RO114805B1

RO114805B1 - Dimer de lizozim purificat si procedeu de obtinere a acestuia

Info

Publication number: RO114805B1
Application number: RO92-0931A
Authority: RO
Inventors: Peter Herrmann; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd Vaduz
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1990-01-08
Publication date: 1999-07-30
Also published as: NO922626D0; EP0509984B1; FI923123A0; SG49871A1; JP2732514B2; FI923123L; HU9202250D0; MC2243A1; NO922626L; BG61040B1; CA2073351C; HK1007456A1; HU214509B; LT3422B; LTIP594A; AU654651B2; NO302484B1; DE69032375T2; DE69032375D1; BR9007971A

Description

Prezenta invenție se referă la un dimer de lizozim purificat și procedeu de obținere, care este util la tratamentul infecțiilor virale și bacteriene.

Numărul tot mai mare de tulpini bacteriene și de afecțiuni virale ce sunt rezistente la antibiotice au făcut necesară introducerea unor noi sorturi de medicamente în scopul tratării animalelor și omului. Printre numeroasele tratamente prezente cunoscute, cât și printre medicamentele cunoscute, se cunoaște administrarea enzimelor în forma monomerică pentru a beneficia pacienții afectați de diferite maladii virale. Enzimele sunt proteine catalitic active, care efectuează aproape toată majoritatea proceselor vitale din organisme. Astfel, multe enzime, fie individuale, fie în anumite combinații, au fost izolate pentru efectele lor fiziochimice, fiziologice sau biologice.

Printre variatele enzime pentru care anumite efecte terapeutice au fost documentate, se cunoaște în prezent că lizozimul, care este cunoscut dealtfel din 1922, poate fi utilizat în diferite tratamente fiziologice și biologice. S-a observat că lizozimul are diferite efecte terapeutice,respectiv proprietăți,cum ar fi,efectele antiviral, antibacterian, antiinflamator și antihistaminic. Efectul antibacterian al lizozimului apare ca fiind bazat pe hidroliza beta-1-4-glicozidei la legătura ei dintre acidul nacetilmuraminic și n-acetilglucosamida, ambele combinate în peretele bacterial.

Din nefericire, potențialul teribil față de efectele binefăcătoare posibile datorită utilizării lizozimului nu s-a atins din cauză că prezintă efect citotoxic forma monomeră a acestei enzime. De exemplu, în testele cu fibroblaste cultivate, s-a observat un efect toxic datorită dozelor de lizozim în forma monomerică, chiar când se administrează în cantități foarte mici. Astfel, se impune să se dezvolte o cale prin care să se aducă la maximum efectele binefăcătoare potențiale ce s-ar putea obține de la lizozim prin descoperirea unei căi eficiente de control al efectelor citotoxice asociate cu monomerul.

De curând s-a descoperit că compoziția antivirală sau antibacteriană care nu prezintă efecte citotoxice poate fi obținută din lizozim dacă se prepară o compoziție bazată pe forma dimerică a enzimei. Utilizarea lizozimului în forma dimerică duce la o compoziție utilă pentru tratamentul unui mare număr de boli infecțioase, compoziție care nu prezintă efectele citotoxice ridicate normal asociate cu lizozomul monomer. Ultilizarea dimerului lizozimului în diferite tratamente terapeutice este prezentat în cererea de brevet copendinte POT US 88/01785.

Cu toate că se cunosc căi de preparare a formei dimerice de lizozim din forma sa monomerică, în prezent este imperativ ca să se poată obține cantități mari de formă dimerică de către o persoană ce lucrează în domeniul de specialitate în manieră eficientă și economică. Este astfel foarte de dorit să se dezvolte un sistem pentru producerea și testarea unor cantități mari de dimer lizozim purificat, care să nu conțină forma monomer sau multimer a enzimei sau alți contaminanți.

Sorrentino et al. (Eur.J.Biochem., voi. 124/1, 1982, 183 - 190) prezintă un procedeu de a dimeriza monomeri de lizozim cu agent de reticulare dimetil suberimidat, la un pH de 8,5, unde reacția de dimerizare se termină prin adăugare de acetat de amoniu,după care produsele de reacție care rezultă sunt supuse la o filtrare pe fel, într-o fază unică, cu Sephadex G-75 superfin, care produce 18% dimeri de diribonuclează.

Wang et al. [Biochemistry 15, No.3, 660-665, 1976) au încercat să conducă reacția de dimerizare la valori de pH diferite și din rezultatele lor au conchis că cel mai bun mod de a efectua dimerizarea a constat în folosirea unor condiții cu pH moderat de 7,5...8. Autorii au raportat mai departe că toate încercările de a spori producția

RO 114805 Bl de dimer reticulat a condus la o transformare mai ridicată a dimerilor în oligomeri și 50 că producția maximă de produs dimeric a fost de circa 20%. După timpul prescris de reacție, reacția de dimerizare a fost oprită prin răcirea bruscă a agentului de reticulare, neintrat în reacție, cu acetat de amoniu.

Nici unul din materialele bibliografice referitoare la stadiul tehnicii nu face referiri nici la menținerea pH-ului la valoarea de cel puțin 9 în timpul dimerizării și nici 55 la oprirea reacției de dimerizare prin scăderea pH-ului la aproximativ 7. De asemenea, ei nu prezintă purificarea dublă prin cromatografie lichidă. Ei arată totuși cum se oprește reacția de dimerizare după un timp de reacție, prescris, prin stingerea cu acetat de amoniu a elementului de reticulare neintrat în reacție (ionii de amoniu reacționează cu elementul de reticulare și ocupă locurile de amidinare ale elementului 60 de reticulare; elementul de reticulare nu mai este capabil să se fixeze la proteine).

Metoda comunicată de Sorentino et al. Și Wang se deosebește de prezenta invenție, în măsura în care nu sugerează:

- oprirea dimerizării printr-o deplasare a valorii pH-ului de la un nivel pH =9 sau mai mare la circa pH=7, fără poluarea amestecului de reacție cu acetat de amoniu, 65 fapt care prezintă importanță având în vedere posibilitatea dorită de recirculare a fracțiunilor care conțin monomer, neintrat în reacție, în procedeul de dimerizare conform prezentei invenții;

- concentrarea amestecului de reacție înainte și/sau după fazele cromatografiei lichide, fapt care este foarte important având în vedere aplicarea industrială pe scară 70 largă (metodele citate din stadiul cunoscut al tehnicii nu pot fi folosite ca atare în producerea la scară industrială a dimerilor de lizozimă, din cauză că ar necesita coloane enorme pentru filtrarea pe gel);

- supunerea soluției de lizozimă dimerizată la cel puțin două faze ulterioare de cromatografie lichidă care conduce la lizozimă dimerizată, de înaltă puritate, con- 75 venabilă pentru utilizare terapeutică directă, in vivo (a se vedea PCT/US 88/01785).

Indiferent de scara pe care se desfășoară fabricația, este de dorit să se asigure posibilitatea de reciclare a reactivilor scumpi. De aceea, există convingerea că oprirea reacției prin acidulare în loc de stingere a agentului de reticulare este atât nouă, cât și purtătoare de activitate inventivă. 80

Nici unul din materialele documentare citate din stadiul cunoscut al tehnicii nu sugerează un atare procedeu, iar acesta nici nu poate fi obținut printr-o lecturare combinată a articolelor.

Procedeul lui Sorrentino et al. și al lui Wang et al. cuprind - ca un dezavantaj major- adăugarea de acetat de amoniu pentru a opri dimerizarea. Prin adăugare de 85 acetat de amoniu la amestec, moleculele de agent de reticulare, neintrate în reacție, sunt blocate prin reacție cu ioni de amoniu, motiv pentru care reciclarea fracțiunii de monomer în procesul de dimerizare este prevenită. De asemenea, purificarea amestecului prin filtrare pe gel, în faza unică, folosind matrice Sephadex G-75, așa cum s-a raportat de către surse bibliografice, poate fi insuficientă pentru o separare eficientă 90 a unor molecule mai mici, adică a monomerilor din dimeri mai mari și agregate oligomerice.

Aceste dezavantaje ale stadiului cunoscut al tehnicii sunt depășite prin procedeul de producere conform prezentei invenții.

în concordanță cu prezenta invenție, se prevede un procedeu de preparare și 95 purificare a produsului dimer al lizozimului, procedeu care cuprinde:

a) prepararea soluției de lizozim, prin adăugarea lizozimului necesar la nivel obișnuit de pregătire în domeniul dat, să se poată înțelege și pune în aplicare invenția,

RO 114805 Bl având în vedere cunoștințele din stadiul cunoscut al tehnicii.

b) adăugarea unui agent de cuplare tip suberimidat, respectiv dimetil suberimidat, în scopul dimerizării monomerilor lizozimului în soluție, în timp ce soluția este menținută la un pH de sau aproximativ 9;

c) scăderea pH-ului la aproximativ 7, în scopul opririi reacției de dimerizare la un punct dat;

d) purificarea soluției de lizozim dimerizat prin efectuarea mai întâi a unei prime etape de eluare în care soluția este eluată prin coloană schimbătoare de iokni și colectarea fracțiunilor ce conțin în cantitate substanțială forma dimeră de lizozim;

e) filtrarea fracțiunilor colectate din prima etapă de eluare prin efectuarea unei a doua etape de eluare, în care fracțiunile colectate din prima etapă de eluare sunt eluate pe coloană cu rășină schimbătoare de ioni; și

f) colectarea produsului lizozimic dimer înalt purificat rezultat de la cea de- a doua eluare; soluția de monomer lizozim este ajustată la un pH de aproximativ 10, preferabil adăugând NaOH; soluția din faza (a) cuprinde tampon disodiu hidrogen fosfat dihidrat; reactivul de cuplare este adăugat în soluția de lizozim monomeric în timp ce se menține pH-ul soluției la aproximativ 10; reactivul de cuplare suberimidat cuprinde dimetil suberimidat; faza de dimerizare se efectuează la temperatura camerei, preferabil în timp ce se execută continuu agitarea soluției; reacția de dimerizare din faza (c) este stopată prin adăugarea de HCI; se filtrează particulele nedizolvate utilizând un filtru poros cu o dimensiune a porilor de aproximativ 0,4...0,5 pn; cuprinde colectarea fracțiunilor de monomeri nedimerizați, urmând faza de dimerizare și recirculare a monomerilor nedimerizați în procesul de dimerizare; soluția de monomer al lizozimului cuprinde aproximativ 10 părți, în greutate, de monomer de lizozim per 1000 părți, în greutate, de tampon la care se adaugă reactivul de cuplare în cantitate de aproximativ 1 parte, în greutate; cel puțin una, preferabil prima fază de cromatografie lichidă, este efectuată folosind o rășină schimbătoare de cationi cu o matrice aragoză, preferabil S-Sepharoză-FF; cel puțin una, preferabil a doua fază de cromatografie lichidă, este efectuată folosind o rășină de filtrare pe gel cu o matrice de dextran reticulat, preferabil Sephadex G-50 F; cel puțin una, preferabil a doua fază de cromatografie lichidă, este efectuată folosind o rășină de filtrare pe gel cu o matrice de dextran reticulat, preferabil Sephadex G-50 F; cel puțin una, preferabil a doua fază de cromatografie lichidă este efectuată folosind o rășină de filtrare pe gel cu o matrice de dextran reticulat, preferabil Sephadex G-50 F; produsul lizozim dimer purificat, colectat după a doua fază de cromatografie lichidă, este liofilizat; produsul dimer de lizozimă este lipsit în mod substanțial de formele monomerice și multimerice ale lizozimei și de alți contaminanți.

Invenția se referă și la un dimer de lizozim purificat care conține nu mai mult de 10% în greutate, preferabil nu mai mult de 5% în greutate, forme monomerice și multimerice ale lizozimei sau ale altor contaminanți.

Se pot prepara cantități mari de dimer lizozim purificat, care poate fi util la tratarea unei varietăți de boli virale și bacteriene.

- fig. 1 reprezintă un grafic al profilului de eluție obținut din prima etapă de eluare efectuată în concordanță cu prezenta invenție;

- fig.2 reprezintă un grafic al profilului de eluție obținut din a doua etapă de eluție efectuată în concordanță cu prezenta invenție.

Pentru prepararea dimerilor lizozimului în concordanță cu prezenta invenție, orice monomeri ai lizozimului disponibili pot fi utilizați ca materii prime de pornire. în prezenta invenție, monomerii lizozimului utilizați au fost obținuți de la Serva Feine

RO 114805 Bl

150

Biochemica, GmbH, Heidelberg, și au numărul de catalog 2826G. înainte de a fi adăugată soluția respectivului de cuplare la monomer, se prepară soluția de lizozim într-un pahar, prin dizolvarea monomerului în soluție tampon fosfat, la temperatura camerei, în timp ce se agită continuu soluția timp de cel puțin aproximativ 2 h. Soluția tampon fosfat utilizată este preferabil soluție 0,1 m disodiu hidrogen fosfat dihidrat. O soluție tampon corespunzătoare se prepară prin dizolvarea a aproximativ 7G g de disodiu hidrogen fosfat dihidrat în aproximativ 1OOO ml apă. Cu toate că actualele cantități de reactivi și soluții utilizate în prezenta invenție pot varia, reacția de dimerizare conform prezentei invenții poate fi efectuată prin utilizarea a aproximativ 40 la aproximativ 60 gde monomer lizozim ce se dizolvă în pahar având aproximativ 5 I de tampon disodiu hidrogen fosfat dihidrat. De asemenea, este de preferat ca soluția monomer să aibă pH-ul ajustat la aproximativ 9, și mai preferabil la aproximativ 10. Ajustarea pH-ului poate fi făcută prin utilizarea unei soluții bazice, cum ar fi soluția 1 n de hidroxid de sodiu.

Reacția de dimerizare este apoi lăsată să se desfășoare prin adăugarea de agent reactiv de cuplare - suberimidat corespunzător, în proporție corespunzătoare față de soluția monomer de lizozim, în timp ce se menține pH-ul la aproximativ 9. Este preferabil ca reactivul de cuplare dimetil suberimidat să fie utilizat în prezenta invenție. La soluția preparată după cum se indică mai sus, se adaugă 4 - 6 g de dimetil suberimidat și acesta se dizolvă în aproximativ 1 min. Reacția de cuplare se lasă să se desfășoare timp de aproximativ 60 min la temperatura camerei (25 ± 5°C),în timp ce soluția este continuu agitată cu agitator magnetic sau alt mijloc de agitare.

Reacția de dimerizare poate fi oprită la un punct dat prin scăderea pH-ului la aproximativ 7 ±0,2, și acest lucru se poate face prin adăugarea de acid clorhidric 1 m și/sau adăugarea de soluție de acetat de amoniu 0,2 m (până la aproximativ 250 ml). Soluția corespunzătoare de acetat de amoniu se prepară prin utilizarea a aproximativ 15 g acetat de amoniu ce se dizolvă în 1000 ml apă. Normal, reacția de dimerizare este lăsată să se dezvolte timp de aproximativ 1 h, deși pot fi utilizați și timpi mai mici sau mai mari înainte ca reacția să fie oprită, depinzând de cantitățile precise și de natura reactivilor și soluțiilor utilizate.

Este de preferat la acest punct ca întregul amestec de reacție, care prezintă în general un grad ridicat de turbiditate, să fie trecut prin membrana filtrantă în scopul de a separa particulele nedizolvate. Acest lucru este în general necesar, deoarece soluția la acest punct va conține o porțiune de multimeri care sunt prezenți în formă nedizolvată. Pentru a separa multimerii și alte particule nedizolvate, este preferabil să se utilizeze un filtru cu dimensiunea porilor de aproximativ 0,4...0,5 micrometri. S-au efectuat studiile de gel electroforeză pe diferite probe luate la diferite momente după adăugarea agentului de cuplare la soluția de monomer de lizozim. Aceste studii arată că deși forma monomer este clar vizibilă în aproape fiecare fracțiune analizată, se poate recunoaște o bandă corespunzătoare formei dimer a lizozimului după aproximativ 10 min de timp de reacție și banda devine mai largă pe măsură ce se continuă reacția. Greutatea moleculară a monomerului de lizozim este de aproximativ 14000 și banda corespunde dimerului cu dimensiunea de aproximativ 30000 greutate moleculară. în urmele electroforetice, generarea formelor multimer pot fi de asemenea recunoscute.

în scopul de a prepara cantități substanțiale de produs dimer al lizozimului purificat, este preferabil ca soluția de lizozim dimerizat să treacă la cel puțin încă două etape următoare de purificare și să fie înlăturați monomerii și alți contaminați, îndepărtarea monomerilor nedimerizați ai lizozimului poate fi făcută și monomerii sunt ♦

155

160

165

170

175

180

185

190

195

200

205

210

215

220

225

230

235

240

RO 114805 Bl recirculați la dimerizare astfel încât să se asigure un randament maxim în obținerea dimerilor.

O primă etapă de purificare este efectuată prin utilizarea cromatografierii pe schimbători de ioni. în această etapă, soluția de lizozim dimerizat obținută prin procesul de dimerizare descris mai sus, este introdusă în coloana cu schimbători de ioni cuprinzând Sehparoză sau alte materiale schimbătoare de cationi. într-o formă preferată, se încarcă o coloană cu S-Sepharoză FF (Pharmacia) de aproximativ 10 cm în diametru și 25 cm înălțime, cu un volum de aproximativ 2,1 I echilibrat la 4,2 I cu soluție tampon 50 mmolară K-fosfat la pH=7. Se trec aproximativ 5 I de soluție dimerizată peste coloana cu schimbători de ioni și eluția se face preferabil cu o viteză de curgere de aproximativ 60 ml/min. De asemenea, este preferabil ca eluția să aibă loc utilizând un gradient salin de 0,15...1 m NaCI în tampon 50 mmolar K-fosfat. Fracțiunile din această etapă de eluție sunt colectate și ținute în baloane sterile prin utilizarea dispozitivelor, cum ar fi colectorul de fracții (LKB 2211 Suprec.J. Un profil de eluție poate fi înregistrat cu ajutorul înregistratorului LKB 2210, ce funcționează cu o viteză de ImM/minut, și acest profil de eluție poate fi utilizat la determinarea compoziției precise a fracțiunilor colectate. Absorbția soluțiilor colectate se face preferabil la 280 nm cu ajutorul LKB UVICOR S II.

Conținutul precis de proteină al fiecărei fracțiuni colectate din prima etapă de eluția descrisă mai sus, preferabil, se analizează prin metoda gel-electroforeză, cum ar fi SDS-PAGE (SDS-poliacrilamid gel electroforeză] tehnică, cum ar fi cea descrisă de Thomas și colaboratorii în PNAS 72: 2626- (1979). în acest studiu electroforetic, preferabil aproximativ 50 microlitri din fiecare fracțiune se amestecă cu aproximativ 50 microlitri de tampon de acoperire și amestecul se încălzește timp de aproximativ 10 min la temperatura de aproximativ 95°C. După ce electroforeză s-a făcut timp de aproximativ 4 la 20...35 mA, benzile corespunzătoare proteinei separă și, preferabil, sunt vizualizate prin colorarea cu colorant, cum ar fi Coomassie-Blue R 250 (Merk). Utilizând procedeul SDS-gel, monomerii, dimerii și multimerii lizozimului pot fi separați. Studiile electroforetice pot fi utilizate la identificarea acelor fracțiuni de lizozim colectate care au cea mai mare cantitate de formă dimerică. Fracțiunile care conțin cea mai mare cantitate de formă dimerică de lizozim se colectează, și preferabil, se concentrează la aproximativ 800 ml în sistem de curgere tangențială.

La acest punct, este preferabil ca etapa subsecvențială de filtare să fie efectuată în continuare prin asigurarea purificării produsului dimer. în forma preferată, fracțiunile colectate de la prima etapă de eluție care au fost concentrate prin utilizarea sistemului de curgere tangențiale vor fi eluate din nou prin coloană cu schimbători de ioni. Se recomandă ca o astfel de coloană să fie cu Sephadex G 50 F (Pharmacia] cu dimensiunile de aproximativ 25 cm în diametru și 120 cm în înălțime. Coloana se echilibrează cu un volum de aproximativ 60 I de soluție tampon 5 mmolară amoniu acetat, care fixează pH-ul la aproximativ 5. Soluția tampon corespunzătoare de acetat de amoniu se prepară prin utilizarea a aproximativ 4 g de acetat de amoniu ce se dizolvă în 1000 ml apă și la care se ajustează pH-ul la aproximativ 5 cu soluție de 3 g acid acetic în aproximativ 1ooo ml apă distilată.

Soluția cu dimerul lizozimului colectată din prima etapă de eluție, care a fost concentrată prin sistemul de curgere tangențială, se înglobează în coloana schimbătoare de ioni astfel ca eluția preferabil să aibă loc la o viteză de curgere de aproximativ 70 ml/min în tampon echilibrat. Ca și în etapa primă de eluție de mai sus, fracțiunile sunt colectate și stocate, și aproximativ 50 microlitri din fiecare fracțiune este analizată prin tehnicile SDS-PAGE discutate mai sus. Suplimentar,

245

RO 114805 Bl

250 profilul de eluție este înregistrat din nou cu o viteză de înregistrare de aproximativ 0,5 mm/min. Adsorbția se măsoară din nou la 280 nm. Profilurile de eluție obținute din fracțiunile luate după a doua etapă de eluare prezintă trei picuri, dar profilurile ce sunt cuprinse în principal în picul de la mijloc reprezintă fracțiunile cu lizozim dimer. în acest moment, rămân numai cantități minime de forma multimer și monomer ale lizozimului. Fracțiunile de dimer al lizozimului puternic purificate, așa cum este indicată de picul din mijlocul profilului de eluare sunt colectate, și din nou concentrate, utilizând sistemul tangențial de curgere. în final, dimerii purificați sunt liofilizați și stocați până când este necesar.

Acest proces total poate fi repetat ori de câte ori este necesar, până ce volumul dorit de produs dimer final se obține. Șarjele individuale de produs dimer după purificare pot fi introduse în apă distilată și liofilizate în continuare. Pe această cale se pot obține șarje omogene de dimer lizozim, produs ce este foarte util la tratamentul multor afecțiuni virale și bacteriene. Suplimentar efectelor sale antivirale și antibacteriene, prezintă și alte proprietăți, cum ar fi cele antiinflamatorii și antihistaminice, fără a avea efectele citotoxice asociate monomerului lizozimului. Procedeul conform prezentei invenții este astfel util pentru producerea eficientă și a unor mari cantități de produs lizozim dimer bine purificați. Datorită efectului său de a descompunere bacteria, produsul dimer obținut conform prezentei invenții poate fi testat în ceea ce privește eficiența sa prin administrarea dimerului la o soluție de microorganisme și apoi controlarea scăderii nivelului microorganismelor (măsurată prin spectrofotometru), după ce a fost aplicat dimerul enzimei. Testele conduse în această manieră au indicat faptul că dimerii lizozimului produși conform prezentului procedeu al invenției au un mare potențial de combatere a afecțiunilor virale și bacteriene.

în continuare, se prezintă câteva exemple ilustrative pentru prezenta invenție, dar nici decum cu scop limitativ pentru ea.

Se dă mai jos un exemplu de preparare a dimerului lizozimului.

5D g de monomer lizozim (Serva Feine, Catalog nr.28260) se dizolvă în pahar acoperit, utilizând 5 I de tampon 0,1 m disodiu hidrogen fosfat dihidrat, care soluție se amestecă continuu timp de 2 h la temperatura de 25°C. Tamponul fosfat dihidrat se prepară prin dizolvarea a 70,98 g disodiu hidrogen fosfat dihidrat (Merck, p.a. în 1000 ml apă. pH-ul soluției se ajustează la 10 utilizând hidroxid de sodiu 1n. Apoi se adaugă 5 g de agent de cuplare reprezentat dimetil suberimidat (Sigma) la soluția de proteină, și pH-ul se ajustează continuu la pH=10. Reactivul de culoare se dizolvă complet în decurs de un minut, și reacția de cuplare se incubează timp de 60 min la temperatura camerei (25°C) cu agitare continuă, utilizând agitator magnetic. Reacția se oprește prin scăderea pH-ului la 7 utilizând acid clorhidric 1 m și aproximativ 250 ml tampon acetat de amoniu 0,2 n. Soluția acetat de amoniu 0,2 m se prepară prin utilizare a 15,42 g acetat de amoniu (Merk), p.a) dizolvat în 1000 ml. întregul amestec de reacție prezintă turbiditate mare la acest punct și se trece prin membrana de filtrare de 0,45 micrometri dimensiunea porilor, în scopul separării particulelor nedizolvate. Particulele nedizovate includ multimerii care au fost prezenți în forma nedizolvată și care au fost detectați cu ajutorul SDS-gel-electroforezei. După adăugarea reactivului de cuplare se recoltează probe la timpi diferiți și se analizează prin gel electroforeză. Forma monomerică a lizozimului a fost clar vizibilă în fiecare urmă înregistrată. A fost reprezentată de o bandă inferioară ce corespunde la greutatea moleculară de aproximativ 14000 (greutatea moleculară a lizozimului este de 14386). Din cea de-a doua urmă (înregistrare) făcută la aproximativ 10 min timp

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 114805 Bl de reacție, dubla legătură dimerică poate fi observată, și această bandă devine tot mai largă pe măsură ce reacția progresează. Banda dimerului corespunde la o dimensiune de aproximativ 30000 greutate moleculară. Suplimentar, la urmele de mai târziu, se poate recunoaște o bandă corespunzătoare la multimer.

în scopul producerii unui produs purificat preliminar, 5 I din compoziția de mai sus se introduce peste schimbător cationic cuprins într-o coloană ce conține SSepharoză FF (Pharmacia). Coloana cu 10 cm diametru și 25 cm înălțime are un volum de 2,1 I echilibrat cu 4,2 I de 50 mmolar K-fosfat tampon la pH=7. Cei 5 I de soluție dimerizată se înglobează în coloană și se eluează cu o viteză de curgere de 60 ml/min cu gradient de 0,15...1 m NaCI în tampon 50 mmolar K-fosfat la pH=7.

Gradientul salin se stabilește și se controlează în maniera următoare, utilizând un gradient - mixer - Controller LKB 2152. Se prepară o primă soluție (Soluția A), care cuprinde 50 mM K-fosfat tampon pH=7 cu 0% NaCI, și o a doua soluție (Soluția B), care se prepară să cuprindă 50 mM K-fosfat tampon pH=7 și 1M NaCI. La momentul pornirii (t₀), proporția de Soluția B în tamponul de eluție este 15%; după o oră (tj, se crește direct la 50%, ceea ce se atinge după 3,5 h (t₄₅) și este menținut timp de 30 min (t₅). în decurs de o oră (tg) el crește la 100% și rămâne constant timp de o oră (t₇). Apoi scade în 5 min (t_{7 05}] din nou la aproximativ 0%. Coloana se spală apoi timp de 90 min (tg₃₅) cu porțiuni de 0% NaCI.

□in eluentul de la schimbătorul cationic S-Sepharoză, fracțiuni de aproximativ 600 ml, rezultați de la acumulare corespunzătoare la 10 min de la curgerea eluatului, se colectează în flacoane Schott sterile de capacitate 2 I. Colectarea se efectuează cu ajutorul colectorului de fracțiuni (LKB 2211 Suprec). Un profil de eluție este înregistrat cu ajutorul înregistratorului LKB 2210 ce are o viteză de 1 mm/min.

Absorbția se măsoară la 280 nm cu ajutorul LKB 2238 UVICOR S II. Profilul de eluție înregistrat pentru această primă etapă de eluție este indicat în fig. 1. în fig. 1 se poate observa că toate fracțiunile conținând în principal formele dimerice ale lizozimului sunt indicate prin umbrirea sub linia groasă. Gradientul salin este indicat de linia subțire.

Amestecul de proteină din fiecare fracțiune individuală a fost analizat prin SDSpoliacrilamid gel-electroforeză (PAGE) în concordanță cu procedeul descris de Thomas și colaboratorii, PNAS 72: 2626 (1975). în acest scop, 50 microlitri de fiecare fracțiune se amestecă cu 50 microlitri de tampon de acoperire și se încălzesc timp de 10 min la 95°C.Apoi 25 microlitri din acest amestec se introduc în locașul cu gel. Amestecul de proteină standard IV (Merck) se aplică ca referință. Tamponul de acoperire cuprinde următoarea compoziție:

0,72 g tris HCL (0,06 m)

0,136 g EDTA (III) (5 mm]

0,18 g glicină (10%) g SDS (5%) pH-ul ajustat la 7,2 (adăugare 90 ml apă) ml beta-mercaptoetanol (10%).

Pentru gel-electroforeză se prepară un gel separator 18% care este stratificat pe un gel colector 3,9%. Soluția gel separatoare de 18% acrilamidă a fost compusă din următoarele:

g acrilamidă

0,045 g b/s-acrilamidă

0,136 g tris HCI pH =8,8 (0,325 m)

0,03 SDS

RO 114805 Bl

200 microlitri 10% soluție persulfat de amoniu microlitri TEMED

Soluția gel colectoare de 3,9% acrilamidă a fost compusă din:

0,39 g acrilamidă

10,4 mg bis- acrilamidă mg SDS

100 microlitri 10% soluție amoniu persulfat, mitrolitri TEMED

SDS-poliacrilamid gelul se prepară prin luarea a două plăci de sticlă de dimensiunea 20 x 20 cm, ce se curăță foarte bine și se clătesc cu etanol, și se așează una peste alta. Două fâșii de spațiere de grosime de 1 mm (lungime de 20 cm, lățime de 1 cm) asigură spațiul dintre plăci, spațiu în care se va turna gel. Fâșiile de spațiere sunt montate pe marginile stângă și dreaptă ale plăcilor de sticlă. Marginea de la bază este etanșată printr-o fâșie adezivă textilă, și toate celelalte trei margini sunt întărite cu cleme. Marginile sunt izolate suplimentar cu soluție 1% agaroză. După întărirea agarozei, soluția gel separatoare preparată mai sus este introdusă în interstițiile respective în poziția verticală până la aproximativ 3 cm sub marginea de sus a plăcii de sticlă, și cu ajutorul unei pipete Pasteur, se completează până depășește cu un strat de apă. Gelul este polimerizat după aproximativ 30 min. Apa de acoperire este eliminată, și marginile gelului se clătesc o dată cu soluție de gel colectoare descrisă mai sus.

După aceea, soluția de gel colectoare este depusă până la marginea superioară, și pieptenele de colectare a probei, din teflon, este introdus în marginea de la bază, astfel ca marginea de bază a buzunarului pentru probă să fie aproximativ 1 cm peste marginea frontului stratului de gel separator. După aproximativ 15 min, gelul colector este polimerizat, și pieptenele se îndepărtează. Apoi, se îndepărtează fâșia de material textil adeziv și gelul este adus în poziție verticală la un aparat de electroforeză. Camerele tampon sunt umplute cu tampon de electroforeză (6 g tris -bază (0,05 m); 28,5 g glicină (0,38 m); 1 g SDS (0,1%) și 1000 ml apă) și buzunarele de gel (locașurile practicate în masa de gel cu pieptenele de teflon) sunt clătite o dată cu ajutorul soluției tampon pulverizată. Probele de dimer al lizozimului sunt încălzite timp de aproximativ 10 min în tampon de acoperire la 95°C și introduse într-un container sau zonă în buzunarul de testare a probei corespunzând buzunarului de gel.

Electroforeză este efectuată la aproximativ 20 mA timp de 4 h. Dacă se dorește efectuarea electroforezei peste noapte, acest lucru se poate face la sarcină redusă de aproximativ 6...8mA. Frontul ce se deplasează este vizualizat prin amestecarea colorantului albastru de brom fenol 0,02% în tamponul de acoperire. Electroforeză se consideră terminată când frontul de deplasare a procesului atinge marginea bazală a gelului. Gelul de separare este tăiat, colorat pentru aproximativ 30 min în soluție de fixare și este albit din nou timp de 2 h în soluție de albire de 400 metanol, 140 ml acid acetic și 2000 ml apă. Soluția de fixare se prepară prin combinarea a 500 ml de soluție de albire cu 12 ml de soluție cuprinzând 1 g de colorant Coomassie-blue (FI 250, Merck), 50 ml apă și 50 ml metanol. Benzile corespunzătoare proteinei au fost apoi vizualizate prin colorarea cu soluție de colorant, așa cum se indică mai sus. Urmele făcute prin utilizarea tehnicii SDS-PAGE au indicat creșterea gradată a cantității de lizozim dimerizatîn probele respective, care, spre sfârșit au inclus fracțiuni conținând multimeri la fel de bine. Fracțiunile ce conțineau în primul rând lizozim în formă dimerică au fost colectate și concentrate până la 800 ml în sistem de curgere tangențială. Acest sistem, fabricat de firma Milliore,

345

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 114805 Bl include un filtru exclusiv, filtron 10000 d, o membrană olefinică având o rezistență la rupere de 7 bari, și o pompă Verder 80 W (Tip 20...30 nr.60079). Presiunea de intrare este de 2 bari, și presiunea de ieșire la minimum mai mică de 0,2. Capacitatea de lucru este de aproximativ 1 l/h. Aparatul are un volummort de 400 ml, astfel că, după terminarea pompării, membrana este clătită cu 400 ml, volumul total obținut fiind de 1200 ml.

Dimerii lizozimului sunt apoi purificați prin filtrare pe Sephadex G 50 F (Pharmacia) - rășină schimbătoare de ioni. Pentru aceasta, o coloană (diametrul 25,2 cm, înălțimea 120 cm) se echilibrează cu un volum de 60 I de tampon 5 mmolar de acetat de amoniu la pH=5. Soluția totală de proteină de 1,2 I se înglobează și un eluat cu viteza de curgere de 70 ml/min în tampon de echilibru se colectează. Se colectează fracțiuni de 700 ml, și din fiecare fracțiune câte 50 microlitri se analizează așa cum s-a descris mai sus, utilizând procedeul SDS-PAGE.

Profilul de eluție pentru acest procedeu de filtrare a fost indicat de un înregistrator având o viteză de 0,5 mm/min și măsurând absorbția la 280 nm. Profilul de eluție înregistrat este redat în fig.2. Linia groasă din fig.2 reprezintă profilul de adsorbție a soluțiilor de lizozim cu detecție mai sensibilă decât cea din linia subțire a graficului. Deși acest profil de eluție indică trei picuri, picul din mijloc este cel care este extrem de proeminent, și acesta este cel care reprezintă fracțiunile de dimer. Primul și ultimul dintre picuri se referă la cantități mai mici de forme multimer și monomer de lizozim rămas în amestecul de acoperire.

în final, fracțiunile conținând dimer lizozim înalt purificat (fracțiunile 8...13 în profilul de eluție] sunt colectate și concentrate în sistemul de curgere tangențial descris mai sus. După concentrare, dimerul purificat este liofilizat. După repetarea acestui proces de câteva ori, șarjele individuale de dimer sunt purificate, introduse în apă distilată, și apoi din nou liofilizate, astfel că se obține o șarjă omogenă de dimer al lizozimului.

Testarea activității enzimei

Activitatea enzimei de dimer de lizozim preparat conform prezentei invenții poate fi testată utilizând testul descris de către Verhamme și colaboratorii, Internațional Pharmacy Journal, voi 2: 5(1988).

Acest test se bazează pe reducerea microorganismului Micrococcus lutenus în produși de descompunere solubili de către enzim-induse liză a pereților celulari ai microorganismului. Clarificarea treptată sau eliminarea totală a turbidității la o lungime de undă de 450 nm se măsoară prin fotometrul spectral și se înregistrează ca măsură a activității enzimei (activității enzimatice).

Pentru acest test, o suspensie de Micrococcus luteus este preparată. Aproximativ 30 mg de Micrococcus luteus (ATCC 4698, viu, liofilizat, produs de Boehringer Mannheim) este măcinat, transferat cu aproximativ 25 ml de tampon fosfat în balon Erlenmeyer de 100 ml și agitat încet timp de aproximativ 2 h, la temperatura camerei, utilizând un agitator magnetic. Apoi, suspensia este centrifugată timp de 1 min la 500 rpm și excesul este decantat în vas proaspăt. Mici coloane de bacterii care nu sunt suspendate au fost găsite în sediment. Suspensia este agitată în continuare, și pentru a preveni sedimentarea, se diluează cu tampon fosfat. Se măsoară în comparație cu aerul la grosimea stratului de 1 cm. Probele reprezentative corespunzătoare din suspensia diluată în această manieră, cu agitare continuă, sunt prelevate pentru măsurătorile testului.

Soluțiile de probă conținând dimerul lizozimului sunt preparate în concentrație de 1 mg/ml apă. Proba de testat este dizolvată în apă imediat înainte de

RO 114805 Bl

445 măsurătoare, și activitatea este corespunzător diluată la 1:250 sau 1:25 în apă distilată. Apoi, testul se efectuează la temperatură constantă de 25°C. Pentru acest scop, întreaga soluție trebuie să fie la 25°C, și măsurătoarea se execută cu preluare în cuvetă cu temperatura controlată (cuvetă termostatată). Volumul cuvetei este de 3 ml, grosimea stratului soluției de testat este de 1 cm și scăderea turbidității după pornirea reacției se înregistrează la 450 nm pe parcursul a 7 min. Scăderea turbidității pe minut este indicată de fotometrul spectral (Spectronic 1001, Bausch and Lomb). Amestecul de reacție se prepară din 2,95 ml de Micrococcus luteus în suspensie și 0,05 ml de soluție de probă de testat. Fiecare măsurătoare se repetă de două ori și valoarea medie se determină din aceste măsurători.

Viteza activității enzimatice determinată prin scăderea turbidității urmărită, pornind de la domeniul inițial liniar, și delta E (E = extincția perioadei de timp bacterie/minut este analizat. Valoarea delta E/minut este mai mică decât 0,03, și gradul de diluție a probei de testat poate fi selectat corespunzător. Scăderea turbidității este de asemenea determinată în proba martor de testat (Micrococcus luteus cu apă), și valoarea ce se obține prin cuvetă trebuie scăzută din valorile măsurate cu probele de testat.

Testele efectuate au indicat o semnificantă cantitate a activității enzimatice în suspensie de Micrococcus luteus cu soluție de dimer, ceea ce nu s-a observat și la proba de control de Micrococcus luteus în suspensie cu apă.

450

455

460

Se dă mai jos certificatul de analiză a produsului conform invenției

CERTIFICAT DE ANALIZĂ
PRODUS: KLP (Lidium-KLP	Lot-No.: 506459
Test	Specificații	Rezultate
Color	Alb	Alb
Solubilitate	> 50 mg/mL în H₂0	corespunde
pH	6,7 ±0,3	6,6
Greutatea moleculară (SDS)	29'000 ± 1000	28'510
Dimerul lizozimului (SDS/HPLC)	> 95%	corespunde
Conținut în proteine fără apă	> 95%	95,7%
Conținut în apă	< 15%	2,2 - 2,6%¹¹
Amoniu (proteină fără apă)	< 0,5%	corespunde
Acid acetic (proteină fără apă]	< 50 ppm	corespunde
Metale grele Farm. Elveția	să corespundă testului	corespunde
¹¹ Produs foarte higroscopic Cantitatea: 204 g Data: 17.11.1994

465

Claims

1. Dimer de lizozim purificat, caracterizată prin aceea că, conține nu mai mult de 10% în greutate, preferabil nu mai mult de 5% în greutate forme monomerice și multimerice ale lizozimei sau ale altor contaminanți.

2. Procedeu de preparare a dimerului lizozimului purificat, cuprinzând fazele de: a/ prepararea soluției de lizozim prin adăugarea monomerului de lizozim la o soluție tampon și ajustarea pH-ului la cel puțin aproximativ 9;

b/ adăugarea unui reactiv de cuplare suberimidat la soluția de lizozim și efectuarea unei dimerizări a monomerilor lizozimului în timp ce se menține pH-ul la aproximativ cel puțin 9;

c/ oprirea reacției de dimerizare la un punct dat și d/ purificarea soluției de lizozim dimerizat printr-un procedeu care cuprinde cromatografie lichidă, caracterizat prin aceea că, reacția de dimerizare din faza [c] este oprită prin scăderea pH-ului la circa 7, prin adăugare de acid, după care amestecul rezultat - opțional după filtrarea particulelor nedizolvate - este concentrat și supus la purificare conform fazei (d), care cuprinde cel puțin două faze succesive de cromatografie lichidă unde, după o primă fază de cromatografie lichidă, fracțiunile care sunt cuprinse efectiv de forma dimerică a lizozimului sunt colectate și concentrate și apoi sunt supuse la cea de-a doua fază de cromatografie lichidă.

3. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că,soluția de monomer lizozim este ajustată la un pH de aproximativ 10, preferabil adăugând NaOH.

4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, soluția din faza (a] cuprinde tampon disodiu hidrogen fosfat dihidrat.

5. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că, reactivul de cuplare este adăugat în soluția de lizozim monomeric în timp ce se menține pH-ul soluției la aproximativ 10.

6. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că, reactivul de cuplare suberimidat cuprinde dimetil suberimidat.

7. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că,faza de dimerizare se efectuează la temperatura camerei, preferabil în timp ce se execută continuu agitarea soluției.

8. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că,reacția de dimerizare din faza (c) este stopată prin adăugarea de HCI.

9. Procedeu conform revendicării 1 .caracterizat prin aceea că, se filtrează particulele nedizolvate utilizând un filtru poros cu o dimensiune a porilor de aproximativ 0,4...0,5 μηπ.

10. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde colectarea fracțiunilor de monomeri nedimerizați, urmând faza de dimerizare și recirculare a monomerilor nedimerizați în procesul de dimerizare.

11. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că,soluția de monomer al lizozimului cuprinde aproximativ 10 părți, în greutate, de monomer de lizozim per 1000 părți, în greutate, de tampon, la care se adaugă reactivul de cuplare în cantitate de aproximativ 1 parte, în greutate.

12. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cel puțin una, preferabil prima fază de cromatografie lichidă, este efectuată folosind o rășină schimbătoare de cationi cu o matrice aragoză, preferabil S-Sepharoză-FF.

RO 114805 Bl

535

13. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cel puțin una, preferabil a doua fază de cromatografie lichidă, este efectuată folosind o rășină de filtrare pe gel cu o matrice de dextran reticulat, preferabil Sephadex G-5O F.

14. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, fracțiunile colectate după prima și/sau a doua fază de cromatografie lichidă sunt concentrate cu ajutorul unui sistem de curgere tangențial.

15. Procedeu conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, produsul lizozim dimer purificat, colectat după a doua fază de cromatografie lichidă, este liofilizat.

16. Procedeu conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că produsul dimer de lizozim este lipsit în mod substanțial de formele monomerice ale lizozimei și de alți contaminanți.