BR102013025838A2 - Proteínas de fusão endo-bax e endo-bax-endo e suas sequências de aminoácidos - Google Patents
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Abstract
proteina de fusão endo-bax e endo-bax-endo e suas sequências de aminoácidos. a presente invenção refere-se à obtenção de proteínas híbridas baseadas na fusão da endostatina a peptídeos indutores de morte celular. as proteínas de fusão endo-bax e endo-bax-endo são compostas de dois domínios funcionais: o primeiro domínio, a endostatina, apresenta especificidade pelas células endoteliais ativadas, utilizado para dirigir a proteína de fusão e permitir sua internalização. o segundo domínio é o peptídeo indutor de morte celular proveniente da região bh3 da proteína bax, tóxico somente quando internalizado, por desencadear a cadeia de eventos que culminam em morte celular por apoptose. a ptoteína endo-bax apresenta o domínio pró-apoptótico derivado da proteína bax fundido no c-terminal da endostatina. na proteína endo-bax-endo a segunda (alfa)-hélice da endostatina foi trocada pela (alfa)-hélice do peptídeo apoptótico de bax. foram construídos os vetores plasmídicos de exprassão pet28-endo- bax e pet28-endo-bax-endo, e utilizados para transformação de bactérias e. coli bl21(de3). a duas proteínas foram produzidas como corpos de inclusão, agregados insolúveis em bactérias e. coli. as proteínas foram renaturadas e purificadas. os dois híbridos foram eficientemente internalizados pelas células de origem endotelial em proliferação. a presença do domínio bh3 do bax exerce uma melhoria significativa sobre a atividade ex vivo e in vivo das proteínas mutantes. as proteínas endo-bax e endo-bax-endo podem der utilizadas como novos agentes terapêuticos com especificidade para o endotélio tumoral e com ação apoptótica amplificada.
Description
A presente invenção refere-se a proteínas híbridas recombinantes que possuem ação antiangiogênica específica para células endoteliais e atividade apoptótica potencializadas, podendo ser utilizadas como novos agentes terapêuticos com especificidade para as células endoteliais visando à regressão de tumores. Mais particularmente, trata-se da obtenção de proteínas compostas da fusão de dois domínios funcionais: o primeiro domínio é composto pela endostatina, uma proteína com potente atividade antiangiogênica que apresenta especificidade pelas células endoteliais ativadas, utilizada para dirigir a proteína de fusão e permitir sua internalização por este tipo de células em proliferação; e o segundo domínio é composto de um peptídeo indutor de apoptose (proveniente do domínio BH3 da proteína apoptótica ΒΑΧ), tóxico somente quando internalizado. As sequências de aminoácidos das referidas proteínas resultantes são: endo-BAX, cuja sequência é mostrada em SEQ. ID. N°.1, e endo-BAX-endo, cuja sequência é mostrada em SEQ. ID. N°. 2.
A supressão da angiogênese tem provado ser uma eficiente estratégia que leva à regressão tumoral. Células tumorais expressam varias moléculas pró-angiogênicas, Promovendo angiogênese exacerbada, característica que faz parte da patologia co câncer, e sua supressão leva a um estado de dormência em tumores (Hanahan, D. and J. Folkman, Cell, 1996. 86(3): p. 353-364). O bloqueio da angiogênese tem mostrado ser promissor, sendo uma abordagem terapêutica para tratar e até erradicar o câncer ao impedir o suprimento sanguíneo. Esta terapia é eficaz pelos seguintes motivos: 1) o crescimento tumoral é dependente de angiogênese, 2) o grau de angiogênese é geralmente proporcional à invasividade do tumor, 3) as células endoteliais presentes nos tumores são qualitativamente diferentes de células endoteliais presentes em tecido adulto não neoplásico, 4) inibidores endógenos existem e podem ser isolados.
Inibidores de angiogênese são considerados uma nova classe de agentes antitumorais que se caracterizam por apresentar baixa toxicidade e resistência a drogas, inibindo o crescimento tumoral pelo bloqueio da formação de novos vasos sanguíneos, os quais provêem oxigênio e nutrientes que permitem o crescimento tumoral (Folkman, J., APMIS, 2004. 112(7-8): p. 496-507). Endostatina é um dos inibidores de angiogênese mais estudado e testado em múltiplos testes clínicos. Esta proteína é um fragmento de 20 kDa da porção C-terminal do colágeno XVIII. Foi primeiramente purificada do produto de secreção de uma linhagem celular murina de hemangioendotelioma (O'Reilly, M.S., et al.,. Cell, 1997. 88(2): p. 277285). Sua atividade antitumoral é atribuída à sua especificidade em inibir a proliferação de células endoteliais em proliferação, agindo pela inibição indireta do crescimento tumoral (Hu, B., et al., Acta Pharmacologica Sinica, 2008. 29(11): p. 1357-1369).
O tratamento de tumores e metástases utilizando a endostatina apresenta algumas vantagens sobre a quimioterapia convencional: o endotélio vascular é um alvo que pode ser facilmente atingido por agentes antiangiogênicos administrados sistemicamente; a endostatina é altamente específica para células endoteliais ativadas e sob condições fisiologicamente normais. Com exceção dos órgãos reprodutores femininos, as células endoteliais não se dividem; a endostatina possui baixa toxicidade; não causa resposta imunológica por se tratar de uma proteína endógena e apresenta ação sobre diferentes tipos de tumores, pois sua atuação é sobre o endotélio tumoral não sobre as células tumorais.
Apesar das vantagens do tratamento com esta proteína, existem restrições quanto ao seu uso: meia vida curta (duas horas), necessidade de uma administração continua para o tratamento ser eficiente (15-600mg/m2/dia) (Karamouzis MV, Moschos SJ. Expert Opin Biol Ther, 2009, 9(5): p. 641-648) e necessidade de ajuste de doses (Celik I, et al. Cancer Res, 200565(23): p. 1104411050). O mais importante obstáculo para o uso da endostatina, no entanto, é o pequeno efeito antitumoral observado em ensaios clínicos em humanos (Thomas, et al.. J Clin Oncol, 2003, 21(2): p. 223-231).
Várias proteínas e peptídeos com ação terapêutica têm sido usados para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer. A indução de apoptose tem sido um dos mecanismos testados com este objetivo (Devireddy, L.R., et al., 2001. Science, 293(5531): p. 829-834; Gel er, H.M., et al., J Neurochem, 2001. 78(2): p. 265-275; Lehmann, S., et al., Eur J Haematol, 2001. 66(6): p. 357-364; Mansat, V., et al., FASEB J, 1997. 11(8): p. 695-702; Michael, J.M., M.F. Lavin, and D.J. Watters, Cancer Res, 1997. 57(16): p. 3600-3605). Estudos demonstraram que peptídeos derivados do domínio BH3 de proteínas pertencentes à família Bcl-2, família de proteínas que desempenha um papei importante na regulação da morte celular por apoptose induzida por uma grande variedade de estímulos, são eficientes em Promover apoptose (Krajewski, S., et al., Clin Cancer Res, 1997. 3(2): p. 199-208). Esses peptídeos consistem de regiões mínimas correspondentes ao domínio de morte ou domínio mínimo necessário para induzir apoptose. Peptídeos sintéticos compostos de seqüências curtas (16 ou mais aminoácidos), que correspondem ao domínio BH3 da proteína pró-apoptótica BAX, têm provado serem potentes indutores de apoptose desencadeando a ativação de caspases e o processo! que envolve a liberação de citocromo C e culmina em morte celular programada (Moreau, C., et al., J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19426-19435). O domínio BH3 da proteína pró-apoptótica BAX sozinho não é reconhecido ou internalizado por células. Han e Chittenden demostraram que o domínio BH3 da proteína BAX (Han, J., et al., Genes Dev, 1996. 10(4): p. 461-77) (Chittenden, T., et al., Nature, 1995. 374(6524): p. 733-736) é suficiente para induzir apoptose quando internalizado (Zhou, X.M., et al., J Biol Chem, 2000. 275(32): p. 25046-25051). Embora tal abordagem tenha sido utilizada para induzir apoptose de células tumorais, sua aplicação terapêutica in vivo não seria factível, pois esse peptídeo não possui especificidade por células do endotélio tumoral. Por outro lado, se não corretamente direcionado, poderia ser internalizado inclusive por células do endotélio de tecidos sadios (Finnegan, N.M., et al., Br J Cancer, 2001. 85(1): p 115-121). Para que esse peptídeo pudesse ser especificamente internalizado pelas células do endotélio tumoral em proliferação, seria necessário que fosse fundido a sequências que possuíssem especificidade e que direcionassem sua internalização (Myc, A., A.K. Patri, and J.R. Baker, Jr., Biomacromolecules, 2007. 8(10): p. 2986-2989).
Tendo conhecimento destas propriedades, no presente estudo, combinamos a ação específica da endostatina - internalização, efeito inibitório e antiproliferativo sobre células endoteliais - com a atividade apoptótica do domínio BH3. Assim, sequências que correspondem aos domínios BH3 da proteína pró-apoptótica BAX, por se tratar de potente indutor de apoptose, induziriam à morte celular se adequadamente internalizadas nas células endoteliais ativadas por meio de fusão com a endostatina. As proteínas de fusão apresentam as vantagens da endostatina, ou seja, com ação antiangiogênica específica para as células endoteliais ativadas, mas com propriedades apoptóticas potencializadas de modo a apresentar uma ação mais eficaz contra o crescimento tumoral.
Estratégias estudadas para o tratamento do câncer incluem a utilização de peptídeos capazes de induzir morte celular quando forçados à internalização. Cosulich e cols. (Cosulich, S.C., et al., Current Biology, 1997. 7(12): p. 913-920) testaram peptídeos que correspondem à seqüências mínimas do domínio BH3 de proteínas da família BCL-2 e constataram que estas seqüências são suficientes para desencadear morte celular e poderiam ser utilizadas como inciadores de apoptose. Além disso, Moreau e cols. (Moreau, C., et al., J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19426-19435) testaram a atividade de um peptídeo com 16 resíduos do domínio BH3 da proteína BAX comprovando que esta molécula é capaz de ocasionar apoptose na presença de BAX intracelular. Estudos utilizando peptídeos de fusão possuindo o domínio BH3 fundido a moléculas que promovam sua internalização não específica levaram à perda da viabilidade celular (Holinger, E.P., T. Chittenden, and RJ. Lutz, Journal of Biological Chemistry, 1999. 274(19): p. 13298-13304). No entanto, este tipo de tratamento seria prejudicial para células sadias, assim como para as células tumorais.
Objetivando melhorar as propriedades da endostatina, alguns grupos de pesquisa modificaram esta proteína Yang e colaboradores (Ou-Yang, F., et al., Cancer Res, 2006. 66(1): p. 378-384) produziram uma proteína de fusão composta da enzima citosina deaminase fundida à endostatina (US 2007 0134206 A1). A citosina deaminase é uma enzima que catalisa a reação do agente não tóxico 5-fluorocitosina para 5-fluorouracil, que é uma droga tóxica e com ação quimioterapêutica para o câncer. Assim, a presença da enzima citosina deaminase sensibiliza as células tumorais à presença do 5-fluorocitosina. Contudo, apesar de a proteína de fusão se apresentar mais eficiente em inibir a proliferação de células endoteliais pela indução de apoptose, é necessária a administração conjunta da proteína de fusão e da prodroga 5-fluorocitosina para que o tratamento seja eficiente.
Wen Y. Chen (US 2008 7,339,027 B2) utilizou proteínas de fusão que compreendem antagonistas da Prolactina humana e inibidores de angiogênese para tratamento de tumores em modelos animais. Foi combinada a ação de um antagonista da Prolactina (G129R), que possui a habilidade de inibir a proliferação de células de câncer de mama humano, com a atividade antiangiogênica da endostatina obtendo a proteína de fusão G129R-endostatina. Esta proteína exibiu um maior efeito inibitório sobre as células de origem endotelial HUVEC do que a endostatina se vagem. Além disso, a aplicação da G129R-endostatina aumentou a meia vida de camundongos apresentando tumores (câncer de mama). Esta estratégia só se mostrou eficiente para uma linhagem tumoral específica, não apresentando ação eficaz em outros tipos tumorais.
No documento de patente US 2005 0008649 A1(2004), uma molécula de fusão quimérica compreendendo a endostatina fundida a um domínio imunoglobulina (lg) do anticorpo anti-HER2/neu foi usada para tratar tumores. A proteína quimérica foi denominada anti-HER2neulgG3-endostatin. Esta fusão levou ao aumento da meia-vida desta proteína no soro e melhorou sua estabilidade se comparada com a endostatina selvagem. No entanto, uma grave limitação do uso desta proteína é que ela só é eficiente no tratamento de tumores que expressam a proteína HER2neu.
Scappaticci e cols (Scappaticci, F.A., et al., Molecular Therapy, 2001. 3(2): p. 186-196) construíram um vetor retroviral codificando os genes da endostatina e angiostatina, obtendo a expressão da proteína de fusão que foi denominada statin-A pelas células transfectadas com este vetor. A statin-A apresentou atividade antiangiogênica melhorada em linhagens endoteliais (HUVEC) e atividade antitumoral em camundongos com melanoma, se comparada com a ação de cada proteína isolada, o que demonstrou um efeito sinergístico entre ambas as proteínas.
Um estudo realizado por Ellerby (Ellerby, H.M., et al., Nat Med, 1999. 5(9): p. 1032-1038) mostrou que peptídeos sintéticos compostos por um domínio que confere afinidade por células endoteliais fundidos com um peptídeo capaz de induzir morte celular foram internalizados e se mostraram indutores de apoptose de células do endotélio tumoral.
Entretanto, não há registro na literatura científica ou de patentes de estudos que combinem a ação da endostatina selvagem: internalização e efeito antiproliferativo sobre as células endoteliais, com a atividade apoptótica do domínio BH3 da proteína BAX, conseguindo deste modo efeito terapêutico potencializado sobre células de origem endotelial. A aplicabilidade destas proteínas híbridas é de extrema importância, tendo em vista que a presente invenção demonstra que a endostatina pode ser utilizada para direcionar diferentes agentes indutores de apoptose, devido à sua especificidade por células endoteliais e pelo fato da proteína híbrida endo-BAX apresentar um maior efeito apoptótico e antiangiogênico, tornando viável sua utilização em terapia antiangiogênica de tumores. Os híbridos da endostatina apresentam um efeito terapêutico ma s eficaz do que o obtido utilizando a endostatina selvagem.
A presente invenção visa obter proteínas híbridas recombinantes que possuem atividade apoptótica e atividade antiangiogênica potencializadas, sendo compostas da fusão da sequência da proteína antiangiogênica endostatina murina com a sequência correspondente ao domínio BH3 da proteína pró-apoptótica BAX, apresentando um efeito terapêutico amplificado e tornando viável sua utilização em terapia antiangiogênica de tumores. A presente invenção provê as sequências de aminoácidos das referidas proteínas resultantes: endo-BAX, cuja sequência é mostrada em SEQ. ID. N°,1, e endo-BAX-endo, cuja sequência é mostrada em SEQ. ID. N°. 2
A descrição detalhada da invenção faz referência às seguintes figuras:
A Figura 1 mostra o alinhamento entre a sequência primária da endostatina com as sequências das proteínas de fusão (endo-BAX e endo-BAX-endo). Em vermelho: seis histidinas. Em laranja: aminoácidos da 1a α-hélice da endostatina. Em marrom: Gly-Gly. Em azul: aminoácidos da α-hélice do BH3 do bax (16 aminoácidos importantes para a atividade apoptótica). Em rosa: cisteína da 1a a-hélice. Sublinhados: argininas importantes para a ligação da endostatina ao heparan sulfato. Em verde: os primeiros e últimos aminoácidos desordenados da endostatina que não formam estrutura cristalográfica.
A Figura 2 mostra os oligonucleotideos desenhados para serem complementares ao cDNA fita simples do vetor pET20-endo e para inserção dos fragmentos de DNA contendo as sequências a serem inseridas (em endo-BAX ou trocadas (em endo-BAX-endo). Em cinza: sequência do gene da endostatina, em violeta: sequência do vetor pET20, em azul: sequências introduzidas do domínio BH3 do BAX.
A Figura 3 mostra um gel de agarose com os vetores pET, pET28-endo, pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo digeridos com as enzimas de restrição Hind III e Bgl II, mostrando os fragmentos de aproximadamente 600 bases com os genes de interesse (endostatina, endo-BAX e endo-BAX-endo).
A Figura 4 mostra as bandas majoritárias de aproximadamente 20 kDa referentes às proteínas expressas em bactérias E. coli, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 5 mostra as bandas de aproximadamente 20 kDa referentes às proteínas renaturadas, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 6 mostra as bandas de aproximdamente 20 kDa referentes às proteínas renaturadas e purificadas, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 7 mostra as bandas das proteínas que mostraram afinidade pelo anticorpo anti-endostatina, analisadas por imunoblotting.
A Figura 8 mostra os espectros de dicroísmo circular, que indica o grau de estruturas secundárias, das três proteínas.
A Figura 9 mostra a elipticidade das proteínas em função da temperatura, que indica grau de perda de estruturas secundárias das proteínas em função da temperatura.
A Figura 10 mostra os espectros de emissão de fluorescência quando as amostras foram excitadas com luz em comprimento de onda de 288 nm.
A Figura 11 mostra as bandas das proteínas (10 µg/ml) que foram incubadas por diferentes tempos a 37°C com as células endoteliais C-PAE e que mostraram afinidade pelo anticorpo anti-endostatina, analisadas por imunoblotting.
A Figura 12 mostra a porcentagem de células endoteliais C-PAE viáveis após incubação das células em cultura por 72 horas com 20 μg/ml das proteínas, analisadas utilizando-se ensaio de MTS, que avalia a viabilidade celular.
A Figura 13 mostra a porcentagem de células endoteliais C-PAE em apoptose após incubação das células em cultura por 72 horas com 20 μg/ml das proteínas. A determinação de incorporação de iodeto de propídio às células, que indica morte celular por apoptose, foi realizada por citometria de fluxo.
A Figura 14 A mostra fotografias representativas da proliferação de células ao redor de aneis de aorta incubados durante 7 dias em matrigel com ou sem as proteínas e a figura 14 Β mostra a quantificação do crescimento das células ao redor dos anéis.
A Figura 15 A mostra o gráfico do crescimento dos tumores de camundongos injetados com células tumorais Renca, tratados ou não com 15 µg/ml das proteínas durante 11 dias A Figura 15 Β mostra fotografias representativas dos tumores retirados no 11° dia após o começo do tratamento. A figura 15 C mostra a média dos pesos dos tumores retirados dos camundongos no 11° dia.
A Figura 1 mostra o alinhamento entre a sequência primária da endostatina com as sequências das proteínas de fusão (endo-BAX e endo-BAX-endo). Em vermelho: seis histidinas. Em laranja: aminoácidos da 1a α-hélice da endostatina. Em marrom: Gly-Gly. Em azul: aminoácidos da α-hélice do BH3 do bax (16 aminoácidos importantes para a atividade apoptótica). Em rosa: cisteína da 1a a-hélice. Sublinhados: argininas importantes para a ligação da endostatina ao heparan sulfato. Em verde: os primeiros e últimos aminoácidos desordenados da endostatina que não formam estrutura cristalográfica.
A Figura 2 mostra os oligonucleotideos desenhados para serem complementares ao cDNA fita simples do vetor pET20-endo e para inserção dos fragmentos de DNA contendo as sequências a serem inseridas (em endo-BAX ou trocadas (em endo-BAX-endo). Em cinza: sequência do gene da endostatina, em violeta: sequência do vetor pET20, em azul: sequências introduzidas do domínio BH3 do BAX.
A Figura 3 mostra um gel de agarose com os vetores pET, pET28-endo, pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo digeridos com as enzimas de restrição Hind III e Bgl II, mostrando os fragmentos de aproximadamente 600 bases com os genes de interesse (endostatina, endo-BAX e endo-BAX-endo).
A Figura 4 mostra as bandas majoritárias de aproximadamente 20 kDa referentes às proteínas expressas em bactérias E. coli, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 5 mostra as bandas de aproximadamente 20 kDa referentes às proteínas renaturadas, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 6 mostra as bandas de aproximdamente 20 kDa referentes às proteínas renaturadas e purificadas, analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
A Figura 7 mostra as bandas das proteínas que mostraram afinidade pelo anticorpo anti-endostatina, analisadas por imunoblotting.
A Figura 8 mostra os espectros de dicroísmo circular, que indica o grau de estruturas secundárias, das três proteínas.
A Figura 9 mostra a elipticidade das proteínas em função da temperatura, que indica grau de perda de estruturas secundárias das proteínas em função da temperatura.
A Figura 10 mostra os espectros de emissão de fluorescência quando as amostras foram excitadas com luz em comprimento de onda de 288 nm.
A Figura 11 mostra as bandas das proteínas (10 µg/ml) que foram incubadas por diferentes tempos a 37°C com as células endoteliais C-PAE e que mostraram afinidade pelo anticorpo anti-endostatina, analisadas por imunoblotting.
A Figura 12 mostra a porcentagem de células endoteliais C-PAE viáveis após incubação das células em cultura por 72 horas com 20 μg/ml das proteínas, analisadas utilizando-se ensaio de MTS, que avalia a viabilidade celular.
A Figura 13 mostra a porcentagem de células endoteliais C-PAE em apoptose após incubação das células em cultura por 72 horas com 20 μg/ml das proteínas. A determinação de incorporação de iodeto de propídio às células, que indica morte celular por apoptose, foi realizada por citometria de fluxo.
A Figura 14 A mostra fotografias representativas da proliferação de células ao redor de aneis de aorta incubados durante 7 dias em matrigel com ou sem as proteínas e a figura 14 Β mostra a quantificação do crescimento das células ao redor dos anéis.
A Figura 15 A mostra o gráfico do crescimento dos tumores de camundongos injetados com células tumorais Renca, tratados ou não com 15 µg/ml das proteínas durante 11 dias A Figura 15 Β mostra fotografias representativas dos tumores retirados no 11° dia após o começo do tratamento. A figura 15 C mostra a média dos pesos dos tumores retirados dos camundongos no 11° dia.
A modelagem das proteínas híbridas foi realizada utilizando os moldes da endostatina (1KOE) e das seqüências do peptídeo pró-apoptótico com 16 aminoácidos (domínio BH3) da proteína BAX, selecionada utilizando o banco de dados de estruturas terciárias de proteínas Protein Data Bank (Berman, H.M., et al., Nucleic Acids Research, 2000. 28(1): p. 235-242).
Foi utilizado como modelo da endostatina o domínio endostatina murina, fragmento C-Terminal de 184 resíduos da cadeia α1 do Colágeno XVIII (1KOE) (Hohenester, E., et al., EMBO J, 1998. 17(6): p. 1656-1964).
Para a modelagem de BAX, foi utilizado um fragmento correspondente à α-hélice 2 e parte da a-hélice 3 do BH3 do BAX. Esta seqüência corresponde à região mínima responsável pela atividade pró-apoptótica da proteína BAX (Sattler, M., et al., Science, 1997. 275(5302): p. 983-986).
Foram feitas as modelagens das seguintes proteínas de fusão:
Foram feitas as modelagens das seguintes proteínas de fusão:
- • Endo-BAX: Fusão de 6 Histidinas à região N-terminal da endostatina. Na região C-terminal da endostatina, foram introduzidos dois aminoácidos glicina e, a seguir, o domínio BH3, que é o peptídeo pró-apoptótico da proteína BAX.
- • Endo-BAX-endo: Fusão de 6 Histidinas à região N-terminal da endostatina. Substituição da a-hélice 1 da endostatina pelo peptídeo com 16 aminoácidos (que também forma α-hélice) do domínio BH3 da proteína apoptótica BAX.
Na Figura 1 observa-se o alinhamento entre a sequência primária da endostatina com as sequências das proteínas de fusão (endo-BAX e endo-BAX-endo). A modelagem foi realizada utilizando o programa MODELLER versão 9v4 (Sanchez, R. and A. Sali, Proteins-Structure Function and Genetics, 1997: p. 5058). O melhor modelo foi escolhido baseado na qualidade estereoquímica utilizando o programa PROCHECK (Laskowski, R.A., et al., Journal of Applied Crystallography, 1993. 26: p. 283-291), e a função objetiva do MODELLER (Sali, A. and T.L. Blundell, J Mol Biol, 1993. 234(3): p. 779-815).
As sequências de aminoácidos das proteínas endo-BAX e endo-BAX-endo são mostradas em SEQ. ID. N°1 e SEQ. ID. N°. 2, respectivamente.
O gene da endostatina murina presente no vetor pETKH1 (ATCC n°63404) foi amplificado, utilizando-se a técnica de PCR, incluindo-se nas extremidades os sítios para as enzimas de restrição NcoI e EcoRI, a 5’ e a 3’ do gene, respectivamente. O DNA amplificado foi digerido com as enzimas de restrição NcoI e EcoRI e foi clonado no vetor pET20 (Novagen), digerido com as mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante, denominado pET20-endo foi utilizado na reação de mutagênese sítio-específica.
Foram realizados dois procedimentos de mutagênese seguindo o protocolo descrito por Kunkel (Kunkel, T.A., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985. 82(2): p. 488-492). Para tal utilizou-se o DNA de fita simples do vetor pET20-endo e oligonucleotídeos desenhados para introduzir as mutações desejadas. Na Figura 2 estão representados os oligonucleotideos desenhados para serem complementares ao cDNA fita simples do vetor pET20-endo e para inserção dos fragmentos de DNA. O primeiro procedimento de mutagênese foi realizado para a introdução de codons correspondentes ao peptídeo apoptótico de BAX à jusante do gene da endostatina no vetor pET20-endo. Outro procedimento foi efetuado para a troca dos nucleotídeos correspondentes à primeira α-hélice do gene da endostatina pela α-hélice do peptídeo de BAX. A obtenção das mutações desejadas foi confirmada pelo sequenciamento das regiões de interesse dos DNAs.
Foram feitas subclonagens dos cassetes de expressão: endostatina, endo-BAX e endo-Bkx-endo no vetor de expressão pET28. (Novagen). Os fragmentos de DNA correspondentes aos cDMAs das 3 proteínas presentes no vetor plasmídico de expressão pET20 foram digeridos com as enzimas de restrição NcoI e EcoRI.
Os vetores resultantes da subclonagem foram denominados pET28-endo, pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo. A análise da eficiência da clonagem foi confirmada ao digerir as respectivas construções com enzimas de restrição (Hind III e Bgl II), obtendo-se o padrão de bandas esperado para os clones contendo os fragmentos esperados (bandas entre 500 e 700 pares de bases na eletroforese em gel de agarose mostrada na Figura 3) ao analisá-los para a reação de ligação entre o vetor pET28 e os insertos: endostatina, endo-BAX, e endo-BAX-endo.
A expressão das proteínas híbridas foi realizada em bactérias E. coli BL-21 (DE3) pLys S competentes transformadas com os vetores pET28-endo, pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo e em 250 mL de meio rico 2HKSII (Jensen, E.B. and S. Carlsen, Biotechnol Bioeng, 1990. 36(1): p. 1-11) cultivadas a 37°C sob agitação até que a densidade óptica a 600 nm atingisse 3.0 quando então se adicionou IPTG (concentração final de 0,5mM). O cultivo foi mantido nas mesmas condições por mais 16 horas, medindo-se novamente as densidades ópticas (600nm) ao final deste período. Os meios de cultura foram centrifugados a 2500 x g por 10 minutos a 4°C, os sobrenadantes foram descartados e os precipitados contendo as proteínas de interesse foram processados. A fração insolúvel, contendo os corpos de inclusão, foi ressuspensa em 50 mL de tampão contendo 100 mM Tris-HCI pH 7.5 e 5 mM EDTA, seguida pela adição de lisozima em concentração final de 50 µg/mL e incubados a temperatura ambiente por 15 minutos. A suspensão foi sonicada na presença de 0.1% de deoxicolato de sódio, seguida por centrifugação a 8000x g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado, e a fração insolúvel foi ressuspensa em 0,05M de Tris-HCl pH 7,5 contendo 5 mM EDTA e 0,1 % de deoxicolato de sódio. Os procedimentos de centrifugação e ressuspenção foram repetidos duas vezes e o precipitado resultante foi dissolvido em 15 mL de 0,05mM de Tris-HCl pH 7,5, contendo 100 mM NaCl e 3 M de uréia e centrifugada 8000 x g for 10 min a 4°C. As lavagens com uréia foram repetidas 5 vezes, o precipitado resultante da última centrifugação foi lavado 2 vezes com 0.05 M de Tris-HCl pH 7.5, e ressuspenso no mesmo tampão.
Foi obtida expressão das proteínas recombinantes endostatina e das proteínas híbridas endo-BAX e endo-BAX-endo utilizando este protocolo. Podem ser observadas diferenças entre as massas molecular da endostatina e da proteína mutante endo-BAX. Esta última apresentou menor migração na eletroforese em gel de poliacrilamida devido à fusão no C-terminal da endostatina do peptídeo pró-apoptótico BAX. EBE não apresentou mudanças na sua massa molecular, pois a substituição da α-hélice da endostatina pela α-hélice do BAX não levou a uma alteração significativa na massa molecular desta proteína (Figura 4).
Uma estratégia baseada na aplicação de alta pressão para a desagregação dos agregados protéicos foi utilizada para obter a renaturação das proteínas híbridas. Corpúsculos de inclusão das proteínas recombinantes foram ressuspensos em tampão de renaturação (50mM de Tris HCI pH 7.5 com 1mM EDTA) contendo 1,5M do agente denaturante GdnHCI (0-6M) e na presença de 0,5 mM de glutationa oxidada e 0,5 mM de glutationa reduzida. As suspensões foram colocadas em sacos plásticos, os quais foram selados, introduzidos em outro plástico maior o qual foi selado a vácuo e então colocado em um vaso de pressão contendo uma mistura de óleo e água como fluido de transmissão. Foi aplicada uma pressão de 30000 psi por 16 horas. Após despressurização lenta (aproximadamente 20 minutos) as amostras foram centrifugadas a 12000 g por 15 minutos para separar os agregados insolúveis da fração solúvel. A fração solúvel foi então dialisada contra tampão Tris HCI 50mM pH 7.5, a fim de retirar o reagente GdnHCI, e novamente centrifugada nas mesmas condições.
Na Figura 5 observa-se a eletroforese em gel de poliacrilamida em que aparecem as bandas de aproximadamente 20 kDa correspondentes às três proteínas renaturadas pela ação de alta pressão, com alto grau de pureza e apresentando as massas moleculares esperadas.
A endostatina e os híbridos foram purificados em resina de heparina. As proteínas foram aplicadas em coluna HiTrap Heparin HP (GE Healthcare) contendo 1 mL. de resina pré lavada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 e pré-equilibrada com 5 volumes de coluna em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7.5. A coluna foi lavada com 10 mL de tampão de equilíbrio e as proteínas foram eluídas usando um gradiente de NaCl (0-1M). As purificações foram realizadas aplicando um fluxo de 1mL por minuto. As frações foram coletadas em coletor automático do sistema FPLC (“Fast Protein Liquid Chromatography”) com determinação continua da absorvância em comprimento de onda de 280 nm. As frações que continham os picos principais foram coletadas e dialisadas contra tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, para realizar a retirada do NaCl das amostras purificadas.
Bons rendimentos e grau de purificação foram alcançados, evidenciado pela presença de bandas referentes às proteínas recombinantes, endostatina, endo-BAX, e endo-BAX-endo, com as massas moleculares esperadas na análise em SDS-PAGE. Na Figura 6 pode-se observar a pureza das proteínas renaturadas e purificadas por afinidade.
Endo-BAX e endostatina mostraram grande afinidade pela heparina o que facilitou sua purificação e permitiu a obtenção destas proteínas com alta pureza. No entanto, a proteína de fusão endo-BAX-endo, mostrou uma recuperação menor se comparada com as outras proteínas. Embora apresente na sua sequência as argininas essenciais para permitir sua ligação à heparina, a troca da a-hélice possivelmente afetou sua estabilidade, o que provavelmente leva à agregação e menor rendimento de recuperação de proteína pura.
As proteínas foram analisadas; pela técnica de Western Blot. As amostras foram submetidas à SDS-PAGE e em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A transferência das proteínas foi realizada por eletroeluição do seguinte modo colocaram-se 8 folhas de papel filtro pré-umedecido em tampão de transferência (0,3% glicina, 0,6% Tris-base, 0,04% SDS, 20% metanol) e em seguida, do polo positivo para o pólo negativo, colocaram-se a membrana de nitrocelulose, o gel e mais 8 folhas de papel filtro pré-umedecidas. A corrente foi fixada de acordo com a área de gel (0,85 mA por cm2) para a transferência total das proteínas, realizada por 1 hora. A membrana foi lavada com tampão fosfato-salina (PBS) contendo 5% de leite em pó desnatado e liofilizado (Moliço, São Paulo, Brasil) e então foi incubada por 10 horas com o anticorpo policlonal anti-endostatina (Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.) diluído 150 vezes em PBS contendo 5% de leite em pó desnatado. As reações foram detectadas pela incubação com anticorpo secundário conjugado à peroxidase por uma hora. Foi utilizado o sistema de detecção ECL seguindo-se as instruções do fabricante (GE Healthcare) e a seguir as membranas foram expostas a filmes de radiografia. Na Figura 7 observam-se bandas de aproximadamente 20 kDa correspondentes a endostatina, endo-BAX e endo-BAX-endo, visualizados na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida, confirmando a identidade imunológica e ligação ao anticorpo anti-endostatina específico.
Experimsntos de análise de CD foram empregados para avaliar a estrutura secundária da endostatina e das proteínas de fusão. Os experimentos foram realizados utilizando o espectropolarímetro Jasco-J810 equipado com um sistema de banho-maria líquido com controle de temperatura. Os espectros de dicroísmo circular no UV distante (260-190 nm) foram adquiridos utilizando-se uma cubeta de quartzo de 0.1 cm de caminho óptico. Os espectros de CD foram obtidos empregando-se médias de cinco varreduras. A estrutura secundária das proteínas obtidas pelo CD foi calculada utilizando o programa K2D (http://www.embl-heidelberg.de/ andrade/k2d).
A proteína híbrida endo-BAX apresenta um perfil idêntico ao da endostatina selvagem nativa, exibindo um pico negativo a 205 nm (Figura 8), com um conteúdo de 7 % de a-hélice, 51 % de folhas-β e 42 % de estrutura desordenada (random coil) analisados pelo programa K2D. Esses dados estão de acordo com a estrutura secundária reportada para a endostatina, confirmando que endo-BAX possui estrutura secundária muito semelhante à da endostatina (Wu, X.Y., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004. 320(3): p. 973-978; He, G.A., et al., Life Sciences, 2005. 77(12): p. 1331-1340).
A proteína de fusão endo-BAX-endo apresentou um perfil de CD diferente se comparado com a endostatina selvagem nativa (Figura 8) com um aumento do conteúdo de α-hélice (11 %) diminuição de folhas-β (36 %) e aumento dá porcentagem de estrutura desordenada (53 %), evidenciando que a mutação afetou significativamente a estrutura secundária deste mutante.
A estabilidade termodinâmica da endostatina selvagem e a da endo-BAX foram comparadas utilizando as mudanças de elipticidade a 222 nm para a determinação da temperatura de indução de desdobramento induzidas pelo aquecimento. A temperatura de fusão para a endostatina selvagem foi de 53°C . A presença do peptídeo BH3 de BAX em endo-BAX produziu uma elevação de 8°C na temperatura de fusão (61 °C) (Figura 9), o que sugere uma elevação na estabilidade termodinâmica da endo-BAX na comparação com a endostatina.
A espectroscopia de emissão intrínseca de fluorescência foi utilizada para caracterizar a estrutura terciária das proteínas de fusão. A endostatina possui 4 resíduos de triptofano distribuídos na sua estrutura (Hohenester, E., et al., EMBO J, 1998. 17(6): p. 1656-1964), o que torna a fluorescência um bom marcador de modificações da sua estrutura terciária.
Estudos de emissão de fluorescência da endostatina e das proteínas de fusão foram realizados no espectrômetro de fluorescência F-4500 (Hitachi), utilizando-se uma cubeta de quartzo com 1 cm de caminho óptico. As amostras foram excitadas a 288 nm e a emissão da fluorescência intrínseca das proteínas endo-BAX e er do-BAX-endo foi monitorada no intervalo de 300-400 nm.
O espectro de fluorescência da endostatina mostrou uma emissão máxima a 318 nm quando excitada a 288 nm A proteína mutante endo-BAX apresenta espectro semelhante à da proteína selvagem (Figura 10). Esses dados estão de acordo com os espectros para endostatina relatados na literatura (Zhou, H., W. Wang, and Y. Luo, J Biol Chem, 2005. 280(12): p. 11303-11312). No entanto, para a endo-BAX-endo um espectro diferente foi observado apresentado uma emissão máxima a 345 nm, o que confirma que esta proteína possui uma estrutura terciária diferente das outras, provavelmente com os triptofanos mais expostos.
A internalização da endostatina por células de origem endotelial e a ausência deste efeito por linhagens de origem não endotelial, já foi amplamente comprovada por diferentes estudos (Dixelius, J., et al., Blood, 2000. 95(11): p. 3403-3411; MacDonald, N.J., et al., Journal of Biological Chemistry, 2001. 276(27): p. 25190-25196; Zhou, H., W. Wang, and Y. Luo, J Biol Chem, 2005. 280(12): p. 11303-11312). A internalização da endostatina e das proteínas mutantes e sua especificidade por céulas endoteliais, foram demonstradas em em ensaios de internalização.
Células endoteliais C-PAE (5 x 104) foram semeadas em placas de 12 poços. As células foram mantidas a 37°C, em incubadora umidificada de CO2, em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após 24 horas o meio de cultura foi trocado pelo mesmo meio contendo 2% de soro fetal bovino + 10ng/mL de bFGF e adicionou-se endostatina ou as proteínas de fusão (10µg/mL), incubando-se em diferentes tempos: 0, 30, 90 e 180 minutos. Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS e a seguir as células foram lisadas pela adição de tampão de amostra para SDS-PAGE e incubação a 60°C por 5 minutos. As amostras foram coletadas, fervidas e aplicadas em SDS-PAGE a 12%. Após a corrida eletroforética, as proteínas do gel foram transferidas para membranas de nitrocelulose. O Western blotting foi realizado utilizando-se anticorpo anti-endostatina e 2° anticorpo anti-IgG de coelho ligado à peroxidase. As reações foram detectadas utilizando-se quimioluminescência (kit ECL da GE) e exposição das membranas a filmes de raios-X que foram posteriormente revelados.
Tanto a endostatina como as proteínas'de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo foram aderidas às células ou internalizadas pela linhagem endotelial C-PAE, o mesmo não acontecendo com linhagens não endoteliais (fibroblastos NHI 3T3) (Figura 11). Houve internalização da endostatina e também das proteínas de fusão após 3C minutos de incubação. As proteínas continuaram presentes nas células endoteliais mesmo após 3 horas de incubação. Apesar de ter sido demonstrada ausência de estrutura correta na proteína endo-BAX endo, esta proteína também foi internalizada pelas células endoteliais em menor grau nos tempos iniciais de internalização se comparadas com a endostatina e endo-BAX. Variações no tempo de internalização foram observadas para cada proteína, fator provavelmente ocasionado pelas mutações, que de algum modo afetaram o tempo, mas não a capacidade de internalização.
A linhagem celular C-PAE (célula endotelial de artéria do pulmão de bezerro) adquirida da ATCC (CCL-209) (Manassas, VA) foi utilizada para testar a habilidade da endostatina, endo-BAX e endo-BAX-endo em inibir a proliferação de células endoteliais. A habilidade da endostatina e dos seus mutantes, endo-BAX e endo-BAX-endo em diminuir a viabilidade de células endoteliais C-PAE foi avaliada pelo método colorimétrico no qual se utiliza o composto tetrazólico (3-(dimetiltiazol-2-|il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) (Cory, A.H., et al., Cancer Commun, 1991. 3(7): p. 207-212).
As células foram mantidas em meio mínimo essencial “Eagle’s" (EMEM) suplementado com 20% soro fetal bovino, 50 U/mL penicilina, 50 µg/mL estreptomicina e 2 mM L-glutamina e incubadas em ambiente úmido a 37°C, na presença de 5% CO2. As incubações foram realizadas em placas de 96-poços com um volume final de 100 µL/poço de EMEM contendo 2% soro fetal bovino, com concentrações iniciais de células de 5 x 103 células/poço. Após 24 horas de incubação o meio foi trocado por 90 µL de EMEM fresco contendo 2% soro fetal bovino e 5 ng/mL de bFGF (fator básico de crescimento de fibroblastos) e então foram adicionados 10 µL das proteínas purificadas, em diferentes diluições. Como controle foi utilizado o mesmo volume de tampão (Tris 50 mM). Cada amostra foi analisada em triplicata. As placas foram colocadas em incubadora úmida com 5% de CO2 por 72 horas a 37°C. A viabilidade celular foi determinada pela adição de 20 µL de uma solução de 20 MTS : 1 PMS à cada poço e a placa foi incubada por mais 2 horas. As leituras de absorvância, com filtro de 495 nm, foram feitos em uma leitora de ELISA (espectrofotômetro para placas de 96 poços).
Tanto a endo-BAX quanto a endo-BAX-endo mostraram maior atividade de redução de viabilidade das células endoteliais (com reduções de 50 e 34,2 %, respectivamente) do que a endostatina (com redução de 21,7 %) (Figura 12). Estes resultados indicam que a presença do peptídeo pró-apoptótico de BAX nas duas proteínaas de fusão potencializou a atividade da endostatina sobre as células endoteliais.
O efeito apoptótico do tratamento com as proteínas endostatina, endo-BAX e endo-BAX-erdo sobre as células endoteliais foi avaliado por citometria de fluxo.
Foram utilizadas células bovinas C-PAE semeadas em placas de 6 poços (1,5 x 105 células/poço) em meio EMEM com 20% de soro fetal bovino. Após 24 horas o meio foi trocado por 1 mL de meio com 2% de soro fetal bovino, 20 ng/mL de bFGF e 20µg/mL de endostatina, endo-BAX ou endo-BAX-endo. Após 16 horas as células não aderentes foram coletadas das placas contendo células tratadas e os seus controles correspondentes, em seguida os poços foram tripsinizados e as células aderertes foram adicionadas às já coletadas. As suspensões contendo todas as células de cada poço foram centrifugadas (240 x g por 5 minutos) e as células foram incubadas por 1 hora (4°C) com 300 uL de solução de iodeto de propídio em tampão HFS (50µg/mL de iodeto de propídio - PI, 0.1% Triton X-100 e 0,1% de citrato de sódio) para marcação. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACScalibur, Bencton-Dickinson).
A fusão do peptídeo pró-apoptótico potencializou a atividade apoptótica da endostatina. Ensaios de avaliação de apoptose por citometria de fluxo mostram que as células de origem endotelial apresentaram um maior grau de apoptose quando tratadas por 16 horas com 20 µg de endo-BAX ou endo-BAX-endo/mL do que as células tratadas com a mesma quantidade de endostatina. Na Figura 13 podemos observar que endo-BAX e endo-BAX-endo induzem maior grau de morte celular (63,9 ± 5,0 % e 61,0 ± 2,5 %, respectivamente) do que a endostatina (35,6 ± 2,8%).
A ação destas proteínas em fibroblastos murinos NIH 3T3 (células de origem não endotelial) foi também testada, não sendo observada morte celular significativa (2,9 ± 2 %), o que confirma a especificidade da endostatina sobre linhagens endoteliais (Dixelius, J., et al., Blood, 2000. 95(11): p. 3403-3411).
A atividade antiangiogênica da endostatina selvagem e das proteínas mutantes foi demonstrada pela inibição de crescimento de microvasos nos anéis aórticos de rato cultivados em matrigel (Kruger E.A., et al. Biochem Biophys Res Commun 2000 (268) p: 183-191). A aorta torácica proximal de ratos adultos Sprague-Dawley machos foi retirada e seccionada transversalmente em anéis de 1 mm, os mesmos foram colocados em placas de cultura de 48 poços contendo 150 µl de Matrigel (Becton-Dickinson), recobertos com um volume adicional de 150 µl de Matrigel, e cultivados durante 24 h em 1 ml de EBM-2 suplementado com 10 µg/ml de gentamicina. Após incubação, o meio foi removido e substituído com 1 ml de EBM-2, suplementado com 2% SFB, gentamicina e 10 µg/ml de endostatina, endo-BAX, ou endo-BAX-endo, o ensaio foi realizado em triplicata. O meio foi trocado todos os dias. As culturas foram mantidas a 37 °C em ambiente umidificado contendo 5% de CO2. Após 7 dias de tratamento, as culturas foram lavadas três vezes em PBS, e o meio foi substituído com meio RPMI contendo 5 mg/ml de 3 - (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) e as placas foram incubadas durante 2 h. O sobrenadante foi descartado, e imagens digitais dos anéis da aorta foram adquiridos. A área de crescimento dos microvasos foi quantificada utilizando o software Image J.
Endo-BAX e endo-BAX-endo induziram um efeito antiproliferativo mais potente na formação de microvasos se comparado com o tratamento com a endostatina se vagem. Endo-BAX, quase completamente, inibiu o crescimento de células endoteliais da aorta de rato (Figura 14A). A análise quantitativa deste ensaio evidenciou que o efeito antiproliferativo exercido por endo-BAX e endo-BAX-endo foi muito maior do que o efeito exercido pela endostatina selvagem (Figura 14B).
Para a avaliação da atividade antitumoral das proteínas foram utilizados camundongos BALB/C machos (6-7 semanas de idade). A manipulação destes animais antes ou durante os experimentos foi em conformidade com os "Princípios de Laboratório Animal Care" (NIH publ. N. 86-23, revisto em 1985), os "Princípios de Ética em Experimentação Animal" (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA). Os camundongos foram injetados, no flanco posterior esquerdo, via subcutânea (sc), com 2 x 105 células Renca (adenocarcinoma renal), num volume de 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). O tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram o volume de 100 mm3. Foram aplicadas injeções subcutâneas diárias de 15 µg de endostatina ou endo-BAX/g camundongo, durante 10 dias. As dimensões dos tumores foram medidas utilizando-se um paquímetro eletrônico, e os volumes foram calculados aplicando a seguinte fórmula: volume do tumor = comprimento x largura2 x 0,52. Observou-se uma diminuição muito mais acentuada do volume tumoral em camundongos tratados com endo-BAX, se comparados com o tratamento com a endostatina (Figura 15A). Em três dos cinco camundongos tratados com endo-BAX, o crescimento do tumor foi estabilizado ou reduzido, o que não ocorreu em nenhum dos animais dos outros grupos. Os pesos tumorais médios foram de 2,3 ± 1,19 g (grupo não tratado), 1,10 ± 0,58 g (tratados com endostatina) e 0,31 ± 0,23 g (tratados com endo-BAX) (Figuras 15B e 15C), indicando uma redução notável no peso médio dos tumores de 88% em relação ao grupo controle (não tratado) para o grupo tratado com endo-BAX.
Os estudos relacionados à presente invenção demonstram que a endostatina pode ser utilizada para direcionar agentes indutores de apoptose, devido a sua especificidade por células endoteliais e ao fato de serem internalizadas por estas células. Também mostram que a presença do domínio BH3 do BAX exerce uma melhoria significativa sobre a atividade in vitro, ex vivo e in vivo das proteínas mutantes. Como resultado, as proteínas híbridas endo-BAX e endo-BAX-endo aqui descritas podem ser utilizadas como novos agentes terapêuticos com especificidade para o endotélio tumoral e com ação apoptótica amplificada, podendo ser aplicadas no tratamento de processos angiogênicos patológicos, tais como tumores sólidos e neovascularização de córnea.
Claims (12)
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, caracterizadas por compreenderem a seqüência da proteína antiangiogênica endostatina murina juntamente com a seqüência correspondente ao domínio BH3 da proteína pró-apoptótica BAX e por apresentarem ação antiangiogênica específica para as células endoteliais ativadas e atividade apoptótica aumentada.
- Proteína! de fusão endo-BAX, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ. ID. N°.1 e consistir da fusão de seis aminoácidos Histidina à região N-terminal da endostatina e dois aminoácidos Glicina e à região C-terminal da endostatina, seguido da fusão do domínio BH3 da proteína BAX.
- Proteína de fusão endo-BAX-endo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ. ID. N°.2 e consistir da fusão de seis aminoácidos Histidina à região N-terminal da endostatina e da substituição da primeira alfa-hélice da endostatina pela alfa-hélice do peptídeo com 16 aminoácidos do domínio BH3 da proteína BAX.
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com as reivindicações 2 e 3, caracterizadas por seus vetores de expressão recombinantes serem construidos por meio das seguintes etapas:
- a) Clonagem do DNA amplificado do gene da endostatina murina presente no vetor pETKH1, contendo sítios para as enzimas de restrição NcoI e EcoRI, no vetor pET20, obtendo-se o vetor pET20-endo;
- b) Realização de dois procedimentos de mutagênese, utilizando-se o DNA de fita simples do vetor pET20-endo e oligonucleotídeos desenhados para introduzir as mutações desejadas, sendo o primeiro procedimento para introdução de codons correspondentes ao peptídeo apoptótico de BAX à jusante do gene da endostatina no vetor pET20-endo, e o segundo para a troca dos nucleotídeos correspondentes à primeira α-hélice do gene da endostatina pela α-hélice do peptídeo de BAX, gerando as sequências de DNA para endo-BAX e endo-BAX-endo respectivamente.
- c) Subclonagens dos cassetes de expressão endo-BAX e endo-BAX-endo no vetor pET28, sendo que os fragmentos de DNA presentes no vetor de expressão pET20 foram digeridos com as enzimas de restrição NcoI e EcoRI e clonados no vetor pET28obtendo-se os vetores pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo.
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pela expressão em bactérias Escherichia coli recombinantes transformadas com os vetores de expressão pET28-endo-BAX e pET28-endo-BAX-endo, seguindo-se as etapas de renaturação das referidas proteínas e sua purificação.
- Proteína de fusão endo-BAX, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por apresentar as seguintes características após renaturação e purificação: a) massa molecular 23260 Da; b) grau de pureza alto; c) estrutura secundáriacom conteúdo de 7 % de α-hélice, 51 % de folhas-β e 42 % de estrutura desordenada; d) estabilidade termodinâmica.
- Proteína de fusão endo-BAX-endo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por apresentar as seguintes características após renaturação e purificação: a) massa molecular 21330 Da; b) grau de pureza alto; c) estrutura secundária com conteúdo de 11% de a-hélice, 36% de folhas-β e 53% de estrutura desordenada.
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 6 e 7, caracterizadas por serem internalizadas pelas células endoteliais ativadas após o período de 30 minutos de incubação e permanecerem presentes nas referidas células por período superior a 3 horas, com redução de 50% e 34,2 %de viabilidade celular, respectivamente.
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 6 e 7, caracterizadas pelo fato de induzir atividade apoptótica, comprovada pela elevação da porcentagem de morte de células endoteliais ativadas na ordem de 63,9% ± 5,0% e 61,0% ± 2,5%, respectivamente.
- Proteinas s de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com as reivindicações 8 e 9, caracterizadas por induzirem a atividade antiangiogênica em ensaio realizado em anéis de aorta de rato, sendo comprovado efeito antiproliferativo potente na excrescência das células de anéis de aorta na ordem de 90% e 80% respectivamente.
- Proteína de fusão endo-BAX, de acordo com as reivindicações 8 e 9, caracterizada por induzir a redução acentuada de 93,3 % no peso médio dos tumores em camundongos injetados com células tumorais.
- Proteínas de fusão endo-BAX e endo-BAX-endo, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizadas por serem aplicadas no tratamento de processos angiogênicos patológicos, compreendendo tumores sólidos e neovascularização de córnea.
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