BG64423B1 - Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза i - Google Patents

Abstract

Аминокиселинните последователности на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I редуцират афинитета за свързване на актин. Осигурени са последователности на нуклеинови киселини, кодиращи такива актинрезистентни варианти, при което става възможно получаването им в количества, достатъчни да бъдат използвани в клиничната практика. Изобретението се отнася също до фармацевтични състави и до терапевтичните приложения в клиниката на актинрезистентните варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. а

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, по-специално до резистентни на актин варианти и тяхното приложение за редуциране на вискоеластичността на ДНК съдържащ материал.

Предшестващо състояние на техниката

Дезоксирибонуклеаза I е фосфодиестераза, способна да хидролизира полидезоксирибонуклеинова киселина. Дезоксирибонуклеаза I е пречистена от различни биологични видове при различни степени на пречистеност.

Волската дезоксирибонуклеаза 1 е обект на екстензивни биохимични изследвания [виж например Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed), pp. 281 -296, Academic press, New York (1981)]. Пълната аминокиселинна последователност на волска дезоксирибонуклеаза I е известна (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefher, et al., J. Mol. Biol. 192: 604-632 (1986); Lahm, et al., J. Mol. Biol. 221:645-667 (1991), а ДНК, която кодира волска дезоксирибонуклеаза I, успешно е клонирана и експресирана (Worrall, et al., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Структурата на волската дезоксирибонуклеаза I е била определена с помощта. на рентгенова кристалография. Suck, et al., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck, et al., Nature 321: 620-625 (1986); Oefner, al., J. Mol. Biol. 192: 605-632(1986).

ДНК, която кодира човешка дезоксирибонуклеаза I, е изолирана и е определена аминокиселинната й последователност и ДНК е била експресирана в рекомбинантни клетки гостоприемници и посредством това е възможно производството на човешка дезоксирибонуклеаза I в комерсиално приложими количества (Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990)).

Човешка дезоксирибонуклеаза I притежава качества, които я правят приложима за целите на клиничната терапия. Нейното основно терапевтично свойство е да редуцира вискоеластичността на белодробните секреции (слуз) при такива заболявания като пневмония и кистозна фиброза, като по този начин се постига изчистване на дихателните пътища (виж напр. Lourenco, et al., Arch Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Hubbard, et al., New England. J. Med. 326: 812-815; Fuchs, et al., New England. J. Med. 331: 637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48:894-906(1994). Слузта също допринася за заболеваемостта от хронични бронхити, астматични бронхити, бронхиектазии, емфизема, остри и хронични синузити и дори обикновените настинки.

Материалите от белодробната секреция на болните от посочените заболявания представляват сложни комплекси, които включват мукусни глюкопротеини, мукополизахариди, протеази, актин, ДНК. Някои от тези материали се отделят от белите кръвни клетки - левкоцити (неутрофили), които се инфилтрират в белодробните тъкани при нахлуването и размножаването на патогенни микроорганизми (например щамове бактерии на Pseudomonas, Pneumococcus и Staphylococcus) или други дразнители (например тютюнев дим, полени и др.). По време на взаимодействието си с такива микроби или дразнители, левкоцитите могат да бъдат разрушени и техните съставки да бъдат освободени, което допринася за вискоеластичността на белодробните секреции.

Свойството на дезоксирибонуклеаза I да редуцира вискоеластичността на белодробните секреции е било обяснено с нейната способност за ензимно разграждане на големи количества от ДНК, освободени от неутрофили (Shack, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Atiken, etal., Am. Med. Assos. 267: 1847-1951 (1992).

По-късно е предложен друг механизъм за обяснение на муколитичния ефект на дезоксирибонуклеаза I, включващ, разграждане на актин (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). Актинът е един от най-широко разпространените белтъци в еукариотните клетки (например актинът представлява около 10% от общото, количество на левкоцитарния белтък) и е изследван задълбочено (Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76(1992); Sheterline,etal.,Prot. Profile 1: 1-121 (1994)). Актинът се среща в две форми: мономерна форма (G-актин) и нишковидна форма (F-актин), която е комплектована от G-актинови мономери. Полимерните нишки на актина са с голяма вискоеластичност и имат значителен принос за вискозитета на белодробните секреции (Momet, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 3680-3684 (1984); Newman, etal., Biochemistry 24:1538-1544); Janney, et al., Biochemistry 27: 8218-8226 (1988); Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994)).

Поради това, че за дезоксирибонуклеаза 1 се знае, че се свързва с актин (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Kabsh, et al., Nature 347: 37-44 (1990) и че деполимеризиpa актиновите нишки (също като инхибира полимеризацията на G-актин в нишки) (Mannherz, et al., FEBS Lett. 60: 34-38 (1975); Hitchcock, et al., Cell 7: 531-542 (1976): Pinder, et al., Biochemistry 21:4780-4786 (1994), се предполага, че муколитичният ефект на дезоксирибонуклеаза I върху храчките и други белодробни секреции се дължи поскоро на разграждането на актина (деполимеризация), отколкото на хидролизата на ДНК (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). От тази гледна точка, известно е, че в присъствието на актин, хидролитичната активност към ДНК на дезоксирибонуклеаза I е инхибирана (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Mannherz, et al., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980)). Също от тази гледна точка е съобщено, че протеините с отделен актин (например гелсолин) са ефективни по отношение на намаляване на вискоеластичността на храчките при кистозна фиброза (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994); Stossel, et al., PCT Patent Publication No WO 1994/022465 (published October 13,1994)).

Представяното изобретение се основава отчасти на проучване, проведено от авторите на изобретението, за да бъде определена биохимичната база, на която се основава муколитичната активност на дезоксирибонуклеаза I. Това изследване включва проектиране и синтезиране на различни варианти на човешка дезоксирибонуклеааа 1 и апробиране на тези варианти , за да бъде оценена тяхната способност да хидролизират ДНК, да свързват актин и да намаляват in vitro вискоеластичността на храчки. Създадени са няколко класа от варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Един такъв клас от варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I (варианти, които са резистентни на актин) има намалена способност да свързва актин, но пък притежава и муколитична активност и в някои случаи е имал повишена муколитична активност при сравняване с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Тези резистентни по отношение на актина варианти имат приблизително същата способност да хидролизират ДНК, като тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, но такава активност е помалко чувствителна на инхибиране посредством актин. Друг клас от варианти свързва актин с подобен афинитет на този, установен при природната човешка дезоксирибонуклеаза I, но има на малена муколитична активност и намалена хидролитична активност към ДНК, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.

Тези резултати показват, че терапевтичната ефикасност на човешка дезоксирибонуклеаза I при редуциране на вискоеластичността на белодробните секрети се дължи по-скоро на нейната каталитична хидролизна активност за ДНК, отколкото на нейната способност да деполимеризира нишковиден актин. В съответствие с това, варианти на човешка дезоксирибонуклеза I, които свързват актин с по-нисък афинитет, в сравнение с човешка дезоксирибонуклеаза I, но пък притежават активност да хидролизират ДНК, биха били успешно прилагани като терапевтични средства, по-специално при лечението на пациенти, имащи белодробни секрети с относително големи количества актин. Поради това, че такива варианти имат намалена активност за актин, тяхната активност да хидролизират ДНК е по-малко инхибирана при наличие на актин, така че тези варианти имат по-голяма муколитична активност в присъствието на актин, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.

Цел на представяното изобретение е да предложат варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, които да притежават активност да хидролизират ДНК, но и да свързват актин с по-нисък афинитет в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.

Друга цел на изобретението е да предостави нуклеинови киселини, които да кодират такива резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, рекомбинантни вектори, включващи такива нуклеинови киселини, рекомбинантни клетки гостоприемници, трансформирани с тези нуклеинови киселини или вектори, и технологични методи за получаване на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I посредством рекомбинантната ДНК технология.

Изобретението се отнася също и до приложение на такива резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I в in vitro диагностични анализи на вискозен материал, както и за производство на медикамент за редуциране на вискоеластичността на ДНК съдържащи биологични материали. Последните са характерни за заболявания като кистозни фибрози, хронични бронхити, пневмония, бронхиектазии, емфизема, бронхиална астма или системен лупус еритематозус.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 показва аминокиселинната последователност на човешка зряла дезоксирибонуклеаза I (секвенция 1). Номерата показват секвен ционната позиция на аминокиселинните остатъци в тяхната последователност.

Фигурите от 2 до 6 предлагат данни за следните варианти:

А114С (SEQID. No. 68) А114Е (SEQ ID. No. 69) A114G (SEQ ID. No. 70) A114H (SEQ ID. No. 71) A114K (SEQ ID. No. 72) A114L (SEQ ID. No. 73) A114M (SEQ ID. No. 74) A114Q (SEQ ID. No. 75) A114R (SEQ ID. No. 76) A114W(SEQ ID. No. 77) A114Y (SEQID. No. 78) D53A (SEQ ID. No. 11) D53C (SEQ ID. No. 43) D53AK(SEQ ID. No. 12)

D53R (SEQ ID No. 13) D53Y (SEQ ID No. 14) D58T (SEQ ID No. 80) E13A(SEQ ID No. 2) E13H (SEQ ID No. 3) E13R (SEQ ID No. 4) E13w(SEQ ID No. 5) E13A(SEQID No. 6) E69A (SEQ ID No. 65) E69C (SEQ ID No.66) E69K (SEQ ID No. 21) E69M (SEQ ID No. 67) E69R (SEQ ID No. 22) E49M (SEQ ID No. 35)

D53I...	( SEQ	ID. Ho:	44)	(3491	( SEQ	ID .. No :	36 )
1)5314	( SEQ	1 ID.. Nos	45)	(349K	( SEQ	ID., No:	37 )
(349I4	( SEQ	ID.. Nos	38)	V67A	(SEQ	ID. No:	18)
G49Y	( SEQ	ID. Mo:	39)	V67C	(SEQ	ID. No:	55)
H44A	( SEQ	ID. Nos	7 )	V67D	(SEQ	ID. No:	56)
II44C	( SEQ	ID. No:	28 )	V67E	( SEQ	II). Nos	19)
H44D	( SI- Q	ID. No:	8)	V67H	( SEQ	II).. No:	57)
H44E	(SEQ	ID. No:	86)	V67K	( SEQ	11) ,. No s	20)
H44N	( SEQ	ID. Nos	79)	V67I1	( SEQ	ID. No:	58)
H44Q	( SEQ	ID. Nos	29)	V67P	( SEQ	ID. Nos	59)
H44W	( SEQ	II)„ No:	:l. й)	V67I4'	(SEQ	ID. Nos	60)
H44Y	( SEQ	ID. Nos	9 )	V67S	( SEQ	ID. No:	61 )
1.45(3	( SEQ	ID. No:	30 )	Y65A	( SEQ	ID. Nos	15)
1...4 5 K	( SEQ	II) » No:	31 )	Y65C	(SEQ	II). Nos	51 )
1..4(514-	( SEQ	ID. No:	32)	Y65E	( SEQ	ID. No::	87 )
1..52C	( SEQ	ID. Nos	40)	Y65K	( SEQ	ID. No:	52)

L52K	( SEQ	ID. No:	41 I	Y 6 51’1 (SEQ	ID.	No s	53)
1..5214	(SEQ	II). No:	42)	Y6 5E' (SEQ	ID.	No ;	97 )
I..52N	( SEQ	II). Nos	90 )	Y65R (SEQ	ID .	No ::	.1.6)
I...52R	(SEQ	II). No::	91)	Y65S (SEQ	ID.	No s	54)
N560	( SEQ	ID. No:	46 )	Y65W (SEQ	ID.	No 5	17)
N560	( SEQ	II). Nos	92)	D65R s E.69R	( SEQ	ID.	No s	25)
Ν56Γ-	( SEQ	ID. Nos	47)	D53R;H44A	(SEQ	II).	No :	23)
N56F	( SEQ	II).. Nos	93)	D53R:Y44A	( SEQ	ID.	No s	24)
N56K	( SEQ	II). Nos	94 )	H64RsV66T	( SEQ	ID.	No s	81)
N56K	(SEQ	11) « No::	48)	S68W: Ι'7(.·11	( SEQ	II).	No::	98)
N56R	( SEQ	ID. Nos	49)	S94N:Y69T	( SEQ	ID.	No:	85)
N56R	( SEQ	ID. Nos	95)	V67N s E69T	( SEQ	ID..	No::	84 )
N56W	( SEQ	1D . No s	50)	Y65NsV67I	( SEQ	ID.	No :	82)
N56W	( SEQ	ID. No::	96)	D53R s Y65A:: E6 5K'	( SEQ	ID.	No::
S68K	( SEQ	ID. Ilo:	62)
S 561’1	( SEQ	ID. Nos	63)	H44As»53RsY65A	(SEQ	ID.	No и
S68R	( SEQ	ID. No?	64)
V48C	( SEQ	ID. No;	33)	H44A;Y65AsE69R	( SEQ	II).	No :
V48K	( SEQ	ID. No:	34)
V48R	(SEQ	II). Nos	89 )
V66N	(SEQ	ID. Nos	83)

Фигурите 2а до г показват относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти. Чертите за грешка показват стандартното отклонение. Относителната специфична активност на Pulmozyme човешка дезоксирибонуклеаза I (GENETECH, Inc., South San Francisko, California, USA) е определена на 1.0. Относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I е по-голяма от тази на Pulmozyme, което се дължи на наличието на дезамидирани форми на човешка дезоксирибонуклеаза I, което е намалило хидролитичната активност по отношение на ДНК (Frenz, et al., РСТ Patent Publication No. WO93/25670, published Desember23,1993).

Фигура 3 показва ДНК-хидролитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти с единични остатъци на човешка дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин, определени с хиперхроматичен анализ. “Процентна активност” е процентът ДНК-хидролитичната активност на природна дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изчислен, както е описан в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на дезоксирибонуклеазата I при отсъствието на актин е определен на 100% активност. Чертите за грешка показват стандартното отклонение.

Фигура 4 показва ДНК-хидролитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти с множество от остатъци на човешка дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин, определени е хиперхроматичен или е метилово зелено анализ. “Процентна активност” е процентът ДНК-хидролитичната активност на природна дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изчислен, както е описан в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на дезоксирибонуклеазата I при отсъствието на актин е определен на 100% активност. Чертите за грешка показват стандартното отклонение.

Фигурите 5а до г показват относителната свързваща активност на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I за актин, както е определена в описания в пример 3 ELISA метод на свързан актин. Стойността ЕС50 е концентрацията на дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), която се изисква, за да даде половината от максималния сигнал в анализа. Чертите за грешка показват стандартното отклонение. Стойностите на ЕС50 за Pulmozyme и природна човешка дезоксирибонуклеаза I са 67 ± 23 рМ (п = 31)и87 ± 14 пМ (п = 32), съответно. Относителната свързваща активност, показана на фигурата, е стойността на ЕС50, определена за вариант на човешка дезоксирибонуклеаза 1, разделена на стойността на ЕС50, определена за природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Варианти, където стойността на ЕС50 е по-голяма от тази, която може да бъде измерена при анализа, са индикирани като имащи пропорция (ЕС50 (вариант на дезоксирибонуклеаза 1)/ЕС50 (природна дезоксирибонуклеаза I)), по-голяма от известената стойност, (например, >10, >100, >300, >2000, >20000, >35000).

Фигура 6 показва муколитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I в проби от храчки на пациенти с кистозна фиброза, определени с компактен анализ. Чертите за грешка показват средната стандартна грешка.

Фигура 7 показва схематично представяне на актин свързващия ELISA метод, описан в пример 3.

Техническа същност на изобретението

I. Определения

Както се използват в предлаганата патентна заявка, термините “човешка дезоксирибонуклеаза I”, “природна човешка дезоксирибонуклеаза I” и “див тип дезоксирибонуклеаза I” се отнасят за полипептида, имащ аминокиселинната последователност на зряла човешка дезоксирибонуклеаза I, както е изложена на фигура I.

“Вариант” или “вариант на аминокиселинна последователност” на човешка дезоксирибонуклеаза I е полипептид, съдържащ аминокиселинна секвенция, която е различна от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Общо взето, един вариант ще притежава поне 80% идентичност на секвенцията (хомоложност), за предпочитане поне 90% идентичност на секвенцията, още по-добре поне 95% хомоложност и най-добре поне 98% идентичност на секвенцията е тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза 1. Процентът на идентичност на секвенцията е определен, например от Fitch, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1382-1386 (1983), а версия на алгоритъма е определена от Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), след подреждане на последователността, за да се получи максималната хомоложност.

Термините “вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, резистентна на актин”, “вариант на резистентна на актин” и “вариант на резистентна на актин на човешка дезоксирибонуклеаза I” се отнася за вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, която има (1) хидролитична активност за ДНК и (2) редуцирана свързваща активност за актин. “Хидролитична активност за ДНК” се отнася за ензимната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I в хидролизиращ (разграждащ субстрат на ДНК, за да даде 5'-фосфорилирани олигонуклеотидни крайни продукти. “Хидролитична активност за ДНК” е определена е помощта на някои известни методи, включително електрофореза с аналитичен полиакриламид и агарозен гел, хиперхроматичен анализ (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377 (1950) или анализ c метилово зелено (Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222: 351-358(1994)).

Терминът “свързваща активност” на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или на вариант на резистентна на актин човешка дезоксирибонуклеаза I за актин се отнася за способността на дезоксирибонуклеаза I за нековалентно свързване с актин. Свързващата активност може да бъде определена посредством някои от известните методи, например, както е описан от Mannherz, etal., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Алтернативно, относителните свързващи активности на различни дезоксирибонуклеази (напр. природна човешка дезоксирибонуклеаза I и нейните вари анти) са определени чрез измерване на свързването на дезоксирибонуклеазите с имобилизиран актин с метода на ELISA (описан в пример 3) или чрез сравняването на хидролитичната активност за ДНК на дезоксирибонуклеазите в присъствието или без присъствието на актин (описан в пример 3). Методите, които са описани в дадените примери, са особено подходящи за скрининг на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I за бързото идентифициране на тези варианти, които имат редуцирана способност за свързване по отношение на актин.

Вариант на резистентна на актин човешка дезоксирибонуклеаза I, имащ “редуцирана свързваща способност за актин”, е един вариант, който има свързваща способност за актин, която е относително по-малка от афинитета, с който природната човешка дезоксирибонуклеаза I свързва протеина актин, определяни при съпоставими условия. Ако се прилага методът ELISA със свързващ актин, както е описан в пример 3, за да бъде определен свързващият афинитет на човешка дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант) за актин, тогава резистентният за актин вариант, имащ “редуцирана свързваща способност за актин”, ще бъде вариант, имащ стойност на ЕС50, която е по-голяма, в сравнение с тази на природна човешка дезоксирибонуклеаза I. В този анализ вариант с резистентност за актин типично ще има стойност на ЕС 50 от 5 до 100 пъти по-голяма от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I; но варианти, резистентни за актин, имащи стойности на ЕС 50 над 500 пъти от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, също са предлагани в готова форма, специално чрез редуване на множество аминокиселинни остатъци на аминокиселинната секвенция на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, също са предлагани в готова форма, специално чрез редуване на множество аминокиселинни остатъци на аминокиселинната секвенция на природната човешка дезоксирибонуклеаза I (виж фигури 5А и5Г).

Терминът “муколитична активност” се отнася за намаляване на вискоеластичността (вискозитета) на храчки или друг биологичен материал, например при наблюдаване на опит с третиране на материал с природна човешка дезоксирибонуклеаза I или вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Муколитичната активност е оп ределена с помощта на различни известни методи, включително анализ за компактност на храчки (РСТ Patent Publication No. WO 1994/010567, published May 11,1994), методи, използващи торсионно махало (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22: 41-53 (1991), или други реологични методологии.

Терминът “полимеразна верижна реакция” или “ПВР” най-общо се отнася за метод за амплифициране на желана нуклеотидна секвенция in vitro, както е описан, например в USA Pat. No. 4 683 193. Методът на ПВР включва повтарящи се цикли от първично екстензионно синтезиране, с използването на олигонуклеотидни праймъри, способни да хибридизират преференциално към матрична нуклеинова киселина.

Термините “клетка”, “клетка гостоприемния”, “клетъчна линия” и “клетъчна култура” се използват тук взаимозаменяемо и всички такива термини са за потомство, получено от растежа на клетки. “Трансформация” и “трансфекция” се използват взаимозаменяемо и се отнасят за процеса на въвеждане на ДНК в клетката.

“Оперативно свързване” се отнася за ковалентно свързване на две или повече секвенции на ДНК с помощта на ензимно лигиране или в конфигурация по отношение един на друг, така че нормалната функция на последователността да може да бъде осъществявана. Например, ДНК за предсеквенция или секреторен водач е оперативна свързан за ДНК за полипептид, ако е експресиран като предпротеин, който преципитира в секрет на полипептида; един промотор или усилвател е оперативно свързан за кодиращата последователност, ако той повлиява на транскрипцията на последователността; или рибозомен свързан участък е оперативно свързан към кодираща последователност, ако е позициониран така, че да съдейства на транслацията. Най-общо, “оперативно свързване” означава, че секвенциите на ДНК са свързани долепено, в случая на секреторен водач, долепено и във фаза на прочитане. Свързване се извършва чрез лигиране на подходящи рестрикционни участъци. Ако такива участъци не съществуват, тогава се използват синтетични олигонуклеотидни адаптори или линкери за свързване със стандартни методи за рекомбинация на ДНК.

Аминокиселините са обозначени със съкращения от три или от една буква, както следва:

ALANINE	Ala	A	- Аланин (Ала)
ARGININE	Arg	R	- Аргинин (Apr)
ASPARAGINE	Asn	N	- Аспарагин (Асн)
ASPARATIC ACID	Asp	D	- Аспарагинова к-на
CISTEINE	Cys	C	- Цистеин (Цис.)
GLUTAMIC ACID	Glu	E	~ Глутаминова к-на
bLU 1 AMINE	Gin	Q	- Гднтамин (Глн)
GLYCINE	Gly	6	- Глицин (гли)

HISTIDINE

His H - Хистидин (Xue)

ISOLEUCINE I leu

LEUCINE Leu

LYSINE Lys

METHIONINE Met

PHENYLALANINE Phe

PROLINE Pro

SERINE Ser

THREONINE Thr

TRYPTOPHAN Trp

TYROSINE Tyr

VALINE Val

I - Изолебцин (Иле)

L - Левцин (Лев)

K - Лизин (Лиз)

М - Метионин (Мет)

F - Фенилаланин (Фал)

Р - Пролин (Про)

S - Серин (Сер)

Т - Треонин (Тре)

Т - ТриптоФан (Три)

Т - Тирозин (Тир)

V - Валин (Вал)

II. Подбор на варианти резистентни на актин

Представяното изобретение е базирано на изучаване на структура, свойства за свързване на актин, хидролитична активност за ДНК и муколитична активност на аминокиселинни последователности на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Вариантите, резистентни на актин, от предлаганото изобретение имат хидроли45 тична активност за ДНК, но свързват актин с помалка активност, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Редакцията на свързването на актин е постигната чрез приготвяне на мутации на и/или тези аминокиселинни остатъци с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, за да се повлияе на свързването на актин, включително, например, за остатъци на Glul3, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56,

Asp58, His64, Tyr65, Val66, Val67, Ser68, Glu69, Pro70, Ser94, Tyr96 и Alai 14 на природна човешка дезоксирибонуклеаза I (номерът, който следва обозначението от три букви, показва специфичната позиция на аминокиселинния остатък в секвенцията на фигура 1.

Има множество от начини за направа на резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. В едно от изпълненията на изобретението резистентен на актин вариант е приготвен посредством въвеждане или на едно или много аминокиселинни заместители, инсерции и/или делеции вътре или в съседство (с около пет аминокиселинни остатъка от) до тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, което влияе на свързването на актина. Някои подходящи примери за това са следните: D53R, D53K, D53Y, D53Y, Y65 A, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65 A, D53R:E69R, H44A:D53R: Y65A, H44A:Y65A:E69R (виж фигури 2-6).

В друго изпълнение на изобретението, резистентен на актин вариант е получен чрез въвеждане на мутация(и), което създава нов гликозилационен участък вътре или в съседство (с около пет аминокиселинни остатъка от) до тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, което влияе на свързването на актина. Например, насочена към участък мутагенеза е използвана да се въведе една от трипептидните секвенции, аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин (където X е всяка една аминокиселина, с изключение на пролин), които са познати последователности за ензимно прикрепване на въглехидратната част към страничната верига на аспарагин, Creighton, Proteins, рр. 76-78 (W. Н. Freeman, 1984). Пространствена пречка, която се явява между въглехидратната част на получения N-гликозилатен вариант на дезоксирибонуклеаза I и актин, може да редуцира или предотврати свързването на актин и в резултат на това получено инхибиране на хидролитичната активност на ДНК на дезоксирибонуклеаза I, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Някои подходящи примери за това са следните: H44N, D58S, D58T, V66N, H44N:T46S, H64N: V66S, H64N:V66T, Y65N:V67S, Y65N:V67T, V66N.S68T, V67N:E69S, S68N:P70S, S68N:P70T, S94N:Y96S, S94N:Y96T.

Факултативно, при свързване c такива мутации, за да се създаде нов гликозилатен участък, естествено срещащият се гликозилатен участък на позиции 18 и/или 106 в аминокиселинна после дователност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I може да бъде изтрита, в зависимост от степента на желаната гликозилация във варианта на резистентност на актин.

В друг вариант на това изобретение насочен към участък мутагенеза е използвана, за да се въведат остатъци вътре или в съседство до (с около пет аминокиселинни остатъка от) тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, които са включени в свързване на актин, като подходящи за следтранслационна модификация или биологична или химична такава (виж по-долу). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Metods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W.H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Такива посттранслационни модификации могат да създадат пространствена пречка или да променят електростатичните свойства в дезоксирибонуклезза I, което ще редуцира или предотврати свързване на актин и последваща инхибиция на хидролитичната активност на ДНК, в сравнение с природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Например, цистеинов остатък може да бъде въведен вътре или в съседство с остатък на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, който е включен в свързването на актин. Свободният тиол на цистеиновия остатък може да формира интермолекуларна дисулфидна връзка с друг такъв вариант на дезоксирибонуклеаза I, за да формира димер на дезоксирибонуклеаза I или може да бъде видоизменен, например със специфичен тиолов алкилиращ агент. Някои подходящи примери за такива мутации са следните: 444С, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, Е69С, А11С.

За удобство замествания, инсерции и/или делеции в аминокиселинните секвенции на природната човешка дезоксирибонуклеаза I обикновено са правени посредством въвеждане на мутации в кореспондиращата нуклеотидна секвенция на кодиращата ДНК природна човешка дезоксирибонуклеаза I, например чрез насочена към участък мутагенеза. Експресията на мутираната ДНК впоследствие води до резултат, изразяващ се в производството на варианта на човешката дезоксирибонуклеаза I , имаща желаната (неприродна) аминокиселинна секвенция. Докато всяка известна техника може да бъде прилагана, за да се извърши насочена към участък мута генеза, например, както това е описано в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, U.S.A. (1989)), насочена към олигонуклеотид мутагенеза е предпочитаният метод за получаване на вариантите на човешка дезоксирибонуклеаза I от това изобретение. Този метод, който е добре известен в науката (Zoller, et al., Meth. Enz. 100: 4668-5000 (1983); Zoller, et al., Meth. Enz. 154: 329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154: 382-403 (1987); Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185: 599-611 (1990), е особено подходящ за направата на заместени варианти, въпреки че той може също да бъде използван за конвенционално получени делеционни и инсерционни варианти.

Технологията, която се използва, е при насочен към участък мутагенезен фагвектор, който съществува както при едноверижна или двуверижна форма. Типичните вектори, които се използват при насочена към участък мутагенеза, включват вектори като фаг Μ13 и плазмидни вектори, които съдържат едноверижен фагов източник на репликация (Messing, et., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1978); Veiraet al., Meth. Enzymol. 153:311 (1987); Short, et al., Nuc. Acids. Res. 16: 75837600 (1988)). Репликация на тези вектори в подходящи клетки гостоприемници води до синтезата на едноверижна ДНК, която може да бъде използвана за насочена към участък мутагенеза. Накратко при изпълнението на насочена към участък мутагенеза на кодираща ДНК природна човешка дезоксирибонуклеаза I (или неин вариант), ДНК е изменена посредством първа хибридизация на олигонуклеотид, кодиращ желаната мутация на единична верига на ДНК. След хибридизация ДНК полимераза е използвана, за да се синтезира цяла втората верига, използвайки хибриден олигонуклеотид като праймер и прилагайки единичната верига на ДНК като матрица. Така олигонуклеотидът, който кодира желаната мутация, е вграден в получената двуверижна ДНК.

Олигонуклеотидите, които се използват като хибридизационни сонди или праймери, могат да бъдат приготвени посредством всеки един от подходящите за тази цел методи, например пречистване на срещаща се естествено ДНК или с помощта на синтеза in vitro. Например, олигонуклеотиди са готово синтезирани при използване на лични технологии в органичната химия, като описаните от Narang, et al., Meth. Enzymol. 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109

151 (1979); Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154: 287-313(1985). Общият подход за синтезирането на подходяща хибридизационна сонда или праймер е добре известен. Keller, et al., DNK Probes, pp. 11-18 (Stockton Press, 1989). Обичайно, хибридизационната сонда или праймер ще съдържа 1-25 или повече нуклеотида, и ще включва поне 5 нуклеотида на всяка страна на секвенцията, която кодира желаната мутация, така че да се осигури възможността олигонуклеотидът да хибридизира преференциално на желаното място на едноверижната матрична молекула на ДНК.

Разбира се, насочена към участък мутагенеза може да бъде прилагана за многократно въвеждане на мутации от заместване, инсерция или делеция в стартиращата ДНК. Ако участъците, които ще бъдат мутирани, са локализирани близо един до друг, мутациите могат да бъдат въведени едновременно при използване на единствен олигонуклеотид, който кодира всички желани мутации. Ако обаче участъците, които ще бъдат мутирани, са локализирани далеч един до друг (разделени чрез поне около десет нуклеотида), много по-трудно е да се генерира единствен олигонуклеотид, който да кодира всички от желаните промени. Вместо това, могат да бъдат използвани един или два алтернативни метода.

В първия метод отделен олигонуклеотид е произведен за всяка желана мутация. Олигонуклеотидите са след това ренатурирани едновременно към едноверижната матрична ДНК и втората верига на ДНК, която е синтезирана от матрицата, ще кодира всички желани аминокиселинни замествания.

Алтернативният метод включва два или повече етапа на мутагенеза до производството на желания вариант. Първият етап е като описания за въвеждане на единична мутация. Вторият етап използва мутираната ДНК, която е получена през първия етап на мутагенезата като матрицата. Така, матрицата вече съдържа една или повече мутации. Олигонуклеотидът, който кодира желаното аминокиселинно заместване (замествания), след това е ренатуриран на тази матрица и получената верига на ДНК сега кодира мутации от първия и втория етап на мутагенезата. Тази получена ДНК може да бъде използвана като матрица в трети етап на мутагенеза и така нататък.

Мутагенеза с полимеразна верижна реакция (Higushi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Valette, et al., Nuc. Acids. Res. 17:723-733 (1989)) е също подходяща за напра вата на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Накратко, когато малки количества от матрична ДНК се използват като стартиращ материал в полимеразна верижна реакция, праймери, които се различават слабо по секвенции на кореспондиращ регион в матрична ДНК, могат да бъдат използвани за получаване на относително големи количества на специфичен ДНК фрагмент, който се различава от матричната секвенция само на позициите, където примерите се различават от матрицата. За въвеждане на мутация в плазмидна ДНК, например секвенцията на един от праймерите включва желаната мутация и е проектирана да хибридизира на една верига на плазмидната ДНК на позицията на мутацията; последователността на другия праймер трябва да бъде идентична с нуклеотидна секвенция с противоположна верига на противоположната верига на плазмидната ДНК, но тази секвенция може да бъде локализирана където и да е по продължение на плазмидната ДНК. За предпочитане е секвенцията на втория праймер да е локализирана в 200 нуклеотида от тези на първия, така че в края на изцяло амплифицирания регион на ДНК, свързан посредством праймерите, може лесно да бъде направена секвенция. Амплификация с полимеразна верижна реакция с използването на праймерен чифт наподобява един вече описан резултат в популация на фрагменти на ДНК, които се различават на позицията на мутацията, определена посредством такъв праймер, и възможно и на други позиции, като матрица, копираща малко грешно положение. Wagner, et al., in PCR Topics, pp. 69-71 (Springer - Verlag, 1991).

Ако съотношението на матрицата към произведената амплифицирана ДНК е извънредно ниско, болшинството от получените фрагменти на ДНК инкорпорират желаната (желаните) мутация(и). Тази произведена ДНК се използва, за да смени кореспондиращия регион в плазмида, който служи като матрица за полимеразна верижна реакция, използвайки методи за рекомбиниране на ДНК. Мутации на отделни позиции могат да бъдат въведени едновременно посредством или мутантен вторичен праймер, или осъществявайки вторична полимеразна верижна реакция с различни мутантни праймери и лигирайки два от получените фрагменти от ПВР едновременно към плазмидния фрагмент на три (или повече) отделни лигатури.

Друг способ за получаване на варианти, касетна мутагенеза, е основан на технологията, описана от Well et al., Gene, 34:315-323 (1985). Началният материал е плазмид (или драг вектор), който включва секвенцията на ДНК, която трябва да бъде мутирана. Кодът (кодовете) в стартиращата ДНК, която трябва да бъде мутирана, са идентични. Трябва да има рестрикционен ендонуклеазен участък на установен мутационен участък (участъци). Ако няма такива рестрикционни участъци, те трябва да бъдат създадени с помощта на по-горе описания метод за олигонуклеотид-медиирана мутагенеза, за да бъдат въведени на подходящата локализация в ДНК. Плазмидната ДНК е срязана линеарно на тези участъци. Двуверижен олигонуклеотид, кодира секвенцията на ДНК между рестрикционните участъци, но съдържащия желаната мутация(и) е синтезиран с помощта на стандартни процедури, при които двете вериги на олигонуклеотида са синтезирани разделено и след това хибридизирани заедно, като се прилагат стандартни технологии. Този двойноверижен олигонуклеотид се третира като касета. Тази касета е проектирана да има 5’ и 3’ краища, които са съвместими с краищата на линейния плазмид, така че да може директно да бъде лигиран към плазмида. Полученият плазмид съдържа мутирана секвенция на ДНК.

Наличието на мутация(и) в ДНК е определено посредством добре познати методи в науката, включително рестрикционно генетично картиране и/или получаване на последователност на ДНК. Предпочитан метод за получаване на последователност на ДНК е този на дидезокси верижна терминация на Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72:3918-3921(1979).

ДНК, която кодира вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I е инсертирана в реплициран вектор за по-нататъшно клониране или експресия. “Векторите” са плазмиди или друг вид ДНК, които са способни да реплицират в клетка хазяин и по този начин се използват за извършване на свързване с подходящи клетки гостоприемници (система на вектор-хазяин). Една от функциите е да улеснява клонирането на нуклеиновата киселина, която кодира вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, например да произвежда използваеми количества от нуклеиновата киселина. Другата функция е да насочва експресията на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Една или и двете функции се изпълняват в отделна клетка хазяин, използвана за клониране или експресия. Векторите ще съдържат различни компоненти в зависимост от функцията, която трябва да изпълняват.

За да се реализира производството на вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, експресионеи вектор ще съдържа варианта на кодиращата ДНК, както е описана по-горе, оперативно свързана с промотор и участък, свързване на рибозома. След това вариантът е експресиран директно в рекомбинантна клетъчна култура или съединяване с хетероложен полипептид, за предпочитане сигнална последователност или друг полипептид, имащ специфичен разграждащ участък на свързване между хетероложния полипептид и варианта на природната човешка дезоксирибонуклеаза I.

Прокариоти (например Е. coli и друга бактерия) са предпочитани клетки гостоприемници за началните стъпки на клониране съгласно изобретението. Те са особено полезни за бързо произвеждане на големи количества ДНК, за получаване на едноверижни матрици на ДНК, използвани за насочена към участък мутагенеза и за секвениране на ДНК на произведения вариант. Прокариотни клетки гостоприемници също могат да бъдат използвани за експресия на вариант на кодиран от ДНК вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Полипептидите, които се получават в прокариотни клетки гостоприемници, типично не са гликолизирани.

В допълнение, вариантите на човешката дезоксирибонуклеаза I от представяното изобретение могат да бъдат експресирани в еукариотни клетки гостоприемници, включително еукариотни микроби (например дрожди) или клетки, които са произлезли от животно или друг многоклетъчен организъм (например клетки от яйчник на китайски хамстер и други клетки от бозайник) или в живи животни (например крави, кози, овце и ДР·)·

Методологиите за клониране и експресия са добре известни в науката. Примери за прокариотни и еукариотни клетки гостоприемници и експресионни вектори, подходящи за получаване на вариантите на човешката дезоксирибонуклеаза I от представяното изобретение, например могат да служат и тези, които предлага Shak, PST Patent Publication No. WO 90/07572 (published July 12,1990).

Ако прокариотни клетки или клетки, които съдържат субстанциални компоненти на клетъчната стена, са използвани в качеството им на клетки гостоприемници, предпочитаните методи за трансфекция на клетките с ДНК са методът с тре тиране с калций, описан от Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110-2114 (1972) или методът c третиране c полиетилен гликол, описан от Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16:3580-3581 (1988). Ако като клетки гостоприемници се използват дрожди, трансфекция обикновено се извършва с използването на полиетилен гликол, както предлага Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 1929-1933 (1978). Ако като клетки гостоприемници се използват клетки от бозайници, трансфекция обикновено се извършва чрез използването на метод за преципитация с калциев фосфат, както предлага Graham, et al., Virology 52: 546 (1978). Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2: 3-10 (1990). Обаче, и други известни методи за въвеждане на ДНК в прокариотни и еукариотни клетки са подходящи за употреба в това изобретение, например, ядрено инжектиране, електропорация или протоплазмено сливане.

Особено приложими в предлаганото изобретение са експресионни вектори, които осигуряват преходна експресия на варианти на ДНК кодираща човешка дезоксирибонуклеаза I в клетки от бозайник. Изобщо, една преходна експресия включва използването на експресионеи вектор, който може да осигури ефикасна репликация в клетка хазяин, така че клетката хазяин да акумулира много копия от експресионния вектор и последователно синтезира високи нива на желан полипептид, кодиран посредством експресионен вектор. Преходна експресионна система, включваща подходящ експресионеи вектор и клетка гостоприемник позволява подходяща позитивна идентификация на полипепдити, кодирани с помощта на клонални дезоксирибонуклеинови киселини, а също така и бърз Wong, et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360 - 4364 (1985); Yang, et al., al., Cell 47: 3 - 10 (1986). По такъв начин, преходните експресионни системи са много подходящи за приложение за експресиране на ДНК кодираните аминокиселинни секвенции на вариантите на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, във връзка с анализи за идентифициране на тези варианти, които свързват актин с ниска активност в сравнение с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, а също така и за анализи за измерване на тези варианти с активност за хидролизиране на ДНКВариант на човешка дезоксирибонуклеаза 1 е секретиран за предпочитане от клетката гостоприемник, в която е експресиран, в този случай този вариант е възстановен от културална среда, в която са култивирани клетките хазяи. В този случай, може да прораснат клетки в културална среда без серум, тъй като отсъствието на серумни протеини и други серумни компоненти в средата може да улеснява пречистването на варианта. Ако последният не е секретиран, тогава вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I е възстановен от лизати на клетките гостоприемници. Когато вариантът е експресиран в клетка хазяин от бозайник, но не от човек, вариантът ще бъде напълно освободен от белтъци от човешки произход. Във всеки случай, ще бъде необходимо да се пречисти вариантът от рекомбинантни клетъчни белтъци с цел да се добият в субстанционно хомогенизирани приготовления на човешка дезоксирибонуклеаза I. За терапевтични нужди пречистеният вариант с предпочитание ще бъде над 99% чистота (например, всички други белтъци ще съдържат по-малко от 1% от общия протеин в пречистената композиция).

Общо взето, пречистването на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I е осъществено посредством използване на предимството на различни физикохимични качества на варианта, в сравнение с контаминантите, с които той може да бъде асоцииран. Например, като първи етап, културалната среда или лизат на клетката гостоприемник е центрофугирана, за да се отделят клетъчните отломки. Вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I след това е пречистен до контаминантни разтворими протеини и полипептиди, например, чрез преципитация с амониев сулфат или етанол, гелна филтрация (молекулярна ексклузионна хроматография), йоннообменна хроматография, хидрофобна хроматография, имуноафинитетна хроматография (напр.използвайки колона, която съдържа антитела за античовешка дезоксирибонуклеаза I, свързана със Sepharose), катионна обменна хроматография (Frenz, et al., РСТ Patent Publication No WO 1993/025670, published December 23, 1993), ХПЛТ c обърната фаза и/или гелна електрохореза.

Разбира се, всеки експериментатор с опит ще прецени, че тези методи за пречистване, които са пригодни за природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, може да изискват някои видоизменения, за да се осъществи пречистване на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, давайки си сметка за структурните и други различия между природния протеин и този на варианта. Например, в някои клетки гостоприемници (особено бактериални клетки хазяи) вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I може да бъде експресирана първоначално в неразтворима, агрегатна форма (известни като “клетъчни включвания” или рефрактилни включвания”), в който случай ще бъде необходимо в процеса на пречистване вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I да бъде разтворен и ренатуриран. Методи за разтваряне и ренатуриране на рекомбинантни протеинови клетъчни включвания са познати, (виж например BuiLder, et al., USA Patent No 4 511 502).

В друго изпълнение на представяното изобретение, човешки варианти на дезоксирибонуклеаза 1 са получени посредством направа на ковалентни видоизменения директно в протеин на природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Такива модификации са направени, за да въздействуват активното свързване или друго свойство на белтъка (например стабилност, биологичен полуживот, имуногенност) и могат да бъдат реализирани вместо или с прибавяне към аминнокиселинното секвенционно заместване и делеционни мутации, описани по-горе.

Ковалентни видоизменения могат да бъдат въведени чрез реакция на таргетни аминокиселинни остатъци на природна или на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I с органичен деривационен агент, който е способен да реагира с избрани аминокиселинни странични вериги или остатъци с N- или С-терминал. Подходящи деривационни агенти и методи са добре известни в науката.

Например, цистеинилни остатъци най-често реагират с α-халоацетати (и кореспондиращи амини), такива като хлороцетна киселина, за да дадат карбоксиметилови или карбоксиамидметилови деривати. Цистеинилни остатъци също са произлезли чрез реакция с: бромтрифлуорацетон, а-бром-3-(5-имидазоил)пропионова киселина, хлорацетилов фосфат, N-алкилмалеимиди, 3нитро-2-пиридилов дисулфид, метил 2-пиридилов дисулфид, р-хлорживачен бензоат, 2-хлорживачен-4-нитрофенол или хлор-7-нитробензо-2-окса1,3-диазол.

Хистидиловите остатъци са получени посредством химическа реакция с диетилпирокарбонат при pH 5.5 - 7.0,поради обстоятелството, че този агент е относително специфичен за хистидиловата странична верига. Пара-бромфениловият бромид също е много полезен; реакцията с предпочитание се извършва в 0.1 М натриев какодилат при pH 6.0.

Лизинил и амино терминални остатъци влизат в реакция с янтарна киселина или други анхидриди на карбоксилни киселини. Получаването с тези агенти има ефект на обръщане на заряда на лизиниловите остатъци. Други подходящи реагенти за получаване на α-амино съдържащи остатъци включват например метилов пиколинимидат; пиридоксалов фосфат; пиридоксал; хлороборохидрид; тринитробензенсулфонова киселина; О-метилизоуреа; 2,4-пентандион и катализирана от трансаминаза реакция с глиоксилат.

Аргинилови остатъци са модифицирани с помощта на химическа реакция с един от няколко конвенционални реагенти, сред които фенилглиоксал , 2,3 бутандион, 1,2-циклохександион и нинхидрин. Получаването на аргининови остатъци изисква химическата реакция да бъде извършена в алкална среда, поради високата рК на гуанидиновата функционална група. Освен това, тези реагенти могат да реагират с групата на лизина също като групата на аргинин епсилон-амино.

Карбоксилни странични групи (аспартил или глутамил) са селективно видоизменени с помощта на химическа реакция с карбодимиди (R’N=C=N-R’), където R и R’ са различни алкилови групи, например такива като 1-циклохексил-3-( 2морфолинил-4-етил ) карбодимид или 1-етил-З(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодимид. Освен това, остатъци на аспартил и глутамил са превърнати в остатъци на аспарагинил и глутаминил посредством химическа реакция с амониеви йони.

Ковалентно чифтосване на гликозиди с аминокиселинни остатъци на протеина може да бъде използвано, за да се видоизмени или увеличи броят или профилът на карбохидратните заместители, особено на или в съседство с тези остатъци, които са включени в свързване на актина. В зависимост от използвания за чифтосване модел, захарта (захарите) може да бъде прикрепена към (а) аргинин и хистидин, (б) свободна карбоксилна група, (в) свободни сулфхидрилни групи като тези на цистенина, (г) свободни хидроксилни групи, такива като тези на серин, треонин или хидроксипролин, (д) ароматни остатъци, такива като тези на фенилаланин, тирозин или триптофан или (е) амидната група на глутамина. Подходящи методи са описани, например в РСТ Patent Publication No WO 1987/05330 (published September 11, 1987, 11, 1987), и от Aplin, et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259 - 306 (1981).

Ковалентно прикрепване на такива вещества като полиетиленов гликол (ПЕГ) или човешки серумен албумин към варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I може да доведе до редуциране имуногенноста и/или токсичноста на варианта и/или да удължи неговия полуживот, както е било наблюдавано при други белтъци. Abuchowski, et al., J. Biol Chem. 252: 3582-3586 (1977)); Poznansky, et al., FEBS Letters 239:19-22 (1988); Goodson, et al., Biotechnology 8: 343 - 346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209 - 213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Prese, 1992). В допълнение, видоизменение на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза I посредством тези вещества на или в съседство с (например с около пет амииокиселинни остатъци на) аминокиселинен остатък, който въздействува свързване на актин, може да доведе до вариант, който е резистентен на актина.

В допълнително изпълнение на представяното изобретение вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, може да включва мутация на остатък на аспарагин, който се среща на 74-та позиция на аминокиселинната секвенция на природна човешка дезоксирибонуклеаза I (например N74D, N74K или N74S мутация), за да редуцира или предотврати дезамидирането на вариантът на дезоксирибонуклеазата I. Frenz, et al., РСТ Patent Publocation No, WO 93/25670, published Desember 23, 1993.Като друг пример, вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, може да включва аминокиселинна последователност на мутация или друга ковалентна мутация, които редуцират чувствителността на варианта по отношение на разграждане от ензими протеази (например неутрофилна еластаза), които могат да бъдат открити в храчки или други биологични материали.

Хидролитичната активност за ДНК и активността за свързване на актин на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I получени, както това е описано по-горе, са лесни за детерминиране с помощта на анализи и методи, които са добре известни в науката и описани в тази патентна заявка. Всеки такъв вариант, имащ хидролитичната активност за ДНК и редуциращ активността за свързване на актин (както вече бе дефинирана по-горе) е един вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I в обсега на това изобретение.

Варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I от предлага ното изобретение, се използват, за да редуцират вискоеластичността на материал, който съдържа ДНК, такъв като храчки, слуз или други белодробни секреции. Такива варианти са особено полезни за лекуването на пациенти с белодробни заболявания, които имат патологичен вискозитет или сгъстени секреции и състояния като остра или хронична форма за бронхиални белодробни заболявания, включително инфекциозна пневмония, бронхити или трахеобронхити, бронхиектазии, кистозна фиброза, бронхиална астма, белодробна туберкулоза и причинени от гъбички инфекции. За терапевтични курсове се прилагат фино разделени сухи препарати на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, които се внедряват във дихателните пътища (напр. бронхите) или белите дробове на пациентите посредством конвенционални способи, например инхалация с аерозоли.

Природна човешка дезоксирибонуклеаза I и нейни варианти, които са резистентни на актина, също могат да бъдат полезни за лечението на системен лупус еритематозус (СЛЕ), застрашаващо живота автоимунно заболяване, което се характеризира с производство на антитела срещу с действие срещу самия организъм. ДНК е първостепенен антигенен компонент на имунния комплекс. В този пример, човешката дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант) може да бъде давана систематично, например посредством вътревенозно, подкожно, вътремускулно приложение на заболелия пациент.

Природна човешка дезоксирибонуклеаза 1 и варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I също могат да бъдат полезни за предпазването от ново развитие и/или обостряне на дихателни инфекциозни болести, които могат да се развият при пациенти с кистозна фиброза, хронични бронхити, бронхиална астма, пневмонии или други белодробни заболявания, или при пациенти, чието дишане е подпомагано от вентилираща система или други механични уреди, или при други пациенти с риск да развият респираторни инфекции, например след големи хирургически интервенции или травми.

Варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, могат да бъдат формулирани с помощта на известни методи за приготвяне на композиции с терапевтично предназначение. Предпочетена лекарствена форма е разтвор на вариант, който е резистентен на актина в буферен или небуферен воден разтвор, за предпочитане, в изотоничен солеви разтвор като 150 тМ натриев хлорид, съдържащ 1.0 тМ калциев хлорид при pH 7. Тези разтвори са особено приспособими за използване за пълнене на комерсиално-достъпни пулверизатори, включително струйни пулверизатори, ултразвукови пулверизатори, полезни за прилагане направо във въздушните пътища или белите дробове на засегнатите пациенти.

В друго изпълнение на изобретението терапевтичната композиция е под формата на сух прах на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, с предпочитание приготвен за спрей с помощта на разтвор на този вариант, по-специално както е описан в патентна заявка, USA 08/206,020 (filed March 4,1994).

В друго изпълнение на предлаганото изобретение, терапевтичният състав съдържа клетки, които активно произвеждат вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I. Такива клетки могат директно да бъдат въведени в тъканта на пациент или могат да бъдат капсуловани с порьозни мембрани, които се имплантират в пациента и във всички случаи осигуряват проникването на варианта, който е резистентен на актина в тялото на пациента в нарастващи концентрации на хидролитичната активност за ДНК. Например собствените клетки на пациента могат да бъдат трансформирани или in vivo, или ex vivo, с кодиращ ДНК вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I и след това се използват, за да произвеждат дезоксирибонуклеаза I направо в организма на пациента.

Терапевтично активното количество на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, ще зависи, например от количествата на ДНК и актина в материала, който ще бъде третиран, от терапевтичната тактика, от пътищата за вкарване в организма и от състоянието на пациента. В съответствие с това, ще бъде необходимо за терапевта да определя дозата и начина на въвеждане в организма, ако иска да получи оптимален терапевтичен ефект.От гледна точка на редуциране на активността за свързване на актин и като последица от това увеличена хидролитичната активност за ДНК в присъствието на актин, съвместим с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, количеството на вариант, който е резистентен на актина, за да се постигне терапевтичен ефект, може да бъде по-малко в сравнение с количеството природна човешка дезоксирибо нуклеаза I, необходимо за да се постигне същият ефект при същите условия. Изобщо, терапевтичната ефективна доза на варианта, който е резистентен на актина, ще бъде дозировка от 0.1 pg до около 5 mg от варианта за килограм тегло на пациента, въведени с фармакологични композиции, както вече бе описано по-горе.

Вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, оптимално е комбиниран за употреба съвместно с един или повече фармакологични препарата, които се използват за лечение на болестните състояния, описани вече по-горе, такива като антибиотици, бронходилататори, противовъзпалителни средства, муколитични препарати(например п-ацетил-цистеин), свързващи или разделящи актина протеини (например gelsolin; Matsubara et al., Cell 54: 139-140 (1988): Stossel, et al., PCT Patent Publication No WO 1994/022456 (published October 13,1994), инхибитори на протеаза или продукти за генна терапия (например, включване на генен регулатор на трансмембранната проводимост при кистозна фиброза (CFTR),Riordan, et al., Science 245: 1066-1073 (1989).

Следващите примери се предлагат за илюстриране на изобретението и не ограничават способите за изпълнение на изобретението и не ограничават изобретението.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1.

Мутагенеза на човешка дезоксирибонуклеаза I

CJ 236, щам на Е. coli (BioRad Laboratories, Richmond, California, USA) беше трансформиран c плазмид pRK. дезоксирибонуклеаза. 3 c помощта на метода на Chund et al., (Muc. Acids. Res. 16: 3680 (1988). Плазмидът pRK дезоксирибонуклеаза.З, който е използван за реализирането на представяното изобретение, е като описания в РСТ Patent Publication No. WO 9007572 (published July 12,1990), c изключение на това, че нуклеотидната последователност, която кодира човешка дезоксирибонуклеаза I, е като показаната на Фигура 1. Трансформираните клетки са посети на LB петрита с агар, съдържащи 50 pg carbenicillin и растящи в продължение на една нощ при температура 37°С, бульон 2YT, (5 ml), съдържащ 50 pg carbenicillin и 10ml VCSM13 φaгxeлπep(Stratagene, La Jolla, California,USA)6eme инокулиран на индивидуална колония на петри с агар и последва растеж в продължение на една нощ при температура 37°С с разклащане. Едноверижна ДНК беше изолирана от тази култура и използвана като матрица за последваща мутагенеза.

Насочена към участък мутагенеза беше осъществена с помощта на синтетични олигонуклеотиди, в съответствие с метода на Kunkel, et al. (Meth. Enzimol. 154:367 - 382 (.1987). Мутагенните олигонуклеотиди бяха 21-мери или 24-мери, имащи или точно 9, или 12 бази 5'съвместими към несъвпадащ код и точно 9 бази 3'съвместими към несъвпадащ кодон. Следваща мутагенеза, едноверижна ДНК от индивидуални клонове беше приложена на дидезокси секвениране (Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 748: 5463 - 5467 (1977)). Варианти на ДНК имащи нуклеотидни последователности, след това бяха трансформирани, както бе описано по-горе в щам XL1 Blue MRF’ (Stratagene) на Е. coli. След посявка и изолиране на единична колония, индивидуалните колонии бяха използвани, за да инокулират 0.5 1 LB бульон,съдържащ 50 pg/ml carbenicillin. Последва растеж в продължение на една нощ, при температура 37°С с разклащане. Клетките бяха отделени посредством центрофугиране и вариантът на ДНК (в експресионния вектор) беше пречистен с помощта на колони на Qiagen tip-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, California, USA).

Ha фигурите от 2 до 6 се идентифицират различните варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I,които бяха направени. Във фигурите и в спецификацията, описанието на аминокиселинната заместваща мутация(и), присъстващи във варианта на дезоксирибонуклеаза I съкратено, като се използва за обозначение първа буква, номер и втора буква. Първата буква е обозначение на аминокиселинния остатък в природна (див вид) човешка зряла дезоксирибонуклеаза I, номерът означава позицията на този остатък в природна човешка зряла дезоксирибонуклеаза I (номериране, както е показано на фигара 1) и втората буква е еднозначна абревиатура на аминокиселинния остатък на тази позиция във варианта на дезоксирибонуклеаза I. Например, във варианта на дезоксирибонуклеаза I, имаща мутация D53R, остатък на аспаргинова киселина (D) на 53 позиция в природна човешка зряла дезоксирибонуклеаза I е била изместена от аргининов (R) остатък. Многократни мутации в единичен вариант са обозначени по подобен начин, с двоеточие (:), разделящо всяка една от различните мутации, които са представени във варианта. Например, обозначе нието D53R:Y65A означава, че вариантът има мутация D53R и мутация Y65A.

Пример 2.

Експресия на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I

293 клетки от човешки ембрионален бъбрек (АТСС CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) бяха посети за растеж в серум, съдържащ среда в 150 mm пластмасови панички на Петри. Клетки в Log фаза бяха краткотрайно котрансфектирани с 22.5 g пречистен ДНК вариант (приготвен според описанието от по-горе) и 17pg ДНК от аденовирус с помощта на метода с преципитация с калциев фосфат (Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech.2:310(1990)). Приблизително 16 h след трансфекцията, клетките бяха промити с 15 ml на солеви буферен фосфат и средата беше сменена със среда без серум. Две реколти от клетъчни култури бяха взети от всяка паничка, първата или на 24-ия или на 72-ия h и последната на 96-ия h, последвано от смяна на серума без среда. Общо приблизително 50 ml от супернатант от клетъчна култура, съдържащ варианта на дезоксирибонуклеаза 1 бяха добити по този начин. Депо от супернатант, събран от всяко петри, беше концентриран от 5 до 50 пъти с помощта на концентратор Centripep 10 и концентратите са подложени на анализи, за да определят различни биохимични и биологични активности на вариантите на дезоксирибонуклеаза I.

Концентрат, съдържащ природна човешка дезоксирибонуклеаза I, е приготвен посредством същата процедура, като описаната по-горе, с изключение на това, че 293-те клетки бяха за кратко време трансфектирани с плазмид pRK. дезоксирибонуклеаза. 3.

Пример 3. Биохимични и биологични активности на варианти на дезоксирибонуклеаза I.

I. Относителна специфична активност

Относителната специфична активност на варианти на дезоксирибонуклеаза I бяха анализирани посредством сравняване на активността на варианта с тази на природна човешка дезоксирибонуклеаза I с два различни анализа. В частност, относителната специфична активност на вариантите е дефинирана, като концентрацията на варианта (вариантите), детерминирана с анализа за активност с метилово зелено (Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41 - 53 (1950), разделена на концентрацията на варианта (в pg/ml), детерминирана с анализа ELISA 1 дезоксирибонуклеаза I (описан по-долу). В двата анализа, анализа за активност с метилово зелено и анализа ELISA дезоксирибонуклеаза I, стандартните криви бяха определени с помощта на Pulmozyme човешка дезоксирибонуклеаза I. Относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и на варианти на дезоксирибонуклеаза I бяха показани на фигури 2а - г.

Анализът за активност с метилово зелено (Sinicropi, et al., Anal. Biochem.222:351 - 358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41 - 53 (1950), използва метилово зелено багрило, което вмъква приблизително всяка 10 база в ДНК, в резултат на което се получава зелен субстрат. Тъй като ДНК е разцепена от дезоксирибонуклеаза I, метилово зеленото багрило се освобождава и се окислява до безцветна форма. Така, загубата на зелен цвят е пропорционална на количеството на дезоксирибонуклеаза I, прибавено към анализираната проба. Количеството дезоксирибонуклеаза I, което е в наличност в анализа, след това се определя количествено, посредством сравняване със стандартна крива, която е приготвена с помощта на анализирани известни предварително количества от дезоксирибонуклеаза I.

Анализът ELISA дезоксирибонуклеаза I включва наслоени микротитърни панички с кози анти-дезоксирибонуклеаза I поликлонални антитела, прибавени към пробата, която ще се изследва, и намиране на всяка получена свързана дезоксирибонуклеаза I със заешко антидезоксирибонуклеаза I поликлонално антитяло, което е конюгирано към пероксидаза от хрян. Когато се прибавят субстрат на пероксидаза от хрян и цветно проявяващ се реагент, цветното проявяване е пропорционално на количеството дезоксирибонуклеаза I, присъствуващо в пробата. Количеството дезоксирибонуклеаза I, присъствуващо в пробата, след това се сравнява със стандартната крива, която е приготвена с помощта на анализирани известни предварително количества от дезоксирибонуклеаза I.

В двата описани анализа бяха изследвани многократно разрежданията на пробите и тези стойности, които попаднаха в средната област на стандартната крива, бяха осреднени и след това бяха изчислени средните стандартни отклонения.

Също така, беше използвана стандартна концентрация на дезоксирибонуклеаза I, както бе определена с анализа ELISA дезоксирибонуклеаза I, за стандартизиране на концентрации на дезоксирибонуклеаза I в други анализи, в които ва рианти на дезоксирибонуклеаза I бяха характеризирани (например в анализ за определяне на инхибиция чрез актин, описан по-долу) за хидролитичната активност за ДНК.

И. Инхибиция на актин от хидролитичната активност на дезоксирибонуклеаза I

Беше приготвен G-актин (Kabash, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992) посредством диализиране в продължение на една нощ на 1 mg/ml разтвор на актин (осигурени чрез закупуване от фирмата SIGMA, St.Louis, Missuri, USA) през 5 mM HEPES, pH 7.2,0.2 mM CaCl, 0.5 mM ATP (аденозинтрифосфат), 0.5 mM β-меркаптоетанол при 4°C. След центрофугиране при 13000 x g продължение на 5 min, количеството G-актин беше определено посредством измерване на поглъщането на светлината при дължина на вълната 290 nm; 1 ml разтвор има поглъщане от 0.66 CD. Количеството на получения Gактин, за който се изисква в голяма степен (>50% инхибиране), но пълна инхибиция на хидролитичната активност на ДНК на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, беше определено в предварителни експерименти при същите условия, използвани за всеки анализ. Чувствителността по отношение на инхибиране на актин бе преценена чрез измерване на хидролитичната активност на вариантите в присъствие или отсъствие на актин в единия от два различни анализа, анализа с метилово зелено, вече описан по-горе, и хиперхроматичен анализ, който се основава на увеличаване на поглъщането на светлината при дължина на вълната 260 пт при денатурация и деполимеризация на ДНК (Kunitz, et al., J.Gen.Physiol. 33: 349 -362 (1950); Kunitz et al., J. Gen. Physiol. 33: 363 377 (1950)). Процентът на инхибиция на избраните варианти в тези анализи е демонстриран във фигури 3 и фигури 4.

При хиперхроматичния анализ концентрирани супернатанти от култури (получени според описанието от по-горе, съдържащи варианти на дезоксирибонуклеаза I) бяха инкубирани или без прибавен или с 2- до 3-кратен моларен излишък на актин в буфер А (25 mM HEPES, pH 7.5,4 тМ CaCl, 4 тМ MgCl, В S А) за 1 h при стайна температура, преди да бъдат прибавени в кювета, която съдържа 40 pg ДНК в общ обем от 1.0 ml. Финалната концентрация на вариант на дезоксирибонуклеаза I в анализа беше приблизително 26 пМ, както бе определено посредством дезоксирибонуклеаза IILISA. Бяха измерени степените на хидролизата на ДНК от вариантите на дезоксирибо нуклеаза I в присъствието или в отсъствието на актин. Процентът на активност, изобразен на фигура 3 и фигура 4 бяха изчислени посредством определяне на пропорцията на хидролитичната активност за ДНК на човешка (природна или вариант) дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин към нейната хидролитична активност за ДНК в отсъствието на актин и умножено по 100.

При анализа с метилово зелено концентрирани супернатанти от култури (получени според описанието от по-горе, съдържащи варианти на дезоксирибонуклеаза I) бяха инкубирани или без прибавен или с 1000-кратен моларен излишък на актин в буфер в (25 mM HEPES, pH 7.5,4 тМ СаС1₂ 4 тМ MgCl, 0.1% В S А, 0.01% thimerosal и 0.05% Tween 20) за 16 h при температура 37°С. Концентрацията на активен ензим във всеки отделен случай бе определена чрез сравняване със стандартната крива на Pulmozyme. “Процентната активност”, оставаща на варианта, се отнася 100 пъти към пропорцията на активността в присъствието на актин към пропорцията на активността в отсъствието на актин.

Както е показано на фигури 3 и фигури 4, хидролитичната активност за ДНК на природна човешка дезоксирибонуклеза I е съществено редуцирана в присъствието на актин. Посредством сравняване, различни варианти на природна човешка дезоксирибонуклеаза I с единични- и множествени остатъци са относително резистентни по отношение на инхибиция с актин, както е показано чрез тяхната по-висока хидролитичната активност за ДНК в присъствие на актин, отколкото е човешка дезоксирибонуклеаза I.

111. EL1SA със свързване на актин

Анализ, основан на микротитруване, беше използван за измерване на свързването на човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти на дезоксирибонуклеаза I с имобилизиран актин. Първо, гнездата на плочката на MaxiSorp (Nunc, Inc., Naperville, IIIinoise.USA) бяха покрити c по 100 ml на гнездо от човешки GC глобулин (Calbiochem, La Jolla, California, USA), актин свързващ белтък (Goldschmidt-Clermont, et al., Biochem. J. 228:471 477 (1985, McLeod, et al., J.Biol. Chem. 264:1260 1267 (1989), Houmeida, et al., Eur. J. Biochem. 203:499503 (1992), при концентрация от 10 pg/ml в (25 mM HEPES, pH 7.2,4 mM CaCl₂,4 mM MgCl₂,0.1 %. при 4° в продължение на 16 - 24 h. След отхвърляне на GC-глобулин, излишните реактивни участъци бяха блокирани чрез прибавяне на 200 ml на гнездо от буфер С буфер (буфер С е всъщност буфер В, с прибавени 0.5 mM аденозинтрифосфат; буферът С беше използван като разредител във всички последващи етапи, освен изписаните по различен начин) и инкубиране на паничките върху шейкър за 1 - 2 h при стайна температура. Всеки инкубационен етап, който следваше, беше проведен при стайна температура за 1 h с помощта на MiniOrbital Shaker (Belco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA); между всеки от етапите, паничката беше изпразвана и промивана 6-кратно със солев фосфатен буфер, съдържащ 0.05% Tween с Microwash II plate washer (Skatron A/S, Norway). След това G-актин, получен според гореспоменато описание, беше разреден с 50 pg/ml в буфер Си 100 ml бяха прибавени към всяко гнездо; паничките бяха инкубирани и промити и 100 ml от различни разреждания на Pulmozyne и среда на клетъчна култура, съдържаща или природна човешка дезоксирибонуклеаза I или нейни варианти бяха прибавени към гнездата и паничките бяха инкубирани и промити. Накрая, 100 ml с разреждане 1/25000 от конюгат на пероксидаза от хрян и античовешка дезоксирибонуклеаза 1 заешки поликлонални антитела (оригиналната концентрация на запаса беше 465 pg/ml) също бяха прибавени. След инкубиране и промиване, беше дарено началото на промяната на цвета чрез прибавяне на 100 ml на всяко гнездо от специален за тази цел реагент (Sigma Fast о-фениленедиамин и уреа/ Н₂О таблетки, разтваряни според препоръките на фирмата производител) и преустановено чрез прибавяне на 100 ml за гнездо 4,5 NH₂SO₄. Поглъщането при дължина на вълната от 492 nm беше записано и нанесено с помощта на плотер срещу концентрацията на дезоксирибонуклеаза I, прибавена оригинално към гнездото. Бяха получени сигмоидалните криви, за природна човешка дезоксирибонуклеаза I и за тези варианти, които са свързани с актин; тези криви бяха нагласени за четири параметъра с помощта на нелинеен регресионен анализ (Marquardt, J. Soc. Indust.Appl. Math. 11:431 - 441 (1963); концентрацията на всяка дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изискваща да дава половината от максималния сигнал в анализа, беше изчислена от кривите и беше записана като стойност ЕС50. Беше прието, че молекулната маса на природната човешка дезоксирибонуклеаза I е 37000 Далтона.

Относителната свързваща активност на всяка човешка дезоксирибонуклеза I беше изчислена чрез разделяне на стойността на ЕС50 със стойността на ЕС 50 на природна човешка дезок сирибонуклеаза I получена с метода ILISA, а резултатите са показани на фигури 5 а - г. Например, ако относителната свързваща активност на варианта на човешката дезоксирибонуклеаза I беше изчислена на 5, тази стойност ще показва, че стойността на ЕС50 на този вариант е 5 - кратно по-голяма, в сравнение със стойността на ЕС50 на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или с други думи, че вариантът има афинитет по отношение на актин, който е 5 пъти по-малък от афинитета на природна човешка дезоксирибонуклеаза I по отношение на актин в този ELISA анализ.

III. Анализи на плътността на материали от храчки

Анализ на плътността на материали от храчки (РСТ Publication No WO 1994/010567, published May 11, 1994,) беше използван за измерване на относителната вискоеластичност на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза, преди и след инкубация с природна човешка дезоксирибонуклеаза I и различни варианти на дезоксирибонуклеаза I. След смесване на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза с проба от дезоксирибонуклеаза I и инкубиране за 20 min при стайна температура полутвърдите разтвори бяха въведени в капилярни туби, които след това бяха центрофугирани при 12000 об/min, в продължение на 20min. След центрофугирането, беше измерено теглото на гранулата и сравнено с теглото на разтвора плюс гранулата. Тези измервания след това бяха използвани, за да бъде изчислен процентът на плътност (компактност) на храчките, който корелира с високоеластичността на храчката.

Процентът на компактност, определен при третирането на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза с природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, е показан на фигура 6. Тези резултати показват, че вариантите, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, са по- ефикасни от природна човешка дезоксирибонуклеаза I за намаляването на вискоеластичността на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза.

Claims (9)

1. Патентни претенции

   1. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, резистентни на актин, характеризиращи се с това, че включват най-малко едно аминоки селинно заместване в позиция Ser68, Pro70, Ser94 Туг96.
2. 2. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че аминокиселинните замествания са избрани от групата, състояща се от H44Q, L45C, L45K, L45R, V48K, V48R, G491, G49K, G49R, G49Y, L52K, L52M, L52N, L52R, D53L, D53M, N56R, Y65K, Y65M, Y65S, Y65P, V66N, V67D, V67H, V67M, V67P, V67R, V67S, S68K, S68R, S68M, Е69А, А114Е, Al 14G, Al 14Н, Al 14К, Al 14L, Al 14М, Al 14Q, A114R, A114Wh A114Y.
3. 3. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I съгласно претенция 2, характеризиращи се с това, че включват най-малко едно аминокиселинно заместване от групата, състояща се от: V48, G49I, G49R, D53M, N56R, V66N, Al 14G и А114Н.
4. 4. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I съгласно претенция 2, характеризиращи се с това, че включват най-малко едно аминокиселинно заместване от групата, състояща се от: G49R,A114GhA114H.
5. 5. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, характеризиращи се с това, че включват най- малко едно аминокиселинно заместване от групата, състояща се от: Y65N: V67T, V67M:E69T, S68N:P70T и S94N: Y96T.
6. 6. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I съгласно претенция 5, характеризиращи се с това, че включват най- малко едно аминокиселинно заместване от групата, състояща се от: Y65N: У67Ти S94N: Y96T.
7. 7. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I съгласно която и да е от претенциите от 1 до 6, характеризиращ се с това, че имат най- малко 90% идентичност с аминокиселинната последователност на нативна човешка дезоксирибонуклеаза I, както е показано на фиг. 1.
8. 8. Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I съгласно която и да е от претенциите от 1 до 6, характеризиращи се с това, че имат най-малко 95% идентичност с аминокиселинната последователност на нативна човешка дезоксирибонуклеаза I, както е показано на фиг. 1.
9. 9. Приложение на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I за производство на медикамент за редуциране на вискоеластичността на ДНК съдържащ материал.