificando o processo sem sacrificar a qualidade da vacina produzida. a vacina é produzida utilizando a linhagem celular bhk-21, vírus pv e biorreator do tipo agitado operando pelo método de perfusão com dispositivo fixado internamente no biorreator. essa configuração proporciona vantagens nos processos de multiplicação de células, de vírus e de coleta do antígeno, possibilitando valores menores de moi (multiplicidade de infecção) e o uso da perfusão em escala industrial por um longo período, incrementando a produtividade. além disso, na presente patente não há necessidade de processo de clarificação, concentração e purificação da coleta do biorreator, possibilitando diferenciar este processo do descrito na literatura sobre produção industrial de antígeno antirrábico veterinário.

Description

Processo compacto de produção de vacina antirrábica veterinária utilizando células BHK-21, vírus PV e método de perfusão.

CAMPO TÉCNICO

[001] A raiva está presente em todo o mundo e representa um grave problema para a saúde pública, especialmente em países em desenvolvimento, devido à sua alta letalidade tanto em humanos quanto em animais (Meslin, 1997; WHO, 2013). No último relatório divulgado pela OMS (Organização Mundial da Saúde) em 2015 estima-se 60 mil mortes relacionadas às endemias de raiva no mundo, sendo a África e a Ásia responsáveis por mais de 95% dos casos em humanos. A maior parte dos casos ocorre na área rural e 40% das pessoas que são mordidas por animais raivosos suspeitos são crianças com menos de 15 anos de idade (WHO, 2015).

[002] A prevenção da raiva humana é possível, principalmente através da vacinação de animais hospedeiros transmissores da doença, cães e gatos em sua maioria. O controle do vírus circulante e sua manifestação nos animais hospedeiros é a maneira mais eficaz de diminuir a incidência da doença por serem os principais vetores de disseminação da doença no ciclo urbano (Organização Pan-Americana da Saúde, 2001). Segundo relatório publicado pela OMS, os cães foram responsáveis por 99% dos casos de raiva humana transmitidos por animais (WHO, 2015).

[003] O número de casos de raiva humana no Brasil caiu drasticamente desde o início das campanhas de vacinação em massa de cães e gatos na década de 70. Na região Sul do Brasil não foram registrados casos de raiva humana, transmitidos por cães e gatos, desde a década de 80. Apesar da doença encontrar-se controlada no Brasil, casos esporádicos ainda causam mortes em humanos em regiões isoladas do país, sendo transmitidos geralmente por animais silvestres, principalmente os morcegos. Normalmente quando a doença é diagnosticada nestas populações não há mais tempo para cura, pois o tratamento curativo com vacina ou vacina e soro, dependendo da gravidade das mordidas, não foi iniciado em tempo hábil.

[004] A imunoprofilaxia nas espécies animais consideradas como reservatórios do vírus da raiva na natureza constitui um dos métodos mais adequados para controle e erradicação da raiva humana. O Ministério da Saúde realiza anualmente campanha de vacinação antirrábica em cães e gatos como forma de controlar a circulação do vírus da raiva nas áreas urbanas e evitar a exposição dos humanos à doença. Até 2009 eram utilizadas vacinas antirrábicas produzidas a partir de cérebros de camundongos neonatos inoculados com vírus rábico fixo PV, utilizando a metodologia de produção da vacina descrita por Fuenzalida & Palacios em 1955. As vacinas produzidas por essa metodologia possuem baixo custo de produção, pouco investimento nas plantas e matérias-primas quando comparadas às vacinas produzidas em cultivo celular, porém com capacidade para induzir proteção satisfatória nos animais vacinados, sendo esta uma das principais razões para a demora na mudança de tecnologia de produção de vacinas antirrábicas de uso veterinário no Brasil. Muitos países ainda utilizam as vacinas produzidas em cérebro, inclusive para uso humano, no entanto estas vacinas induzem mais reações adversas quando comparadas às de cultivo celular.

[005] ESTADO DA ARTE DA INVENÇÃO

[006] Foi na década de 50, com o advento da técnica de cultura de células "in vitro” que KISSILING (1958) relatou o primeiro trabalho com dados significativos sobre a propagação do vírus rábico em cultivo celular, mas foi em células BHK-21/C13 que o vírus melhor se adaptou, com multiplicação satisfatória para produção em escala industrial de vacinas antirrábicas. A primeira vacina antirrábica preparada a partir de cultivo celular foi desenvolvida por Fenje em 1960 e deste então inúmeras vacinas para uso veterinário foram preparadas e comercializadas, sempre buscando reduzir os custos sem afetar a eficiência imunológica do produto. No Brasil, a partir de 2010, o governo passou a seguir a recomendação da OMS de utilizar vacinas produzidas por cultivo celular para uso veterinário devido a maior segurança e eficiência imunológica.

[007] A maioria dos processos e patentes descritos na literatura de vacinas antirrábicas veterinárias de cultivo celular são de processos operando em sistema de batelada ou batelada alimentada, que utilizam células em suspensão ou aderidas em microcarreadores. A célula BHK-21 é a mais comumente utilizada para produção de vacinas antirrábicas veterinárias e esta linhagem celular originalmente cresce aderida, ocasionando dificuldades e limitações no seu uso em escala industrial. A estratégia mais comumente utilizada para produção de vacinas em células aderidas é o uso de microcarreadores em tanques agitados, como nos experimentos descritos por Kallel et al em 2003 intitulado "A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells grown on microcarriers in a 20 L bioreactor”, na qual uma resina, neste caso Cytodex 3, é utilizada para servir de suporte para a adesão e crescimento da célula e o processo de perfusão é necessário para manter o cultivo viável em alta densidade celular. Como as células crescem aderidas ao microcarreador, a relação entre a área total para adesão e o volume disponível foi aumentada, sendo possível atingir concentrações celulares, na ordem de 4x106células/mL, em um biorreator com volume reduzido. Apesar de bem descrito, esse método encontra limitações quanto a sua aplicação na escala industrial de produção de vacinas antirrábicas veterinárias devido ao alto custo dos microcarreadores em um produto de baixo valor agregado. Outra desvantagem desse método é o aumento na complexidade da ampliação celular e determinação da densidade celular, reduzindo a homogeneidade e o padrão entre os lotes produtivos.

[008] Devido a essas limitações, a maioria dos produtores de vacinas antirrábicas veterinárias utilizam células adaptadas para crescimento em suspensão sem a utilização de microcarreadores. Apesar da cepa original crescer imobilizada, existem muitos protocolos de adaptação para crescimento das células em suspensão em poucas passagens. Por se tratar de uma linhagem celular contínua que pode ser subcultivada indefinidamente, as células BHK-21 são largamente utilizadas na produção de vacinas veterinárias. O cultivo de células livres em suspensão facilita o cultivo e a manipulação é mais simples quando comparada aos cultivos com microcarreadores. A patente PI0400341 obtida pelo Instituto Butantan intitulada "Processo de obtenção de vacina antirrábica em células BHK-21 purificada, para uso veterinário, e respectiva vacina resultante” descreve um processo que utiliza células BHK-21 crescidas em suspensão para produção de antígeno viral que foi posteriormente concentrado e purificado por técnicas de cromatografia. Também foi utilizado albumina equina como estabilizador e otimizador da resposta imune humoral. Apesar dessas aparentes vantagens, a albumina equina possui custo maior que outros estabilizantes utilizados na indústria de vacinas, como a sacarose, aumentando o preço da vacina quando comparado a outros produtores.

[009] Atualmente, pesquisadores e empresas têm focado seus interesses em processos de cultivo em suspensão utilizando o método de perfusão. Este método apresenta muitas vantagens quando comparado aos métodos tradicionais de produção de vacina antirrábica utilizando batelada e batelada alimentada. Devido à maior automação do processo, há ganhos na reprodutibilidade entre os lotes produzidos e o sistema de perfusão também permite aos biorreatores operar com alta concentração celular, aumentando a produção de vírus. Como as células ficam retidas no sistema e o vírus é coletado continuamente seu tempo de residência no biorreator é reduzido, diminuindo a perda de atividade por degradação da partícula viral. Desta maneira, há um aumento de produtividade e menor necessidade de biorreatores de grande capacidade. Algumas patentes publicadas na China corroboram essa tendência como a patente CN101851608 intitulada “Method for producing rabies viruses by suspension culture of BHK21 cells”, CN103285390 intitulada “Method for preparing rabies vaccine” e CN102228686 intitulada “Process for preparing veterinary rabies inactivated and freeze-dried vaccine through suspension culture cell”.

[0010] Quando comparada com as outras patentes licenciadas no exterior, a presente patente apresenta singularidades. A patente CN 103285390 intitulada “Method for preparing rabies vaccine” descreve uma nova técnica para produção de vacina antirrábica veterinária em um biorreator batizado pelo inventor de “biorreator de perfusão torrencial”. Este processo utiliza um conjunto de bolsas descartáveis conectadas por bombas peristálticas, num processo com notáveis diferenças ao invento proposto pela presente invenção, que utiliza um biorreator do tipo agitado com um dispositivo de perfusão interna fixado na parte superior do biorreator. Dessa maneira, apesar de ambos produzirem vacina antirrábica veterinária, há uma grande diferença entre os processos de ampliação de células, vírus e coleta de antígeno. Além disso, na presente patente não há a necessidade de clarificação, concentração e purificação da coleta do biorreator como ocorre na patente CN 103285390.

[0011] A patente CN 101851608 intitulada "Method for producing rabies viruses by suspension culture of BHK21 cells” reivindica um processo de produção de vírus rábico utilizando células BHK-21 em suspensão com vírus das cepas Flury, ERA e CNT em um meio de cultura definido descrito nas reivindicações. A caracterização do meio de cultura utilizado é parte importante nas reivindicações, servindo como base de outras reivindicações abordando aspectos mais técnicos do invento. O objeto da presente patente diferencia-se por não se basear apenas na composição do meio, mas por também utilizar técnicas de processo que se diferenciam do descrito na literatura sobre raiva como o uso de perfusão em escala industrial por um longo período de tempo e utilizando valores de MOI inferiores ao descrito em outros artigos e patentes.

[0012] A patente CN 102228686 intitulada "Process for preparing veterinary rabies inactivated and freeze-dried vaccine through suspension culture cell” descreve um processo de obtenção de vacina antirrábica veterinária liofilizada e suas etapas. Durante a produção de suspensão viral as principais diferenças observadas entre o processo em questão e a presente patente ocorre pelo uso de MOI reduzida e processo de perfusão, que aumentam a duração do tempo de coleta, entre 96 e 120 horas, e proporciona um aumento na produtividade e volume total de coleta do processo. Outra diferença importante é relativa à ausência de processo de purificação da vacina da presente patente devido à diferenças no método de produção, onde um antígeno com menor carga de impurezas é obtido.

[0013] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] Apesar do método de cultivo celular para produção de vacinas antirrábicas ser conhecido por empresas nacionais, inclusive com patente depositada (n° PI0400341), ainda não foi possível a aquisição pelo Ministério da Saúde de um fornecedor nacional que supra todo quantitativo demandado em qualidade e quantidade para campanhas nacionais de vacinação antirrábica. O governo brasileiro continua importando vacinas, o que aumenta os custos das campanhas de vacinação em massa. Existe uma demanda nacional por uma vacina com qualidade e preço acessível para manter a raiva animal, e consequentemente a humana, sob controle.

[0015] Tendo em vista esse cenário, um dos objetivos da presente patente é desenvolver um processo de produção de vacina antirrábica para uso veterinário moderno, eficaz, com baixo custo de produção e com capacidade de competir em igualdade com as tecnologias disponíveis no Brasil e exterior, oferecendo um produto de alta qualidade. Além disso, o processo desenvolvido buscou reduzir ao máximo a quantidade de operações pós coleta do antígeno viral para compactar a área de produção e dessa forma reduzir os custos de implantação do processo e de produção e assim simplificar o processo sem sacrificar a qualidade da vacina produzida.

[0016] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] O objeto da presente patente de invenção é um “PROCESSO COMPACTO DE PRODUÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA VETERINÁRIA UTILIZANDO CÉLULAS BHK-21, VÍRUS PV E MÉTODO DE PERFUSÃO’, onde o processo descrito passa pelas seguintes etapas: primeiramente células BHK-21 C13 foram descongeladas de um banco de células trabalho e multiplicadas em frascos tipo spinner à temperatura de 37°C e com atmosfera de CO2 em 5% até atingir quantidade de células suficiente para inoculo em biorreator. Após inoculação, o processo de multiplicação celular prosseguiu em biorreator operando com perfusão do tipo interna utilizando uma malha rotativa de 10 μm de poro para retenção das células no interior do sistema.

[0018] Quando a densidade de 1,0 - 5,0 x105 células/mL foi atingida, as condições foram ajustadas para temperatura entre 36 - 37 °C, pH entre 7 -7,5, pO2 entre 10 - 20% de saturação do ar e agitação da hélice em 50 - 80 rpm. Esta malha rotaciona com velocidades entre 50 - 80 rpm. A aeração foi realizada utilizando membranas de aeração para evitar estresse mecânico.

[0019] Quando a densidade celular atingiu entre 2,0 x106 e 4,0 x106 células/mL foi realizada a infecção celular com o vírus PV/BHK utilizando DEAE dextran para facilitar a adsorção do vírus às células, otimizando o processo. A taxa de multiplicidade de infecção (MOI) utilizada varia entre 0,0001 e 0,001.

[0020] Após infecção os parâmetros foram ajustados para: temperatura 33 -34 °C, pH entre 6,9 - 7,6, pO2 entre 10 - 20% de saturação do ar, agitação da hélice entre 50 - 80 rpm e agitação da malha rotativa entre 50 - 80 rpm. Coletas de vírus foram realizadas diariamente entre 8 a 12 dias, com o volume de coleta variando entre 50-200% do volume de biorreator por dia, dependendo do estágio do processo. Nos dois primeiros dias após infecção a taxa de perfusão foi menor, aumentando em seguida devido à maior concentração celular e títulos virais. Diariamente foi realizado um acompanhamento da quantidade de lactato e glicose presentes no cultivo, quantidade de células totais e viáveis, esterilidade e título viral das coletas das suspensões virais.

[0021] A cada coleta de suspensão viral foi adicionada solução estabilizante contendo sacarose e a suspensão viral é inativada utilizando β-propiolactona na proporção 1:4000. Em seguida timerosal na proporção 1:10000 e hidróxido de alumínio na concentração final de 0,2 g/L foram adicionados à suspensão viral inativada como conservante e adjuvante, respectivamente. Esse produto foi envasado em frascos multidose de 25 mL com doses de 1 mL e então analisados pelo controle de qualidade interno e externo antes da sua comercialização.

[0022] A vacina assim produzida deve possuir as seguintes características: ausência de vírus residual, esterilidade, inocuidade, pH em 8 ± 0,5, eficiência pelo método de NIH maior que 1 UI, proteína total menor que 500 mg/mL e validade de no mínimo 2 anos em temperatura de 2°C a 8°C. O meio de cultura utilizado para o crescimento celular deve possuir menos de 3% de soro fetal bovino.

[0023] REFERÊNCIAS

[0024] Meslin, F.X., 1997. Global aspects of emerging and potential zoonoses: a WHO perspective. Emerging. Infectious. Disease. v.3, p.223228.

[0025] WHO. Expert consultation in rabies: second report. WHO Technical Report Series 982, 2013.

[0026] WHO. Rabies. Fact Sheet N°99, 2015. Disponível em http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/, acessado em 25 de fevereiro de 2016.

[0027] Organização Pan-Americana da Saúde (Rio de Janeiro). Boletín: Vigilância epdemiológica de la rabia en las Américas. V. XXXIII, p. 40, 2001.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1 - “Processo compacto de produção de vacina antirrábica veterinária utilizando células BHK-21, vírus PV e método de perfusão” caracterizada pelo uso de células BHK-21, utilizando vírus PV e método de perfusão contendo as seguintes etapas: a) Células do tipo BHK-21 C13, adaptadas à suspensão, descongeladas de um banco trabalho e amplificadas, em frascos tipo spinner, até quantidade suficiente para se atingir uma 5 densidade celular após inóculo no biorreator entre 1,0 - 5,0 x 10 células/mL, onde o cultivo é ajustado para temperatura entre 36 -37 °C, pH entre 7 - 7,5, pO2 entre 10 - 20% de saturação do ar e agitação da hélice entre 50 - 80 rpm; O processo de amplificação ocorre em biorreator operando com perfusão do tipo interna, utilizando uma malha rotativa com poro menor que 10 μm para reter as células no interior do sistema e coletar as partículas virais; Esta malha circula com velocidade entre 50 - 80 rpm; A aeração é realizada utilizando membranas de aeração; Quando o 66 sistema atinge densidade celular entre 2x10 e 4x10 células/mL é realizada a infecção com o vírus PV/BHK utilizando DEAE dextran para promover a adsorção do vírus com as células; A taxa de multiplicidade de infecção (MOI) utilizada varia entre 0,0001 e 0,001; b) Após infecção os parâmetros são ajustados para: temperatura 33 - 34 °C, pH entre 6,9 - 7,6, pO2 entre 10 - 20% de saturação do ar, agitação da hélice entre 50 - 80 rpm e agitação da malha rotativa entre 50 - 80 rpm; Coletas de vírus são realizadas diariamente entre 8 a 12 dias, com o volume de coleta variando entre 50-200% do volume de biorreator por dia; Após coleta é adicionada solução estabilizante contendo sacarose e a suspensão viral é inativada utilizando β-propiolactona na proporção 1:4000; Em seguida timerosal e hidróxido de alumínio são adicionados à suspensão viral inativada e o produto é então envasado em frascos multidose com doses de 1 ml; c) A vacina produzida é analisada quanto a qualidade interna e externamente, devendo apresentar as seguintes características: ausência de vírus residual, esterilidade, inocuidade, pH entre 7,5 e 8,2, eficiência pelo método de NIH maior que 1 UI, proteína total menor que 500 μg/mL e validade mínima de 2 anos quando o produto é mantido entre 2 e 8°C.

2 - Processo conforme reivindicação (1) caracterizado por utilizar meio de cultura com concentração de soro bovino menor que 3%.

3 - A vacina produzida conforme reivindicação (1) caracterizado por reduzir ao máximo a quantidade de operações pós coleta do antígeno viral para compactar a área de produção e dessa forma reduzir os custos de implantação do processo e de produção e assim simplificar o processo sem sacrificar a qualidade da vacina produzida.

4 - Processo conforme reivindicação (1) caracterizado pelo uso de MOI reduzida e processo de perfusão, que aumentam a duração do tempo de coleta e proporcionam um aumento na produtividade e volume total de coleta do processo.

5 - Processo conforme reivindicação (1) caracterizado pela ausência de processo de purificação da vacina devido à diferenças no método de produção, onde um antígeno com menor carga de impurezas é obtido.