BG61040B1

BG61040B1 - Метод за получаване на пречистени лизозимни димери

Info

Publication number: BG61040B1
Application number: BG96578A
Authority: BG
Inventors: Peter Herrmann; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 1996-09-30
Also published as: KR0158216B1; JP2732514B2; CA2073351C; EP0509984B1; LT3422B; RO114805B1; NO302484B1; BR9007971A; LV10119B; BG96578A; HU9202250D0; NO922626L; HUT65931A; WO1991010731A1; DE69032375T2; LV10119A; HU214509B; MC2242A1; CA2073351A1; LTIP594A

Abstract

Лизозимният димерен продукт е с високи чистота и добив, подходящ за лечение на вирусни и бактериални болести и не причинява цитотоксични ефекти, дължащи се на мономерната форма. По метода лизозимният разтвор се получава чрез добавяне на мономерен лизозим към буферен разтвор при pH 9. Лизозимният мономер в разтвора се димеризира със суперимидатен свързващ реагент, като pH се поддържа най-малко 9, като в определен момент процесът спира чрез понижаване на pH до 7 с добавяне на киселина. Лизозимният димерен продукт се пречиства най-малко чрез двукратна гелна хроматография, включваща етап на елуиране през колона с агарозен пълнеж, събиране на фракциите, съдържащи главно димерната форма на лизозима, и подлагане на тези фракции поне на още един етап на елуиране през колона с декстранов пълнеж.

Description

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се отнася до метод да получаване и пречистване на лизозимен димер, който е особено полезен при лечението на вирусни и бактериални инфекции.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ

Постоянно нарастващият брой бактериални щамове и вирусни заболявания, които са резистентни към антибиотици, налага въвеждането на нови видове лекарства за лечението на хора и животни. Сред многото съвременни лечения и използвани медикаменти е известно прилагането на ензими в мономерна форма, с цел облекчаване състоянието на пациенти, страдащи от различни заболявания. Ензимите са каталитично активни белтъци, които изпълняват почти всички главни жизнени процеси в организмите. Така много ензими, било индивидуално или в определени комбинации, са изолирани заради техните физикохимични, физиологични или биологични ефекти.

Сред разнообразните ензими, за които определени терапевтични ефекти са документирани, в настоящия момент е известно, че лизозим, който е известно от 1922 г., може да се използва при различни физиологични и биологични лечения. Установено е, че лизозимът има различни терапевтични свойства, като например антивирусно, антибактериално, противовъзпалително и антихистаминово действие. Антибактериалният ефект на лизозима, изглежда, се базира на хидролизата на бета-1-4-гликозидната връзка между н-ацетилмураминова киселина и н-ацетилглюкозамин, и двеста съдържащи се в бактериалната стена.

За съжаление, огромният потенциал от възможности, свързани с благоприятния ефект при използване на лизозим, не е използван, преди всичко в резултат на наблюдаван цитотоксичен ефект на мономерната форма на този ензим. Например в опитите в култивирани фибробласти се наблюдава цитотоксичен ефект при прилагане на лизозим в мономерна форма дори в много малки количества. Ето защо е необходимо да се намери начин за максимално използване на потенциалните благоприятни ефекти, които могат да бъдат получени от лизозим чрез откриване на ефективен начин за контролиране на цитотоксичните ефекти, свързани с мономера.

Напоследък се установи, че антивирус5 ни или антибактериални състави, които не показват цитотоксични ефекти, могат да съдържат лизозим, ако се приготвя състав, основан на димерната форма на ензима. Използването на лизозим в димерна форма води до получа10 ване на състав, полезен при лечението на редица инфекциозни заболявания, който не показва високите цитотоксични ефекти, обикновено свързани с лизозимния мономер. Използването на лизозимен димер при раз15 лични лечения е разкрито във висяща международна заявка за патент № PCT/US 88/01785.

Въпреки че са известни методи за получаване на димерната форма на лизозима от нейната мономерна форма, сега се налага про20 изводството на големи количества от димерната форма по икономически изгоден и ефикасен начин. Поради това е желателно да се развие система за произвеждане и изследване на големи количества пречистен лизозимен димер, който не съдържа мономерна или мултимерна форма на този ензим или други примеси.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Методът за получаване на пречистен лизозимен димер съгласно изобретението включва етапи на:

а) получаване на лизозимен разтвор чрез добавяне на мономерен лизозим към буферен разтвор и установяване на желаната стойност на pH;

б) добавяне на суберимидатен свързващ реагент за димеризиране на лизозимните мономери в лизозимния разтвор, като pH се поддържа при желаната стойност;

в) спиране на димеризацията в определен момент;

г) пречистване на разтвора на димеризиралия лизозим чрез гелна хроматография;

д) събиране на фракциите, които съдържат по същество димерната форма на лизозима, като pH в етап а) се довежда най-малко до 9 и в етап б) се поддържа също най-малко 9, след което димеризацията в етап в) се спира чрез понижаване на pH до около 7 чрез добавяне на киселина и разтворът на лизозимния димер от етап г) се пречиства чрез най-малко двук

I:

ратна гелна хроматография, която включва 1) поне един етап на елуиране през колона с агарозен пълнеж, 11) събиране на фракциите, които по същество съдържат димерната форма на лизозима и iii) подлагане на тези фракции на поне още един етап на елуиране през колона с декстранов пълнеж, след което се събира лизозимен димер с висока степен на чистота.

По този начин се получават големи количества пречистен лизозимен димер, който е приложим при лечение на различни вирусни и бактериални заболявания.

ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фигура 1 е графично изображение на профила (кривата) на елуиране, получен при първия етап на елуиране, проведен съгласно изобретението;

фигура 2 - графично представяне на профила на елуиране, получен при втория етап на елуиране, проведен съгласно изобретението.

ПОДРОБНО ОПИСАНИТЕ НА

ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ИЗПЪЛНЕНИЯ При получаване на лизозимни димери съгласно изобретението могат да се използват като изходен продукт всички лизозимни мономери, с които се разполага в момента. Съгласно изобретението използваните лизозимни мономери са производство на Serva Feine Biochemica, GmbH, Heidelberg, и имат каталожен номер 28260. Преди да се добави свързващият реагент към мономера, се приготвя лизозимен разтвор в чаша чрез разтваряне на мономера във фосфатен буферен разтвор при стайна температура и при непрекъснато разбъркване на разтвора в продължение на поне 2 h. Използваният разтвор на фосфатен буфер е за предпочитане 0,1 М дихидрат не динатриев хидрогенфосфат в около 1,000 ml Н₂0. Въпреки че действителните количества на реагентите и разтворите могат да варират, реакцията на димеризация съгласно изобретението може да се осъществи с от около 40 до около 60 g лизозимен мономер, който е разтворен в чаша, съдържаща около 5 1 буфер, дихидрат на динатриев хидрогенфосфат. Също така за предпочитане е мономерният разтвор да има pH най-малко 9, най-добре около 10. Нагласяването на pH може да се извърши, като се използва основен разтвор, например IN NaOH.

Реакцията на димеризация тогава се оставя да протече чрез добавяне на подходящ суберимидатен свързващ реагент към разтвора на лизозимния мономер при поддържане на 5 _РН 9 или над 9. Съгласно изобретението за предпочитане се използва диметилсуберимидат като свързващ реагент. Към разтвора, получен, както е показано по-горе, се прибавя 4-6 g диметилсуберимидат, разтворен в моно10 мерния разтвор за около минута. Реакцията на свързване протича за около 60 min при стайна температура (25+/-5°С), разтворът непрекъснато се разбърква с магнитна или друга бъркалка.

Реакцията на димеризация може да се спре в определен момент чрез понижаване на pH до около 7 /±0,2/ и това може да се съпроводи с добавяне на 1 М НС1 и/или добавяне на 0,2 М разтвор на амониев ацетат /приблизително около 250 ml/. Подходящ разтвор на амониев ацетат се приготвя чрез използването на около 15 g, разтворени в 1,000 ml Н₂0. Обикновено реакцията на димеризация се оставя да протече за около 1 h, въпреки че могат да се допуснат по-дълги или по-кратки периоди от време преди реакцията да е спряла в зависимост от точните количества и характера на използваните реагенти и разтвори.

За предпочитане в този момент цялата реагираща смес, която обикновено силно помътнява, се прекарва през мембранен филтър, за да се отделят неразтворените частици. Това обикновено е необходимо, защото разтворът в този момент съдържа една част мултимери, които се намират в неразтворена форма. На този етап се предпочита използването на филтър с размери на порите около 0,4-0,5 цт за отделяне на мултимерите.

Извършени са изследвания чрез гелна електрофореза на проби, взети по различно време след добавяне на свързващия реагент към лизозимния мономерен разтвор. Тези проучвания показват, че въпреки че мономерната форма се вижда ясно почти във всяка анализирана фракция, след около 10 min от началото на реакцията се открива ивица, съответстваща на димерната форма на лизозима, и тази ивица става все по-широка с напредване на реакцията. Мономерното тегло на лизозима е приблизително 14,000 и димерната ивица съответства на молекулно тегло около 30,000. В записа от електрофорезата също могат да се

Ihl открият мултимерни форми.

За да се получат съществени количества пречистен лизозимен димерен продукт, е желателно димеризиралият лизозимен разтвор да претърпи поне два по-нататъшни пречистващи етапа, за да се изолират лизозимните димери се отстранят лизозимните мономери или други примеси. Отделените недимеризирали лизозимни мономери могат да се съберат и да се върнат в изходния етап на метода, като по този начин се повишава ефективността при производството на димери.

Първият пречистващ етап се извършва за предпочитане при използване на йонообменна хроматография. В този етап разтворът на димерния лизозим, получен при димеризацията, описана по-горе, се въвежда в йонообменна колона от смола, състояща се от Sepbarose или други катионобменни вещества. В продпочитано изпълнение колона от S-Seplearose FF /Pharmacia/ к приблизително диаметър 10 cm и 25 cm височина е запълнена с обем от около 2,1 1, уравновесени с 4,2 1 50 тМ К-фосфатен буферен разтвор с pH 7. Приблизително 5 1 от димеризиралия разтвор се добавят в йонообменната колона и елуирането се извършва с предпочитана скорост на потока около 60 ml/min. Също така е за предпочитане елуирането да се извърши при използване на солеви градиент 0,15-1 М NaCl в 50 тМ К-фосфатен буфер. Фракциите от този етап на елуиране се събират и се държат в стерилни колби чрез използване на устройство като фракционен колектор /L КВ 2211 Suprec./. Кривата на елуиране може да бъде записана чрез LKB 2210 регистриращо устройство, което работи със скорост от 1 mM/min и тази крива на елуиране може да бъде използвана за определяне точния състав на събраните фракции. Абсорбцията на събраните разтвори се измерва за презпочитане при 280 nm с помощта на LKB 2238 UVICOR/S/II.

Точното протеиново съдържание във всяка от фракциите, събрани от първия етап на елуиране, описан по-горе, се анализира за предпочитане с метода на гелна електрофореза, като например SDS-PAGE/SOS-полиакриламид гелна електрофореза/ метод както е описан от Thomas et al.,PNAS72: 2626 /1979/. В това електрофорезно изследване се предпочита смесването на около 50 μΐ от всяка фракция и около 50 μΐ от покриващия буфер и сместа се нагрява за около 10 min при около 95°С. След това μΐ от тази смес се нанасят в гелова гилза. След извършване на електрофорезата за около 4 h при 20-35 mA протеиновите ивици се разделят и за предпочитане стават видими чрез оцветяване с багрило като например Coomassie-Blue 250 /Мегск/.

Като се използва SDS-гел процес, могат да се разделят мономери, димери и мултимери за лизозима. Електрофорезни изследвания могат да се използват за идентифициране на събраните лизозимни фракции, които са най-вече в димерна форма. Фракциите, които се състоят основно от лизозимни димери, се събират и за предпочитане се концентрират до около 800 ml в тангенциална поточна система.

В този етап е за предпочитане да се проведе следващ етап на филтруване, за да се осигури пречистването на димерния продукт. В предпочитаното изпълнение събраните фракции от първия етап на елуиране, които са концентрирани чрез тангенциалната поточна система, се елуират отново чрез гелна филтрация. За предпочитане е да се използва колона като Sephadex G 50 F /Pharmacia/c приблизителен диаметър 25 cm и височина 120 cm. Колонката се уравновесява с 60 1 буферен разтвор на 5 тМ амониев ацетат, който поддържа pH около 5. Подходящ разтвор на амониев ацетат се приготвя, използвайки около 4 g амониев ацетат, разтворен в 1,000 ml вода, като pH се довежда до около 5 с разтвор на 3 g оцетна киселина в приблизително 1,000 ml дестилирана вода.

Събраният лизозимен димерен разтвор от първия етап на елуиране, която е концентриран чрез тангенциална поточна система, се нанася върху колона за гелна филтрация, така че елуирането се извършва за предпочитане с обемна скорост от около 70 ml/min в уравновесяващия буфер. Както при горния първи етап на елуиране фракциите се събират и съхраняват и приблизително 50 μΐ от всяка фракция се анализират чрез споменатите по-горе SDS-PAGE методи. Освен това, кривата (профила) на елуиране отново се записва, като се използва записващо устройство, работещо със скорост около 0,5 mm/min. Абсорбцията отново се измерва при 280 nm. Профилите (кривите) на елуиране, получени от фракции взети след втория етап на елуиране, показват три пика, но профилите се състоят преди всичко

Ill:

от среден пик, който представлява фракции на лизозимния димер. До този момент остават само минимални количества мултимерни и мономерни форми на лизозима. Много добре пречистените димерни фракции, както се вижда от средните пикове на профила на елуиране, след това се събират и за предпочитане отново се концентрират, като се използва тангенциална поточна система. Накрая пречистените димери се лиофилизират и се съхраняват, докато е нужно.

Целият този процес може да се повтори толкова пъти, колкото е необходимо, докато се получи желаният обем от крайния димерен продукт. Отделни партиди от димера могат да се поставят в дестилирана вода след пречистване и след това да се лиофилизират. По този начин, може да се получи хомогенен лизозимен димер, който е полезен при лечението на много вирусни и бактериални заболявания. Към антивирусните и антибактериални ефекти на лизозимния димер могат да се добавят и други терапевтични ефекти като противовъзпалителни и антихистаминови свойства без цитотоксичните ефекти, свързани с лизозимния мономер.

Така настоящият метод е приложим за производство на големи количества пречистен лизозимен димерен продукт. Поради влиянието си при разграждане на бактериите димерният продукт, получен съгласно изобретението може да се изследва за ефективност чрез внасяне на димер в разтвор на микроорганизми и следващо следене на намаляването на нивото на микроорганизмите /като за измерване се използва спектрален фотометър/, след като е добавен ензимният димер. Тестове, проведени по този начин, показват, че лизозимните димери, получени по методи съгласно изобретението, имат големи възможности за борба с вирусни и бактериални заболявания.

Следващите примери илюстрират изобретението и не го ограничават по никакъв начин.

Пример 1. Получаване на лизозимен димер.

g лизозимен мономер /Serva Feine, Catalog № 28260/ се разтварят в покрити чаши, като се използва 5 1 буфер, представляващ 0,1 М дихидрат на динатриев хидрогенфосфат, който се разбърква постоянно в продължение на 2 h при 25°С. Дихидратът на фосфорния буфер се приготвя, като се използват 70,98 g динатриев хидрогенфосфат х 2Н₂0 /Мегск, р.А./, разтворени в 1,000 ml Н₂0. pH на разтвора се довежда до 10, използвайки 1 N NaOH. След 5 това 5 g от свързващия реагент - суберимидат /Sigma/ се добавят към белтъчния разтвор и pH постоянно се коригира до 10. Реагентът напълно се разтваря в течение на 1 min и реакцията на свързване протича в продължение 10 на 60 min при стайна температура /25°/, при постоянно разбъркване с магнитна бъркалка. Реакцията се спира чрез понижаване на pH до 7, използвайки IM НС1 и около 250 ml разтвор на 0,2 М амониев ацетат. 0,2 М разтвор на 15 амониев ацетат се приготвя чрез използването на 15,42 g амониев ацетат /Мегск, р.А./, разтворен в 1,000 ml Н₂0. Цялата реакционна смес показва силно помътняване в този момент и тогава се пропуска през мембранен фил20 тър с размер на порите 0,45 pm, за да се отделят неразтворените частици. Неразтворените частици включват мултимери, които присъстват в неразтворена форма, както е определено с SDS-гелна електрофореза.

След добавяне на свързващия реагент се вземат проби в различни моменти и се анализират чрез гелна електрофореза. Мономерната форма на лизозима ес вижда ясно във всеки един запис. Тя е представена от тясна ивица, явяваща се при относително молекулно тегло от около 14,000 /молекулното тегло на лизозима е 14386/. От втория запис нататък, направен след 10 min реакционна време, може да се наблюдава димерната двойна ивица и тази ивица се разширява с напредването на реакцията. Димерната ивица съответства на молекулно тегло 30,000. Освен това в по-късните записи може да се разпознае също така мултимерна връзка.

За да се пречисти предварително продуктът, 5 1 от горния състав се пропускат през катионобменна колона, от S.Sepharose FF /Pharmacia/. Колоната с диаметър 10 cm и с 25 cm височина, има обем 2,1 1, уравновесени с 4,2 1 50 mM К-фосфатен буфер при pH 7. 5те 1 от димеризиралия разтвор се нанасят върху колоната и се елуират при скорост на потока 60 ml/min и при градиент 0,15-1 m NaCl в 50 mM К-фосфатен буфер при pH 7.

Солевият градиент е установен и се контролира, като се използва като градиентсмесител LKB 2151 Controller. Приготвя се пър50 liil.

ви разтвор /Разтвор А/, който съдържа 50 тМ К-фосфатен буфер, pH 7 с 0% NaCl, и втори разтвор /Разтвор В/, съдържащ 50 тМ К-фосфатен буфер рН 7 и IM NaCl. В началния момент Л_о/, количеството на Разтвор В в елуиращия буфер е 15%; след 1 h /xj то се повишава до 50%, което се постига след 3,5 h /t_4J/ и се поддържа в продължение на 30 min /t_s,. В следващия 1 h /xj то се повишава до 100% и остава постоянно 1 h Д₇/. След това то пада за 5 min Л_7О5/ обратно отново приблизително до 0%. Колоната след това се промива 90 min /t_g3i/ с порция от 0% NaCl.

От елуирането в S-Sepharose катионобменната колона се събират фракции, приблизително 600 милилитрови, получени от събиране в продължение на 10 min от елуирания поток, в 2-литрови стерилни шотови колби. Събирането се извършва с фракционен колектор /LKB 2211 Suprec./. Кривата на елуиране се записва с LKB 2210 записващо устройство, което работи със скорост 1 mm/min Абсорбцията се измерва при 280 nm с LKB 2238 Unicor S II. Записаната крива на елуиране от този първи етап на елуиране е показана на фиг. 1. На фиг. 1 може да се види, че всички фракции, съдържащи първични димерни форми на лизозима, са показани чрез щриховане под дебелата линия. Солевият градиент е показан чрез тънката линия.

Протеиновата смес на всяка една отделна фракция се анализира чрез SDS-полиакриламидна гелна елекрофореза /PAGE/ в съответствие с методиката на Thomas et al., PNAS 72: 2626 /1975/. C тази цел 50 1 от всяка фракция се смесват с 50 μΐ от покриващия буфер и се загряват в продължение на 10 min при 95°С. След това 25 μΐ от тази смес се разпръскват в гел-гилза. Белтъчната смес Standart IV /Мегск/ се прилага като сравнение. Покриващият буфер се състои от следните компоненти:

0,72 g трие НС1 /0,06 М/

0,136 g EDTA /111/ /5 тМ/ /етилендиаминотетраоцетна киселина/

0,18 g глицерин /10%/ g SDS /5%/ рН, нагласено до 7,2 /добавяне 90 ml Н₂0/ ml бета-меркаптоетанол /10%/

За гел-електрофорезата се приготвя 18% разделящ гел, който се наслоява с 3,9% събиращ гел. Разтворът на разделящия гел за 18% акриламид се състои от:

g акриламид

0,045 g бис - акриламид

0,136 g трие HCI рН 8,8 /0,325 М/ 0,03 g SDS

200 μΐ 10% разтвор на амониев персулфат 20 μΐ TEMED

Разтворът на събиращия гел за 3,9% акриламид съдържа:

0,39 g акриламид

10,4 mg бис-акриламид

Mg SDS

100μ1 10% разтвор на амониев персулфан μΐ TEMED

SDS-полиакриламидният гел се приготвя, като се използват две стъклени плочки 20x20 cm, които добре се почистват и се изплакват с етанол, след което се поставят една върху друга. Две пространствени ивици с дебелина 1 mm /дължина 20 cm, ширина 1 cm/ създават пространството между плочките, в което се излива гелът. Пространствените ивици са разположени в левите и десните краища на плочките. Дъното се затваря с текстилна адхезивна ивица и всичките три ръба се стягат със скоби. Ръбовете допълнително се залепват с 1 % агарозен разтвор. След втвърдяване на агарозата разтворът на разделящия гел, приготвен по-горе, се излива във вертикално разположения промеждутък до приблизително 3 cm под горния ръб на стъклената плочка и с пипетата на Pasfeur се покрива със слой вода. Гелът полимеризира след приблизително 30 min. Водното покритие се излива, ръбовете на гела се изплакват един път с разтвора на събиращия гел, описан по-горе.

След това разтворът на събиращия гел се изсипва догоре до ръба и “гребен”, събиращ пробата, се слага вътре така, че долният ръб на пробната гилза лежи приблизително на 1 cm над предния ръб на слоя от разделящия гел. След приблизително 15 min събиращият гел полимеризира и гребенът може да се отстрани. След това текстилната адхезивна лента се маха и гелът се добавя във вертикално положение към електрофорезния апарат. Буферните камери се напълват с електрофорезен буфер /6 g трис-база /0,05 М/, 28,5 g глицин /0,38 М/, 1 g SDS /0,1 %/ и 1,000 ml Н₂0 и гелните гилзи се изплакват един път с буферен спрей. Лизозимните димерни проби се загряват в продължение на приблизително min в буферно покритие при 95° и пълнят в контейнер или в част от гилзата от опитната проба, съответстваща на гелната гилза.

Електрофорезата се извършва при около 20 mA в продължение на 4 h. Ако по желание електрофорезата продължи една нощ, това трябва да се извърши при понижено натоварване от около 6-8 mA. Движещата се граница се визуализира чрез смесване на 0,02% бромфенолово синьо с покриващия буфер. Електрофорезата завършва, когато движещата се граница достигне долния ръб на гела. Разделящият гел се отстранява, оцветява се в продължение на приблизително 30 min във фиксиращ разтвор и тогава се избелва отново в продължение на 2 h в избелващ разтвор от 400 ml метанол, 140 ml оцетна киселина и 2,000 ml Н₂0. Фиксиращият разтвор се приготвя чрез смесване на 500 ml избелващ разтвор с 12 ml багрилен разтвор, съдържащ 1 g R 250, Мегск/, 50 ml Н₂0 и 50 ml метанол. Протеиновите връзки тогава се визуализират чрез оцветяване с багрилен разтвор, както е показано по-горе. Очертаните линии, използвайки SDS-PAGE техника, показват постепенно нарастване на количеството на димеризиралия лизозим в пробите, които в крайна сметка включват фракции, съдържащи и мултимери. Фракциите, които са първоначално лизозим в димерна форма, се събират и концентрират до 800 ml в тангенциална поточна система. Тази система, производство на Millipore, включва филтрон с диаметър на филтъра 10,000, олефинова мембрана със съпротивление на разкъсване 700 kN/m² и Verder 80W помпа /Тип 20-30 № 60079/. Началното налягане е 200 kN/т², а крайното налягане е по-ниско от 20 kN/m². Работният капацитет е приблизително 1 Ι/h. Апаратът има мъртъв обем 400 ml, така че в края, след мембраната се подсушава с 400 ml, общият получен обем е 1200 ml.

Лизозимните димери тогава се пречистват чрез филтрация в хроматографска колона от Sephadex G 50 F /Pharmacia/. За тази цел колона (диаметър 25,2 cm, височина 120 cm) се уравновесява с 60 1 5 тМ амониево-ацетатен буфер с pH 5. Общият протеинов разтвор от 1,2 1 се нанася върху колоната и се елуира при скорост на потока 70 ml/min в уравновеся ващ буфер. Фракции от приблизително 700 ml се събират и всеки 50 ml на фракция са анализират, както е описано по-горе, като се използва SDS-PAGE процедурата.

Кривата на елуиране за този метод на филтрация е показана чрез записващо устройство, имащо скорост 0,5 mm/min, измервайки абсорбцията при 280 nm. Записаната крива на елуиране е показана на фигура 2. Плътната черна линия във фигура 2 представлява кривата на абсорбция на лизозимните разтвори с по-чувствителен детектор, отколкото при тънката линия на графиката. Въпреки че кривата на елуиране показва три пика, именно средният пик е изключително изтъкнал и този пик отговаря на димерните фракции. Първият и последният пик се отнасят до по-малки количества мултимерни и мономерни форми на лизозима, оставащи в покриващата смес.

Най-накрая фракциите, съдържащи лизозимен димер с висока чистота /фракции 813 в кривата на елуиране/, се събират и се концентрират с тангенциалната поточна система, описана по-горе. След концентрация пречистеният димер се лиофизира. След повтаряне на този процес няколко пъти отделни порции от димера се пречистват, поставят се в дестилирана вода и след това отново се лиофилизират, така че се получава хомогенен заряд на лизозимния димер.

Пример 2. Изследване на ензимната активност.

Ензимната активност на димерния лизозим, получен съгласно изобретението, може да се определи с тест за активност, описан от Verhamme et al., в International Pharmacy Journal, Vol. 2: 5 /1988/. Този тест се основава на намаляване на микроорганизма Micrococcus luteus до разтворими продукти на разлагане чрез ензимно индуциран лизис на клетъчните стени на микроорганизма. Степенното просветляване или пълното изчезване на помътняването при дължина на вълната 450 nm се измерва със спектрален фотометър като мярка на ензимната активност.

За този тест се приготвя суспензия от Micrococcus luteus. Приблизително 30 mg М.luteus (ATCC 4698, живи, лиофилизирани, получени от Boehringer Mannheim) се смилат и заедно с приблизително 25 ml фосфатен буфер се прехвърлят в 100 ml ерленмайерова колба и се разбъркват бавно в продължение на почти 2 h при стайна температура, като се

Ill използва магнитна бъркалка. След това суспензията се центрофугира 1 min при 500 об/ min излишъкът се отдекантира в нов съд. Малки бучки от бактерии, които не са суспендирани, се откриват в утайката. Суспензията се разбърква още и за да се предотврати утаяване, се разрежда с фосфатен буфер. Измерва се в сравнение с въздуха и дебелината на слоя е 1 cm. Съответни представителни проби от суспензията се разреждат по този начин, при непрекъснато бъркане и се отделят за опитни измервания.

Разтвори на проби, съдържащи лизозимен димер, се приготвят с концентрация 1 mg/ ml вода. Опитната проба се разтваря във вода непосредствено преди извършване на измерването и активната проба се разрежда в дестилирана вода съответно до 1:250 или 1:25. Опитът се извършва при постоянна температура 25°С. За тази цел всички разтвори трябва да са с температура 25°С и измерването се извършва с температурно-контролирана кювета. Обемът на кюветата е 3 ml, дебелината на слоя на опитния разтвор е 1 cm и намаляването на помътняването, следващо началото на реакцията, се измерва при 450 шп в продължение на 7 min. намаляването на помътняването за 1 min е показано на спектралния фотометър / Spectronic 1001, Bausch and Lomb./. Реакционната смес се приготвя от 2,95 ml от суспензия на M.luteus и 0,05 ml от разтвора на пробата. Всяко измерване се повтаря два пъти и оттам се определя средната стойност.

Степента на ензимната активност, определена чрез намаляване на помътняването, се проследява, започвайки от линейната начална зона, и се следи ΔΕ (Е = екстинкция на бактерията) за минута време. Стойността наАЕ/пйп е по-малка от 0,03 и степента на разреждане на опитната проба трябва да бъде съответно избрано. Намаляването на помътняването се определя също така и в “празна” проба (M.luteus и вода) и стойността, която се получава през кюветата, трябва да се извади от измерените стойности за опитните проби.

Извършените измервания показват значителна ензимна активност в суспензия на M.luteus с димерен разтвор, каквато не се наблюдава в контролната проба от суспензия на M.luteus и вода.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на пречистени лизозимни димери, включващ етапите на:

5 а) получаване на лизозимен разтвор чрез добавяне на мономерен лизозим към буферен разтвор и установяване на желаната стойност на pH;

б) добавяне на суберимидатен свързващ реагент за димеризиране на лизозимните мономери в лизозимния разтвор, като pH се поддържа при желаната стойност;

в) спиране на димеризацията в определен момент;

г) пречистване на разтвора на димеризиралия лизозим чрез гелна хроматография;

д) събиране на фракциите, които съдържат по същество димерната форма на лизозима, характеризиращ се с това, че: pH в етап а) се довежда най-малко до 9 и в етап б) се поддържа също най-малко 9, след което димеризацията в етап в) се спира чрез понижаване на pH до около 7 чрез добавяне на киселина, и че разтворът на лизозимния димер от етап г) се пречиства чрез най-малко двукратна гелна хроматография, която включва

i) поне един етап на елуиране през колона с агарозен пълнеж, ii) събиране на фракциите, които по същество съдържат димерната форма на лизозима и iii) подлагане на тези фракции на поне още един етап на елуиране през колона с декстранов пълнеж, след което се събира лизозимен димер с висока степен на чистота.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че pH на разтвора на мономерния лизозим се довежда до около 10, за предпочитане чрез добавяне на натриев хидроксид.
3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че буферният разтвор съдържа като буфер дихидрат на динатриев хидрогенфосфат.
4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че свързващият реагент се прибавя като pH се поддържа около 10, за предпочитане при непрекъснато разбъркване на разтвора и по желание чрез провеждане на димеризацията при стайна температура.
5. Метод съгласно претенция 1, харак-

IS теризиращ се с това, че суберимидатният свързващ реагент е диметилсуберимидат.
6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че pH се понижава чрез добавяне на солна киселина.
7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва допълнително отфилтруване на неразтворените частици след димеризацията с помощта на порьозен филтър, за предпочитане с размер на порите около 0,4-0,5 цт.
8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че допълнително се събират недимеризиралите мономери на лизозима след етапа на димеризация и че недимеризиралите мономери се връщат в процеса на димеризация.
9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че разтворът на лизозимния мономер съдържа 40-60 g лизозимен мономер и 4-6 ml буфер и че свързващият реагент се прибавя в количество от 4-6 g.
10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че колоната с агарозен пълнеж е катионобменна колона и че елуирането в първия етап на елуиране за предпочитане се провежда със солеви градиент - нат- риев хлорид в К-фосфатен буфер.
11. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че колоната с декстранов пълнеж е колона за гелна филтрация.

5
12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фракциите, получени при елуиране, се анализират за съдържание на лизозимен димер с гелна електрофореза и че фракциите, съдържащи основната част от 10 лизозимния димер, за предпочитане се концентрират чрез подаване на тангенциален поток.
13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пречистеният лизозимен димер се лиофилизира.
14. Лизозимен димер, по същество свободен от мономерната и мултимерните форми на лизозима, както и от други онечиствания.
15. Лизозимен димер съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че е получен по метод, съгласно която и да е претенция от 1 до 13.
16. Лизозимен димер съгласно претенция 14 и 15, характеризиращ се с това, че е лиофилизиран.