BG67308B1 - Инхибитор на вирусната невраминидаза и на м2 протонния канал - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до инхибитор на вирусната невраминидаза и на М2 протонния канал и представлява съединение с формула 1: както и до метод за неговото получаване и приложение като средство за профилактика и лечение на вирусни инфекции.

Description

Настоящето изобретение се отнася до инхибитор на вирусна невраминидаза и на M2 протонния канал, метод за него получаване и приложението му за профилактика и лечение на вирусни инфекции.

Предшестващо състояние на техниката

Грипът представлява сериозна вирусна инфекция на респираторния тракт. По данни на СЗО, грипният вирус е οτγοβι за заболяването на 3 до 5 милиона души и за смъртта на 250 000 до 500 000 души годишно, причинени както директн вируса, така и от вторични инфекции [1]. През последното столетие три големи пандемии, Η1Ν1 вирус през 191 (Испански грип), Η2Ν2 вирус през 1957 и Η3Ν2 вируса през 1968 кумулативно са причина за загуба на приблизителн млн души. „Испанският грип” представлява най-тежката пандемия, причинила смъртта на приблизително 20 млн души < през първата година. Последната пандемия - през 2009 известна още като “Мексикански грип” (грипен вирус тип А, Н свински грип), се оказа относително безобидна, докато високо патогенния „птичи грипен вирус” (Η5Ν1) през послед години е причина за сериозно безпокойство, т. к. лесно преминава от животните върху хора.

Понастоящем се прилагат два основни (доказани) терапевтични подхода за лечение на грипа или за превенци инфекциите: 1) ваксини и 2) използване на противовирусни средства.

Оказва се, че приложението на ваксините, като средство за защита е незадоволително поради антигенната вариацг грипния вирус, което налага търсене и разработване на нови противовирусни лекарствени средства.

Развитието на ефективна химиотерапия на грипа е от първостепенно значение в борбата с това заболяване, но ош противогрипни химиотерапевтици показва, че лекарствената устойчивост на вируса е основно препятствие за тях ефективност. Освен загубата на противовирусна активност на веществата, като резултат от възникване на мутации, устой¹ на лекарствата, този феномен показва други неблагоприятни фенотипни прояви, като повишена вирулентнос трансмисионна способност.

Усилената работа в последните 40 години в изследването на вещества с инхибиторен ефект върху различни мишен грипните вируси е довело до утвърждаването в клинична практика основно на две групи съединения: M2 блоке] невраминидазни инхибитори.

Известно е, че повърхностните мембранни протеини на грипния вирус са изградени от три основни компонента, протонен канал, хемаглутинин (НА) и невраминидаза (ΝΑ) [2]. M2 - протонният канал е отговорен за протон пропускливост, необходима за вирусната репликация. Хемаглутининът е важен за свързването към повърхностт< инфектираната клетка, водещо до прикрепване и проникването на вирусите в клетката - мишена, а ензимът невраминид; гликопротеин, необходим за освобождаване на новите вирусни частици (вириони), разкъсвайки крайната сиалова кисели! хемаглутининовите им рецептори, така че те да могат свободно да циркулират в тялото и да инфектират други кле Следователно всеки един от трите компонента може да бъде мишена при създаване на нови лекарствени средства.

В областта на невраминидазните инхибитори са направени много изследвания с оглед откриване на потенциално ι активни вещества, както и за оптимизиране или модифициране на известни структури, общата цел на които е получава! вещества с подобрена ефективност или биодостъпност [3-5]. Така например, съгласно международна заявка за па W09626933 са създадени невраминидазни инхибитори с обща формула

където Е e -(CRiRi)miWi, a RI може да бъде Н или алкил с 1 до 12 С атома, Wi е група включваща кисел Н, защ група или R«c , което може да бъде Н или аминен остатък, най-често е -CO2R1, където Ri е дефинирано по-горе и ml моя бъде от 0 до 2, най-често 0. Описани са: инхибиторите от изобретението, методите за инхибиране на невраминидазата, к и резултати от противовирусната активност на съединението от изобретението. Активното вещество на база този пат оселтамивир, е одобрено като лекарствено средство за лечение на вирусни инфекции под името тамифлу.

(1)

Освен това, патент WO2013060889 описва производни на оселтамивира с обща формула (2), които са ефикасн лечение на грип:

N, .N.....- Н^!

BG 67308 Bl (2)

Където: Z може да е С, a R⁴ може да бъде Н или разклонен или неразклонен, наситен или ненаситен, субституиран несубституиран въглеводород с верига от 1 до 12 С атома.

Структурните аналози на оселтамивира имат сходно действие, но нито един от тях не го превишава по качества, по] което и нито един не е одобрен, като фармацевтично активно вещество. Съществени за успеха на едно терапевтично сред са неговият фармакокинетичен профил, повлиян от разтворимостта, способността да активира потенциални предшествег на активното вещество, както и формирането на протеинови връзки. Еднакво важна е и стабилността при физиолоп условия. От съществена значимост е също оралната биодостъпност на терапевтичното средство, която показва степен която даден активен инградиент се абсорбира след орално приложение. Оралното приложение е най-лесният начи използване в сравнение с останалите инжекционна или инхалационна форми. Например, не е нужно да се съблю стерилност, която е необходима при инфузия или инжектиране. В допълнение дозирането и прилагането е много по-лес сравнение, например, с една инхалационна медикаментозна форма.

Напоследък обект на загриженост е наблюдаваното нарастване устойчивостта на вирусите A(H1N1) с мутация Н7 спрямо оселтавимир. Но ако оселтавимира се окаже неефективен срещу по-нататъшна устойчивост на вируса, полез количество на орално приложимото вещество, ефективно срещу вирусната инфекция, се загубва.

Известно е също, че друга група противогрипни препарати- т. нар. M2 инхибитори, като амантадин и римант; проявяват резистентност при продължителна употреба [6-10]. Така например, изследване върху повече от 7000 проб инфектирани с грипен вирус А пациенти, събрани в света през годините 1994 - 2004, показват повишена устойчивост сп] M2 инхибитори от 0,4% през 1994 - 1995 до 12,3% през 2003 - 2004 г. В допълнение, римантадинът причинява и страш ефекти като гастро-интестинални неразположения.

Ето защо, задача на изобретението е да предложи съединение, което да действа като инхибитор на невраминидаз; на M2 протонният канал и което да проявява подобрен фармакокинетичен профил и добра биодостъпност с о приложимостта му, като средство за профилактика и лечение на вирусни инфекции.

Техническа същност на изобретението

По своята същност изобретението се отнася до инхибитор на вирусната невраминидаза и на M2 протонния кан представлява съединение с формула I:

BG 67308 Bl

Химичното съединение с Формула 1 се получава чрез следната последователност от синтези: В разтво| тетрахидрофуран се добавят римантадин хидрохлорид и дициклохексилкарбодиимид, реакционната смес се охлажда на ле. баня и се разбърква на магнитна бъркалка. Към охладената смес се прибавят оселтамивир, разтворен в тетрахидрофур диметиламинопиридин. Полученият след приключване на реакцията дициклохексилкарбамид се филтрува, а получе вещество се хроматографира на колона със силикагел. За елуент се използва МеОН:ЕЮАс (3:1). Добив = 75%.

Ή NMR (600 MHz, DME) δ 9.39 (s, 7Η), 8.37 (s, 20Н), 8.12 (s, 7H), 6.76 (d, J=7.6 Hz, 7H), 5.37 (s, 28H), 5.09 (s, 53H), (t, J=7.1 Hz, 193H), 4.16 (d, J=7.5 Hz, 41H), 4.04 (d, J=7.5 Hz, 98H), 3.68 (s, 128H), 3.60 (s, 141H), 3.33 (s, 489H), 2.52 (s, 27 2.39 (s, 101H), 2.28 (t, J=7.8 Hz, 198H), 2.13 (s, 28H), 1.97 (s, 408H), 1.84 (d, J=21.2 Hz, 351H), 1.62 (d, J=12.2 Hz, 180H), 13 J=13.3 Hz, 130H), 1.31 (s, 108H), 0.94(d, J=16.7 Hz, 63H);

¹³C-NMR (151 MHz, DME) δ 157.55 (s), 143.33 (s), 128.48 (s), 109.44 (s), 102.05 (s), 81.83 (s), 79.94 (s), 68.96 (s), 68.6: 68.43 (s), 68.25 (s), 60.70 (s), 49.74 (s), 34.84 (s), 33.36 (s), 31.82 (s), 27.58 (s), 27.26 (s), 25.87 (t, J=10.2 Hz), 25.66 (s), 24.6 14.49 (s), 11.01 (s), 9.36 (d, J=6.4Hz). [M+H]=446.

Полученото съединение е c наименование по ШРАС: Н-(Г-адамантан-Г-етил) (3S, 4R, 58)-5-амино-4-ацетамщ пентан-3 -ил-окси-циклохексен-1 -ил-карбоксамид.

Етапите на синтеза на съединението с формула I, съгласно изобретението, са обобщени на схема I по- долу.

Схема I

Където:

i) е въздействие с тетрахидрофуран, дициклохексилкарбодиимид, 0°С, 1 h;

ii) е въздействие с тетрахидрофуран, диметиламинопиридин 0°С, 1 h.

Химичната стабилност на съединението с Формула I, съгласно изобретението, е изследвана при стойности на pH = (0,1М HCI) и pH = 7,4 (фосфатен буфер) и температура 37°С и показва стабилност в кисела среда.

По този начин е създадено ново съединение, действащо, като инхибитор на вирусната невраминизада и на протонният канал, и по този начин е ефективно в преодоляване на развиваща се срещу оселтамивир и римант. резистентност. Същевременно съединението показва подобрен фармакокинетичен профил и добра биодостьпност с о приложимостта му, като средство за профилактика и лечение на вирусни инфекции без характерните за риманта, странични ефекти.

BG 67308 Bl

Пояснение на приложените фигури:

Фигура 1 представя времето на полуразпад на съединението, като полулогаритмична зависимост на относител) изменение на концентрацията на изследваното вещество с времето.

Фигура 2 показва полулогаритмичната зависимост на концентрацията от времето при pH - 1.0.

Фигура 3 представя промяната на концентрацията на съединението с формула I във времето при 37°С и pH 7.4.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват:

Пример 1: Получаване на съединение с Формула I

Съгласно един предпочитан вариант на изпълнение, за получаване на съединението с Формула I, съгл изобретението, се процедира по следния начин:

В 10 ml разтвор на тетрахидрофуран се разтварят римантадин хидрохлорид (0.350 g, 1,6 ммол дициклохексилкарбодиимид (0.150 g, 0.72 ммол). Реакционната смес се охлажда до 0°С на ледена баня. Така смесе вещества се разбъркват на магнитна бъркалка в продължение на lh. Към охладената смес се прибавят оселтамивир (0.2.

ммол), разтворен в тетрахидрофуран и диметиламинопиридин (0,090 g, 0.72 ммол). След приключване на реакп дициклохексилкарбамида се филтрува, а полученото съединение се хроматографира на колона със силикагел. За елуент се използва MeOH:EtOAc (3:1). Добив = 0.240 g (75%).

Ή NMR (600 MHz, DME) δ 9.39 (s, 7H), 8.37 (s, 20H), 8.12 (s, 7H), 6.76 (d, J=7.6 Hz, 7H), 5.37 (s, 28H), 5.09 (s, 53H), (t, J=7.1Hz, 193H), 4.16 (d, J=7.5 Hz, 41H), 4.04 (d, J=7.5 Hz, 98H), 3.68 (s, 128H), 3.60 (s, 141H), 3.33 (s, 489H), 2.52 (s, 27 2.39 (s, 101H), 2.28 (t, J=7.8 Hz, 198H), 2.13 (s, 28H), 1.97 (s, 408H), 1.84 (d, J=21.2 Hz, 351H), 1.62 (d, J=12.2 Hz, 180H), 13 J=13.3Hz, 130H), 1.3 l(s, 108H), 0.94 (d, J=16.7Hz, 63H);

¹³C-NMR (151 MHz, DME) δ 157.55 (s), 143.33 (s), 128.48 (s), 109.44 (s), 102.05 (s), 81.83 (s), 79.94 (s), 68.96 (s), 68.6 68.43 (s), 68.25 (s), 60.70 (s), 49.74 (s), 34.84 (s), 33.36 (s), 31.82 (s), 27.58 (s), 27.26 (s), 25.87 (t, J=10.2 Hz), 25.66 (s), 24.6' 14.49 (s), 11.01 (s), 9.36 (d, J=6.4Hz). [M+H]=446.

Хидролизният процес протича като процес от първи порядък. Скоростната константа на хидролиза - К се пресмя' наклона на правата, илюстрираща промяната на логаритьма от концентрацията на изходното вещество с времето (InC - 1 kt). Презполовителното време се изчислява като ti/2 ⁼ In2/k (фиг. 1).

Както е видно от фигура 1, зависимостта Со/С с времето не е линейна, което показва, че реакцията не протича от в· порядък. Въпреки че в реакцията на хидролиза на изследваното съединение участват две изходни вещества, реакцията про като реакция от първи порядък по отношение на изследваното вещество, защото вторият компонент в реакцията - водат много голямо количество и концентрацията й остава постоянна. Както се вижда от приложената фигура хидролизат изследваното съединение протича като реакция от първи порядък.

За да се определи времето на полуразпадане на съединението са построени полулогаритмичните зависимост: относителното изменение концентрацията на изследваното вещество с времето.

Пример 2: Изследване на химична стабилност на съединението с Формула I, съгласно изобретението:

Химичната стабилност на съединението е изследвана при pH 1.0 и при pH 7.4. На фигура 2 по-долу е пока полулогаритмичната зависимост на концентрацията от времето при рН=1.0.

На таблица 1 по-долу са показани стойностите на времената на полуразпадане видно е, че изследваното съедин показва стабилност в кисела среда (1½. = 0.5 h) и (t^ = 1.05 h) при неутрално pH.

Таблица 1

BG 67308 Bl

Таблица 1

Кисела среда	Неутрална среда
pH 1.0*. 37*С	pH 7.4“, 37°С
ty„ = 0.5 h	t%, = 1.05h

Където:

-^аеНС1 (0.1 М);

-^б е НзРОЦОЛМ).

Промяната на концентрацията на съединение с формула I във времето при 37°С и pH 7.4 в полулогаритм! координати е илюстрирана на фигура 3.

BG 67308 Bl

Пример 3: Тестване на in vitro противовирусната активност

Ефектът на съединението с формула I, съгласно настоящето изобретение, е изпитан с експерименти върху мш инфектирани с грипен вирус A/Aichi/H3N2. Вирусната суспензия е от колекцията на секция „Вирусология” на Институ микробиология „Стефан Ангелов” при Българската академия на науките.

За експериментите са използвани MDCK (Madin-Darby canine kidney) клетъчни култури. Клетъчната линия се поддт чрез последователни пасажи в растежна среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium) c 10% фетален телешки cep антибиотици (пеницилин 100 IU/mL, стрептомицин 100 pg/mL и гентамицин 50 pg/mL) и 20 mM HEPES.

Вирусът е грипен вирус A/H3N2, щам Aichi. Вирусът се култивира в поддържаща среда DMEM (Gibco BRL, US 0.5% фетален телешки серум, 10 mM HEPES (Merck, Germany) и антибиотици (пеницилин 100 UI/mL и стрептомицин pg/mL) при 37°С и в присъствие на 5% СО₂. Титрира се по метода на крайното разреждане като титърът е представ CCIDso/mL. Цитопатичният ефект е отчитан микроскопски и по колориметричния метод с оцветяване на жизнените клет Neutral red uptake assay.

Клетъчна култура и хранителна среда: Клетъчна линия от телешки бъбречни клетки MDBK, култивирана с хранит среда RPM1-1640 (Flow laboratories).

Методи: Максимална поносима концентрация (МПК): На 96-ямкови микроплаки при пълен клетъчен монослой съответното разреждане на веществото инокулират по 3 ямки и се добавя хранителна среда. Микроплаките се инкубирг 37°С за 96 h. На всеки 24 h се определя промяната в морфологията на третираните клетки, сравнение с контролни клетк: МПК се определя концентрация, която не предизвиква морфологични промени в третирания монослой.

1. Определяне на противовирусната активност чрез редукция на вирусната репликация.

Пълен клетъчен монослой се заразява с 320 CCID50/0, 1 ml от съответния вирусен щам. След 1 h адсорбция от в разреждане на веществото се инокулират по 3 ямки. При пълна деструкция на клетъчния монослой в контролата се опре вирусния цитопатичен ефект (ЦПЕ). За всяка концентрация на веществата се взема средната стойност на ЦПЕ и се изра: като процент от вирусната контрола.

На базата на получените резултати графично се определя дозата, предизвикваща 50% редукция на вирус репликация. (EDso)·

2. Определяне на противогрипна активност

За експериментите са използвани MDCK клетъчни култури. Клетъчната линия се поддържа чрез последователни па< в растежна среда DMEM с 10% фетален телешки серум и антибиотици (пеницилин 100 IU/mL, стрептомицин 100 pg/r гентамицин 50 pg/mL) и 20 mM HEPES. Вирусът е грипен вирус щам А/Aichi/ H3N2 Вирусната суспензия е от колекция! секция „Вирусология на Институт по микробиология „Стефан Ангелов при Българската академия на науките. Вируст култивира в поддържаща среда DMEM (Gibco BRL, USA) c 0.5% фетален телешки серум, 10 mM HEPES (Merck, Germai антибиотици (пеницилин 100 UI/mL и стрептомицин 100 (pg/mL) при 37°C и в присъствие на 5% СО₂. Титрира се по ме на крайното разреждане като титърът е представен в CCIDso/mL.

Цитопатичният ефект е отчитан микроскопски и по колориметричния метод с оцветяване на жизнените клетки с Ne red uptake assay.

3. Цитотоксичност

Цитотоксичността е изпитана върху монослойни клетъчни култури в 96-ямкови плаки. Клетъчният монослой във в ямка се инокулира с по 0.1 mL от 0.5 1д серийни разреждания на веществата в поддържаща среда. Ямки, инокулирани са поддържаща среда, служат за клетъчна контрола. Клетките се инкубират при 37°С в присъствие на 5% СО₂ и ежедневг проследяват за наличие на микроскопски промени. На 48-я час клетъчните култури се оцветяват с NR и резултатът се от колориметрично.

4. ЦПЕ-инхибиращ тест

Монослойни клетъчни култури се инокулират с по 0.1 mL вирусна суспензия в поддържаща среда, съдържаща ССШ50 на изпитвания вирус. След 1 h за адсорбция на вируса при стайна температура вирусната суспензия се отстраня на нейно място се инокулират по 0.1 mL от 0.5 1g серийни разреждания на изпитваните съединения. Така обработе клетъчни култури се инкубират в термостат на 37°С и 5% С02 и се наблюдават ежедневно за развитието на виру цитопатичен ефект. След пълното разгръщане на ЦПЕ в ямките с вирусната контрола (без инхибитор в поддържащата ср клетъчните култури се обработват с NR. Получените стойности на оптичната плътност на отделните проби се използв: пресмятане на процента на защита (ако има такъв).

Резултатите от изпитването за противовирусна активност in vitro на съединението, съгласно настоящето изобрете срещу грипен вирус A/Aich/H3N2 са представени на таблица 2 по-долу.

Таблица 2.

Таблица 2.

Съединение	ССмЧмМ)	1Сй‘(мМ)	SI·
Съединение с формула 1	254.76	7.27	35
Оселтамивиркарбоксилат	>100	80	>1.25

BG 67308 Bl

Където:

^а СС50 - 50% цитотоксична концентрация - концентрацията, при която 50% от клетъчния монослой е със запа жизненост.

^б1С₅о - 50% инхибираща концентрация - концентрацията, при която 50% от вирусния цитопатичен ефект е инхиб: (т. е. при която съединението защитава 50% от клетъчния монослой).

^в SI - селективен индекс — CC50/IC50.

Получените резултати показват, че съединението, съгласно изобретението, проявява висока противогрипна активи. SI=35 (за активно се счита съединение, което проявява SI=10).

Claims (3)

1. Инхибитор на вирусната невраминидаза и на M2 протонния канал с формула I
2. Метод за получаване на инхибитор на вирусната невраминидаза и на M2 протонния канал с формула (I), съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че 1.6 mmol римантадин хидрохлорид и 0.72 mmol дициклохексилкарбодиимид се добавят към 10 ml разтвор на тетрахидрофуран, реакционната смес се охлажда до 0°С на ледена баня, разбъркват се в продължение на 1 h на магнитна бъркалка, към охладената смес се прибавят 72 mmol оселтамивир, разтворен в 0.72 mmol тетрахидрофуран и диметиламинопиридин, като полученият след приключване на реакцията дициклохексилкарбамид се филтрува, а полученото вещество се хроматографира на колона със силикагел с елуент МеОН: ЕtOАс (3:1)
3. Инхибитор на вирусната невраминидаза и на M2 протонния канал с формула (I), съгласно претенции 1 и 2, приложим за профилактика и лечение на вирусни инфекции