JPH03280899A - 酵素活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体試料中のリポ多糖分解活性の測定方法に
関する。

（従来の技術及び問題点） リポ多糖は、ダラム陰性細菌の外膜構成成分であり、他
の生物に対して様々な生理活性を持つことが知られてい
る。特に哺乳動物に対しては、血中に入ることにより発
熱、白血球や血小板の減少、エンドトキシン血症、エン
ドトキシンショック、骨吸収等の様々な病態を引き起こ
すことが知られている。そのためリポ多糖分解活性を迅
速かつ簡便、正確に測定することは大変重要である。

これまでのリポ多糖の分解活性の測定方法としては、ま
ず、リポ多糖の多岐にわたる生理活性を利用して、それ
らの作用の低下の度合で判定する方法が報告されている
。例えばエクスベリエンティア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ）　−第３５巻・第４号・４９４〜４９５頁（１９７
９年）にはヒトの血球凝集反応の阻害活性の低下、払掃
体性の低下の度合を調べることによって、リポ多糖の分
解活性を測定する方法が記載されている。また、ヘモス
タシス（）１ａｅｓｏｓｔａｓｉｓ　）第７巻・１８３
〜１８８頁（１９７８年）には、リポ多糖の生理活性の
一つであるカブトガニの血球凝固作用において、リポ多
糖により活性化される因子の発色合成基質を利用したリ
ポ多糖の微量定量法が記載されている。しがし生理活性
を測定する操作自体が、無菌操作を伴う大変煩雑な操作
であるため、多数の測定試料を一度に処理する場合にお
いて生理活性の低下でリポ多糖分解活性を測定すること
は大変困難である。また、これらの生理活性を測定する
際に使用される血球、補体等の材料のばらつきによって
大きく測定値が変化し、リポ多糖分解活性の強さを定量
的に比較することはできないという問題がある。

次にザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ
ー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｗｌｓｔｒｙ）　・第２５７巻・１７号・
１０２２２〜１０２３４頁（１９８２年）には、放射性
同位元素で標識したリポ多糖を調製し、この標識リポ多
糖を用いて分解反応を行い、薄層クロマトグラフィーに
おける移動度の違いから分解活性の検出を行ったという
報告がある。しかし放射性同位元素で標識したリポ多糖
の調製は、［３２ｐｌリン酸あるいは［１４（：］グル
コースを加えた培地で微生物を培養し、その菌体のリポ
多糖を分離・精製するという調製法のため、多大な時間
と労力が必要である。また、実験操作上の安全性にも問
題があり、多数の測定試料のリポ多糖分解活性を調べる
場合、現実的な方法ではないことがわかった。

また、以上の方法の問題点として、リポ多糖分解活性の
強さを定量的に比較することができないという点があっ
た。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、かかる従来のリポ多糖分解活性測定方法に
おける欠点を克服すべく鋭意研究を行った結果、簡便か
つ定量的にリポ多糖分解活性の測定が可能な方法を完成
するに至った。

すなわち、本発明は、（１）生体試料中のリポ多糖分解
活性を測定するに際し、リポ多糖に生体試料を作用させ
、遊離した脂肪酸を定量することを特徴とするリポ多糖
分解活性の測定方法、及び（２）リポ多糖より遊離した
脂肪酸の測定方法において、脂肪酸に蛍光標識化試薬を
反応せしめ、生成した脂肪酸の蛍光誘導体を定量するこ
とを特徴とするリポ多糖分解活性の測定方法である。

本発明でいう生体試料とは、生体由来のものであればい
かなるものでもよく、例えば細胞あるいは微生物を培養
した培養液そのもの、培養液から集めた培養細胞あるい
は微生物菌体、培養液から細胞あるいは微生物を遠心分
離などで取り除いた培養土清液、細胞あるいは微生物の
破砕液等のが挙げられる。また、本発明でいうリポ多糖
とばりビドＡとよばれる脂質部分と、これに共有結合し
た多糖鎖からなる化合物であり、ダラム陰性細菌表層の
外膜の構成成分の一つである。多糖鎖部分の脂質との結
合に近い部分は近縁な菌種間では比較的均一な構造をと
るが、それに続く多糖鎖部分ば菌種によって構造が異な
っている。このリポ多糖は発熱作用、白血球や血小板の
減少等様々な失理的活性を持ち、特にリビドＡとよばれ
る脂質部分かりボ多糖の生理活性の発現に重要な役割を
果たしている。

本発明でいうリポ多糖分解活性とは、リポ多糖に作用し
てその構成単位である脂質部分から脂肪酸を遊離しつる
活性をいう。遊離する脂肪酸の種類は測定に際して使用
するリポ多糖の種類、すなわちリポ多糖がどういう菌体
から抽出、精製されたものであるかによって異なってく
る。例えば大ｌＩ菌由来のリポ多糖を用いた場合には、
検出される脂肪酸は３−ヒドロキシミリスチン酸、ラウ
リン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
ヒドロキシへキサデカジエン酸、ヒドロキシオクタデセ
ン酸等である。

リポ多糖の生理活性は非常に微量であっても発現される
。このため、　リポ多糖分解活性測定においても、非常
に微量のリポ多糖に作用してＭＩＩｌシた極微量の脂肪
酸を検出できることが重要である。

遊離した脂肪酸の高感度検出・定量法としては、蛍光Ｉ
’ｍ化法を用いることができる。これは発蛍光団にカル
ボン酸と結合する構造をもたせた蛍光ＩＩ！識化賦化試
薬肪酸と反応させることで、脂肪酸の蛍光誘導体を形成
させ、この脂肪酸の蛍光誘導体を検出することで脂肪酸
を定量する方法である。

この蛍光法による脂肪酸の定量方法は、蛍光エネルギー
を検出・定量するため、高感度の脂肪ＭＳ定が可能であ
り、また、吸光、発光の２段階の過程を経る測定法であ
るため、選択性が非常に高いという利点がある。蛍光Ｉ
ｌ！識化賦化試薬ては、発蛍光団に、カルボン酸に結合
する基を有する化合物であればいかなるものでもよい。

例えば７−アセトキシ−４−（ブロモメチル）コラマリ
ン、９−アンスリルジアゾメタン等の試薬が挙げられる
。脂肪酸の蛍光誘導体の検出方法には高速液体クロマト
グラフィー、薄層クロマトグラフィー等を用いることが
できる。高速液体クロマトグラフィーには、脂肪酸の蛍
光誘導体を分離できるカラムならばいかなるカラムでも
用いることができるが、例えばオクタデシル基系の逆相
カラム、オクチル基系の逆相カラム等が挙げられる。分
離した脂肪酸の蛍光誘導体の検出・定量には蛍光分光検
出器を用いることができる。また薄層クロマトグラフィ
ーには脂肪酸の蛍光誘導体を分離できるプレートならば
いかなるプレートでも用いることができるが、例えばオ
クチル基系、オクタデシル基系の逆相プレート等が好適
である。分離した脂肪酸の蛍光誘導体の検出・定量には
デンシトメーター等を用いることができる。

本発明によるリポ多糖分解活性測定方法を具体的に以下
に説明する。

（１）リポ多糖を水あるいは緩衝液に溶解させる。ここ
で用いる緩衝液は、リポ多糖のアルカリあるいは酸加水
分解を防ぐために、ｐＨ６〜８であることが好ましい。

緩衝液の種類はＰＨ６〜８付近に緩衝能を持つ緩衝液な
らばいずれのものでもよく、例えばリン酸緩衝液、　ト
リス塩酸緩衝液等が好適である。リポ多糖の濃度は、測
定に使用するリポ多糖の種類によって異なってくるが、
０．０１〜０．５ｚが好ましい。

（２）生体試料を調製する。それが細胞あるいは微生物
の場合は、０．０１〜１（ｌとなるように水あるいは緩
衝液に懸濁する。それが培養上清の場合は培養細胞ある
いは微生物を遠心分離で取り除いたものをそのまま用い
る。それが細胞あるいは菌体破砕液の場合は細胞あるい
は菌体が１０ズとなるように水あるいは緩衝液中に懸濁
し、超音波破砕機、ホモジェネーター等で破砕液中のタ
ンパク量が増加しなくなる程度まで破砕し、遠心分離な
どで細胞膜あるいは菌体を取り除く。後に続く抽出操作
において大量の沈澱が生じるのを防ぐために、最軒的な
タンパク濃度は２％以下とすることが望ましい。

（３）リポ多糖濃度が０．０１〜０．１χとなるように
生体試料と混合し、一定温度、一定時間反応させる。

温度は細胞あるいは微生物の培養条件に近い温度範囲な
らばいずれでもよいが、１０〜４０℃が望ましい。反応
時間は生体試料が失活しない時間範囲ならばいずれでも
よいが、３０分〜２０時間が好適である。以上の操作で
リポ多糖に生体試料を反応させた液を反応液とする。

（４）反応液に有機溶媒を加えて振とうし、反応液中に
遊離した脂肪酸を抽出する。この抽出に使用する有機溶
媒はクロロホルム、エーテル、酢酸エチル等、あるいは
それらの有機溶媒にメタノールを１０対１〜１対１の割
合で混合したものが好ましいが、クロロホルムとメタノ
ールを２対１に混合した液が好適である０反応液中の脂
肪酸を抽出した有機溶媒層を水層から分離し、有機溶媒
層中の有機溶媒を減圧下で蒸発させる。その後、蒸発さ
せた有機溶媒と同容量のメタノールを加える。このメタ
ノール溶液を抽出液とする。

（５）抽出液中の脂肪酸の検出・定量を行う。脂肪酸の
蛍光標識化試薬として９−アンスリルジアゾメタンのメ
タノール溶液を用い、抽出液と同量混合し、２０゛Ｃ１
約３０分反応させ、脂肪酸の蛍光誘導体とする。この脂
肪酸誘導体を高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマ
トグラフィー等にて検出・定量する。

高速液体クロマトグラフィーにおいてはオクチル基系、
オクタデシル基系の逆相カラム等を用いることができる
。展開溶媒はメタノール、アセトニトリル等の有機溶媒
、あるいはそれらの有機溶媒と水との混合液等を用いる
ことができるが、アセトニトリルと水の比が４対１〜１
０対１のものが好適である。検出に蛍光分光検出器を用
いる場合には、励起波長３６５ｎｍ、検出波長４１２ｎ
−とする。

薄層クロマトグラフィーにおいてはオクチル基系、オク
タデシル基系の逆相プレートを用いることができる０Ｍ
開溶螺としてはアセトン、アセトニトリル、クロロホル
ム、メタノール、プロパツール、酢酸、アンモニア水、
水等を混合したものを用いることができるが、アセトニ
トリル、メタノール、水、酢酸を９５対２対３対０．５
の割合で混合したものが望ましい、検出に蛍光デンシト
メーター等を用いる場合には、励起波長は３６５ｒｍ、
検出波長は４１２１■とする。

（６）遊離した脂肪酸の定量値からリポ多糖分解活性を
求める。ここでリポ多糖分解活性１ｕｎｉｔとは、３０
℃の条件下で、　１時間当たり　１ｎ■ｏｌｅの脂肪酸
を遊離しろる分解活性と定義する。

（効果） 本発明のリポ多糖分解活性測定方法は、（１）活性測定
方法が非常に簡便である、（２）特別の試薬あるいは操
作を必要としない、（３）常に一定の条件で多数の測定
試料を同時に処理できる、（４）分解活性の強さを定量
的に比較できるという特徴を持ち、数多くの測定試料の
リポ多糖分解活性測定が短時間に測定可能となる。

以下実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 土壌微生物を培養して得た生体試料である菌体破砕液８
００μｍにリポ多糖　（デイフコ社製、大腸菌　０１１
１Ｂ４株由来）を５　Ｂ／ｍｌの濃度で含む１０　ａＮ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）　　２００　μｌを加え反応液
とする。コントロールとして破砕液８００μｍに１０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）　　２００μｌを加えたもの
を用意する。反応液とコントロールを３０°Ｃで１２時
間反応させる。それぞれにクロロホルムとメタノールを
２対１の割合で混合した溶液を　１’　ｍｌ加え、振と
うにより抽出を行う。その後静置により水と分離した有
機溶媒層をとり、有機溶媒を蒸発させ、メタノール１寵
ｌを加える。このメタノール溶液に　１　ｍＭ　９−ア
ンスリルジアゾメタンのメタノール溶液１■ｌを加え、
２０°Ｃで３０分反応させた（組　高速液体クロマトグ
ラフィーにて脂肪酸の蛍光誘導体の検出、定量を行う。

高速液体クロマトグラフィーは島津製作所製のＬＣ３Ａ
システムを用い、流速は　１■ｌ／ｊｉｎ、カラムはオ
クタデシル基系逆相カラム（島津製作所製、シムパック
０ＤＳ）を用いる。展開溶媒には９０χアセトニトリル
を用い、島津製作所製蛍光分光検出器ＦＬＤ−１で検出
する。　　結果を第１表に示す。

第」−老

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料中のリポ多糖分解活性を測定するに際し
   、リポ多糖に生体試料を作用させ、遊離した脂肪酸を定
   量することを特徴とするリポ多糖分解活性の測定方法
2. （２）請求項第（１）項の測定方法において、脂肪酸に
   蛍光標識化試薬を反応せしめ、生成した脂肪酸の蛍光誘
   導体を定量することを特徴とするリポ多糖分解活性の測
   定方法