BG97660A - Метод за изолиране и пречистване на ловастатин - Google Patents

Abstract

Ловастатинът намира приложение в хуманната и ветеринарната медицина. Чрез метода се повишава добивът от крайния продукт. По него културален бульон (среда) се алкализира до рн 8,5 9. Мицелът се филтрир а и се подлага на екстракционна обработка с алкална вода при стайна температура и рн 8,5-9. Следва ново филтриране. Филтратите от филтрацията на културалния бульон и екстракцията на мицела се смесват. Обединеният филтрат се подлага на пречистване, което може да бъде екстракционно в два варианта, или мембранно. Пречистеният филтрат се концентрира с едновременна лактонизация на ловастатиновата кисел ина. През концентрата, съдържащ ловастатинлактон, се пропуска газообразен амоняк и образувалата се утайка от баластни вещества се филтрира. Филтратът се концентрира повторно до 1/10 от първоначалния о бем и се охлажда до -200с. Изкристализиралият ловастатинлактон се филтрира. Кристалите се сушат под вакуум и се подлагат на рекристализация из етилацетат, бутилацетат или етанол. Следва филтриране на чистия ловастатинлактон и сушене под вакуум.

Description

Изобретението се отнася до метод за изолиране и пречиствг не на ловасЬтин, който намира приложение в хуманната медицина кг то хипохолестеролемично и хиполипемично средство.

ПБЕдасШВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Известно е„ че. ловастатинът е биологичен продукт, продущ ран от различни щамове като напр. atcc 20541. Химически той представлява З-метил-бутанолова киселина-1, 2 _гЗ,.7_г8_г8а-хексахидро-З_г7-диметил-8-/2-тетрахидро-4-хидрокси-6OKCO-2H пиран-ил/-етил-1-нафталенил естер /2-бета.,_;6-алфа-диметил

8-2.-метил-1-оксобутокси/лактон с формула /1/

Известни са методи за изолиране и: пречистване на ловастатин /1,2/, при които ловастатинът се изойира от¹ ферментационния разтвор чрез подкисляване до pH. 5 и екстракция с етилацетат,. сле което са възможни три варианта:

а/ Колонна хроматография и гелхроматография,. последвани с двукратно ггрекристализиране;

б/ Гелхроматография,. комбинирана с препаративна хроматог^ фия за разделяне на ловастатин лактон от съответната му киселина в/ Получаване на амониева сол и последващо лактонизиране.

Етилацетатният екстракт,, съдържащ, ловастатин се подлага първоначално на алкална хидролиза при pH 9. Следва кисела реекст кция на водния разтвор със смес хексан:етилацетат в съотношение

2.:1.,. както и вотра екстракция на водния слой със същите органичн разтворители.. Отделената органична фаза се суши върху безводен магнезиев сулфат и филтрува. През органичният разтвор се пропуск газообразен амоняк, при което се получава амониева сол. Тя се· пр мива с ацетон и суши на въздух. Прекристализира се? из смес хлороформ : метанол : амониева основа 80 : 2Θ : 2. Суспендира се толуол и се нагрява при температура 106° за 2 1/2 часа на обрат хладник. Филтрува се на горещо и филтратът се оставя да престои една нощ при -20°С„ за да изкристализира ловастатин лактон. Кри _талният продукт се· филтрува,. промива се? със студен толуол и пет ролев етер и се суши на въздух. Чрез тези методи от 400 л култу рална течност се получават¹ 128 г амониева сол, а от тях - 84 г ловастатин лактон.

Недостатък на известните методи е получаване на краен nj дукт със сравнително невисок добив.

Задача на изобретението е да се разработи метод за изолг рзне и пречистване на ловастатин с повишен добив на краен прод,

ТЕХНИЧЕСКА ОБЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Методът, съгласно изобретението съдържа следващите опере ции ·

Културалният бульон /среда/се алкализира до pH 8,5-9, с. което мицельт се. филтрува. Полученият мицел се подлага на екст? ционна обработка с алкална вода при pH 8,5 - 9 и разбъркване зг около 90 мин. Съотношението между мицел : екстрагент е 1:5 и ез тракцията се провежда при стайна температура. Полученият екстр; се филтрува.

Двата филтрата - от бульона и екстракцията се обединява· и подлагат на пречистване’.. Пречистването може да се осъществи з два начина - чрез екстракционно пречистване или чрез мембаранн пречистване.

Метиленхлоридният екстракт, подучен по единия или други, начин на пречистване се подлага на концентриране до 1/10 от пъ * —· *4:

t началния обем. При концентрирането на екстрактите киселината hs лова.статина отделя молекула вода и се превръща в ловастатин лав тон. Превръщането се следи хроматографски. За завършване на лак тонизирането към концентрата се прибавя равен обем сух бутилаце тат и дестилацията продължава до посочения краен обем.

През концентрата се пропуска газообразен амоняк, при кое се утаява^т съпътстващите вещества с близки физикохимични свойст Образуваната утайка се филтрува.

Филтратът се подлага отново на концентриране' до 1/10 от първоначалния обем и се охлажда до -20°С за изкристализиране на ловастатин лактона.

Кристалите се филтруват и изсушават под вакум при 40°С з; около 3 часа.Изсушените кристали се прекриетализират из етилацетат или абсолютен етанол. Следва ново филтруване и сушене под вг кум при 4-0°С за около 3 часа.,

Екстракционното пречистване на обединения филтрат се. със1 от следните- действия: Подкисляване до pH 4 с 18 %-на солна KHcej на и екстракция на филтрата с бутилацетат еднократно при съотно^ шение водна фаза:бутилацетат 3:1. Бутилацетатният екстракт се пс с ^w лага на реекстракция с алкална вода двукратно при pH 8,5-^ , кат обема на водната, фаза към органичната фаза е 1:2.. Алкалният реев стра.кт се подкислява до pH 4 с 18 %-на солна киселина. Ловастати нът се екстрахира с метиленхлорид двукратно, като съотношението на обемите на метиленхлорида : водната фаза е 1:5 при първата ек тракция и 1:10 при втората.

Мембранното пречистване на обединеният филтрат включва не

I утрализирането му до pH 7 с 18 %-на солна киселина и ултрафилтра· ция през мембрани с големина на порите от 10000 до 60000 юя. Да. тона. Ултрафилтратът се концентрира до 1/3 от първоначалния обем « - 5 чрез обратна осмоза и· подкислява до pH 4 с 18%-на солна киселин Следва екстракция на концентрата с метилен^хлорид двукратно с 1/5 и 1/10 спрямо обема на водната фаза.

Добивът на краен продукт лова статии лактон е от порядъка на 67 %.

Предимството на изобретението се изразява в повишаване- д бива на крайния биологичноактивен продукт.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1

100 л културялна среда /бульон/, със съдържание на ловас тия 500 гами/мл /изчислен като ловастатин лактон/ се алкализира¹ ’ до pH 8,,5-9 с 50 %-на натриева основа при температура 15-20°С.

След достигане на желаното pH бульонът се филтрува на камерна φι търпреса. Филтратът се запазва, а мицелът с тегло около 14 кг с< подлага на екстракция с вода, при 20°С и съотношение 1:5. pH на средата при нужда се коригира до' 8,5-9 с 50 на натриева основг Екстракцията се провежда при разбъркване в продължение на 90 ми1 След приключването и суспензията се- филтрува.

Филтратът се обединява с филтрата от културалната среда. Обединеният филтрат с обем около 160 л се екстрахира с 50 л бут1 ацетат. Екстракцията се провежда при температура. 20°С и разбъркване за 15 мин. След отстояване 15 мин. водният слой се- отделя, а бутилацетатният се екстрахира двукратно с по 25 л вода, при pH 8,5-9 /при необходимост се корегира е 50 %-на натриева основа/. Ре екстракцията продължава около 20 мин при 2;0°С и разбъркване.

Двата обединени водни, екстракти се. подкисляват с 18 %-на солна киселина до pH 4, след което се подлагат на двукратна екстракция с метиленхлорид при следните съотношения:

- 6 . Първа екстракция - с 10 л / 1/5 спрямо обема на водната фада/ и Втора екстракция - с 5 л / 1/10 спрямо обема на водната фаза/.

Двата метиленхлоридни екстракти· се обединяват и подлагат на конценриране при атмосферно налягане до около 1/10 от първонг чалния обем. Към кубовият остатък /концентрата/ от 1,5 л се прибавя равен обем сух бутилацетат. Концентрирането продължава под вакум при 15 мм живачен стълб и температура 50°С до получаване 1 остатък от 1,5 л, при което ловастатин киселината се лактонизир Лактонизирането се следи хроматографски^

Концентратът, Съдържащ 38 г ловадгатин лактон се насища < газообразен амоняк до момента на спиране на образуване на утайк Получената утайка се: филтру.ва на Бюхнер под вакум и се: промивас сух бутилацетат.

Филтратът се- изпарява до около 100 мл и се оставя в хладилник при -20°С. След 24 часа изкристализиралият ловастатин ла тон ое филтрува. и суши под вакум при температура 45°С до постоя тегло. Получават се около 32 г ловастатин лактон.

Допълнително от матерните луги след обработка се получа! още. 2 г ловастатин лактон.

Полученият ловастатин лактон се прекристализира из етилацетат или абсолютен етанол.

Добивът на ловастатин лактон спрямо съдържанието в кулгу ралната течност е 67 %.

Прекристализираният ловастатин лактон притежава следните физикохимични свойства.’ ’ - Т.,т. 170° - 171°С;

- УЪ спектър - макс.- 230 нм, 237,5 нм, 246 нм;.

- ИЧС спектър - 3550 см¹, 2970 см“¹; 1694 см¹ и 1220 см¹

- Оптично въртене g /οί/25 = 320,7

Субстанцията лова статии лактон отговаря на изпитваните ш казатели по Ме Чек Index.

Пример 2

100 л културална xenmskx среда /бульон/ с количествено ст държание на ловастатин, ицчислено като лактон 500 гами/мл се об» ра0тва както в пример 1. до получаването на обединения филтрат оп филтрацията на кулщ^уралната среда и екстракцията на минела. Обе диненият филтрат се неутрализира е 18 %-на солна киселина до pH 7, след коешо се подлага на ултрафилтрация при 20°С,Използват се мембрани за ултрафилтрация с пори от 10000 до 60000 Далтона. Пе^ меатът /ултрафилтратът/ се концентрира чрез обратна осмоза до 1/ от първоначалния обем. Концентратът се подкислява с 18 %-на солна киселина до pH 4, след което се' екстрахира двукратно в съгците съотношения и условия, както в пример 1, с метиленхлорид. ббедиие мдае Метиленхлориднй^?кстракти се обединяват, концентрират и лак тонизират както в пример 1. Обработката на концентрата с газооб^ зен амоняк, филтруване, промиване със сух бутилацетат, концентри ране_г кристализиране и т.н. да получаването на краен продукт се &

** осъществява, съгласно процедурите от пример 1..

Добивът на ловастатин лактон спрямо съдържанието в култура лната среда е 67

Прекристализираният ловастин лактон притежава следните физикохимични' свойства:

- Т.т. 170°-1.71 °C;

- УВ спектър - манс. - 230 нм, 237,5 нм, 246 нм;

- ИЧ спектър - 3550 см¹,, 2970 см”¹, 1694 см”¹ и 1220 см”¹ ;

- Оптично въртене /25 = 32.0,7

Claims (3)

1. Метод за изолиране' и пречистване на ловастатин, харак теризиращ се с това,, че културалният бульон се алкализира до pH

8,5 ~ 9, мицелът се филтрува и подлага на екстракционна обработ на с алкална вода при pH 8,,5 - 9 при стайна температура и филтр ване, обединяване на двата филтрата, провежда се екстракционно или мембранно пречистване на обединения филтрат,, полученият сле това метиленхлориден екстракт се концентрира до 1/10 от първона лния обем с едновременна лактонизация, като за завършване на ла. тонизацията в края на концентрирането се? прибавя равен обем сух бутилацетат, през концентрата се. пропуска газообразен амоняк и образувалата се утайка се филтрува, повторно се концентрира фил· трата до 1/10 от първоначалния обем и охлажда до -20°С, филтрув, не на изкристализиралият ловастатин лактон,. следва изсушаване н; кристалите под вакум при 40 θ, прекристализация из етилацетат и, абсолютен е.танол, филтруване на чистия ловастатин лактон и сушене: под вакум.

2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това че· екстракционното пречистване- включва подкисляване на обединен] филтрат с 18. /«на солна киселина до pH. 4, е-кстракция на филтрата с бутилацетат, двукратна ре-екстракция с алкална вода при pH 8,59, подкисляване на алкалния реекстракт с 18 $-на солна киселина до pH 4 и двукратна екстракция на ловастатина с метиленхлорид.

3. Метод,, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че мемранното пречистване се състои в неутрализиране на обединеният филтрат с 1.8 %-на солна киселина до pH 7,. ултрафилтрация през мемрани с големина на порите от 10000 до 60000 далтона, полученият ултрафилтрат се концентрира чрез обратна осмоза до 1/3

- 9 от първоначалния обем, подкислява се до pH 4 с 18 %-на солна ки селина и концентратът се екстрахира двукратно с метиленхлорид.