BG102413A

BG102413A - Скъсени форми на хемокин вета-8

Info

Publication number: BG102413A
Application number: BG102413A
Authority: BG
Inventors: John White; Edward Appelbaum; SHANNESSY Daniel O'; James FORNWALD; Kevin O'donnell
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 1999-04-30
Also published as: BR9610671A; JPH11512610A; PL326080A1; KR20030096447A; HUP9802699A3; MX9802380A; EP0859842A4; AU711573B2; CZ92198A3; WO1997012041A1; KR19990063834A; EP0859842A1; CN1198186A; NZ320932A; ZA968204B; CN1405180A; TR199800575T1; AU7379096A; NO981387L; EA199800352A1

Abstract

Изобретението се отнася до нови полипептиди на скъсената форма на човешки Ск -8 и до методи за използване на полипептидите.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Това изобретение се отнася за полипептид и полинуклеотидни последователности, кодиращи скъсена форма на хемокин бета-8 (Скр-8). Поконкретно настоящото изобретение се отнася за използването на полинуклеотидните и полипептидни последователности„ за получаването на полинуклеотидни и полипептидни последователности и за инхибиране действието на полипептида. Хемокините, означавани още като интеркринни цитокини, представляват субфамилия от структурно и функционално родствени цитокини. Тези молекули са малки, индуцируеми, провъзпалителни молекули. Цитокините показват най-общо 20% до 75% хомология на аминокиселинно равнище и се характеризират с четири консервативни цистеинови остатъка, които образуват два дисулфидни моста. На основата на подреждането на първите два цистеинови остатъка хемокините бяха класифицирани в две субфамилии, алфа и бета. В субфамилията алфа първите два цистеинаа са разделени от една аминокиселина и поради това се означават като субфамилия С-Х-С“. В субфамилията бета двата цистеина са разположени в съседство и поради това се означават като субфамилия С-С. Първият цистеин образува дисулфиден мост с третия цистеин, а вторият с четвъртия, което има за резултат формирането на сходна третична структураа за много от хемокините. За получаването на функционален, зрял

белтък повечето от хемокините претърпяват структурен протеолитичен процесинг. Това обикновено включва отстраняването на къса лидерна (водеща) последователност в N-крайния участък на белтъка. На белтъчно и/или ДНК равнище бяха описани са най-малко 14 различни α-хемокини и 12 β-хемокини.

Интеркринните цитокини проявяват глямо разнообразие от функции.

Една важна черта е тяхната способност да стимулират мигрирането чрез хемотаксис на различни клетъчни типове, такива като моноцити, неутрофили, Тлимфоцити, базофили и фибробласти. Субфамилиите а и β се различават малко по специфичността си към прицелните клетки. Повечето от а-хемокините привличат неутрофили, фибробласти, Т-клетки и NK-клетки. β-хемокините привличат предимно моноцити и Т-лимфоцити. Много от хемокините имат провъзпалителна активност и участват в множество стъпки повреме на възпалителната реакция. Тези активности включват стимулиране отделянето на хистамин, отделане на лизозомен ензим и леукотриен, повишена адхезивност на прицелните имунни клетки към ендотелните клетки, засилено свързване на белтъци от комплемента, индуциране експресия на гранулоцитни адхезивни молекули и рецептори на комплемента, както респираторно възпаление. Освен участието им във възпалението за някои хемокини е показано, че проявяват и други функции. Например, възпалителният белтък от макрофаги (macrophage inflammatori protein, MIP-1) е способен да подтисне пролиферацията на хематопоетичните стволови клетки, а тромбоцитният фактор-4 (PF-4) е мощен инхибитор на растежа на ендотелните клетки, Интерлевкин-8 (IL-8) предизвиква пролиферацията на кератиноцитите, a GRO представлява автокринен растежен фактор за меланомни клетки. Хемокините участват в редица физиологични и болестни състояния и по-конкретно в тези, които представляват възпалителен компонент. Те включват, но не са ограничени до: трафика на лимфоцити, заздравяване на рани, регулация на хематопоезата и имунологични заболявания, такива като алергия, астма и артрит. Много цитокини бяха първоначално изолирани като продукти на възпалителен отговор. Например, MIP-1 беше изолиран в началото като провъзпалителен цитокин, индуциращ се от

ендотоксини, който се произвежда от макрофагите. По подобен начин на основата на индуцирано възпаление и на хомология в аминокиселинните последователности бяха идентифицирани и други членове на тази субфамилия.

Това включва пълноразмерни, както и скъсени форми на полипептида Скр~8 на настоящото изобретение.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно един аспект на настоящото изотретение е предоставена смес от нови полипептиди, представляващи скъсени форми на човешкия Скр-8, както и техни фрагменти, аналози и производни, които са биологично активни и приложими в диагностиката и терапията.

Съгласно друг аспект на настоящото изобретение са предоставени изолирани молекули на нуклеинови киселини, кодиращи такива полипептиди, в това число мРНКи, ДНКи, кДНКи, геномна ДНК, както и техни фрагменти, аналози и производни, които са биологично активни и приложими в диагностиката и терапията.

Съгласно следващ аспект на това изобретение е предоставен метод за получаването на такива полипептиди чрез рекомбинантни техники, които включват култивирането на рекомбинантни прокариотни и/или еукариотни гостоприемни клетки, съдържащи последователности от нуклеинови киселини

......;..: .... , при условия благоприятстващи експресията на белтъците и последващо изолиране на белтъците.

Съгласно друг следващ аспект на настоящото изобретение е предоставен метод за използването на такива полипептиди или полинуклеотиди, кодиращи такива полипептиди, за терапевтични цели, например за предпазване на стволовите клетки на костния мозък от химиотерапевтични вещества повреме на химиотерапия и за стимулиране заздравяването на рани.

Съгласно друг аспект на настоящото изобретение са предоставени

антитела срещу такъв полипепитд.

Съгласно по-нататъшен аспект на настоящото изобретение са предоставени антагонисти на такъв полипептид, които могат да се използват за инхибиране действието на такъв полипептид, например, за лечение на апластична анемия, миелодиспластичен синдром, астма и артрит.

Съгласно друг аспект на настоящото изобретение са предоставени също така сонди от нуклеинови киселини, включващи молекули нуклеинови киселини с дължина, достатъчна за да хибридизират специфично с нуклеотидната последователност на Скр-8.

Съгласно следващ аспект на настоящото изобретение са предоставени диагностични тестове за откриването на заболявания, свързани с недостатъчната

експресия или свръхекспресия на полипептида и за откриването на мутации в нуклеотидните последователности, кодиращи такива полипептиди.

Съгласно друг следващ аспект на настоящото изобретение е предоставен метод за използването на такъв полипептид или на полинуклеотиди, кодиращи такъв полипептид, като реактиви за научни изследвания in vitro, синтеза на ДНК и получаването на ДНК-вектори, с цел разработването на терапия и диагностика за лечението на човешко заболяване.

Тези и други аспекти на настоящото изобретение ще станат ясни за специалистите от следващото описание.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Бяха описани ДНК последователности, кодиращи полипептиди, родствени на суперфамилията от про-възпалителни интеркринни хемокини. Полинуклеотидната последователност, кодираща пълноразмерен Скр-8 (120 аминокиселини), беше получена от библиотика кДНК на аортен ендотел. Настоящото изобретение се отнася за нови скъсени форми на Ο<β-8, съдържащи само 82, 76, 75 или 74 С-крайни аминокиселини от дългата форма. N-крайните аминокиселини, както и сигналният пептид от 21 остатъци са отстранени. Както и

в длъгата форма на С1ф-8 първите два цистеинови остатъка в тези клонове са в съседни позиции, което ги поставя в субфамилията цитокини С-С или бета.

Наличието на този мотив ги отличава от субфамилията цитокини а (“СХС), в които първите два цстеинови остатъка са разделени от една аминокиселина.

Полинуклеотидните последователности, кодиращи зрелите полипептиди (SEQ ID NOs: 1, 2, 3 и 4) могат да се представят под формата на всякаква нуклеинова киселина, такава като РНК, едноверижна (ss) ДНК, геномна ДНК и т. н., включваща допълнителни кодиращи и не-кодиращи последователности, свързани с полипептида. Освен това в резултат на изродеността на аминокиселинния код всяка ДНК-кодираща последователност, която кодира същите зрели полипептиди, ще попада в обсега на това изобретение. Ще се включват също така и всички варианти на тази последователности, алелни или несрещащи се в природата. Настоящото изобретение включва също последователност е свързана полинуклеотиди, в които кодиращата в същата рамка за четене с друга последователност ДНК, която спомага за експресията или секрецията на белтъка от клетката или служи като маркер за идентифицирането на белтъка в клетките (напр., НА tag).

По-нататък това изобретение се отнася за полинуклеотидни последователности, които хибридизират с желаната последователност при идентичност в последователностите най-малко 50%, а за предпочитане 70%. Тези полинуклеотиди кодират полипептиди, които се предпочита да запазват същата биологична функция или активност, ' както и зрелият полипептид. Като алтернатива последователността може да бъде представена от полинуклеотиди, които се предпочита да имат 50 бази, които са идентични или хибридизират с последователностите на настоящото изобретение, но не запазват активността си. Такива последователности могат да се използват като сонда или праймер за PCR (полимеразна верижна реакция).

Полипептидите на настоящото изобретение могат да бъдат рекомбинантни полипептиди, природни полипептиди или синтетични полипептиди. Производни на тези полипептиди могат да бъдат такива, в които са налице една или повече аминокиселинни замени; такива, в които една или повече аминокиселини съдържат заместващи групи; такива, в които зрелият белтък е слят с друго съединение; или такива, в които със зрелия белтък са слети допълнителни аминокиселини.

С предпочитание полипептидите на настоящото изобретение се предоствят в изолирана форма и с предпочитание са пречистени до хомогенност.

Настоящото изобретение се отнася също така за вектори, които включват полинуклеотиди на настоящото изобретение, гостоприемни клетки, получени с този вектор по пътя на генното инженерство, както и за получаването на полипептиди на настоящото изобретение чрез рекомбинантни техники. Гостоприемните клетки се конструират с векторите на това изобретение (клониране и експресия). Специалистите са запознати с условията на култивиране на тези клетки, необходими за активиране на промотори, селекция на трансформанти и амплифициране на скъсения ген за Скр-8.

Полинуклеотидните последователнонсти могат да се включат в някой от многото експресионни вектори дотолкова, доколкото те могат да се реплицират и да преживяват в гостоприемника. Полинуклеотидната последователност, включена в експресионния вектор се намира под контрола на подходящ промотор, който направлява синтезата на мРНК (напр., LTR-промотор). Експресионният вектор съдържа също място за свързване с рибозомите за инициация на транслацията, терминатор на транскрипцията, усилващи (инхансерни) елементи, които усилват транскрипцията (напр., късният инхансер на SV40) и съответни маркери за селекция, които осигуряват задържането на вектора в гостоприемника (напр., ген за ампицилинова устойчивост). Гостоприемните клетки могат да бъдат клетки на висши еукариоти, такива като клетки от бозайници или насекоми, клетки на нисши еукариоти, такива като дрожди, както и прокариотни клетки, такива като бактерии. Въвеждането на конструкцията в гостоприемната клетка може да се осъществи по различни протоколи. Всички по-горе споменати стъпки са познати на специалистите от областта на техниката. Добре познати в тази област са както стъпките на клониране, така и подборът на гостоприемници и вектори (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Editon, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989).

Белтъците могат да се синтезират в гостоприемната клетка под контрола на подходящ промотор. За получаването на такива белтъци могат да се използват също извънклетъчни (/h vitro) транслационни системи като се използват РНКи, получени от ДНК-конструкциите на настоящото изобретение. Като алтернатива полипептидът на настоящото изобретение може да се получи по синтетичен път чрез конвенционални пептидни синтезатори.

След трансформация или трансфекция на подходящ щамгостоприемник и култивиране на гостоприемния щам до съответна клетъчна плътност избраният промотор се индуцира по съответни начини (напр., промяна на температурата или химична индукция) и клетките се култивират допълнително. Клетките обикновено се събират чрез центрофугиране, разрушават се чрез физични или химични способи и се пречистват до хомогенност чрез различни методи (напр., хроматография, HPLC). В зависимост от използвания гостоприемник полипептидът може да бъде модифициран по някакъв начин (нпар., гликозилиран). Полипептидите на изобретението могат също да включват начален метионинов остатък.

Дългата форма на Скр-8 представлява хемоатрактант за лвекоцити и поради това може да се използва в различни имунорегулаторни и възпалителни функции, както и при редица болестни състояния. Белтъкът се експресира предимно в тъкани с хематопоетичен произход. Един важен биологичен ефект на полипептида Скр-8 върху левкоцитите представлява стимулирането мобилизацията на резервите от Са⁺⁺. Тази мобилизация е свойствена за функционалното активиране на клетката. Беше установено, че стимулирането на различни клетки EOL-3 със смес, съдържаща четири скъсени форми на СкР-8 (SEQ ID NOS:1-4) води до незабавно повишаване на вътреклетъчния Са⁺⁺, което е зависимо от дозата. При индивидуално тестиране най-активна беше формата със SEQ ID NO: 4. За разлика от нея дългата форма на Скр-8 беше приблизително 1000 пъти по-слабо активна от скъсените форми за мобилизиране на Са⁺⁺. Високата активност на скъсените форми на настоящото изобретение може да направи ефективно терапревтичното приложение на този хемокин, включващо, но не ограничено до предпазване на стволовите клетки на костния мозък от химотерапевтици повреме на химиотерапия, отстраняване на левкемични клетки, стимулиране на имунен отговор, регулиране на хематопоезата и лимфоцитния трафик, лечение на псориазис, солидни тумори, повишаване защитните сили на гостоприемника срещу резистентни хронични или акутни инфекции и стимулиране заздравяването на рани.

Полинукклеотидите и полипептидите на настоящото изобретение могат да се използват като реактиви за научни изследвания, за синтеза на ДНК и получаването на ДНК-вектори, както и за целите на терапията и диагностиката при лечението на човешко заболяване (напр., в експанзията на незрели хематопоетични родителски клетки). фрагменти от тази скъсена полинуклеотидна последователност на Скр-8 могат да се използват също и като хибридизационна сонда за изолирането на други гени, които са много сходни по последователност. Техниките за този вид експерименти са добре познати на специалистите от областта на техниката.

Това изобретение се отнася също и за използването на тези последователности като част от диагностичен тест за откриването на заболявания или на предразположеност към заболявания, свързани с наличието на мутации в нуклеотидните последователности. Такива заболявания са свързани с недостатъчната експресия на хемокиновите полипептиди. Например, индивиди носещи мутации в гена за Скр-8 могат да се открият на равнище ДНК чрез различни техники, такива като PCR. Генетичното тестиране на основата на различия в последователноста на ДНК може да се постигне чрез откриването на изменения в електрофоретичната подвижност на фрагменти ДНК в гелове със или без денатуриращи агенти. Откриването на специфична последователност ДНК може да се постигне чрез методи, такива като хибридизация, РНазна протекция, химично разграждане, директно секвениране на ДНК, RFLP (полиморфизъм в дължината на рестриктазни фрагменти) анализ и пренос на геномна ДНК (Southern blotting)). Мутации могат ддаа се детектират също и чрез анализ in situ.

Настоящото изобретение се отася също за диагностичен тест за откриваане на променени равнища на белтъка Скр-8 в различни тъкани, доколкото свръхекспресията на белтъците в сравнение с проби от нормални контролни тъкани може да детектира наличието на заболяване или на предразположеност към заболяване, например тумор. Тестовете, използвани за установяване равнищата на белтъка Скр-8 в проба, получена от гостоприемник, са добре познати на специалистите от областта на техниката и включват радиоимунологичен анализ, тестове по конкурентно свързване, анализ чрез белтъчен пренос (Western blot), ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) исандвичови тестове.

Това изобретение предоставя метод за идентифициране на рецепторите за хемокиновите полипептиди. Генът, кодиращ рецептора, може да се индентифицира чрез различни методи, познати на специалистите от областта на техниката, в това число залавяне (panning) на лиганди и сортиране чрез FACS (флуоресцентно активирано клетъчно сортиране).

Алтернативен подход за идентифицирането на рецептори включва фотоафинитетно свързване на белязаните полипептиди с клетъчната мембрана или екстракцията на препарати, които експресират рецепторната молекула. Белязаният комплекс може да се изолира и да се подложи на белтъчно микросеквениране. Получената аминокиселинна последователност би могла да се използва за проектирането на набор от изродени олигонуклеотидни сонди за скриниране на библиотека от кДНК с цел идентификация на гените, кодиращи предполагаемите рецептори.

Това изобретение предоставя метод за скриниране на съединения, с което се цели да се идентифицират агонисти и антагонисти на хемокиновия полипептид на настоящото изобретение. Хемотаксисът може да се тестира като клетките, които се привличат по химичен път от тези полипептиди се поставят върху горната страна на филтър с пори, достатъчно големи, за да пропуснат клетките (5 мм). Разтворите на потенциалните агонисти или антагонисти се поставят в долната камера, така че клетките мигрират или са възпрепятствани да мигрират през мембраната за период от време. Като алтернатива рецепторите на Ск0-8 биха могли да се инкубират с белязан полипептид в присъствието на съединение. Би могла да се измери способността на съединението да блокира това взаимодействие или да взаимодейства с рецептора в отсъствието на полипептид.

Примерите за потенциални антагонисти на скъсения Скр-8 включват антитела, олигонуклеотиди, които се свързват с полипептидите или полипептиди, които се свързват с рецептора за полипептида див тип, но нямат биологична активност. Антисенс технологията, използвана за контролиране на генната експресия, също би могла да бъде потенциален антагонист. Пригодността н гораспоменатите технологии би трябвало да е очевидна за специалистите от областта на техниката.

Антагонистите могат да се използват за личение на заразни заболявания, такива като силикоза, саркоидоза, идиопатична белодробна фиброза, идиопатичен хипер-еозинофилен синдром и ендотоксичен шок - всички

I чрез преустановяване синтезата на полипептида на настоящото изобретение. Антагонистите могат да се използват също за лечение на атеросклероза чрез преустановяване инфилтрацията на моноцити в артериалната стена. Антагонистите могат да се използват за лечение на алергични реакции, опосредствани от хистамин и на различни имунологични смущения, засягащи дермата.

Антагонистите могат да се използват също за лечение на костномозъчна недостатъчност при апластична анемия или миелодиспластичен синдром. Те могат също така да се използват за лечение на астма и алергия, както и на фиброза на подепителната базална мембрана, която е характерна за астматичния бял дроб.

Хемокиновите полипептиди, агонисти и антагонисти могат да се употребяват с подходящ фармацевтичен носител, такъв като физиологичен разтвор, буфериран физиологичен разтвор, декстроза, вода, глицерол, етанол или комбинации от тях. Съставът трябва да отговаря на начина на приложение. Изобретението предоставя също и фармацевтичен комплект или набор, включващ едина или повече опаковки, напълнени с една или повече от съставките на фармацевтичните препарати на това изобретение.

фармацевтичните препарати могат да се прилагат по подходящ начин

като например чрез местни, интравенозни, интраперитонеални, мускулни, интратуморни, субкутанни, интраназални или интрадермални способи в количество, което е ефективно за лечение на специфична индикация. Тези приложения би трябвало да се очевидни за специалистите от областта на техниката.

Хемокиновите полипептиди, агонисти или анатагонисти, които са полипептдиди, могат да се използват в съгласие с настоящото изобретение чрез експресията на такива полипептиди in vivo. Този тип генна терапия е добре позната в областта на техниката. Например, клетки от пациента могат да се манипулират ex vivo с ДНК или РНК, кодиращи скъсените форми на полипептида Ск0-8 и манипулираните клетки, експресиращи тези полипептиди, да се въведат в пациента. По подобен начин е възможно клетки да се манипулират in vivo за експресията на полипептид in vivo.

Както е известно в областта на техниката, възможно е да се използват ретровирусни частици, съдържащи РНК, кодираща полипептида на настоящото изобретение. Ретровирусните плазмидни вектори се използват за трансдукция на опаковащи клетъчни линии (напр., РЕ501) чрез различни способи (напр., електропорация), за да се образуват продуциращи клетъчни линии. В предпочетено приложение ретровирусният експресионен вектор, съдържащ

полинуклеотидната последователност, е под контрола на промотор, такв като LTR (дълг терминален повтор) и съдържа маркер за селекция на устойчивост срещу медикамент (напр., пео). Получаването на тези вектори и на производните клетъчни линии би трябвало да е познато на специалистите, а също така става ясно и от съдържащите се тук техники. Продуциращата клетъчна линия образува инфекциозни частици от ретровирусния вектор, които съдържат нуклеотидната(ите) последователност(и), кодираща полипептидите. Такива частици от ретровирусни вектори след това могат да се използват за трансдукция на еукариотни клетки, например, фибробласти или ендотелни клетки, както in vitro, така и in vivo. Трасдуцираните еукариотни клетки след това ще експресират нуклеотидната(ите) последователност(и), кодираща белтъка.

Последователностите на настоящото изобретение са ценни също така и за идентифицирането на хромозоми. Последоваелностите се насочват специфично към и могат да хибридизират с определен локус върху индивидуална хромозома. Картирането на ДНК в хрмозомите предсавлява важна стъпка в намирането на корелация между гените и дадено заболяване. Една техника, позната на специалисите, включва получаването на праймери, които се използват за скриниране чрез PCR на соматични клетъчни хибриди, съдържащи индивидуални човешки хромозоми. Само тези хибриди, които съдържат човешкия ген, съвотестващ на праймера, ще дадат амплифициран фрагмент. Останалите стратегии за картиране, познати на специалистите от областта на техниката включват, но не се ограничават до: хибридизация in situ, прескрининг с проточно сортирани хромозоми, сублокализация във фрагменти от специфични хромозоми чрез използването на същите праймери и преселекция чрез хибридизация за конструирането на библиотеки кДНК, специфични за хромозомите. За прецизна хромозомна локализация в една стъпка може да се използва флуоресцентна хибридизация in situ (FISH) на клонове кДНК с разпръснати метафазни

хромозоми.

След като веднъж последователността се картира в прецизен хромозомен локус нейното физическо разположение може да се съотнесе с данните от генетичното картиране. Връзката между гените и заболяванията може да се идентифицира чрез анализ на скачването. Всяка разлика в кДНК или геномните последователности между засегнатите и незасегнатите индивиди може да бъде индикация за заболяване. Например, една мутация в ДНК, която се открива само в засегнатите индивиди, може да бъде причинител на заболяването.

Полипептидите, техните фрагменти или други производни, или експресиращите ги клетки могат да се използват като имуноген за получаването на антитела срещу тях. Тези антитела могат да бъдат например поликлонални или моноклонални антитела. Настоящото изобретение включва също така химерни, едноверижни и хуманизирани антитела, както и Fab-фрагменти или продукта на библиотека, експресираща Fab. За получаването на такива антитела или фрагменти могат да се използват различни методи, известни в областта на техниката. Поликлонални антитела, получени чрез стандартни методи, могат да се използват за изолирането на полипептидите от тъкани, експресиращи тези полипептиди. За получаването на моноклонални антитела може да се използва всяка техника, която осигурява продукцията на антитела от непрекъснати култури на клетъчни линии. Технкиките, описани за получаването на едноверижни антитела, могат да се адаптират за получаването на едноверижни ангтитела срещу имуногенни пептиди на това изобретение. Мога да се използват също така трансгенни мишки за експресията на хуманизирани антитела срещу имуногенни полипептиди на това изобретение.

Настоящото изобретение ще бъде описано по-нататък, позовавайки се на следващите примери; трябва обаче да се разбере, че настоящото изобретение не се ограничава до такива примери. За да се улесни разбирането на следващите примери, накратко ще бъдат описани някои често срщащи се методи и/или термини.

Изходните плазмиди или могат да се закупят, или са общодостъпни без ограничения, или пък могат да се конструират от достъпни плазмиди в съгласие с публикувани методи. Освен това плазмиди, еквивалентни на описаните, са познати в областта на техниката и са известни на обикновените специалисти.

Различните рестриктазни ензими, използвани за смилане на ДНК, представляват търговски препарати, а техните реакционни условия, кофактори и други изисквания би трябвало да са познати на обикновените специалисти. Разделянето на разградените фрагменти по големина се извършва чрез използването на 8% полиакриламиден гел.

Олигонуклеотидите - това са или едноверижни полидезоксинуклеотиди или две комплементарни полидезоксинуклеотидни вериги, които могат да се синтезират химично. Такива синтетични олигонуклеотиди нямат 5'-фосфат и поради това няма да се лигират с друг олигонуклеотид без добавянето на фосфат с АТР (аденозинтрифосфат) в присъствието на киназа. Един синтетичен олигонуклеотид ще се лигира с фрагмент, който не е бил дефосфорилиран. Трансформацията се провежда, освен ако не е отбелязано друго, както е описано в метода на Graham, F. and Van der Eb, A., Virology 1973, 52, 465-457.

Следващите примери са приведени с единствено ислюстративни цели и нямат за цел да ограничат изобретението.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1: Бактериална експресия и пречистване на СкЗ-б

Последователността от ДНК, кодираща Ckp-8, ATCC# 75676, първоначално се амплифицира чрез използването на праймери за PCR, съответстващи на 5'- и 3'-крайните последователности на процесирания белтък Скр-8 (минус сигналната пептидна последователност) и на векторните последователности откъм 3'-края на гена за Скр-8. 5'-олигонуклеотидният праймер има последователността 5'-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3' (SEQ ID N0:5), а 3'-праймерът има последователността 5'CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID N0:6). Тези праймери съдържат съответно рестриктазни места за ВатН\ и ХЬа], които се използват за клониране в полилинкерната област на устойчивия към ампицилин бактериален експресионен вектор PQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, СА). Амплифицираните последователности се лигират в PQE-9 в рамка с последователността, кодираща хистидиновата закачка (tag) и мястото за свързване с рибозомите (RBS). Лигирането се използва за трансформация на £ coli, щам M15/rep 4 (Qiagen), който съдържа множество копия на плазмида pREP4. pREP4 експресира репресора lacl и придава също така устойчивост към канамицин. Трансформантите се селекционират по тяхната способност да растат върху петрита с LB (хранителна среда Luria/Bertani) с прибавен ампицилин/канамицин. Клоновете, съдържащи желаната конструкция (изолирана и потвърдена с рестриктазен анализ) се култивират през нощта в течна среда LB, към която е добавен както Amp (100 мкг/мл), така и Кап (25 мкг/мл). Тази култура се използва за инокулирането на голяма култура при съотношение от 1:100 до 1:250. Клетките се култивират до оптична плътност 600 между 0,4 и 0,6. След това се прибавя IPTG (изопропил-В-О-тиогалакто-пиранозид) до крайна концентрация 1 мМ. След това клетките се култивират допълнително 3 до 4 часа, после се събират чрез центрофугиране. Клетъчната утайка се разтваря в хаотропното вещество 6 М гуанидин HCI, лизира се и се подлага на хроматография върху никел-хелатна колона при условия, които позволяват плътното свързване на белтъци, съдържащи закачката 6-His (Hochuli, Е. etal. J. Chromatography 1984, 411,177-184). Скъсеният Ckp-8 (95% чист) се елуира от колоната в 6 М гуанидин HCI pH 5 и за целите на ренатурацията се довежда до 3 М гуанидин HCI, 100 мМ натриев фосфат, 10 мМ глутатион (редуциран) и 2 мМ глутатион (окислен). След инккубиране в този разтвор за 12 часа белтъкът се диализира срещу 10 мМ натриев фосфат.

Пример 2: Експресия на рекомбинантен Ckb-8 в COS-клетки

Експресионният плазмид CMV-Ckp-8 НА се получава от вектора pcDNAI/Amp (Invitrogen), съдържащ гена за ампицилинова устойчивост и CMVпромотора, следван от полилинкерна област, интрон на SV40 и място за полиаденилиране. В полилинкерната област на вектора се клонира фрагмент ДНК, кодиращ скъсената последователност на Скр-8 и закачка НА, слята в рамка с 3'-края; по този начин експресията на рекомбинантния белтък се направлява от CMV-промотора. Закачката НА съответста на епитоп, получен от белтъка хемаглутинин на грипния вирус, както беше описано по-рано (I. Wilson et a/., Cell 1984, 37:767). Сливането на закачката НА с прицелния белтък позволява лесно откриване на рекомбинантния белтък с антитяло, което разпознава НА-епитопа.

За експресията на рекомбинантни скъсени форми на Скр-8 COS-клетки се трансфектират с експресионния вектор чрез DEAE-декстрановия метод (J. Sambrook, Е. Fritsch, Т. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Клетките се бележат 8 часа с ³⁵8-цистеин два дни след трансфекцията. След това културалните среди се събират и клетките се лизират с детергент (буфер RIPA (150 мМ NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 мМ Трие, pH 7,5) (Wilson, I. et al., ID. 1984, 37:767). Както клетъчният лизат, така и културалните среди се преципитират с моноклонално антитяло, специфично за НА. Преципитираните белтъци се анализират на 15% SDS-PAGE гелове.

Пример 3: Експресия и пречистване на скъсена форма на хемокин Скр-8 чрез използването на бакуловирусна експресионна система

БР9-клетки се инфектират с рекомбинантен бакуловирус, конструиран така, че да експресира кДНК за Ckp-8. С клетките се инфектира 10 литрова култура при MOI 2 и се култивира в условия на ниско съдържание на серум при 28°С 72-96 часа. Клетъчните отломки от инфектираната култура се отстраняват чрез центрофугиране при ниски обороти. Към надутайката се прибавя коктейл от протеазни инхибитори до крайна концентрация 20 мкг/мл (1 мкг/мл леупептин, 1 мкг/мл Е-64 и 1 мМ EDTA). Тези конкретни условия на култивиране (т. е., ниско съдържание на серум) водят до получаването на някои скъсени откъм ИН2-края форми на полипептида Скр-8. Равнището на Скр-8 в надутайката се проследява чрез нанасянето на 20-30 мкл от надутайката на 15% SDS-PAGE гел. Скъсените форми на Скр-8 се откриват като видими ивици, съответстващи на равнища на експресия от няколко мг на литър. Скъсеният Скр-8 по-нататък се пречиства чрез метод, включващ три стъпки: 1) Хепарин-свързваща афинитетна хроматография. Надутайката от бакуловирусната култура се смесва с 1/3 обема буфер, съдържащ 100 мМ HEPES/MEM/NaOAc pH 6 и се филтрува през мембрана от 0,22 мкм. След това пробата се нанася върху хепарин-свързваща колона (HEI poros 20, ΒΙΟ-Perceptive System Inc.). Скъсените форми на Ckp-8 се елуират приблизително при 300 мМ NaCI в линеен градиент от 50 до 500 мМ NaCI в 50 мМ

HEPES/MES/NaOac при pH 6; 2) Катионообменна хроматография. Набогатеният след хепариновата колона белтък се подлага на 5-кратна разредка с буфер, съдържащ 50 мМ HEPES/MES/NaOAc pH 6. Получената смес след това се нанася на катионообменна колона (S/M poros 20, ΒΙΟ-Perceptive System Inc.). Скъсеният Ckp-8 се елуира при 250 мМ NaCI в линеен градиент от 25 до 300 мМ NaCI в 50 мМ HEPES/MES/NaOAc при pH 6; 3) Гел филтрация. След катионообменната хроматография скъсеният Ckp-8 се пречиства по-нататък чрез нанасяне върху гел-филтрационна колона (HW50, TOSO HAAS, 1,4 х 45 см). Аминокиселинното секвениране на пречистения препарат показва семе от най-малко четири преобладаващи последователности, съответстващи на четирите скъсени форми на белтъка (SEQ ID NOS: 1, 2, 3 и 4).

Пример 4: Стимулиране на EOL-3-клетки и PBLs със смес, съдържаща скъсени форми на Скр-8

EOL-3 клетки се култивират при стандартни условия на култивиране и се диференцират за две седмици в 1 мкМ Na-бутират. PBLs (левкоцити от периферна кръв) се получават от човешки донори чрез венозна пунктура. PBLs се пречистват чрез стандартни методи. Двата клетъчни препарата се натоварват поотделно с FURA-2 (1 мкМ) 45 минути. Клетки при концентрация 1х10⁶/мл (общо 2 мл) се прехвърлят в пластмасови кювети. флуоресцентният спектрофотометър се нулира така, че да дава базова линия преди добавянето на скъсените форми (871а, 871Ь, 871 с, 871RP) или на длгата форма (899) на Скр-8 до концентрация 0,33 до 33 нМ. Повишаването на флуоресценцията се проследява със спектрофотометър. Промяната на свободния Са⁺⁺ вътре в клетката се изчислява като най-напред клетките се лизират с Тритон хЮО в присъствието на излишък от Са⁺⁺ (за да се получи Fmax) и след това се прибавя 5 мМ EGTA, за да се получи Fmin. Делът на свободня Са⁺⁺ може да се изчисли от min и max стойностите. МСР-1 (моноцитен хемотаксисен белтък-1) е известен хемокин и се използва като положителна контрола.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛИ: John White, Edward Appelbaum, Daniel O’Shannessy,

James Allan Fornwald and Kevin O’Donnel (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: СКЪСЕНИ ФОРМИ HA ХЕМОКИН

БЕТА-8 (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 6 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕСАТ:

(B) УЛИЦА: 709 Swedeland Road (C) ГРАД: King of Prussia (D) ЩАТ: PA (E) СТРАНА: USA (F) КОД: 19406 (v) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ:

(A) ТИП СРЕДА: Дискета, 3,5 инча, 1,44 Mb памет (B) КОМПЮТЪР: IBM 486 (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: WINDOWS FOR WORKGROUPS (D) ПРОГРАМА: WORDPERFECT 5,1 (vi) ДАННИ ЗА НАСТОЯЩАТА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: още не е даден (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: сега (C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ДАННИ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА:

(B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ:

(viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПЪЛНОМОЩНИКА/АГЕНТА:

(A) ИМЕ: William Т. Нап (B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 34 344 (C) НОМЕР НА УКАЗАТЕЛЯ/РЕГИСТЪРА: Р50381 (ix) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: (610) 270-5219 (B) ТЕЛЕФАКС: (610) 270-5090 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 82 (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1

GLU ASN PRO VAL LEU LEU ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP

5 1015

CYS CYS ILE SER TYR THR PRO ARG SER ILE PRO CYS SER LEULEU

2530

GLU SER TYR PHE GLU THR ASN SER GLU CYS SER LYS PRO GLY VAL 35 4045

ILE PHE LEU THR LYS LYS GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER 50 5560

ASP LYS GLN VAL GLN VAL CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR 65 7075

ARG ILE LYS THR ARG LYS ASN (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 77 (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2

LEU ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS ILE SER TYR

5 1015

THR PRO ARG SER ILE PRO CYS SER LEU LEU GLU SER TYR PHE GLU 20 2530

THR ASN SER GLU CYS SER LYS PRO GLY VAL ILE PHE LEU THR LYS 35 4045

LYS GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER ASP LYS GLN VAL GLN

5560

VAL CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR ARG ILE LYS THR ARG

7075

LYS ASN (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 76 (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3

ASP ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS ILE SER TYR THR 15 10 15

PRO ARG SER ILE PRO CYS SER LEU LEU GLU SER TYR PHE GLU THR 20 2530

ASN SER GLU CYS SER LYS PRO GLY VAL ILE PHE LEU THR LYS LYS 35 4045

GLY ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER ASP LYS GLN VAL GLN VAL 50 5560

CYS MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR ARG ILE LYS THR ARG LYS 65 7075

ASN (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 75 (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4

ARG PHE HIS ALA THR SER ALA ASP CYS CYS ILE SER TYR THR PRO

5 1015

ARG SER ILE PRO CYS SER LEU LEU GLU SER TYR PHE GLU THR ASN 20 2530

SER GLU CYS SER LYS PRO GLY VAL ILE PHE LEU THR LYS LYS GLY 35 4045

ARG ARG PHE CYS ALA ASN PRO SER ASP LYS GLN VAL GLN VAL CYS 50 5560

MET ARG MET LEU LYS LEU ASP THR ARG ILE LYS THR ARG LYS ASN

7075 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:5:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (iv) АНТИ-СЕНС: не (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5

TCAGGATCCG TCACAAAAGA TGCAGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:6:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (iv) АНТИ-СЕНС: не (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6 CGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGT

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Полипептид, включващ последователността SEQ ID N0:1.
2. Полипептид, включващ последователността SEQ ID N0:2.
3. Полипептид, включващ последователността SEQ ID N0:3.
4. Полипептид; включващ последователността SEQ ID N0:4.
5. Препарат, характеризиращ се с това, че включва смес от полипептидите на претенции 1, 2, 3 и 4.
6. Вектор, характеризиращ се с това, че включва полинуклеотид, кодиращ полипептида на претенция 1,2,3 или 4.
7. Гостоприемна клетка, характеризираща се с това, че е получена по генно-инженерен път с вектор на претенция 6.
8. Метод за получаване на полипептид на претенция 1, 2, 3 или 4, характеризиращ се с това, че включва експресия на полипептида от гостоприемна клетка, която е получена по генно-инженерен път с вектор, включващ плинуклеотид, кодиращ полипептида на претенция 1,2,3 или 4.
9. Агонист на полипептида на претенция 1, 2, 3 или 4.
10. Антагонист на полипептида на претенция 1, 2, 3 или 4.
11. Метод за лечение на пациент, нуждаещ се от Скр-8, характеризиращ се с това, че включва въвеждане в пациента на ефективно количество от полипептида на претенция 1, 2, 3 или 4.
12. Метод за лечение на пациент, нуждаещ се от Скр-8, характеризиращ се с това, че включва въвеждане в пациента на ефективно количество от препарата на претенция 5.
13. Метод за лечение на пациент, нуждаещ се от Скр-8, характеризиращ се с това, че включва въвеждане в пациента на ефективно количество от антагониста на претенция 10.
14. Метод за идентифициране на антагонисти и агонисти на полипептид на претенция 1, 2, 3 или 4, характеризиращ се с това, че включва комбиниране на избраните тест-клетки, на съединението, което се скринира и на полипептид на претенция 1, 2, 3 или 4; и определяне дали сединението е ефективен агноист или антагонист на основата на отговора на тест-клетките.
15. Метод за диагностика на заболяване или на предразположеност към заболяване, свързано с по-ниската експресия на полипептид на претенция 1, 2, 3 или 4, характеризиращ се с това, че се определя дали има мутация в последователността на нуклеиновата киселина, кодираща полипептида.

<0 претенция 1, 2, 3 или 4; и определяне дали сединението е ефективен агноист или антагонист на основата на отговора на тест-клетките.

15. Метод за диагностика на заболяване или на предразположеност към заболяване, свързано с по-ниската експресия на полипептид на претенция 1, 2, 3 или 4, характеризиращ се с това, че се определя дали има мутация в последователността на нуклеиновата киселина, кодираща полипептида.