BG67301B1 - Адамантаново производно с противовирусна и антипаркинсонова активност - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до адамантаново производно с формула I: до метод за неговото получаване и до приложението му като противовирусно и антипаркинсоново средство.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до адамантаново производно с противовирусна и антипаркинсонова активност, приложимо за превенция и лечение на заболявания, свързани с нарушение на биосинтеза и екскрецията на допамин.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че допаминът е съединение, което тялото продуцира по естествен път в мозъка и функционира като невротрансмитер. Това е критична компонента, използвана от мозъка да контролира движението на тялото, поради което всяко изменение на нивото й в мозъка води до много лоши резултати. Повишаването на нивото на допамина в мозъка се асоциира със състояния като пристрастяване към лекарства и психиатрични състояния като шизофрения, докато неговото понижаване води до депресия, Болестта на Паркинсон (БП) и Паркинсоноподобни разстройства.

Болестта на Паркинсон е прогресивно разстройство на централната нервна система, която поразява хиляди хора по света и се асоциира със загуба на допаминова продукция в специфична област на мозъка. Макар обичайно да засяга възрастните хора, напоследък с това заболяване биват диагностицирани все повече хора преди да достигнат 50 години. Това е хронично и прогресивно заболяване, симптомите на което все повече се влошават и са необратими във времето. Характерните симптоми включват намаляване на спонтанните движения, трудност при ходене, ортостатична нестабилност, скованост и тремор.

Както множество неврологични заболявания, истинската причина за Болестта на Паркинсон е неизвестна. Независимо от това, проучванията са доказали, че БП се проявява когато група от невронни клетки в област на мозъка, наречена substantia nigra pars compacta (SNc), са c понижена активност и евентуално са загинали, което води до понижаване в нивата на допамин в мозъка и което от своя страна води до нарушение в контрола на движението и координацията. Понастоящем се счита, че БП е нелечима. Прилаганите лекарствени средства са симптоматични и са насочени към повишаване на нивата на допамин в мозъка, но понякога се прибягва и до поинвазивни хирургични методи за лечение чрез невронна аблация или дълбоко мозъчна стимулация. За съжаление, тези методи имат недостатъци, някои от които много сериозни и компрометиращи качеството на живот на пациентите.

Ето защо усилията на изследователите са насочени към намиране на нови пътища за разбиране и изучаване на допаминергичните заболявания и състояния, както и на нови пътища за лечението им без да бъде повлияна нормалната функция на невроните и качеството на живот на заболелите.

Резултатите от изследванията на проф. James Surmeier, както и неговите изобретения, са основани на разбирането, че загиването на допаминергичните неврони е в пряка зависимост от калциевите ионни канали в клетките на бозайници, по-специално на Ca_vL3a, както и на Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 и Kv3.4 йонните канали. Изобретателят предлага метод за превенция и лечение на Болестта на Паркинсон, включващ директно въздействие върху Ca_v1.3a калциевите йонни канали с блокери, по-специално с дихидропиридинов блокер на калциевите канали (US 2018064697 Al; US 2013345230 А1), което защитава увредените клетки и ги предпазва от по-нататъшна деградация и евентуална смърт. В някои варианти на изпълнение, в качеството на дихидропиридинов блокер на калциевите канали се използва нифидипин, нимодипин и/или израдипин, а в други освен блокер, допълнително се прилага терапевтично средство, избрано от групата, включваща леводопа, карбидопа, ентакапон, апоморфин хидрохлорид, бромокриптин, перголид, прамипексол, ропинерол, бензотропин мезилат, трихексифенидил НС1, селегилин, толкапон, амантадин, рилузол и/или L-допа етил етер.

В патент US 7629323 (В2) същият автор претендира, че манипулирането на активността на ионни канали от групата, включваща K_v3.1, K_v3.2, Κ_ν3.3 и Κ_ν3.4 и свързани с БП и други неврологични заболявания и състояния, може да се осъществи посредством трансфекция на увредени невронни клетки, съдържащи тези йонни канали, чрез въвеждането на siRNA, която е способна да инхибира експресията на тези йонни канали в клетките.

От друга страна, известно е свойството на адамантина да инхибира репликацията на грипния вирус тип А посредством блокиране на М2-протеина в йонния канал. Освен това, наскоро са установени и други важни клинични приложения на амантадина като Болестта на Паркинсон, невралгия, депресия и др., които според последни изследвания се дължат на способността му да блокира серотонин активиращият йонен канал, йонният канал на никотин-ацетилхолиновите рецептори, както и йонният канал на N-метил-О-аспартатните рецептори. Доколкото е известно, става въпрос за способността на адамантина да блокира невромускулното предаване, оказващо влияние върху биосинтеза и екскрецията на допамин [1]. Биологичната активност на адамантина се дължи още и на симетрията и пространственото разположение на молекулата, както и на значителната и липофилност, благодарение на стабилната въглеводородна рамка, което позволява да проникне лесно през биологичните мембрани [2].

Задача на изобретението е да предложи съединение, което да проявява едновременно както противовирусна, така също антипаркинсонова активност и което да е приложимо за профилактика и лечение на заболявания, свързани с нарушение на биосинтеза и екскрецията на допамин [3].

Техническа същност на изобретението

По своята същност изобретението се отнася до адамантаново производно с Формула I.

ОН

BG 67301 Bl

(·)

Химичното съединение се получава в следната последователност от синтези: най-напред третбутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозин-ОН (Boc-Tyr(tBu)-OH) се разтваря в дихлорометан и се добавя триетиламин. При непрекъснато разбъркване към него се добавя 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметиламинов тетрафлуорборат (TBTU) [4]. Амантадин хидрохлорид се разтваря в дихлорметан и се добавя към реакционната смес. След приключване на реакцията, реакционната смес се промива с 4%-ен разтвор на NaHCO₃, NaCI и вода. Органичният слой се суши с безводен Na₂SO₄, разтворителят се изпарява и се получава продукт под формата на масло. Към получения трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозинил-амантадин, разтворен в дихлорметан при 0°С, се прибавя трифлуороцетна киселина (TFA). След края на реакцията разтворителят се изпарява и се добавя диетилов етер. Получава се трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин. Към трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин се добавя концентриран NH₄OH и pH на разтвора се довежда до 7.0. Полученото съединение е е наименование по UPAC: 2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропаноил-1адамантиламин.

Ή-NMR: (DMSO-d₆) δ (ppm): 0.75 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D2), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, DI), 1,18 (3H, H2', DI), 1,26 (3H, H-2’, DI), 1,45 (6H, H-2’,D2), 1,49 (3H, H-4b’,Dl), 1,57 (3H, H-4a’, DI), 1,57 (3H, H-4b',D2), 1,65 (3H, H-4a', D2), 1.84 (br, 3H, H-3, DI), 1.93 (br, 3H, H-3, D2), 2.87 (m, 2H, CH₂, D1+D2), 3.44 (D1+D2), 3.93 (m, 1H, CH, D2), 3.99 (m, 1H, CH, DI), 6.69 (m, 2H, Ar, DI), 6.70 (m, 2H, Ar, D2), 7.04 (m, 2H, Ar, DI), 7.01 (m, 2H, Ar, D2), 7.78 (d, 1H, J=9.4 Hz, NH - амид, D2), 7.89 (d, 2H, J=9.4 Hz, NH - амид, DI), 8.12 (br, 1H, NH2, D2), 8.17 (br, 2H, NH2, DI); C-NMR: (DMSO-d₆) δ (ppm): 13.6 (CH₃, D2), 13.9 (CH₃, DI), 36.3 (CH₂, D1+D2), 37.5 (C-4, амантадин, DI), 37.6 (C-4, амантадин, D2), 37.5 (C-2, амантадин, DI), 37.6 (C-2, амантадин, D2), 52.7 (CH, DI), 52.6 (CH, DI), 53.6 (CH, DI), 53.5 (CH, DI), CQau амантадин. 115 (CH-Ar, D1+D2), 124,7 (Cquat, D1+D2) 130.4 (CH-Ar, D2) 130.2 (CH-Ar, D2), 156.5 (Cquat, DI), 156.4 (Cquat, D2), 167.1 (CO, DI), 167.1 (CO, D2); ESI-MS: 509 [M+K]+, 493 [M+Na]+, 471 [M+H]+.

Етапите на синтеза на съединението с формула I, съгласно изобретението, са обобщени на Схема I по-долу.

BG 67301 Bl

Схема I

Постигнатата по този начин химична модификация на съществуващото противогрипно лекарствено средство амантадин води до получаването на ново адамантаново производно, което в условията на организма се хидролизира и се разделя на двете участващи компоненти: амантадин и прекурсора на допамин в организма аминокиселината тирозин, поради което новосинтезираното съединение действа както като инхибитор на вирусната невраминидаза, така и като прекурсор на допамина [5].

BG 67301 Bl

По този начин е създадено ново средство, което от една страна е ефективно в преодоляване на развиваща се спрямо вирусни мутации резистентност, а от друга е ефективно при лечение на Болестта на Паркинсон. Полученото съединение е с висока стабилност: при pH = 1 тя е 52 h, а при pH - 7.4 е 73 h.

Адамантановото производно съгласно изобретението, проявява значими невробиологични и биохимични ефекти върху мишки и плъхове в значително по-ниски дози (около 2.5 пъти) спрямо референта амантадин, умерена интраперитонеална токсичност и отсъствие на кожни лезии след третиране; приложено в много по-ниски дози в експериментален метод на плъхове с 6-хидрокси допамин, защитният ефект срещу БП показва съизмерим ефект, а в някои случаи превъзхожда този на референта.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват.

Пример 1. Получаване на съединение с формула I съгласно изобретението

За получаване на съединение с формула (I), при стайна температура 7.7 mmol (2.8 g) третбутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозин-ОН се разтваря в дихлорометан и при непрекъснато разбъркване се добавят 7.7 mmol (1 ml) триетиламин и 10.8 mmol (3.5 g) 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламинов тетрафлуорборат (TBTU). След 30 min към разтвора се добавя 8.5 mmol (1.6 g) амантадин хидрохлорид, разтворен в дихлорметан. След приключване на реакцията, реакционната смес се промива с 4%-ен разтвор на NaHCO₃, NaHSCU и вода. Органичният слой се суши с безводен Na₂SO₄. След филтруване, разтворителят се изпарява и се получава продукт под формата на масло.

Към получения трет-бутилоксикарбонил-О-трет-бутил-тирозинил-амантадин, разтворен в дихлорметан при 0°С, се прибавят 8.5 mmol (1.2 ml) трифлуороцетна киселина (TFA). След края на реакцията разтворителят се изпарява и се добавя диетилов етер. Получава се трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин. Към трифлуороцетна сол на тирозинил-амантадин се добавя концентриран NH₄OH и pH на разтвора се довежда до 7.0. Добив -1.4 g (59%).

Полученото съединение е с наименование по UPAC: 2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропаноил-1адамантиламин.

‘H-NMR: (DMSO-d₆) δ (ppm): 0.75 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D2), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, DI), 1,18 (3H, H2’, DI), 1,26 (3H, H-2’, DI), 1,45 (6H, H-2', D2), 1,49 (3H, H-4b’, DI), 1,57 (3H, H-4a’, DI), 1,57 (3H, H-4b’, D2), 1,65 (3H, H-4a’, D2), 1.84 (br, 3H, H-3, DI), 1.93 (br, 3H, H-3, D2), 2.87 (m, 2H, CH₂, D1+D2), 3.44 (D1+D2) 3.93 (m, 1H, CH, D2), 3.99 (m, 1H, CH, DI), 6.69 (m, 2H, Ar, DI), 6.70 (m, 2H, Ar, D2), 7.04 (m, 2H, Ar, DI), 7.01 (m, 2H, Ar, D2), 7.78 (d, 1H, J=9.4 Hz, NH - амид, D2), 7.89 (d, 2H, J=9.4 Hz, NH - амид, DI), 8.12 (br, 1H, NH2, D2), 8.17 (br, 2H, NH2, DI); ^l3C-NMR: (DMSO-d₆) δ (ppm): 13.6 (CH₃, D2), 13.9 (CH₃, DI), 36.3 (CH₂, D1+D2), 37.5 (C-4, амантадин, DI), 37.6 (C-4, амантадин, D2), 37.5 (C-2, амантадин, DI), 37.6 (C-2, амантадин, D2), 52.7 (CH, DI), 52.6 (CH, DI), 53.6 (CH, DI), 53.5 (CH, DI), CQau амантадин, 115 (CH-Ar, D1+D2), 124,7 (Cquat, D1+D2), 130.4 (CH-Ar, D2), 130.2 (CH-Ar, D2), 156.5 (Cquat, DI), 156.4 (Cquat, D2), 167.1 (CO, DI), 167.1 (CO, D2); ESI-MS: 509 [M+K]+, 493 [M+Na]+, 471 [M+H]+.

ЯМР спектрите на получените съединения са снети на спектрометър с висока разделителна спосооност Bruker DRX 500 (Германия) и са проведени в ИОХЦФ - БАН. ЯМР химичните отмествания на синтезираното адамантаново производно са измерени в стандартен разтвор на деутериран хлороформ и деутериран диметилсулфоксид (DMSO).

Масспектрите са снети с помощта на апарат Bruker Esquire 3000 Plus Ion Trap Mass Spectrometer (Германия), като е използвана масспектрометрия с електроспрей йонизация и са проведени в Карловия Университет, Прага. Преди анализа за пробоподготовката е използван разтворител метанол.

Пример 2. Изследване на противовирусната активност на съединението, съгласно изобретението

Изследване на противовирусната активност на съединението съгласно настоящото изобретение спрямо грипен вирус A/H3N2, щам Hong Kong/68 е проведено в Университета „Фридрих Шилер“, гр. Йена, Германия. Резултатите за цитотоксичност и противовирусна активност са сравнени с амантадин и оселтамивир и са представени в Таблица 1 по-долу.

Таблица 1

Съединение	ССм(рМ) MDCK клетки	HNTC (μΜ) MDCK клетки	|Ся(рМ) към А/Hong Копд/68
средно	средно	средно
L-Tyr-Am	>100	>100	3,93
Амантадин	п/а	п/а	0,39
Оселтамивир	п/а	п/а	0,002

BG 67301 Bl

Където:

вирус - грипен вирус A/H3N2, щам А/Hong Kong/68 клетки: MDCK (Madin-Darby клетъчни култури от кучешки бъбрек)

- L-Tyr-Am е съединението, съгласно изобретението

- СС₅о обозначава цитотоксична концентрация

- HNTC обозначава най-висока нетоксична концентрация

- 1С₅о обозначава инхибираща концентрация

- η/а = неприложимо

От получените данни за противовирусна активност на новосинтезираното адамантаново производно спрямо грипен вирус А/Hong Kong/68 става ясно, че съединението е с ниска цитотоксичност и проявява противовирусно действие. Неговата противовирусна активност in vitro е по-ниска от тази на амантадина, но показва висока стабилност при pH = 1 (52 h), съответстващо на гастроинтестиналния тракт, а при pH = 7.4 е 73 h.

Пример 3. Изследване на антиоксидантната (АО) активност на съединението съгласно изобретението Съединението, съгласно изобретението, е тествано в системи, генериращи активни форми на кислорода: Система, генерираща хидроксилни радикали - Използван е метода на Halliwell et al. (1988) [6], при който измереното количество субстанции, реагиращи с тиобарбитуровата киселина (TBARS), получени в резултат на деградацията на дезоксирибозата, служи като мярка за продукцията на хидроксилни (НО*) радикали. Абсорбцията на образуваните TBARS се отчита при 532 шп. Намаляването на продукцията на TBARS в присъствието на тестваното вещество е мярка за антиоксидантния му капацитет.

BG 67301 Bl

Система, генерираща супероксидни анионни радикали - Използван е метода на Beauchamp и Fndovich [7]. Супероксидните анионни радикали (Of) се генерират фотохимично от съдържащия се в реакционната среда рибофлавин, чрез използване на живачна лампа. Образуваните радикали редуцират нитро-блутетразолиума (NBT) до син формазанов продукт, чиято абсорбция се измерва при 560 nm. Намаляването на интензитета на оцветяване на реакционната среда е мярка за антиоксидантния капацитет на изследваното вещество.

Резултатите от изследването показват, че антиоксидантната активност на съединението, съгласно изобретението, в концентрации до 50 μΜ по отношение на DPPH радикали е незначителна (от 3% до 10%); по отношение на супероксидните анионни радикали, съединението в концентрации 50 μΜ предизвиква 12% инхибиране на редукцията на ΝΒΤ; двата деоксирибозни теста (в присъствието и в отсъствието на хелатор) са използвани, за да се оцени улавящия или хелатиращия потенциал на съединението - резултатите показват, че те са незначителни - под 4%.

В заключение, адамантановото производно съгласно изобретението, не показа висок антиоксидантен потенциал, но е с ниска цитотоксичност и показва противовирусна активност спрямо грипен вирус Α/Η3Ν2, щам А/Hong Kong/68.

Пример 4. Определяне токсичността на съединението in vivo

Използвани са бели мъжки полово зрели мишки ICR с начално телесно тегло 18-24 g, отглеждани в помещенията на вивариума на Института по невробиология, БАН, при стайна температура, свободен достъп до храна и вода и автоматично контролиран 12-часов цикъл светлина-тъмнина.

Изследвани са следните основни токсикологични параметри: а) Праг на острото действие (Lim_ac) - това е минималната доза, предизвикваща биологичен ефект, регистриран по промените в поведенческите показатели на животните след еднократно въвеждане на веществата; Ь) Определяне нивото на липсващ ефект - това е дозата на веществото, приложена еднократно, при която липсва забележим ефект (No Observed Effect Level - NOEL). За целта на 5-6 мишки се въвежда веществото с начални дози над 1/20 LD₅o и 1/50 LD₅o, проследява се промяната в поведението на животните след въвеждане на еднократни, възходящи дози на тирзинил-амантадина - на 1-я, 2-я, 4-я, 6-я и 8-я час от въвеждането, като за сравнение паралелно внимателно се наблюдава контролна група животни; с) Определяне на острата токсичност - средна смъртна (летална) доза (LD₅₀), предизвикваща летален изход при 50% от животните, като при 1-ва група животни - началното разтваряне на съединението от изобретението се прави с деутериран диметилсулфоксид (ДМСО), а следващите разреждания са с вода; при II група животни изходния разтвор и последващите разреждания са направени само с ДМСО; Дозите се изчисляват в милиграм активна субстанция на килограм телесно тегло, въвеждането е интраперитонеално в допустимите обеми за мишки (0.10 ml/10 g телесно тегло). Работните дози от веществото са: 10, 16, 32, 100, 150, 300,320, 350, 500 и 1000 mg/kg. Смъртността в групите се проследява на 1-я, 24-я и 48-я час от прилагането на веществата. Контролната група получава същия обем разтворител. Определя се и ефективната доза ED₅₀; d) Изследване на пролонгираната токсичност на съединението - проследени са следните показатели: общо състояние, апетит, общо тегло, външен вид (настръхнала кожа, слюнкотечение, екзофталм (изпъкване на очите), оцветяване на лигавиците (цианоза, зачервяване). Смъртността в групите е отчетена на 5-я и 7-я ден след еднократното прилагане на веществото; е) Макроскопски оглед - в края на изследваните периоди (24-я и 48-я час и 5-я и 7-я ден) е направена

BG 67301 Bl дисекция на животните, като вътрешните им органи (черен дроб, бял дроб и стомах) са огледани макроскопски за евентуални поражения от прилаганите вещества; f) Реверзибилност на токсичните поражения - проследява се също реверзибилността на токсичните поражения на 15-я ден след еднократното третиране.

Резултатите от изследването за остра токсичност на съединението, съгласно настоящото изобретение показват, че:

- LD50 е 320 mg/kg (интраперитонеално) при мишки

- LD50 е 150 mg/kg (интраперитонеално) при плъхове

- Терапевтичен индекс - 20

- NOEL - 5 mg/kg (интраперитонеално)

- Liniac - 8 mg/kg (интраперитонеално)

- ED₅o 16 mg/kg т.т. (интраперитонеално)

Резултатите от изследването за пролонгирана токсичност на съединението, съгласно изобретението показват известна пролонгирана токсичност, съчетана с невисока водна разтворимост, което предполага и забавен чернодробен метаболизъм.

Резултатите от макроскопския оглед след прилагане на съединението, съгласно изобретението, показват слаби изменения във външния вид на черния дроб, липса на промени в белия дроб и реверзибилност на наблюдаваните изменения.

Пример 5. Изследване за неврофармакологична активност на съединението, съгласно изобретението, при здрави гризачи

Всяка група съдържа по 6 бр. мъжки ICR полово зрели мишки (18-24 g) и по 6 бр. мъжки полово зрели плъхове Вистар (180-230 g), третирани еднократно с 16 mg/kg от съединението, съпоставяни с група от контролни животни. Животните са отглеждани в стандартните условия на Вивариума на Института по невробиология на БАН. След едноседмична адаптация в условията на вивариума, животните са подложени на следните поведенчески тестове:

а) Проследяване за промени в невромускулната координация при гризачи (Rotarod тест) по метода на Dunham и Miya [8]. Използван е апарат с диаметър на въртящия се лост 3.5 cm и скорост на въртене 7 об/mm. Тестовият период е 3 min, като в зависимост от нуждите на експеримента се отчита или продължителността на престой върху апарата или броят на паданията по време на наблюдавания период.

Ь) Проследяване за промени в ориентировъчното поведение при гризачи (“Hole board тест) по метода на Boissier и Simon [9]. За целта е използвана черна пластмасова плоскост с размери 50-50 cm, на която има 16 симетрично разположени кръгли отвори с диаметър 3 cm. Пластмасовата плоскост служи за под на кутия със стени с височина 25 cm, а самата плоскост се намира на 10 cm височина. Изследователското поведение на мишките е проследявано в продължение на 3 min от двама независими наблюдатели. Отчитан е броят на надничанията на поставеното в апарата животно.

с) Проследяване за промени в паметта и обучението при гризачи (step through тест; пасивно избягване с отрицателно подкрепление) по метода на Jarvik и Корр [10]. Апаратът е конструиран в Институт по невробиология, БАН и се състои от светла и тъмна камера, свързани помежду си с подвижна преграда. Подът в тъмната част на апарата е метална решетка, по която може да се подава токово дразнене със сила 1 мА и продължителност 1 s. Различаваме обучителна и тестова фаза на метода. По време на обучителната фаза животното се поставя върху платформа в светлата част на апарата, след което се отваря подвижната преграда и то преминава в неговата тъмна част, където получава токово дразнение на лапите. В тази фаза се отчита времето (в секунди), за което животното е преминало от светлата в тъмната част на апарата. Животни, престояли повече от една минута в светлата част на апарата се изключват от експеримента. Следва тестовата фаза. Степента на запаметяване на задачата да остане в светлата част на апарата се тества през различни периоди от време след обучителната тренировка. Отчита се времето (в секунди), за което животното остава върху платформата в осветената част. Тестът се прави за период от 180 s.

Ефектът от въздействието на еднократни дози от по 8, 16 и 32 mg/kg от съединението върху невромускулната координация при мишки на 3 h (1 А) и на 24 h от прилагането (1В) е показан на Фиг. 1 по-долу.

• ·.« V» юитрогап

Фиг. 1

Въздействието на еднократни дози от съединението от по 8, 16 и 32 mg/kg върху паметта и обучението на мишки е показан на Фиг. 2 по-долу, където ефективността на дозата от 16 mg/kg е подчертано висока.

BG 67301 Bl

А. Зчас

• ОМ η интромт·

В. 24 час

• 0.М VI жоитролвта

Фиг. 2

Където:

НЛ е начално латентно време

СТЛ е степ тру латентно време

Ефектът на еднократна доза от 16 mg/kg от съединението върху ориентировъчното поведение на мишки е илюстриран с Фиг. 3, от която е видно, че този ефект е продължителен и се задържа до 24-тия час от началото на експеримента.

BG 67301 Bl

Фиг. 3

Изследванията за неврофармакологична активност при 5-дневно третиране на здрави гризачи с доза 16 mg/kg от съединението, съгласно изобретението показват още, че подобно на амантадина, новосинтезираното съединение няма амнестичен ефект върху животните.

Пример 6. Изследване превантивните ефекти на съединението, съгласно изобретението, върху гризачи с модел на Болест на Паркинсон

Неврофармакологичната активност на съединението, съгласно изобретението, както и възможността той да има защитен ефект при заболяването е изследвана върху плъхове с модел на БП. Ефектът му е сравняван с този на утвърден лекарствен препарат от същата химична група - Амантадин, който се прилага превантивно като невропротектор в началото на лечението.

За създаването на експерименталния модел на Болестта на Паркинсон е използван невротоксина 6хидрокси допамин (6-OHDA), който не преминава кръвно-мозъчната бариера и селективно уврежда катехоламинергичната невротрансмисия на ниво централна и периферна нервна система. За нуждите на експеримента са използвани мъжки, полово зрели плъхове от породата Вистар с тегло 250-300 g, които се упояват с хлоралхидрат (400 mg/kg, и.п) и се фиксират на стереотаксичен апарат. Невротоксинът 6-OHDA (10 pg/2 μΐ), се инжектира едностранно в десен стриатум при координати АР = 0 mm, LR = 3.5 mm, Η = 5 mm, спрямо брегмата и черепната повърхност [11]. При контролните животни се прави отвор с координати, отговарящи на striatum, като се инжектира 2 μΐ 0.9% NaCl. Във всички групи петдневните интраперитонеални инжектирания предшестват хирургичната интервенция и стереотаксичното прилагане на токсина 6-OHDA. Опитните животни са разделени в експериментални групи, показани на Таблица 2 по-долу.

Таблица 2

Групи	Стереотаксично инжектиране (стриатум)	Интраперитонеално третиране (5 дни)
SO (фалшиво оперирани)	0.9% NaCI (2 μΙ)	0.9% NaCI
6-OHDA	6-OHDA (10 pg/2 μΙ)	0.9% NaCI
6-OHDA * амантадин	6-OHDA (10 pg/2 pl)	амантадин (40 mg/kg)
6-OHDA + Съединение по изобретението	6-OHDA (10 pg/2 μΙ)	Съединение по изобретението (16 mg/kg)

Приложените поведенчески и биохимични методи на изследване на третираните животни показват, че съединението, съгласно настоящото изобретение, намалява значимо броят на контралатералните ротации /при апомофиновия тест/ спрямо 6-OHDA група, което демонстрира убедително протективния ефект на веществото; подобрява също значимо паметовите процеси, нарушени от БП в групата с 6-OHDA /степ тру тест/; намалява оксидативния стрес чрез намаляване на липидна пероксидация в мозъка на плъхове с модел на ПБ и не повлиява мозъчната ацетилхолинестеразна активност. Освен това, новосинтезираното вещество не предизвиква кожни лезии, за разлика от третираните с референта Амантадин животни.

Установените значими невробиологични и биохимични ефекти върху мишки и плъхове, са съизмерими с тези на референта Амантадин, но в значително по-ниски дози (около 2,5 пъти), което е предимство на новосинтезираното вещество; върху експериментален модел на плъхове с 6-OHDA защитните ефекти на съединението, съгласно изобретението, срещу БП също са много добри - те са съизмерими, а в някои случаи превъзхождат тези на референта Амантадин, но приложени в значително по-ниски дози.

Claims (1)

1. Адамантаново производно с формула I