BG2481U1

BG2481U1 - Пробиотичнахранителна добавка

Info

Publication number: BG2481U1
Application number: BG3604U
Authority: BG
Inventors: Валерий Даниленко; Николаевич Даниленк Валерий; Ольга Аверина; Викторовна Аверина Ольга
Original assignee: „Биотехфарм“ Оод
Priority date: 2016-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2017-03-31

Abstract

Полезният модел се отнася до пробиотична хранителна добавка, притежаваща имуномодулиращо действие, която намира приложение за профилактика на дисбактериоза с различна етиология, подобряване на общото състояние на червата, намаляване на възпалителните процеси на чревната лигавица и за комплексна терапия на заболяванията на стомашно-чревния тракт. Тя включва лиофилизирана жизнеспособна култура Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ АС-1928 със съдържание на активни жизнеспособни клетки от 108 до 109 CFU, арабиногалактан, витамин Dз и магнезиев стеарат. Предимство на пробиотичната хранителна добавка е високото съдържание на активни клетки на селекционния пробиотичен щам, който притежава висока преживяемост и добра жизнеспособност, както по време на производство, така и в процеса на съхранение на добавката.

Description

Област на техниката

Полезният модел се отнася до пробиотична хранителна добавка, притежаваща имуномодулиращо действие, която намира приложение за профилактика на дисбактериоза с различна етиология, подобряване на общото състояние на червата, намаляване на възпалителните процеси на чревната лигавица и за комплексната терапия на заболяванията на стомашно-чревния тракт.

Предшестващо състояние на техниката

Организмът на съвременния човек, особено на хората, живеещи в мегаполиси, е подложен на негативно въздействие от различни фактори, свързани с лоша екология, постоянен стрес, небалансирано хранене, употребата на различни лекарствени средства и антибиотици, което се отразява негативно върху неговия имунен статус. Това определя в значителна степен стремежа на медиците да използват за оздравяване на човешкия организъм средства, коригиращи нарушената имунна система. Перспективни в това отношение са биологично активните състави, включващи пробиотични бактерии с имуномодулиращи свойства, които съчетават благоприятното въздействие върху имунната система на организма с инхибиращо въздействие върху инфекционните агенти.

Известно е, че бифидобактериите влияят благотворно на здравето на човека чрез антагонизма си към патогенни бактерии и способността към модулации на местния и системен имунен отговор. Те участват в стабилизацията и съхранението на чревната бариера, способни са да преобразуват различни питателни компоненти в биологично активните молекули, да регулират работата на червата и да поддържат микробния хомеостаз. (Bermudez-Brito М, Plaza-DHaz J, Mucoz-Quezada S, Gymez-Llorente C, Gil A Probiotic Mechanisms of Action. Ann Nutr Metab. 2012, 61, 160-174; Lyte M. The microbial organ in the gut as a driver of homeostasis and disease. Med Hypotheses. 2010,74(4), 634-8). Сред известните видове бифидобактерии представителите на вида Bifidobacterium longum се явяват най-разпространените бактерии сред бифидофлората, както на възрастния човек, така и на децата (Turroni F., Peano С., Pass D.P. et al. Diversity of Bifidobacteria

UI within the Infant Gut Microbiota PLoS ONE. 2012, 7(5), 36957). Бифидобактериите се считат за безопасни и широко се използват във функционални хранителни продукти, биологично активни добавки и лекарствени средства в пробиотично качество.

Международна заявка WO 2010055499 описва група изолирани пробиотични бактерии от вида Bifidobacterium longum и използване на техните жизнеспособни клетки в комбинация с фармацевтично приемлив носител под форма на капсули, таблетки или прах за подобряване на чревната микрофлора и улесняване на стомашночревния транзит.

Международна заявка WO 2008141240 разкрива пробиотични храни и състави на хранителни добавки с имунологична активност. Съставите съдържат жизнеспособни микробни клетки от най-малко един пробиотик в комбинация с поне един естествен полизахарид под формата на капсули, гелкапсули, таблетки или ефервесцентни таблетки. В един вариант на изпълнение пробиотикът е Bufidobacterium longum.

Задача на полезния модел е създаването на пробиотична хранителна добавка, притежаваща силно изразено имуномодулириращо и противовъзпалително действие, приложима за профилактика и отстраняване на дисбиотични нарушения на червата, конюгирани с проявления на различни заболявания на стомашно-чревния тракт, в която да бъде включен селекционен щам от вида Bifidobacterium longum, притежаващ добра жизнеспособност по време на производство и съхранение, с високо съдържание на активни клетки с висока преживяемост.

Техническа същност на полезния модел

Задачата се решава чрез пробиотична хранителна добавка с имуномодулиращи свойства, приложима за профилактика на дисбактериоза и възпалителни заболявания на червата във вид на чревно-разтворима капсула, включваща лиофилизирана жизнеспособна култура Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928 със съдържание на активни жизнеспособни клетки от 10⁸ до 10⁹ CFU, естествения полизахарид арабиногалактан, витамин D₃ и магнезиев стеарат. Компонентите на пробиотичната хранителна добавка са в следните количествени съотношения в състава на капсулата: от 200 до 250 mg

2481 UI

Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, от 200 до 250 mg арабиногалактан, от 10 до 15 microg витамин D₃ и от 2,5 до 3,5 mg магнезиев стеарат.

Щамът Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928 е пробиотичен селекционен щам изолиран от стомашно-чревния тракт на възрастен здрав човек. Щамът е охарактеризиран в съответствие с изискванията по биобезопасност. Генът на щама е секвениран при използване на технологии от ново поколение (Roche 454) и получените контиги са събрани в единна последователност. ДНК геномът на щама Bifidobacterium longum subsp. longum GT15 е депозиран в GenBank под № СР006741. Щамът Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928 проявява имуномодулираща активност, проявяваща се в индукция на експресия на клетки in vitro, както на противовъзпалителния цитокин 1L-10, така и на провъзпалителните цитокини IL-8 и FHO-алфа в ТНР-1.

Арабиногалактанът е неусвояем полизахарид, който служи за питателна среда за пробиотика Bifidobacterium longum subsp. longum GT15 в организма. Арабиногалактанът избирателно стимулира ръста на полезната микрофлора на червата, увеличава образуването на извънредно важни за нормалната им работа чревни мастни киселини с къси вериги и проявява имуномодулиращи свойства. Арабиногалактанът е пребиотик, признат за перспективен при прилагане в медицината, фармакологията и биотехнологиите, който повишава терапевтичния ефект при едновременна употреба с пробиотици, съдържащи живи лакто- и бифидобактерии.

Витамин D₃ /холекалциферол/ регулира специфичния и неспецифичен имунитет чрез различни механизми. Рецепторите към хормонално-активните форми на витамин D₃ са идентифицирани в активираните пролифериращи Т и В лимфоцити, моноцити и макрофаги.

Използването на чревно-разтворими капсули позволява да се изключи агресивното въздействие на стомашния сок и жлъчката върху компонентите на разработената пробиотична композиция и повишава нейната ефективност.

За приготвяне на пробиотичната хранителна добавка, пробиотичният селекционен щам Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928 се култивира на теч на и агаризирана среда Манн-Рогоза-Шарп / MRS/ с добавка на 0,05% стерилен L-цистеин хидрохлорид. Култивирането се осъществява в анаеробни условия в течение на 24-48 h. Температурата на инкубация е 37°С. Пробиотичният щам Bifidobacterium longum subsp. longum GT15 нараства във ферментатора до концентрация 10⁸- 10⁹ CFU, пренася се на защитна среда за изсушаване, съдържаща 1 % желатин и 10% захароза, лиофилизира се и се смесва с арабиногалактана, витамин D₃ и магнезиевия стеарат. Получената хомогенна смес стерилно се разфасова в чревно разтворими капсули.

Предимство на пробиотичната хранителна добавка е силно изразеното й имуномодулиращо и противовъзпалително действие, нейната ефективност при профилактиката и отстраняването надисбиотичните нарушения на червата, конюгирани с проявления на различни заболявания на стомашно-чревния тракт, а също така и с високото съдържание на активни клетки на селекционния пробиотичен щам с висока преживяемост и добра жизнеспособност, както по време на производство, така и в процеса на съхранение на добавката.

Примери за изпълнение на полезния модел

Полезният модел се илюстрира със следните примерни изпълнения.

Пример 1.

За изготвяне на хранителната добавка щамът Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928, се култивира на течна и агаризирана среда Манн-Рогоза-Шарп (MRS, Himedia, Индия), към която е добавен 0,05% стерилен L-цистеин хидрохлорид. Съставът на 1 1 среда MRS в грамове е: протеозопептон - 10,0; месен екстракт - 10,0; дрождев екстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; полисорбат 80 -1,0; амониев цитрат - 2,0; натриев ацетат - 5,0; магнезиев сулфат - 0,1; манганов сулфат - 0,05; калиев фосфат двузаместен - 2,0. pH на средата при 25°С е 6,5. Култивирането се осъществява в анаеробни условия в течение на 40 h с използване на анаеростат HiAnaerobic System-Mark III и rasnaKerAnaeroHiGas Pack на фирмата Himedia. Температурата на инкубация е 37°С. Концентрация на пробиотичния щам в културалната среда в края на процеса е 10⁹CFU/ml. Културата се пренася на защитна среда за изсушаване, съдържаща 1% желатин и 10%

2481 UI захароза и се лиофилизира.

Лиофилизираният жизнеспособен селекционен щам Bifidobacterium longum subsp. longum

GT 15, ВКПМ AC-1928 се използва за изготвяне на биологично активна хранителна добавка със следния състав:

Компоненти на състава	Количество за една капсула
Лиофилизирана жизнеспособна култура Bifidobacterium longum subsp. longum GT 15 със съдържание на активни жизнеспособни клетки 10⁹CFU	250 mg
арабиногалактан	250 mg
витамин D₃	15 pg/600 МЕ/
магнезиев стеарат	3,5 mg

Компонентите на пробиотичната хранителна добавка се дозират в смесител, смесват се, 2θ след което получената смес се разфасова при стерилни условия в чревно-разтворими капсули от 500 mg.

Жизнеспособността на щама се съхранява неизменна в течение на година. 25

Пример 2. Изследване на специфичната активност на пробиотичната хранителна добавка

Изследването се проведе по модела експериментална ентеропатия, предизвикана от 5-флуороурацил в червата на плъхове линия Вистар. Изследвано бе изменението в микробиота на червата, морфо-функционалните характеристики на червата и състоянието на имунитета на животните, върху които се прилага състава, описан в Пример 1, в сравнение с контролна група и с групи, получаващи препаратите, използвани за сравнение Бифиформ (Дания) и Линекс (Словения). Наблюдава се: бърза нормализация на микробиота (изчезване на признаците на прекомерен ръст на клебсиел, протея, стафилококи и други условно-патогени бактерии и гъби), увеличение съдържанието на продуцирания бутират Faecalibacterium prausnitzii; стимулация на синтеза на противовъзпалителните цитокини IL-10 и ТСРбета, тенденция към намаляване на синтеза на провъзпалителния цитокин МСР1; увеличение на фагоцитарната активност на левкоцитите; удебеляване наслоя слуз, отделящ се върху микробиота на червата от повърхността на епитела; увеличение на изработката на основни фосфатазни клетки на лигавицата на тънките черва; бърза компенсация след токсичното действие наантимикробните препарати по биохимични показатели на кръвния серум. Получените данни при изследване на композицията, описана в Пример 1 показват, че тя не отстъпва на препаратите, използвани за сравнение - Бифиформ и Линекс.

Пример 3. Изследване на токсичността на пробиотичната хранителна добавка

Определянето на острата токсичност на състава, описан в Пример 1, е проведено при използване на различни дози от него върху безпородни бели мишки (10⁷-10¹⁰ CFU) и плъхове линии Вистар (10⁸-10” CFU). Еднократното вътрестомашно се въвежда изследваният препарат при всички животни. В максималните 35 използвани дози той не предизвиква загиване на животните и проявление на интоксикация. При интраперитонеално въвеждане на пробиотика при дози: 10¹⁰ CFU за мишки (средно тегло 20 g) и 10¹¹ CFU за плъхове (средно тегло 70 g) също ^0 не бе констатирано загиване на животните и проявление на интоксикация. Терапевтичната доза на пробиотика за хора при средно тегло 50 kg е 10⁸-10¹⁰ CFU. При отчитане на съотношението на теглото на тялото на човека и това на гризачите, е видно, че получените при мишки и плъхове 45 дози от препарата превъзхождат терапевтичните дози многократно.

Изследването на подострата токсичност на хранителната добавка върху мишки при вътрестомашно въвеждане не доведе до значими отклонения в динамиката на натрупване на телесна маса. Посявка върху фекалии не показва признаци на дисбиоза в червата на мишки. Изслед4

2481 UI ването на хроничната токсичност върху двата вида животни (мишки и плъхове) при прилагане вътре в стомаха, не показа значими отклонения в динамиката на натрупване на телесна маса, потреблението на храна и вода, хематологичните и биохимични показатели, морфологията на вътрешните органи на животните и не доведе до повишаване температурата на тялото.

Получените резултати позволяват пробиотичната хранителна добавка на основа на щам Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, арабиногалактан и витамин D₃ при прилагане в терапевтични дози, да се отнесе към нетоксичните лекарствени вещества.

Пример 4. Изследване на специфичните видове токсичност на пробиотичната хранителна добавка

Получените резултати при изучаване на имунотоксичността позволяват да се направи извод за това, че в диапазона на изследване при дози (10⁷ и 10⁸ CFU/мишка) хранителната добавка не показва имунотоксично действие, а проявява имуностимулиращо (фагоцитозно) и супресиращо (реакция на хиперчувствителност от забавен тип) действие и не отменя образуването на антитела, и инициирането на протеинов антиген.

При изучаване на мутагенността е установено, че пробиотичната хранителна добавка, както в доза 10'° CFU при перорално въвеждане и 24 h експозиция, така и при петкратно въвеждане в доза 10⁸ CFU, не предизвиква статистически достоверно увеличение на количеството клетки с хромозомни аберации в костния мозък на миш10 ки линии СВА. Следователно пробиотичната хранителна добавка не притежава мутагенна активност по отношение на соматичните клетки на топлокръвни животни.

При изследване на тератогенността на пробиотичната хранителна добавка, от Пример 1, върху плъхове линии Вистар (препаратите се въвеждат на бременни самки вътре в стомаха), ембрио анализът/фетолеталното действие не показва превишение на нивото на до- и постимплантационна гибел на плода на сумарния ембрио(фето)летален ефект, в сравнение с показателите на контролата. Също така, при нито една от опитните групи не бе проявена макропатология на плода.

Claims

Претенции

1. Пробиотична хранителна добавка, включваща жизнеспособни клетки на пробиотична бактерия от вида Bifidobacterium longum и естествен полизахарид, поместени в капсула, характеризираща се с това, че в състава на хранителната добавка са включени също витамин D₃ и магнезиев стеарат, пробиотичната бактерия е Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, ВКПМ AC-1928 в лиофилизирана форма със съдържание на активни жизнеспособни клетки от 10⁸до 10⁹ CFU, естественият полизахарид е арабиногалактан, а капсулата е чревно-разтворима капсула, като компонентите са в следните количествени съотношения: от 200 до 250 mg Bifidobacterium longum subsp. longum GT15, от 200 до 250 mg арабиногалактан, от 10 до 15 microg витамин D₃ и от 2,5 до 3,5 mg магнезиев стеарат.