BG113615A - Миконозид-съдържащ екстракт от инвитро системи на растения, принадлежащи към родовете haberlea и ramonda, метод за неговото получаване и използване като хемо-, радио- и uv-протектор - Google Patents

Abstract

Настоящото изобретение се отнася до миконозид-съдържащ екстракт, получен от инвитро системи на растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae, по-специално от родовете Haberlea и Ramonda, включващи видовете Haberlea rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C. B. Clarke; Ramonda myconi (L.) Rchb.; Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic, както и техните хибриди и метод за неговото получаване. Освен това, настоящото изобретение се отнася и до използване на споменатия екстракт в хуманната и ветеринарната медицина, хранителните добавки и козметиката като хемо-, радио- и UV-протектор. Описаният екстракт от инвитро системи на растения съдържа поотделно или заедно Екстракт 1 на фракция, съдържаща основно флавон-С гликозиди и фенилетаноиди и Екстракт 2 на фракция, съдържаща основно фенилетаноиди, по-специално миконозид и пауцифлосид, където фенилетаноидите на Екстракт 1 съдържат в % тегл. от 0,1 до 55,0 миконозид и пауцифлоцид и до 100% тегл. свободни феноли, захари, органични-, мастни- и аминокиселини, а Екстракт 2 съдържа фенилетаноидите миконозид и пауцифлосид в % тегл. от 55,0 до 99,9, както и до 100% тегл. фенолни съединения, моно, дизахари или техни остатъци. Получените Екстракти 1 и 2 съгласно изобретението съдържат основно фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) в широк спектър и количествени граници. Тези съединения (по-специално миконозида), са носител на високи биологични активности, с доказани в настоящото изобретение антиоксидантна, антимутагенна и антикластогенна активност, което позволява използването им поотделно или заедно чрез контролирано смесване, както и да бъдат кондиционирани чрез разреждане, за приготвяне на продукти, използвани като природни хемо-, радио- и UV-протектори с контролирана степен на защита. Последните намират приложение в хуманната и ветеринарната медицина, хранителните добавки и козметиката за профилактика и лечение на вредните хемо-, радио- и UV-въздействия

Description

МИКОНОЗИД - СЪДЪРЖАЩ ЕКСТРАКТ ОТ ИНВИТРО СИСТЕМИ НА РАСТЕНИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩИ КЪМ РОДОВЕТЕ HABERLEA И RAMONDA, МЕТОД ЗА НЕГОВОТО ПОЛУЧАВАНЕ И ИЗПОЛЗВАНЕ КАТО ХЕМО-, РАДИО- И UVПРОТЕКТОР

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до миконозид съдържащ екстракт, получен от инвитро системи на растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae, поспециално от родовете Haberlea и Ramonda, включващи видовете Haberlea 10 rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C.B.Clarke; Ramonda myconi (L.) Rchb.;

Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic, както и техните хибриди и метод за неговото получаване. Освен това, настоящото изобретение се отнася и до използване на споменатия екстракт в хуманната и ветеринарната медицина, хранителните добавки и козметиката като хемо-, радио- и UV протектор.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ

Растенията в дивата природа или култивираните с помощта на традиционни селскостопански техники често произвеждат ниски нива на желаните биоактивни съединения. Освен това, има лечебни растения, които е невъзможно да се отглеждат 20 и такива, които са редки или застрашени в т.ч. и видовете, принадлежащи към родовете Haberlea и Ramonda като Haberlea rhodopensis, Ramonda serbica и Ramonda nathaliae, което прави ценните биологично активни съставки, които природно се синтезират недостъпни за индустрията. Голямото търсене на натурални растителни биологично активни вещества и ограниченията на химичния синтез, насърчават 25 необходимостта от получаването на активни съставки чрез биотехнологични методи.

Растителната биотехнология и по-специално растителните инвитро системи, са обещаващ инструмент за възобновимо получаване/производство на ценни растителни биологично активни съставки при контролируеми условия. При използването на растителни инвитро системи, различни съединения могат да се 30 получават в значително по-високи концентрации, отколкото при дивите растения без да се увреждат натуралните хабитати и да се нарушава биоразнообразието.

През последните години растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae и растителните видове като Haberlea rhodopensis и Ramonda serbica привлякоха вниманието на изследователите по отношение на благоприятното си въздействие върху здравето на хората и животните.

При съвместно проучване са създадени национални ин- витро колекции на Ramonda serbica в Албания и България и Ramonda nathaliae в Македония, както и е избран метод на микроразмножаване с оценка на полиморфизма на някои естествени популации. (E.Daskalova et.al, April 2012,Biotechnology & Biotechnological Equipment 26(1):16-25).

Метаболитните промени в Ramonda serbica u Ramonda nathaliae са изследвани по време на тяхното изсушаване и възстановяване посредством 1H-NMR и GC-MS и е представен метаболитния състав в растенията. (Dejan Godeva, et.al, Phytochemical analysis vol 33, issue 6/p.961-970, Aug. 2022).

Изследвания на класически водно-алкохолни екстракти от Haberlea rhodopensis показват уникални лечебни свойства и фармацевтичен потенциал, свързан с техните антиоксидантни, радиопротективни, антикластогенни, химиопротективни, цитопротективни, антимикробни, антимутагенни, имунологични, противоракови и против стареене ефекти (Bankova R., et al..Tradition and modernity in veterinary medicine, 2022, vol. 7, No 1(12).

Литературни източници потвърждават, че повишаването на свободните радикали (ROS) в клетките - т.нар. оксидативен стрес - е причина за увреждания на геномната ДНК и възникване на мутации. ROS като резултат от окислителноредукционните реакции, протичащи в организма са силно реактивоспособни, причиняват значителни биологични увреждания, , което води до мутации в ключови гени и в крайна сметка до развитието на ракови образувания, хронични заболявания и др.

Антиоксидантните свойства на екстракти от интактни растения, по-специално на фенолни компоненти от Haberlea rhodopensis са известни от литературните източници (Kondeva-Burdina М, et al Pharmacogn Mag. 2013 Oct;9(36)) и (Mihaylova, D. Et al., , V., 2013. J.F. Biochemistry, 37(3). Многобройни проучвания показват, че съвременният човек е подложен на влиянието на фактори на околната среда като слънчева радиация (UV-светлина в диапазона на UVA и UVB спектъра). Също така, свободните радикали, генерирани след облъчване с гама радиация са силно реактивоспособни и могат да предизвикат верижни реакции, водещи до възникването на значителни биологични увреждания. Провеждането на химиотерапия при раковите заболявания също предизвиква силен оксидативен стрес, който поразява множество клетъчни цели и може да редуцира действието на противораковите лекарства. Използването на анти-оксиданти по време на химиотерапията може да подсили терапевтичния ефект. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.goV/15523100/).

Екстрактите от интактни растения на Haberlea rhodopensis притежават радиопротективни свойства (Georgieva S, et.al.Indian J Exp Biol. 2013 51(1), както и от Georgiev, Y.N.,et al., J.Ethnopharmacology, 2020, 249, и (Bankova, R.,2022 Tradition and modernity in veterinary medicine, 2022, vol. 7, No 1(12)) Georgieva, S., Gencheva, D., Popov, B., Grozeva, N., & Zhelyazkova, M. (2019). Radioprotective action of resurrection plant Haberlea rhodopensis Friv.(Gesneriaceae) and role of flavonoids and phenolic acids. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 25(Suppl. 3), 158-168, като учените не са изследвали съединенията, носители на тези свойства, а предполагат че те се дължат на наличието на фенолни киселини и флавоноиди в екстракта.

Известно е още, че някои природни гликозидирани полифеноли (GPPs) (основно вербаскозид) проявяват слънце-защитни свойства (US 2017/16613858).

Също така, екстракт от друг тип клетъчна култура, принадлежаща към родовете Syringa, по-специално от Syringa vulgaris е описан в патент ЕР2319914 и метод за получаването му. Описаният екстракт съдържа от 20% тегл. до 90% тегл. фенилпропаноиди (които съдържат от 5-20% изовербаскозид) и от 80% тегл. до 10% тегл. други chromophore free fractions, съдържащи главно олиго- и полизахариди, протеини и липидни молекули. Тази клетъчна култура има висока антиоксидантна активност, стимулираща производството на колаген, активност и характеристики за регулиране на пигментацията.

Известен е от WO2021184086 (Инова БМ) екстракт от инвитро култури на Haberlea rhodopensis, съдържащ полифеноли 25-35% тегл. от общия екстракт и други фракции до 100% тегл. като: органични-, мастни- и амино киселини, заедно със стероли, захари и свободни феноли, при количество на фенилетанода миконозид от 18 до 35 % тегл. от полифенолната фракция. Описаният екстракт съдържа лимитирано количество полифеноли, съответно фенилетанодни гликозиди като миконозид .Цитираният документ описва детайлно принципите на създаване на растителни инвитро системи и размножаването на растителните инвитро култури върху твърда и в течна хранителна среда за култивиране. Използваните в него специфични условия при биотехнологичните методи за мащабно култивиране на растителни инвитро системи са подходящи за конкретните растителни видове и са от особена важност за производството на специфични биологично активни съединения/метаболити, както и за желаните целеви съединения в тяхното контролирано количествено съдържание и използването им за различни цели.

От особена важност за екстрактите от растителни инвитро системи, използвани като природни хемо-, радио- и UV протектори с висока ефективност и ниска токсичност, е наличието им в контролирано в широки граници съдържание, което да позволи използването им в продукти с различно приложение, тяхното фино дозиране при различни нива на облъчване и съответно бързо елиминиране на вредните ген токсични ефекти в резултат на облъчването.

Проблемът, който следва да се реши с изобретението е намиране на екстракт с контролирано съдържание на редките фенилетаноди (по-специално миконозид и пауцифлосид), получен от инвитро системи от растения, принадлежащи към родовете Haberlea и Ramonda на семейство Gesneriaceae, както и техните хибриди, който да притежава висока биологична стойност и се използва за производство на нови средства с гарантирано и контролирано протективно действие срещу хемо-, радио- и UV въздействие.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Този проблем се решава, съгласно изобретението с екстракт, получен от растителни инвитро системи от растения принадлежащи към родовете Haberlea и Ramonda на семейство Gesneriaceae, и по-специално от видовете Haberlea rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C.B.Clarke; Ramonda myconi (L.) Rchb.; Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic, както и техните хибриди., съдържащ поотделно или заедно Екстракт 1 на полифенолна фракция, съдържаща основно флавон -С гликозиди и фенилетаноиди ) и Екстракт 2 на фракция съдържаща основно миконозид, където Екстракт 1 съдържа от 0.1 до 55.0% тегл. Фенилетаноиди (ФЕ) (по-специално миконозид и пауцифлосид) и до 100% тегл. свободни феноли, захари, органични- , мастни- и аминокиселини, стероли, а Екстракт 2 съдържа от 55.0 до 99,9% тегл. ФЕНИЛЕТАНОИДИ (по-специално миконозид и пауцифлосид) и съответно до 100% тегл. фенолни съединения, моно-, дизахари или техни остатъци.

Един следващ обект на настоящото изобретение е метод за получаване на 5 описания Екстракт от споменатите растителни инвитро системи, съгласно изобретението, включващ следните стъпки:

а) подлагане на биомаса (съдържаща 0,01-25,0% фенилетаноидни гликозиди) получена след иницииране на инвитро културите и тяхното култивиране (проведено съгласно WO2021184086) на екстракция с вода или водно-алкохолна смес (от 1 до 3 10 въглеродни атома, 40-90%, като етанол, изопропанол, метанол) в съотношение от 1:10 до 1: 100 w/v и следваща от една до три- степенни екстракции на водния остатък с неполярен разтворител позволен за хранителни, фармацевтични и козметични цели, до максималното отстраняване на мастно-разтворимите фракции;

б) пречистената водна фаза от етап а) се концентрира под вакуум до 2/3 от обема си, 15 при температура 40°С -60°С за отстраняване на разтворителя, до получаване на суров екстракт, който се подлага на твърдофазова екстракция с хидрофобновзаимодействаща смола (по-специално обратнофазова С18) за задържане на фенолните съединения и фенилетаноидите, а захарите и полярните съединения (основно органични- и амино киселини) се отмиват с подвижната водна фаза;

в) Елюиране на фенолната фракция от смолата чрез елуиране посредством подвижна фаза избрана от разтворители с различна полярност, (по-специално етил-ацетат или изопропилов алкохол). Получената фракция се изпарява до сухо под вакуум при температура 20°С-70°С до получаване на Екстракт 1 съдържащ от 0.1 до 55.0% тегл. фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) и до 100% тегл. свободни 25 феноли, захари, органични-, мастни- и аминокиселини;

г) Елюиране на фенилетаноидната фракция от смолата чрез елуиране с водноалкохолна смес (от 1 до 3 въглеродни атома) от 5 до 70 % v/v . Събраната( ФЕ) фракция се подлага на концентриране под вакуум при температура от 40 °C до 60 °C до пълното отстраняване на органичния разтворител и лиофилизация или сушене, до зо получаване на Екстракт 2 съдържа от 55.0 до 99,9% тегл. ФЕНИЛЕТАНОИДИ (поспециално миконозид и пауцифлосид) и съответно до 100% тегл. фенолни съединения, моно-, дизахари или техни остатъци.

Добивът на миконозид спрямо съдържанието му в първоначалния суров екстракт е между 60 и 90%.

Получените Екстракт 1 и Екстракт 2 са подходящи да бъдат използвани поотделно или заедно чрез контролирано смесване, както и да бъдат кондиционирани чрез разреждане с подходящ за хранителни, козметични и фармацевтични цели, безопасен разтворител (например вода, глицерин, пропилен гликол или бутилен гликол) до достигане на желани крайни концентрации на фенилетаноидните гликозиди (миконозид и пауцифлосид), по-специално стандартизиране до крайна концентрация на миконозид от 0,001 % до 99,0%. Така полученият продукт се използва и осигурява контролираното съдържание на БАВ.

Друг следващ обект на настоящото изобретение е използването поотделно или заедно на получените Екстракт 1 и Екстракт 2, получени от растителни инвитро системи от растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae, по-специално от родовете Haberlea и Ramonda, и по-специално от видовете Haberlea rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C.B.Clarke; Ramonda myconi (L.) Rchb.; Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic, както и техните хибриди, директно или след кондициониране, за получаване на нови средства в хуманната и ветеринарната медицина, хранителните добавки и козметиката като хемо-, радио- и UV протектори. Възможността за дозирано смесване на получения Екстракт 1 и Екстракт 2 осигурява и гарантира специфичната потребност и конкретната цел за използване. При крайни концентрации на фенилетаноидните гликозиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) от 0,01 до 99,9 %, така полученият продукт може да се използва като пречистен екстракт от инвитро култури на растения от родовете Haberlea и Ramonda, и е със значително повишена биологична активност в сравнение със суровия непречистен екстракт.

Получените Екстракти 1 и 2 съгласно изобретението съдържат основно фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) в широк спектър и количествени граници. Тези съединения (по-специално миконозида), са носител на високи биологични активности, с доказани в настоящето изобретение антиоксидантна, антимутагенна и антикластогенна активности, което позволява използването им поотделно или заедно чрез контролирано смесване, както и да бъдат кондиционирани чрез разреждане, за приготвяне на продукти, използвани като природни хемо-, радио- и UV-протектори с контролирана степен на защита. Последните намират приложение в хуманната и ветеринарната медицина, хранителните добавки и козметиката за профилактика и лечение на вредните хемо-, радио- и UV-въздействия.

Дефиниции

Според настоящото изобретение, „Екстракт“ означава фракция, съдържаща фенилетаноида Миконозид, получена чрез директна екстракция или фракциониране на груб екстракт, получен от инвитро системи от растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae, по-специално от родовете Haberlea и Ramonda, както и от техните хибриди.

Както се използва тук, терминът растение се отнася до представители от семейство Gesneriaceae, по-специално от родовете Haberlea и Ramonda, и по-специално видовете Haberlea rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C.B.Clarke; Ramonda myconi (L.) Rchb.; Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic, както и техните хибриди и се отнася до растителни клетки, цели растения, растителни органи, растителни тъкани, семена и потомство от същите.

Както се използва тук, терминът инвитро системи се отнася без ограничение за клетки от семена, ембриони, меристематични области, листа, корени, издънки, гаметофити, спорофити, полени и микроспори, калусна тъкан, суспензионни култури, прорастъци, меристемни (шутови) култури, коренови култури (нормални, добавъчни и трансформирани корени), както и инвитро растения, култивирани при контролирани инвитро условия върху твърда или течна хранителна среда или култивационен субстрат.

„Мииконозид“ е кафеоил-фенилетаноиден гликозид с молекулярна формула СЗЗН44О19, IUPAC Name: “[(2R,3R,4R,5R,6R)-4-[(2R,3R,4R)-3,4-dihydroxy-4(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-2-[[(2R,3R,4R)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2yl]oxymethyl]-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]-5-hydroxyoxan-3-yl] 3-(3,4dihydroxyphenyl)propanoate”

ПРИМЕРНО ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се илюстрира, без да се ограничава от следните примерни изпълнения:

ПРИМЕР 1:

1. 500 грама суха биомаса от инвитро култура на Haberlea rhodopensis (съдържаща 12% фенилетаноидни гликозиди) се екстрахира с водно-алкохолна смес ( 70 % алкохол, като например етанол, в съотношение от 1:15, w/v. След филтруване, течната фаза се концентрира под вакуум до отстраняване на алкохола, след което се подлага на трикратна (3x2 L., за 1 час, при 21 °C) течно-течна екстракция с пречистен хексан за отстраняване на мастноразтворимите фракции. Пречистената водна фаза се концентрира до 2/3 от обема си под вакуум при температура 40°С за отстраняване на остатъците от разтворителя, при което се получава суров екстракт, който се подлага на твърдофазова екстракция;

2. Суровият екстракт (2,0 L) се подава към твърдофазова екстракция с използването на кондиционирана обратнофазова С18 смола (600 д.). При това фенолните съединения и фенилетаноидните гликозиди се задържат от смолата а захарите и полярните съединения (основно органични и амино киселини) се отмиват с подвижната водна фаза;

3. Следва елюиране на фенолната фракция с използване на етил ацетат (4 L) като подвижна фаза, при което се елюират по-голямата част от фенолните съединения и флавоноидите както и част от фенилетаноидите (по-специално миконозид и пауцифлосид). Получената фракция се изпарява до сухо под вакуум при температура 40°С до получаване на Екстракт 1 съдържащ от 54,7% тегл. Фенилетаноиди (поспециално миконозид и пауцифлосид) и до 100% тегл. свободни феноли, захари, органични- , мастни- и аминокиселини. ( Виж Таблица 1 с представени разлики в концентрациите на съпътстващите метаболити при различните екстракти при направени GC-MS профили на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis: Суров екстракт, Екстракт 1 и Екстракт 2. Резултатите са статистически обработени и групирани по метода на Euclidean Distance и представени като Hierarchical Clustering Heatmaps, като всяка оцветена клетка на картата съответства на стойност на концентрацията на съответното съединение.

4. Следва елюиране фенилетаноид-гликозидната фракция с използване на 2 L. водноетнолна смес ( 70%, w/w). Събраната фенилетаноидна фракция съдържа основно миконозид и в по-малко количество пауцифлосид. Тази фракция се концентрира на вакуум изпарител при температура от 50°С до формиране на клейообразна маса (80 5 д), която се лиофилизира или суши при температура от 40°С, до получаване на

Екстракт 2, съдържащ от 99,5% тегл. фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид - Таблица 2) и съответно до 100% тегл. моно-, дизахари и фенолни съединения и флавоноиди или техни остатъци. (Таблица 1).

Добивът на миконозид спрямо съдържанието му в първоначалният суров екстракт е 10 76,1%.

На фиг 1 са представени GC-MS профили на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis: Суров екстракт, Екстракт 1 и Екстракт 2, получени съгласно пример 1. Резултатите са статистически обработени и групирани по метода на Euclidean Distance и представени като Hierarchical Clustering Heatmaps, като всяка оцветена клетка на 15 картата съответства на стойност на концентрацията на съответното съединение.

Фигура 1.

Pyroglutamic acid Malonic acid 2TMS Asparatic acid 3TM Mono-ethyl malonate Threitol 4TMS Turanose STMS Succinic acid 2TMS Fructose oxime STM Sucrose STMS isome Xylonic acid gamaXylonic acid delta n-Tetradecane Sorbitol STMS Fumaric acid 2TMS Sucrose STMS isome Mannitol 6TMS Quinic acid STMS Ribonic acid STMS Dodecanol myo-lnositol STMS Citric acid ATMS Erythritol ATMS З.А-Dihydroxy hydro Malic acid 3TMS Phosphoric acid 3T Glycerol 3TMS

На табл. 1 (по-долу) е представен фитохимичния състав на екстракти от инвитро системи от растения от Haberlea, получени по метода, описан в Пример 1 на настоящото изобретение. Резултатите са усреднени при направени по 3 паралелни изпитвания и представени като % от сухата маса.

Таблица 1.

Метаболити	Суров екстракт	Екстракт 1	Екстракт 2
Myconoside	7.57	3.03	72.29
Phenolics and flavone C-glycosides	8.64	45.14	7.65
Organic acids and sacharides	72.31	47.21	16.94
Hydrocarbones and fatty alkohols	3.38	1.04	0.09
Amino acids	2.67	0.38	0.15
Others	5.43	3.2	2.88

Agilent Technology Hewlett Packard 7890 A +/MSD 5975 apparatus (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, US) coupled with an Agilent Technology 5975C inert XL EI/CI MSD Mass Spectrometer (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, US). HP-5MS column (30 m x 250 pm x 0.25 pm) at 60 °C temperature program for 2 min, with a temperature rise to 260 °C with 5 °C per minute, and exposure at 260 °C for 8 min. The volume of the injected sample is 1 pl at a split ratio of 10:1. Injector temperature 250 °C with a flow carrying gas (helium) of 1 mL/min. The EI/MS spectrum is recorded at 70 eV.

HPLC system, Waters 1525 Binary pump (Waters, Milford, MA, USA), Waters 2487 Dual Λ Absorbance Detector (Waters, Milford, MA, USA) operated by Breeze 3.30 software; Supelco Discovery HS C18 column (5 pm, 25 cm x 4.6 mm), 128 °C; mobile phase with a gradient of 2% acetic acid and acetonitrile;

Ha таблица 2 са представени NMR данните, доказващи структурите на миконозид и пауцифлосид (500 MHz, във D2O) в Екстракт 2 от настоящото изобретение

Таблица 2.

Paucifloside atom 0 η (ηΙΙΙριΙΙβΙ^ι, B c

Type HI

Α1α· B h B

Ήβ· Л

120	p		79.39	1	P		168.15	1
21	p		71.04	2	c		116.17
22	P		73.51	3	P		143.84
23 p		73.51	6	P		131.36
24	P		110.15	7	P		116.17
25	P		79.39	8	p	И 43.84
26	P		76.98	9	P	1143.84
27	P		101.84	10	1c		116.66
28	P		68.98	11	P	122.87
29	P		73.51	15	P	73.64

30 p		79.39 16 jC : 71.05
31 jc		76.98 17 C 79 22
32 Ю		110.15 18 p |	73.64
33 P		65.96 19 C	101.85
34 C		73.51 22 C I	71.05
35 p		65.96 23	c i	35.22
|зб p		71.04 24	C		131.36
37 p			174.42 25	c		116.66
38 C		34.42 26 ,C	143.84
39 C		35.22 27 p i	143.84
40 p		34.42 28 p |	116.66
|41 p		131.37 29 p	122.87
|42 jc		133.10 32 C		68.98
(43 C		116.66 35 C		110.15
44 |C		121.14 36 C		77.05
45 p		116.17 |37 p		79.44
46 C		120.62 38 p		73.64
47 p 48 P	............-....................................................—.......	143.92 39 P Ϊ16.66 I45 p		65.97 110.15
G) O			143.92 46 p I	77.05
	143.92 147 p		79.44
ei p		116.17 |48 P	73 64

52 p		143.92 49 p	65.97 !
53 H	4.03 (dt, 10.1,6.8 Hz)	3 pH (6.74 (t, 9.5 Hz)
54 H	4.03 (dt, 10.1,6.8 Hz) 3 pH	6.87
55 H	3.86 (m) 7 pH	¢.87 I

56	Н	3.86 (т)		10	CH	6.74 (t, 9.5 Hz)
57	Н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)		11	CH	6.74 (t, 9.5 Hz)
58	Н	3.95 (т)		12	Ьн	-
59	н	3.95 (т)		13	OH	-
60	н	3.60 (т)		15	CH	3.86
61	н	3.86 (т)		16	CH	3.86
62	н	3.60 (т)		17	CH	3.86
63	н	3.86 (т)		18	CH	3 86
64	н	3.95 (т)		19	CH	3.95
65	н	3.95 (т)		20	OH	-
66	н	3.60 (т)		22	CH2	3.86
67	н	3.60 (т)		23	CH2	3.59 (m)
68	н	3.60 (т)		25	CH	6 74 (t, 9.5 Hz)
69	н	3.86 (т)		28	CH	6.74 (t, 9.5 Hz)
70	н	-		29	CH	6.74 (t, 9.5 Hz)
71	н	3.60 (т)		30	OH	-
72	н	3.60 (т)		31	OH	-
73	н	-		32	CH2	3.86
74	н	-		35	CH	5.20 (s)
* 75	н	3.86 (т)		36	CH	3.95
76	н	3.86 (т)		38	CH2	3.86
77	н	-		39	CH2	3.59 (m)
78	н	-		40	OH	-
79	н	-		41	OH
80	н	2.83 (т)		42	OH	-
81	н	2.83 (т)		45	CH	5.20 (s)
82	н	2.83 (т)		46	CH	3.95
83	н	2.83 (т)		48	CH2	3.86
84	н	-		49	CH2	3.86
85	н	2.83 (т)		50	OH	-
86	н	2.83 (т)		51	C)H	-
87	н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)		52	OH
88	н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)
89	н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)
90	н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)
91	н	6.74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)
92	н	6 74 (ddd, 10.6,8.1,2.0 Hz)
93	н	-
94	н	•
95	н	-
96	н

ПРИМЕР 2:

1. 100 гр.суха биомаса от инвитро култура на Ramonda serbica (съдържаща 0.5% 5 фенилетаноидни гликозиди, основно миконозид) се екстрахира с дестилирана вода в съотношение 1: 30, w/v. След филтруване, течната фаза се концентрира под вакуум до 1/3 от обема си, след което се подлага на трикратна (3x2 L., за 1 час, при 21°С) течно-течна екстракция с етил ацетат за отстраняване на мастноразтворимите фракции. Пречистената водна фаза се концентрира до 2/3 от обема си под вакуум при температура 50°С за отстраняване на остатъците от разтворителя, при което се получава суров екстракт, който се подлага на твърдофазова екстракция по описаната 5 вече в точки 2, 3 и 4 процедура от предходния Пример 1.

2. Получената фенолна фракция (Екстракт 1) съдържа от — 2.0% тегл.

фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) и до 100% тегл. свободни феноли, захари, органични-, мастни- и аминокиселини.

3. Получената фенилетаноид-гликозидната фракция (Екстракт 2), съдържащ 57.0% 10 тегл. фенилетаноиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) и съответно до 100% тегл. моно-, дизахари и фенолни съединения и флавоноиди или техни остатъци.

_ь Добивът на миконозид спрямо съдържанието му в първоначалният суров екстракт е 82%

ПРИМЕР 3.

Провежда се също както Пример 1, с тази разлика, че използваната биомаса от инвитро култура на Haberlea rhodopensis съдържа 9% фенилетаноидни гликозиди на Етап 1 и се екстрахира трикратно с 50% изопропанол при съотношение 1:20, а концентрирането на получената пречистена водна фаза се провежда при 50°С, както 20 и елюирюнето на етап 4 на фенилетаноид-гликозидната фракция се извършва с

50%v/v метанол . Полученият Екстракт 1 съдържа 29,5% ФЕ, по-спещиално миконозид и пауцифлоид, а Екстракт 2 съдържа 62.0% фенилетаноиди, по-специално . миконозид и пауцифлоид.

Добивът на миконозид спрямо съдържанието му в първоначалният суров екстракт е 25 92%

ПРИМЕР З.а.

Провежда се също както Пример 3, с тази разлика, че сухата биомаса е от инвитро култура на Ramonda serbica (съдържаща 12% фенилетаноидни гликозиди, основно 30 миконозид). Полученият Екстракт 1 съдържа 52.0% (ФЕ), по-спещиално миконозид и пауцифлоид, а Екстракт 2 съдържа 98.0% фенилетаноиди, по-специално миконозид и пауцифлоид. Добивът на миконозид спрямо съдържанието му в първоначалният суров екстракт е 84%.

На табл. 3 (по-долу) е представен фитохимичния състав на екстракти от инвитро системи от растения от Ramonda serbica, получени по метода, описан в Пример За на настоящото изобретение. Резултатите са усреднени при направени по 3 паралелни изпитвания и представени като % от сухата маса.

Таблица 3.

Метаболити	Суров екстракт	Екстракт 1	Екстракт 2
Myconoside	7.07	2.53	71.19
Phenolics and flavone Cglycosides	9.14	44.64	8.75
Organic acids and sacharides	71.31	46.21	16.04
Hydrocarbones and fatty alkohols	4.38	2.04	0.99
Amino acids	3.67	0.28	0.10
Others	4.43	3.4	2.93

Получените Екстракт 1 и Екстракт 2 съгласно примерите се използват по отделно или заедно, в сухо състояние или като се кондиционират чрез разреждне с подходящ за хранителни, козметични и фармацевтични цели, безопасен разтворител (например вода, глицерин, пропилен глукол, бутилен гликол и др.) до достигане на крайни концентрации на фенилетаноидните гикозиди (по-специално миконозид и пауцифлосид) от 0,01 до 99,0 % и така получеият продукт да се използва като пречистен екстракт от инвитро култури на Haberlea rhodopensis и Ramonda със значително повишена биологична активност.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ НА ЕКСТРАКТИТЕ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТО И ДАННИ ЗА ЕФЕКТА

Материали и метод

Съгласно настоящото изобретение, Екстракт 1 и Екстракт 2, съдържащи фенилетаноидни гикозиди (по-специално миконозид и пауцифлосид), се изолират от инвитро системи от растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae и поспециално от родовете Haberlea и Ramonda, както и от техните хибриди. Сухите екстракти се съхраняват при температура от -20 °C далеч от светлина и влага. Разтворът, използван в експериментите, се приготвя extempore на базата на воден.

ПРИМЕР 4

Изследване на УВ-ВИД абсорбционния спектър на Екстракти 1 и 2, получени от инеитро системи от Haberlea rhodopensis съгласно пример 1.

От изследваните екстракти се приготвят водни разтвори с крайна концентрация на миконозид от 22 μΜ, чийто UV-Vis спектри се записват на спектрофотометър Shimadzu UV/Vis mini 1240. Получените спектри са представени на Фигура 2 и демонстрират, че Екстракт 2 притежава значително по-висока способност да абсорбира светлина от UV спектъра, което е доказателство, че пречистения миконозид има по- силно изразена 10 способност да улавя светлина от УВ спектъра в сравнение с по-малко пречистения Екстракт 1 където има повече съпътстващи съединения (като феноли и флавон С_k гликозиди).

□

Фигура 2.

Изследвана е UVB-UVA пропускпивост на светлина (Т%) на различни разреждания

Екстракт 2 (получен по Пример 1 от настоящото изобретение) с концентрация на на миконозид от 0,11 mg/ml, 0,055 mg/ml, 0,011 mg/ml, 0,0055 mg/ml и 0,00275 mg/ml, като е представена на Фигура 3.

λ, nm

Фигура 3.

Резултатите показват, че минималната концентрация от 0,011 mg/ml на миконозид е достатъчна да осигури 50% инхибиране на преминаването на УВ радиация, както и максималната концентрация от 0,11 mg/ml осигурява 100% защита. Получените резултати демонстрират високия потенциал на фенилетаноидната фракция (основно миконозид и пауцифлосид) съдържаща се в Екстракти 1 и 2 от настоящото изобретение да се използва като УВ филтър в слънцезащитни продукти.

ПРИМЕР 5

Изследване на антиоксидантния потенциал на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis, получени съгласно Пример 1 самостоятелно и в комбинации с доказани в практиката УВ-протектори.

Отчетена е DPPH радикал улавяща активност (% на инхибиране ) на водни разтвори (0,5%) на Екстракт 1, Екстракт 2 (получени по пример 1), Oxybenzone и комбинации екстракт: Oxybenzon 1:1 (w/w). Направен е сравнителен DPPH анализ и съпоставка на антиоксидантния потенциал на изследваните Екстракт 1, Екстракт 2, комерсиалния УВ-протектор (Oxybenzone), както и на комбинации Екстракт 1 с Oxybenzone и Екстракт 2 с Oxybenzone. Резултатите доказват, че носител на антиоксидантната активност е миконозида от пречистения Екстракт 2. Използван е метода на директната ЕПР спектроскопия (Yordanov and Christova, 1997; Карамалакова, 2014). За измерване на DPPH радикал улавящата способност, 98% етанолов разтвор на DPPH (80 тМ, stock), стайна температура (22°С) и от изследваните Екстракт 1, Екстракт 2, Oxybenzone и съответните комбинации (в концентрация 0,5%) се смесват и хомогенизират. Сместа се инкубация на тъмно, като на 1-та, 5-та и 10-та минути се изследва за генерирани в системата (DPPH - Н /R.) радикали. Като вътрешен стандарт

за EPR сигнала беше използван разтвор на DPPH (Фигура 4).

Incubation time, min

Oxybenzone маааааа Oxybenzone after UV Extract 1 tsaassKSi Extract 1 after UV Extract 1 with Oxybenzone —aaai Extract 1 with Oxybenzone after UV

Extract 2

M·· Extract 2 after UV димд™ Extract 2 with Oxybenzone < Extract 2 with Oxybenzone after UV

Фигура 4.

^.0 Резултатите от изследването установяват, че процентът уловени DPPH радикали е статистически значимо повишен при Екстракт 2 (от 14.9% до 18.2%, 21.3 %, р<0.001), УВ протектора Oxybenzone показва най-ниска радикал улавяща активност (от 4.7% до 3.2% до 2.2%, р<0.001) (Фигура 4). Установи се, че продължителното инкубиране на изследваните разтвори не променя статистически значимо процента на уловени DPPH радикали. Резултатите показват, че Oxybenzone самостоятелно проявява много ниска антиоксидантна активност, но при комбинацията с Екстракт 1 и с Екстракт 2, тя се повишава статистически значимо (р<0.001). Индуцирането на UV-В стрес не само, че не понижава инхибиращата способност, но и рязко, статистически значимо я увеличава. Това е видно след 10 мин и при двете комбинации. От представените данни може да се заключи, че в инвитро среда, изследваните екстракти показват силна антиоксидантна активност и дълготрайна способност за улавяне на свободни радикали при различни инкубационни времена, преди и след индуциран UV-В стрес. Този ефект е най-силно изразен при пречистения Екстракт 2 (основно миконозид и 5 пауцифлосид) и комбинацията между него и комерсиалния УВ протектор Oxybenzone.

ПРИМЕР 6

Изледване на антиоксидантния потенциал на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis, получени съгласно Пример 1 самостоятелно 10 и е комбинации с доказани в практиката радиопротектори.

Доказано е, че свободните радикали генерирани след облъчване с гама радиация са силно реактивоспособни и могат да предизвикат верижни реакции водещи до възникването на значителни биологични увреждания и засилен оксидативен стрес. Ето защо за практиката особен интерес представляват така наречените радиопротектори. Те са вещества и съединения със синтетичен или природен произход, които позволяват на клетките на организма да издържат на по-високи нива на облъчване или могат да елиминират бързо вредните генотоксични ефекти от такова облъчване и да поддържат стабилността на човешкия геном. За да докажем, че фенилетаноидната фракция (съдържаща основно миконозид и пауцифлосид) е носител на антиоксидантната активност, е и основната фракция отговорна за радиопротективните свойства на екстрактите от инвитро системи от растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae и по-специално от родовете Haberlea и . Ramonda, както и на техните хибриди, проведохме изследвания за съпоставката на антиоксидантната активност на Екстракт 1, Екстракт 2, комерсиалния радиопротектор amifostine, както и на комбинации Екстракт 1 с amifostine и Екстракт 2 с amifostine чрез директна директна ЕПР спектроскопия. За измерване на DPPH радикал улавящата способност, 98% етанолов разтвор на DPPH (80 mM, stock), стайна температура (22оС) и от изследваните Екстракт 1, Екстракт 2, amifostine и съответните комбинации (в концентрация 0,5%) се смесват и хомогенизират. Сместа се подлага на инкубация на зо тъмно, като на 1-та, 5-та и 10-та минути се изследва за генерирани в системата (DPPH - Н /R.) радикали. Като вътрешен стандарт за EPR сигнала беше използван разтвор на DPPH, като е изпитана DPPH радикал улавяща активност (% на инхибиране) на водни разтвори (0,5%) на Екстракт 1, Екстракт 2 (получени по пример 1) и amifostine.

(Фиг.5)

Фигура 5.

Резултатите от изследването установяват, че процентът уловени DPPH радикали е статистически значимо повишен при пречистения Екстракт 2 (от 59.5% до 72.7%, 85.32 %, р<0.001), докато комерсиалния радиопротектор amifostine показва най-ниска радикал улавяща активност (от 5.1% до 4.5%, 3.9%, р<0.001) (Фиг. 5). Установи се, че продължителното инкубиране на изследваните разтвори не промени процента ю уловени DPPH радикали.

Изследван бе и ефектът от комбинации на изследваните екстракти с комерсиалния радиопротектор amifostine преди и след облъчване с гама радиация (Фиг. 6). Облъчването е с гама-радиация (γ-лъчи) с доза 2.0 Gy във водна баня (37°С) с h облъчвател Рокус-М с радиоактивен заряд 60°С при мощност на дозата 24 Gy/min..

Отчетена е DPPH радикал улавяща активност (% на инхибиране ) на водни разтвори (0,25%) на amifostine (1) Екстракт 1 (2), комбинация „Екстракт 1: amifostine 1:1 (w/w)“ (3), Екстракт 2 (получени по пример 1) (4), и комбинация „Екстракт 2: amifostine 1:1 (w/w)“ (5) преди и след облъчване с гама-радиация с доза 2.0 Gy.

Фигура 6.

Резултатите показват, статистически значимо повишен процент уловени DPPH радикали след Gy облъчване при пречистения Екстракт 2 (съдържаща основно миконозид и пауцифлосид) (19,7 %, р<0.001), както и при комбинацията му с amifostine (25,6 %, р<0.001). Продължителното (30 мин.) инкубиране на изследваните разтвори не променя процентът на уловените DPPH радикали, след облъчване с доза 2.0 Gy. Amifostine (0,25%) самостоятелно проявява незначителна антиоксидантна активност (2,5 % преди и 5,9% след гама облъчване, р<0.001), но в комбинация с пречистения Екстракт 2 тя се повишава значително (21,1% преди и 25,6% след гама облъчване, р<0.005).

ПРИМЕР 7

Изследване на кластогенната активност и антикластогенния потенциал на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis, получени съгласно Пример 1 самостоятелно и в комбинации с доказани в практиката цитопротектори (amifostine) директно поставени в клетъчните култури, както и поставени 1 час след облъчването на кръвта.

Изследван е антикластогенния потенциал на Екстракт 1 и Екстракт 2 (получени по Пример 1), както и на доказания в практиката цитопротектор amifostine, по отделно и в комбинации върху човешки лимфоцитни култури в инвитро условия преди и след въздействието на йонизираща радиация (гама - лъчи) чрез тестовете за отчитане на микроядра. Микроядреният тест върху лимфоцити и полихроматични еритроцити от периферна кръв е най-подходящия тест при скрининг за мутагенност. За дадено съединение се решава, че е мутаген, когато повишава спонтанната честота на МН в полихроматичните еритроцити или в лимфоцитите. С този тест се доказва мутагенен ефект на съединения, които са кластогени или инхибитори на делителното вретено. За анализ на МН в бинуклеарни лимфоцити от периферна кръв е използван цитокинезис - блок микронуклеус теста на Fenech, М. and A. Moorley, (1985).

Изследван е броят на микроядра (МН) открити при изброяването на 500 броя изследвани бинуклеарни клетки от клетъчни култури, направени с облъчена и необлъчена периферна венозна кръв, взета от 5 здрави доброволци. Кръвта на донорите бе облъчвана с гама-радиация (γ-лъчи) с доза 2.0 Gy във водна баня (37°С) с облъчвател Рокус-М с радиоактивен заряд 60°С при мощност на дозата 24 Gy/min.

Експозицията бе изчислена в зависимост от геометричните параметри на облъчвателя, разстоянието и мощността на източника. Фиг.7 представя Броя на микроядра, установени при изследване на 500 бинуклеарни клетки при направените клетъчни култури с необлъчена кръв (А) и облъчена кръв (Б) след добавяне на: Контрола (1); Amifostine (2); Екстракт 1 (3); Екстракт 2 (4); Комбинация „Екстракт 1:

amifostine 1:1 (w/w)“ (5) и Комбинация „Екстракт 2: amifostine 1:1 (w/w)“ (6).

Фигура 7.

Резултатите от добавяне на amifostine, Екстракт 1 и Екстракт 2 (получени по Пример

1) към необлъчени кръвни клетки показват липса на кластогенна активност на 20 изследваните вещества, което е доказателство, че те не са мутагени и могат да се използват безопасно в медицината (Фигура 7А). Сравнителния статистически анализ на получените резултати относно общия брой микроядра в 500 бинуклеарни клетки при различните групи клетъчни култури, третирани след облъчване с гама радиация (Фигура 7Б), се установиха статистически значими различия с контролата на клетките обработени със Екстракт 1, Екстракт 2, както и на техните комбинации с amifostine (р >0.05). Интересно е да се отбележи, че облъчените клетките обработени с комерсиалния радиопротектор amifostine не се различават статистически значимо от контролата, което е показател, че всички останали изследвани вещества и комбинации причежават по-висока цитопротективна активност от чистия amifostine.

ПРИМЕР 8

Изследване на кластогенната активност и антикластогенния потенциал на екстракти от инвитро системи на Haberlea rhodopensis, получени съгласно Пример 1 самостоятелно и в комбинации с доказани в практиката цитопротектори (amifostine) поставени в клетъчните култури 1 час преди облъчването им с йонизираща радиация (γ-лъчи) в инвитро условия.

Изследвана екластогенната активност и антикластогенния потенциал на Екстракт 1 и Екстракт 2 (получени по Пример 1), както и на доказания в практиката цитопротектор amifostine, по отделно и в комбинации върху човешки лимфоцитни култури в инвитро условия преди и след въздействието на йонизираща радиация (гама - лъчи) чрез тестовете за отчитане на индуцирани хромозомни аберации. Използваният метод дава възможност за точната идентификация на всички основни видове структурни хромозомни преустройства, индуцирани от йонизираща радиация (γ-лъчи), като единични и двойни ацентрични фрагменти, дицентрични хромозоми и пръстеновидни хромозоми.

Дизайнът на проучването включва общо 6 групи заедно с нетретираната контрола. Във всяка група са изследвани по 5 донора на кръв и на всеки донор са анализирани за хромозомни аберации по 100 метафазни пластинки получени от лимфоцитни клетки от периферна венозна кръв или общо за всяка група по 500 метафазни пластинки.

За приготвянето на клетъчните култури е използван методът на Evans Н. J., за краткосрочно култивиране на лимфоцити от периферна кръв и получаване на метафазни пластинки за отчитане на ХА. Микроскопирането на хромозомните пластинки е извършвано на микроскоп Olympus ВХ41 на приетите като най-удобни увеличения - скриниране на препаратите на увеличение 63 и подробен анализ на хромозомите за аберации на увеличение 1000. Анализирани са минимум 100 метафази от всяка проба. Клетъчните култури на донорите са облъчвани с гама радиация (γ-лъчи) с доза 2.0 Gy във водна баня (370С) с облъчвател Рокус-М с радиоактивен заряд бОСо при мощност на дозата 24 Gy/min. Експозицията бе изчислена в зависимост от геометричните параметри на облъчвателя, разстоянието и мощността на източника. На Фиг.8 е представена честота на аберентните клетки при изследване на третирани човешки лимфоцити преди (А) и след облъчване с гамарадиация с доза 2.0 Gy (Б) както следва: Контрола (1); Amifostine (2); Екстракт 1 (3); Екстракт 2 (4); Комбинация „Екстракт 1: amifostine 1:1 (w/w)“ (5) и Комбинация „Екстракт 2: amifostine 1:1 (w/w)“ (6).

ю Фигура 8.

Резултатите от добавяне на amifostine, Екстракт 1 и Екстракт 2 (получени по Пример 1) към необлъчени кръвни клетки показват липса на кластогенна активност на изследваните вещества, което е доказателство, че те не са мутагени и могат да се използват безопасно (Фигура 8А). Липсата на кластогенна активност на изследваните ^5 екстракти, при посочените в опитите концентрации, е важно основание получените съгласно изобретението Екстракт 1 и Екстракт 2 да бъдат използвани във фитотерапията и практическата медицина. Сравнителния статистически анализ на получените резултати с използване на претретирани клетки преди облъчване с гама радиация (Фигура 8Б) показва наличието на статистически значими различия с 20 контролата на клетките претретирани със Екстракт 1 и Екстракт 2 (р >0.01), както и на техните комбинации с amifostine (р >0.05). За съпоставка, комерсиалния радиопротектор amifostine не се различават статистически значимо от контролата, което е показател, че всички останали изследвани екстракти притежават по-висока цитопротективна активност от чистия amifostine.

Получените резултати, представени с Примери 7 и 8 установяват, че съдържащите фенилетаноиди (основно миконозид и пауцифлосид) екстракти, получени съгласно Пример 1, имат по- силно изразен антикластогенен потенциал в сравнение със синтетичния amifostine, който се използва като радиопротектор в клиничната практика, 5 но има множество странични ефекти. Липсата на каквато и да е цитотоксична и кластогенна активности на екстрактите от инвитро системи от растения, принадлежащи към семейство Gesneriaceae и по-специално от родовете Haberlea и Ramonda, както и от техните хибриди ни дава основание да твърдим, че те могат да бъдат използвани във фитотерапията като радиопротектори поради силно изразения 10 си антикластогенен потенциал.

Паралелно са проведени аналогично изпитвания съгласно Примери 4-8 и за екстракт от Ramonda serbica, получен съгласно Пример За като получените резултати са близки на представените и демонстрират отклонение в стойностите съответно от ± 0,1% до ±0,9%.

Паралелно са проведени аналогично изпитвания за комбинация от Екстракт 1 и Екстракт 2 от Haberlea rhodopensis Friv. в съотношение 1:1 получени съгласно пример 1, като получените резултати са близки на представените и демонстрират от ±0,05% до ±0,09%.

Claims (10)

1. Миконозид- съдържащ екстракт от инвитро системи на растения, 5 принадлежащи към родовете Haberlea и Ramonda, , характеризиращ се с това, че съдържа поотделно или заедно Екстракт 1 на фракция, съдържаща основно флавон-С гликозиди и фенилетаноиди и Екстракт 2 на фракция, съдържаща основно фенилетаноиди , по-специално миконозид и пауцифлосид, където фенилетаноидите на Екстракт 1 съдържат в % тегл. 10 от 0.1 до 55.0 миконозид и пауцифлоцид и до 100% тегл. свободни феноли, захари, органични- , мастни- и аминокиселини, а Екстракт 2 съдържа фенилетаноидите миконозид и пауцифлосид в % тегл. от 55.0 до 99,9, както и до 100% тегл. фенолни съединения, моно, дизахари или техни остатъци.

15

2. Миконозид- съдържащ екстракт, съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че инвитро системите на растенията принадлежащи към родовете Haberlea и Ramonda, са избрани от видовете Haberlea rhodopensis Friv., Ramonda heldreichii (Boiss.) C.B.Clarke, Ramonda myconi (L.) Rchb.; Ramonda nathaliae Pancic & Petrovic и Ramonda serbica Pancic., както и от техните 20 хибриди.

3. Миконозид- съдържащ екстракт съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че съотношението в комбинацията от Екстракт 1 и Екстракт 2, варира от 1:99 до 99:1.

4. Състав съдържащ миконозиден екстракт съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че е кондициониран с подходящ разтворител за хранителни, фармацевтични и козметични цели, като например вода, глицерин, пропилен глукол или бутилен гликол при крайна стандартизирана зо концентрация на миконозид е от 0,001% до 99,0% при разреждане на екстракти 1 и 2 поотделно, така и при комбинирането им в различни съотношения.

5. Метод за получаване на миконозид-съдържащ екстракт съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че включва следните последователни стъпки: а) получената след иницииране и размножаване на инвитро системата 5 биомаса, се подлага на екстракция с вода или водно-алкохолна смес (40-

90%) при С1 до СЗ на алкохола в съотношение от 1:10 до 1:100w/v, като водната фракция се подлага на от 1- до 3- степенни екстракции с неполярен разтворител за отстраняване на мастно-разтворимите фракции;

б) пречистената водна фаза от етап а) се концентрира под вакуум при 10 температура 40°С -60°Сза отстраняване на разтворителя, до получаване на суров екстракт, който се подлага на твърдофазова екстракция с хидрофобноk взаимодействаща смола за задържане на фенолните съединения и фенилеатаноидите, а захарите и полярните съединения като органични- и амино киселинисе отмиват с подвижната водна фаза;

15 в) Елюиране на фенолната фракция от смолата чрез елуиране посредством подвижна фаза избрана от разтворители с различна полярност, (поспециално етил-ацетат или изопропилов алкохол). Получената фракция се изпарява до сухо под вакуум при температура от 20°С до 70°С и се подлага на лиофилизация или сушене, до получаване на до получаване на Екстракт 20 1 съдържа от 0.1 до 55.0% тегл. фенилетаноидни гликозиди (по-специално миконозид и пауцифлосид).

г) Елюиране на фенилетаноидната фракция (ФЕ) от смолата чрез елуиране । със водно-алкохолна смес от алкохоли с от 1 до 3 въглеродни атома и дестилирана вода от 5 до 70 % обемни. Събраната ФЕ фракция се подлага 25 на концентриране под вакуум при температура от 40 °C до 60°С до пълното отстраняване на органичния разтворител и лиофилизация или сушене, до получаване на Екстракт 2 съдържа от 55.0 до 99,9% тегл. фенилетаноидни гликозиди (по-специално миконозид и пауцифлосид).

зо

6.

Използване на миконозид- съдържащ екстракт, съгласно претенции от 1 до 5 за приготвяне на продукт с хемо, радио- и UV протекторно действие.

7 за получаването на дерматологичен препарат притежаващ антиоксидантна, антимутагенна и антикластогенна активност.

7. Използване на миконозид-съдържащ екстракт, съгласно претенции от 1 до 6 в хуманната и ветеринарната медицина, фармацията, козметиката и хранителната индустрия.

5

8. Използване на миконозид- съдържащ екстракт, съгласно претенции от 1 до

9. Използване на миконозид-съдържащ екстракт, съгласно претенции от 1 до 7 10 за получаването на хранителна добавка с антиоксидантна, антимутагенна и антикластогенна активност.

10. Използване на миконозид-съдържащ екстракт, съгласно претенции от 1 до 7 за получаването на лекарствен препарат с антиоксидантна, антимутагенна и 15 антикластогенна активност.