BG64423B1

BG64423B1 - Human desoxyribonuclease i variants

Info

Publication number: BG64423B1
Application number: BG101847A
Authority: BG
Inventors: Robert LAZARUS; Steven Shak; Jana Ulmer
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2005-01-31
Also published as: JP4624380B2; CZ297463B6; JP2007312781A; MX9706429A; JP2010057516A; JP2010088452A; PT854927E; BG101847A; CZ267897A3

Abstract

The present invention relates to amino acid sequence variants of human DNase I that have reduced binding affinity for actin. The invention provides nucleic acid sequences encoding such actin-resistant variants, thereby enabling the production of these variants in quantities sufficient for clinical use. The invention also relates to pharmaceutical compositions and therapeutic uses of actin-resistant variants of human DNase I.

Description

Област на техникатаTechnical field

Изобретението се отнася до варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, по-специално до резистентни на актин варианти и тяхното приложение за редуциране на вискоеластичността на ДНК съдържащ материал.The invention relates to variants of human deoxyribonuclease I, in particular to actin-resistant variants and their use for reducing the viscoelasticity of DNA-containing material.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Дезоксирибонуклеаза I е фосфодиестераза, способна да хидролизира полидезоксирибонуклеинова киселина. Дезоксирибонуклеаза I е пречистена от различни биологични видове при различни степени на пречистеност.Deoxyribonuclease I is a phosphodiesterase capable of hydrolyzing polydeoxyribonucleic acid. Deoxyribonuclease I is purified from various species at different degrees of purification.

Волската дезоксирибонуклеаза 1 е обект на екстензивни биохимични изследвания [виж например Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed), pp. 281 -296, Academic press, New York (1981)]. Пълната аминокиселинна последователност на волска дезоксирибонуклеаза I е известна (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefher, et al., J. Mol. Biol. 192: 604-632 (1986); Lahm, et al., J. Mol. Biol. 221:645-667 (1991), а ДНК, която кодира волска дезоксирибонуклеаза I, успешно е клонирана и експресирана (Worrall, et al., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Структурата на волската дезоксирибонуклеаза I е била определена с помощта. на рентгенова кристалография. Suck, et al., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck, et al., Nature 321: 620-625 (1986); Oefner, al., J. Mol. Biol. 192: 605-632(1986).Bovine deoxyribonuclease 1 has been the subject of extensive biochemical studies [see, for example, Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed), pp. 281 -296, Academic press, New York (1981)]. The complete amino acid sequence of bovine deoxyribonuclease I is known (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248: 1489-1495 (1973); Oefher, et al., J. Mol. Biol. 192: 604-632 (1986 Lahm, et al., J. Mol. Biol. 221: 645-667 (1991), and DNA encoding bovine deoxyribonuclease I has been successfully cloned and expressed (Worrall, et al., J. Biol. Chem. 265: 21889-21895 (1990).) The structure of ox deoxyribonuclease I was determined using X-ray crystallography. Suck, et al., EMBO J. 3: 2423-2430 (1984); Suck, et al., Nature 321: 620-625 (1986); Oefner, al., J. Mol. Biol. 192: 605-632 (1986).

ДНК, която кодира човешка дезоксирибонуклеаза I, е изолирана и е определена аминокиселинната й последователност и ДНК е била експресирана в рекомбинантни клетки гостоприемници и посредством това е възможно производството на човешка дезоксирибонуклеаза I в комерсиално приложими количества (Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990)).DNA encoding human deoxyribonuclease I was isolated and its amino acid sequence was determined and DNA was expressed in recombinant host cells and thus the production of human deoxyribonuclease I in commercially available amounts possible (Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci 87: 9188-9192 (1990).

Човешка дезоксирибонуклеаза I притежава качества, които я правят приложима за целите на клиничната терапия. Нейното основно терапевтично свойство е да редуцира вискоеластичността на белодробните секреции (слуз) при такива заболявания като пневмония и кистозна фиброза, като по този начин се постига изчистване на дихателните пътища (виж напр. Lourenco, et al., Arch Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Hubbard, et al., New England. J. Med. 326: 812-815; Fuchs, et al., New England. J. Med. 331: 637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48:894-906(1994). Слузта също допринася за заболеваемостта от хронични бронхити, астматични бронхити, бронхиектазии, емфизема, остри и хронични синузити и дори обикновените настинки.Human deoxyribonuclease I has qualities that make it useful for clinical therapy. Its main therapeutic property is to reduce the viscoelasticity of lung secretions (mucus) in diseases such as pneumonia and cystic fibrosis, thereby achieving respiratory clearance (see, e.g., Lourenco, et al., Arch Intern. Med. 142: 2299-2308 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Hubbard, et al., New England. J. Med. 326: 812-815; Fuchs J. et al., New England, J. Med. 331: 637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48: 894-906 (1994). mucus also contributes to the incidence of chronic bronchitis, asthmatic bronchitis, bronchiectasis , emphysema, acute and chronic sinusitis and even the common cold .

Материалите от белодробната секреция на болните от посочените заболявания представляват сложни комплекси, които включват мукусни глюкопротеини, мукополизахариди, протеази, актин, ДНК. Някои от тези материали се отделят от белите кръвни клетки - левкоцити (неутрофили), които се инфилтрират в белодробните тъкани при нахлуването и размножаването на патогенни микроорганизми (например щамове бактерии на Pseudomonas, Pneumococcus и Staphylococcus) или други дразнители (например тютюнев дим, полени и др.). По време на взаимодействието си с такива микроби или дразнители, левкоцитите могат да бъдат разрушени и техните съставки да бъдат освободени, което допринася за вискоеластичността на белодробните секреции.The lung secretion materials of patients with these diseases are complex complexes that include mucosal glycoproteins, mucopolysaccharides, proteases, actin, DNA. Some of these materials are secreted by white blood cells - leukocytes (neutrophils), which infiltrate the lung tissues upon invasion and reproduction of pathogens (eg, strains of bacteria by Pseudomonas, Pneumococcus and Staphylococcus) or other irritants, etc.). During their interaction with such germs or irritants, leukocytes can be destroyed and their constituents released, which contributes to the viscoelasticity of lung secretions.

Свойството на дезоксирибонуклеаза I да редуцира вискоеластичността на белодробните секреции е било обяснено с нейната способност за ензимно разграждане на големи количества от ДНК, освободени от неутрофили (Shack, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Atiken, etal., Am. Med. Assos. 267: 1847-1951 (1992).The ability of deoxyribonuclease I to reduce the viscoelasticity of lung secretions has been explained by its ability to enzymatically digest large amounts of neutrophil-released DNA (Shack, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990 Atiken, etal., Am. Med. Assos. 267: 1847-1951 (1992).

По-късно е предложен друг механизъм за обяснение на муколитичния ефект на дезоксирибонуклеаза I, включващ, разграждане на актин (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). Актинът е един от най-широко разпространените белтъци в еукариотните клетки (например актинът представлява около 10% от общото, количество на левкоцитарния белтък) и е изследван задълбочено (Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76(1992); Sheterline,etal.,Prot. Profile 1: 1-121 (1994)). Актинът се среща в две форми: мономерна форма (G-актин) и нишковидна форма (F-актин), която е комплектована от G-актинови мономери. Полимерните нишки на актина са с голяма вискоеластичност и имат значителен принос за вискозитета на белодробните секреции (Momet, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 3680-3684 (1984); Newman, etal., Biochemistry 24:1538-1544); Janney, et al., Biochemistry 27: 8218-8226 (1988); Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994)).Another mechanism was later proposed to explain the mucolytic effect of deoxyribonuclease I, including, the breakdown of actin (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). Actin is one of the most widely distributed proteins in eukaryotic cells (e.g., actin represents about 10% of the total, leukocyte protein amount) and has been extensively studied (Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21: 49-76 (1992); Sheterline, et al., Prot. Profile 1: 1-121 (1994)) Actin occurs in two forms: the monomeric form (G-actin) and the filamentous form (F-actin), which is complete with G-actin monomers. these actin filaments are highly viscoelastic and have a significant contribution to the viscosity of pulmonary secretions (Momet, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 3680-3684 (1984); Newman, et al., Biochemistry 24: 1538 -1544); Janney, et al., Biochemistry 27: 8218-8226 (1988); Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994).

Поради това, че за дезоксирибонуклеаза 1 се знае, че се свързва с актин (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Kabsh, et al., Nature 347: 37-44 (1990) и че деполимеризиpa актиновите нишки (също като инхибира полимеризацията на G-актин в нишки) (Mannherz, et al., FEBS Lett. 60: 34-38 (1975); Hitchcock, et al., Cell 7: 531-542 (1976): Pinder, et al., Biochemistry 21:4780-4786 (1994), се предполага, че муколитичният ефект на дезоксирибонуклеаза I върху храчките и други белодробни секреции се дължи поскоро на разграждането на актина (деполимеризация), отколкото на хидролизата на ДНК (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). От тази гледна точка, известно е, че в присъствието на актин, хидролитичната активност към ДНК на дезоксирибонуклеаза I е инхибирана (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Mannherz, et al., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980)). Също от тази гледна точка е съобщено, че протеините с отделен актин (например гелсолин) са ефективни по отношение на намаляване на вискоеластичността на храчките при кистозна фиброза (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994); Stossel, et al., PCT Patent Publication No WO 1994/022465 (published October 13,1994)).Because deoxyribonuclease 1 is known to bind to actin (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Kabsh, et al., Nature 347: 37- 44 (1990), and that it depolymerizes actin filaments (also inhibiting G-actin polymerization in filaments) (Mannherz, et al., FEBS Lett. 60: 34-38 (1975); Hitchcock, et al., Cell 7: 531 -542 (1976): Pinder, et al., Biochemistry 21: 4780-4786 (1994), it is suggested that the mucolytic effect of deoxyribonuclease I on phlegm and other pulmonary secretions is due more to actin degradation (depolymerization) than to DNA hydrolysis (Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971 (1994). From this perspective, it is known that in the presence of actin, the hydrolytic activity to the DNA of deoxyribonuclease I is inhibited (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Mannherz, et al., Eur. J. Biochem 104: 367-379 (1980) It has also been reported from this point of view that proteins with separate actin (eg gelsolin) are effective in reducing viscoelasticity of phlegm in cystic fibrosis (Vasconcellos, et al. , Science 263: 969-971 (1994); Stossel, et al., PCT Patent Publication No. WO 1994/022465 (published October 13,1994).

Представяното изобретение се основава отчасти на проучване, проведено от авторите на изобретението, за да бъде определена биохимичната база, на която се основава муколитичната активност на дезоксирибонуклеаза I. Това изследване включва проектиране и синтезиране на различни варианти на човешка дезоксирибонуклеааа 1 и апробиране на тези варианти , за да бъде оценена тяхната способност да хидролизират ДНК, да свързват актин и да намаляват in vitro вискоеластичността на храчки. Създадени са няколко класа от варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Един такъв клас от варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I (варианти, които са резистентни на актин) има намалена способност да свързва актин, но пък притежава и муколитична активност и в някои случаи е имал повишена муколитична активност при сравняване с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Тези резистентни по отношение на актина варианти имат приблизително същата способност да хидролизират ДНК, като тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, но такава активност е помалко чувствителна на инхибиране посредством актин. Друг клас от варианти свързва актин с подобен афинитет на този, установен при природната човешка дезоксирибонуклеаза I, но има на малена муколитична активност и намалена хидролитична активност към ДНК, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.The present invention is based, in part, on a study conducted by the authors of the invention to determine the biochemical basis on which the mucolytic activity of deoxyribonuclease I is based. This study involves designing and synthesizing various variants of human deoxyribonuclease 1 and testing these variants, to evaluate their ability to hydrolyze DNA, bind actin, and reduce in vitro viscoelasticity of phlegm. Several classes of human deoxyribonuclease I variants have been created. One such class of human deoxyribonuclease I variants (actin-resistant variants) has a reduced ability to bind actin, but also has mucolytic activity and in some cases has had increased mucolytic activity. activity when compared to natural human deoxyribonuclease I. These actin-resistant variants have approximately the same ability to hydrolyze DNA as that of natural human deoxyribonuclease I, but such activity is less susceptible to inhibition by actin. Another class of variants binds actin with a similar affinity to that found in natural human deoxyribonuclease I but has low mucolytic activity and reduced hydrolytic activity against DNA compared to natural human deoxyribonuclease I.

Тези резултати показват, че терапевтичната ефикасност на човешка дезоксирибонуклеаза I при редуциране на вискоеластичността на белодробните секрети се дължи по-скоро на нейната каталитична хидролизна активност за ДНК, отколкото на нейната способност да деполимеризира нишковиден актин. В съответствие с това, варианти на човешка дезоксирибонуклеза I, които свързват актин с по-нисък афинитет, в сравнение с човешка дезоксирибонуклеаза I, но пък притежават активност да хидролизират ДНК, биха били успешно прилагани като терапевтични средства, по-специално при лечението на пациенти, имащи белодробни секрети с относително големи количества актин. Поради това, че такива варианти имат намалена активност за актин, тяхната активност да хидролизират ДНК е по-малко инхибирана при наличие на актин, така че тези варианти имат по-голяма муколитична активност в присъствието на актин, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.These results indicate that the therapeutic efficacy of human deoxyribonuclease I in reducing the viscoelasticity of lung secretions is due to its catalytic hydrolysis activity for DNA rather than its ability to depolymerize filamentous actin. Accordingly, variants of human deoxyribonuclease I, which bind actin with lower affinity than human deoxyribonuclease I but have the activity to hydrolyze DNA, would be successfully applied as therapeutic agents, especially in the treatment of patients having pulmonary secretions with relatively large amounts of actin. Because such variants have reduced activity for actin, their activity to hydrolyze DNA is less inhibited in the presence of actin, so that these variants have greater mucolytic activity in the presence of actin than natural human deoxyribonuclease I.

Цел на представяното изобретение е да предложат варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, които да притежават активност да хидролизират ДНК, но и да свързват актин с по-нисък афинитет в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I.It is an object of the present invention to provide variants of human deoxyribonuclease I that have activity to hydrolyze DNA but also bind actin with lower affinity than natural human deoxyribonuclease I.

Друга цел на изобретението е да предостави нуклеинови киселини, които да кодират такива резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I, рекомбинантни вектори, включващи такива нуклеинови киселини, рекомбинантни клетки гостоприемници, трансформирани с тези нуклеинови киселини или вектори, и технологични методи за получаване на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I посредством рекомбинантната ДНК технология.Another object of the invention is to provide nucleic acids that encode such actin-resistant variants of human deoxyribonuclease I, recombinant vectors, including such nucleic acids, recombinant host cells transformed with these nucleic acids or vectors, and technological methods for preparing of human deoxyribonuclease I by recombinant DNA technology.

Изобретението се отнася също и до приложение на такива резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I в in vitro диагностични анализи на вискозен материал, както и за производство на медикамент за редуциране на вискоеластичността на ДНК съдържащи биологични материали. Последните са характерни за заболявания като кистозни фибрози, хронични бронхити, пневмония, бронхиектазии, емфизема, бронхиална астма или системен лупус еритематозус.The invention also relates to the use of such actin-resistant variants of human deoxyribonuclease I in in vitro diagnostic analyzes of viscous material, and to the manufacture of a medicament for reducing the viscoelasticity of DNA containing biological materials. The latter are characteristic of diseases such as cystic fibrosis, chronic bronchitis, pneumonia, bronchiectasis, emphysema, bronchial asthma or systemic lupus erythematosus.

Описание на приложените фигуриDescription of the attached figures

Фигура 1 показва аминокиселинната последователност на човешка зряла дезоксирибонуклеаза I (секвенция 1). Номерата показват секвен ционната позиция на аминокиселинните остатъци в тяхната последователност.Figure 1 shows the amino acid sequence of human mature deoxyribonuclease I (sequence 1). The numbers indicate the sequential position of the amino acid residues in their sequence.

Фигурите от 2 до 6 предлагат данни за следните варианти:Figures 2 to 6 provide data for the following options:

А114С (SEQID. No. 68) А114Е (SEQ ID. No. 69) A114G (SEQ ID. No. 70) A114H (SEQ ID. No. 71) A114K (SEQ ID. No. 72) A114L (SEQ ID. No. 73) A114M (SEQ ID. No. 74) A114Q (SEQ ID. No. 75) A114R (SEQ ID. No. 76) A114W(SEQ ID. No. 77) A114Y (SEQID. No. 78) D53A (SEQ ID. No. 11) D53C (SEQ ID. No. 43) D53AK(SEQ ID. No. 12)A114C (SEQID. No. 68) A114E (SEQ ID. No. 69) A114G (SEQ ID. No. 70) A114H (SEQ ID. No. 71) A114K (SEQ ID. No. 72) A114L (SEQ ID. No. .73) A114M (SEQ ID. No. 74) A114Q (SEQ ID. No. 75) A114R (SEQ ID. No. 76) A114W (SEQ ID. No. 77) A114Y (SEQID. No. 78) D53A (SEQ ID. No. 11) D53C (SEQ ID. No. 43) D53AK (SEQ ID. No. 12)

D53R (SEQ ID No. 13) D53Y (SEQ ID No. 14) D58T (SEQ ID No. 80) E13A(SEQ ID No. 2) E13H (SEQ ID No. 3) E13R (SEQ ID No. 4) E13w(SEQ ID No. 5) E13A(SEQID No. 6) E69A (SEQ ID No. 65) E69C (SEQ ID No.66) E69K (SEQ ID No. 21) E69M (SEQ ID No. 67) E69R (SEQ ID No. 22) E49M (SEQ ID No. 35)D53R (SEQ ID No. 13) D53Y (SEQ ID No. 14) D58T (SEQ ID No. 80) E13A (SEQ ID No. 2) E13H (SEQ ID No. 3) E13R (SEQ ID No. 4) E13w ( SEQ ID No. 5) E13A (SEQID No. 6) E69A (SEQ ID No. 65) E69C (SEQ ID No.66) E69K (SEQ ID No. 21) E69M (SEQ ID No. 67) E69R (SEQ ID No. .22) E49M (SEQ ID No. 35).

D53I... D53I ... ( SEQ (SEQ ID. Ho: ID. Ho: 44) 44) (3491 (3491 ( SEQ (SEQ ID .. No : ID .. No: 36 ) 36) 1)5314 1) 5314 ( SEQ (SEQ ¹ ID.. Nos ¹ ID .. Nos 45) 45) (349K (349K ( SEQ (SEQ ID., No: ID., No: 37 ) 37) (349I4 (349I4 ( SEQ (SEQ ID.. Nos ID .. Nos 38) 38) V67A V67A (SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 18) 18) G49Y G49Y ( SEQ (SEQ ID. Mo: ID. Mo: 39) 39) V67C V67C (SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 55) 55) H44A H44A ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 7 ) 7) V67D V67D (SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 56) 56) II44C II44C ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 28 ) 28) V67E V67E ( SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 19) 19) H44D H44D ( SI- Q (SI-Q ID. No: ID. No: 8) 8) V67H V67H ( SEQ (SEQ II).. No: II) .. No: 57) 57) H44E H44E (SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 86) 86) V67K V67K ( SEQ (SEQ 11) ,. No s 11),. No s 20) 20) H44N H44N ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 79) 79) V67I1 V67I1 ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 58) 58) H44Q H44Q ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 29) 29) V67P V67P ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 59) 59) H44W H44W ( SEQ (SEQ II)„ No: II) "No: :l. й) : l. j) V67I4' V67I4 ' (SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 60) 60) H44Y H44Y ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 9 ) 9) V67S V67S ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 61 ) 61) 1.45(3 1.45 (3 ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 30 ) 30) Y65A Y65A ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 15) 15) 1...4 5 K 1 ... 4 5 K ( SEQ (SEQ II) » No: II) »No: 31 ) 31) Y65C Y65C (SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 51 ) 51) 1..4(514- 1..4 (514- ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 32) 32) Y65E Y65E ( SEQ (SEQ ID. No:: ID. No :: 87 ) 87) 1..52C 1..52C ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 40) 40) Y65K Y65K ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 52) 52)

L52K L52K ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 41 I 41 I Y 6 51’1 (SEQ Y 6 51'1 (SEQ ID. ID. No s No s 53) 53) 1..5214 1..5214 (SEQ (SEQ II). No: II). No: 42) 42) Y6 5E' (SEQ Y6 5E '(SEQ ID. ID. No ; No; 97 ) 97) I..52N I..52N ( SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 90 ) 90) Y65R (SEQ Y65R (SEQ ID . ID. No :: No :: .1.6) .1.6) I...52R And ... 52R (SEQ (SEQ II). No:: II). No :: 91) 91) Y65S (SEQ Y65S (SEQ ID. ID. No s No s 54) 54) N560 N560 ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 46 ) 46) Y65W (SEQ Y65W (SEQ ID. ID. No 5 No 5 17) 17) N560 N560 ( SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 92) 92) D65R s E.69R D65R with E.69R ( SEQ (SEQ ID. ID. No s No s 25) 25) Ν56Γ- Ν56Γ- ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 47) 47) D53R;H44A D53R; H44A (SEQ (SEQ II). II). No : No: 23) 23) N56F N56F ( SEQ (SEQ II).. Nos II) .. Nos 93) 93) D53R:Y44A D53R: Y44A ( SEQ (SEQ ID. ID. No s No s 24) 24) N56K N56K ( SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 94 ) 94) H64RsV66T H64RsV66T ( SEQ (SEQ ID. ID. No s No s 81) 81) N56K N56K (SEQ (SEQ 11) « No:: 11) «No :: 48) 48) S68W: Ι'7(.·11 S68W: Ι'7 (. · 11 ( SEQ (SEQ II). II). No:: No :: 98) 98) N56R N56R ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 49) 49) S94N:Y69T S94N: Y69T ( SEQ (SEQ ID. ID. No: No: 85) 85) N56R N56R ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 95) 95) V67N s E69T V67N with E69T ( SEQ (SEQ ID.. ID .. No:: No :: 84 ) 84) N56W N56W ( SEQ (SEQ 1D . No s 1D. No s 50) 50) Y65NsV67I Y65NsV67I ( SEQ (SEQ ID. ID. No : No: 82) 82) N56W N56W ( SEQ (SEQ ID. No:: ID. No :: 96) 96) D53R s Y65A:: E6 5K' D53R with Y65A :: E6 5K ' ( SEQ (SEQ ID. ID. No:: No :: S68K S68K ( SEQ (SEQ ID. Ilo: ID. Ilo: 62) 62) S 561’1 S 561'1 ( SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 63) 63) H44As»53RsY65A H44As »53RsY65A (SEQ (SEQ ID. ID. No и But and S68R S68R ( SEQ (SEQ ID. No? ID. Well? 64) 64) V48C V48C ( SEQ (SEQ ID. No; ID. No; 33) 33) H44A;Y65AsE69R H44A; Y65AsE69R ( SEQ (SEQ II). II). No : No: V48K V48K ( SEQ (SEQ ID. No: ID. No: 34) 34) V48R V48R (SEQ (SEQ II). Nos II). Nos 89 ) 89) V66N V66N (SEQ (SEQ ID. Nos ID. Nos 83) 83)

Фигурите 2а до г показват относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти. Чертите за грешка показват стандартното отклонение. Относителната специфична активност на Pulmozyme човешка дезоксирибонуклеаза I (GENETECH, Inc., South San Francisko, California, USA) е определена на 1.0. Относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I е по-голяма от тази на Pulmozyme, което се дължи на наличието на дезамидирани форми на човешка дезоксирибонуклеаза I, което е намалило хидролитичната активност по отношение на ДНК (Frenz, et al., РСТ Patent Publication No. WO93/25670, published Desember23,1993).Figures 2a to d show the relative specific activity of natural human deoxyribonuclease I and variants. Error bars show standard deviation. The relative specific activity of Pulmozyme human deoxyribonuclease I (GENETECH, Inc., South San Francisko, California, USA) is set to 1.0. The relative specific activity of natural human deoxyribonuclease I is greater than that of Pulmozyme due to the presence of desamidated forms of human deoxyribonuclease I, which decreased the hydrolytic activity against DNA (Frenz, et al., PCT Patent Publication No WO93 / 25670, published December 23, 1993).

Фигура 3 показва ДНК-хидролитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти с единични остатъци на човешка дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин, определени с хиперхроматичен анализ. “Процентна активност” е процентът ДНК-хидролитичната активност на природна дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изчислен, както е описан в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на дезоксирибонуклеазата I при отсъствието на актин е определен на 100% активност. Чертите за грешка показват стандартното отклонение.Figure 3 shows the DNA-hydrolytic activity of natural human deoxyribonuclease I and single-residue variants of human deoxyribonuclease I in the presence of actin as determined by hyperchromatic analysis. "Percentage activity" means the percentage of DNA hydrolytic activity of natural deoxyribonuclease I (natural or variant) calculated as described in Example 3; The DNA hydrolytic activity of deoxyribonuclease I in the absence of actin was determined to be 100% activity. Error bars show standard deviation.

Фигура 4 показва ДНК-хидролитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти с множество от остатъци на човешка дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин, определени е хиперхроматичен или е метилово зелено анализ. “Процентна активност” е процентът ДНК-хидролитичната активност на природна дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изчислен, както е описан в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на дезоксирибонуклеазата I при отсъствието на актин е определен на 100% активност. Чертите за грешка показват стандартното отклонение.Figure 4 shows the DNA hydrolytic activity of natural human deoxyribonuclease I and variants with a plurality of human deoxyribonuclease I residues in the presence of actin, hyperchromatic or methyl green assay determined. "Percentage activity" means the percentage of DNA hydrolytic activity of natural deoxyribonuclease I (natural or variant) calculated as described in Example 3; The DNA hydrolytic activity of deoxyribonuclease I in the absence of actin was determined to be 100% activity. Error bars show standard deviation.

Фигурите 5а до г показват относителната свързваща активност на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I за актин, както е определена в описания в пример 3 ELISA метод на свързан актин. Стойността ЕС50 е концентрацията на дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), която се изисква, за да даде половината от максималния сигнал в анализа. Чертите за грешка показват стандартното отклонение. Стойностите на ЕС50 за Pulmozyme и природна човешка дезоксирибонуклеаза I са 67 ± 23 рМ (п = 31)и87 ± 14 пМ (п = 32), съответно. Относителната свързваща активност, показана на фигурата, е стойността на ЕС50, определена за вариант на човешка дезоксирибонуклеаза 1, разделена на стойността на ЕС50, определена за природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Варианти, където стойността на ЕС50 е по-голяма от тази, която може да бъде измерена при анализа, са индикирани като имащи пропорция (ЕС50 (вариант на дезоксирибонуклеаза 1)/ЕС50 (природна дезоксирибонуклеаза I)), по-голяма от известената стойност, (например, >10, >100, >300, >2000, >20000, >35000).Figures 5a to d show the relative binding activity of variants of human deoxyribonuclease I for actin as defined in the ELISA method for bound actin described in Example 3. The EC50 value is the concentration of deoxyribonuclease I (natural or variant) required to give half the maximum signal in the assay. Error bars show standard deviation. EC50 values for Pulmozyme and natural human deoxyribonuclease I were 67 ± 23 pM (n = 31) and 87 ± 14 nM (n = 32), respectively. The relative binding activity shown in the figure is the EC50 value determined for the human deoxyribonuclease variant 1 divided by the EC50 value determined for natural human deoxyribonuclease I. Variants where the EC50 value is greater than that which can as measured in the assay, are indicated as having a proportion (EC50 (deoxyribonuclease 1 variant) / EC50 (natural deoxyribonuclease I)) greater than the reported value (e.g.,> 10,> 100,> 300,> 2000,> 20000,> 35000).

Фигура 6 показва муколитичната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I в проби от храчки на пациенти с кистозна фиброза, определени с компактен анализ. Чертите за грешка показват средната стандартна грешка.Figure 6 shows the mucolytic activity of natural human deoxyribonuclease I in sputum samples of patients with cystic fibrosis determined by compact analysis. Error bars show the average standard error.

Фигура 7 показва схематично представяне на актин свързващия ELISA метод, описан в пример 3.Figure 7 shows a schematic representation of the actin binding ELISA method described in Example 3.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

I. ОпределенияI. Definitions

Както се използват в предлаганата патентна заявка, термините “човешка дезоксирибонуклеаза I”, “природна човешка дезоксирибонуклеаза I” и “див тип дезоксирибонуклеаза I” се отнасят за полипептида, имащ аминокиселинната последователност на зряла човешка дезоксирибонуклеаза I, както е изложена на фигура I.As used in the present patent application, the terms "human deoxyribonuclease I", "natural human deoxyribonuclease I" and "wild-type deoxyribonuclease I" refer to a polypeptide having the amino acid sequence of mature human deoxyribonuclease I, as well as to human deoxyribonuclease I.

“Вариант” или “вариант на аминокиселинна последователност” на човешка дезоксирибонуклеаза I е полипептид, съдържащ аминокиселинна секвенция, която е различна от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Общо взето, един вариант ще притежава поне 80% идентичност на секвенцията (хомоложност), за предпочитане поне 90% идентичност на секвенцията, още по-добре поне 95% хомоложност и най-добре поне 98% идентичност на секвенцията е тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза 1. Процентът на идентичност на секвенцията е определен, например от Fitch, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1382-1386 (1983), а версия на алгоритъма е определена от Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), след подреждане на последователността, за да се получи максималната хомоложност.A "variant" or "amino acid sequence variant" of human deoxyribonuclease I is a polypeptide containing an amino acid sequence different from that of natural human deoxyribonuclease I. Generally, one variant will have at least 80% sequence identity (homologue), homologous (homologous) preferably at least 90% sequence identity, more preferably at least 95% homology and most preferably at least 98% sequence identity is that of natural human deoxyribonuclease 1. The percentage of sequence identity is determined, e.g. p of the Fitch, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1382-1386 (1983), and a version of the algorithm was determined by Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), after ordering the sequence to obtain maximum homology.

Термините “вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, резистентна на актин”, “вариант на резистентна на актин” и “вариант на резистентна на актин на човешка дезоксирибонуклеаза I” се отнася за вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, която има (1) хидролитична активност за ДНК и (2) редуцирана свързваща активност за актин. “Хидролитична активност за ДНК” се отнася за ензимната активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I в хидролизиращ (разграждащ субстрат на ДНК, за да даде 5'-фосфорилирани олигонуклеотидни крайни продукти. “Хидролитична активност за ДНК” е определена е помощта на някои известни методи, включително електрофореза с аналитичен полиакриламид и агарозен гел, хиперхроматичен анализ (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377 (1950) или анализ c метилово зелено (Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222: 351-358(1994)).The terms "actin-resistant human deoxyribonuclease I variant", "actin-resistant variant" and "human deoxyribonuclease I-actin resistant variant" refer to a variant of natural human deoxyribonuclease 1 having (1) hydrolytic activity DNA and (2) reduced actin binding activity. "DNA hydrolytic activity" refers to the enzymatic activity of natural human deoxyribonuclease I or a variant of human deoxyribonuclease I in hydrolyzing (degrading DNA substrate to give 5'-phosphorylated oligonucleotide end products. " is using some known methods, including analytical polyacrylamide and agarose gel electrophoresis, hyperchromatic analysis (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377 ( 1950) or methyl green analysis (Kumick, Arch. Biochem. 29: 41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222: 351-358 (1994).

Терминът “свързваща активност” на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или на вариант на резистентна на актин човешка дезоксирибонуклеаза I за актин се отнася за способността на дезоксирибонуклеаза I за нековалентно свързване с актин. Свързващата активност може да бъде определена посредством някои от известните методи, например, както е описан от Mannherz, etal., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Алтернативно, относителните свързващи активности на различни дезоксирибонуклеази (напр. природна човешка дезоксирибонуклеаза I и нейните вари анти) са определени чрез измерване на свързването на дезоксирибонуклеазите с имобилизиран актин с метода на ELISA (описан в пример 3) или чрез сравняването на хидролитичната активност за ДНК на дезоксирибонуклеазите в присъствието или без присъствието на актин (описан в пример 3). Методите, които са описани в дадените примери, са особено подходящи за скрининг на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I за бързото идентифициране на тези варианти, които имат редуцирана способност за свързване по отношение на актин.The term "binding activity" of natural human deoxyribonuclease I or an actin-resistant variant of human deoxyribonuclease I for actin refers to the ability of deoxyribonuclease I to covalently bind to actin. Binding activity can be determined by some of the known methods, for example, as described by Mannherz, etal., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980). Alternatively, the relative binding activities of various deoxyribonucleases (e.g., natural human deoxyribonuclease I and its variants) were determined by measuring the binding of deoxyribonucleases to immobilized actin by the ELISA method (described in Example 3) or by comparing the hydrolytic activity for DNA deoxyribonucleases in the presence or without the presence of actin (described in Example 3). The methods described in these examples are particularly suitable for screening variants of human deoxyribonuclease I for the rapid identification of those variants that have a reduced actin binding ability.

Вариант на резистентна на актин човешка дезоксирибонуклеаза I, имащ “редуцирана свързваща способност за актин”, е един вариант, който има свързваща способност за актин, която е относително по-малка от афинитета, с който природната човешка дезоксирибонуклеаза I свързва протеина актин, определяни при съпоставими условия. Ако се прилага методът ELISA със свързващ актин, както е описан в пример 3, за да бъде определен свързващият афинитет на човешка дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант) за актин, тогава резистентният за актин вариант, имащ “редуцирана свързваща способност за актин”, ще бъде вариант, имащ стойност на ЕС50, която е по-голяма, в сравнение с тази на природна човешка дезоксирибонуклеаза I. В този анализ вариант с резистентност за актин типично ще има стойност на ЕС 50 от 5 до 100 пъти по-голяма от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I; но варианти, резистентни за актин, имащи стойности на ЕС 50 над 500 пъти от тази на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, също са предлагани в готова форма, специално чрез редуване на множество аминокиселинни остатъци на аминокиселинната секвенция на природната човешка дезоксирибонуклеаза I, също са предлагани в готова форма, специално чрез редуване на множество аминокиселинни остатъци на аминокиселинната секвенция на природната човешка дезоксирибонуклеаза I (виж фигури 5А и5Г).An actin-resistant variant of human deoxyribonuclease I having a "reduced actin binding capacity" is one variant that has an actin binding capacity that is relatively less than the affinity with which natural human deoxyribonuclease I binds to protein actin, determined by actin comparable conditions. If the binding actin ELISA method as described in Example 3 is applied to determine the binding affinity of human deoxyribonuclease I (natural or variant) for actin, then the actin resistant variant having "reduced actin binding ability" will be an variant having an EC 50 value greater than that of natural human deoxyribonuclease I. In this analysis, an actin resistance variant will typically have an EC 50 value of 5 to 100 times greater than that of natural human deoxyribonuclease I; however, actin-resistant variants having EC 50 values greater than 500 times that of natural human deoxyribonuclease I are also available in formulation, specifically by alternating multiple amino acid residues of the amino acid sequence of natural human deoxyribonuclease I, also available formulation, especially by alternating multiple amino acid residues of the amino acid sequence of natural human deoxyribonuclease I (see Figures 5A and 5D).

Терминът “муколитична активност” се отнася за намаляване на вискоеластичността (вискозитета) на храчки или друг биологичен материал, например при наблюдаване на опит с третиране на материал с природна човешка дезоксирибонуклеаза I или вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Муколитичната активност е оп ределена с помощта на различни известни методи, включително анализ за компактност на храчки (РСТ Patent Publication No. WO 1994/010567, published May 11,1994), методи, използващи торсионно махало (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22: 41-53 (1991), или други реологични методологии.The term "mucolytic activity" refers to the reduction of viscoelasticity (viscosity) of phlegm or other biological material, for example when observing an attempt to treat a material with natural human deoxyribonuclease I or a variant of human deoxyribonuclease I. The mucolytic activity is determined by various known methods, including analysis of phlegm compactness (PCT Patent Publication No. WO 1994/010567, published May 11,1994), methods using a torsional pendulum (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22: 41-53 (1991 ), or other rheological methodologies.

Терминът “полимеразна верижна реакция” или “ПВР” най-общо се отнася за метод за амплифициране на желана нуклеотидна секвенция in vitro, както е описан, например в USA Pat. No. 4 683 193. Методът на ПВР включва повтарящи се цикли от първично екстензионно синтезиране, с използването на олигонуклеотидни праймъри, способни да хибридизират преференциално към матрична нуклеинова киселина.The term "polymerase chain reaction" or "PCR" generally refers to a method for amplifying a desired nucleotide sequence in vitro, as described, for example, in USA Pat. No. 4 683 193. The PCR method involves repetitive cycles of primary extension synthesis using oligonucleotide primers capable of hybridizing preferentially to a matrix nucleic acid.

Термините “клетка”, “клетка гостоприемния”, “клетъчна линия” и “клетъчна култура” се използват тук взаимозаменяемо и всички такива термини са за потомство, получено от растежа на клетки. “Трансформация” и “трансфекция” се използват взаимозаменяемо и се отнасят за процеса на въвеждане на ДНК в клетката.The terms "cell", "cell host", "cell line" and "cell culture" are used interchangeably herein, and all such terms are for progeny derived from cell growth. "Transformation" and "transfection" are used interchangeably and refer to the process of introducing DNA into the cell.

“Оперативно свързване” се отнася за ковалентно свързване на две или повече секвенции на ДНК с помощта на ензимно лигиране или в конфигурация по отношение един на друг, така че нормалната функция на последователността да може да бъде осъществявана. Например, ДНК за предсеквенция или секреторен водач е оперативна свързан за ДНК за полипептид, ако е експресиран като предпротеин, който преципитира в секрет на полипептида; един промотор или усилвател е оперативно свързан за кодиращата последователност, ако той повлиява на транскрипцията на последователността; или рибозомен свързан участък е оперативно свързан към кодираща последователност, ако е позициониран така, че да съдейства на транслацията. Най-общо, “оперативно свързване” означава, че секвенциите на ДНК са свързани долепено, в случая на секреторен водач, долепено и във фаза на прочитане. Свързване се извършва чрез лигиране на подходящи рестрикционни участъци. Ако такива участъци не съществуват, тогава се използват синтетични олигонуклеотидни адаптори или линкери за свързване със стандартни методи за рекомбинация на ДНК.&Quot; Operative binding " refers to the covalent binding of two or more DNA sequences by enzymatic ligation or in a configuration relative to one another so that the normal sequence function can be performed. For example, pre-sequencing or secretory driver DNA is operatively linked to DNA for a polypeptide if expressed as a preprotein that precipitates into the secret of the polypeptide; a promoter or enhancer is operatively linked to the coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome-linked region is operatively linked to a coding sequence if positioned to facilitate translation. Generally, "operative binding" means that the DNA sequences are attached in the attachment, in the case of the secretory driver, in the attachment and in the read phase. The binding is accomplished by ligation of suitable restriction sites. If no such sites exist, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used to bind to standard DNA recombination methods.

Аминокиселините са обозначени със съкращения от три или от една буква, както следва:Amino acids are indicated by abbreviations of three or one letter as follows:

ALANINE ALANINE Ala Ala A A - Аланин (Ала) - Alanine (Ala) ARGININE ARGININE Arg Arg R R - Аргинин (Apr) - Arginine (Apr) ASPARAGINE ASPARAGINE Asn Asn N N - Аспарагин (Асн) - Asparagine (Asn) ASPARATIC ACID ASPARATIC ACID Asp Asp D D - Аспарагинова к-на - Asparagine's to CISTEINE CISTEINE Cys Cys C C - Цистеин (Цис.) - Cysteine (Cis.) GLUTAMIC ACID GLUTAMIC ACID Glu Glu E E ~ Глутаминова к-на ~ Glutamine to bLU 1 AMINE bLU 1 AMINE Gin Gin Q Q - Гднтамин (Глн) - Gdtamin (Gln) GLYCINE GLYCINE Gly Gly 6 6 - Глицин (гли) - Glycine (gly)

HISTIDINEHISTIDINE

His H - Хистидин (Xue)His H - Histidine (Xue)

ISOLEUCINE I leuISOLEUCINE And leu

LEUCINE LeuLEUCINE Leu

LYSINE LysLYSINE Lys

METHIONINE MetMETHIONINE Met

PHENYLALANINE PhePHENYLALANINE Phe

PROLINE ProPROLINE Pro

SERINE SerSERINE Ser

THREONINE ThrTHREONINE Thr

TRYPTOPHAN TrpTRYPTOPHAN Trp

TYROSINE TyrTYROSINE Tyr

VALINE ValVALINE Val

I - Изолебцин (Иле)I - Isolebcin (Ile)

L - Левцин (Лев)L - Leucine (Leo)

K - Лизин (Лиз)K - Lysine (Liz)

М - Метионин (Мет)M - Methionine (Meth)

F - Фенилаланин (Фал)F - Phenylalanine (Fal)

Р - Пролин (Про)P - Proline (Pro)

S - Серин (Сер)S - Serine (Ser)

Т - Треонин (Тре)T - Threonine (Tre)

Т - ТриптоФан (Три)T - Tryptophan (Three)

Т - Тирозин (Тир)T - Tyrosine (Tyr)

V - Валин (Вал)V - Valin (Val)

II. Подбор на варианти резистентни на актинII. Selection of actin-resistant variants

Представяното изобретение е базирано на изучаване на структура, свойства за свързване на актин, хидролитична активност за ДНК и муколитична активност на аминокиселинни последователности на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Вариантите, резистентни на актин, от предлаганото изобретение имат хидроли45 тична активност за ДНК, но свързват актин с помалка активност, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Редакцията на свързването на актин е постигната чрез приготвяне на мутации на и/или тези аминокиселинни остатъци с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, за да се повлияе на свързването на актин, включително, например, за остатъци на Glul3, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56,The present invention is based on the study of structure, actin binding properties, hydrolytic activity for DNA and mucolytic activity of amino acid sequences of human deoxyribonuclease variants I. The actin-resistant variants of the present invention have hydrolytic activity for DNA but have binding activity for DNA Actin with less activity than natural human deoxyribonuclease I. The editing of actin binding is achieved by preparing mutations of and / or these amino acid residues with natural human deoxyribonuclease I to interfere with actin binding, including, for example, residues of Glul3, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56,

Asp58, His64, Tyr65, Val66, Val67, Ser68, Glu69, Pro70, Ser94, Tyr96 и Alai 14 на природна човешка дезоксирибонуклеаза I (номерът, който следва обозначението от три букви, показва специфичната позиция на аминокиселинния остатък в секвенцията на фигура 1.Asp58, His64, Tyr65, Val66, Val67, Ser68, Glu69, Pro70, Ser94, Tyr96 and Alai 14 of natural human deoxyribonuclease I (the number following the three letter designation indicates the specific position of the amino acid residue in the sequence of Figure 1.

Има множество от начини за направа на резистентни на актин варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. В едно от изпълненията на изобретението резистентен на актин вариант е приготвен посредством въвеждане или на едно или много аминокиселинни заместители, инсерции и/или делеции вътре или в съседство (с около пет аминокиселинни остатъка от) до тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, което влияе на свързването на актина. Някои подходящи примери за това са следните: D53R, D53K, D53Y, D53Y, Y65 A, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65 A, D53R:E69R, H44A:D53R: Y65A, H44A:Y65A:E69R (виж фигури 2-6).There are numerous ways of making actin-resistant variants of human deoxyribonuclease I. In one embodiment of the invention, an actin-resistant variant is prepared by introducing either one or many amino acid substitutions, insertions and / or deletions within or adjacent (with ca. five amino acid residues (a) to those amino acid residues of natural human deoxyribonuclease I, which affects actin binding. Some suitable examples of these are: D53R, D53K, D53Y, D53Y, Y65 A, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R: Y65 A, D53R: E69R, H44A: D53R: Y65A, H44A: Y65A: E69R (see figures 2-6).

В друго изпълнение на изобретението, резистентен на актин вариант е получен чрез въвеждане на мутация(и), което създава нов гликозилационен участък вътре или в съседство (с около пет аминокиселинни остатъка от) до тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, което влияе на свързването на актина. Например, насочена към участък мутагенеза е използвана да се въведе една от трипептидните секвенции, аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин (където X е всяка една аминокиселина, с изключение на пролин), които са познати последователности за ензимно прикрепване на въглехидратната част към страничната верига на аспарагин, Creighton, Proteins, рр. 76-78 (W. Н. Freeman, 1984). Пространствена пречка, която се явява между въглехидратната част на получения N-гликозилатен вариант на дезоксирибонуклеаза I и актин, може да редуцира или предотврати свързването на актин и в резултат на това получено инхибиране на хидролитичната активност на ДНК на дезоксирибонуклеаза I, в сравнение с природната човешка дезоксирибонуклеаза I. Някои подходящи примери за това са следните: H44N, D58S, D58T, V66N, H44N:T46S, H64N: V66S, H64N:V66T, Y65N:V67S, Y65N:V67T, V66N.S68T, V67N:E69S, S68N:P70S, S68N:P70T, S94N:Y96S, S94N:Y96T.In another embodiment of the invention, the actin-resistant variant is obtained by introducing a mutation (s) that creates a new glycosylation region within or adjacent (with about five amino acid residues) to these amino acid residues of natural human deoxyribonuclease 1, which affects actin binding. For example, site-directed mutagenesis has been used to introduce one of the tripeptide sequences, asparagine-X-serine or asparagine-X-threonine (where X is any amino acid except proline), which are known sequences for enzymatic attachment of carbohydrate part of the asparagine side chain, Creighton, Proteins, pp. 76-78 (W. N. Freeman, 1984). The spatial barrier that occurs between the carbohydrate moiety of the resulting N-glycosylate variant of deoxyribonuclease I and actin can reduce or prevent actin binding and, as a result, inhibition of the hydrolytic activity of DNA of deoxyribonuclease I in comparison with natural human deoxyribonuclease I. Some suitable examples of this are the following: H44N, D58S, D58T, V66N, H44N: T46S, H64N: V66S, H64N: V66T, Y65N: V67S, Y65N: V67T, V66N.S68T, V67N: E69S, S68N: P70S, S68N: P70 , S68N: P70T, S94N: Y96S, S94N: Y96T.

Факултативно, при свързване c такива мутации, за да се създаде нов гликозилатен участък, естествено срещащият се гликозилатен участък на позиции 18 и/или 106 в аминокиселинна после дователност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I може да бъде изтрита, в зависимост от степента на желаната гликозилация във варианта на резистентност на актин.Optionally, when coupled to such mutations to create a new glycosylation region, the naturally occurring glycosylation site at positions 18 and / or 106 in the amino acid sequence of natural human deoxyribonuclease I may be deleted, depending on the degree of glycosation desired. the actin resistance variant.

В друг вариант на това изобретение насочен към участък мутагенеза е използвана, за да се въведат остатъци вътре или в съседство до (с около пет аминокиселинни остатъка от) тези аминокиселинни остатъци на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, които са включени в свързване на актин, като подходящи за следтранслационна модификация или биологична или химична такава (виж по-долу). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Metods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W.H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Такива посттранслационни модификации могат да създадат пространствена пречка или да променят електростатичните свойства в дезоксирибонуклезза I, което ще редуцира или предотврати свързване на актин и последваща инхибиция на хидролитичната активност на ДНК, в сравнение с природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Например, цистеинов остатък може да бъде въведен вътре или в съседство с остатък на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, който е включен в свързването на актин. Свободният тиол на цистеиновия остатък може да формира интермолекуларна дисулфидна връзка с друг такъв вариант на дезоксирибонуклеаза I, за да формира димер на дезоксирибонуклеаза I или може да бъде видоизменен, например със специфичен тиолов алкилиращ агент. Някои подходящи примери за такива мутации са следните: 444С, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, Е69С, А11С.In another embodiment of this invention, site-directed mutagenesis is used to introduce residues within or adjacent to (with about five amino acid residues) those amino acid residues of natural human deoxyribonuclease I, which are included in actin binding as appropriate for post-translational modification or biological or chemical modification (see below). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W.H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Such post-translational modifications may create a spatial barrier or alter the electrostatic properties of deoxyribonucleases I, which will reduce or prevent actin binding and subsequent inhibition of DNA hydrolytic activity compared to natural human deoxyribonuclease I. For example, cysteine residues may be introduced. inside or adjacent to a natural human deoxyribonuclease I residue that is involved in actin binding. The free thiol of the cysteine residue may form an intermolecular disulfide bond with another such variant of deoxyribonuclease I to form a dimer of deoxyribonuclease I or may be modified, for example, by a specific thiol alkylating agent. Some suitable examples of such mutations are the following: 444C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, A11C.

За удобство замествания, инсерции и/или делеции в аминокиселинните секвенции на природната човешка дезоксирибонуклеаза I обикновено са правени посредством въвеждане на мутации в кореспондиращата нуклеотидна секвенция на кодиращата ДНК природна човешка дезоксирибонуклеаза I, например чрез насочена към участък мутагенеза. Експресията на мутираната ДНК впоследствие води до резултат, изразяващ се в производството на варианта на човешката дезоксирибонуклеаза I , имаща желаната (неприродна) аминокиселинна секвенция. Докато всяка известна техника може да бъде прилагана, за да се извърши насочена към участък мута генеза, например, както това е описано в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, U.S.A. (1989)), насочена към олигонуклеотид мутагенеза е предпочитаният метод за получаване на вариантите на човешка дезоксирибонуклеаза I от това изобретение. Този метод, който е добре известен в науката (Zoller, et al., Meth. Enz. 100: 4668-5000 (1983); Zoller, et al., Meth. Enz. 154: 329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154: 382-403 (1987); Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185: 599-611 (1990), е особено подходящ за направата на заместени варианти, въпреки че той може също да бъде използван за конвенционално получени делеционни и инсерционни варианти.For convenience, substitutions, insertions and / or deletions in the amino acid sequences of natural human deoxyribonuclease I are typically made by introducing mutations into the corresponding nucleotide sequence of the native human deoxyribonuclease I encoding DNA, for example by stretching a strand. The expression of the mutated DNA subsequently results in the production of a human deoxyribonuclease I variant having the desired (unnatural) amino acid sequence. While any known technique can be applied to perform site-directed mutation of genesis, for example, as described in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York , USA (1989)) directed to oligonucleotide mutagenesis is the preferred method of preparing the human deoxyribonuclease I variants of this invention. This method, which is well known in the art (Zoller, et al., Meth. Enz. 100: 4668-5000 (1983); Zoller, et al., Meth. Enz. 154: 329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154: 382-403 (1987); Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154: 367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185: 599-611 (1990) is particularly suitable for making substituted variants, although it can also be used for conventionally derived deletion and insertion variants.

Технологията, която се използва, е при насочен към участък мутагенезен фагвектор, който съществува както при едноверижна или двуверижна форма. Типичните вектори, които се използват при насочена към участък мутагенеза, включват вектори като фаг Μ13 и плазмидни вектори, които съдържат едноверижен фагов източник на репликация (Messing, et., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1978); Veiraet al., Meth. Enzymol. 153:311 (1987); Short, et al., Nuc. Acids. Res. 16: 75837600 (1988)). Репликация на тези вектори в подходящи клетки гостоприемници води до синтезата на едноверижна ДНК, която може да бъде използвана за насочена към участък мутагенеза. Накратко при изпълнението на насочена към участък мутагенеза на кодираща ДНК природна човешка дезоксирибонуклеаза I (или неин вариант), ДНК е изменена посредством първа хибридизация на олигонуклеотид, кодиращ желаната мутация на единична верига на ДНК. След хибридизация ДНК полимераза е използвана, за да се синтезира цяла втората верига, използвайки хибриден олигонуклеотид като праймер и прилагайки единичната верига на ДНК като матрица. Така олигонуклеотидът, който кодира желаната мутация, е вграден в получената двуверижна ДНК.The technology used is for a site-directed mutagenic phagvector, which exists as in single-stranded or double-stranded form. Typical vectors used for site-directed mutagenesis include vectors such as phage Μ13 and plasmid vectors that contain a single-stranded phage replication source (Messing, et. Meth. Enzymol. 101: 20-78 (1978); Veiraet al. , Meth. Enzymol. 153: 311 (1987); Short, et al., Nuc. Acids. Res. 16: 75837600 (1988). Replication of these vectors in suitable host cells leads to the synthesis of single stranded DNA that can be used for site-directed mutagenesis. Briefly, in performing site-directed mutagenesis of DNA encoding natural human deoxyribonuclease I (or a variant thereof), DNA is altered by first hybridization of an oligonucleotide encoding the desired single strand DNA mutation. After hybridization, DNA polymerase was used to synthesize the entire second strand, using a hybrid oligonucleotide as primer and applying the single strand of DNA as template. Thus, the oligonucleotide that encodes the desired mutation is incorporated into the resulting double stranded DNA.

Олигонуклеотидите, които се използват като хибридизационни сонди или праймери, могат да бъдат приготвени посредством всеки един от подходящите за тази цел методи, например пречистване на срещаща се естествено ДНК или с помощта на синтеза in vitro. Например, олигонуклеотиди са готово синтезирани при използване на лични технологии в органичната химия, като описаните от Narang, et al., Meth. Enzymol. 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109Oligonucleotides, which are used as hybridization probes or primers, can be prepared by any of the methods suitable for this purpose, for example, purification of naturally occurring DNA or by in vitro synthesis. For example, oligonucleotides are readily synthesized using personal technologies in organic chemistry, such as those described by Narang, et al., Meth. Enzymol. 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109

151 (1979); Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154: 287-313(1985). Общият подход за синтезирането на подходяща хибридизационна сонда или праймер е добре известен. Keller, et al., DNK Probes, pp. 11-18 (Stockton Press, 1989). Обичайно, хибридизационната сонда или праймер ще съдържа 1-25 или повече нуклеотида, и ще включва поне 5 нуклеотида на всяка страна на секвенцията, която кодира желаната мутация, така че да се осигури възможността олигонуклеотидът да хибридизира преференциално на желаното място на едноверижната матрична молекула на ДНК.151 (1979); Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154: 287-313 (1985). The general approach to synthesizing a suitable hybridization probe or primer is well known. Keller, et al., DNA Probes, pp. 11-18 (Stockton Press, 1989). Typically, the hybridization probe or primer will contain 1-25 or more nucleotides, and will include at least 5 nucleotides on each side of the sequence that encodes the desired mutation so as to allow the oligonucleotide to preferentially hybridize to the desired location of the single-stranded matrix molecule DNA.

Разбира се, насочена към участък мутагенеза може да бъде прилагана за многократно въвеждане на мутации от заместване, инсерция или делеция в стартиращата ДНК. Ако участъците, които ще бъдат мутирани, са локализирани близо един до друг, мутациите могат да бъдат въведени едновременно при използване на единствен олигонуклеотид, който кодира всички желани мутации. Ако обаче участъците, които ще бъдат мутирани, са локализирани далеч един до друг (разделени чрез поне около десет нуклеотида), много по-трудно е да се генерира единствен олигонуклеотид, който да кодира всички от желаните промени. Вместо това, могат да бъдат използвани един или два алтернативни метода.Of course, site-directed mutagenesis can be applied to repeatedly insert mutations from substitution, insertion or deletion into the starting DNA. If the regions to be mutated are located close to one another, mutations can be introduced simultaneously using a single oligonucleotide that encodes all the desired mutations. However, if the mutated regions are located far from each other (separated by at least about ten nucleotides), it is much more difficult to generate a single oligonucleotide that encodes all of the desired changes. Instead, one or two alternative methods can be used.

В първия метод отделен олигонуклеотид е произведен за всяка желана мутация. Олигонуклеотидите са след това ренатурирани едновременно към едноверижната матрична ДНК и втората верига на ДНК, която е синтезирана от матрицата, ще кодира всички желани аминокиселинни замествания.In the first method, a single oligonucleotide is produced for each desired mutation. The oligonucleotides are then renatured simultaneously to single stranded template DNA and a second strand of DNA that is synthesized by the template will encode all the desired amino acid substitutions.

Алтернативният метод включва два или повече етапа на мутагенеза до производството на желания вариант. Първият етап е като описания за въвеждане на единична мутация. Вторият етап използва мутираната ДНК, която е получена през първия етап на мутагенезата като матрицата. Така, матрицата вече съдържа една или повече мутации. Олигонуклеотидът, който кодира желаното аминокиселинно заместване (замествания), след това е ренатуриран на тази матрица и получената верига на ДНК сега кодира мутации от първия и втория етап на мутагенезата. Тази получена ДНК може да бъде използвана като матрица в трети етап на мутагенеза и така нататък.The alternative method involves two or more stages of mutagenesis to produce the desired variant. The first stage is as described for introducing a single mutation. The second stage uses the mutated DNA that was obtained during the first stage of mutagenesis as a template. Thus, the matrix already contains one or more mutations. The oligonucleotide that encodes the desired amino acid substitution (substitutions) is then renatured to this template and the resulting strand of DNA now encodes mutations from the first and second mutagenesis steps. This DNA obtained can be used as a template in the third stage of mutagenesis and so on.

Мутагенеза с полимеразна верижна реакция (Higushi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Valette, et al., Nuc. Acids. Res. 17:723-733 (1989)) е също подходяща за напра вата на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I. Накратко, когато малки количества от матрична ДНК се използват като стартиращ материал в полимеразна верижна реакция, праймери, които се различават слабо по секвенции на кореспондиращ регион в матрична ДНК, могат да бъдат използвани за получаване на относително големи количества на специфичен ДНК фрагмент, който се различава от матричната секвенция само на позициите, където примерите се различават от матрицата. За въвеждане на мутация в плазмидна ДНК, например секвенцията на един от праймерите включва желаната мутация и е проектирана да хибридизира на една верига на плазмидната ДНК на позицията на мутацията; последователността на другия праймер трябва да бъде идентична с нуклеотидна секвенция с противоположна верига на противоположната верига на плазмидната ДНК, но тази секвенция може да бъде локализирана където и да е по продължение на плазмидната ДНК. За предпочитане е секвенцията на втория праймер да е локализирана в 200 нуклеотида от тези на първия, така че в края на изцяло амплифицирания регион на ДНК, свързан посредством праймерите, може лесно да бъде направена секвенция. Амплификация с полимеразна верижна реакция с използването на праймерен чифт наподобява един вече описан резултат в популация на фрагменти на ДНК, които се различават на позицията на мутацията, определена посредством такъв праймер, и възможно и на други позиции, като матрица, копираща малко грешно положение. Wagner, et al., in PCR Topics, pp. 69-71 (Springer - Verlag, 1991).Polymerase chain reaction mutagenesis (Higushi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Valette, et al., Nuc. Acids. Res. 17: 723-733 (1989)) is also suitable of human variants of deoxyribonuclease I. Briefly, when small amounts of template DNA are used as starting material in a polymerase chain reaction, primers that differ slightly in sequences of the corresponding region in template DNA can be used to obtain relatively large amounts of a specific DNA fragment that differs from the template sequence only in tions where the examples differ from the matrix. For insertion of a mutation into plasmid DNA, for example, the sequence of one of the primers includes the desired mutation and is designed to hybridize to a single strand of plasmid DNA at the mutation position; the sequence of the other primer should be identical to the nucleotide sequence of the opposite strand of the plasmid DNA strand, but this sequence may be located anywhere along the plasmid DNA. Preferably, the sequence of the second primer is localized within 200 nucleotides of those of the first, so that at the end of the fully amplified region of DNA bound through the primers, a sequence can easily be made. Polymerase chain reaction amplification using a primer pair resembles an already described result in a population of DNA fragments that differ in the mutation position determined by such a primer and possibly other positions, such as a small copy misfolding matrix. Wagner, et al., And PCR Topics, pp. 69-71 (Springer - Verlag, 1991).

Ако съотношението на матрицата към произведената амплифицирана ДНК е извънредно ниско, болшинството от получените фрагменти на ДНК инкорпорират желаната (желаните) мутация(и). Тази произведена ДНК се използва, за да смени кореспондиращия регион в плазмида, който служи като матрица за полимеразна верижна реакция, използвайки методи за рекомбиниране на ДНК. Мутации на отделни позиции могат да бъдат въведени едновременно посредством или мутантен вторичен праймер, или осъществявайки вторична полимеразна верижна реакция с различни мутантни праймери и лигирайки два от получените фрагменти от ПВР едновременно към плазмидния фрагмент на три (или повече) отделни лигатури.If the ratio of the matrix to the amplified DNA produced is extremely low, most of the resulting DNA fragments incorporate the desired mutation (s). This DNA produced is used to alter the corresponding region in a plasmid that serves as a polymerase chain reaction template using DNA recombination methods. Single position mutations can be introduced simultaneously by either a mutant secondary primer or by performing a secondary polymerase chain reaction with different mutant primers and ligation of two of the obtained PCR fragments simultaneously to the plasmid fragment of three (or more) individual ligatures.

Друг способ за получаване на варианти, касетна мутагенеза, е основан на технологията, описана от Well et al., Gene, 34:315-323 (1985). Началният материал е плазмид (или драг вектор), който включва секвенцията на ДНК, която трябва да бъде мутирана. Кодът (кодовете) в стартиращата ДНК, която трябва да бъде мутирана, са идентични. Трябва да има рестрикционен ендонуклеазен участък на установен мутационен участък (участъци). Ако няма такива рестрикционни участъци, те трябва да бъдат създадени с помощта на по-горе описания метод за олигонуклеотид-медиирана мутагенеза, за да бъдат въведени на подходящата локализация в ДНК. Плазмидната ДНК е срязана линеарно на тези участъци. Двуверижен олигонуклеотид, кодира секвенцията на ДНК между рестрикционните участъци, но съдържащия желаната мутация(и) е синтезиран с помощта на стандартни процедури, при които двете вериги на олигонуклеотида са синтезирани разделено и след това хибридизирани заедно, като се прилагат стандартни технологии. Този двойноверижен олигонуклеотид се третира като касета. Тази касета е проектирана да има 5’ и 3’ краища, които са съвместими с краищата на линейния плазмид, така че да може директно да бъде лигиран към плазмида. Полученият плазмид съдържа мутирана секвенция на ДНК.Another method of producing variants, cluster mutagenesis, is based on the technology described by Well et al., Gene, 34: 315-323 (1985). The starting material is a plasmid (or dredge vector) that includes the DNA sequence to be mutated. The code (s) in the starting DNA to be mutated are identical. There must be a restriction endonuclease region of an established mutation region (s). If no such restriction sites are present, they must be created using the above-described method for oligonucleotide-mediated mutagenesis to be introduced at the appropriate localization in the DNA. Plasmid DNA is cut linearly at these regions. A double-stranded oligonucleotide encodes the DNA sequence between restriction sites but containing the desired mutation (s) was synthesized using standard procedures in which the two oligonucleotide strands were synthesized separately and then hybridized together using standard technologies. This double stranded oligonucleotide is treated as a cassette. This cartridge is designed to have 5 'and 3' ends that are compatible with the ends of the linear plasmid so that it can be directly ligated to the plasmid. The resulting plasmid contains a mutated DNA sequence.

Наличието на мутация(и) в ДНК е определено посредством добре познати методи в науката, включително рестрикционно генетично картиране и/или получаване на последователност на ДНК. Предпочитан метод за получаване на последователност на ДНК е този на дидезокси верижна терминация на Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72:3918-3921(1979).The presence of mutation (s) in DNA has been determined by well-known methods in the art, including restriction genetic mapping and / or DNA sequencing. A preferred method for obtaining DNA sequencing is the dideoxy chain termination of Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3918-3921 (1979).

ДНК, която кодира вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I е инсертирана в реплициран вектор за по-нататъшно клониране или експресия. “Векторите” са плазмиди или друг вид ДНК, които са способни да реплицират в клетка хазяин и по този начин се използват за извършване на свързване с подходящи клетки гостоприемници (система на вектор-хазяин). Една от функциите е да улеснява клонирането на нуклеиновата киселина, която кодира вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, например да произвежда използваеми количества от нуклеиновата киселина. Другата функция е да насочва експресията на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Една или и двете функции се изпълняват в отделна клетка хазяин, използвана за клониране или експресия. Векторите ще съдържат различни компоненти в зависимост от функцията, която трябва да изпълняват.DNA encoding a variant of human deoxyribonuclease I is inserted into a replicated vector for further cloning or expression. "Vectors" are plasmids or other DNA that are capable of replicating in a host cell and are thus used to bind to suitable host cells (vector host system). One function is to facilitate the cloning of the nucleic acid, which encodes a variant of human deoxyribonuclease I, for example to produce usable amounts of the nucleic acid. The other function is to direct the expression of a variant of human deoxyribonuclease I. One or both functions are performed in a separate host cell used for cloning or expression. Vectors will contain different components depending on the function they need to perform.

За да се реализира производството на вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, експресионеи вектор ще съдържа варианта на кодиращата ДНК, както е описана по-горе, оперативно свързана с промотор и участък, свързване на рибозома. След това вариантът е експресиран директно в рекомбинантна клетъчна култура или съединяване с хетероложен полипептид, за предпочитане сигнална последователност или друг полипептид, имащ специфичен разграждащ участък на свързване между хетероложния полипептид и варианта на природната човешка дезоксирибонуклеаза I.In order to realize the production of a variant of natural human deoxyribonuclease I, the expression vector will comprise the variant of the coding DNA as described above operatively linked to the promoter and the ribosome binding site. The variant is then expressed directly in recombinant cell culture or coupling with a heterologous polypeptide, preferably a signal sequence or other polypeptide having a specific degradation region of binding between the heterologous polypeptide and a variant of natural human deoxyribonuclease I.

Прокариоти (например Е. coli и друга бактерия) са предпочитани клетки гостоприемници за началните стъпки на клониране съгласно изобретението. Те са особено полезни за бързо произвеждане на големи количества ДНК, за получаване на едноверижни матрици на ДНК, използвани за насочена към участък мутагенеза и за секвениране на ДНК на произведения вариант. Прокариотни клетки гостоприемници също могат да бъдат използвани за експресия на вариант на кодиран от ДНК вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I. Полипептидите, които се получават в прокариотни клетки гостоприемници, типично не са гликолизирани.Prokaryotes (eg E. coli and other bacteria) are preferred host cells for the initial cloning steps of the invention. They are particularly useful for the rapid production of large amounts of DNA, for the production of single-stranded DNA matrices used for site-directed mutagenesis and for DNA sequencing of the variant produced. Prokaryotic host cells can also be used to express a DNA-encoded variant of human deoxyribonuclease I. Polypeptides that are produced in prokaryotic host cells are typically not glycosylated.

В допълнение, вариантите на човешката дезоксирибонуклеаза I от представяното изобретение могат да бъдат експресирани в еукариотни клетки гостоприемници, включително еукариотни микроби (например дрожди) или клетки, които са произлезли от животно или друг многоклетъчен организъм (например клетки от яйчник на китайски хамстер и други клетки от бозайник) или в живи животни (например крави, кози, овце и ДР·)·In addition, variants of human deoxyribonuclease I of the present invention may be expressed in host eukaryotic cells, including eukaryotic germs (eg yeast) or cells that have originated from an animal or other multicellular organism (eg Chinese hamster ovary cells and other cells mammal) or in live animals (eg cows, goats, sheep and DR ·) ·

Методологиите за клониране и експресия са добре известни в науката. Примери за прокариотни и еукариотни клетки гостоприемници и експресионни вектори, подходящи за получаване на вариантите на човешката дезоксирибонуклеаза I от представяното изобретение, например могат да служат и тези, които предлага Shak, PST Patent Publication No. WO 90/07572 (published July 12,1990).Methods for cloning and expression are well known in the art. Examples of prokaryotic and eukaryotic host cells and expression vectors suitable for the preparation of the human deoxyribonuclease I variants of the present invention, for example, may be those provided by Shak, PST Patent Publication No. 5, p. WO 90/07572 (published July 12,1990).

Ако прокариотни клетки или клетки, които съдържат субстанциални компоненти на клетъчната стена, са използвани в качеството им на клетки гостоприемници, предпочитаните методи за трансфекция на клетките с ДНК са методът с тре тиране с калций, описан от Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110-2114 (1972) или методът c третиране c полиетилен гликол, описан от Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16:3580-3581 (1988). Ако като клетки гостоприемници се използват дрожди, трансфекция обикновено се извършва с използването на полиетилен гликол, както предлага Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 1929-1933 (1978). Ако като клетки гостоприемници се използват клетки от бозайници, трансфекция обикновено се извършва чрез използването на метод за преципитация с калциев фосфат, както предлага Graham, et al., Virology 52: 546 (1978). Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2: 3-10 (1990). Обаче, и други известни методи за въвеждане на ДНК в прокариотни и еукариотни клетки са подходящи за употреба в това изобретение, например, ядрено инжектиране, електропорация или протоплазмено сливане.If prokaryotic cells or cells containing cell wall substance components are used as host cells, the preferred methods of transfection of cells with DNA are the calcium treatment method described by Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110-2114 (1972) or the polyethylene glycol treatment method described by Chung et al., Nuc. Acids. Really. 16: 3580-3581 (1988). If yeast is used as host cells, transfection is usually performed using polyethylene glycol as suggested by Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 1929-1933 (1978). When mammalian cells are used as host cells, transfection is usually performed using a calcium phosphate precipitation method, as suggested by Graham, et al., Virology 52: 546 (1978). Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2: 3-10 (1990). However, other known methods for introducing DNA into prokaryotic and eukaryotic cells are suitable for use in this invention, for example, nuclear injection, electroporation, or protoplasmic fusion.

Особено приложими в предлаганото изобретение са експресионни вектори, които осигуряват преходна експресия на варианти на ДНК кодираща човешка дезоксирибонуклеаза I в клетки от бозайник. Изобщо, една преходна експресия включва използването на експресионеи вектор, който може да осигури ефикасна репликация в клетка хазяин, така че клетката хазяин да акумулира много копия от експресионния вектор и последователно синтезира високи нива на желан полипептид, кодиран посредством експресионен вектор. Преходна експресионна система, включваща подходящ експресионеи вектор и клетка гостоприемник позволява подходяща позитивна идентификация на полипепдити, кодирани с помощта на клонални дезоксирибонуклеинови киселини, а също така и бърз Wong, et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360 - 4364 (1985); Yang, et al., al., Cell 47: 3 - 10 (1986). По такъв начин, преходните експресионни системи са много подходящи за приложение за експресиране на ДНК кодираните аминокиселинни секвенции на вариантите на природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, във връзка с анализи за идентифициране на тези варианти, които свързват актин с ниска активност в сравнение с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, а също така и за анализи за измерване на тези варианти с активност за хидролизиране на ДНКВариант на човешка дезоксирибонуклеаза 1 е секретиран за предпочитане от клетката гостоприемник, в която е експресиран, в този случай този вариант е възстановен от културална среда, в която са култивирани клетките хазяи. В този случай, може да прораснат клетки в културална среда без серум, тъй като отсъствието на серумни протеини и други серумни компоненти в средата може да улеснява пречистването на варианта. Ако последният не е секретиран, тогава вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I е възстановен от лизати на клетките гостоприемници. Когато вариантът е експресиран в клетка хазяин от бозайник, но не от човек, вариантът ще бъде напълно освободен от белтъци от човешки произход. Във всеки случай, ще бъде необходимо да се пречисти вариантът от рекомбинантни клетъчни белтъци с цел да се добият в субстанционно хомогенизирани приготовления на човешка дезоксирибонуклеаза I. За терапевтични нужди пречистеният вариант с предпочитание ще бъде над 99% чистота (например, всички други белтъци ще съдържат по-малко от 1% от общия протеин в пречистената композиция).Especially useful in the present invention are expression vectors that provide transient expression of variants of DNA encoding human deoxyribonuclease I in mammalian cells. Generally, transient expression involves the use of an expression vector that can provide efficient replication in a host cell such that the host cell accumulates many copies of the expression vector and sequentially synthesizes high levels of the desired polypeptide encoded by the expression vector. A transient expression system including a suitable expression vector and a host cell permits appropriate positive identification of polypeptides encoded by clonal deoxyribonucleic acids, as well as rapid Wong, et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4360 - 4364 (1985); Yang, et al., Al., Cell 47: 3 - 10 (1986). Thus, transient expression systems are well suited for use in expressing DNA-encoded amino acid sequences of natural human deoxyribonuclease 1 variants, in conjunction with assays for identifying those variants that bind low-activity actin compared to natural human deoxyribonucleotide and also for assays for measuring these variants with DNA hydrolysis activity. A variant of human deoxyribonuclease 1 is preferably secreted by a host cell in which expressed, in which case this option is recovered from the culture medium in which cells have been cultured hosts. In this case, cells can grow in a serum-free culture medium, since the absence of serum proteins and other serum components in the medium may facilitate the purification of the variant. If the latter is not secreted, then the human deoxyribonuclease I variant is recovered from the lysates of the host cells. When the variant is expressed in a cell by a mammalian host but not by a human, the variant will be completely released from proteins of human origin. In any case, it will be necessary to purify the recombinant cell protein variant in order to obtain in substantially homogenized preparations of human deoxyribonuclease I. For therapeutic purposes, the purified variant will preferably be above 99% purity (for example, all other proteins will contain less than 1% of total protein in purified composition).

Общо взето, пречистването на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I е осъществено посредством използване на предимството на различни физикохимични качества на варианта, в сравнение с контаминантите, с които той може да бъде асоцииран. Например, като първи етап, културалната среда или лизат на клетката гостоприемник е центрофугирана, за да се отделят клетъчните отломки. Вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I след това е пречистен до контаминантни разтворими протеини и полипептиди, например, чрез преципитация с амониев сулфат или етанол, гелна филтрация (молекулярна ексклузионна хроматография), йоннообменна хроматография, хидрофобна хроматография, имуноафинитетна хроматография (напр.използвайки колона, която съдържа антитела за античовешка дезоксирибонуклеаза I, свързана със Sepharose), катионна обменна хроматография (Frenz, et al., РСТ Patent Publication No WO 1993/025670, published December 23, 1993), ХПЛТ c обърната фаза и/или гелна електрохореза.Generally, the purification of a variant of human deoxyribonuclease I is accomplished by taking advantage of the different physicochemical properties of the variant over the contaminants with which it may be associated. For example, as a first step, the culture medium or host cell lysate is centrifuged to separate the cell debris. A variant of human deoxyribonuclease I is then purified to contaminant soluble proteins and polypeptides, for example, by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, gel filtration (molecular exclusion chromatography), ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydrophobic chromatography, Sepharose-bound anti-human deoxyribonuclease I antibodies, cation exchange chromatography (Frenz, et al., PCT Patent Publication No WO 1993/025670, published December 23, 1993), reverse phase HPLC and / or gel electrode ohoreza.

Разбира се, всеки експериментатор с опит ще прецени, че тези методи за пречистване, които са пригодни за природна човешка дезоксирибонуклеаза 1, може да изискват някои видоизменения, за да се осъществи пречистване на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I, давайки си сметка за структурните и други различия между природния протеин и този на варианта. Например, в някои клетки гостоприемници (особено бактериални клетки хазяи) вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I може да бъде експресирана първоначално в неразтворима, агрегатна форма (известни като “клетъчни включвания” или рефрактилни включвания”), в който случай ще бъде необходимо в процеса на пречистване вариантът на човешка дезоксирибонуклеаза I да бъде разтворен и ренатуриран. Методи за разтваряне и ренатуриране на рекомбинантни протеинови клетъчни включвания са познати, (виж например BuiLder, et al., USA Patent No 4 511 502).Of course, any experienced experimenter will appreciate that these purification methods that are suitable for natural human deoxyribonuclease 1 may require some modification to purge a variant of human deoxyribonuclease I, taking into account structural and other differences between the natural protein and the variant. For example, in some host cells (especially bacterial host cells), the variant human deoxyribonuclease I may initially be expressed in an insoluble, aggregate form (known as "cellular inclusions" or refractive inclusions "), in which case it will be required in the purification process the variant of human deoxyribonuclease I is dissolved and renatured. Methods for dissolving and renaturating recombinant protein cell inclusions are known, (see, for example, BuiLder, et al., USA Patent No. 4 511 502).

В друго изпълнение на представяното изобретение, човешки варианти на дезоксирибонуклеаза 1 са получени посредством направа на ковалентни видоизменения директно в протеин на природна човешка дезоксирибонуклеаза I. Такива модификации са направени, за да въздействуват активното свързване или друго свойство на белтъка (например стабилност, биологичен полуживот, имуногенност) и могат да бъдат реализирани вместо или с прибавяне към аминнокиселинното секвенционно заместване и делеционни мутации, описани по-горе.In another embodiment of the present invention, human variants of deoxyribonuclease 1 are obtained by making covalent modifications directly into a protein of natural human deoxyribonuclease I. Such modifications are made to affect the active binding or other property of the protein (e.g., stability, biological, biological, immunogenicity) and may be realized instead of or by addition to the amino acid sequencing and deletion mutations described above.

Ковалентни видоизменения могат да бъдат въведени чрез реакция на таргетни аминокиселинни остатъци на природна или на вариант на човешка дезоксирибонуклеаза I с органичен деривационен агент, който е способен да реагира с избрани аминокиселинни странични вериги или остатъци с N- или С-терминал. Подходящи деривационни агенти и методи са добре известни в науката.Covalent modifications can be introduced by reacting the targeted amino acid residues of a natural or variant human deoxyribonuclease I with an organic derivative capable of reacting with selected amino acid side chains or N- or C-terminal residues. Suitable derivative agents and methods are well known in the art.

Например, цистеинилни остатъци най-често реагират с α-халоацетати (и кореспондиращи амини), такива като хлороцетна киселина, за да дадат карбоксиметилови или карбоксиамидметилови деривати. Цистеинилни остатъци също са произлезли чрез реакция с: бромтрифлуорацетон, а-бром-3-(5-имидазоил)пропионова киселина, хлорацетилов фосфат, N-алкилмалеимиди, 3нитро-2-пиридилов дисулфид, метил 2-пиридилов дисулфид, р-хлорживачен бензоат, 2-хлорживачен-4-нитрофенол или хлор-7-нитробензо-2-окса1,3-диазол.For example, cysteine residues most often react with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid, to give carboxymethyl or carboxyamidmethyl derivatives. Cysteine residues also arose by reaction with: bromotrifluoroacetone, α-bromo-3- (5-imidazoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, disulfide, 2-chloro-4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa,3,3-diazole.

Хистидиловите остатъци са получени посредством химическа реакция с диетилпирокарбонат при pH 5.5 - 7.0,поради обстоятелството, че този агент е относително специфичен за хистидиловата странична верига. Пара-бромфениловият бромид също е много полезен; реакцията с предпочитание се извършва в 0.1 М натриев какодилат при pH 6.0.Histidyl residues were obtained by chemical reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5 - 7.0, due to the fact that this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromophenyl bromide is also very useful; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0.

Лизинил и амино терминални остатъци влизат в реакция с янтарна киселина или други анхидриди на карбоксилни киселини. Получаването с тези агенти има ефект на обръщане на заряда на лизиниловите остатъци. Други подходящи реагенти за получаване на α-амино съдържащи остатъци включват например метилов пиколинимидат; пиридоксалов фосфат; пиридоксал; хлороборохидрид; тринитробензенсулфонова киселина; О-метилизоуреа; 2,4-пентандион и катализирана от трансаминаза реакция с глиоксилат.Lysinyl and amino terminal residues react with succinic acid or other carboxylic acid anhydrides. The preparation with these agents has the effect of reversing the charge of lysinyl residues. Other suitable reagents for the preparation of α-amino-containing residues include, for example, methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione and transaminase catalyzed reaction with glyoxylate.

Аргинилови остатъци са модифицирани с помощта на химическа реакция с един от няколко конвенционални реагенти, сред които фенилглиоксал , 2,3 бутандион, 1,2-циклохександион и нинхидрин. Получаването на аргининови остатъци изисква химическата реакция да бъде извършена в алкална среда, поради високата рК на гуанидиновата функционална група. Освен това, тези реагенти могат да реагират с групата на лизина също като групата на аргинин епсилон-амино.The arginyl residues have been modified by chemical reaction with one of several conventional reagents, including phenylglyoxal, 2,3 butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. The preparation of arginine residues requires the chemical reaction to be carried out in an alkaline medium due to the high pK of the guanidine functional group. In addition, these reagents can react with the lysine group as well as the arginine epsilon-amino group.

Карбоксилни странични групи (аспартил или глутамил) са селективно видоизменени с помощта на химическа реакция с карбодимиди (R’N=C=N-R’), където R и R’ са различни алкилови групи, например такива като 1-циклохексил-3-( 2морфолинил-4-етил ) карбодимид или 1-етил-З(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодимид. Освен това, остатъци на аспартил и глутамил са превърнати в остатъци на аспарагинил и глутаминил посредством химическа реакция с амониеви йони.Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by chemical reaction with carbodimides (R'N = C = N-R '), where R and R' are different alkyl groups, for example such as 1-cyclohexyl-3- (2morpholinyl-4-ethyl) carbodimide or 1-ethyl-3 (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodimide. In addition, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by chemical reaction with ammonium ions.

Ковалентно чифтосване на гликозиди с аминокиселинни остатъци на протеина може да бъде използвано, за да се видоизмени или увеличи броят или профилът на карбохидратните заместители, особено на или в съседство с тези остатъци, които са включени в свързване на актина. В зависимост от използвания за чифтосване модел, захарта (захарите) може да бъде прикрепена към (а) аргинин и хистидин, (б) свободна карбоксилна група, (в) свободни сулфхидрилни групи като тези на цистенина, (г) свободни хидроксилни групи, такива като тези на серин, треонин или хидроксипролин, (д) ароматни остатъци, такива като тези на фенилаланин, тирозин или триптофан или (е) амидната група на глутамина. Подходящи методи са описани, например в РСТ Patent Publication No WO 1987/05330 (published September 11, 1987, 11, 1987), и от Aplin, et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259 - 306 (1981).Covalent mating of glycosides with amino acid residues of the protein can be used to modify or increase the number or profile of carbohydrate substituents, especially of or adjacent to those residues involved in actin binding. Depending on the mating model used, the sugar (sugars) may be attached to (a) arginine and histidine, (b) a free carboxyl group, (c) free sulfhydryl groups such as cystine, (d) free hydroxyl groups, such such as those of serine, threonine or hydroxyproline, (e) aromatic residues such as those of phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (e) the glutamine amide group. Suitable methods are described, for example, in PCT Patent Publication No. WO 1987/05330 (published September 11, 1987, 11, 1987), and by Aplin, et al., CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259 - 306 (1981).

Ковалентно прикрепване на такива вещества като полиетиленов гликол (ПЕГ) или човешки серумен албумин към варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I може да доведе до редуциране имуногенноста и/или токсичноста на варианта и/или да удължи неговия полуживот, както е било наблюдавано при други белтъци. Abuchowski, et al., J. Biol Chem. 252: 3582-3586 (1977)); Poznansky, et al., FEBS Letters 239:19-22 (1988); Goodson, et al., Biotechnology 8: 343 - 346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209 - 213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Prese, 1992). В допълнение, видоизменение на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или вариант на природна човешка дезоксирибонуклеаза I посредством тези вещества на или в съседство с (например с около пет амииокиселинни остатъци на) аминокиселинен остатък, който въздействува свързване на актин, може да доведе до вариант, който е резистентен на актина.Covalent attachment of such substances as polyethylene glycol (PEG) or human serum albumin to variants of human deoxyribonuclease I may reduce the immunogenicity and / or toxicity of the variant and / or prolong its half-life, as has been observed for other proteins. Abuchowski, et al., J. Biol Chem. 252: 3582-3586 (1977); Poznansky, et al., FEBS Letters 239: 19-22 (1988); Goodson, et al., Biotechnology 8: 343 - 346 (1990); Katre, J. Immunol. 144: 209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Prese, 1992). In addition, modification of natural human deoxyribonuclease I or a variant of natural human deoxyribonuclease I by these substances at or adjacent to (for example, about five amino acid residues) an amino acid residue that acts on actin binding, which may result in actin binding, actin resistant.

В допълнително изпълнение на представяното изобретение вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, може да включва мутация на остатък на аспарагин, който се среща на 74-та позиция на аминокиселинната секвенция на природна човешка дезоксирибонуклеаза I (например N74D, N74K или N74S мутация), за да редуцира или предотврати дезамидирането на вариантът на дезоксирибонуклеазата I. Frenz, et al., РСТ Patent Publocation No, WO 93/25670, published Desember 23, 1993.Като друг пример, вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, може да включва аминокиселинна последователност на мутация или друга ковалентна мутация, които редуцират чувствителността на варианта по отношение на разграждане от ензими протеази (например неутрофилна еластаза), които могат да бъдат открити в храчки или други биологични материали.In a further embodiment of the present invention, a variant that is resistant to actin of human deoxyribonuclease I may include a mutation of an asparagine residue occurring at the 74th position of the amino acid sequence of natural human deoxyribonuclease I (e.g. N74D, N74K or N74D, N74K mutation) to reduce or prevent the deamidation of the deoxyribonuclease variant I. Frenz, et al., PCT Patent Publocation No, WO 93/25670, published Desember 23, 1993. As another example, a variant that is resistant to human actin deoxyribonuclease I, may includes an amino acid sequence of a mutation or other covalent mutation that reduces the sensitivity of the variant to degradation by protease enzymes (eg neutrophil elastase) that may be found in sputum or other biological materials.

Хидролитичната активност за ДНК и активността за свързване на актин на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I получени, както това е описано по-горе, са лесни за детерминиране с помощта на анализи и методи, които са добре известни в науката и описани в тази патентна заявка. Всеки такъв вариант, имащ хидролитичната активност за ДНК и редуциращ активността за свързване на актин (както вече бе дефинирана по-горе) е един вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I в обсега на това изобретение.The hydrolytic activity for DNA and the actin binding activity of variants of human deoxyribonuclease I obtained, as described above, are easy to determine using assays and methods well known in the art and described in this patent application. Any such variant having hydrolytic activity for DNA and reducing actin binding activity (as defined above) is one variant that is resistant to actin of human deoxyribonuclease I within the scope of this invention.

Варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I от предлага ното изобретение, се използват, за да редуцират вискоеластичността на материал, който съдържа ДНК, такъв като храчки, слуз или други белодробни секреции. Такива варианти са особено полезни за лекуването на пациенти с белодробни заболявания, които имат патологичен вискозитет или сгъстени секреции и състояния като остра или хронична форма за бронхиални белодробни заболявания, включително инфекциозна пневмония, бронхити или трахеобронхити, бронхиектазии, кистозна фиброза, бронхиална астма, белодробна туберкулоза и причинени от гъбички инфекции. За терапевтични курсове се прилагат фино разделени сухи препарати на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, които се внедряват във дихателните пътища (напр. бронхите) или белите дробове на пациентите посредством конвенционални способи, например инхалация с аерозоли.Variants that are resistant to the actin resistance of human deoxyribonuclease I of the present invention are used to reduce the viscoelasticity of material containing DNA, such as phlegm, mucus, or other pulmonary secretions. Such variants are particularly useful for the treatment of patients with pulmonary diseases having pathological viscosity or thickened secretions and conditions such as acute or chronic form for bronchial pulmonary diseases, including infectious pneumonia, bronchitis or tracheobronchitis, bronchiectasis, cystic fibrosis, bronchocardial fibrosis and caused by fungal infections. For therapeutic courses, finely divided dry preparations of the human deoxyribonuclease I-resistant actin variant are administered, which are introduced into the airways (eg, bronchi) or the lungs of patients by conventional means, such as aerosol inhalation.

Природна човешка дезоксирибонуклеаза I и нейни варианти, които са резистентни на актина, също могат да бъдат полезни за лечението на системен лупус еритематозус (СЛЕ), застрашаващо живота автоимунно заболяване, което се характеризира с производство на антитела срещу с действие срещу самия организъм. ДНК е първостепенен антигенен компонент на имунния комплекс. В този пример, човешката дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант) може да бъде давана систематично, например посредством вътревенозно, подкожно, вътремускулно приложение на заболелия пациент.Natural human deoxyribonuclease I and its variants that are actin resistant may also be useful for the treatment of systemic lupus erythematosus (SLE), a life-threatening autoimmune disease characterized by the production of antibodies against the body itself. DNA is a major antigenic component of the immune complex. In this example, human deoxyribonuclease I (natural or variant) may be administered systemically, for example, by intravenous, subcutaneous, intramuscular administration to a diseased patient.

Природна човешка дезоксирибонуклеаза 1 и варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I също могат да бъдат полезни за предпазването от ново развитие и/или обостряне на дихателни инфекциозни болести, които могат да се развият при пациенти с кистозна фиброза, хронични бронхити, бронхиална астма, пневмонии или други белодробни заболявания, или при пациенти, чието дишане е подпомагано от вентилираща система или други механични уреди, или при други пациенти с риск да развият респираторни инфекции, например след големи хирургически интервенции или травми.Natural human deoxyribonuclease 1 and variants that are resistant to human deoxyribonuclease I actin may also be useful in preventing new development and / or exacerbation of respiratory infectious diseases that may develop in patients with cystic fibrosis, chronic bronchitis, chronic bronchitis asthma, pneumonia or other pulmonary diseases, or in patients whose breathing is assisted by a ventilation system or other mechanical devices, or in other patients at risk of developing respiratory infections, for example after major my surgery or trauma.

Варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, могат да бъдат формулирани с помощта на известни методи за приготвяне на композиции с терапевтично предназначение. Предпочетена лекарствена форма е разтвор на вариант, който е резистентен на актина в буферен или небуферен воден разтвор, за предпочитане, в изотоничен солеви разтвор като 150 тМ натриев хлорид, съдържащ 1.0 тМ калциев хлорид при pH 7. Тези разтвори са особено приспособими за използване за пълнене на комерсиално-достъпни пулверизатори, включително струйни пулверизатори, ултразвукови пулверизатори, полезни за прилагане направо във въздушните пътища или белите дробове на засегнатите пациенти.Variants that are resistant to human deoxyribonuclease I actin can be formulated using known methods for the preparation of therapeutic compositions. A preferred formulation is a solution of an actin-resistant variant in a buffer or non-buffer aqueous solution, preferably in an isotonic saline solution such as 150 mM sodium chloride containing 1.0 mM calcium chloride at pH 7. These solutions are particularly adaptable for use in filling commercially available nebulizers, including jet nebulizers, ultrasonic nebulizers, useful for administration directly to the airways or lungs of affected patients.

В друго изпълнение на изобретението терапевтичната композиция е под формата на сух прах на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, с предпочитание приготвен за спрей с помощта на разтвор на този вариант, по-специално както е описан в патентна заявка, USA 08/206,020 (filed March 4,1994).In another embodiment of the invention, the therapeutic composition is in the form of a dry powder of an actin-resistant variant of human deoxyribonuclease I, preferably formulated for spray using a solution of this variant, in particular as described in U.S. Patent Application. 08 / 206,020 (filed March 4,1994).

В друго изпълнение на предлаганото изобретение, терапевтичният състав съдържа клетки, които активно произвеждат вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I. Такива клетки могат директно да бъдат въведени в тъканта на пациент или могат да бъдат капсуловани с порьозни мембрани, които се имплантират в пациента и във всички случаи осигуряват проникването на варианта, който е резистентен на актина в тялото на пациента в нарастващи концентрации на хидролитичната активност за ДНК. Например собствените клетки на пациента могат да бъдат трансформирани или in vivo, или ex vivo, с кодиращ ДНК вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I и след това се използват, за да произвеждат дезоксирибонуклеаза I направо в организма на пациента.In another embodiment of the present invention, the therapeutic composition comprises cells that actively produce an actin-resistant variant of human deoxyribonuclease I. Such cells may be directly introduced into the tissue of a patient or may be encapsulated with porous membranes to be implanted in the patient, and in all cases, provide penetration of the actin-resistant variant in the patient's body into increasing concentrations of hydrolytic activity for DNA. For example, the patient's own cells can be transformed either in vivo or ex vivo, with a DNA encoding variant that is resistant to human deoxyribonuclease I actin and then used to produce deoxyribonuclease I directly in the patient's body.

Терапевтично активното количество на вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, ще зависи, например от количествата на ДНК и актина в материала, който ще бъде третиран, от терапевтичната тактика, от пътищата за вкарване в организма и от състоянието на пациента. В съответствие с това, ще бъде необходимо за терапевта да определя дозата и начина на въвеждане в организма, ако иска да получи оптимален терапевтичен ефект.От гледна точка на редуциране на активността за свързване на актин и като последица от това увеличена хидролитичната активност за ДНК в присъствието на актин, съвместим с природна човешка дезоксирибонуклеаза I, количеството на вариант, който е резистентен на актина, за да се постигне терапевтичен ефект, може да бъде по-малко в сравнение с количеството природна човешка дезоксирибо нуклеаза I, необходимо за да се постигне същият ефект при същите условия. Изобщо, терапевтичната ефективна доза на варианта, който е резистентен на актина, ще бъде дозировка от 0.1 pg до около 5 mg от варианта за килограм тегло на пациента, въведени с фармакологични композиции, както вече бе описано по-горе.The therapeutically active amount of a variant that is resistant to human deoxyribonuclease I actin will depend, for example, on the amounts of DNA and actin in the material to be treated, the therapeutic tactics, the routes of administration, and the condition of the patient. Accordingly, it will be necessary for the therapist to determine the dose and route of administration to the body if it is to obtain the optimal therapeutic effect. From the point of view of reducing actin binding activity and, as a consequence, increased hydrolytic activity for DNA in the the presence of actin compatible with natural human deoxyribonuclease I, the amount of an actin-resistant variant to achieve a therapeutic effect may be less than the amount of natural human deoxyribonucleotide aza I required to achieve the same effect under the same conditions. Generally, the therapeutically effective dose of the actin-resistant variant will be a dosage of 0.1 pg to about 5 mg of the variant per kilogram of patient weight administered with the pharmacological compositions as described above.

Вариант, който е резистентен на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, оптимално е комбиниран за употреба съвместно с един или повече фармакологични препарата, които се използват за лечение на болестните състояния, описани вече по-горе, такива като антибиотици, бронходилататори, противовъзпалителни средства, муколитични препарати(например п-ацетил-цистеин), свързващи или разделящи актина протеини (например gelsolin; Matsubara et al., Cell 54: 139-140 (1988): Stossel, et al., PCT Patent Publication No WO 1994/022456 (published October 13,1994), инхибитори на протеаза или продукти за генна терапия (например, включване на генен регулатор на трансмембранната проводимост при кистозна фиброза (CFTR),Riordan, et al., Science 245: 1066-1073 (1989).A variant that is resistant to actin resistance of human deoxyribonuclease I, is optimally combined for use in conjunction with one or more pharmacological agents used to treat the disease conditions described above, such as antibiotics, bronchodilators, anti-inflammatory drugs, mucolytic agents, mucolytic agents preparations (e.g., n-acetyl-cysteine) that bind or separate actin proteins (e.g., gelsolin; Matsubara et al., Cell 54: 139-140 (1988): Stossel, et al., PCT Patent Publication No. WO 1994/022456 (published October 13,1994), protease inhibitors or gene therapy products ( or instance, inclusion of a gene regulator of transmembrane conductance in cystic fibrosis (CFTR), Riordan, et al., Science 245: 1066-1073 (1989).

Следващите примери се предлагат за илюстриране на изобретението и не ограничават способите за изпълнение на изобретението и не ограничават изобретението.The following examples are provided to illustrate the invention and do not limit the methods of carrying out the invention and do not limit the invention.

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention

Пример 1.Example 1.

Мутагенеза на човешка дезоксирибонуклеаза IMutagenesis of human deoxyribonuclease I

CJ 236, щам на Е. coli (BioRad Laboratories, Richmond, California, USA) беше трансформиран c плазмид pRK. дезоксирибонуклеаза. 3 c помощта на метода на Chund et al., (Muc. Acids. Res. 16: 3680 (1988). Плазмидът pRK дезоксирибонуклеаза.З, който е използван за реализирането на представяното изобретение, е като описания в РСТ Patent Publication No. WO 9007572 (published July 12,1990), c изключение на това, че нуклеотидната последователност, която кодира човешка дезоксирибонуклеаза I, е като показаната на Фигура 1. Трансформираните клетки са посети на LB петрита с агар, съдържащи 50 pg carbenicillin и растящи в продължение на една нощ при температура 37°С, бульон 2YT, (5 ml), съдържащ 50 pg carbenicillin и 10ml VCSM13 φaгxeлπep(Stratagene, La Jolla, California,USA)6eme инокулиран на индивидуална колония на петри с агар и последва растеж в продължение на една нощ при температура 37°С с разклащане. Едноверижна ДНК беше изолирана от тази култура и използвана като матрица за последваща мутагенеза.CJ 236, an E. coli strain (BioRad Laboratories, Richmond, California, USA) was transformed with plasmid pRK. deoxyribonuclease. 3 using the method of Chund et al., (Muc. Acids. Res. 16: 3680 (1988). The plasmid pRK deoxyribonuclease. 3, which was used to realize the present invention, is as described in PCT Patent Publication No. WO. 9007572 (published July 12,1990), except that the nucleotide sequence encoding human deoxyribonuclease I is as shown in Figure 1. The transformed cells were seeded on LB agar plates containing 50 pg carbenicillin and growing over overnight at 37 ° C, 2YT broth, (5 ml) containing 50 pg of carbenicillin and 10ml of VCSM13 phage (Stratagene, La Jolla, California, USA) 6eme inox was assayed on an individual colony of agar plates and shaken overnight at 37 ° C. Single stranded DNA was isolated from this culture and used as a template for subsequent mutagenesis.

Насочена към участък мутагенеза беше осъществена с помощта на синтетични олигонуклеотиди, в съответствие с метода на Kunkel, et al. (Meth. Enzimol. 154:367 - 382 (.1987). Мутагенните олигонуклеотиди бяха 21-мери или 24-мери, имащи или точно 9, или 12 бази 5'съвместими към несъвпадащ код и точно 9 бази 3'съвместими към несъвпадащ кодон. Следваща мутагенеза, едноверижна ДНК от индивидуални клонове беше приложена на дидезокси секвениране (Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 748: 5463 - 5467 (1977)). Варианти на ДНК имащи нуклеотидни последователности, след това бяха трансформирани, както бе описано по-горе в щам XL1 Blue MRF’ (Stratagene) на Е. coli. След посявка и изолиране на единична колония, индивидуалните колонии бяха използвани, за да инокулират 0.5 1 LB бульон,съдържащ 50 pg/ml carbenicillin. Последва растеж в продължение на една нощ, при температура 37°С с разклащане. Клетките бяха отделени посредством центрофугиране и вариантът на ДНК (в експресионния вектор) беше пречистен с помощта на колони на Qiagen tip-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, California, USA).Site-directed mutagenesis was accomplished using synthetic oligonucleotides, in accordance with the method of Kunkel, et al. (Meth. Enzimol. 154: 367-382 (.1987). The mutagenic oligonucleotides were 21-mer or 24-mer, having either exactly 9 or 12 bases 5'compatible with a mismatch code and exactly 9 bases 3'compatible with a mismatch codon Subsequent mutagenesis, single stranded DNA from individual clones was applied to dideoxy sequencing (Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 748: 5463-5467 (1977)). DNA variants having nucleotide sequences were then transformed as described above in E. coli strain XL1 Blue MRF '(Stratagene). After single-colony seeding and isolation, individual colonies were used to inoculate 0.5 1 LB broth containing 50 pg / ml carbenicillin, followed by overnight growth at 37 ° C with shaking, the cells were separated by centrifugation and the DNA variant (in the expression vector) was purified using on Qiagen tip-500 columns (Qiagen Inc., Chatsworth, California, USA).

Ha фигурите от 2 до 6 се идентифицират различните варианти на човешка дезоксирибонуклеаза I,които бяха направени. Във фигурите и в спецификацията, описанието на аминокиселинната заместваща мутация(и), присъстващи във варианта на дезоксирибонуклеаза I съкратено, като се използва за обозначение първа буква, номер и втора буква. Първата буква е обозначение на аминокиселинния остатък в природна (див вид) човешка зряла дезоксирибонуклеаза I, номерът означава позицията на този остатък в природна човешка зряла дезоксирибонуклеаза I (номериране, както е показано на фигара 1) и втората буква е еднозначна абревиатура на аминокиселинния остатък на тази позиция във варианта на дезоксирибонуклеаза I. Например, във варианта на дезоксирибонуклеаза I, имаща мутация D53R, остатък на аспаргинова киселина (D) на 53 позиция в природна човешка зряла дезоксирибонуклеаза I е била изместена от аргининов (R) остатък. Многократни мутации в единичен вариант са обозначени по подобен начин, с двоеточие (:), разделящо всяка една от различните мутации, които са представени във варианта. Например, обозначе нието D53R:Y65A означава, че вариантът има мутация D53R и мутация Y65A.Figures 2 to 6 identify the various variants of human deoxyribonuclease I that have been made. In the figures and in the specification, the description of the amino acid replacement mutation (s) present in the deoxyribonuclease I variant is abbreviated, using the first letter, number and second letter to denote. The first letter denotes the amino acid residue in natural (wild) human mature deoxyribonuclease I, the number indicates the position of that residue in natural human mature deoxyribonuclease I (numbering as shown in figure 1), and the second letter is the unambiguous abbreviation this position in the deoxyribonuclease variant I. For example, in the deoxyribonuclease I variant having the D53R mutation, the aspartic acid residue (D) at the 53 position in natural human mature deoxyribonuclease I has been displaced by an arginine (R) residue. Multiple mutations in a single variant are referred to in a similar manner, with a colon (:) separating each of the different mutations represented in the variant. For example, the designation D53R: Y65A means that the variant has a D53R mutation and a Y65A mutation.

Пример 2.Example 2.

Експресия на варианти на човешка дезоксирибонуклеаза IExpression of human deoxyribonuclease I variants

293 клетки от човешки ембрионален бъбрек (АТСС CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) бяха посети за растеж в серум, съдържащ среда в 150 mm пластмасови панички на Петри. Клетки в Log фаза бяха краткотрайно котрансфектирани с 22.5 g пречистен ДНК вариант (приготвен според описанието от по-горе) и 17pg ДНК от аденовирус с помощта на метода с преципитация с калциев фосфат (Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech.2:310(1990)). Приблизително 16 h след трансфекцията, клетките бяха промити с 15 ml на солеви буферен фосфат и средата беше сменена със среда без серум. Две реколти от клетъчни култури бяха взети от всяка паничка, първата или на 24-ия или на 72-ия h и последната на 96-ия h, последвано от смяна на серума без среда. Общо приблизително 50 ml от супернатант от клетъчна култура, съдържащ варианта на дезоксирибонуклеаза 1 бяха добити по този начин. Депо от супернатант, събран от всяко петри, беше концентриран от 5 до 50 пъти с помощта на концентратор Centripep 10 и концентратите са подложени на анализи, за да определят различни биохимични и биологични активности на вариантите на дезоксирибонуклеаза I.293 human embryonic kidney cells (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) were visited for growth in serum containing medium in 150 mm Petri dishes. Log phase cells were briefly cotransfected with 22.5 g of purified DNA variant (prepared as described above) and 17pg of adenovirus DNA using the calcium phosphate precipitation method (Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2: 310 (1990). Approximately 16 h after transfection, cells were washed with 15 ml of saline buffer phosphate and the medium was changed to serum-free medium. Two harvests of cell cultures were taken from each plate, the first either on the 24th or 72nd hour and the last on the 96th hour, followed by serum change without medium. A total of approximately 50 ml of cell culture supernatant containing the deoxyribonuclease variant 1 was thus obtained. The supernatant depot collected from each plate was concentrated 5 to 50 times using a Centripep 10 concentrator and the concentrates were assayed to determine the various biochemical and biological activities of the deoxyribonuclease I. variants.

Концентрат, съдържащ природна човешка дезоксирибонуклеаза I, е приготвен посредством същата процедура, като описаната по-горе, с изключение на това, че 293-те клетки бяха за кратко време трансфектирани с плазмид pRK. дезоксирибонуклеаза. 3.Concentrate containing natural human deoxyribonuclease I was prepared by the same procedure as described above, except that the 293 cells were transfected with plasmid pRK for a short time. deoxyribonuclease. 3.

Пример 3. Биохимични и биологични активности на варианти на дезоксирибонуклеаза I.Example 3. Biochemical and biological activities of deoxyribonuclease I. variants

I. Относителна специфична активностI. Relative specific activity

Относителната специфична активност на варианти на дезоксирибонуклеаза I бяха анализирани посредством сравняване на активността на варианта с тази на природна човешка дезоксирибонуклеаза I с два различни анализа. В частност, относителната специфична активност на вариантите е дефинирана, като концентрацията на варианта (вариантите), детерминирана с анализа за активност с метилово зелено (Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41 - 53 (1950), разделена на концентрацията на варианта (в pg/ml), детерминирана с анализа ELISA 1 дезоксирибонуклеаза I (описан по-долу). В двата анализа, анализа за активност с метилово зелено и анализа ELISA дезоксирибонуклеаза I, стандартните криви бяха определени с помощта на Pulmozyme човешка дезоксирибонуклеаза I. Относителната специфична активност на природна човешка дезоксирибонуклеаза I и на варианти на дезоксирибонуклеаза I бяха показани на фигури 2а - г.The relative specific activity of variants of deoxyribonuclease I was analyzed by comparing the activity of the variant with that of natural human deoxyribonuclease I with two different assays. In particular, the relative specific activity of variants is defined as the concentration of variant (s) determined by the methyl green activity assay (Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222: 351-358 (1994); Kumick, Arch Biochem. 29:41 - 53 (1950) divided by the variant concentration (in pg / ml) determined by ELISA 1 deoxyribonuclease I assay (described below) In both assays, methyl green activity assay and assay. ELISAs, standard curves were determined using Pulmozyme human deoxyribonuclease I. The relative specificity of activity of natural human deoxyribonuclease I and variants of deoxyribonuclease I were shown in Figures 2a - g.

Анализът за активност с метилово зелено (Sinicropi, et al., Anal. Biochem.222:351 - 358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41 - 53 (1950), използва метилово зелено багрило, което вмъква приблизително всяка 10 база в ДНК, в резултат на което се получава зелен субстрат. Тъй като ДНК е разцепена от дезоксирибонуклеаза I, метилово зеленото багрило се освобождава и се окислява до безцветна форма. Така, загубата на зелен цвят е пропорционална на количеството на дезоксирибонуклеаза I, прибавено към анализираната проба. Количеството дезоксирибонуклеаза I, което е в наличност в анализа, след това се определя количествено, посредством сравняване със стандартна крива, която е приготвена с помощта на анализирани известни предварително количества от дезоксирибонуклеаза I.Activity analysis with methyl green (Sinicropi, et al., Anal. Biochem.222: 351 - 358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41 - 53 (1950), uses methyl green dye, which inserts approximately every 10 DNA base resulting in a green substrate As DNA is cleaved by deoxyribonuclease I, the methyl green dye is released and oxidized to a colorless form, thus the loss of green color is proportional to the amount of deoxyribonuclease I added. The amount of deoxyribonuclease I available in the assay a is quantified by comparison with a standard curve that has been prepared using analyzed previously known amounts of deoxyribonuclease I.

Анализът ELISA дезоксирибонуклеаза I включва наслоени микротитърни панички с кози анти-дезоксирибонуклеаза I поликлонални антитела, прибавени към пробата, която ще се изследва, и намиране на всяка получена свързана дезоксирибонуклеаза I със заешко антидезоксирибонуклеаза I поликлонално антитяло, което е конюгирано към пероксидаза от хрян. Когато се прибавят субстрат на пероксидаза от хрян и цветно проявяващ се реагент, цветното проявяване е пропорционално на количеството дезоксирибонуклеаза I, присъствуващо в пробата. Количеството дезоксирибонуклеаза I, присъствуващо в пробата, след това се сравнява със стандартната крива, която е приготвена с помощта на анализирани известни предварително количества от дезоксирибонуклеаза I.The deoxyribonuclease I ELISA assay includes layered microtiter plates with goat anti-deoxyribonuclease I polyclonal antibodies added to the sample to be tested and finding any resulting associated deoxyribonuclease I with rabbit antideoxyribonucleotide chlorothiocyanochlorothioxyl ketone. When horseradish peroxidase substrate and color-developing reagent are added, the color expression is proportional to the amount of deoxyribonuclease I present in the sample. The amount of deoxyribonuclease I present in the sample is then compared to the standard curve, which is prepared using previously known amounts of deoxyribonuclease I.

В двата описани анализа бяха изследвани многократно разрежданията на пробите и тези стойности, които попаднаха в средната област на стандартната крива, бяха осреднени и след това бяха изчислени средните стандартни отклонения.In the two analyzes described above, the dilutions of the samples were repeatedly examined, and those values that fell in the median area of the standard curve were averaged and then the mean standard deviations were calculated.

Също така, беше използвана стандартна концентрация на дезоксирибонуклеаза I, както бе определена с анализа ELISA дезоксирибонуклеаза I, за стандартизиране на концентрации на дезоксирибонуклеаза I в други анализи, в които ва рианти на дезоксирибонуклеаза I бяха характеризирани (например в анализ за определяне на инхибиция чрез актин, описан по-долу) за хидролитичната активност за ДНК.Also, a standard concentration of deoxyribonuclease I, as determined by ELISA deoxyribonuclease I, was used to standardize concentrations of deoxyribonuclease I in other assays in which variants of deoxyribonuclease I were characterized (for example, in an assay to determine inhibition described below) for hydrolytic activity for DNA.

И. Инхибиция на актин от хидролитичната активност на дезоксирибонуклеаза II. Inhibition of actin by the hydrolytic activity of deoxyribonuclease I

Беше приготвен G-актин (Kabash, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992) посредством диализиране в продължение на една нощ на 1 mg/ml разтвор на актин (осигурени чрез закупуване от фирмата SIGMA, St.Louis, Missuri, USA) през 5 mM HEPES, pH 7.2,0.2 mM CaCl, 0.5 mM ATP (аденозинтрифосфат), 0.5 mM β-меркаптоетанол при 4°C. След центрофугиране при 13000 x g продължение на 5 min, количеството G-актин беше определено посредством измерване на поглъщането на светлината при дължина на вълната 290 nm; 1 ml разтвор има поглъщане от 0.66 CD. Количеството на получения Gактин, за който се изисква в голяма степен (>50% инхибиране), но пълна инхибиция на хидролитичната активност на ДНК на природна човешка дезоксирибонуклеаза I, беше определено в предварителни експерименти при същите условия, използвани за всеки анализ. Чувствителността по отношение на инхибиране на актин бе преценена чрез измерване на хидролитичната активност на вариантите в присъствие или отсъствие на актин в единия от два различни анализа, анализа с метилово зелено, вече описан по-горе, и хиперхроматичен анализ, който се основава на увеличаване на поглъщането на светлината при дължина на вълната 260 пт при денатурация и деполимеризация на ДНК (Kunitz, et al., J.Gen.Physiol. 33: 349 -362 (1950); Kunitz et al., J. Gen. Physiol. 33: 363 377 (1950)). Процентът на инхибиция на избраните варианти в тези анализи е демонстриран във фигури 3 и фигури 4.G-actin was prepared (Kabash, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21: 49-76 (1992) by dialysis overnight of 1 mg / ml actin solution (provided by purchase from company SIGMA, St. Louis, Missouri, USA) over 5 mM HEPES, pH 7.2,0.2 mM CaCl, 0.5 mM ATP (adenosine triphosphate), 0.5 mM β-mercaptoethanol at 4 ° C. After centrifugation at 13000 xg for 5 min. the amount of G-actin was determined by measuring the light absorption at a wavelength of 290 nm; 1 ml of solution had an absorption of 0.66 CD The amount of Gactin obtained which is highly required (> 50% inhibition ane), but complete inhibition of the hydrolytic activity of the DNA of natural human deoxyribonuclease I was determined in preliminary experiments under the same conditions used for each assay. The sensitivity to actin inhibition was assessed by measuring the hydrolytic activity of the variants in the presence of or the absence of actin in one of two different assays, the methyl green assay already described above, and the hyperchromatic assay based on increasing the light absorption at wavelength s 260 nm upon denaturation and depolymerization of DNA (Kunitz, et al., J.Gen.Physiol. 33: 349 -362 (1950); Kunitz et al., J. Gen. Physiol. 33: 363 377 (1950). The percent inhibition of the variants selected in these assays is demonstrated in Figures 3 and 4.

При хиперхроматичния анализ концентрирани супернатанти от култури (получени според описанието от по-горе, съдържащи варианти на дезоксирибонуклеаза I) бяха инкубирани или без прибавен или с 2- до 3-кратен моларен излишък на актин в буфер А (25 mM HEPES, pH 7.5,4 тМ CaCl, 4 тМ MgCl, В S А) за 1 h при стайна температура, преди да бъдат прибавени в кювета, която съдържа 40 pg ДНК в общ обем от 1.0 ml. Финалната концентрация на вариант на дезоксирибонуклеаза I в анализа беше приблизително 26 пМ, както бе определено посредством дезоксирибонуклеаза IILISA. Бяха измерени степените на хидролизата на ДНК от вариантите на дезоксирибо нуклеаза I в присъствието или в отсъствието на актин. Процентът на активност, изобразен на фигура 3 и фигура 4 бяха изчислени посредством определяне на пропорцията на хидролитичната активност за ДНК на човешка (природна или вариант) дезоксирибонуклеаза I в присъствието на актин към нейната хидролитична активност за ДНК в отсъствието на актин и умножено по 100.In the hyperchromatic analysis, concentrated culture supernatants (prepared as described above containing variants of deoxyribonuclease I) were incubated either without or with 2- or 3-fold molar excess of actin in buffer A (25 mM HEPES, pH 7.5, 4 mM CaCl, 4 mM MgCl, B S A) for 1 h at room temperature before being added to a cuvette containing 40 µg of DNA in a total volume of 1.0 ml. The final concentration of the deoxyribonuclease I variant in the assay was approximately 26 nM as determined by deoxyribonuclease IILISA. The extent of DNA hydrolysis of the deoxyribo nuclease I variants in the presence or absence of actin was measured. The percentages of activity depicted in Figure 3 and Figure 4 were calculated by determining the proportion of hydrolytic activity for DNA of human (natural or variant) deoxyribonuclease I in the presence of actin to its hydrolytic activity for DNA in the absence of actin and multiplied by 100.

При анализа с метилово зелено концентрирани супернатанти от култури (получени според описанието от по-горе, съдържащи варианти на дезоксирибонуклеаза I) бяха инкубирани или без прибавен или с 1000-кратен моларен излишък на актин в буфер в (25 mM HEPES, pH 7.5,4 тМ СаС1₂4 тМ MgCl, 0.1% В S А, 0.01% thimerosal и 0.05% Tween 20) за 16 h при температура 37°С. Концентрацията на активен ензим във всеки отделен случай бе определена чрез сравняване със стандартната крива на Pulmozyme. “Процентната активност”, оставаща на варианта, се отнася 100 пъти към пропорцията на активността в присъствието на актин към пропорцията на активността в отсъствието на актин.In the assay with methyl green concentrated culture supernatants (prepared as described above containing variants of deoxyribonuclease I) were incubated either without or with 1000-fold molar excess of actin in buffer (25 mM HEPES, pH 7.5,4 mM CaCl ₂ 4 mM MgCl, 0.1% B S A, 0.01% thimerosal and 0.05% Tween 20) for 16 h at 37 ° C. The concentration of active enzyme in each case was determined by comparison with the standard Pulmozyme curve. The "percent activity" remaining in the variant refers 100 times to the proportion of activity in the presence of actin to the proportion of activity in the absence of actin.

Както е показано на фигури 3 и фигури 4, хидролитичната активност за ДНК на природна човешка дезоксирибонуклеза I е съществено редуцирана в присъствието на актин. Посредством сравняване, различни варианти на природна човешка дезоксирибонуклеаза I с единични- и множествени остатъци са относително резистентни по отношение на инхибиция с актин, както е показано чрез тяхната по-висока хидролитичната активност за ДНК в присъствие на актин, отколкото е човешка дезоксирибонуклеаза I.As shown in Figures 3 and Figures 4, the hydrolytic activity for the DNA of natural human deoxyribonuclease I is substantially reduced in the presence of actin. By comparison, different variants of natural human deoxyribonuclease I with single and multiple residues are relatively resistant to inhibition by actin, as shown by their higher hydrolytic activity for DNA in the presence of actin than is human deoxyribonuclease I.

111. EL1SA със свързване на актин111. EL1SA with actin binding

Анализ, основан на микротитруване, беше използван за измерване на свързването на човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти на дезоксирибонуклеаза I с имобилизиран актин. Първо, гнездата на плочката на MaxiSorp (Nunc, Inc., Naperville, IIIinoise.USA) бяха покрити c по 100 ml на гнездо от човешки GC глобулин (Calbiochem, La Jolla, California, USA), актин свързващ белтък (Goldschmidt-Clermont, et al., Biochem. J. 228:471 477 (1985, McLeod, et al., J.Biol. Chem. 264:1260 1267 (1989), Houmeida, et al., Eur. J. Biochem. 203:499503 (1992), при концентрация от 10 pg/ml в (25 mM HEPES, pH 7.2,4 mM CaCl₂,4 mM MgCl₂,0.1 %. при 4° в продължение на 16 - 24 h. След отхвърляне на GC-глобулин, излишните реактивни участъци бяха блокирани чрез прибавяне на 200 ml на гнездо от буфер С буфер (буфер С е всъщност буфер В, с прибавени 0.5 mM аденозинтрифосфат; буферът С беше използван като разредител във всички последващи етапи, освен изписаните по различен начин) и инкубиране на паничките върху шейкър за 1 - 2 h при стайна температура. Всеки инкубационен етап, който следваше, беше проведен при стайна температура за 1 h с помощта на MiniOrbital Shaker (Belco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA); между всеки от етапите, паничката беше изпразвана и промивана 6-кратно със солев фосфатен буфер, съдържащ 0.05% Tween с Microwash II plate washer (Skatron A/S, Norway). След това G-актин, получен според гореспоменато описание, беше разреден с 50 pg/ml в буфер Си 100 ml бяха прибавени към всяко гнездо; паничките бяха инкубирани и промити и 100 ml от различни разреждания на Pulmozyne и среда на клетъчна култура, съдържаща или природна човешка дезоксирибонуклеаза I или нейни варианти бяха прибавени към гнездата и паничките бяха инкубирани и промити. Накрая, 100 ml с разреждане 1/25000 от конюгат на пероксидаза от хрян и античовешка дезоксирибонуклеаза 1 заешки поликлонални антитела (оригиналната концентрация на запаса беше 465 pg/ml) също бяха прибавени. След инкубиране и промиване, беше дарено началото на промяната на цвета чрез прибавяне на 100 ml на всяко гнездо от специален за тази цел реагент (Sigma Fast о-фениленедиамин и уреа/ Н₂О таблетки, разтваряни според препоръките на фирмата производител) и преустановено чрез прибавяне на 100 ml за гнездо 4,5 NH₂SO₄. Поглъщането при дължина на вълната от 492 nm беше записано и нанесено с помощта на плотер срещу концентрацията на дезоксирибонуклеаза I, прибавена оригинално към гнездото. Бяха получени сигмоидалните криви, за природна човешка дезоксирибонуклеаза I и за тези варианти, които са свързани с актин; тези криви бяха нагласени за четири параметъра с помощта на нелинеен регресионен анализ (Marquardt, J. Soc. Indust.Appl. Math. 11:431 - 441 (1963); концентрацията на всяка дезоксирибонуклеаза I (природна или вариант), изискваща да дава половината от максималния сигнал в анализа, беше изчислена от кривите и беше записана като стойност ЕС50. Беше прието, че молекулната маса на природната човешка дезоксирибонуклеаза I е 37000 Далтона.Microtiter based analysis was used to measure the binding of human deoxyribonuclease I and variants of deoxyribonuclease I to immobilized actin. First, the wells of the MaxiSorp plate (Nunc, Inc., Naperville, IIIinoise.USA) were coated with 100 ml per well of human GC globulin (Calbiochem, La Jolla, California, USA), an actin binding protein (Goldschmidt-Clermont, et al., Biochem. J. 228: 471 477 (1985, McLeod, et al., J. Biol. Chem. 264: 1260 1267 (1989), Houmeida, et al., Eur. J. Biochem. 203: 499503 (1992), at a concentration of 10 pg / ml in (25 mM HEPES, pH 7.2.4 mM CaCl ₂ , 4 mM MgCl ₂ , 0.1% at 4 ° for 16-24 h. After GC-globulin rejection , excess reactive sites were blocked by adding 200 ml per well of buffer C buffer (buffer C is actually buffer B, with 0.5 mM adenosine triphosphate added; buffer C was used as a buffer. o diluent in all subsequent stages, except otherwise indicated) and incubation of the plates on a shaker for 1 - 2 h at room temperature Each subsequent incubation step was carried out at room temperature for 1 h using a MiniOrbital Shaker (Belco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA); between each of the steps, the plate was emptied and washed 6 times with saline phosphate buffer containing 0.05% Tween with a Microwash II plate washer (Skatron A / S, Norway). G-actin, prepared as described above, was then diluted with 50 µg / ml in C buffer. 100 ml were added to each well; the plates were incubated and washed and 100 ml of different dilutions of Pulmozyne and cell culture medium containing either natural human deoxyribonuclease I or variants thereof were added to the wells and the plates were incubated and washed. Finally, 100 ml with a 1/25000 dilution of horseradish peroxidase conjugate and anti-human deoxyribonuclease 1 rabbit polyclonal antibodies (original stock concentration was 465 pg / ml) were also added. After incubation and washing, the onset of discoloration was added by adding 100 ml to each well of a special reagent (Sigma Fast o-phenylenediamine and urea / H ₂ O tablets reconstituted as recommended by the manufacturer) and discontinued by adding 100 ml per well 4.5 NH ₂ SO ₄ . An absorbance at 492 nm was recorded and plotted against a concentration of deoxyribonuclease I originally added to the well. Sigmoidal curves were obtained for natural human deoxyribonuclease I and for those actin-bound variants; these curves were adjusted for four parameters using a nonlinear regression analysis (Marquardt, J. Soc. Indust.Appl. Math. 11: 431 - 441 (1963); the concentration of each deoxyribonuclease I (natural or variant) requiring half to yield of the maximum signal in the assay was calculated from the curves and recorded as EC 50. It was assumed that the molecular weight of natural human deoxyribonuclease I was 37,000 Daltons.

Относителната свързваща активност на всяка човешка дезоксирибонуклеза I беше изчислена чрез разделяне на стойността на ЕС50 със стойността на ЕС 50 на природна човешка дезок сирибонуклеаза I получена с метода ILISA, а резултатите са показани на фигури 5 а - г. Например, ако относителната свързваща активност на варианта на човешката дезоксирибонуклеаза I беше изчислена на 5, тази стойност ще показва, че стойността на ЕС50 на този вариант е 5 - кратно по-голяма, в сравнение със стойността на ЕС50 на природна човешка дезоксирибонуклеаза I или с други думи, че вариантът има афинитет по отношение на актин, който е 5 пъти по-малък от афинитета на природна човешка дезоксирибонуклеаза I по отношение на актин в този ELISA анализ.The relative binding activity of each human deoxyribonuclease I was calculated by dividing the EC50 value by the EC 50 value of natural human deoxyribonuclease I obtained by the ILISA method, and the results are shown in Figures 5 a - g. For example, if the relative binding activity of the human deoxyribonuclease I variant was calculated to be 5, this value will indicate that the EC50 value of this variant is 5 times higher than the EC50 natural human deoxyribonuclease I value or in other words That the variant has an affinity with respect to actin that is 5-fold less than the affinity of native human DNase I with respect to actin in this ELISA assay.

III. Анализи на плътността на материали от храчкиIII. Density analysis of phlegm materials

Анализ на плътността на материали от храчки (РСТ Publication No WO 1994/010567, published May 11, 1994,) беше използван за измерване на относителната вискоеластичност на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза, преди и след инкубация с природна човешка дезоксирибонуклеаза I и различни варианти на дезоксирибонуклеаза I. След смесване на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза с проба от дезоксирибонуклеаза I и инкубиране за 20 min при стайна температура полутвърдите разтвори бяха въведени в капилярни туби, които след това бяха центрофугирани при 12000 об/min, в продължение на 20min. След центрофугирането, беше измерено теглото на гранулата и сравнено с теглото на разтвора плюс гранулата. Тези измервания след това бяха използвани, за да бъде изчислен процентът на плътност (компактност) на храчките, който корелира с високоеластичността на храчката.Density analysis of phlegm materials (PCT Publication No WO 1994/010567, published May 11, 1994,) was used to measure the relative viscoelasticity of phlegm from patients with cystic fibrosis before and after incubation with natural human deoxyribonuclease I and various variants of deoxyribonuclease I. After mixing of phlegm from patients suffering from cystic fibrosis with a sample of deoxyribonuclease I and incubating for 20 min at room temperature, the semi-solid solutions were introduced into capillary tubes, which were then centrifuged at 12,000 rpm, in for 20min. After centrifugation, the weight of the granule was measured and compared with the weight of the solution plus the granule. These measurements were then used to calculate the percentage of phlegm density, which correlates with the high elasticity of the phlegm.

Процентът на компактност, определен при третирането на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза с природна човешка дезоксирибонуклеаза I и варианти, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, е показан на фигура 6. Тези резултати показват, че вариантите, които са резистентни на актина на човешка дезоксирибонуклеаза I, са по- ефикасни от природна човешка дезоксирибонуклеаза I за намаляването на вискоеластичността на храчки от пациенти, болни от кистозна фиброза.The percentage of compactness determined in the treatment of phlegm by patients suffering from cystic fibrosis with natural human deoxyribonuclease I and variants that are resistant to human deoxyribonuclease I actin is shown in Figure 6. These results indicate that the variants that are resistant of human deoxyribonuclease I actin, are more effective than natural human deoxyribonuclease I in reducing the viscoelasticity of phlegm from patients with cystic fibrosis.

Claims

1. Actin-resistant human deoxyribonuclease I variants, characterized in that they include at least one amino acid selenium substitution at position Ser68, Pro70, Ser94 Tu96.

Human deoxyribonuclease I variants according to claim 1, characterized in that the amino acid substitutions are selected from the group consisting of H44Q, L45C, L45K, L45R, V48K, V48R, G491, G49K, G49R, G49Y, L52K L52M, L52N, L52R, D53L, D53M, N56R, Y65K, Y65M, Y65S, Y65P, V66N, V67D, V67H, V67M, V67P, V67R, V67S, S68K, S68R, S68M, E69A, A114E, Al 14G, Al 14H, Al 14K, Al 14L, Al 14M, Al 14Q, A114R, A114Wh A114Y.

Human deoxyribonuclease I variants according to claim 2, characterized in that they include at least one amino acid substitution in the group consisting of: V48, G49I, G49R, D53M, N56R, V66N, Al 14G and A114H.

Human deoxyribonuclease I variants according to claim 2, characterized in that they include at least one amino acid substitution from the group consisting of: G49R, A114GhA114H.

5. Human deoxyribonuclease I variants, characterized in that they include at least one amino acid substitution from the group consisting of: Y65N: V67T, V67M: E69T, S68N: P70T and S94N: Y96T.

Human deoxyribonuclease I variants according to claim 5, characterized in that they include at least one amino acid substitution from the group consisting of: Y65N: Y67T and S94N: Y96T.

Variants of human deoxyribonuclease I according to any one of claims 1 to 6, characterized in that they have at least 90% identity to the amino acid sequence of native human deoxyribonuclease I, as shown in FIG. 1.

8. Human deoxyribonuclease I variants according to any one of claims 1 to 6, characterized in that they have at least 95% identity to the amino acid sequence of native human deoxyribonuclease I, as shown in FIG. 1.

9. Use of human deoxyribonuclease I variants for the manufacture of a medicament for reducing the viscoelasticity of DNA containing material.