BG112806A - Адамантаново производно с противовирусна и антипаркинсонова активност - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до адамантаново производно с формула I: (I) до метод за неговото получаване и до приложението му като противовирусно и антипаркинсово средство.

Description

Адамантаново производно с противовирусна и антипаркинсонова активност

Област

Изобретението се отнася до адамантаново производно с противовирусна и антипаркинсонова активност, приложимо за превенция и лечение на заболявания, свързани с нарушение на биосинтеза и екскрецията на допамин.

Ниво на техниката

Известно е, че допаминът е съединение, което тялото продуцира по естествен път в мозъка и функционира като невротрансмитер. Това е критична компонента, използвана от мозъка да контролира движението на тялото, поради което всяко изменение на нивото й в мозъка води до много лоши резултати. Повишаването на нивото на допамина в мозъка се асоциира със състояния като пристрастяване към лекарства и психиатрични състояния като шизофрения, докато неговото понижаване води до депресия, Болестта на Паркинсон (БП) и Паркинсоноподобни разстройства.

Болестта на Паркинсон е прогресивно разстройство на централната нервна система, която поразява хиляди хора по света и се асоциира със загуба на допаминова продукция в специфична област на мозъка. Макар обичайно да засяга възрастните хора, напоследък с това заболяване биват диагностицирани все повече хора преди да достигнат 50 години. Това е хронично и прогресивно заболяване, симптомите на което все повече се влошават и са необратими във времето. Характерните симптоми включват намаляване на спонтанните движения, трудност при ходене, ортостатична нестабилност, скованост и тремор.

Както множество неврологични заболявания, истинската причина за Болестта на Паркинсон е неизвестна. Независимо от това, проучванията са доказали, че БП се проявява когато група от невронни клетки в област на мозъка, наречена substantia nigra pars compacta (SNc), са c понижена активност и евентуално са загинали, което води до понижаване в нивата на допамин в мозъка и което от своя страна води до нарушение в контрола на движението и координацията. Понастоящем се счита, че БП е нелечима. Прилаганите лекарствени средства са симптоматични и са насочени към повишаване на нивата на допамин в мозъка, но понякога се прибягва и до по- инвазивни хирургични методи за лечение чрез невронна аблация или дълбоко мозъчна стимулация. За съжаление, тези методи имат недостатъци, някои от които много сериозни и компрометиращи качеството на живот на пациентите.

Ето защо усилията на изследователите са насочени към намиране на нови пътища за разбиране и изучаване на допаминергичните заболявания и състояния, както и на нови пътища за лечението им без да бъде повлияна нормалната функция на невроните и качеството на живот на заболелите.

Резултатите от изследванията на проф. James Surmeier, както и неговите изобретения, са основани на разбирането, че загиването на допаминергичните неврони е в пряка зависимост от калциевите йонни канали в клетките на бозайници, по-специално на Ca_v1.3a, както и на Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 йонните канали. Изобретателят предлага метод за превенция и лечение на Болестта на Паркинсон, включващ директно въздействие върху Ca_v1.3a калциевите йонни канали с блокери, по- специално с дихидропиридинов блокер на калциевите канали (US2018064697 А1; US2013345230 А1), което защитава увредените клетки и ги предпазва от по-нататъшна деградация и евентуална смърт. В някои варианти на изпълнение, в качеството на дихидропиридинов блокер на калциевите канали се използва нифидипин, нимодипин и/или израдипин, а в други освен блокер, допълнително се прилага терапевтично средство, избрано от групата, включваща леводопа, карбидопа, ентакапон, апоморфин хидрохлорид, бромокриптин, перголид, прамипексол, ропинерол, бензотропин мезилат, трихексифенидил HCI, селегилин, толкапон, амантадин, рилузол и/или L-допа етил етер.

В патент US7629323 (В2) същият автор претендира, че манипулирането на активността на йонни канали от групата, включваща K_v3.1, Κ_ν3.2, Κ_ν3.3 и Κ_ν3.4 и свързани с БП и други неврологични заболявания и състояния, може да се осъществи посредством трансфекция на увредени невронни клетки, съдържащи тези йонни канали, чрез въвеждането на siRNA, която е способна да инхибира експресията на тези йонни канали в клетките.

От друга страна, известно е свойството на адамантина да инхибира репликацията на грипният вирус тип А посредством блокиране на М2-протеина в йонния канал. Освен това, наскоро са установени и други важни клинични приложения на амантадина като Болестта на Паркинсон, невралгия, депресия и др., които според последни изследвания се дължат на способността му да блокира серотонин активиращият йонен канал, йонният канал на никотин-ацетилхолиновите рецептори, както и йонният канал на N-метил-Оаспартатните рецептори. Доколкото е известно, става въпрос за способността на адамантина да блокира невромускулното предаване, оказващо влияние върху биосинтеза и екскрецията на допамин [1]. Биологичната активност на адамантина се дължи още и на симетрията и пространственото разположение на молекулата, както и на значителната й липофилност, благодарение на стабилната въглеводородна рамка, което позволява да проникне лесно през биологичните мембрани [2].

Задача на изобретението е да предложи съединение, което да проявява едновременно както противовирусна, така също антипаркинсонова активност и което да е приложимо за профилактика и лечение на заболявания, свързани с нарушение на биосинтеза и екскрецията на допамин [3].

I I I 4 1 MiSli

Същност на изобретението

По своята същност изобретението се отнася до адамантаново производно с Формула I:

ОН

(I)

Химичното съединение се получава в следната последователност от синтези: найнапред трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозин-ОН (Boc-Tyr(tBu)-OH) се разтваря в дихлорометан и се добавя триетиламин. При непрекъснато разбъркване към него се добавя 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламинов тетрафлуорборат (TBTU) [4]. Амантадин хидрохлорид се разтваря в дихлорметан и се добавя към реакционната смес. След приключване на реакцията, реакционната смес се промива с 4%-ен разтвор на МаНСОз, NaCI и вода. Органичният слой се суши с безводен Na₂SO4, разтворителят се изпарява и се получава продукт под формата на масло. Към полученият трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозинил-амантадин, разтворен в дихлорметан при 0°С, се прибавя трифлуорооцетна киселина (TFA). След края на реакцията разтворителят се изпарява и се добавя диетилов етер. Получава се трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин.Към трифлуороцетна сол на тирозиниламантадин се добавя концентриран NH4OH и pH на разтвора се довежда до 7.0. Полученото съединение е с наименование по UPAC: 2-амино-3-(4хидроксифенил)пропаноил-1-адамантиламин.

¹H-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 0.75. (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D2), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D1), 1,18 (3H, H-2’, D1), 1,26 (3H, H-2', D1), 1,45 (6H, H-2', D2), 1,49 (3H, H-4b’, D1), 1,57 (3H, H-4a’, D1). 1,57 (3H, H-4b’, D2), 1,65 (3H, H-4a’, D2), 1.84 (br, 3H, H-3, D1), 1.93 (br, 3H, H-3, D2), 2.87 (m, 2H, CH2, D1+D2), 3.44 (D1+D2) 3.93 (m, 1H, CH, D2), 3.99 (m, 1H, CH, D1), 6.69 (m, 2H, Ar, D1), 6.70 (m, 2H, Ar, D2), 7.04 (m, 2H, Ar, D1), 7.01 (m, 2H, Ar, D2), 7.78 (d, 1H, J=9.4 Hz, NH - амид, D2), 7.89 (d, 2H, J=9.4 Hz, NH - амид, D1), 8.12 (br., 1H, NH2, D2), 8.17 (br, 2H, NH2, D1); ¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 13.6 (СНз, D2), 13.9 (СНз, D1), 36.3 (CH2, D1+D2), 37.5 (C-4, амантадин, D1), 37.6 (C-4, амантадин, D2), 37.5 (C-2, амантадин, D1), 37.6 (C-2, амантадин, D2), 52.7 (CH, D1), 52.6 (CH, D1), 53.6 (CH, D1), 53.5 (CH, D1), CQau амантадин. 115 (CH-Ar, D1+D2), 124,7 (Cquat, D1+D2) 130.4 (CH-Ar, D2) 130.2 (CH-Ar, D2), 156.5 (Cquat, D1), 156.4 (Cquat, D2), 167.1 (CO, D1), 167.1 (CO, D2); ESI-MS: 509 [M+K]+, 493 [M+Na]+, 471 [M+H]+.

Етапите на синтеза на съединението с формула I, съгласно изобретението, са обобщени на Схема I по- долу:

Схема I

Постигнатата по този начин химична модификация на съществуващото противогрипно лекарствено средство амантадин води до получаването на ново адамантаново производно, което в условията на организма се хидролизира и се разделя на двете участващи компоненти: амантадин и прекурсора на допамин в организмааминокиселината тирозин, поради което новосинтезираното съединение действа както като инхибитор на вирусната невраминидаза, така и като прекурсор на допамина [5].

По този начин е създадено ново средство, което от една страна е ефективно в преодоляване на развиваща се спрямо вирусни мутации резистентност, а от друга е ефективно при лечение на Болестта на Паркинсон. Полученото съединение е с висока стабилност: при pH =1 тя е 52 часа, а при pH = 7.4 е 73 часа.

Адамантановото производно съгласно изобретението, проявява значими невробиологични и биохимични ефекти върху мишки и плъхове в значително по-ниски дози (около 2.5 пъти) спрямо референта амантадин, умерена интраперитонеална токсичност и отсъствие на кожни лезии след третиране; приложено в много по-ниски дози в експериментален метод на плъхове с 6-хидрокси допамин, защитният ефект срещу БП показва съизмерим ефект, а в някои случаи превъзхожда този на референта.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения без да ограничават неговият обхват.

Пример 1: Получаване на съединение с формула I съгласно изобретението

За получаване на съединение с формула (I), при стайна температура 7.7 mmol (2.8 g) трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозин-ОН се разтваря в дихлорометан и при непрекъснато разбъркване се добавят 7.7 mmol (1 ml) триетиламин и 10.8 mmol (3.5 g) 2(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламинов тетрафлуорборат (TBTU). След 30 минути към разтвора се добавя 8.5 mmol (1.6 g) амантадин хидрохлорид, разтворен в дихлорметан. След приключване на реакцията, реакционната смес се промива с 4%-ен разтвор на №НСОз, NaHSO4 и вода. Органичният слой се суши с безводен МагБОд. След филтруване, разтворителят се изпарява и се получава продукт под формата на масло.

I I il' ΙίτΙΙιίΗ

Към полученият трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозинил-амантадин, разтворен в дихлорметан при 0°С, се прибавят 8.5 mmol (1.2 ml) трифлуороцетна киселина (TFA). След края на реакцията разтворителят се изпарява и се добавя диетилов етер. Получава се трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин. Към трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин се добавя концентриран NH4OH и pH на разтвора се довежда до 7.0. Добив - 1.4 g (59%).

Полученото съединение е с наименование по UPAC: 2-амино-3-(4хидроксифенил)пропаноил-1-адамантиламин.

¹H-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 0.75. (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D2), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D1), 1,18 (3H, H-2’, D1), 1,26 (3H, H-2’, D1), 1,45 (6H, H-2’, D2), 1,49 (3H, H-4b’, D1), 1,57 (3H, H-4a’, D1). 1,57 (3H, H-4b’, D2), 1,65 (3H, H-4a’, D2), 1.84 (br, 3H, H-3, D1), 1.93 (br, 3H, H-3, D2), 2.87 (m, 2H, CH2, D1+D2), 3.44 (D1+D2) 3.93 (m, 1H, CH, D2), 3.99 (m, 1H, CH, D1), 6.69 (m, 2H, Ar, D1), 6.70 (m, 2H, Ar, D2), 7.04 (m, 2H, Ar, D1), 7.01 (m, 2H, Ar, D2), 7.78 (d, 1H, J=9.4 Hz, NH - амид, D2), 7.89 (d, 2H, J=9.4 Hz, NH - амид, D1), 8.12 (br., 1H, NH2, D2), 8.17 (br, 2H, NH2, D1); ¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 13.6 (СНз, D2), 13.9 (СНз, D1), 36.3 (CH₂, D1+D2), 37.5 (C-4, амантадин, D1), 37.6 (C-4, амантадин, D2), 37.5 (C-2, амантадин, D1), 37.6 (C-2, амантадин, D2), 52.7 (CH, D1), 52.6 (CH, D1), 53.6 (CH, D1), 53.5 (CH, D1), CQau амантадин, 115 (CH-Ar, D1+D2), 124,7 (Cquat, D1+D2) 130.4 (CH-Ar, D2) 130.2 (CH-Ar, D2), 156.5 (Cquat, D1), 156.4 (Cquat, D2), 167.1 (CO, D1), 167.1 (CO, D2); ESI-MS: 509 [M+K]+, 493 [M+Na]+, 471 [M+H]+.

ЯМР спектрите на получените съединения са снети на спектрометър с висока разделителна способност Bruker DRX 500 (Германия) и са проведени в ИОХЦФ- БАН. ЯМР химичните отмествания на синтезираното адамантаново производно са измерени в стандартен разтвор на деутериран хлороформ и деутриран диметилсулфоксид (DMSO).

Мас спектрите са снети с помощта на апарат Bruker Esquire 3000 Plus Ion Trap Mass Spectrometer (Германия), като е използвана мас спектрометрия с електроспрей йонизация и са проведени в Карловия Университет, Прага. Преди анализа за пробоподготовката е използван разтворител метанол.

Пример 2: Изследване на противовирусната активност на съединението, съгласно изобретението

Изследване на противовирусната активност на съединението съгласно настоящото изобретение спрямо грипен вирус A/H3N2, щам Hong Kong/68 е проведено в Университета „Фридрих Шилер“, гр. Йена, Германия. Резултатите за цитотоксичност и противовирусна активност са сравнени с амантадин и оселтамивир и са представени в Таблица 1 по- долу.

i I 4 li I

Таблица 1

Съединение	СС50 (μΜ) MDCK клетки	HNTC (μΜ) MDCK клетки	ICso (μΜ) към А/Hong Kong/68
средно	средно	средно
L-Tyr-Am	> 100	> 100	3,93
Амантадин	п/а	п/а	0,39
Оселтамивир	п/а	п/а	0,002

Където:

вирус - грипен вирус A/H3N2 , щам А/Hong Kong/68 клетки: MDCK (Madin-Darby клетъчни култури от кучешки бъбрек)

L-Tyr-Am е съединението, съгласно изобретението;

ССбо обозначава цитотоксична концентрация

HNTC обозначава най-висока нетоксична концентрация

IC50 обозначава инхибираща концентрация η/а = неприложимо

От получените данни за противовирусна активност на новосинтезираното адамантаново производно спрямо грипен вирус А/Hong Kong/68 става ясно, че съединението е с ниска цитотоксичност и проявява противовирусно действие. Неговата противовирусна активност in vitro е по-ниска от тази на амантадина, но показва висока стабилност при pH =1 (52 часа), съответстващо на гастроинтестиналния тракт, а при pH = 7.4 е 73 часа.

Пример 3. Изследване на антиоксидантната (АО) активност на съединението съгласно изобретението

Съединението, съгласно изобретението, е тествано в системи, генериращи активни форми на кислорода:

Система генерираща хидроксилни радикали - Използван е метода на Halliwell et al. (1988) [6], при който измереното количество субстанции, реагиращи с тиобарбитуровата киселина (TBARS), получени в резултат на деградацията на дезоксирибозата, служи като мярка за продукцията на хидроксилни (НО·) радикали. Абсорбцията на образуваните TBARS се отчита при 532 nm. Намаляването на продукцията на TBARS в присъствието на тестваното вещество е мярка за антиоксидантния му капацитет.

Система генерираща супероксидни анионни радикали - Използван е метода на Beauchamp и Fridovich [7]. Супероксидните анионни радикали (Or) се генерират фотохимично от съдържащия се в реакционната среда рибофлавин, чрез използване на живачна лампа. Образуваните радикали редуцират нитро-блутетразолиума (NBT) до син формазанов продукт, чиято абсорбция се измерва при 560 nm. Намаляването на интензитета на оцветяване на реакционната среда е мярка за антиоксидантният капацитет на изследваното вещество.

I ιίι 4 ii iihi

Резултатите от изследването показват че антиоксидантната активност на съединението, съгласно изобретението, в концентрации до 50 μΜ по отношение на DPPH радикали е незначителна (от 3% до 10%); по отношение на супероксидните анионни радикали, съединението в концентрации 50 μΜ предизвиква 12% инхибиране на редукцията на ΝΒΤ; двата деоксирибозни теста (в присъствието и в отсъствието на хелатор) са използвани, за да се оцени улавящия или хелатиращия потенциал на съединениеторезултатите показват, че те са незначителни - под 4%.

В заключение, адамантановото производно съгласно изобретението, не показа висок антиоксидантен потенциал, но е с ниска цитотоксичност и показва противовирусна активност спрямо грипен вирус Α/Η3Ν2 , щам А/Hong Kong/68.

Пример 4. Определяне токсичността на съединението in vivo

Използвани са бели мъжки полово зрели мишки ICR с начално телесно тегло 18-24 g отглеждани в помещенията на вивариума на Института по Невробиология, БАН, при стайна температура, свободен достъп до храна и вода и автоматично контролиран 12 часов цикъл светлина-тъмнина.

Изследвани са следните основни токсикологични параметри: а) Праг на острото действие (Lim_ac)- това е минималната доза, предизвикваща биологичен ефект, регистриран по промените в поведенческите показатели на животните след еднократно въвеждане на веществата; Ь) Определяне нивото на липсващ ефект - това е дозата на веществото, приложена еднократно, при която липсва забележим ефект (No Observed Effect Level- NOEL). За целта на 5-6 мишки се въвежда веществото с начални дози над 1/20 LDso и 1/50 LD50, проследява се промяната в поведението на животните след въвеждане на еднократни, възходящи дози на тирзинил-амантадина- на 1-я, 2-я, 4-я, 6-я и 8-я час от въвеждането, като за сравнение паралелно внимателно се наблюдава контролна група животни; с) Определяне на острата токсичност- Средна смъртна (летална) доза (LD50), предизвикваща летален изход при 50% от животните, като при 1-ва група животни- началното разтваряне на съединението от изобретението се прави с Деутериран диметилсулфоксид (ДМСО), а следващите разреждания са с вода; при II група животни изходния разтвор и последващите разреждания са направени само с ДМСО; Дозите се изчисляват в милиграм активна субстанция на килограм телесно тегло, въвеждането е интраперитонеално в допустимите обеми за мишки (0.10 ml/10 g телесно тегло). Работните дози от веществото са: 10, 16, 32, 100, 150, 300, 320, 350, 500 и 1000 mg/kg. Смъртността в групите се проследява на 1-я, 24-ят и 48-ят час от прилагането на веществата. Контролната група получава същия обем разтворител. Определя се и ефективната доза ED50; d) Изследване на пролонгираната токсичност на съединението- Проследени са следните показатели: общо състояние, апетит, общо тегло, външен вид (настръхнала кожа, слюнкотечение, екзофталм (изпькване на очите), оцветяване на лигавиците (цианоза, зачервяване). Смъртността в групите е отчетена на

I II ill № lilu

5-ят и 7-ят ден след еднократното прилагане на веществото; е) Макроскопски оглед- В края на изследваните периоди (24-я и 48-я час и 5-я и 7-я ден) е направена дисекция на животните, като вътрешните им органи (черен дроб, бял дроб и стомах) са огледани макроскопски за евентуални поражения от прилаганите вещества; f) Реверзибилност на токсичните поражения- Проследява се също реверзибилността на токсичните поражения на 15-я ден след еднократното третиране.

Резултатите от изследването за остра токсичност на съединението, съгласно настоящото изобретение показват че:

LDsoe 320 mg/kg (интраперитонеално) при мишки

LDsoe 150 mg/kg (интраперитонеално) при плъхове

Терапевтичен индекс- 20

NOEL - 5 mg/kg (интраперитонеално)

Limас - 8 mg/kg (интраперитонеално)

EDso 16 mg/kg т.т. (интраперитонеално)

Резултатите от изследването за пролонгирана токсичност на съединението, съгласно изобретението показват известна пролонгирана токсичност, съчетана с невисока водна разтворимост, което предполага и забавен чернодробен метаболизъм.

Резултатите от макроскопският оглед след прилагане на съединението, съгласно изобретението, показват слаби изменения във външния вид на черния дроб, липса на промени в белия дроб и реверзибилност на наблюдаваните изменения.

Пример 5. Изследване за неврофармакологична активност на съединението, съгласно изобретението, при здрави гризачи

Всяка група съдържа по 6 бр. мъжки ICR полово зрели мишки (18-24 д) и по 6 бр. мъжки полово зрели плъхове Вистар (180- 230 д)- третирани еднократно с 16 mg/kg от съединението, съпоставяни с група от контролни животни. Животните са отглеждани в стандартните условия на Вивариума на Института по Невробиология на БАН. След едноседмична адаптация в условията на вивариума, животните са подложени на следните поведенчески тестове:

а) Проследяване за промени в невромускулната координация при гризачи (Rotarod тест) по метода на Dunham и Miya [8]. Използван е апарат с диаметър на въртящия се лост 3.5 см и скорост на въртене 7 об/мин. Тестовия период е 3 мин, като в зависимост от нуждите на експеримента се отчита или продължителността на престой върху апарата или броя на паданията по време на наблюдавания период.

Ь) Проследяване за промени в ориентировъчното поведение при гризачи (“Hole board тест) по метода на Boissier и Simon [9]. За целта е използвана черна пластмасова плоскост с размери 50-50 см, на която има 16 симетрично разположени кръгли отвори с диаметър 3 см. Пластмасовата плоскост служи за под на кутия със стени с височина 25 см, а самата плоскост се намира на 10 см височина. Изследователското поведение на

ΗΗιΓΗι^ί.

мишките е проследявано в продължение на 3 мин от двама независими наблюдатели. Отчитан е броят на надничанията на поставеното в апарата животно.

с) Проследяване за промени в паметта и обучението при гризачи (step through тест; пасивно избягване с отрицателно подкрепление) по метода на Jarvik и Корр [10]. Апаратът е конструиран в Институт по Невробиология, БАН и се състои се от светла и тъмна камера, свързани помежду си с подвижна преграда. Подът в тъмната част на апарата е метална решетка, по която може да се подава токово дразнене със сила 1 мА и продължителност 1 секунда. Различаваме обучителна и тестова фаза на метода. По време на обучителната фаза животното се поставя върху платформа в светлата част на апарата след което се отваря подвижната преграда и то преминава в неговата тъмната част, където получава токово дразнение на лапите. В тази фаза се отчита времето (в секунди) за което животното е преминало от светлата в тъмната част на апарата. Животни престояли повече от една минута в светлата част на апарата се изключват от експеримента. Следва тестовата фаза. Степента на запаметяване на задачата да остане в светлата част на апарата се тества през различни периоди от време след обучителната тренировка. Отчита се времето (в секунди) за което животното остава върху платформата в осветената част. Теста се прави за период от 180 s.

Ефектът от въздействието на еднократни дози от по 8, 16 и 32 mg/kg от съединението върху невромускулната координация при мишки на 3 часа (1А) и на 24 часа от прилагането (1В) е показан на Фиг. 1 по-долу.

А 3 час В 24 час

-7 150Ф 1002 Ф Q.

CO БОКонтрола □ контрола

L-Tyr-Am

Ф Q.

СО 50контрола мг/кг 16 мг/кг 32 мг/кг □ контрола i L-Tyr-Am

Р< 0.05 vs контролата

Фиг. 1

Въздействието на еднократни дози от съединението от по 8, 16 и 32 mg/kg върху паметта и обучението на мишки е показан на Фиг. 2 по- долу, където ефективността на дозата от 16 mg/kg е подчертано висока.

I i iiht

A. 3 час

200

* P< 0.05 vs контролата □ НЛ

M стл

B. 24 час

200

* P< 0.05 vs контролата □ НЛ

I СТЛ

Фиг. 2

Където:

НЛ - е начално латентно време

СТЛ - е степ тру латентно време

Ефектът на еднократна доза от 16 mg/kg от съединението върху ориентировъчното поведение на мишки е илюстриран с Фиг. 3, от която е видно, че този ефект е продължителен и се задържа до 24-тия час от началото на експеримента.

* Р< 0.05 vs базално нивото

Фиг. 3

Изследванията за неврофармакологична активност при 5- дневно третиране на здрави гризачи с доза 16 мг/кг от съединението, съгласно изобретението показват още, че подобно на амантадина, новосинтезираното съединение няма амнестичен ефект върху животните.

Пример 6. Изследване превантивните ефекти на съединението, съгласно изобретението, върху гризачи с модел на Болест на Паркинсон

Неврофармакологичната активност на съединението, съгласно изобретението, както и възможността той да има защитен ефект при заболяването е изследвана върху плъхове с модел на БП. Ефектът му е сравняван с този на утвърден лекарствен препарат от същата химична група- Амантадин, който се прилага превантивно като невропротектор в началото на лечението.

За създаването на експерименталният модел на Болестта на Паркинсон е използван невротоксина 6-хидрокси допамин (6-OHDA), който не преминава кръвно-мозъчната бариера и селективно уврежда катехоламинергичната невротрасмисия на ниво централна и периферна нервна система. За нуждите на експеримента са използвани мъжки, полово зрели плъхове от породата Вистар с тегло 250-300 гр, които се упояват с хлоралхидрат (400 мг/кг, и.п) и се фиксират на стереотаксичен апарат. Невротоксина 6OHDA (10 рд/ 2μΙ), се инжектира едностранно в десен стриатум при координати АР = 0 mm, LR = 3.5 mm, Н= 5 mm, спрямо брегмата и черепната повърхност [11]. При контролните животни се прави отвор с координати, отговарящи на striatum, като се инжектира 2 μΐ 0.9% NaCI. Във всички групи петдневните интраперитонеални инжектирания предшестват хирургичната интервенция и стереотаксичното прилагане на токсина 6-OHDA. Опитните животни са разделени в експериментални групи, показани на Таблица 2 по-долу:

Таблица 2

Групи	Стереотаксично инжектиране (стриатум)	Интраперитонеално третиране (5 дни)
SO (фалшиво оперирани)	0.9% NaCI (2 μ|)	0.9% NaCI
6-OHDA	6-OHDA (10 μ9/2 μΙ)	0.9% NaCI
6-OHDA + амантадин	6-OHDA (10 pg/2 μΙ)	амантадин (40 mg/kg)
6-OHDA + Съединение по изобретението	6-OHDA (10 pg/2 μΙ)	Съединение по изобретението (16 mg/kg)

Приложените поведенчески и биохимични методи на изследване на третираните животни показват, че съединението, съгласно настоящото изобретение, намалява значимо броя на контралатералните ротации /при апомофиновия тест/ спрямо 6-OHDA група, което демонстрира убедително протективния ефект на веществото; подобрява също значимо паметовите процеси, нарушени от БП в групата с 6-OHDA /степ тру тест/; намалява оксидативния стрес чрез намаляване на липидна пероксидация в мозъка на плъхове с модел на ПБ и не повлиява мозъчната ацетилхолинестеразна активност. Освен това, новосинтезираното вещество не предизвиква кожни лезии, за разлика от третираните с референта Амантадин животни.

Установените значими невробиологични и биохимични ефекти върху мишки и плъхове, са съизмерими с тези на референта Амантадин, но в значително по-ниски дози (около 2,5 пъти), което е предимство на новосинтезираното вещество; върху експериментален модел на плъхове с 6-OHDA защитните ефекти на съединението, съгласно изобретението, срещу БП също са много добри - те са съизмерими, а в някои случаи превъзхождат тези на референта Амантадин, но приложени в значително по-ниски дози.

Литература:

1. Grelak, R. Р., Clark, R., Stump, J. Μ., & Vernier, V. G. (1970). Amantadine-dopamine interaction: possible mode of action in Parkinsonism. Science, 169(3941), 203-204.

2. Schwab, R. S„ Poskanzer, D. C„ England, A. C„ & Young, R. R. (1972). Amantadine in Parkinson's disease: review of more than two years' experience. Jama, 222(7), 792-795.

3. Stanicova, J., Miskovsky, P., & Sutiak, V. (2001). Amantadine: an antiviral and antiparkinsonian agent. Vet. Med. Czech, 46, 244-256.].Bak I., Hassler R., Kim J. and K. Kataoka (1972). Amantadine Actions on Acetylcholine and GABA in Striatum and Substantia Nigra of Rat in Relation to Behavioral Changes. Journal of Neural Transmission 33:45-61.

4. Knor R., Arnold T., Bannwarth W., Gillessen D., (1989). New coupling reagents in peptide chemistry, Tetrahedron Letters, 30, 15, 1989, 1927-1930.

5. Di Francisco-Donoghue J., Rabin E„ Lamberg E. M„ Werner G.W., Effects of tyrosine on Parkinson's disease: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial, 2014, Clinical Practice, https://doi.org/10.1002/mdc3.12082.

6. Puppo, A. & Halliwell, B. (1988). Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent?. Biochemical Journal 249(1), 185-190.

7. Beauchamp, C., & Fridovich, I. (1971). Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical biochemistry, 44^), 276-287.

8. Dunham N. and T. Miya (1957). A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Assoc Am Pharm Assoc., 46(3):208-209.

9. Boissier J. and P. Simon (1964). “L¹ utilisation d' une reaction particulire de la souris (Methode de la planche a trous) pour 1' etude des medicaments psychotropes”Therapie XIX 571-589.

10. Jarvik M. and R. Kopp (1967). An improved one-trial passive avoidance learning situation. Psychol Rep., 21(1):221-224.

11. Paxinos G. and C. Watson (1998). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Academic Press New York NY USA, ISBN: 9780125476126.

Claims (5)

1. Претенции

   1. Адамантаново производно c формула I:

   OH

   (I)
2. 2. Метод за получаване на адамантановото производно с формула (I) съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че трет-бутилоксикарбонил-тирозинил(третбутил)-ОН се разтваря в дихлорометан и към полученият разтвор се добавя триетиламин, добавя се 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламинов тетрафлуорборат при непрекъснато разбъркване, този разтвор се смесва с предварително разтворен в дихлорметан амантадин хидрохлорид и след приключване на реакцията се извършва промиване с 4%-ен разтвор на NaHCOs, NaCI и вода; органичният слой се суши с безводен МагБОд, разтворителят се изпарява и към полученият трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозинил-амантадин, разтворен в дихлорметан при 0°С, се прибавя трифлуорооцетна киселина; разтворителят се изпарява, добавя се диетилов етер и към получената кристална сол се добавя концентриран NH4OH, a pH на разтвора се довежда до 7.0.
3. 3. Адамантаново производно съгласно претенции 1 и 2, приложимо за профилактика и лечение на заболявания, свързани с нарушение на биосинтеза и екскрецията на допамин.
4. 4. Адамантаново производно съгласно претенция 3, приложимо за профилактика и лечение на Болестта на Паркинсон.
5. 5. Адамантаново производно съгласно претенции 1 и 2, приложимо за профилактика и лечение на вирусни заболявания.